BR112021013109A2 - Rna de fita dupla e seus usos. - Google Patents
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Abstract
rna de fita dupla e seus usos. a presente divulgação relaciona-se a um tratamento não invasivo e específico de alelo, em particular, para a doença de machado-joseph (mjd). a presente divulgação usa tecnologia de silenciamento de rna (p.ex., interferência de rna) contra polimorfismos de nucleotídeo único (snps) exônicos no gene da ataxina-3, codificando a proteína ataxina-3 mutante de ganho-de-função dominante, resultando deste modo em um tratamento eficaz para a mjd. para esse propósito, rnas silenciadores gênicos altamente específicos para o alvo, cujas sequências antissenso são complementares aos snps que estão em desequilíbrio de ligação com a expansão causadora da doença, foram desenhados e testados. esta divulgação relaciona-se também a um vetor viral adenoassociado selecionado, em particular, o serotipo 9 (aav9) como um vetor de entrega gênica, após o que os referidos rnas de fita dupla podem ser entregues no sistema nervoso central (cns) por vias minimamente invasivas (p.ex., administração intravenosa), uma vez que este serotipo particular atravessa eficientemente a barreira hematoencefálica (bbb).
Description
[001] A presente divulgação relaciona-se a um tratamento não invasivo e específico de alelo, em particular, para a doença de Machado-Joseph (MJD). A presente divulgação usa tecnologia de silenciamento de RNA (p.ex., interferência de RNA) contra polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) exônicos no gene da ataxina-3, que codificam a proteína ataxina-3 mutante de ganho-de-função dominante, resultando deste modo em um tratamento eficaz para a MJD. Para esse propósito, RNAs silenciadores gênicos altamente específicos para o alvo, cujas sequências antissenso são complementares aos SNPs que estão em desequilíbrio de ligação com a expansão causadora da doença, foram desenhados e testados.
[002] Além do mais, esta divulgação relaciona-se também a um vetor viral adenoassociado selecionado, em particular, o serotipo 9 (AAV9) como um vetor de entrega gênica, após o que os referidos RNAs de fita dupla podem ser entregues no sistema nervoso central (CNS) por vias minimamente invasivas (p.ex., administração intravenosa), uma vez que este serotipo particular atravessa eficientemente a barreira hematoencefálica (BBB).
[003] A doença de Machado-Joseph (MJD) é uma disfunção neurodegenerativa autossômica dominante caracterizada por disfunção cerebelar e perda da coordenação motora. Esta disfunção, que corresponde ao tipo mais comum de ataxia espinocerebelar em todo o mundo, é causada por uma mutação genética na região codificante do gene da ataxina-3 (gene MJD1/ATXN3). A mutação genética envolve um segmento de DNA do gene da ataxina-3 conhecido como a repetição de trinucleotídeos CAG. Normalmente, o segmento CAG no gene da ataxina-3 de humanos é repetido múltiplas vezes, i.e., cerca de 10-42 vezes. Pessoas que desenvolvem a MJD têm uma expansão do número de repetições CAG em pelo menos um alelo. Uma pessoa afetada herda usualmente o alelo mutado de um pai afetado. As pessoas com mais do que 51 repetições CAG podem desenvolver sinais e sintomas da MJD, enquanto as pessoas com 60 ou mais repetições quase sempre desenvolvem a disfunção. O aumento no tamanho da repetição CAG leva à produção de uma proteína ataxina-3 alongada (mutada). Essa proteína é processada na célula em fragmentos mais pequenos que são citotóxicos e que se acumulam e se agregam nos neurônios. Isso desencadeia múltiplos mecanismos patogênicos, levando em última instância à neurodegeneração em várias regiões do cérebro, o que está subjacente aos sinais e sintomas da MJD.
[004] Uma das soluções mais diretas, específicas e eficazes para corrigir a MJD seria inibir a expressão de ataxina-3 mutante usando interferência de RNA (RNAi), visando assim a causa inicial da disfunção. A RNAi é um mecanismo ocorrendo naturalmente que envolve a subregulação específica da sequência do RNA mensageiro (mRNA). A subregulação do mRNA resulta em uma redução da quantidade de proteína que é expressa. A RNAi é desencadeada por RNA de fita dupla (dsRNAs). Uma das fitas do dsRNA é substancial ou completamente complementar ao seu alvo, o mRNA. Essa fita é denominada a fita guia ou fita antissenso. O mecanismo de RNAi envolve a incorporação da fita guia no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Nesse processo, o RISC prefere a fita cuja extremidade 5´ se emparelha mais livremente com seu complemento. O RISC é um complexo de renovação múltipla que, através do emparelhamento de bases complementares, se liga ao seu mRNA alvo. Uma vez ligado ao seu mRNA alvo, ele pode clivar o mRNA ou reduzir a eficiência da tradução. O RISC pode clivar o mRNA entre resíduos emparelhados com os nucleotídeos 10 e 11 da fita guia. A RNAi tem desde a sua descoberta sido amplamente usada para silenciar genes alvo específicos. Os desencadeadores para induzir a RNAi que têm sido empregues envolvem o uso de pequeno RNA interferente (siRNA) ou RNA de grampo curto (shRNA). Adicionalmente, moléculas que podem desencadear naturalmente a RNAi, os assim chamados microRNAs (miRNAs), têm sido usadas para preparar miRNAs artificiais que mimetizam suas contrapartes ocorrendo naturalmente. Essas estratégias têm em comum o fato de proporcionarem moléculas de dsRNA desenhadas para visarem um gene de escolha. As abordagens terapêuticas baseadas em RNAi que utilizam a modalidade específica de sequência de RNAi estão em desenvolvimento e várias estão correntemente em ensaios clínicos.
[005] A interferência de RNA tem sido empregue para visar os genes tanto mutantes como não mutantes da ataxina-3 (WO2005105995, Alves et al., 2010). Em este último caso, não foi mostrado que o silenciamento da proteína ataxina-3 normal em ratos tivesse quaisquer efeitos prejudiciais aparentes. Não obstante, não se sabe se as células neurais no cérebro humano irão tolerar o silenciamento a longo prazo dos genes tanto mutantes como não mutantes da ataxina-3. Portanto, esforços para regular o silenciamento, ou inibir somente o alelo mutante, devem ser explorados, pois será necessária terapia durante décadas para a MJD.
[006] Uma das soluções mais específicas e eficazes seria visar SNPs situados na região codificante do gene da ataxina-3, em particular nucleotídeos base de SNP que estão em desequilíbrio de ligação com o alelo da doença. Por exemplo, a citosina (C) no SNP localizada na extremidade 3´ do trato CAG expandido (C987GG/G987GG: rs12895357) foi descrita como estando em desequilíbrio de ligação com a doença, estando associada à expansão anormal de CAG em 70% dos pacientes com MJD em todo o mundo.
[007] A redução específica de alelo do gene mutante da ataxina-3 tem sido investigada em células (US10072264B2) e em modelos de roedores da MJD (Alves et al., 2008a, Nobrega et al., 2013), por uso de siRNAs ou shRNAs dirigidos à citosina (C) em rs12895357. No entanto, em esses estudos prévios, as sequências desenhadas não permitiram um silenciamento específico do alelo completo do alelo mutante. Além disso, a toxicidade das sequências de silenciamento no sistema nervoso central (CNS) de modelos de roedores não foi avaliada em um tratamento durável ou em animais de tipo selvagem. De fato, foi recentemente relatado que os shRNAs podem levar a toxicidade grave do cérebro em tratamentos a longo prazo ou quando são usadas elevadas doses. Efeitos secundários tóxicos têm sido associados à saturação da maquinaria celular de RNAi e mudanças na expressão de miRNA endógeno. Além disso, o silenciamento prévio específico de alelo e baseado em vírus da ataxina-3 mutante em modelos de roedores envolveu craniotomia e administração direta de vetores virais no parênquima cerebral, que é um procedimento invasivo, associado a potenciais efeitos adversos e resulta em dispersão limitada do vetor em todo o cérebro, não visando deste modo todas as regiões afetadas na MJD.
[008] Estes fatos são divulgados de modo a ilustrar o problema técnico abordado pela presente divulgação.
[009] Como a MJD envolve a expressão de uma proteína ataxina-3 mutante, o seu acúmulo levando à doença, a RNAi proporciona uma oportunidade de tratar a doença pois pode reduzir a expressão dos genes da ataxina-3. O paradigma subjacente a essa abordagem envolve uma redução dos níveis de mRNA da ataxina-3 mutante, enquanto se preserva o mRNA da ataxina-3 normal, para desse modo reduzir os efeitos tóxicos resultantes da proteína ataxina-3 mutante, para alcançar uma redução e/ou atraso de sintomas da MJD ou, mesmo, para prevenir os sintomas da MJD completamente.
[010] A presente divulgação proporciona dsRNAs visando SNP compreendendo uma primeira sequência de RNA e uma segunda sequência de RNA, em que a primeira e a segunda sequência de RNA são substancialmente complementares, em que a primeira sequência de RNA tem um comprimento de sequência de pelo menos 19 nucleotídeos, preferencialmente tem um comprimento de sequência de 19-23 nucleotídeos e é complementar a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19. Os referidos dsRNAs são para uso na indução de RNAi específica de alvo contra genes da ataxina-3 mutantes humanos.
[011] Os dsRNAs visando SNP desta divulgação envolvem direcionamento de SNPs que estão presentes em duas regiões codificantes de alelos da doença, i.e., rs12895357 (éxon 10) e rs1048755 (éxon 8) (FIG. 1). Tais dsRNAs podem ser entregues sozinhos ou em combinação, em uma célula, diretamente através de transfecção ou indiretamente através de entrega de DNA (p.ex., transfecção) ou através de expressão mediada por vetor após o que os dsRNAs podem ser expressos, para visar e reduzir especificamente a expressão de genes da ataxina-3 mutados que compreendem uma citosina (C) (SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5 e 6) ou uma guanina (G) (SEQ ID NO. 8, 9, 10, 11 e 12) no rs12895357 (C987GG/G987GG) - éxon 10; ou uma adenina (A) (SEQ ID NO. 14, 15, 16, 17 e 18) ou uma guanina (G) (SEQ ID NO. 20, 21, 22, 23 e 24) no rs1048755 (A669TG/G669 TG) - éxon
8. Alternativamente, dsRNAs visando SNP podem ser também usados em combinação para visar genes não mutantes e mutantes da ataxina-3.
[012] Em particular, um dos dsRNAs visando SNP desenhados da presente divulgação, cuja primeira fita/sequência é SEQ ID NO. 2, foi capaz de reduzir os níveis de mRNA de proteína ataxina-3 mutante quando disponibilizado em um molde de miRNA, por direcionamento do nucleotídeo C no rs12895357. Esse dsRNA proporcionou uma melhoria, em comparação com um dsRNA visando SNP anterior na técnica, sendo mais específico no direcionamento do gene da ataxina-3 mutante. Quando entregue no corpo estriado de um modelo de camundongo baseado em lentivírus da MJD, através da expressão mediada por AAV9 em um cassete de miRNA foi capaz de reduzir a morte de células neuronais e agregados de ataxina-3 mutante. Além do mais foi capaz de reduzir os déficits de comportamento motor, neuropatologia cerebelar e déficits de biomarcadores de espectroscopia de ressonância magnética em um modelo de camundongo transgênico muito grave da MJD, quando intravenosamente administrado.
[013] Os dsRNAs de acordo com a divulgação podem ser proporcionados como um siRNA, um shRNA, um pré-miRNA ou pri-miRNA. Tais dsRNAs podem ser entregues às células alvo diretamente, p.ex., através de captação celular usando, p.ex., métodos de transfecção. Preferencialmente, a referida entrega é alcançada usando um vetor de terapia gênica, em que um cassete de expressão para o siRNA, shRNA, pré-miRNA ou pri-miRNA é incluído em um vetor. Desse modo, as células podem ser proporcionadas com um fornecimento constante de dsRNAs para alcançar a supressão durável do gene da ataxina-3 sem requerer administração repetida. Preferencialmente, o vetor viral de escolha é AAV9 ou derivados, uma vez que esse serotipo de AAV particular cruza eficientemente a BBB, permitindo a administração intravenosa. O AAV9, AAVrh10 ou derivados, tais como PHP.B ou PHP.eB ou PHP.S, estão disponíveis em https://www.addgene.org/viral-service/aav-prep/.
[014] A corrente divulgação proporciona assim o uso médico de dsRNAs de acordo com a divulgação, tal como o tratamento da MJD, em que tal uso médico pode também compreender um cassete de expressão ou um vetor viral, tal como AAV9, capaz de expressar o referido dsRNA da divulgação.
[015] A presente divulgação relaciona-se a um RNA de fita dupla compreendendo uma primeira fita de RNA e uma segunda fita de RNA, em que:
a primeira fita de RNA e a segunda fita de RNA são substancialmente complementares entre si, preferencialmente a primeira e a segunda fita de RNA são pelo menos 90% complementares entre si; a primeira fita de RNA tem um comprimento de sequência de pelo menos 19 nucleotídeos; a primeira fita de RNA é pelo menos 86% complementar a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19; a primeira fita de RNA é diferente de SEQ ID NO. 26; e um primeiro nucleotídeo da primeira fita de RNA é diferente da citosina.
[016] Em uma modalidade, a primeira fita de RNA pode ter um comprimento de sequência de pelo menos 19 nucleotídeos a 23 nucleotídeos, preferencialmente a primeira fita de RNA pode ter um comprimento de sequência de 20-22 nucleotídeos, mais preferencialmente e para obter melhores resultados a primeira fita de RNA pode ter um comprimento de sequência de 21-22 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente e para obter resultados ainda melhores a primeira fita de RNA pode ter um comprimento de sequência de 22 nucleotídeos.
[017] Em uma modalidade, a primeira fita de RNA pode ser 90% idêntica a SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23 ou 24; preferencialmente 95% idêntica a SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23 ou 24; mais preferencialmente 100 % idêntica a SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23 ou 24.
[018] A identidade foi determinada como resumido na seguinte tabela: Identidade entre duas sequências (em percentagem) Comprimento das duas e número de bases sequencialmente idênticas sequências a serem comparadas (nt) 95% 90% idênticas idênticas 100% idênticas 23 nt 21 22 23 22 nt 20 21 22 21 nt 19 20 21 20 nt 18 19 20 19 nt 17 18 19
[019] Em uma modalidade, a primeira fita de RNA pode ser pelo menos 90% complementar a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19, preferencialmente 95% complementar a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19, mais preferencialmente 99% complementar a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19, ainda mais preferencialmente a primeira fita de RNA é 100% complementar a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19.
[020] Em uma modalidade, a primeira fita de RNA pode ser selecionada de SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23 ou 24.
[021] Em uma modalidade, e para obter melhores resultados, a primeira fita de RNA pode ser complementar a SEQ ID NO. 1 e a primeira fita de RNA pode ser selecionada de SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5 ou 6.
[022] Em uma modalidade, e para se obter ainda melhores resultados, a primeira fita de RNA pode ser SEQ ID NO. 2 ou pode ser SEQ ID NO. 3.
[023] Em uma modalidade, a primeira fita de RNA pode ser complementar a SEQ ID NO. 7 e a primeira fita de RNA pode ser selecionada de SEQ ID NO. 8, 9, 10, 11 ou 12.
[024] Em uma modalidade, a primeira fita de RNA pode ser complementar a SEQ ID NO. 13 e a primeira fita de RNA pode ser selecionada de SEQ ID NO. 14, 15, 16, 17 ou
18.
[025] Em uma modalidade, a primeira fita de RNA pode ser complementar a SEQ ID NO. 19 e a primeira fita de RNA pode ser selecionada de SEQ ID NO. 20, 21, 22, 23 ou
24.
[026] Em uma modalidade, e para obter resultados ainda melhores, o primeiro nucleotídeo da primeira fita de RNA pode ser uma uracila.
[027] Em uma modalidade, o RNA de fita dupla pode estar compreendido em um molde de pré-miRNA, um molde de pri-miRNA, um molde de miRNA, um shRNA ou um siRNA, preferencialmente um molde miRNA ou um shRNA, mais preferencialmente um miRNA.
[028] Em uma modalidade, o RNA de fita dupla pode estar compreendido em um molde de miRNA, preferencialmente derivado de miR-155, tal como aquele descrito por Chung et al. (2006), mais preferencialmente em que o molde baseado em miR155 compreende SEQ ID NO. 27, 28 e 29.
[029] A presente divulgação relaciona-se também a: uma sequência de DNA isolada codificando o RNA de fita dupla agora divulgado, um cassete de expressão compreendendo a referida sequência de DNA isolada ou o referido RNA de fita dupla.
[030] Essa divulgação relaciona-se também a um vetor compreendendo o DNA isolado ou o RNA de fita dupla ou o cassete de expressão, agora divulgado; preferencialmente em que o referido vetor é um vetor viral adenoassociado ou um vetor lentiviral ou um vetor adenoviral ou um vetor não viral; mais preferencialmente em que o vetor viral adenoassociado é AAV9 ou AAVrh10 ou PHP.B ou PHP.eB ou PHP.S.
[031] Essa divulgação relaciona-se também a uma célula hospedeira compreendendo a sequência de DNA isolada ou o RNA de fita dupla ou o cassete de expressão ou o vetor agora divulgado, preferencialmente em que a referida célula hospedeira é uma célula eucariótica, mais preferencialmente em que a referida célula hospedeira é uma célula de mamífero.
[032] Essa divulgação relaciona-se adicionalmente a uma composição compreendendo o DNA isolado ou o RNA de fita dupla ou o cassete de expressão ou o vetor ou a célula hospedeira agora divulgado.
[033] Essa divulgação relaciona-se adicionalmente a um estojo compreendendo a sequência de DNA isolada ou o RNA de fita dupla ou o cassete de expressão ou o vetor ou a célula hospedeira ou a composição agora divulgada.
[034] Além disso, a presente divulgação relaciona-se também ao RNA de fita dupla, um vetor compreendendo a sequência de DNA isolada codificando o referido RNA de fita dupla ou um cassete de expressão compreendendo a referida sequência de DNA isolada, para uso em medicina.
[035] A presente divulgação relaciona-se adicionalmente ao RNA de fita dupla, um vetor compreendendo a sequência de DNA isolada codificando o referido RNA de fita dupla ou um cassete de expressão compreendendo a referida sequência de DNA isolada, para uso no tratamento ou na prevenção de uma doença neurodegenerativa ou no tratamento ou na prevenção dos efeitos citotóxicos da referida doença neurodegenerativa, preferencialmente em que a doença neurodegenerativa pode ser uma doença de repetição de trinucleotídeos, mais preferencialmente em que a doença neurodegenerativa pode ser uma doença de repetição de trinucleotídeos CAG, ainda mais preferencialmente o RNA de fita dupla, o vetor ou cassete de expressão é administrado para regular os níveis de neurometabolitos, preferencialmente para aumentar N-acetilaspartato, para diminuir mio-Inositol, glicerofosfocolina e fosfocolina.
[036] Em uma modalidade, a doença neurodegenerativa é a doença de Machado- Joseph.
[037] Em uma modalidade, o RNA de fita dupla é administrado sistemicamente, intravenosamente, intratumoralmente, oralmente, intranasalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, intravertebralmente, intracerebralmente, intracerebroventriculalmente, intracisternamente, intratecalmente, intraocularmente, intracardiacamente, intradermicamente ou subcutaneamente, preferencialmente intravenosamente, intracisternamente, intratecalmente ou in situ, por administração intracerebral.
[038] Na presente divulgação, o termo complementar significa nucleotídeos de uma sequência de ácidos nucleicos que se podem ligar a uma outra sequência de ácidos nucleicos através de ligações de hidrogênio, i.e., nucleotídeos que são capazes de emparelhamento de bases. As fitas de RNA complementares formam o RNA de fita dupla. Um RNA de fita dupla pode ser formado a partir de duas fitas de RNA complementares separadas ou as duas fitas de RNA complementares podem estar compreendidas em uma fita de RNA. Nas fitas de RNA complementares, os nucleotídeos citosina e guanina (C e G) podem formar um par de bases, guanina e uracila (G e U), e uracila e adenina (U e A).
[039] Na presente divulgação, o termo complementaridade substancial significa que não é requerido ter a primeira e a segunda sequência de RNA totalmente complementares ou ter a primeira sequência de RNA e SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19 totalmente complementares.
[040] Além do mais, na presente divulgação, a complementaridade substancial entre a primeira sequência de RNA e a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19 significa não ter incompatibilidades, um nucleotídeo incompatível, dois nucleotídeos incompatíveis ou três nucleotídeos incompatíveis. Por exemplo, considerando a primeira sequência de
RNA e SEQ ID NO. 1, é entendido que um nucleotídeo incompatível significa que ao longo do comprimento inteiro da primeira sequência de RNA que emparelha entre bases com SEQ ID NO. 1 um nucleotídeo não emparelha entre bases com SEQ ID NO. 1. Não ter incompatibilidades significa que todos os nucleotídeos emparelham entre bases com SEQ ID NO. 1. Ter 2 incompatibilidades significa que dois nucleotídeos não emparelham entre bases com SEQ ID NO. 1. Ter 3 incompatibilidades significa que três nucleotídeos não emparelham entre bases com SEQ ID NO. 1. O mesmo se aplica à primeira sequência de RNA e SEQ ID NO. 7, primeira sequência de RNA e SEQ ID NO. 13 ou primeira sequência de RNA e SEQ ID NO. 19.
[041] Na presente divulgação, a primeira sequência de RNA pode ser também maior do que 19 nucleotídeos; em este cenário, a complementaridade substancial é determinada ao longo do comprimento total de SEQ ID NO. 1. Isso significa que SEQ ID NO. 1 em esta modalidade ou não tem nenhuma, ou tem uma ou duas incompatibilidades ao longo de seu comprimento total quando emparelhada entre bases com a primeira sequência de RNA. A seguinte tabela ilustra o que foi explicado nos parágrafos acima: Emparelhamento entre a primeira fita de RNA e SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou 19 (em percentagem) e número de nucleotídeos incompatíveis Comprimento da primeira fita de RNA (nt) 86% 90% 95% 100 % 23 3 2 1 0 22 3 2 1 0 21 3 2 1 0 20 3 2 1 0 19 3 2 1 0
[042] As seguintes figuras proporcionam modalidades preferenciais para ilustrar a descrição e não devem ser vistas como limitando o escopo da divulgação.
Figura 1: Representação esquemática do gene MJD1 e polimorfismos de nucleotídeo único exônicos rs1048755 e rs12895357. O gene MJD1 é composto por 11 éxons (caixas cinza). A repetição CAG está localizada no éxon 10 e a MJD pode ser causada por mais do que 51 repetições.
Um SNP foi identificado imediatamente após a expansão CAG (nucleotídeo 987) - rs12895357. Os alelos não mutantes exibem tipicamente uma guanina (G) em essa posição, ao passo que os alelos mutantes apresentam uma citosina (C) em 70% dos pacientes com MJD.
Um outro SNP foi identificado no éxon 8 (nucleotídeo 669) - rs1048755. Em este caso, os alelos não mutantes exibem normalmente uma guanina (G) em essa posição, ao passo que os alelos mutantes apresentam uma adenina (A) em 70% dos pacientes com MJD; Figura 2: miR-ATXN3 medeia um silenciamento eficiente e específico de alelo da ataxina-3 mutante in vitro. (a) Representação de microRNAs (miRs) artificiais e construtos de vetor de grampo curto (sh). Um construto de microRNA artificial foi desenhado, com base na sequência de silenciamento SEQ.
ID NO. 2 agora divulgada, para silenciar especificamente a ataxina-3 mutante (miR-ATXN3). Um miRNA de controle (miR-controle), cuja sequência não silencia nenhum RNA de mamífero, foi também desenhado.
Ambos foram inseridos em um esqueleto de vetor de plasmídeo AAV2, sob o controle do promotor U6 e com o gene repórter da EGFP.
Um plasmídeo codificando um shRNA que visa especificamente a ataxina-3 mutante, e conhecido na técnica (Alves et al., 2008a), foi também usado (sh-mutATXN3); b, c) Células Neuro2a (linha celular derivada da crista neural de camundongo) previamente infectadas com vetores lentivirais codificando ataxina-3 mutante humana com 72Q (b) ou ataxina-3 humana de tipo selvagem com 27Q (c) foram transfectadas com plasmídeos codificando miR-Controle (condição de controle), miR-ATXN3 e sh-ATXN3. miR-ATXN3 induziu uma redução de 42,03 ± 6,26% dos níveis de mRNA de ataxina-3 mutante humana, não afetando os níveis de mRNA de tipo selvagem da ataxina-3 humana.
Estes resultados foram apoiados por transferência de Western em d) e e), respectivamente.
Os dados representam a média ± s.e.m.; NS P>0,05, *P<0,05 e **P<0,01. b, c, d, e) Análise de variância unilateral (ANOVA) com teste post-hoc de Bonferroni. miR-Controle n=5; miR- ATXN3 n=5; sh-ATXN3 n=5. Os controles internos para a normalização foram selecionados de acordo com a análise GenEx, correspondendo aos níveis de mRNA endógeno de ataxina-3 e Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de camundongo.
CMV, Intensificador de citomegalovírus; CBA, Promotor da beta-actina de frango; EGFP, Proteína fluorescente verde intensificada; ITR, Repetições terminais invertidas; Figura 3: SEQ ID NO. 3, similarmente a SEQ ID NO. 2 (miR-ATXN3), medeia um silenciamento eficiente e específico de alelo da ataxina-3 mutante in vitro. a, b) Células Neuro2a previamente infectadas com vetores lentivirais codificando ataxina-3 mutante humana com 72Q (a) ou ataxina-3 humana de tipo selvagem com 27Q (b) foram transfectadas com plasmídeos codificando miR-Controle, SEQ ID NO. 2 (miR-ATXN3), SEQ ID NO.3 ou sh-ATXN3. Um construto artificial baseado em miR155 codificando SEQ ID NO. 3 induziu uma redução dos níveis de mRNA de ataxina-3 mutante humana similar a um construto codificando SEQ ID NO. 2 (miR-ATXN3), não afetando os níveis de mRNA de tipo selvagem.
Os dados representam a média ± s.e.m.; NS P>0,05, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001. (a, b) Análise de variância unilateral (ANOVA) com teste post- hoc de Bonferroni. miR-Controle n=5; miR-ATXN3 n=5; SEQ ID NO. 3 n=5 e sh-ATXN3 n=5. Os controles internos para a normalização foram selecionados de acordo com a análise GenEx, correspondendo aos níveis de mRNA endógeno de ataxina-3 e Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de camundongo; Figura 4: o tratamento com miR-ATXN3 não induz alterações nos níveis de mRNA endógeno de Ataxina-3 de camundongo in vitro. (a, b) Células Neuro2a infectadas com (a) ataxina-3 mutante humana (72Q) ou (b) ataxina-3 humana de tipo selvagem (27Q) foram transfectadas com plasmídeos codificando miR-Controle, miR-ATXN3 e sh- ATXN3. Os níveis de expressão relativa de mRNA de ataxina-3 de camundongo foram determinados por PCR quantitativa-transcriptase reversa.
Os dados representam os níveis médios relativos de mRNA ± s.e.m.; ns = p>0,05 em comparação com miR- Controle.
Análise de variância unilateral (ANOVA) com teste post-hoc de Bonferroni. miR-Controle n=5; miR-ATXN3 n=5; sh-ATXN3 n=5;
Figura 5: miR-ATXN3 reduz os níveis de mRNA de ataxina-3 mutante e ataxina-3 agregada mutante e evita a degeneração estriatal após injeção intracraniana em um modelo de camundongo baseado em lentivírus da MJD. (a) Representação esquemática da estratégia usada para gerar um modelo de camundongo baseado em lentivírus estriatal da MJD e para silenciar a ataxina-3 mutante usando AAV9. Camundongos com dez semanas de idade foram bilateralmente coinjetados no corpo estriado com vetores lentivirais codificando ataxina-3 mutante humana com 72Q (LV-Atx3-MUT) e vetores AAV9 codificando miR-ATXN3 no hemisfério direito (AAV9- miR-ATXN3) e miR-Controle no hemisfério esquerdo (AAV9-miR-Controle). Cinco semanas após a cirurgia, os camundongos foram eutanasiados. (b) Imagem de microscopia confocal mostrando uma transdução eficaz de corpo estriado de camundongo do modelo lentiviral estriatal da MJD por ambos os vetores rAAV9. (c) A análise de PCR quantitativa-transcriptase reversa demonstrou que miR-ATXN3 induziu uma diminuição de 63,75 ± 2,25% nos níveis de mRNA da ataxina-3 mutante, em comparação com o hemisfério de controle esquerdo. (d) A análise de transferência de Western confirmou também que a expressão de miR-ATXN3 reduziu significativamente os agregados de ataxina-3 mutante. (e) Imunorreatividade da ubiquitina no corpo estriado de modelo de camundongo baseado em lentivírus estriatal da MJD coinjetado com miR-Controle ou mir-ATXN3. O número total de inclusões de ataxina-3 mutante foi contado e quantificado em (f). Barra de escala, 50 μm. (g) A coloração DARPP-32 revelou uma grande perda de imunorreatividade de DARPP-32 no hemisfério estriatal coinfectado com ataxina-3 mutante humana e miR-Controle.
Barra de escala, 200 μm.
Isto foi quantificado em (h), como volume esgotado de coloração DARPP-32. (i) Coloração com violeta de cresila indicando núcleos picnóticos em ambos os hemisférios.
Um número mais elevado de núcleos picnóticos era visível no hemisfério de controle.
Isto foi quantificado em j). Barra de escala, 20 μm.
Os dados representam a média ± s.e.m.; ns p>0,05, *p<0,05, ***p<0,001 em comparação com o hemisfério de controle. (c, d) Teste t de Student emparelhado. n=5. (f, h) Teste t de Student emparelhado. n=8. (j) Teste t de Student emparelhado. n=4;
Figura 6: Os vetores rAAV9 intravenosamente injetados medeiam uma transdução eficiente de todo o cérebro de camundongos com MJD de tipo selvagem e transgênicos.
Imagens representativas da imuno-histoquímica de GFP (em cinza) nos cérebros de camundongos com 3 meses de idade: A) um camundongo transgênico não injetado; B) um camundongo transgênico sujeito a injeção IV de rAAV9-miR-ATXN3 no dia pós-natal 1; C) um camundongo de tipo selvagem sujeito ao mesmo procedimento.
As imagens mostram a transdução do rAAV9 do cérebro inteiro, cerebelo (CB), hipocampo (HIP), núcleos pontinos (PN) e medula/medula espinhal (Md/SC), obtidas com objetivas 5x e 20x; Figura 7: Os vetores rAAV9 exibem uma transdução eficiente de cerebelos de camundongo transgênico.
Imagens representativas da imuno-histoquímica visível de GFP (em cinza) no cerebelo de um camundongo com 3 meses de idade sujeito a injeção IV neonatal de rAAV9-miR-ATXN3. As imagens foram obtidas com uma objetiva 20x e mostram regiões cerebelares com transdução particularmente eficiente incluindo: núcleos cerebelares profundos (DCN), lóbulos 10, 9, 7 e 6 e células do plexo coroide do quarto ventrículo (4V); Figura 8: O rAAV9 visa as principais regiões de acúmulo de ataxina-3 mutante em cerebelos de camundongo transgénico.
Imagens representativas mostrando imunofluorescência para HA e GFP no cerebelo de um camundongo transgênico sujeito à injeção de rAAV9-miR-ATXN3 em P1. As imagens foram obtidas em um microscópio confocal com uma objetiva 20x. a) Imagem representativa de células de Purkinje positivas para rAAV9, mostrando colocalização de sinais de HA e GFP (cor branca). DCN - núcleos cerebelares profundos; PCL - camada de células de Purkinje; Figura 9: O silenciamento da ataxina-3 mutante melhora o desempenho no rotarod em camundongos transgênicos com MJD. a) Plano experimental em camundongos transgênicos com MJD, dividido em três tarefas importantes: 1) injeção intravenosa de AAV9 em PN1; 2) Avaliação comportamental em 3 momentos diferentes e 3) Sacrifício e análise neuropatológica. b) Desempenho no rotarod a velocidade constante (5 rpm). c) Desempenho no Rotarod em velocidade acelerada.
Os dados são apresentados como tempo de latência médio para queda ±SEM para camundongos de controle (miR-
Controle, n = 11) e camundongos injetados com miR-ATXN3 (n = 8). A análise estatística foi realizada usando o teste t de Student não emparelhado (*P≤0,05, **p<0,01); Figura 10: O tratamento com miR-ATXN3 melhora a natação, desempenho de caminhada na viga e ataxia de marcha em camundongos transgênicos com MJD. a) Os animais foram avaliados com base no tempo que levaram para nadar ao longo de uma piscina e escalar a plataforma.
Os dados são apresentados como tempo de latência média ± SEM. b) Os animais foram avaliados com base em seu desempenho ao caminharem em uma viga redonda de 9 mm.
Considerando o tempo total para atravessar a viga e a coordenação motora, cada animal recebeu uma pontuação.
O padrão de marcha foi analisado por medição: c) largura da base traseira, d) largura da base dianteira e e) sobreposição da pegada (cm). Os dados são apresentados como pontuação de desempenho média ±SEM.
A análise estatística foi realizada usando o teste t de Student não emparelhado (*p<0,05), comparando o desempenho de camundongos de controle (miR-Controle, n = 11) e camundongos injetados com rAAV9- miR-ATXN3 (n = 8); Figura 11: o tratamento com miR-ATXN3 reduz eficientemente o número de agregados de ataxina-3 mutante e preserva eficientemente a espessura da camada molecular. a) Imagens representativas de imunofluorescência marcando a ataxina-3 mutante (HA em branco) no lóbulo 10 do controle (miR-Controle) e camundongos transgênicos tratados (miR-ATXN3). As imagens foram obtidas em um microscópio confocal com uma objetiva 20x. b) Quantificação dos agregados de ataxina-3 mutante por área nos lóbulos 10, 9 e 6. c) Imagens representativas da coloração com violeta de cresila no lóbulo 10 de camundongos transgênicos tratados e de controle, obtidas com uma objetiva 20x. d) Quantificação da espessura da camada molecular nos lóbulos 10, 9 e 6. Os valores correspondem à média ± SEM de três seções específicas para cada animal (miR-Controle, n=11; miR-ATXN3, n = 8). A análise estatística foi realizada usando o teste t de Student não emparelhado (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). ML - espessura da camada molecular; Lob10 - Lóbulo 10; Figura 12: Representação esquemática de possíveis mecanismos subjacentes ao impacto terapêutico de AAV9-miR-ATXN3 na presente divulgação. i) os vetores rAAV9 codificando miR-ATXN3 foram intravenosamente injetados em camundongos transgênicos com MJD neonatais, resultando em ii) silenciamento de ataxina-3 mutante no cerebelo e consequentemente iii) alívio das deficiências neuropatológicas e comportamentais.
Embora os vetores rAAV9 tenham transduzido eficientemente células de Purkinje (PCs) em lóbulos 10 e 9, outros mecanismos poderiam potencialmente aumentar seus níveis de transdução e/ou efeitos benéficos, tais como: 1) Transferência de vetores virais do sangue para o CSF e/ou secreção de construtos de miR para o CSF por células epiteliais transduzidas no plexo coroide; 2) transporte retrógrado de rAAV9 de DCN para camada de PC e/ou transferência de miRs de células transduzidas no DCN para projeções de PC; 3) Transferência ou miRs entre PCs vizinhas; 4) Efeitos neuroprotetores induzidos por PCs positivos para rAAV9. LCR - líquido cefalorraquidiano; DCN - Núcleos Cerebelares Profundos; PC - célula de Purkinje; Figura 13: Diferentes níveis de transdução de rAAV9 se correlacionam com parâmetros neuropatológicos e comportamentais em camundongos tratados. a) Gráfico de regressão linear entre a intensidade média de GFP nos lóbulos 9 e 10 (A.U. = unidades arbitrárias) e o número de agregados/mm2 na mesma região para animais tratados com rAAV9-miR-ATXN3 (n=8) (p=0,0309, R2=0,5675). b) Gráfico de regressão linear entre a intensidade integrada de GFP em todos os lóbulos cerebelares (A.U. = unidades arbitrárias) e latência média para queda no rotarod acelerado para animais tratados com rAAV9-miR-ATXN3 (n=8), considerando todos os momentos (35, 55 e 85 dias). De acordo com a análise de resíduos, um animal foi considerado um outlier para o modelo de regressão linear previsto.
A análise foi realizada sem este animal (p=0,0123, R2=0,7457). A análise estatística foi realizada usando a correlação de Pearson (valor de p bicaudal). As linhas pontilhadas representam os intervalos de confiança de 95%; Figura 14: A injeção IV de rAAV9-miR-ATXN3 não afeta o desempenho no rotarod em camundongos de tipo selvagem. a) Desempenho no Rotarod em velocidade constante (5 r.p.m.). b) Desempenho no Rotarod em velocidade acelerada.
Os dados são apresentados como tempo de latência médio para queda ± _SEM para camundongos de tipo selvagem (miR-Controle, n = 5) e camundongos injetados com
AAV9-miR-ATXN3 (n = 5). A análise estatística foi realizada usando o teste t de Student não emparelhado (ns=não significativo); Figura 15: O tratamento com miR-ATXN3 melhora os níveis de metabólitos-chave no cerebelo. a) Espectroscopia de ressonância magnética: Perfis neuroquímicos cerebelares dos camundongos com miR-controle, miR-ATXN3 e WT aos 75 dias. Os metabolitos NAA, tCol e Ins foram altamente desregulados nos camundongos com MJD transgênicos em comparação com os WT. Os camundongos injetados com rAAV9 miR- ATXN3 apresentaram níveis mais elevados de NAA (marcador neuronal) e níveis mais baixos de Ins e tCo (marcadores de morte celular) em comparação com camundongos controle, demonstrando a eficácia do tratamento com miR-ATXN3. b) As razões NAA/Ins, NAA/tCo e NAA/(Ins+tCo) foram usadas para avaliar a eficácia desta terapia baseada em genes. Todos os valores são apresentados como a média ± SEM e a análise estatística foi realizada usando a ANOVA unidirecional. miR-Controle (n = 8), miR- ATXN3 (n = 7) e WT (n = 8). Os asteriscos indicam uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos, *p<0,05, ****p<0,0001. Ins: mio-inositol, NAA: N- acetilaspartato, tCo: glicerofosfocolina + fosfocolina; Figura 16: Exemplo de um dsRNA da presente divulgação visando o mRNA da ataxina-3 em rs12895357(Citosina) embebido em um molde de miRNA artificial usando pri-miR-155. A primeira sequência/fita de RNA do dsRNA (SEQ ID NO. 2) está ilustrada no retângulo.
[043] A presente divulgação proporciona um dsRNA visando SNP compreendendo uma primeira sequência/fita de RNA e uma segunda sequência/fita de RNA, em que a primeira e a segunda sequências/fitas de RNA são substancialmente complementares entre si, preferencialmente a primeira fita de RNA e a segunda fita de RNA são pelo menos 90% complementares entre si, em que a primeira sequência/fita de RNA tem um comprimento de sequência de pelo menos 19 nucleotídeos, preferencialmente tem uma sequência de 19-23 nucleotídeos, é pelo menos 86% complementar a SEQ ID NO. 1, 7, 13 ou
19. Preferencialmente, a primeira fita de RNA é diferente de SEQ ID NO. 26; e um primeiro nucleotídeo da primeira fita de RNA é diferente da citosina.
[044] Na presente divulgação, para aumentar a eficiência do silenciamento gênico em células de mamífero, todos os dsRNAs visando SNP desenhados, sem exceção, incluem: i) uma uracila (U) na extremidade 5´, ii) pelo menos cinco resíduos de A/U nos primeiros oito nucleotídeos do terminal de extremidade 5´ e iii) a ausência de qualquer trecho de GC de mais do que cinco nucleotídeos em comprimento na primeira fita (fita antissenso).
[045] O silenciamento gênico específico de alelo agora descrito é alcançado por um emparelhamento preciso fora da região semente da primeira sequência/fita de RNA (i.e., antissenso), mais precisamente na posição 12, perto do local de clivagem. A sequência “semente” do terminal 5´ do antissenso (posições 2-8) é complementar a ambos os alelos (i.e., alelo normal e mutante). Portanto, todos os dsRNAs visando SNP selecionados são totalmente complementares ao mRNA contendo o alelo de SNP alvo, mas formam uma incompatibilidade na posição 12 com o mRNA não alvo, permitindo o silenciamento discriminatório.
[046] Seguindo este raciocínio, uma sequência de silenciamento (SEQ ID NO. 2) foi em primeiro lugar desenhada para visar a citosina (C) no SNP localizado na extremidade 3´ do trato de CAG expandido do éxon 10 do gene da ataxina-3 (C987GG/G987GG: rs12895357). O éxon 10 do gene da ataxina-3 tem mais do que 51 repetições CAG quando mutado e um nucleotídeo C após os CAGs sobre-expandidos em 70% dos pacientes com MJD, enquanto o alelo não mutante da ataxina-3 tem tipicamente um G em esta posição (FIG. 1). Isto permite que SEQ ID NO. 2, bem como SEQ ID NO. 3, 4, 5 ou 6, promova o silenciamento específico de alelo da ataxina-3 mutante. SEQ ID NO. 8, 9, 10, 11 ou 12 pode ser aplicada em casos raros onde um nucleotídeo G está presente em esta posição e associado ao alelo mutante. Além disso, qualquer sequência de silenciamento que visa um C no rs12895357 (SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5 ou 6) em combinação com um silenciamento que visa um G em esta posição (SEQ ID NO. 8, 9, 10, 11 ou 12), pode silenciar a ataxina-3 tanto mutante como não mutante, levando a um silenciamento completo da expressão de ataxina-3.
[047] Seguindo o mesmo raciocínio, o SNP exônico rs1048755 (A669TG/G669TG), localizado no éxon 8, pode ser também usado para o silenciamento específico de alelo de genes da ataxina-3 mutantes (FIG. 1). Por exemplo, SEQ ID NO. 14, 15, 16, 17 ou 18 visa uma adenina (A) em esta posição, que está também em desequilíbrio de ligação com a expansão causadora da doença em 70% das famílias com MJD, enquanto SEQ ID NO. 20, 21, 22, 23 ou 24 pode ser usada em situações raras onde um nucleotídeo G em esta posição está associado a um alelo mutante.
[048] Para avaliar o raciocínio usado na presente divulgação para o desenho de sequências de silenciamento específicas de alelo conduzimos em primeiro lugar estudos in vitro para avaliar SEQ ID NO. 2. Subsequentemente, o potencial terapêutico de SEQ ID NO.2 foi testado em dois modelos diferentes de camundongo da MJD, i.e., em um modelo de camundongo da MJD baseado em lentivírus e outro transgênico. Estudos in vitro
[049] Em uma modalidade, um plasmídeo de RNAi baseado em miRNA foi produzido como se segue. Com base na SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO.3, miRNAs artificiais baseados em miR-155 visando o mRNA da ataxina-3 em rs12895357 (miR-ATXN3) foram desenhados. Um miRNA de controle, cuja sequência não silencia nenhum mRNA de mamífero, foi também desenhado (miR-Controle). Ambos os miRNAs artificiais foram subsequentemente clonados em um esqueleto do vírus adenoassociado autocomplementar do serotipo 2 (plasmídeo scAAV2-U6-miRempty-CBA-eGFP), gentilmente fornecido por Miguel Sena-Esteves (UMass Medical School, Gene Therapy Center, Worcester, MA, EUA), que incluem o gene repórter fluorescente verde intensificado (EGFP) e onde o miRNA artificial é dirigido pelo promotor U6 (FIG. 2A).
[050] Em uma modalidade, um plasmídeo codificando um shRNA que visa especificamente a ataxina-3 mutante e é conhecido na técnica (sh-ATXN3) foi produzido como já descrito (Alves et al., 2008a) (FIG. 2A). Similarmente, para SEQ ID NO. 2, sh- ATXN3 (SEQ ID NO. 26) pretende visar um nucleotídeo C no SNP localizado na extremidade 3´ do trato CAG expandido do éxon 10 (rs12895357). A expressão de shRNA é dirigida pelo promotor H1.
[051] Em uma modalidade, os vetores lentivirais codificando ataxina-3 humana de tipo selvagem (LV-WT-ATXN3) e mutante (LV-Mut-ATXN3), com 27Q e 72Q, respectivamente, foram previamente gerados em células HEK293T com um sistema de quatro plasmídeos, como já descrito (Alves et al., 2008b). As partículas lentivirais foram ressuspensas em albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O conteúdo de partículas virais dos lotes foi determinado por avaliação dos níveis de antígeno p24 do HIV-1 (RETROtek, Gentaur, Paris, França). Os estoques virais foram armazenados a -80 °C até ao uso.
[052] Em uma modalidade, a cultura de linha celular derivada da crista neural de camundongo (células Neuro2a) foi obtida como se segue. A linha celular derivada da crista neural de camundongo foi obtida do banco de biologia celular American Type Culture Collection (CCL-131) e mantida em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%, penicilina a 100 U/mL e estreptomicina a 100 mg/mL (Gibco) (meio completo) a 37 °C em atmosfera de 5% CO2/ar.
[053] Em uma modalidade, a infecção de células Neuro2a foi levada a cabo como se segue. Para obter linhas de células neuronais expressando estavelmente ataxina-3 mutante ou não mutante (i.e., tipo selvagem), células Neuro2a foram infectadas com vetores lentivirais codificando a ataxina-3 mutante humana de comprimento total (72Q) com um C em rs12895357 (éxon 10) ou a forma de tipo selvagem (27Q) com um G no mesmo SNP, como previamente descrito. Resumidamente, as células Neuro2a foram incubadas com os respectivos vetores à razão de 10 ng de antígeno p24/105 células, na presença de polibreno.
[054] Em uma modalidade, a transfecção de células Neuro2a foi realizada como se segue. No dia anterior à transfecção, células Neuro2a previamente infectadas com ataxina-3 mutante ou de tipo selvagem usando vetores lentivirais foram plaqueadas em uma placa de doze poços (180.000 células/poço). As células foram transfectadas com os respectivos plasmídeos AAV: miR-Controle, miR-ATXN3 e sh-ATXN3, usando Polietilenimina (PEI) linear, Mw 40.000 (Polysciences, Inc., Warrington, PA, EUA), como reagente de transfecção. Resumidamente, a formação do complexo DNA:PEI foi induzida pela mistura de 10 µL de DMEM, 4 µL de PEI (1 mg/mL) e 800 ng de DNA. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, 500 µL de meio DMEM completo foram adicionados à mistura. Finalmente, as células Neuro2a foram incubadas com 500 µL de solução de transfecção por poço, após remoção de metade do meio. Quarenta e oito horas após transfecção, as células Neuro2a foram lavadas com PBS1X, tratadas com tripsina, coletadas por centrifugação e armazenadas a -80 °C.
[055] Em uma modalidade, a extração de RNA, tratamento com DNase e síntese de cDNA foram levados a cabo como se segue. O RNA total foi isolado usando o Estojo Nucleospin RNA (Macherey Nagel, Düren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, após lise celular, o RNA total foi adsorvido a uma matriz de sílica, lavado com os tampões recomendados e eluído com água isenta de RNase por centrifugação. A quantidade total de RNA foi quantificada por densidade óptica (OD) usando um espectrofotômetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, EUA) e a pureza foi avaliada por medição da razão de OD a 260 e 280 nm.
[056] Em uma modalidade, de modo a evitar a contaminação de DNA genómico e coamplificação, o tratamento com DNAase foi realizado usando Qiagen Conjunto de RNase-free DNase (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o volume final da reação foi 6 μL, contendo 0,6 μL de tampão de DNase, 0,25 μL de DNase e 500 ng de RNA. Após uma incubação de 30 minutos a 37 °C, 0,5 μL de EDTA a 20 mM pH=8 foram adicionados para parar a reação. O passo final foi uma incubação a 65 °C durante 10 minutos.
[057] Em uma modalidade, o cDNA foi, em seguida, obtido por conversão de 420 ng de RNA total utilizando o iScript Select cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura completa, com um volume total de 10 μL, foi preparada usando 2 μL de mistura de reação (5x), 0,5 μL de transcriptase reversa iScript e o volume apropriado de modelo de RNA e água livre de nuclease. A mistura de reação completa foi incubada 5 minutos a 25 °C, seguido por 30 minutos a 42 °C e 5 minutos a 85 °C. Após a reação de transcriptase reversa, as misturas foram armazenadas a -20 °C.
[058] Em uma modalidade, a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizada como se segue. Todas as qPCRs foram realizadas em um sistema Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR (Life technologies, EUA) usando placas de microtitulação de 96 poços e o SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.
[059] Em uma modalidade, as reações foram realizadas em um 20 μL de mistura reacional de volume final contendo 10 μL de SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio- Rad, Hercules, EUA), 10 ng de molde de DNA e 500 nM de iniciadores específicos previamente validados para a ataxina-3 humana, ataxina-3 de camundongo, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de camundongo e hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HPRT) de camundongo de acordo com as diretrizes MIQE. O protocolo de PCR foi iniciado por um programa de desnaturação (95 °C durante 30 segundos), seguido por 40 ciclos de dois passos: desnaturação a 95 °C durante 5 segundos e emparelhamento/extensão a 56 °C durante 10 segundos. O protocolo da curva de fusão começou após os ciclos de amplificação, através de um aumento gradual da temperatura, de 65 a 95 °C, com uma taxa de aquecimento de 0,5 °C/5s.
[060] Em uma modalidade, os valores de limite de ciclo (Ct) foram determinados automaticamente pelo software StepOnePlus (Life technologies, USA). Para cada gene, as curvas padrão foram obtidas, e eficiência da PCR quantitativa foi determinada pelo software. A quantificação relativa do mRNA no que diz respeito às amostras de controle foi determinada pelo método de Pfaff. Os genes de referência ideais foram determinados usando o software GenEx.
[061] Em uma modalidade, a proteína foi extraída de células neuro2a e homogeneizada usando tampão de lise RIPA misturado com um cocktail inibidor de protease e 2 mM de ditiotreitol. O lisado foi adicionalmente sonicado e a concentração de proteína estimada através do método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad). Sessenta microgramas de proteína desnaturada total foram depois carregados em um gel de poliacrilamida com empilhamento a 4%, resolução a 10% para separação eletroforética. As proteínas foram depois transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore) e bloqueadas em leite desnatado a 5%. A imunotransferência foi realizada usando o anticorpo monoclonal antiataxina-3 (1H9, 1:1000; Chemicon) e beta-tubulina. A quantificação densitométrica da ataxina-3 humana mutante ou não mutante e ataxina-3 de camundongo endógena foi relativa à proteína beta-tubulina. Estudos in vivo
[062] Em uma modalidade, a produção de vetores virais adenoassociados do serotipo 9 (AAV9) foi levada a cabo como se segue. Resumidamente, o estoque de vetores foi preparado por transfecção tripla de células HEK293T com precipitação de fosfato de cálcio de construtos AAV (miR-ATXN3 e miR-Controle), pFΔ6 (plasmídeo auxiliar adenoviral) e plasmídeo AAV9 rep/cap, como previamente descrito levando à produção de rAAV9-miR-ATXN3 e rAAV9-miR-Controle. Os vetores AAV9 foram depois purificados por centrifugação em gradiente de iodixanol, seguida por concentração e diálise como previamente descrito. O título do vetor foi determinado por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) com iniciadores específicos e sonda para o elemento poliA do hormônio de crescimento bovino (pBGH).
[063] Em uma modalidade foi avaliada a funcionalidade e eficácia desta estratégia baseada em AAV9 em um modelo de camundongo baseado em lentivírus (LV) da MJD após administração intracraniana (FIG. 5A). Este modelo de camundongo particular permite testar abordagens terapêuticas em um curto espaço de tempo e análise quantitativa dos déficits neuropatológicos induzidos pela expressão da ataxina-3 mutante (Alves et al., 2008 b).
[064] Em uma modalidade, treze camundongos com 10 semanas de idade foram anestesiados e coinjetados bilateralmente no corpo estriado com vetores lentivirais codificando ataxina-3 mutante humana (72Q) (3x105 ng de p24) e vetores rAAV9 codificando um miR artificial visando mRNA de ataxina-3 mutante no hemisfério direito (AAV9-miR-ATAX3) (7x109 genomas virais), e vetores rAAV9 codificando um miR de controle no hemisfério esquerdo (AAV-miR Controle) (7x109 genomas virais) (FIG. 5A).
[065] Em uma modalidade foi realizada transferência de Western de ambos os hemisférios de três animais. Os corpos estriados injetados foram dissecados e homogeneizados usando tampão de lise RIPA misturado com um cocktail de inibidor de protease e 2 mM de ditiotreitol. O lisado foi adicionalmente sonicado e a concentração de proteína estimada através do método de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio- Rad). Sessenta microgramas de proteína desnaturada total foram depois carregados em um gel de poliacrilamida com empilhamento a 4%, resolução a 10% para separação eletroforética. As proteínas foram depois transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore) e bloqueadas em leite desnatado a 5%. A imunotransferência foi realizada usando o anticorpo monoclonal antiataxina 3 (1H9, 1:1000; Chemicon) e antiactina (clone AC-74, 1:5000; Sigma). A quantificação densitométrica da ataxina-3 agregada mutante foi relativa à proteína beta-actina.
[066] Em uma modalidade, as seções coronais mostrando amostragem rostrocaudal completa do corpo estriado (12 seções/animal) foram digitalizadas usando o microscópio Zeiss Axio Imager Z2 com uma objetiva x20. As áreas analisadas do corpo estriado englobaram a região inteira de inclusões de ubiquitina, como revelado pela coloração com o anticorpo antiubiquitina. Todas as inclusões e sua área foram contadas usando um pacote de software de análise automática de imagens (software Image J, EUA).
[067] Em uma modalidade, a extensão da perda de DARPP-32 no corpo estriado foi analisada por digitalização de 12 seções coradas por animal (seções de 25 μm de espessura em intervalos de 200 μm) para obter amostragem rostrocaudal completa do corpo estriado. Para calcular a perda de DARPP-32, as seções foram visualizadas usando o recurso tiles do software Zen (Zeiss). A área esgotada do corpo estriado foi estimada usando a seguinte fórmula: Volume = d (a1 + a2 + a3 +...), onde d é a distância entre as seções em série (200 μm) e a1, a2, a3 são áreas esgotadas em DARPP-32 para seções em série individuais.
[068] Em uma modalidade, a análise quantitativa do número de núcleos picnóticos condensados no corpo estriado foi realizada por análise de 3 seções coradas por animal (fechadas para o rastro da agulha) em intervalos de 200 μm. A quantificação foi realizada manualmente usando o software Adobe Photoshop.
[069] Em uma modalidade, camundongos com MJD transgênicos polyQ69 foram também usados. Este modelo expressa ataxina-3 humana truncada no terminal N com um trato de 69 poliglutaminas especificamente em células de Purkinje cerebelares, sob o controle do promotor L7. Além disso, a proteína mutante exibe um epítopo de hemaglutinina (HA) no terminal amino. Importantemente, o transgene contém o SNP previamente identificado a jusante da expansão de CAG (rs12895357), mostrando portanto complementaridade com miR-ATXN3. Os camundongos transgênicos são caracterizados por um acúmulo de ataxina-3 mutante na camada de células de Purkinje e núcleos cerebelares profundos e atrofia cerebelar pronunciada. Eles exibem um fenótipo atáxico grave começando no dia pós-natal 21 (P21).
[070] Em uma modalidade, a colônia de camundongos transgénicos (fundo de C57BL/6) foi mantida na instalação de alojamento de animais do Centro de Neurociências e Biologia Celular de Coimbra (CNC) por retrocruzamento de machos heterozigotos com fêmeas C57BL/6. Os animais foram alojados em uma sala com temperatura controlada mantida em um ciclo de 12h de luz/12h de escuridão. Alimentos e água foram fornecidos ad libitum. A genotipagem foi realizada por PCR às 4 semanas de idade.
[071] Em uma modalidade, as experiências foram levadas a cabo de acordo com a Diretiva Europeia do Conselho da Comunidade (86/609/CEE) para o cuidado e uso de animais de laboratório. Os investigadores receberam formação adequada (curso certificado pela FELASA) e certificação para realizar as experiências pelas autoridades portuguesas (Direcção Geral de Veterinária).
[072] Em uma modalidade, o desenho experimental foi realizado como se segue. A presente divulgação usou 19 camundongos com MJD heterozigotos fêmeas, injetados no dia pós-natal 1 (P1), com AAV9 codificando miR-ATXN3 (n=8) e AAV9 codificando miR-Controle (n=11) (FIG. 9A).
[073] Em uma modalidade, os camundongos com MJD de controle e tratados foram depois avaliados com base em seu desempenho comportamental e alterações neuropatológicas. Uma bateria de testes comportamentais foi realizada aos 35, 55 e 85 dias. Os camundongos foram sacrificados no dia pós-natal 95 (P95), seguido por análise de patologia cerebral.
[074] Em uma modalidade, a injeção neonatal de AAV9 foi realizada como se segue. As injeções intravenosas foram realizadas na veia facial de camundongos com MJD recém- nascidos e companheiros de ninhada de tipo selvagem (P1). Em um protocolo otimizado, em primeiro lugar os neonatos foram anestesiados utilizando um leito de gelo durante aproximadamente 1 minuto. Após isso, um total de 3,5x1011 vg de vetores AAV9 foram injetados, em um volume total de 50 µL, na veia facial usando uma seringa de calibre 30 (Hamilton, Reno, NV, EUA). Uma injeção correta foi verificada por observação do branqueamento da veia.
[075] Em uma modalidade, o teste comportamental foi realizado como se segue. Os camundongos transgênicos com MJD realizaram uma bateria de testes comportamentais aos 35, 55 e 85 dias de idade, na mesma sala escura e silenciosa com temperatura controlada, após uma hora de aclimatização.
[076] Em uma modalidade, o dispositivo rotarod (Letica Scientific Instruments, Panlab) foi usado de modo a avaliar a coordenação motora e o equilíbrio de camundongos com MJD, por medição de sua latência para queda (em segundos). O desempenho foi analisado no rotarod estacionário, usando uma velocidade constante de 5 rpm, e no rotarod acelerado, no qual a velocidade aumentou gradualmente de 4 para 40 rpm, ambos durante um máximo de 5 minutos. Para cada momento (35, 55 e 85 dias), o teste foi realizado em três dias consecutivos, com um total de quatro ensaios por dia. Entre ensaios subsequentes, os camundongos tiveram um período de repouso de pelo menos 20 minutos. Para análise estatística foi calculada a latência média para queda para cada momento considerando todos os dias consecutivos e ensaios.
[077] Em uma modalidade, de modo a avaliar a possível toxicidade devido ao tratamento, um grupo de camundongos de tipo selvagem sujeitos a injeção IV de rAAV9- miR-ATXN3 (n=5) e rAAV9-miR-Controle (n=5) realizou também testes no rotarod. Em este caso, o teste foi realizado somente no último momento (85 dias) em dois dias consecutivos, com um total de quatro ensaios por dia. Para análise estatística, a latência média para queda foi calculada considerando o segundo dia.
[078] Em uma modalidade, a coordenação de membros dos camundongos com MJD foi também avaliada através do desempenho de natação em um tanque de vidro (70 cm de comprimento, 12,5 cm de largura e paredes com 19,5 cm de altura). A piscina apresenta uma plataforma visível no final e foi cheia com água até ao seu nível (8,5 cm). Os camundongos foram depois colocados em uma extremidade do tanque e foram encorajados a nadar até à plataforma de escape na extremidade oposta. Para cada momento, os animais realizaram quatro ensaios, nadando ao longo do tanque duas vezes por ensaio e com pelo menos 20 minutos de descanso entre ensaios. Seu desempenho foi gravado em vídeo, de modo a se medir o tempo requerido para nadar a distância inteira e subir a plataforma com suas quatro patas. A análise estatística foi baseada nas pontuações médias dos ensaios 2, 3 e 4.
[079] Em uma modalidade, a coordenação motora e o equilíbrio dos camundongos com MJD foram avaliados por avaliação da sua capacidade de cruzar uma série de vigas elevadas. Longas vigas de madeira foram colocadas horizontalmente, 20 cm acima de uma superfície acolchoada com ambas as extremidades montadas em um suporte. Para cada momento, os camundongos realizaram dois ensaios consecutivos em cada viga, progredindo da mais fácil para a mais difícil: vigas com i) 18 mm de largura quadrada, ii) 9 mm de largura quadrada e iii) 9 mm de diâmetro redondo. Para todas elas, os camundongos tiveram de atravessar 40 cm para alcançar uma plataforma de segurança fechada. A latência para cruzar a viga e o desempenho motor foram registrados e pontuados de acordo com uma escala de classificação predefinida.
[080] Em uma modalidade, os padrões de pegadas dos camundongos com MJD foram analisados de modo a comparar diferentes parâmetros de marcha. Após revestir as patas dianteiras e traseiras com tintas não tóxicas vermelhas e azuis respectivamente, os animais foram encorajados a caminhar em uma linha reta em um corredor coberto de papel com 50 cm de comprimento, 10 cm de largura para uma caixa fechada. Para cada momento, cinco passos consecutivos em cada lado, preferencialmente no meio da corrida, foram selecionados para análise. Os valores do comprimento da passada foram medidos, correspondendo à distância entre os membros anteriores e membros posteriores esquerdos e direitos subsequentes. A largura da base posterior e dianteira foi determinada por medição da distância entre as patas traseiras e dianteiras direita e esquerda, respectivamente. De modo a avaliar a uniformidade da alternância dos passos, a sobreposição foi medida como a distância entre a pata dianteira e traseira do mesmo lado. Para cada momento, o valor médio obtido para os cinco passos consecutivos selecionados foi usado para análise estatística.
[081] Em uma modalidade, a aquisição de imagens in vivo foi conduzida com um digitalizador de ressonância magnética 9,4 T de pequenos animais (BioSpec 94/20) com uma configuração de bobina cruzada Bruker padrão usando uma bobina de volume para excitação (86/112 mm de diâmetro interno/externo, respectivamente) e uma bobina de superfície de quadratura de camundongo para detecção de sinal (Bruker Biospin, Ettlingen, Alemanha) no Instituto de Ciências Nucleares Aplicadas à Saúde (ICNAS), Universidade de Coimbra. Análises volumétricas e 1H-MRS foram realizadas.
[082] Em uma modalidade, a preparação de tecidos foi realizada após uma dose excessiva de pentobarbital, os camundongos foram intracardiacamente perfundidos com 1X PBS frio seguido por fixação com paraformaldeído frio a 4% (PFA a 4%). Os cérebros foram depois removidos e pós-fixados em paraformaldeído a 4% durante 24 h a 4 °C e crioprotegidos por incubação em sacarose a 25%/PBS durante 48 h a 4 °C.
[083] Em uma modalidade, para cada animal, 96 seções sagitais de 30 µm foram cortadas ao longo de um hemisfério cerebral utilizando um crióstato (LEICA CM3050S, Alemanha) a -20 °C. Foram depois coletadas e armazenadas em duas placas de 48 poços, como seções de flutuação livre em 1X PBS suplementado com azida de sódio a 0,05% a 4 °C.
[084] Em uma modalidade, o protocolo de imuno-histoquímica foi realizado como previamente relatado (Alves et al., 2010). Para cada animal foram selecionadas oito seções sagitais com uma distância de intersecção de 240 µm.
[085] Em uma modalidade, o procedimento começou com a inibição da peroxidase endógena por incubação das seções em PBS1X contendo Fenil-hidrazina a 0,1% (Merck, EUA), durante 30 minutos a 37 °C. Subsequentemente, o bloqueio e a permeabilização dos tecidos foram realizados em Triton X-100 a 0,1% NGS a 10% (soro de cabra normal, Gibco) preparado em 1X PBS, durante 1 hora à temperatura ambiente. As seções foram depois incubadas durante a noite a 4 °C com o anticorpo primário anti-GFP de coelho (Invitrogen), previamente preparado em solução de bloqueio à diluição apropriada (1:1000). Após três lavagens, fatias de cérebro foram incubadas em anticorpo secundário biotinilado anticoelho (Vector Laboratories) diluído em solução de bloqueio (1:250), à temperatura ambiente durante 2 h. Subsequentemente, as seções de flutuação livre foram enxaguadas e tratadas com o estojo Vectastain ABC (Vector Laboratories) durante 30 minutos à temperatura ambiente, induzindo a formação de complexos Avidina/Peroxidase biotinilada. O sinal foi depois desenvolvido por incubação de fatias com o substrato de peroxidase:tetra-hidrocloreto de 3,3´-diaminobenzidina
(Estojo DAB Substrate, Vector Laboratories). A reação foi parada após alcançar a coloração ideal, por lavagem das seções em 1X PBS. As seções do cérebro foram subsequentemente montadas em lâminas revestidas com gelatina, desidratadas em uma série ascendente de etanol (75, 95 e 100%), depuradas com xileno e finalmente cobertas com uma lamela usando meio de montagem Eukitt (Sigma-Aldrich).
[086] Em uma modalidade, as imagens de seções sagitais do cérebro sujeitas a imuno- histoquímica de GFP foram obtidas no microscópio Zeiss Axio Imager Z2. Imagens do cérebro inteiro foram adquiridas com uma objetiva EC Plan-Neofluar 5×/0,16, ao passo que as imagens de regiões específicas foram obtidas com uma objetiva Plan- Apochromat 20×/0,8.
[087] Em uma modalidade, a imunofluorescência foi também realizada. Para cada animal foram selecionadas oito seções sagitais com uma distância de intersecção de 240 µm. Resumidamente, o protocolo começou com um passo de bloqueio e permeabilização, no qual seções de flutuação livre foram mantidas em Triton X-100 a 0,1% em 1X PBS suplementado com NGS a 10% (soro de cabra normal, Gibco), durante 1 h à temperatura ambiente. Fatias de cérebro foram depois incubadas durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio (NGS a 10%, Triton X-100 a 0,1% em PBS): Anti-HA de camundongo (1:1000, Invivo Gen) e Anti- GFP de coelho (1:1000, Invitrogen). Após três passos de lavagem em 1X PBS, as seções de flutuação livre foram incubadas 2 h à temperatura ambiente em anticorpos secundários acoplados a fluoróforo preparados em solução de bloqueio à diluição apropriada: anticamundongo e anticoelho conjugados a Alexa Fluor 594 e 488 (1:200, Life technologies), respectivamente. Após três passos crescentes em 1X PBS, a coloração nuclear foi realizada usando DAPI (4´,6-diamidino-2- fenilindol). Subsequentemente, as seções do cérebro foram lavadas, montadas em lâminas de microscópio revestidas com gelatina e finalmente cobertas com uma lamela em meio de montagem de fluorescência Dako (S3023).
[088] Em uma modalidade, a coloração com Violeta de cresila foi realizada usando oito seções sagitais com uma distância de interseção de 240 µm por animal. Seções cerebrais selecionadas foram pré-montadas em lâminas revestidas com gelatina e secas à temperatura ambiente. Após terem sido lavadas em água, as seções foram sujeitas à desidratação (usando etanol a 96% e 100%), desengorduramento (usando substituto do xileno) e reidratação (usando etanol a 75% e água). Depois, as lâminas foram imersas em violeta de cresila durante 5 minutos, de modo a corar a substância de Nissl presente nos corpos neuronais. Finalmente, as seções foram lavadas em água, diferenciadas em etanol a 70% e desidratadas por passagem através de soluções de etanol a 96% e 100%. Após um passo de limpeza em xileno, as seções foram montadas com Eukitt (Sigma-Aldrich). Análise quantitativa de imunofluorescência
[089] Após imunofluorescência de GFP e HA, seções sagitais específicas foram selecionadas para adquirir imagens do cerebelo inteiro. Imagens de empilhamento z em série (intervalo = 0,9 μm) foram capturadas por um microscópio confocal (Zeiss Cell Observer Spinning Disk Microscope). As imagens foram adquiridas com objetiva Plan- Apochromat 20×/0,8, usando linhas de lasers de estado sólido (561 nm ou 488) para excitação.
[090] Em uma modalidade, a quantificação da intensidade de fluorescência de GFP média e integrada foi realizada em 3 seções sagitais específicas de animais tratados (corte em um plano sagital 0,48, 0,72 e 0,96 mm lateral à linha média: Diagramas sagitais 105, 107 e 109 em (Franklin e Paxinos)). Imagens do cerebelo inteiro foram adquiridas usando microscopia confocal, como já descrito. Depois foram obtidas as projeções de intensidade máxima para cada seção, utilizando o software Zen Black 2012.
[091] Em uma modalidade, a intensidade de fluorescência de GFP média foi determinada para quantificar o nível de transdução viral em lóbulos cerebelares específicos. Para cada seção, a intensidade de fluorescência de GFP média foi determinada pelo software Zen e calculada após subtração do fundo. Os valores finais correspondem à intensidade média, considerando as três seções analisadas por animal.
[092] Em uma modalidade, a intensidade de fluorescência de GFP integrada foi determinada para os lóbulos cerebelares por inteiro, de modo a comparar os níveis totais de transdução viral em diferentes animais. Em este caso, a intensidade de fluorescência de GFP média foi determinada incluindo todos os lóbulos cerebelares e este valor foi multiplicado pela respectiva área, para calcular a intensidade de fluorescência integrada. Os valores finais correspondem à intensidade média integrada, considerando as três seções analisadas por animal.
[093] Em uma modalidade, a análise quantitativa de agregados marcados com hemaglutinina (HA) foi realizada como se segue. Três seções específicas por animal foram selecionadas para quantificar o número de agregados nos lóbulos 10, 9 e 6 (planos sagitais 0,48, 0,72 e 0,96 mm laterais à linha média para os lóbulos 9 e 10; planos sagitais 0,72, 0,96 e 1,68 mm laterais à linha média para o lóbulo 6, de acordo com (Franklin e Paxinos)).
[094] As imagens foram adquiridas usando um microscópio confocal, como previamente descrito. As projeções de intensidade média foram obtidas para cada seção, usando o software Zen Black 2012. Após quantificação manual do número de agregados em cada lóbulo, o valor foi normalizado com a respectiva área lobular, determinada no software Zen. Os valores finais correspondem ao número médio de agregados/mm2 nas três seções selecionadas por animal. Ambos os grupos tratado e de controle foram incluídos em esta análise.
[095] Em uma modalidade, a quantificação da espessura da camada molecular foi levada a cabo como se segue. Três seções específicas por animal foram selecionadas para quantificar a espessura da camada molecular nos lóbulos 10, 9 e 6, após coloração com violeta de cresila (planos sagitais 0,48, 0,72 e 0,96 mm laterais à linha média para os lóbulos 9 e 10; planos sagitais 0,72, 0,96 e 1,68 mm laterais à linha média para o lóbulo 6, de acordo com (Franklin e Paxinos)).
[096] Em uma modalidade, as imagens do cerebelo inteiro foram obtidas no microscópio Zeiss Axio Imager Z2 com uma objetiva Plan-Apochromat 20×/0,8 e analisadas com o software Zen Blue.
[097] Em uma modalidade, para cada seção, a espessura da camada molecular foi calculada separadamente nos lóbulos 10, 9 e 6, usando três medições em regiões específicas predefinidas. Os valores finais correspondem à espessura média da camada molecular no respectivo lóbulo, considerando as três seções selecionadas por animal. Ambos os grupos tratado e de controle foram incluídos em esta análise.
[098] Em uma modalidade, a análise estatística foi realizada usando o software Prism GraphPad. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM) e os outliers foram removidos de acordo com o teste de Grubb (alfa=0,05). O teste t de Student não emparelhado foi realizado para comparar os grupos de controle e tratado, ao passo que o teste ANOVA unidirecional foi usado para comparações múltiplas. As correlações entre os parâmetros foram determinadas de acordo com o coeficiente de correlação de Pearson. A significância foi determinada de acordo com os seguintes critérios: p>0,05 = não significativo (ns); *p<0,05, **p<0,01 ***p<0,001 e ****p<0,0001.
[099] A presente divulgação relaciona-se a dsRNAs visando SNP que podem visar e reduzir especificamente os níveis da proteína ataxina-3 mutante humana, enquanto mantêm os níveis da forma não mutante.
[100] A presente divulgação relaciona-se, em particular, a uma sequência de dsRNA (SEQ ID NO. 2) que foi desenhada para visar precisamente o nucleotídeo C no SNP localizado na extremidade 3´ do trato CAG expandido do éxon 10 do gene da ataxina-3 (rs12895357), que foi relatado como estando associado à expansão anormal de CAG em 70% dos pacientes com MJD em todo o mundo (FIG. 1).
[101] Em uma modalidade, SEQ ID NO. 2 foi incorporada em um molde de miR-155, gerando um microRNA artificial (Fig. 16). Em paralelo, uma sequência de controle (SEQ. ID NO. 25), que não silencia nenhum mRNA de mamífero, foi também usada e incorporada em um molde de miR-155. Ambos os miRNAs artificiais foram clonados em esqueletos de AAV2 autocomplementares sob o controle do promotor U6 e com EGFP como gene repórter (miR-Controle e miR-ATXN3) (Fig. 2A).
[102] De modo a confirmar a capacidade de silenciamento e a especificidade desta nova sequência de silenciamento, o plasmídeo miR-ATXN3 foi transfectado em uma linha celular derivada da crista neural de camundongo (Neuro2a), previamente infectada com vetores lentivirais estavelmente expressando: i) ataxina-3 mutante humana (72Q) com um nucleotídeo C no rs12895357 ou ii) ataxina-3 de tipo selvagem humana (27Q) com um nucleotídeo G no rs12895357. O plasmídeo miR-Controle foi usado como o controle negativo e um plasmídeo lentiviral codificando um sh-ATXN3 conhecido na técnica como silenciando a ataxina-3 mutante humana (SEQ ID NO. 26) foi usado como um controle positivo (FIG. 2A).
[103] De acordo com os resultados da PCR quantitativa-transcriptase reversa (qPCR), a transfecção com o plasmídeo miR-ATXN3 resultou em uma redução de 42,03% ± 6,26% nos níveis de mRNA da ataxina-3 mutante, próximo do que ocorre na presença de sh-ATXN3 (FIG. 2B). No entanto, em contraste com sh-ATXN3, nenhumas alterações foram detectadas nos níveis de mRNA de ataxina-3 de tipo selvagem após transfecção com o plasmídeo mut-ATXN3 (FIG. 2C), provando que SEQ ID NO. 2 visa precisamente o nucleótido C no SNP rs12895357 permitindo o silenciamento específico de alelo da ataxina-3 humana. Resultados similares foram obtidos usando um construto de miRNA- 155 artificial codificando SEQ ID NO. 3, como ilustrado na FIG. 3.
[104] Em termos de níveis de proteína, miR-ATXN3 foi tão eficaz quanto sh-ATXN3 na redução dos níveis da proteína ataxina-3 mutante (FIG. 2D) (miR-ATXN: 50,66 ± 8,34% versus sh-ATXN3: 55,65 ± 6,04%); no entanto foi muito mais seletivo. De fato, nenhumas alterações nos níveis de proteína de tipo selvagem foram detectadas após transfecção com o plasmídeo miR-ATXN3, enquanto sh-ATXN3 induziu uma redução significativa dos níveis de mRNA da ataxina-3 de tipo selvagem humana em células Neuro2a expressando a forma de tipo selvagem (FIG. 2E).
[105] Em conjunto, isto indica que a estratégia baseada em miR agora divulgada retém a capacidade de silenciamento da ataxina-3 mutante de sequências previamente relatadas na técnica, mas que é muito mais seletiva. Isto significa que miR-ATXN3 permite a discriminação entre os transcritos mutantes e de tipo selvagem, mantendo deste modo as funções normais da ataxina-3, uma vantagem significativa quando se traduz esta abordagem terapêutica para pacientes humanos.
[106] Além disso, nenhumas alterações nos níveis de mRNA endógeno de ataxina-3 de camundongo foram detectadas (Fig. 4), provando que o efeito de silenciamento é específico para o mRNA da ataxina-3 humana.
[107] Para explorar o potencial terapêutico de SEQ ID NO. 2 in vivo, os plasmídeos de AAV miR-ATXN3 e miR-Controle foram empacotados em capsídeos rAAV9. O vetor AAV foi considerado a plataforma preferida para a entrega gênica ao CNS, dada a sua transdução neuronal eficiente, expressão transgênica a longo prazo e perfil de segurança. Em particular, o serotipo 9 de AAV (AAV9) tem também a capacidade de contornar a BBB em roedores de tipo selvagem, gatos, primatas não humanos e humano, permitindo a injeção intravenosa (IV).
[108] miR-ATXN3 foi testado em dois modelos de camundongo diferentes da MJD, i.e., em um modelo da MJD baseado em lentivírus e de camundongos transgênico, por administração intraparenquimatosa e intravenosa, respectivamente.
[109] Em primeiro lugar avaliámos a funcionalidade e a eficácia de miR-ATXN3 em um modelo de camundongo baseado em lentivírus (LV) da MJD após administração intracraniana (IC). Este modelo de camundongo permite testar abordagens terapêuticas em um curto espaço de tempo e uma análise quantitativa precisa dos déficits neuropatológicos induzidos pela expressão da ataxina-3 mutante (Alves et al., 2008b). Portanto, treze camundongos com 10 semanas de idade foram coinjetados bilateralmente no corpo estriado com vetores lentivirais (LVs) codificando a ataxina-3 mutante humana com 72 repetições CAG (LV-Atx3-MUT) e vetores rAAV9 codificando miR-ATXN3 no hemisfério direito e vetores rAAV9 codificando um miR-Controle no hemisfério esquerdo (FIG. 5A).
[110] Cinco semanas após injeção, cinco camundongos foram sacrificados para avaliar os níveis de expressão de mRNA de ataxina-3 mutante (por qPCR) e os níveis de proteína ataxina-3 agregada mutante (por transferência de Western) e oito camundongos foram perfundidos e sacrificados para análise de imuno-histoquímica (EGFP, antiubiquitina, DARPP-32, violeta de cresila).
[111] Como ilustrado na FIG. 5B, a microscopia de fluorescência mostrou que a administração intracraniana de vetores AAV9 foi eficaz em ambos os hemisférios, como pode ser visto pela expressão intensa do gene repórter de EGFP.
[112] Por qPCR (Fig. 5C) e por transferência de Western (Fig. 5D) foi observado que a expressão de miR-ATXN3 induziu uma diminuição de 63,75 ± 2,25% nos níveis de mRNA no corpo estriado de ataxina-3 mutante e uma diminuição de 37,64 ± 4,52% na forma agregada da ataxina 3 mutante, respectivamente, em comparação com o hemisfério de controle esquerdo.
[113] Uma vez que a presença de inclusões intranucleares neuronais contendo ataxina- 3 agregada é uma característica importante da MJD, em seguida foi avaliado o potencial do tratamento com miR-ATXN3 para diminuir o número total e o tamanho das inclusões positivas para ubiquitina após administração IC. Em comparação com o hemisfério de controle esquerdo foi observada uma eliminação do número de agregados no hemisfério injetado com rAAV9 codificando miR-ATXN3, demonstrando a eficácia do tratamento (FIG. 5 E e F).
[114] Depois, para avaliar se esta estratégia poderia mediar a neuroproteção estriatal, foi realizada uma imuno-histoquímica contra DARPP-32, um regulador da sinalização do receptor de dopamina e um marcador sensível para a disfunção neuronal, que demonstrámos previamente ser um marcador sensível para detectar a disfunção neuronal precoce no modelo da MJD baseado em LV (Alves et al., 2008b). A administração intracraniana de miR-ATXN3 diminuiu a lesão esgotada em DARP-32 (em 80,87%) em comparação com miR-Controle (Fig. 5 G e H).
[115] Finalmente, a coloração com violeta de cresila foi realizada para avaliar a lesão celular devido à expressão de ataxina-3 mutante e uma clara redução de núcleos hipercromáticos foi observada no hemisfério tratado à direita (aproximadamente 30%) (Fig. 5 I e J).
[116] Globalmente, estes resultados mostram que o silenciamento específico de alelo da ataxina-3 mutante baseado na estratégia baseada em AAV9 foi eficaz na redução dos níveis de mRNA da ataxina-3 mutante e proteína agregada mutante após injeção IC. Isto promoveu a eliminação de inclusões positivas para ubiquitina, prevenindo lesão celular e degeneração estriatal.
[117] Em seguida, exploramos a capacidade de vetores rAAV9 desenvolvidos de transpor a BBB e de transduzir neurônios após injeção intravenosa em um modelo de camundongo transgênico gravemente prejudicado da MJD (camundongos transgênicos PolyQ69) e em seus companheiros de ninhada de tipo selvagem em P1. Este modelo de camundongo transgênico expressa uma forma truncada da ataxina-3 humana contendo 69 repetições de glutamina especificamente nas células de Purkinje (PCs) cerebelares e desenvolve um fenótipo patológico grave e de início precoce (P21). Além disso, este modelo de camundongo transgênico com MJD permite a avaliação de estratégias específicas de alelo, pois a ataxina-3 humana truncada carrega a variante C no SNP rs12895357, presente em 70% dos pacientes com MJD.
[118] De fato, para obter impacto terapêutico em camundongos transgênicos PolyQ69, os vetores rAAV9 injetados IV têm de contornar a BBB e transduzir eficientemente o cérebro. Em resultado, o estudo da distribuição de rAAV9 no cérebro de camundongo transgênico com MJD, após sacrifício aos 95 dias de idade, foi levado a cabo. Para esse propósito foi levada a cabo a imuno-histoquímica de seções sagitais do cérebro usando um anticorpo contra a proteína fluorescente verde (GFP), o gene repórter presente nos plasmídeos de AAV. Para além de analisar seções de camundongos transgênicos injetados com rAAV9 usámos também um camundongo com MJD não injetado como um controle negativo e um camundongo de tipo selvagem (WT) injetado com rAAV9 para comparar a distribuição de rAAV9 (FIG. 6).
[119] O padrão de expressão de GFP foi muito similar nos camundongos transgênicos, em ambos os grupos de controle e tratado, sujeitos à injeção IV de rAAV9. Se provou que o vetor se espalha eficientemente por todo o cérebro, incluindo regiões normalmente afetadas na MJD tais como o cerebelo, tronco cerebral, medula espinhal e corpo estriado. Em particular, os núcleos pontinos, que é um dos principais locais de degeneração na MJD, mostraram grande expressão transgênica. Outras áreas eficientemente transduzidas incluíram o córtex cerebral, o bulbo olfatório e o hipocampo. A injeção IV de rAAV9 na veia da cauda de animais adultos transgênicos também mediou uma transdução eficaz do cérebro de camundongo. A principal diferença observada entre animais transgênicos e de tipo selvagem corresponde à expressão de GFP cerebelar. De fato, os animais com MJD exibem um sinal de GFP mais fraco e espacialmente limitado, em comparação com a expressão transgênica robusta no cerebelo inteiro de camundongos WT (FIG. 6B e C). Estas observações poderiam ser explicadas por defeitos de vascularização cerebelar em este modelo animal transgênico particular, que já foram relatados.
[120] Dado que a expressão da ataxina-3 mutante humana é restrita às PCs cerebelares de camundongos transgênicos polyQ69 com MJD, a ação terapêutica de rAAV9-miR-
ATXN3 depende grandemente da capacidade do vetor de transduzir o cerebelo, particularmente este subtipo celular. Portanto foi analisada em mais detalhe a distribuição do sinal de GFP em esta região, após processamento imuno-histoquímico. Como mostrado na FIG. 7, a expressão de GFP não foi igualmente distribuída por todo o cerebelo, sendo particularmente evidente no lóbulo cerebelar 10, seguido pelos núcleos cerebelares profundos (DCN, provavelmente a região mais afetada precocemente na MJD) e lóbulo 9. Neurônios isolados transduzidos foram também detectados nos lóbulos 6 e 7 e nos lóbulos restantes, embora em menor proporção. Importantemente, as células do plexo coroide do quarto ventrículo exibiram também uma expressão de GFP marcada. Este padrão de distribuição de GFP foi observado para todos os animais transgênicos sujeitos à injeção IV de rAAV9, incluindo os grupos de controle e tratado.
[121] Esta transdução cerebelar preferencial nos lóbulos 9 e 10 poderia ocorrer devido a uma melhor vascularização em esta região ou provavelmente devido à sua proximidade com o plexo coroide do quarto ventrículo. O plexo coroide (PC) é composto por uma monocamada de células epiteliais, que são responsáveis pela produção do líquido cefalorraquidiano (CSF) e constituem uma barreira entre o sangue e o CSF - a barreira sangue-CSF (BCSFB). Portanto, os vetores rAAV9 circulantes no sangue alcançando o CP poderiam eventualmente contornar a BCSFB e passar para o CSF. Uma vez o lóbulo 10 está próximo do CP e no caminho do fluxo do CSF, o acesso do rAAV9 às PCs ocorreria preferencialmente em esta região cerebelar.
[122] Finalmente foi avaliado se rAAV9 visa a população de células maioritariamente afetada em este modelo de camundongo, i.e., as PCs que expressam a ataxina-3 mutante. Para isso foi realizada uma coimunofluorescência marcando tanto GFP como hemaglutinina (HA). Como esperado, o sinal de HA foi detectado na camada de células PC, na qual a ataxina-3 mutante estava distribuída por todo o soma com uma coloração difusa e na forma de agregados (FIG. 8). Além disso, agregados mutantes de ataxina-3 foram também detectados nos terminais dos axônios das PCs, em núcleos cerebelares profundos (DCN). Quando se compara a distribuição dos sinais de GFP e HA foi observada uma colocalização na camada de PC e no DCN, as duas principais regiões de acúmulo da ataxina-3 mutante (FIG. 8). Esta última descoberta indica que os vetores AAV podem ser transportados retrogradamente do DCN para as PCs, contribuindo para o impacto terapêutico. Além do mais, a transdução de rAAV9 em DCN poderia ser também benéfica em pacientes com a MJD uma vez que esta região é gravemente afetada no contexto da doença. Este padrão foi similar para todos os camundongos injetados IV com rAAV9, incluindo grupos de controle e tratado.
[123] Na presente divulgação foi também investigado se a injeção de rAAV9-miR ATXN3 aliviaria os déficits comportamentais associados à MJD. Os sintomas mais comuns da MJD incluem deficiências na coordenação motora e no equilíbrio, bem como na marcha atáxica. Os camundongos transgênicos PolyQ69 mimetizam com sucesso estas características, mostrando um fenótipo atáxico extremamente grave com um início precoce (P21). Estas deficiências comportamentais ocorrem devido à disfunção das PC, uma subpopulação neuronal com papéis importantes na coordenação motora e na aprendizagem. De fato, as PCs são vulneráveis e facilmente danificadas levando a uma capacidade de controle motor deficiente.
[124] De modo a explorar o impacto do tratamento com miR-ATXN3 no comportamento de camundongos transgênicos, os animais tanto tratados como de controle, i.e., que receberam uma injeção intravenosa P1 de vetores rAAV9 codificando miR-ATXN3 ou miR-Controle, respectivamente, foram sujeitos a uma bateria de testes em três idades diferentes: 35, 55 e 85 dias (FIG. 9A). Estes testes incluíram rotarod estacionário e acelerado, bem como teste de caminhada na viga, uma vez que são apropriados para avaliar o equilíbrio e a coordenação motora. Adicionalmente, o teste de natação permitiu uma avaliação adicional do desempenho motor e da força. Por outro lado, a análise da pegada nos permitiu avaliar os déficits de marcha associados à MJD.
[125] O desempenho no rotarod foi determinado como o tempo de latência médio para queda quando os camundongos andam em um dispositivo de rotarod em velocidades constantes e aceleradas. O tratamento provou ter efeitos benéficos em todos os momentos e para ambos os paradigmas (FIG. 9B e C). Os resultados mais consistentes foram obtidos aos 85 dias, uma vez que esta melhoria foi estatisticamente significativa para o rotarod tanto estacionário como acelerado (aumento de 1,7 e 1,5 vezes no tempo de latência para queda, respectivamente).
[126] No teste de natação, os camundongos foram colocados em uma extremidade de um tanque de vidro cheio de água e foram encorajados a nadar através da piscina e escalar uma plataforma. Foi registrado o tempo requerido para cada animal nadar a distância inteira e subir a plataforma. De acordo com os resultados, os animais tratados mostraram um melhor desempenho aos 55 dias (FIG. 10A).
[127] No teste de caminhada na viga, os camundongos cruzaram um viga elevada redonda com i) largura quadrada de 18 mm, ii) largura quadrada de 9 mm e iii) diâmetro de 9 mm. Os animais foram avaliados com base no tempo que levaram para completar a caminhada e na sua coordenação motora. O desempenho foi pontuado de acordo com uma escala de classificação predefinida, na qual pontuações mais elevadas indicam um melhor equilíbrio e coordenação. De acordo com esta análise, nenhumas diferenças foram detectadas diferenças entre os grupos de controle e tratado para as vigas com largura quadrada de 18 mm e 9 mm. Não obstante, os animais exibiram desempenhos distintos na viga redonda com diâmetro de 9 mm, que é considerada a mais difícil de atravessar (FIG. 10B). No grupo de controle foi observada uma redução progressiva na pontuação de desempenho ao longo do tempo, enquanto os camundongos tratados retiveram sua capacidade de atravessar a viga. Em resultado, os animais injetados com rAAV9-miR-ATXN3 apresentaram um desempenho significativamente melhor no teste de caminhada na viga no último momento (aumento de 2,2 vezes na pontuação média) (FIG. 10B).
[128] De modo a avaliar se o tratamento foi capaz de atenuar a ataxia dos membros e marcha característica da MJD, o padrão de pegada de ambos os grupos experimentais foi analisado. A marcha atáxica é normalmente caracterizada por: i) uma largura da passada aumentada; ii) um comprimento de passada mais curto e iii) uma distância de sobreposição aumentada, que reflete a uniformidade reduzida da alternância de passos. A análise dos padrões de marcha de animais tratados, em comparação com o grupo de controle, revelou várias melhorias em diferentes momentos, maioritariamente: uma diminuição significativa na largura da base posterior e dianteira, aos 55 e 35 dias,
respectivamente. Adicionalmente, no último momento (85 dias), foi detectada uma redução significativa na distância de sobreposição da pegada (FIG. 10C, D e E).
[129] Globalmente, os animais tratados mostraram um melhor desempenho em todos os testes comportamentais, com resultados significativos no rotarod, natação, caminhada na viga e análise de pegada, indicando uma melhoria geral nas habilidades motoras (FIG. 9 e 10). Este é o primeiro relato de melhoria comportamental significativa após silenciamento da ataxina-3 mediado por AAV e a primeira vez que a injeção de rAAV9-IV demonstrou um impacto comportamental positivo em disfunções de PolyQ.
[130] Em conjunto, isto indica um impacto terapêutico superior para a nossa estratégia, possivelmente devido à seletividade dos dsRNAs visando SNP da presente divulgação, serotipo selecionado e via de entrega.
[131] Subsequentemente, o impacto da injeção de rAAV9-miR-ATXN3 nas mudanças neuropatológicas associadas à MJD foi também avaliado. Uma das principais características da MJD consiste no acúmulo de agregados de ataxina-3 mutante, que refletem a progressão da doença. No modelo de camundongo selecionado, estes agregados são formados em PCs começando em P40 e aumentando marcadamente em número e tamanho ao longo do tempo.
[132] Portanto, uma imunofluorescência para hemaglutinina (HA) em seções sagitais de camundongos com MJD tratados e de controle foi realizada, uma vez que este marcador está presente no terminal N da ataxina-3 mutante (FIG. 11A). Depois foi quantificado o número de agregados de ataxina-3 mutante por área nos lóbulos cerebelares 10 e 9, uma vez que correspondem à região com níveis de transdução mais elevados. De modo a avaliar o impacto do tratamento com rAAV9 em regiões com baixa eficiência de transdução, o lóbulo 6 foi também analisado. De acordo com os resultados agora divulgados, o tratamento com miR-ATXN3 reduziu a agregação em todos os três lóbulos analisados (diminuição de 35%, 18% e 20% nos lóbulos 10, 9 e 6, respectivamente), contribuindo deste modo para a atenuação da neuropatologia (FIG. 11B).
[133] Uma outra característica importante em pacientes com a MJD inclui a atrofia cerebelar, que ocorre em consequência da neurodegeneração em esta região e apresenta normalmente uma correlação com sintomas clínicos. Em este modelo de camundongo particular, uma atrofia cerebelar marcada é detectada logo às 3 semanas de idade. Conformemente, a degeneração ou alternâncias funcionais/morfológicas em PCs poderiam afetar outras regiões cerebelares devido à forte interconexão entre tipos celulares distintos. Em particular, os camundongos transgênicos Q69 são caracterizados por uma pobre arborização dendrítica em PCs, reduzindo consequentemente a espessura da camada molecular. Portanto, a coloração com violeta de cresila foi realizada em seções sagitais de ambos os grupos experimentais, de modo a distinguir as camadas cerebelares (FIG. 11C). Por análise da camada molecular, uma espessura significativamente maior foi encontrada nos lóbulos 10 e 9 de camundongos tratados com miR-ATXN3 (21% e 15% respectivamente), bem como uma forte tendência no lóbulo 6 (13%, p=0,0587) (FIG. 11D).
[134] Em conjunto, os resultados agora divulgados demonstram que o silenciamento da ataxina-3 mutante através da injeção IV de rAAV9 é uma abordagem terapêutica eficiente em camundongos transgênicos com MJD, aliviando as deficiências tanto comportamentais como neuropatológicas. Importantemente, estes efeitos positivos foram obtidos em um modelo muito grave com um início precoce, que já poderia exibir defeitos neurológicos e de vascularização no dia do nascimento. Portanto, um impacto ainda mais significativo pode ser previsto se se testar esta estratégia em outros modelos da MJD, que apresentam um fenótipo tardio e leve.
[135] Embora as primeiras observações dizendo respeito à distribuição de rAAV9 em camundongos transgénicos com MJD tenham sugerido uma resposta terapêutica localizada somente no lóbulo 10, um efeito muito generalizado foi detectado no cerebelo inteiro e no comportamento dos camundongos. Se poderia especular que a transdução altamente eficiente do lóbulo 10 poderia ser suficiente para induzir melhorias no teste de caminhada na viga ou no rotarod, uma vez que este lóbulo é parte do sistema vestibular, sendo importante para o equilíbrio. No entanto, somente um efeito benéfico global poderia explicar o melhor desempenho geral dos camundongos tratados, especialmente em testes explorando a coordenação motora, a força e a marcha. Uma possível explicação é que as PCs transduzidas em outros lóbulos, embora escassas, poderiam ser suficientes para induzir efeitos positivos na respectiva região. Isto pode ocorrer através de uma ação neuroprotetora induzida por PCs positivas para rAAV9 no cerebelo inteiro, por liberação de fatores neurotróficos ou inibição da neuroinflamação, por exemplo. Alternativamente, as PCs transduzidas poderiam transferir moléculas de miR- ATXN3 para as células vizinhas. Portanto, as PCs transduzidas poderiam comunicar com neurônios negativos para rAAV9 através da possível transferência de miRs individuais e/ou usando vesículas extracelulares contendo miR-ATXN3. Usando um mecanismo similar, as células transduzidas no DCN podem também liberar construtos de miR- ATXN3, que são depois entregues às projeções de PC. Finalmente, o fato de as células epiteliais CP serem elas próprias transduzidas por rAAV9 poderia contribuir para nossas descobertas. Conformemente, a terapia gênica dirigida por CP tem sido investigada no contexto de disfunções de armazenamento lisossomal, onde permite a secreção contínua de proteínas terapêuticas no CSF, levando a efeitos benéficos. Similarmente, as células epiteliais CP podem secretar miRNAs incorporados em vesículas extracelulares. Com base nisso é possível que células CP positivas para rAAV9 no quarto ventrículo possam transferir vesículas extracelulares contendo miR-ATXN3 para o CSF, que depois exercem sua ação silenciadora no cerebelo. A FIG. 12 resume os possíveis mecanismos subjacentes ao impacto terapêutico de rAAV9-miR-ATXN3 na presente divulgação.
[136] Foi também avaliado se o efeito terapêutico em camundongos tratados é dependente dos níveis de transdução cerebelar de rAAV9. O fato de animais particulares apresentarem uma melhoria comportamental ou atenuação neuropatológica mais evidente poderia ser explicado por uma dose mais elevada de vetor transduzindo PCs.
[137] Para esse propósito, a fluorescência média de GFP foi analisada nos lóbulos 10 e 9, bem como o número de agregados por área na respectiva região. Uma correlação inversa entre estes dois parâmetros foi encontrada, levando à conclusão de que níveis de transdução mais elevados nos lóbulos 10 e 9 são acompanhados por uma melhoria na eliminação de agregados (FIG. 13A). No entanto, a mesma relação não pôde ser estabelecida para o lóbulo 6, indicando que efeitos benéficos em esta região particular poderiam depender de outros parâmetros.
[138] Além disso foi avaliado se camundongos com transdução cerebelar superior correspondem àqueles com melhor desempenho motor. Em este contexto, uma relação positiva entre a intensidade integrada de GFP em todos os lóbulos cerebelares e o desempenho médio no rotarod acelerado foi encontrada (Fig. 13B).
[139] Tomando tudo isto em consideração foi concluído que a variabilidade observada nos animais tratados para testes comportamentais e sinais neuropatológicos pode ser causada por diferentes eficiências de transdução. Isto pode ser devido à demanda técnica de administração intrafacial em camundongos neonatos, combinada com o grande volume injetado, ou ao fato de alguns animais poderem ter recebido diferentes doses do vetor. Além disso, a quantidade de partículas virais que alcançam o cerebelo pode também variar entre diferentes animais, possivelmente devido a diferenças na vascularização ou nos níveis do receptor de AAV.
[140] Em resumo, a injeção de rAAV9-miR-ATXN3 induz uma resposta dependente da dose, uma vez que concentrações de vetor mais elevadas no cerebelo correspondem a um efeito terapêutico mais potente. Assim, com base em estes resultados, pode ser concluído que o efeito terapêutico poderia ser potencialmente maximizado por aumento das doses de vetor injetadas, i.e., o número de partículas virais por animal.
[141] Para além da eficácia provada, o perfil de segurança de uma estratégia terapêutica necessita de ser avaliado para permitir uma possível tradução para a clínica. Estudos recentes relataram respostas imunitárias desencadeadas no cérebro após entrega de rAAV9 e toxicidade devido ao silenciamento fora do alvo induzido por miR. Embora não tenhamos explorado todos estes parâmetros em detalhe, a estratégia terapêutica agora divulgada foi avaliada em animais de tipo selvagem, com base em seus desempenhos no rotarod estacionário e acelerado aos 85 dias, para avaliar se este tratamento é bem tolerado. Nenhumas diferenças foram detectadas para o desempenho no rotarod de camundongos de tipo selvagem intravenosamente injetados com rAAV9-miR-Controle ou rAAV9-miR-ATXN3 (FIG. 14 A e B). Estas descobertas indicam que a sequência terapêutica não induz grandes efeitos tóxicos.
[142] Finalmente, em PN75, os animais foram também submetidos à Visualização de Ressonância Magnética (MRI) e Espectroscopia (MRS) para avaliar as mudanças morfológicas e metabólicas do cerebelo de camundongos transgênicos com MJD tanto tratados como de controle, bem como companheiros de ninhada de tipo selvagem usando um digitalizador 9.4 Tesla.
[143] Três neuroquímicos foram altamente desregulados na MJD transgênica em comparação com camundongos do tipo selvagem no cerebelo: i.e., N-acetilaspartato (NAA), mio-Inositol (Ins) e glicerofosfocolina + fosfocolina (tCo) (FIG. 15A). Interessantemente, os níveis destes três neurometabolitos foram melhorados em camundongos com MJD injetados com miR-ATAX3, o que significa níveis mais elevados de NAA (marcador neuronal) e níveis mais baixos de Ins e tCo (marcadores de morte celular) em comparação com os camundongos com MJD de controle (FIG. 15B).
[144] As razões neuroquímicas NAA/Ins e NAA/Colina total, bem como a razão NAA/(Ins+tCo), foram também aplicadas para avaliar a eficácia dessa terapia. Todos os três valores de razão foram significativamente mais elevados em camundongos com MJD tratados em comparação com os camundongos com MJD de controle, demonstrando a eficácia do tratamento com miR-ATAX3 (FIG. 15B).
[145] Em conjunto, isso demonstra que os biomarcadores neuroquímicos, em particular NAA, Ins e tCo, podem ser usados para monitorizar a eficácia desta terapia baseada em genes durante os ensaios pré-clínicos e serem subsequentemente traduzidos para ensaios clínicos em humanos, como biomarcadores terapêuticos não invasivos importantes.
[146] Em conclusão, essa divulgação proporciona evidência convincente de que uma única injeção intravenosa de rAAV9 codificando um miRNA artificial baseado em miR155 compreendendo SEQ ID NO.2 em P1 é capaz de: i) transpor a barreira hematoencefálica, ii) silenciar precisamente o mRNA da ataxina-3 mutante e iii) aliviar as mudanças neuropatológicas e as deficiências motoras da MJD.
[147] Além do mais, a presente divulgação relata uma melhoria comportamental significativa em disfunções de poliglutaminas após administração intravenosa de rAAV9 e constitui a primeira abordagem terapêutica da MJD capaz de induzir o silenciamento generalizado e a longo prazo da ataxina-3 através de um sistema não invasivo.
[148] O termo “compreendendo” sempre que usado em este documento se destina a indicar a presença de características, números inteiros, passos, componentes declarados, mas não a impedir a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, passos, componentes ou seus grupos.
[149] Será apreciado por aqueles com conhecimentos comuns na técnica que, a não ser que de outro modo indicado aqui, a sequência particular de passos descrita é somente ilustrativa e pode ser variada sem se afastar da divulgação. Assim, a não ser que de outro modo indicado, os passos descritos estão assim desordenados significando que, quando possível, os passos podem ser realizados em qualquer ordem conveniente ou desejável.
[150] A divulgação não deve ser vista de forma alguma restrita às modalidades descritas e uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica irá prever muitas possibilidades de modificações da mesma. As modalidades descritas acima são combináveis.
[151] As seguintes reivindicações estabelecem adicionalmente modalidades particulares da divulgação. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS: 1) Sequências alvo e sequências de RNAs de fita dupla visando SNPs residentes em ATXN-3
1.1 Sequências alvo no éxon 10 (rs12895357) e respectivos RNAs de fita dupla visando SNP
1.1.1 Sequência alvo e sequência antissenso dos RNAs de fita dupla visando o mRNA da ataxina-3 em rs12895357(Citosina) SEQ ID NO. 1: Sequência alvo no éxon 10 (rs12895357)(C): agcagcagcagcgggaccuauca SEQ ID NO. 2: (miR357C.22): 5’ – ugauaggucccgcugcugcugc – 3’ (22 nt) SEQ ID NO. 3: (miR357C.21): 5’ – ugauaggucccgcugcugcug – 3’ (21 nt) SEQ ID NO. 4: (miR357C.19): 5’ – ugauaggucccgcugcugc – 3’ (19 nt) SEQ ID NO. 5: (miR357C.20): 5’ – ugauaggucccgcugcugcu – 3’ (20 nt) SEQ ID NO. 6: (miR357C.23): 5’ – ugauaggucccgcugcugcugcu – 3’ (23 nt)
1.1.2. Sequência alvo e sequência antissenso dos RNAs de fita dupla visando o mRNA da ataxina-3 em rs12895357 (Guanina) SEQ ID NO. 7: Sequência alvo no éxon 10 (rs12895357)(G): agcagcagcagggggaccuauca SEQ ID NO. 8 (miR357G.22): 5’ – ugauaggucccccugcugcugc – 3’ (22 nt) SEQ ID NO. 9 (miR357G.19): 5’ – ugauaggucccccugcugc – 3’ (19 nt) SEQ ID NO. 10 (miR357G.20): 5’ – ugauaggucccccugcugcu – 3’ (20 nt) SEQ ID NO. 11 (miR357G.21): 5’ – ugauaggucccccugcugcug – 3’ (21 nt) SEQ ID NO. 12 (miR357G.23): 5’ – ugauaggucccccugcugcugcu – 3’ (23 nt)
1.2 Sequências alvo no éxon 8 (rs1048755) e respectivos RNAs de fita dupla visando SNP
1.2.1 Sequência alvo e sequência antissenso dos RNAs de fita dupla visando o alelo da ataxina-3 em rs1048755 (Adenina) SEQ ID NO. 13: Sequência alvo no éxon 8 (rs1048755) (A): accuggaacgaauguuagaagca SEQ ID NO. 14 (miR755A.22): 5’ – ugcuucuaacauucguuccagg – 3’ (22 nt) SEQ ID NO. 15 (miR755A.19): 5’ – ugcuucuaacauucguucc – 3’ (19 nt) SEQ ID NO. 16 (miR755A.20): 5’ – ugcuucuaacauucguucca – 3’ (20 nt) SEQ ID NO. 17 (miR755A.21): 5’ – ugcuucuaacauucguuccag – 3’ (21 nt) SEQ ID NO. 18 (miR755A.23): 5’ – ugcuucuaacauucguuccaggu – 3’ (23 nt)
1.2.2 Sequência alvo e sequência antissenso dos RNAs de fita dupla visando o alelo da ataxina-3 em rs1048755 (Guanina) SEQ ID NO. 19: Sequência alvo no éxon 8 (rs1048755) (G): accuggaacgaguguuagaagca SEQ ID NO. 20 (miR755G.22): 5’ – ugcuucuaacacucguuccagg – 3’ (22 nt) SEQ ID NO. 21 (miR755G.19): 5’ – ugcuucuaacacucguucc – 3’ (19 nt) SEQ ID NO. 22 (miR755G.20): 5’ – ugcuucuaacacucguucca – 3’ (20 nt) SEQ ID NO. 23 (miR755G.21): 5’ – ugcuucuaacacucguuccag – 3’ (21 nt) SEQ ID NO. 24 (miR755G.23): 5’ – ugcuucuaacacucguuccaggu – 3’ (23 nt) Outras Sequências
SEQ ID NO. 25 (miR-Controle): 5’ – caacaagaugaagagcaccaa – 3’ (21 nt) SEQ ID NO. 26 (sh-ATXN3): 5’ – gauaggucccgcugcugcu – 3’ (19 nt) SEQ ID NO. 27 (miR155 - braço 5´): 5’ – cuggaggcuugcugaaggcuguaugcug – 3’ SEQ ID NO. 28 (alça de miR ): 5’ – guuuuggccacugacugac – 3’ (19 nt) SEQ ID NO. 29 (miR155 - braço 3´): 5’ – caggacaaggccuguuacuagcacucacauggaacaaauggcc – 3’ (43 nt)
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Claims (17)
1. Uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) caracterizada por compreender: uma sequência de ribonucleotídeos antissenso emparelhada entre bases com uma sequência de ribonucleotídeos senso substancialmente complementar; em que cada ribonucleotídeo da sequência de RNA antissenso é complementar a um ribonucleotídeo correspondente do mRNA da ataxina-3 humana mutante compreendendo um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um alelo da doença de Machado-Joseph (MJD) do gene da ataxina-3 humana mutante, e em que o ribonucleotídeo da sequência de RNA antissenso que é complementar ao polimorfismo de nucleotídeo único do mRNA da ataxina-3 humana mutante está afastado 10 ribonucleotídeos do ribonucleotídeo na extremidade 5´ da sequência de RNA antissenso.
2. A molécula de RNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência de ribonucleotídeos senso emparelhada entre bases não ser totalmente complementar à sequência de ribonucleotídeos antissenso.
3. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizada pela sequência de ribonucleotídeos antissenso ser pelo menos 90% complementar à sequência de ribonucleotídeos senso.
4. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizada pela sequência de ribonucleotídeos antissenso é complementar à sequência nucleotídica de SEQ ID NO. 1 ou 13.
5. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-4, caracterizada pela sequência de ribonucleotídeos antissenso tem a sequência nucleotídica de SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 14, 15, 16, 17 ou 18.
6. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-5, caracterizada pela sequência de ribonucleotídeos antissenso compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO. 2.
7. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-6, caracterizada pelos ribonucleotídeos nas extremidades 5´ e 3´ da sequência de RNA antissenso estão separados por pelo menos 17 ribonucleotídeos.
8. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizada pelos ribonucleotídeos nas extremidades 5´ e 3´ da sequência de RNA antissenso estão separados por 17, 18, 19, 20 ou 21 ribonucleotídeos.
9. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-8, caracterizada pela molécula de RNA é uma única molécula de RNA.
10. A molécula de RNA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela molécula de RNA é um miRNA.
11. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-10, caracterizada pelo polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) compreende um SNP de um alelo rs1048755 (éxon 8) ou rs12895357 (éxon 10) do gene da ataxina-3 humana.
12. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-11, caracterizada pela molécula de RNA é terapeuticamente eficaz em silenciar seletivamente a expressão do alelo da doença de Machado-Joseph (MJD) do gene da ataxina-3 humana mutante mas não um alelo da ataxina-3 humana de tipo selvagem.
13. A molécula de RNA, de acordo com as reivindicações 1-12, caracterizada por compreender um molde de miRNA derivado de miR-155, em que o ribonucleotídeo antissenso tem a sequência nucleotídica de SEQ ID NO. 2 e o ribonucleotídeo senso tem a sequência nucleotídica de SEQ ID NO. 1.
14. Um vetor viral adenoassociado, caracterizado por compreender uma sequência de DNA isolada operacionalmente ligada a um promotor, em que a sequência de DNA codifica a molécula de RNA, conforme definida nas reivindicações 1-13.
15. Um método para silenciar seletivamente a expressão de um alelo da ataxina-3 humana mutante tendo um polimorfismo de nucleotídeo único em desequilíbrio de ligação com um alelo da doença de Machado-Joseph (MJD) da ataxina-3 humana mutante, caracterizado por compreender a administração do vetor viral adenoassociado, conforme definido na reivindicação 14, a um sujeito com sua necessidade.
16. O método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) compreender um SNP de um alelo rs1048755 (éxon 8) ou rs12895357 (éxon 10) do gene da ataxina-3 humana mutante.
17. O método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo vetor viral adenoassociado ser administrado sistemicamente, intravenosamente, oralmente, intranasalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, intravertebralmente, intracerebralmente, intracerebroventricularmente, intracisternamente, intratecalmente, intraocularmente, intracardiacamente, intradermicamente ou subcutaneamente.
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