ES2871527T3 - Virión de virus adenoasociado para usar en el tratamiento de la epilepsia - Google Patents

Virión de virus adenoasociado para usar en el tratamiento de la epilepsia Download PDF

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Abstract

Un vector de virus adenoasociado recombinante, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína para mejorar la función inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras en un sujeto vivo, en donde el vector vírico es para usar en el tratamiento de la epilepsia, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína neuroligina 2 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con dicha secuencia de aminoácidos y unión a neurexina, y en donde el vector de virus adenoasociado recombinante comprende: una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que al menos una tirosina está sustituida por fenilalanina y la tirosina en la posición 445 está sustituida por fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA1 de tipo silvestre; una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que al menos una tirosina está sustituida por fenilalanina y la tirosina en la posición 444 está sustituida por fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA2 de tipo silvestre; o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que al menos una tirosina está sustituida por fenilalanina y la tirosina en la posición 446 está sustituida por fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA9 de tipo silvestre.

Description

DESCRIPCIÓN
Virión de virus adenoasociado para usar en el tratamiento de la epilepsia
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a viriones de virus adenoasociados genéticamente recombinantes (VAAr) para enfermedades neurales. De manera más específica, la presente invención se refiere a VAAr para el tratamiento de la epilepsia.
Estado de la técnica
La epilepsia se clasifica en convulsiones parciales que son crisis generadas parcialmente en partes del cuerpo como resultado de la excitación anómala de neuronas en el cerebro en sitios relativamente limitados y crisis generalizadas (p. ej., crisis tonicoclónicas) que son convulsiones generalizadas generadas porque las neuronas excitadas de forma anómala en el cerebro afectan a la corteza por completo. Una crisis generalizada provoca la pérdida del conocimiento y es una enfermedad que no causa convulsiones, pero puede causar una alteración de la consciencia sola o síntomas psiquiátricos anómalos (p. ej., crisis psicomotoras). Los enfoques terapéuticos generales actuales son principalmente farmacoterapias que usan fármacos antiepilépticos (p. ej., fenitoína, carbamazepina y ácido valproico). También se realiza tratamiento quirúrgico para casos de epilepsia resistentes al tratamiento.
Aproximadamente el 30 % de los casos de epilepsia se deben a enfermedades resistentes al tratamiento, cuyas crisis no se suprimen mediante el tratamiento farmacológico. En el caso de la epilepsia del lóbulo temporal interno, el tratamiento quirúrgico, tal como la lobulectomía temporal, puede ser eficaz. Sin embargo, la escisión de los hipocampos bilaterales causa una disminución de la fijación de la memoria, de modo que, si los focos epilépticos se encuentran en hipocampos bilaterales, un caso de este tipo no es candidato a cirugía. Por otra parte, se estima que el número de pacientes con epilepsia resistente al tratamiento, tal como encefalopatía epiléptica infantil (p. ej., síndrome de West), que tienen focos epilépticos desconocidos es de aproximadamente 100000 en Japón, y no existe una terapia de curación para dichos pacientes.
Para tratar dicha epilepsia resistente al tratamiento, también se ha examinado un método para tratar cada enfermedad mediante una terapia génica dirigida a células nerviosas. Como medio (vector) para suministrar un gen terapéutico a las células nerviosas, se conoce en la técnica un medio para usar un virus adenoasociado recombinante (VAAr). Los ejemplos de dicho VAAr incluyen los descritos en las publicaciones internacionales WO2012/057363, WO2008/124724, WO2003/093479 y similares.
Se han estudiado medios para ajustar la actividad neuronal dirigiéndose a las proteínas asociadas a la sinapsis. Por ejemplo, el documento de Kohl, C et al. (referencia no perteneciente a patente 1) desvela que la administración directa de un vector de VAAr que expresa neuroligina 2 (NLGN2), que es una proteína localizada en la sinapsis de las células nerviosas, al hipocampo para sobreexpresar NLGN2, da lugar a una alteración del comportamiento social y una transmisión sináptica inhibidora, pero no describe ningún tratamiento específico de la enfermedad. El documento de Moe et al. (referencia no perteneciente a patente 2) desvela que el tratamiento de la epilepsia mediante un vector de VAAr que expresa el neuropéptido Y alivia síntomas de la epilepsia. Por otra parte, el documento de Fang et al. (referencia no perteneciente a patente 3) desvela que los síntomas de la epilepsia se alivian como resultado de la administración directa de un vector de VAAr que expresa el antisentido de neuroligina 1 (NLGN1), que es una proteína localizada en la sinapsis de las células nerviosas, al hipocampo.
Documentos de la técnica anterior
Referencias de patentes
Referencia de patente 1: WO 2012/057363
Referencia de patente 2: WO 2008/124724
Referencia de patente 3: WO 2003/093479
Referencia de patente 4: WO 2014/160092
Referencia de patente 5: WO 2008/016629
Referencia de patente 6: WO 2010/037143
La referencia de patente 1 desvela viriones de virus adenoasociados para transferir genes a células neurales.
La referencia de patente 4 proporciona vectores de VAA y métodos de uso de los mismos para el suministro de transgenes o ácidos nucleicos terapéuticos a sujetos.
La referencia de patente 5 se refiere a nuevas proteínas de descarboxilasas del ácido glutámico (GAD) y métodos de uso.
La referencia de patente 6 desvela vectores y métodos de tratamiento de las crisis cerebrales
Referencias no pertenecientes a patentes
Referencia no perteneciente a patente 1: Kohl, C. et al., PLOS ONE, febrero de 2013, vol. 8, e56871 Referencia no perteneciente a patente 2: Moe', F. M. et al., JASPER'S BASIC MECHANISMS OF THE EPILEPSY, 2012,
Referencia no perteneciente a patente 3: Kullmann, D. M. et al., Nature Reviews Neurology, 2014, vol. 10, páginas 300-304
Referencia no perteneciente a patente 4: Fang et al., Mol. Neurobiol. 27 de noviembre de 2014 [publicación electrónica]
Referencia no perteneciente a patente 5: Duque et al., Molecular Therapy, 2009, vol. 17, número 7, páginas 1187­ 1196
Referencia no perteneciente a patente 6: Oguro. et al., Tenkan Kenkyu, 2015, vol. 33, n.° 2, página 521.
Referencia no perteneciente a patente 7: Raol et al., J. Neurosci., 2006, vol. 26, n.° 44, páginas 11342-11346 Referencia no perteneciente a patente 8: Ogura et al., Tenkan Kenkyu, 2016, vol. 34, n.° 2, página 442.
La referencia no perteneciente a patente 1 enseña que la sobreexpresión de neuroligina-2 del hipocampo conduce a una reducción de la agresión y una inhibición de la reactividad frente a novedades en ratas.
La referencia no perteneciente a patente 2 enseña la terapia génica de la epilepsia de inicio focal mediante el uso de la sobreexpresión del neuropéptido Y mediada por vectores de virus adenoasociados.
La referencia no perteneciente a patente 3 se centra en los ensayos clínicos para la terapia génica en la epilepsia. La referencia no perteneciente a patente 4 enseña que la atenuación de la neuroligina-1 suprime la actividad convulsiva regulando la hiperexcitabilidad neuronal.
La referencia no perteneciente a patente 5 enseña que la administración intravenosa de vaa9 autocomplementario permite el suministro de transgenes a neuronas motoras adultas.
La referencia no perteneciente a patente 6 desvela la terapia génica para ratones el epilépticos mediante la administración intravascular de virus adenoasociado.
La referencia no perteneciente a patente 7 enseña que la mejora de los niveles de la subunidad alfa 1 del receptor gaba(a) en la circunvolución dentada del hipocampo inhibe el desarrollo de la epilepsia en un modelo animal de epilepsia del lóbulo temporal.
La referencia no perteneciente a patente 8 desvela la terapia génica para ratones el epilépticos mediante la administración intravascular de virus adenoasociado.
Objeto de la invención
Problema técnico
Es necesario un nuevo medicamento para el tratamiento de la epilepsia por transferencia génica. Asimismo, se desea que un medicamento de este tipo sea ventajoso en la medicación real, de modo que tenga menos efectos secundarios y pueda administrarse de forma más sencilla, por ejemplo.
Solución al problema
Como resultado de estudios intensivos para establecer una terapia génica para la epilepsia, los inventores de la presente solicitud han descubierto que mediante la preparación de un vector de virus adenoasociado recombinante que comprende un polinucleótido, que codifica la neuroligina 2 que es una proteína para mejorar la capacidad inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras, y la administración del vector a un sujeto vivo, los síntomas de la epilepsia mejoran y, por tanto, han completado la invención de la presente solicitud.
Específicamente, la presente solicitud proporciona un vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr) como se describe a continuación para el tratamiento de las siguientes enfermedades relacionadas con las células nerviosas, tales como la epilepsia, y una composición farmacéutica que comprende el vector, por ejemplos. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas. Los inventores describen:
{1} Un vector de virus adenoasociado recombinante, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína para mejorar la función inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras en un sujeto vivo, que se usa para el tratamiento de la epilepsia.
{2} El vector de virus adenoasociado recombinante según {1}, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína neuroligina 2 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de aproximadamente el 95 % o más con dicha secuencia de aminoácidos y unión a neurexina.
{4} El vector recombinante de virus adenoasociado según uno cualquiera de {1} a {2}, en donde el vector de virus adenoasociado recombinante comprende: una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que la tirosina en la posición 445 en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA1 de tipo silvestre está sustituida por fenilalanina; una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que la tirosina en la posición 445 en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA2 de tipo silvestre está sustituida por fenilalanina; o
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que la tirosina en la posición 446 en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA9 de tipo silvestre está sustituida por fenilalanina. {8} Una composición farmacéutica, que comprende el vector de virus adenoasociado recombinante según uno cualquiera de {1} a {4}.
{9} La composición farmacéutica según {8}, que se administra por vía intracerebral.
{10} La composición farmacéutica según {8}, que se administra por vía intratecal.
{11} La composición farmacéutica según {8}, que se administra por vía periférica.
{12} La composición farmacéutica según uno cualquiera de {8} a {11}, que se usa en combinación con un agente quimioterapéutico para una enfermedad neuropsiquiátrica.
Efectos ventajosos de la invención
La mejora de las funciones de un sistema inhibidor sináptico mediante una terapia génica según la invención de la presente solicitud es útil como método para el tratamiento de la epilepsia. Se puede esperar que la composición de la invención de la presente solicitud sea eficaz incluso para pacientes con epilepsia resistente al tratamiento que tienen focos epilépticos indeterminados, tal como encefalopatía epiléptica infantil (p. ej., síndrome de West).
Descripción de las figuras
[Figura 1] La figura 1a muestra el resultado de la confirmación de la expresión de la proteína neuroligina 2 recombinante en un ratón al que se administró VAAr de tipo administración vascular mediante la tinción de secciones tisulares con anticuerpo de FLAG. La figura 1b muestra el resultado de la detección de la expresión de la neuroligina 2 recombinante en un ratón al que se administró un control.
[Figura 2] La figura 2 muestra los resultados de la medición de las frecuencias de crisis epilépticas de ratones sometidos a 3 tipos de administración intracardíaca (administración intracardíaca de VAAr de tipo administración vascular que expresa NLGN2, VAAr de tipo de administración vascular que expresa proteína GFP y solución salina fisiológica) a las edades en semanas representadas en el eje horizontal.
[Figura 3] La figura 3 muestra los resultados de la duración de la crisis de ratones sometidos a los 3 tipos anteriores de administración intracardíaca.
[Figura 4] La figura 4 muestra los resultados de la intensidad de la crisis de ratones sometidos a los 3 tipos anteriores de administración intracardíaca.
[Figura 5] La figura 5 muestra los resultados de la agregación de los resultados de duración de la crisis x intensidad de la crisis en la figura 3 y la figura 4.
[Figura 6] La figura 6 muestra los resultados de los umbrales cuando los ratones sometidos a los 3 tipos de administración anteriores se sometieron a estimulación eléctrica a cada edad en semanas.
[Figura 7] La figura 7a muestra los resultados de la medición de las frecuencias de crisis de la epilepsia de ratones a los que se administraron por vía tópica VAAr de tipo de administración vascular que expresaba NLGN2, VAAr de tipo administración vascular que expresaba proteína GFP y solución salina fisiológica en el hipocampo a las edades en semanas indicadas en el eje horizontal (fig.7a), así como los resultados de la misma en ratones a los que se administraron por vía intracardíaca VAAr de tipo administración vascular que expresaba NLGN2 y VAAr de tipo administración vascular que expresaba la proteína GFP a las edades en semanas representadas en el eje horizontal (fig. 7b).
[Figura 8] La figura 8 muestra los resultados de medir la duración de las crisis de los ratones en la figura 7. [Figura 9] La figura 9 muestra los resultados de medir la intensidad de las crisis de los ratones en la figura 7. [Figura 10] La figura 10 muestra los resultados agregados de duración de las crisis x intensidad de las crisis de los ratones en la figura 7. [Figura 11] La figura 11 muestra los umbrales de estimulación eléctrica medidos a cada edad en semanas de los ratones en la figura 7.
Descripción detallada de la invención
En la presente solicitud, se proporciona un vector de virus adenoasociado recombinante para el tratamiento de la epilepsia, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína para mejorar la función inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras en un sujeto vivo.
1. Control de la excitación en sinapsis excitadora y sinapsis inhibidora
En la presente solicitud, el término "sinapsis" se refiere a complejos de unión entre un botón sináptico formado por cada terminal axonal hinchado de las células nerviosas y su neurona o miocito diana. En un sujeto vivo, están presentes sinapsis excitadoras para transmitir la excitación y sinapsis inhibidoras para inhibir la transmisión de la excitación. Por otra parte, la mayoría de las sinapsis son sinapsis químicas (transducción lenta de señales) que están mediadas por la transmisión de sustancias químicas. Otro tipo de sinapsis incluye sinapsis eléctricas que presentan una respuesta rápida con respecto al tiempo, pero se observan con poca frecuencia en el sistema nervioso central de un mamífero maduro.
En sinapsis excitadoras, aminoácidos tales como ácido glutámico, ácido aspártico, ácido cisteico y ácido homocisteico actúan como transmisores, se genera potencial postsináptico excitador (PPSE) y, a continuación, cuando el potencial eléctrico supera un umbral, se realiza la transmisión de la excitación (impulso). Por otro lado, en sinapsis inhibidoras, aminoácidos tales como el ácido Y-aminobutírico (GABA), glicina, taurina, alanina, cistationina y serina actúan como transmisores y, a continuación, se genera el potencial postsináptico inhibidor (PPSI), que se considera que suprime el impulso de las neuronas postsinápticas o dificulta su generación. PPSE y PPSI incluyen PPSE rápido o PPSI rápido que presenta un ciclo temporal rápido (el ciclo temporal completo está dentro de 100 milisegundos) y PPSE lento o PPSI lento que presentan un ciclo temporal extremadamente lento que dura decenas de segundos a decenas de minutos. Aquí, en PPSI rápido, se sabe que actúan GABA asociado con un canal (Cl-) receptor GABAa y glicina asociada con un canal (Cl-) receptor de glicina. Como transmisores de PPSI lentos, se sabe que actúan GABAb que actúa a través de un receptor GABAb así como acetilcolina y catecolamina.
Los ejemplos de una proteína para mejorar la función inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras incluyen neuroligina 2 y neurexina implicadas en la estabilización de la sinapsis, receptor de GABA, glutaminadescarboxilasa (GAD) implicada en la biosíntesis de GABA, proteína de canal Na+ y proteína de canal Cl- implicadas en el transporte de glicina, neuropéptido Y, gefirina, que es una proteína de armazón, SLITRK3 que es una proteína transmembrana y está implicada en la formación de sinapsis inhibidora y PTPRD que es una tirosina fosfatasa de tipo receptor que se une a SLITRK3. Un polinucleótido contenido en el vector de la presente invención comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína neuroligina 2 (SEQ ID NO: 2, 4 o 6) como proteína para mejorar la función inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras.
El término "neuroligina (NLGN)" se refiere a una familia de proteínas de membrana que existe en una membrana postsináptica y generalmente se clasifica en neuroliginas 1 a 4. Cada una de estas neuroliginas se une específicamente a una molécula de adhesión celular neurexina (Neurexina: NRXN), proteína de una membrana presináptica para conectar una sinapsis preterminal y un sitio postsináptico. La neuroligina 1 se ubica en las sinapsis excitadoras y se considera que media en la transmisión sináptica excitadora. Por otro lado, la neuroligina 2 se ubica en las sinapsis inhibidoras y se considera que media en la transmisión sináptica inhibidora. Por otra parte, la neuroligina 3 se expresa tanto en sinapsis excitadoras como en sinapsis inhibidoras, el corazón, el páncreas y similares, y la neuroligina 4 se expresa en el corazón, el hígado y similares.
Las proteínas neurexinas que son compañeros de unión de las neuroliginas se clasifican en general en neurexina 1a a 3a y 1p a 3p. En el presente documento, las a neurexinas y las p neurexinas son proteínas de cadena larga y proteínas de cadena corta, respectivamente, que se generan a partir del mismo gen por la acción de diferentes promotores. La neuroligina 2 que se va a usar en la invención de la presente solicitud se une funcionalmente a la neurexina 1a.
Se puede usar una secuencia de aminoácidos conocida como secuencia de aminoácidos de la proteína neuroligina 2 que se va a usar en la invención de la presente solicitud. Los ejemplos de dicha secuencia de aminoácidos incluyen el n.° de referencia de Genbank AAM46111 (humano), EDL12455 (de ratón) y EDMO4903 (de rata). Los ejemplos de dichas proteínas de otras especies animales que pueden usarse en el presente documento incluyen proteínas procedentes de mamíferos tales como monos, perros, cerdos, vacas y caballos. Las secuencias de aminoácidos de proteínas neuroligina 2 humanas, de ratón y de rata están representadas por las SEQ ID NO: 2, 4 y 6, respectivamente.
Asimismo, los ejemplos de la proteína neuroligina 2 que se van a usar en la invención de la presente solicitud incluyen una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6, y es capaz de unirse a una proteína neurexina 1a en condiciones fisiológicas. Normalmente se prefieren valores numéricos mayores. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de la neuroligina 2 humana y la de la neuroligina 2 de ratón comparten una identidad del 98 % o más y la secuencia de aminoácidos de la neuroligina 2 humana y la de la neuroligina 2 de rata comparten una identidad del 91 % o más. En la presente invención, la expresión "una proteína variante actúa en un grado equivalente al de la proteína original" (por ejemplo, una proteína presenta una capacidad de unión equivalente a la de la proteína original) significa que, por ejemplo, la actividad específica varía de aproximadamente 0,01 a 100, preferentemente varía de aproximadamente 0,5 a 20 y más preferentemente varía de aproximadamente 0,5 a 2, pero los ejemplos de las mismas no se limitan a estas.
Asimismo, los ejemplos de la proteína neuroligina 2 que se van a usar en la invención de la presente solicitud incluyen una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene la identidad anterior con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6, en la que se suprimen, sustituyen, insertan y/o añaden uno o más aminoácidos, y es capaz de unirse a la proteína neurexina 1a en condiciones fisiológicas. Entre la supresión, sustitución, inserción y adición de aminoácidos anteriores, dos o más tipos de los mismos pueden tener lugar simultáneamente. Un ejemplo de dicha proteína es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se prepara a partir de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6 por supresión, sustitución, inserción y/o adición de, por ejemplo, de 1 a 50, de 1 a 40, de 1 a 39, de 1 a 38, de 1 a 37, de 1 a 36, de 1 a 35, de 1 a 34, de 1 a 33, de 1 a 32, de 1 a 31, de 1 a 30, de 1 a 29, de 1 a 28, de 1 a 27, de 1 a 26, de 1 a 25, de 1 a 24, de 1 a 23, de 1 a 22, de 1 a 21, de 1 a 20, de 1 a 19, de 1 a 18, de 1 a 17, de 1 a 16, de 1 a 15, de 1 a 14, de 1 a 13, de 1 a 12, de 1 a 11, de 1 a 10, de 1 a 9 (de 1 a varios), de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, de 1 a 2 o un resto de aminoácido, y es capaz de unirse a una proteína neurexina a en condiciones fisiológicas. Se prefiere, en general, suprimir, sustituir, insertar y/o añadir el menor número de los restos de aminoácidos anteriores.
Se describen a continuación ejemplos de restos de aminoácidos en la proteína (polipéptido) de la presente invención, que se pueden sustituir entre sí. Los restos de aminoácidos incluidos en el mismo grupo pueden sustituirse entre sí.
Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, ometilserina, t-butilglicina, t-butilalanina y ciclohexilalanina;
Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico y ácido 2-aminosubérico;
Grupo C: asparagina y glutamina;
Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico y ácido 2,3-diaminopropiónico;
Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina y 4-hidroxiprolina;
Grupo F: serina, treonina y homoserina; y Grupo G: fenilalanina y tirosina.
Se puede preparar una proteína neuroligina en la que un resto o restos de aminoácidos están sustituidos según un método conocido por los expertos en la materia, tal como una técnica de ingeniería genética general. Dichos procedimientos de ingeniería genética se pueden referir a, por ejemplo, Molecular Cloning 3a edición, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997.
Asimismo, los ejemplos de un polinucleótido que se usa preferentemente en la invención de la presente solicitud incluyen un polinucleótido que tiene la secuencia polinucleotídica de las SEQ ID NO: 1, 3 o 5, en la que 1 o más (por ejemplo, de 1 a 50, de 1 a 4o, de 1 a 30, de 1 a 25, de 1 a 20, de 1 a 15, de 1 a 10, de 1 a 9 (de 1 a varios), de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, de 1 a 2 y 1) nucleótidos se suprimen, sustituyen, insertan y/o añaden, y que codifica la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6, o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos preparada a partir de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6 mediante supresión, sustitución, inserción y/o adición de uno o más aminoácidos como se ha descrito anteriormente, y es capaz de unirse a una neurexina 1a. Entre estas supresiones, sustituciones, inserciones y adiciones, dos o más tipos de las mismas pueden estar contenidos en combinación simultáneamente. Se prefiere, en general, suprimir, sustituir, insertar y/o añadir un menor número de los nucleótidos anteriores. Por otra parte, los ejemplos de un polinucleótido preferible en la invención de la presente solicitud incluyen un polinucleótido que se puede hibridar en condiciones rigurosas de hibridación con las SEQ ID NO: 7, 9 u 11 o su secuencia complementaria y codifica la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6, y un polinucleótido que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos preparada a partir de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6 mediante supresión, sustitución, inserción y/o adición de uno o más aminoácidos como se ha descrito anteriormente, y es capaz de unirse a una neurexina.
Se puede realizar hibridación mediante métodos bien conocidos o métodos modificados a partir de ellos, por ejemplo, métodos descritos en Molecular Cloning (3a edición, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001), etc. Cuando se usan bibliotecas disponibles en el mercado, se puede realizar hibridación de acuerdo con los métodos descritos en las instrucciones proporcionadas por los fabricantes, etc. Como se usa en el presente documento, la expresión "condiciones rigurosas" puede ser cualquiera de las condiciones rigurosas bajas, condiciones rigurosas moderadas y condiciones muy rigurosas. La expresión "condiciones poco rigurosas" se refiere a condiciones de, por ejemplo, SSC 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5 % y formamida al 50 % a 32 °C. La expresión "condiciones rigurosas moderadas" se refiere a condiciones de, por ejemplo, SSC 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5 % y formamida al 50 % a 42 °C. La expresión "condiciones muy rigurosas" se refiere a condiciones de, por ejemplo, SSC 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5 % y formamida al 50 % a 50 °C. En estas condiciones, se puede esperar que se obtenga ADN con mayor homología de manera eficiente a temperaturas más altas. Múltiples factores están implicados en la rigurosidad de la hibridación, incluyendo la temperatura, concentración de la sonda, longitud de la sonda, fuerza iónica, tiempo, concentración salina y otros, pero los expertos en la materia pueden seleccionar adecuadamente estos factores para lograr una rigurosidad similar.
Los ejemplos de dicho polinucleótido hibridable incluyen polinucleótidos que tienen, p. ej., 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 91 % o más, 92 % o más, 93 % o más, 94 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, 99 % o más, 99,1 % o más, 99,2 % o más, 99,3 % o más, 99,4 % o más, 99,5 % o más, 99,6 % o más, 99,7 % o más, 99,8 % o más, 99,9 % o más identidad con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 7, 9 u 11, calculada mediante el uso de parámetros predeterminados en un programa informático de búsqueda de homología, tal como FASTA y BLAST. En general, se prefiere más el valor numérico mayor de la homología anterior.
La identidad u homología entre secuencias de aminoácidos o secuencias polinucleotídicas se puede determinar usando el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 5873, 1993). Se han desarrollado programas denominados BLASTN y BLASTX basados en el algoritmo BLAST (Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Cuando se analiza una secuencia de nucleótidos usando BLASTN, los parámetros son, por ejemplo, puntuación = 100 y longitud de la palabra = 12. Cuando se analiza una secuencia de aminoácidos usando BLASTX, los parámetros son, por ejemplo, puntuación = 50 y longitud de la palabra = 3. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parámetros predeterminados para cada uno de los programas.
2. Enfermedad diana en la presente invención
La invención de la presente solicitud proporciona un vector de VAAr útil para el tratamiento de la epilepsia.
La epilepsia se refiere a procesos patológicos en los que la descarga sincrónica, excesiva, de las células nerviosas cerebrales da lugar a crisis clínicas repetidas que quedan en el mismo tipo en un individuo (p. ej., crisis tonicoclónica generalizada, crisis de ausencia, crisis con alucinación auditiva y crisis tónica de una parte de las extremidades). Según la clasificación de la Liga Internacional contra la Epilepsia (ILAE) en 1981, las convulsiones clínicas se dividen en crisis parciales (crisis parcial simple y crisis parcial compleja), crisis generalizadas (crisis de ausencia, crisis de mioclonía, crisis tonicoclónica, crisis atónica) y crisis variables comunes. Asimismo, según la "Clasificación de la epilepsia, síndrome epiléptico y trastornos convulsivos relacionados" de la ILAE en 1989, la epilepsia se clasifica en epilepsia relacionada con la localización (subclasificada en epilepsia relacionada con la edad, sintomática, criptogénica), epilepsia generalizada (subclasificada en epilepsia idiopática, criptogénica o sintomática), casos que no pueden determinarse como epilepsia focal o generalizada y síndrome especial (p. ej., convulsión febril).
Un ejemplo de epilepsia con una breve crisis en flexión, que comienza en la infancia (alrededor de 1 año) como signo clave es el síndrome de West (o espasmos infantiles). Esta enfermedad forma una serie de crisis tónicas momentáneas por las cuales el paciente dobla la parte superior del cuerpo y la parte de la cabeza hacia adelante continuamente. Existen diversas causas del síndrome de West y las causas son conocidas, incluyendo malformación congénita del cerebro, síndrome neurocutáneo, tal como esclerosis tuberosa y errores innatos del metabolismo, tales como deficiencia de vitamina B6. El síndrome de West se acompaña con frecuencia de retraso mental y, en general, evoluciona a medida que el paciente avanza hacia una epilepsia generalizada asociada principalmente con crisis tonicoclónicas generalizadas (epilepsia del gran mal) u otros tipos de epilepsia, tales como el síndrome de Lennox, la epilepsia del lóbulo temporal y similares. El vector de VAAr de la presente invención puede tener un efecto terapéutico contra el síndrome de West.
3. Vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr) de la presente invención
En la invención de la presente solicitud, como vector para el suministro de un gen que se va a usar para controlar las funciones sinápticas de las células del sistema nervioso, pueden usarse un vector de virus adenoasociado recombinante (también denominado en el presente documento "vector de tipo de administración vascular") descrito en el documento WO 2012/057363, que es capaz de suministrar genes de manera eficiente a las células nerviosas también a través de la administración periférica, o un vector descrito en el documento WO 2008/124724, etc., por ejemplo. El vector de VAAr de la presente invención puede atravesar la barrera hematoencefálica de un sujeto vivo y, por tanto, es capaz de introducir un gen terapéutico de interés en las células del sistema nervioso del cerebro, la médula espinal o similares de un paciente mediante un medio de administración para suministro al cerebro a través de la barrera hematoencefálica, tal como mediante administración periférica al paciente. Por otra parte, el vector también se puede administrar por vía intratecal o directamente a un sitio diana en el cerebro.
El vector de VAAr de la presente invención se puede preparar a partir de virus adenoasociados preferentemente naturales de tipo 1 (VAA1), tipo 2 (VAA2), tipo 3 (VAA3), tipo 4 (VAA4), tipo 5 (VAA5), tipo 6 (VAA6), tipo 7 (VAA7), tipo 8 (VAA8), tipo 9 (VAA9) o similares, pero los ejemplos de los mismos no se limitan a estos. Las secuencias de nucleótidos de estos genomas víricos adenoasociados son conocidas y pueden referirse a las secuencias de nucleótidos de los números de referencia de GenBank: AF063497.1 (VAA1), AF043303 (VAA2), NC_001729 (VAA3), NC_001829.1 (VAA4), NC_006152.1 (VAA5), AF028704.1 (VAA6), NC_006260.1 (VAA7), NC_006261.1 (VAA8) y AY530579 (VAA9), respectivamente. Entre ellas, los tipos 2, 3, 5 y 9 son de origen humano. Según la presente invención, se prefiere en particular usar la proteína de la cápside (VP1, VP2, VP3 o similar) procedente de VAA1, VAA2 o VAA9. Entre los VAA de origen humano, se informó de que VAA1 y VAA9 tienen una multiplicidad comparativamente alta de infección en las células nerviosas (Taymans, et al., Hum Gene Ther 18: 195-206, 2007, etc.).
Una proteína de la cápside que va a estar contenida en el vector de VAAr usado en la presente invención es preferentemente una proteína variante, como se describe en los documentos WO2012/057363, WO2008/124724 o similares, que tiene una secuencia de aminoácidos en la que al menos una tirosina está sustituida con otro aminoácido tal como fenilalanina en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre. Los ejemplos de la misma incluyen una proteína variante que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) formada por sustitución de tirosina en la posición 445 con fenilalanina de la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de VAA1 de tipo silvestre, una proteína variante que tiene una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) en la que el resto de tirosina en la posición 444 en la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de VAA2 de tipo silvestre está sustituido por el resto de fenilalanina y una proteína variante que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) en la que el resto de tirosina en la posición 446 en la secuencia de aminoácidos de una proteína de la cápside de v Aa 9 de tipo silvestre está sustituido por el resto de fenilalanina (documentos WO2012/057363 y WO 2008/124724). Dicha proteína de la cápside tiene la función de formar un capsómero únicamente o en combinación con los otros miembros de la proteína de la cápside (por ejemplo, VP2 y VP3). Por otra parte, en el capsómero se empaqueta un polinucleótido que comprende un gen terapéutico de interés para suministrar a las células del sistema nervioso.
Cuando el vector de VAAr de la presente invención se administra en el torrente sanguíneo, el vector de VAAr puede atravesar la barrera hematoencefálica de un sujeto vivo, incluyendo un adulto y un feto. En la presente invención, los ejemplos de células del sistema nervioso como dianas de la transferencia génica incluyen al menos las células nerviosas contenidas en el sistema nervioso central, tal como el cerebro y la médula espinal, y los ejemplos de las células pueden incluir además células neurogliales, células de la microglía, astrocitos, oligodendrocitos, ependimocitos y células endoteliales cerebrovasculares. El porcentaje de células nerviosas en las células del sistema nervioso a las que se transfiere un gen es, preferentemente, 70 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 91 % o más, 92 % 0 más, 93 % o más, 94 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, 99 % o más, 99,1 % o más, 99,2 % o más, 99,3 % o más, 99,4 % o más, 99,5 % o más, 99,6 % o más, 99,7 % o más, 99,8 % o más, 99,9 % o más o 100 %.
La proteína Rep usada en la presente invención puede tener la misma identidad de secuencia de aminoácidos descrita anteriormente y puede contener supresión, sustitución, inserción y/o adición del mismo número de restos de aminoácidos descrito anteriormente, siempre que tenga funciones conocidas en el mismo grado, tal como la función de reconocer una secuencia de RTI y replicar el genoma dependiendo de la secuencia, la función de reclutar y empaquetar un genoma de VAA de tipo silvestre (o genoma de VAAr) en un vector vírico y una función de formar el vector de VAAr de la presente invención. Los ejemplos del intervalo de grados funcionalmente equivalentes incluyen los intervalos descritos en la descripción con respecto a la actividad específica anterior. En la presente invención, preferentemente, se usa una proteína Rep procedente de VAA3 conocido.
Un polinucleótido que codifica la proteína Rep usada en la presente invención puede tener el mismo número de identidad descrito anteriormente o puede contener supresión, sustitución, inserción y/o adición de nucleótidos en el mismo número descrito anteriormente, siempre que codifique una proteína Rep que tenga funciones conocidas en el mismo grado, tales como una función de reconocer una secuencia de RTI y replicar el genoma dependiendo de la secuencia, la función de reclutar y empaquetar un genoma de VAA de tipo silvestre (o genoma de VAAr) en un vector vírico y una función de formar el vector de VAAr de la presente invención. Los ejemplos del intervalo de grados funcionalmente equivalentes incluyen los intervalos descritos en la descripción con respecto a la actividad específica anterior. En la presente invención, preferentemente, se usa una proteína rep procedente de VAA3 o VAA2.
En una realización de la presente invención, la proteína de la cápside VP1 (VP1, VP2 y/o VP3) codificada por una región interna del genoma de VAA de tipo silvestre anterior y la proteína Rep se usan mediante la incorporación de un polinucleótido que las codifica en un plásmido auxiliar de VAA. Las proteínas de la cápside (VP1, VP2 y/o VP3) y la proteína Rep usadas en la presente invención pueden incorporarse en uno, dos, tres o más tipos de plásmido, si es necesario. En determinados casos, uno o más tipos de estas proteínas de la cápside y la proteína Rep pueden estar contenidos en el genoma de VAA. En la presente invención, preferentemente, las proteínas de la cápside (VP1, VP2 y/o VP3) y la proteína Rep están todas codificadas por un tipo de polinucleótido y se proporcionan en forma de un plásmido auxiliar de VAA.
Se puede preparar un polinucleótido que se va a empaquetar en el vector de VAAr de la presente invención (denominado polinucleótido) sustituyendo un polinucleótido de la región interna (específicamente, uno o ambos del gen rep y el gen cap) ubicado entre la RTI del lado 5' y la del lado 3' del genoma de tipo silvestre con un casete génico que contiene un polinucleótido que codifica una proteína de interés (gen terapéutico), una secuencia promotora para la transcripción del polinucleótido y similares. Preferentemente, la RTI del lado 5' y la del lado 3' se ubican en el extremo 5' y el extremo 3' del genoma de VAA, respectivamente. Preferentemente, el genoma de VAAr de la presente invención incluye 5'-RTI y 3'-RTI contenidas en el genoma de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA8 o VAA9. En general, ya que una parte de RTI toma fácilmente una secuencia en la que se reemplaza la secuencia complementaria (estructura oscilante) y la dirección 5' a 3' puede invertirse en la r T i contenida en el genoma de VAAr de la presente invención. En el genoma de VAAr de la presente invención, la longitud del polinucleótido que se reemplaza por la región interna (es decir, el gen terapéutico) es preferentemente similar a la longitud del polinucleótido original desde un punto de vista práctico. Específicamente, se prefiere que el genoma de VAAr de la presente invención tenga casi el mismo tamaño que 5 kb, que es la longitud completa del genoma de tipo silvestre, por ejemplo, de aproximadamente 2 kb a 6 kb, preferentemente de aproximadamente 4 kb a 6 kb. Excepto por la longitud de una región reguladora de la transcripción que incluye un promotor, poliadenilación, etc. (suponiendo que la longitud es, p. ej., de aproximadamente 1 kb a 1,5 kb), el tamaño de un gen terapéutico que se va a incorporar en el genoma de VAAr de la presente invención varía preferentemente de aproximadamente 0,01 kb a 3,7 kb, más preferentemente, de aproximadamente 0,01 kb a 2,5 kb y aún más preferentemente, de aproximadamente 0,01 kb a 2 kb, de longitud, pero sin limitarse a las mismas.
En general, un polinucleótido que se va a empaquetar en un vector de virus adenoasociado recombinante puede tardar un tiempo (varios días) hasta que se exprese la proteína terapéutica de interés, cuando el genoma es monocatenario. En tal caso, un gen terapéutico que se va a introducir puede diseñarse para que sea de tipo sc (autocomplementario) con el fin de presentar un efecto en un periodo de tiempo más corto. Se describen detalles acerca de este procedimiento en Foust K. D., et al. (Nat Biotechnol. enero de 2009; 27 (1): 59- 65), por ejemplo. El polinucleótido empaquetado en el vector de VAAr de la presente invención puede ser de tipo no sc o de tipo sc.
En una realización, el vector de VAAr de la presente invención comprende un polinucleótido (es decir, dicho polinucleótido está empaquetado) que comprende, preferentemente, una secuencia promotora específica de células nerviosas y un gen terapéutico unido operativamente a la secuencia promotora. Como secuencia promotora para usar en la presente invención, una secuencia promotora específica de las células nerviosas procede de las células nerviosas, células neurogliales, oligodendrocitos, células endoteliales cerebrovasculares, células de la microglía o células epiteliales ventriculares, por ejemplo, pero los ejemplos de las mismas no se limitan a estas. Los ejemplos específicos de dicha secuencia promotora incluyen, pero sin limitación, una secuencia promotora de la sinapsina I, una secuencia promotora de la proteína básica de mielina, una secuencia promotora de enolasa específica de neuronas, una secuencia promotora de la proteína ácida fibrilar glial, una secuencia promotora L7 (promotor específico de células de Purkinje cerebelares), una secuencia promotora del receptor de glutamato delta 2 (promotor específico de células de Purkinje cerebelares), una secuencia promotora de la proteína ácida fibrilar glial (hGfa2) y una secuencia promotora de la descarboxilasa de ácido glutámico (GAD65/GAD67). Por otra parte, en el vector de VAAr de la presente invención, también se pueden usar secuencias promotoras tales como una secuencia promotora de la proteína cinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CMKII), una secuencia promotora de la tubulina al, una secuencia promotora de la cadena p del factor de crecimiento derivado de plaquetas, y similares. Las secuencias promotoras anteriores pueden usarse independientemente o en combinación opcional de dos o más de las mismas. Adicionalmente, las secuencias promotoras anteriores pueden ser secuencias promotoras fuertes que se usan en general, tales como un promotor de CMV y un promotor de CAG. Los ejemplos de secuencias promotoras particularmente preferibles en la presente invención incluyen una secuencia promotora de sinapsina I, una secuencia promotora de la proteína básica de mielina, una secuencia promotora de L7 (promotor específico de células de Purkinje cerebelares) y un promotor delta 2 del receptor de glutamato (promotor específico de células de Purkinje cerebelares). Asimismo, también pueden estar contenidas secuencias conocidas tales como una secuencia potenciadora que ayuda en la transcripción de ARNm, traducción en una proteína, etc., una secuencia de Kozak, una secuencia señal de poliadenilación adecuada, etc.
Un gen terapéutico de interés para incorporar en el genoma de VAAr de la presente invención se suministra con alta eficiencia a las células nerviosas y después se integra en el genoma de las células. Cuando se usa el vector de VAAr de la presente invención, el gen terapéutico se puede transferir a aproximadamente 10 veces más, aproximadamente 20 veces o más, aproximadamente 3o veces o más, aproximadamente 40 veces o más o aproximadamente 50 veces o más de la célula nerviosa en comparación con un vector de VAAr convencional. Se puede determinar el número de células nerviosas que portan el gen transferido a las mismas, p. ej., preparando un vector de VAAr para empaquetar el genoma del vector de VAAr con cualquier gen marcador incorporado en el mismo, administrando el vector de VAAr a un animal para ensayar y midiendo después el número de células del sistema nervioso que expresan el gen marcador (o proteína marcadora) incorporado en el genoma del vector de VAAr. El gen marcador que se va a usar en el presente documento se selecciona de genes conocidos. Los ejemplos de dicho gen marcador incluyen un gen LacZ, un gen de proteína de fluorescencia verde (GFP) y un gen de proteína emisora de luz (p. ej., luciferasa de luciérnaga).
4. Otros genes terapéuticos
Como otros medios o medios adicionales para mejorar la función inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras, por ejemplo, se puede esperar un medio para mejorar la expresión de la neurexina 1a que es un compañero de unión de la neuroligina 2, y un medio para mejorar la transducción de señales intracelulares de la neuroligina 2. Como alternativa, como tales otros medios o medios adicionales, un medio para reducir las funciones de las sinapsis excitadoras, tales como suprimir la expresión de una proteína que implica la operación de sinapsis excitadoras, que es específicamente un medio de reducir el número de neuroligina 1 mediante el uso del antisentido de neuroligina 1 (referencia no perteneciente a patente 4: Fang et al., Mol. Neurobiol. noviembre de 2014) también puede ser útil.
El vector de VAAr de la presente invención puede expresar diferentes proteínas para controlar las funciones sinápticas. Los ejemplos de tales proteínas diferentes incluyen anticuerpos neutralizantes contra proteínas y receptores que existen en las membranas sinápticas (incluyendo los sitios de unión a antígenos, Fab, Fab2, anticuerpo monocatenario (scFv), etc.). Los ejemplos de las clases de estos anticuerpos incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
Por ejemplo, para la inhibición de las funciones de las sinapsis excitadoras, un gen terapéutico que se va a incorporar al genoma de VAAr de la presente invención puede ser un polinucleótido para modificar (por ejemplo, interrumpir o disminuir) una función de un gen endógeno diana o un polinucleótido para cambiar (por ejemplo, reducir) un nivel de expresión de una proteína endógena, tal como una molécula antisentido, una ribozima, ARN interferente (ARNi) y microARN (miARN). Por ejemplo, para inhibir eficazmente la expresión de un gen diana mediante el uso de una secuencia antisentido, preferentemente, la longitud de un ácido nucleico antisentido es de 10 o más nucleótidos, 15 o más nucleótidos, 20 o más nucleótidos o 100 o más nucleótidos, o incluso más preferentemente 500 o más nucleótidos. En general, la longitud de un ácido nucleico antisentido para usar es menor de 5 kb y es preferentemente menor de 2,5 kb.
Mediante el uso de una ribozima, el ARNm que codifica una proteína de interés se puede escindir específicamente para disminuir la expresión de la proteína. Para el diseño de dicha ribozima, se puede hacer referencia a diversas publicaciones conocidas (véase, p. ej., FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986, etc.).
El término "ARNi" se refiere a un fenómeno que, cuando se introduce en las células un ARN bicatenario con una secuencia idéntica o similar a una secuencia génica diana, se disminuye la expresión tanto de un gen extraño diana introducido como del gen endógeno diana. Los ejemplos de ARN usados en el presente documento incluyen ARN bicatenario de 21 a 25 nucleótidos de longitud que desencadena la interferencia de ARN, tales como ARNbc (ARN bicatenario), ARNip (ARN de interferencia pequeño), ARNhc (ARN de horquilla corto) o miARN (microARN). Estos ARN se pueden suministrar localmente a un sitio deseado mediante un sistema de suministro usando liposomas o se puede usar un vector que genera el ARN bicatenario descrito anteriormente para la expresión local del mismo. Se conocen métodos para preparar o usar dicho ARN bicatenario (ARNbc, ARNip, ARNhc o miARN) a partir de muchas publicaciones (véase, p. ej., la publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2002-516062, patente de los Estados Unidos n.° 2002/086356A, Nature Genetics, 24 (2), 180-183, febrero de 2000).
Para usar estos otros genes terapéuticos, por ejemplo, se permite que una secuencia conocida del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) intervenga en un polinucleótido contenido en el vector de la presente invención. Cuando el genoma de VAAr de la presente invención es de tipo no sc, es posible seleccionar promotores con longitudes y genes de interés más variados y también una pluralidad de genes de interés. Un polinucleótido que se va a empaquetar en el vector de VAAr de la presente invención tiene una longitud completa preferentemente de aproximadamente 5 kb o menos (aproximadamente 4,7 kb o menos cuando se excluye una región de RTI).
5. Preparación del vector de VAAr de la presente invención
Puede emplearse un método general como método para preparar el vector de VAAr de la presente invención. Por ejemplo, el método puede comprender una etapa de transfección de una célula cultivada con: (a) un primer polinucleótido que codifica una proteína de la cápside (denominada en general plásmido auxiliar de VAA) y (b) un segundo polinucleótido (que porta un gen terapéutico de interés) para empaquetar en el vector de VAAr de la presente invención; y puede comprender además una etapa de transfección de la célula cultivada con (c) un plásmido que codifica un factor derivado de adenovirus, también denominado plásmido auxiliar de adenovirus (AdV), o una etapa de infectar células cultivadas con un adenovirus. El método también puede comprender una etapa de cultivo de la célula cultivada transfectada y una etapa de recogida del vector de virus adenoasociado recombinante del sobrenadante de cultivo. Asimismo, (d) un ejemplo de un método para preparar el vector de VAAr de la presente invención incluye un método para producir un VAAr a gran escala mediante la preparación de baculovirus que contienen los polinucleótidos (a) y (b) anteriores, respectivamente, y a continuación la infección de células de insectos, Sf9 o similares con los virus. Este método ya se conoce y también se usa en los ejemplos de la descripción.
Un nucleótido que codifica la proteína de la cápside de la presente invención en el primer polinucleótido (a) se une preferentemente de manera operativa a una secuencia promotora conocida que es operativa en células cultivadas. Como dicha secuencia promotora, por ejemplo, se puede usar adecuadamente un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de EF-1a, un promotor de SV40 y similares. Asimismo, el primer polinucleótido puede comprender una secuencia potenciadora conocida, una secuencia de Kozak, una secuencia de señal de adición de poliA y similares, según sea adecuado.
El segundo polinucleótido (b) comprende un gen terapéutico en una posición en la que es operativo con un promotor específico de células del sistema nervioso. Asimismo, el segundo polinucleótido puede comprender una secuencia potenciadora conocida, una secuencia de Kozak, una secuencia de señal de adición de poliA y similares según sea adecuado. El primer polinucleótido puede comprender además un sitio de clonación, que se puede escindir mediante diversas enzimas de restricción conocidas y se localiza cadena abajo de la secuencia promotora específica de células del sistema nervioso. Es más preferido un sitio de clonación múltiple que contenga una pluralidad de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Los expertos en la materia pueden incorporar un gen terapéutico de interés cadena abajo del promotor específico de células del sistema nervioso, de acuerdo con procedimientos de ingeniería genética conocidos. Para dichos procedimientos de ingeniería genética, véase, p. ej., Molecular Cloning 3a edición, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001, etc.
En la preparación del vector de VAAr de la presente invención, se usa un plásmido de virus auxiliar (p. ej., adenovirus, virus del herpes o vaccinia) y se puede introducir en células cultivadas simultáneamente con el primer y segundo polinucleótidos anteriores. Preferentemente, el método de preparación de la presente invención comprende además una etapa de introducción de un plásmido auxiliar de adenovirus (AdV). En la presente invención, preferentemente, el auxiliar de AdV procede de un virus de la misma especie que el de las células cultivadas. Por ejemplo, cuando se usan células humanas cultivadas 293T, se puede usar un vector de virus auxiliar procedente de AdV humano. Como dicho vector auxiliar de AdV, se puede usar un sistema de VAA sin auxiliar disponible en el mercado (Agilent Technologies, n.° de catálogo 240071), por ejemplo.
En la preparación del vector de VAAr de la presente invención, los ejemplos de un método para transfectar células cultivadas con el o los tipos de plásmidos anteriores, que se pueden usar en el presente documento, incluyen diversos métodos conocidos, tales como el método de fosfato de calcio, método de lipofección y método de electroporación, etc. Dichos métodos se describen en, p. ej., Molecular Cloning 3a Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, etc.
6. Composición farmacéutica que contiene el vector de VAAr de la presente invención
El principio activo de la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular solo o en combinación en la misma y también se puede proporcionar como preparación farmacéutica mediante formulación con un vehículo o aditivo farmacéuticamente aceptable para una preparación farmacéutica. En este caso, el principio activo de la presente invención puede estar contenido en una cantidad, p. ej., de 0,1 a 99,9 % en peso en la preparación.
Los ejemplos de vehículos o aditivos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar incluyen excipientes, disgregantes, adyuvantes de disgregación, aglutinantes, lubricantes, agentes de recubrimiento, colorantes, diluyentes, agentes de disolución, adyuvantes de disolución, agentes isotónicos, reguladores de pH, estabilizadores, etc. Para administración oral, se pueden usar en combinación excipientes que se usan en general en la técnica, tales como celulosa microcristalina, citrato de sodio, carbonato de calcio, disgregantes tales como almidón y ácido algínico, aglutinantes de granulación, tales como polivinilpirrolidona y lubricantes. Cuando se desean suspensiones y/o elixires acuosos para administración oral, el principio activo se puede usar en combinación con diversos edulcorantes o correctores, agentes colorantes o tintes y, si es necesario, también agentes emulsionantes y/o de suspensión, junto con diluyentes, tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina, etc. y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de preparaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden incluir polvos, comprimidos, cápsulas, gránulos finos, gránulos, líquidos o jarabes, etc. Los ejemplos de preparaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden incluir inyecciones, inyecciones intratecales, supositorios, etc. Para administración parenteral, pueden emplearse soluciones del principio activo de la presente invención disueltas en aceite de sésamo o de cacahuete o en una solución acuosa de propilenglicol. Las soluciones acuosas deben tamponarse adecuadamente (preferentemente a pH 8 o superior) según sea necesario; en primer lugar, es necesario hacer que el diluyente líquido sea isotónico. Como dicho diluyente líquido, se puede usar solución salina fisiológica. Las soluciones acuosas preparadas de este modo son adecuadas para inyección intravenosa. Por otro lado, las soluciones oleosas son adecuadas para inyección intraarticular, inyección intramuscular e inyección subcutánea. La preparación de todas estas soluciones en condiciones estériles se puede lograr fácilmente mediante técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia. Asimismo, el principio activo de la presente invención también se puede administrar por vía tópica a la piel, etc. En este caso, la administración tópica se realiza convenientemente mediante cremas, geles, pastas, pomadas y similares, de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional.
La dosis de la composición farmacéutica de la presente invención no está particularmente limitada y se puede elegir una dosis adecuada dependiendo de diversas condiciones tales como el tipo de enfermedad, la edad y los síntomas del paciente, la vía de administración, el objetivo terapéutico, la presencia o ausencia de fármacos concurrentes, etc. La dosis de la composición farmacéutica de la presente invención es, pero sin limitación, por ejemplo, de 1 a 5000 mg y preferentemente de 10 a 1000 mg por día para un adulto (p. ej., de peso corporal de 60 kg). Dicha dosis diaria se puede administrar en 2 a 4 dosis divididas al día. Cuando se usa gv (genoma vectorial) como unidad de dosificación, la dosis puede seleccionarse de, pero sin limitación, p. ej., el intervalo de 109 a 1014 gv, preferentemente, de 1010 a 1013 gv y, más preferentemente, de 1010 a 1012 gv por kg de peso corporal.
7. Administración del vector de VAAr de la presente invención
El VAAr de la presente invención es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica de un sujeto vivo (incluyendo las barreras hematoencefálicas fetales y neonatales incompletas y las barreras hematoencefálicas adultas establecidas) y, por tanto, es capaz de suministrar genes en el VAAr a células del sistema nervioso del cerebro, la médula espinal y similares a través de la administración periférica a un sujeto vivo (incluyendo adultos y fetos o recién nacidos). Asimismo, el vector de VAAr que se va a usar en la presente invención puede dirigirse a las células nerviosas contenidas en el cerebro, la médula espinal y similares de un adulto mediante administración periférica. Como se usa en el presente documento, la expresión "administración periférica" se refiere a vías de administración que los expertos en la materia normalmente entienden como administración periférica, incluyendo administración intravenosa, administración intraarterial, administración intraperitoneal, administración intracardíaca, administración intramuscular y administración intravascular umbilical (p. ej., el objetivo es un feto), etc. Asimismo, también se puede usar un método de administración, que implica el uso de un líquido distinto de la sangre que se comunica de forma fluida con el cerebro, tal como la administración intratecal, para el vector de VAAr de la presente invención. En otra realización, el vector de VAAr de la presente invención también se puede administrar localmente a un sitio diana dentro del cerebro, tal como el hipocampo. Por ejemplo, cuando el VAAr de la presente invención se administra mediante administración intratecal en un líquido cefalorraquídeo o mediante administración periférica en la sangre, puede proporcionarse un medio de administración más sencillo que la administración intraparenquimatosa.
8. Equipo para la preparación del vector de VAAr de la presente invención
En otra realización, la presente invención proporciona un equipo para preparar el VAAr de la presente invención. Dicho equipo puede contener, por ejemplo, (a) un primer polinucleótido para la expresión de la proteína de la cápside VP1 o similar y (b) un segundo polinucleótido que se va a empaquetar en el vector de VAAr. Por ejemplo, el primer polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica los aminoácidos de la SEQ ID NO. Por ejemplo, el segundo polinucleótido puede comprender o no un gen terapéutico de interés, pero preferentemente puede comprender diversos sitios de escisión por enzimas de restricción para la incorporación de dicho gen terapéutico de interés.
El equipo para preparar el vector de VAAr de la presente invención puede contener además cualquier componente descrito en el presente documento (p. ej., un auxiliar de AdV). El equipo de la presente invención puede incluir además instrucciones que describen los protocolos para la preparación del vector de VAAr usando el equipo de la presente invención.
9. Agente quimioterapéutico para usar en combinación con el VAAr de la presente invención
El vector de VAAr según la invención de la presente solicitud también se puede usar en combinación con un agente quimioterapéutico existente. Los ejemplos de dicho agente quimioterapéutico incluyen fenitoína, carbamazepina, ácido valproico, topiramato, lamotrigina, rufinamida, fenobarbital, diazepam, clonazepam, etosuximida, zonisamida, gabapentina, levetiracetam, midazolam, clobazam y propofol. Por ejemplo, después de la administración del VAAr de la invención de la presente solicitud, se puede esperar una reducción significativa de la dosis del agente quimioterapéutico anterior.
10. Determinación de efectos terapéuticos
Los efectos terapéuticos del vector de VAAr de la presente invención se pueden determinar usando un medio conocido para determinar si la excitación puede ser inhibida por los efectos terapéuticos. Los ejemplos de dichos medios conocidos incluyen, pero sin limitación, análisis de niveles de comportamiento, análisis de la farmacodinámica de transmisores marcados (p. ej., GABA), medición del potencial postsináptico excitador y del potencial postsináptico inhibidor, medición de los cambios en el umbral de la epilepsia inducidos por medicamentos o estimulación eléctrica, onda cerebral, topografía óptica y tomografía por emisión de positrones (TEP).
11. Términos usados en la descripción
El significado indicado por cada término como se usa en el presente documento es como se describe a continuación. Se entiendo que los términos que no se han descrito en particular en el presente documento hacen referencia a significados que normalmente entienden los expertos en la materia.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "virus o vector vírico", "virión de virus" y "virus o partículas víricas" se usan indistintamente, a menos que se indique otra cosa.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sistema nervioso" se refiere a un sistema de órganos compuesto por tejidos nerviosos. Como se usa en el presente documento, la expresión "células del sistema nervioso" incluye al menos las células nerviosas incluidas en el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal, etc. y puede incluir además células neurogliales, células de la microglía, astrocitos, oligodendrocitos, ependimocitos, células endoteliales cerebrovasculares, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se usa indistintamente con "ácido nucleico", "gen" o "molécula de ácido nucleico", que se entiende que significan un polímero de nucleótidos. Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de nucleótidos" se usa indistintamente con "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia de bases", que está representada por una secuencia de desoxirribonucleótidos (abreviados como A, G, C y T). Por ejemplo, se entiende que el "polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma" significa un polinucleótido que comprende una secuencia mostrada por los desoxinucleótidos respectivos A, G, C y/o T de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma.
Cada uno de "virus o genoma vírico" y "polinucleótido" según la presente invención puede existir en forma de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico), respectivamente, y también puede estar en forma de ARN (por ejemplo, ARNm). Cada uno del genoma vírico y el polinucleótido, como se usan en el presente documento, puede ser un ADN bicatenario o monocatenario. El ADN o ARN monocatenario puede ser una hebra codificante (también conocida como hebra con sentido) o una hebra no codificante (también conocida como hebra antisentido). Con respecto a la explicación del presente documento para colocar un promotor, un gen de interés, señal de poliadenilación, etc. en el gen, que están codificados por el genoma de VAAr, si el genoma de VAAr es una hebra con sentido, se describe la propia hebra y, si es una hebra antisentido, se describe su hebra complementaria, a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en el presente documento, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente y se entiende que significan un polímero de aminoácidos. El polipéptido como se usa en el presente documento se representa de acuerdo con la designación de péptidos convencional, en la que el extremo N (extremo amino) está en el lado izquierdo y el extremo C (extremo carboxilo), en el lado derecho. El péptido parcial en el polipéptido de la presente invención (como se usa en el presente documento, puede denominarse brevemente péptido parcial de la presente invención) incluye un péptido parcial del polipéptido de la presente invención descrito anteriormente, que tiene preferentemente las mismas propiedades que las del polipéptido anterior de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, el término "plásmido" se refiere a diversos elementos génicos conocidos, por ejemplo, un plásmido, un fago, un transposón, un cósmido, un cromosoma, etc. El plásmido se puede replicar en un hospedador particular y transportar secuencias génicas entre células. Como se usa en el presente documento, el plásmido contiene diversos nucleótidos conocidos (ADN, ARN, PNA y una mezcla de los mismos) y puede ser monocatenario o bicatenario, y preferentemente bicatenario. Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión "plásmido de vector de VAAr" incluye una doble cadena formada por el genoma del vector de VAAr y su hebra complementaria, a menos que se indique lo contrario. El plásmido usado en la presente invención puede ser lineal o circular.
Como se usa en el presente documento, el término "empaquetamiento" se refiere a los acontecimientos que incluyen la preparación de genomas víricos monocatenarios, ensamblaje de proteínas de la cubierta (cápside), confinamiento del genoma vírico dentro de una cápside (encapsidación) y similares. Cuando se introduce un vector plasmídico adecuado (normalmente, una pluralidad de plásmidos) en una línea celular que permite el empaquetamiento en condiciones adecuadas, se construyen y secretan en el cultivo partículas víricas recombinantes (es decir, viriones de virus, vectores víricos).
Ejemplos
La presente invención se describe a continuación con más detalle haciendo referencia a los ejemplos, pero el alcance de la invención no debería limitarse a los siguientes ejemplos.
Esquema experimental
Administración intracardíaca de VAAr-Neuroligina2 (VAAr-NL2) a las 6 semanas de edad para: - Frecuencia de las crisis - Duración - Intensidad - Duración x intensidad - Cambios en el umbral de estimulación eléctrica
Expresión intracerebral de VAAr de tipo administración intravascular portador de neuroligina2
Se encuentran informes acerca de la terapia génica para la epilepsia con modelos animales en diversos sitios, pero todos implican realizar la administración tópica de forma estereotáctica. Para su aplicación a un paciente humano, se desean métodos de administración sin procedimientos invasivos. En esta ocasión, los inventores de la presente solicitud prepararon un vector de virus adenoasociado de tipo administración intravascular (VAAr), administraron el vector a ratones EL que desarrollaban epilepsia de forma natural (Suzuki, Proc. Jpn. Acad., Ser.B89 (2013)) y, a continuación, observaron la condición de la expresión intracerebral y la presencia o ausencia de un efecto de supresión de las crisis.
Materiales y métodos experimentales
- Vector de virus adenoasociado recombinante (VAAr)
El vector que se va a usar en los ejemplos es el AAV9/3 desvelado previamente (que tiene una mutación de tirosina (Y446 ^ F) introducida en la cápside de VAA9 y RTI de VAA3) que porta un promotor de sinapsina I (documento WO 2012/057363). Para diferenciarla de la neuroligina 2 endógena (NL2), se preparó un vector de VAAr que expresa neuroligina2 con el extremo N, al que se había unido una secuencia marcadora FLAG (DDDDK), (AAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL2), y, a continuación, se administró a animales experimentales.
- Administración al animal
Se usaron ratones EL (6 semanas de edad, machos, peso corporal: 22-32 g).
Con anestesia de sevoflurano al 2-4 %, se realizó la inyección intracardíaca de AAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL2 a 4,1 x 1013 genomas vectoriales/ml x 0,1 ml/ratón (grupo de inyección intracardíaca de NL2 n = 10). Un grupo al que se administró AAV9/3-Syn1-AcGFP-WPRE mediante inyección intracardíaca a 2,3 x 1013 gv/ml x 0,1 ml/ratón (n = 17) y un grupo al que solo se administró solución salina fisiológica a 0,1 ml/ratón (n = 14) se designaron como grupos de control. Además, para comparar con la administración tópica, un grupo de ratones a los que se inyectó AAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL 2 en la región CA3 del hipocampo bilateral (0,5 mm anterior y 3,0 mm lateral al bregma, y 2,0 mm desde la superficie del cerebro) a 4,1 x 1013 gv/ml x 0,005 ml (n = 3) se designó como grupo de administración tópica.
T l 11
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continuación
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- Evaluación por estimulación aceleradora angular
Después de la administración del vector y similares, cada uno de los ratones se rotó con la cola sujeta durante tiempos predeterminados (8 rotaciones) cada semana hasta las 22 semanas de edad y se grabó en vídeo el comportamiento de cada uno de los ratones. A continuación, se observó en vídeo la presencia o ausencia de crisis, la duración cuando un ratón había desarrollado una crisis y la intensidad de la misma.
La intensidad de las crisis se puntuó de la siguiente manera:
1 punto: sin crisis;
2 puntos: solo levantó la cola o solo sacudió el cuerpo;
3 puntos: desarrolló una crisis clara, pero mantuvo la postura sin caerse; y
4 puntos: desarrolló una crisis grave y no pudo mantener la postura y cayó de lado.
La duración de las crisis se puntuó de la siguiente manera:
1 punto: sin crisis;
2 puntos: 1-10 segundos;
3 puntos: 11-20 segundos;
4 puntos: 21-30 segundos;
5 puntos: 31-60 segundos; y
6 puntos: 61 segundos o más.
La incidencia de las crisis, la duración media de las crisis, la intensidad media de las crisis y la duración x intensidad media de las crisis de cada grupo se evaluaron semanalmente.
- Evaluación mediante estimulación eléctrica
A las 5 (antes de la administración del vector), 12, 18, 22 semanas de edad, se colocaron electrodos en ambas orejas de un ratón, se aplicó estimulación eléctrica (se usaron los siguientes parámetros en Neuropack S1 (NIHON KOHDEN): duración: 1 ms, intervalo: 50 ms, serie de 10, resistencia: máx. 50 mA cada 0 mA a 5 mA) para inducir una crisis epiléptica y después se midió el umbral de crisis. Si no se indujo una crisis con 50 mA, se determinó que el umbral de convulsión era de 60 mA para su evaluación. Solo para el grupo de ratones de administración tópica, este procedimiento se realizó a las 5, 12 y 22 semanas de edad.
- El procesamiento estadístico se evaluó mediante las siguientes pruebas.
Incidencia de crisis: Prueba exacta de Fisher
Otros: Prueba de la t de Welch
- Análisis histológico
Preparación de la muestra de cerebro: Cada ratón se anestesió profundamente con pentobarbital y, a continuación, se le inyectó tampón de fosfato 0,1 M que contenía paraformaldehído al 4 % (pH 7,4) a través del ventrículo izquierdo para la fijación por perfusión. Después de la fijación, el cerebro se disecó, se fijó por inmersión en un fijador durante medio día, se transfirió a un tampón de fosfato 0,1 M que contenía sacarosa al 15 % (pH 7,4) y, a continuación, se almacenó en un frigorífico hasta un experimento histoquímico.
- Expresión e identificación celular de VAAr9-GFP
Se prepararon secciones sagitales de 40 pm usando un criomicrotomo y, a continuación, se identificó la expresión de GFP en cada sitio del cerebro usando un microscopio de fluorescencia. Las células que expresan GFP se identificaron mediante doble tinción con los siguientes marcadores.
Células nerviosas: NeuN o MAP2; células gliales: GFAP; e interneuronas inhibidoras: parvalbúmina
- Expresión e identificación celular de VAAr9-NL2
De manera similar a la de la identificación de GFP, se prepararon secciones sagitales de 40 pm y se identificó la expresión del transgén NL2 mediante tinción de anticuerpos de FLAG (DDDDK). El anticuerpo de FLAG se adquirió de Abcam pic. y la expresión se identificó en un microscopio de fluorescencia mediante procesamiento de imágenes usando un anticuerpo secundario conjugado con Alexafluor 488.
Resultados experimentales y análisis
Se sometieron cortes de hipocampo (muestras) a la medición de los cambios en el flujo de entrada Ca2+ intracelular tras la carga isquémica en función de los cambios de fluorescencia de rhod 2-AM (DOJINDO n.° de catálogo: R002). En comparación con los ratones DDY, los ratones EL presentaron, en la región CA3, aumentos significativos en el flujo de entrada de Ca2+ intracelular inducidos en hipocampos por carga isquémica, lo que sugiere la vulnerabilidad del sistema inhibidor en la región CA3. A continuación, la expresión de las células intermedias de un sistema de inhibición de la excitación en hipocampos de EL se examinó histológicamente mediante inmunotinción con el anticuerpo de parvalbúmina (n.° de catálogo: LS-C39101). No se encontraron diferencias significativas entre los ratones EL y los ratones DDY con respecto al número de células positivas para parvalbúmina en cada región del hipocampo, lo que sugiere posibles cambios a nivel sináptico. Según los resultados anteriores, se preparó un vector de VAAr que expresa un gen de una molécula relacionada con la sinapsis del sistema inhibidor, el vector se administró a EL mediante inyección estereotáctica en el hipocampo e inyección intravascular y, a continuación, se observó histológicamente la distribución intracerebral mediante tinción usando un anticuerpo de FLAG (fig. 1a y fig. 1b). Como se muestra en la fig. 1a, NLGN2 marcado con FLAG se expresó ampliamente en células nerviosas corticales del cerebro y del hipocampo como resultado de la administración intravascular del vector de la presente invención, de modo que pudo confirmarse el suministro exitosa de genes por VAAr.
Posteriormente, se observó en el grupo de inyección intravascular la presencia o ausencia del efecto de supresión de la crisis epiléptica (fig. 2 a fig. 6). Un grupo al que se administró un vector de VAA de expresión de proteína fluorescente verde EGFP y un grupo al que se administró solución salina fisiológica se designaron grupos de control. Se evaluó el efecto de suprimir la epilepsia para cada atributo; es decir, la frecuencia de desarrollo de convulsiones, la intensidad, la duración y la intensidad x duración de las crisis de un ratón a cada edad en semanas. Adicionalmente, se observaron diferencias significativas en las posiciones marcadas con "*" y "**" en las figuras. El grupo al que se había administrado NLGN2 suprimió las crisis de manera más significativa que los grupos de control y no presentó ningún cambio en el umbral para la estimulación eléctrica (fig. 2 a fig. 6). La ausencia de cambio en el umbral para la estimulación eléctrica sugirió que el inicio de la operación de las sinapsis inhibidoras permaneció sin cambios desde el momento anterior a la introducción y sugirió un efecto secundario bajo.
Se observó expresión del gen de interés en las neuronas del hipocampo del grupo de inyección del hipocampo y en las neuronas del cerebro completo, incluyendo las neuronas del hipocampo del grupo de administración intravascular (los resultados no se muestran). En comparación con el grupo de control, el grupo de inyección en el hipocampo, específicamente, el grupo al que se había administrado NLGN2 presentó una diferencia significativa en la frecuencia de las crisis en algunos casos, pero, en general, no mostró ninguna diferencia significativa en el efecto (fig. 7 a fig.
11). En las figuras, se observaron diferencias significativas para los indicados con "*" y "**". Por otra parte, en comparación con los grupos de administración intracardíaca, en general, se observó que los grupos de administración intracardíaca tienden a presentar efectos más altos en la supresión de la epilepsia que los otros grupos en cualquier atributo de la frecuencia de las crisis, la duración de las crisis y la intensidad de las crisis.
Las moléculas diana se suministraron a las neuronas del cerebro completo mediante el vector de VAA de tipo administración intravascular. El efecto inhibidor de la excitación de dichas moléculas es capaz de suprimir las crisis epilépticas sin cambiar el umbral de estimulación eléctrica, lo que sugiere la posibilidad de una terapia génica de epilepsia no invasiva como un método terapéutico más ventajoso.
Aplicabilidad industrial
Se puede esperar que el uso del vector de VAAr de la presente invención trate (p. ej., alivio, mejora y reparación) disfunciones genéticas en las células del sistema nervioso (incluyendo disfunciones congénitas y adquiridas).
Texto independiente del listado de secuencias
SEQ ID NO 1: secuencia de nucleótidos de neuroligina2 humana
SEQ ID NO 2: secuencia de aminoácidos de neuroligina2 humana
SEQ ID NO 3: secuencia de nucleótidos de neuroligina2 de ratón
SEQ ID NO 4: secuencia de aminoácidos de neuroligina2 de ratón
SEQ ID NO 5: secuencia de nucleótidos de neuroligina2 de rata
SEQ ID NO 6: secuencia de aminoácidos de neuroligina2 de rata
SEQ ID NO 7: secuencia de nucleótidos de neuroligina2 de ratón marcada con Flag
SEQ ID NO 8: secuencia de aminoácidos de neuroligina2 de ratón marcada con Flag
SEQ ID NO 9: secuencia de aminoácidos variante Y445F de la proteína de la cápside de VAA1
SEQ ID NO 10: secuencia de aminoácidos variante Y444F de la proteína de la cápside de VAA2
SEQ ID NO 11: secuencia de aminoácidos variante Y446F de la proteína de la cápside de VAA9

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de virus adenoasociado recombinante, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína para mejorar la función inhibidora de la excitación de las sinapsis inhibidoras en un sujeto vivo, en donde el vector vírico es para usar en el tratamiento de la epilepsia,
en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína neuroligina 2 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 95 % o más con dicha secuencia de aminoácidos y unión a neurexina, y
en donde el vector de virus adenoasociado recombinante comprende:
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que al menos una tirosina está sustituida por fenilalanina y la tirosina en la posición 445 está sustituida por fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA1 de tipo silvestre;
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que al menos una tirosina está sustituida por fenilalanina y la tirosina en la posición 444 está sustituida por fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA2 de tipo silvestre; o
una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos variante en la que al menos una tirosina está sustituida por fenilalanina y la tirosina en la posición 446 está sustituida por fenilalanina en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de VAA9 de tipo silvestre.
2. El vector de virus adenoasociado recombinante para usar según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido comprende una secuencia promotora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia promotora de sinapsina I, una secuencia promotora de la proteína básica de mielina, una secuencia promotora de enolasa específica de neuronas, una secuencia promotora de la proteína cinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CMKII), una secuencia promotora de tubulina al, una secuencia promotora de la cadena p del factor de crecimiento derivado de plaquetas, una secuencia promotora de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), una secuencia promotora L7 (promotor específico de células de Purkinje cerebelares), una secuencia promotora de la proteína ácida fibrilar glial (hGfa2) y una secuencia promotora del receptor de glutamato delta 2 (promotor específico de células de Purkinje del cerebelo) y una secuencia promotora de la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD65/GAD67).
3. El vector de virus adenoasociado recombinante para usar según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polinucleótido comprende una repetición terminal invertida (RTI) seleccionada del grupo que consiste en VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA8 y VAA9.
4. El vector de virus adenoasociado recombinante para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polinucleótido comprende además un polinucleótido para inhibir la excitación de sinapsis excitadoras.
5. Una composición farmacéutica, que comprende el vector de virus adenoasociado recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. La composición farmacéutica según
Figure imgf000057_0001
reivindicación 5, que está adaptada para la administración intracerebral.
7. La composición farmacéutica según
Figure imgf000057_0002
reivindicación 5, que está adaptada para la administración intratecal.
8. La composición farmacéutica según
Figure imgf000057_0003
reivindicación 5, que está adaptada para la administración periférica.
9. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que es para usar según las reivindicaciones 1-4, en donde se usa en combinación con un agente quimioterapéutico para una enfermedad neuropsiquiátrica.
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