JP6924441B2 - てんかん治療のためのアデノ随伴ウイルスビリオン - Google Patents
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Description
[1] 生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害(注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群)からなる群より選択される疾患の治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
[2] 前記ポリヌクレオチドが、配列番号2、4もしくは6のアミノ酸配列、またはこれら配列と約90%以上の同一性を有してニューレキシンと結合するアミノ酸配列を含むニューロリギン2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、[1]に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
[3] 前記疾患がてんかんである、[1]又は[2]に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
[4] 前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸配列中446位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス組換えベクター。
[5] 前記ポリヌクレオチドが、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター配列、L7プロモーター配列(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)、グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ2プロモーター(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)配列、グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD65/GAD67)プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
[6] 前記ポリヌクレオチドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8、およびAAV9からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート(ITR)を含む、[1]〜[5]のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
[7] 前記ポリヌクレオチドが、興奮性シナプスの興奮を抑制するためのポリヌクレオチドをさらに含む、[1]〜[6]のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
[8] [1]〜[7]のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス組換えベクターを含む、医薬組成物。
[9] 脳内投与されるための、[8]に記載の医薬組成物。
[10] 髄腔内投与されるための、[8]に記載の医薬組成物。
[11] 末梢投与されるための、[8]に記載の医薬組成物。
[12] 神経精神疾患に係る化学療法剤と併用するための、[8]〜[11]のいずれかに記載の医薬組成物。
[13] 生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターを生体に投与することを含む、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害(注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群)からなる群より選択される疾患の治療方法。
[14]化学療法と併用される、[13]に記載の治療方法
本出願において、シナプスとは、神経細胞の軸索終末等が膨らんだシナプス小頭部と、その標的のニューロンまたは筋細胞との接合部を指す。生体において、シナプスには、興奮を伝達する興奮性シナプスと、興奮の伝達を抑制する抑制性シナプスとが存在する。また、大部分のシナプスは、化学物質の伝達によって媒介される化学シナプス(信号伝達が遅い)である。もう1つの型は、時間的に速い応答を示す電気シナプスであるが、成熟哺乳類の中枢神経では余り見られない。
本願発明は、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害(注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群)からなる群より選択される疾患、とりわけてんかんの治療に有用であるrAAVベクターを提供するものである。
本願発明において、シナプスの機能制御に用いられる遺伝子を神経系細胞に送達するためのベクターとしては、WO 2012/057363に記載される、末梢投与によっても神経細胞に効率的に遺伝子送達できる組換えアデノ随伴ウイルスベクター(本明細書中、血管投与型ベクターともいう)、あるいはWO 2008/124724などに記載されるものを用いることができる。本発明のrAAVベクターは、生体の血液脳関門を通過可能であり、したがって血液脳関門を介して脳に送達される投与手段、例えば患者への末梢投与などによって、患者の脳、脊髄などの神経系細胞に目的の治療用遺伝子を導入可能である。また、髄腔内投与や脳内の標的部位に直接投与することも可能である。
抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させる他の手段または追加の手段として、例えば、ニューロリギン2の結合パートナーであるニューレキシン1αの発現を増強させる手段、ニューロリギン2の細胞内シグナル伝達を向上させる手段などが期待できる。あるいは、そのような他の手段または追加の手段として、興奮性シナプスの機能を低下させる手段、例えば興奮性シナプスの作動に関するタンパク質の発現を抑制すること、具体的にはニューロリギン1のアンチセンスによってニューロリギン1を低減させる手段(非特許文献4:Fangら、Mol. Neurobiol. 2014 Nov.)等もまた有用となり得る。
本発明のrAAVベクターを調製する方法としては一般的なものを利用することができ、例えば、(a)カプシドタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド(一般に、AAVヘルパープラスミドと称される)、および(b)本発明のrAAVベクター内にパッケージングされる第2のポリヌクレオチド(目的の治療用遺伝子を含む)を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、(c)アデノウイルス(AdV)ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、および培養上清より組換えアデノ随伴ウイルスベクターを収集する工程を含むこともできる。(d)さらに、本発明のrAAVベクターの調製方法は、上記(a)(b)のポリヌクレオチドをそれぞれ含むバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞であるSf9などに感染させることにより、rAAVを大量に産生する方法も含む。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。
本発明のrAAVベクターは、神経疾患、とりわけシナプスにおけるタンパク質機能異常に係る疾患(例、統合失調症、自閉症スペクトラム障害など)などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができる。それら遺伝子を含むrAAVベクターを、例えば血管内に投与し、血液脳関門を通過して脳、脊髄、網膜の神経細胞中に組込むことができる。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のような抗体、神経栄養因子(NGF)、成長因子(HGF)、酸性線維細胞増殖因子(aFGF)、miRNAなどをコードするポリヌクレオチドを選択できる。このようなrAAVベクターを被検体に末梢投与することによって、などの神経疾患を治療することが期待できる。
本発明のrAAVは、生体の血液脳関門(未完成な胎児及び新生児の血液脳関門、および確立した成体の血液脳関門を含む)を通過可能であるので、生体(成体および胎児または新生児を含む)に末梢投与することによって、本発明のrAAVを脳、脊髄などの神経系細胞に遺伝子の送達が可能である。さらに、本発明に用いるrAAVベクターは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経細胞を標的とすることができる。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与、臍帯血管内投与(例えば、胎児を対象とする場合)など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。また、血液以外に脳と流体接続される投与方法、例えば髄腔内投与も、本発明のrAAVベクターに用いることができる。別の実施形態において、本発明のrAAVベクターを、海馬などの脳内の標的部位に局所投与することも可能である。例えば、本発明のrAAVを、髄腔内投与にて髄液内に、または末梢投与によって血中内に投与する場合、脳実質内投与と比較して、より平易な投与手段を提供できる。
本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、(a)カプシドタンパク質VP1等を発現するための第1のポリヌクレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第2のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、第1のポリヌクレオチドは、配列番号:のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、第2のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺伝子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。
本願発明に係るrAAVベクターは、既存の化学療法剤と併用することもできる。そのような化学療法剤の例としては、フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、トピラマート、ラモトリギン、ルフィナミド、フェノバルビタール、ジアゼパム、クロナゼパム、エトスクシミド、ゾニサミド、ガバペンチン、レベチラセタム、ミダゾラム、クロバザム、プロポフォールが挙げられる。例えば、本願発明のrAAVの投与後に、上記化学治療剤の投与量を大きく低減することが期待できる。
本発明のrAAVベクターの治療効果は、興奮が抑えられることを測定するための公知手段を用いて判断される。そのような公知手段としては、例えば、行動レベルの解析、標識した伝達物質(GABAなど)の薬理動態の解析、興奮性シナプス後電位や抑制性シナプス後電位の測定、薬剤または電気刺激よるてんかん誘発閾値変化の測定、脳波、光トポグラフィー、陽電子放出断層撮影(PET)などが挙げられるが、これらに限定されない。。
11.本明細書中の用語について
本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
生後6週時にrAAV-Neuroligin2(rAAV-NL2)を心腔内投与
・発作頻度・持続時間・強さ・持続時間×強さ・電気刺激に対する閾値の変化
ニューロリギン2搭載血管内投与型rAAVの脳内発現
○ 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター
本実施例において用いるベクターは、先に公開されたAAV9/3 (AAV9のカプシドにチロシン変異(Y446→F)を導入し、AAV3のITRを持つ)にSynapsin I promoterを搭載しているものである(WO 2012/057363)。内因性のNeuroligin 2 (NL2)と区別するため、FLAG tag (DDDDK)配列がN末端に結合したニューロリギン2を発現するrAAVベクターを調製し(AAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL2)、これを対象動物に投与した。
ELマウス(6週齢、雄、体重22 - 32g)を使用した。
2-4%セボフルレン麻酔下にAAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL2を4.1×1013 vector genome/ml × 0.1ml /mouse心注した (NL2心注群n = 10)。AAV9/3-Syn1-AcGFP-WPREを2.3×1013 vg/ml × 0.1ml /mouse心注した群(n=17)と生理食塩水のみを0.1ml/mouse心注した群(n=14)を対照とした。また、局所投与と比較するため、両側海馬CA3領域(Bregmaより 0.5 mm後方、3.0 mm側方、脳表より2.0 mm)にAAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL 2を4.1×1013 vg/ml × 0.005 ml注入したグループを局所投与群(n = 3)とした。
ベクター等投与後、22週齢に至るまで1週間毎に、尻尾を持ってマウスを一定数回転させ(8回転)、行動をビデオ記録した。後にビデオ上で発作の有無、発作を起こした場合の持続時間、強度を観察した。
発作強度を
1点: 発作なし
2点: 尻尾を挙げる、または体を震わせるのみ
3点: 明らかな発作だが、倒れずに姿勢を保つ
4点: 激しい発作で、姿勢を保てず、横に倒れる
として得点化した。
発作の持続時間を
1点: 発作なし
2点: 1-10秒
3点: 11-20秒
4点: 21-30秒
5点: 31-60秒
6点: 61秒−
として得点化した。
各グループの発作出現率、平均発作時間、平均発作強度、平均発作時間×強度を週毎に評価した
5(ベクター投与前), 12, 18, 22週齢において、両耳に電極を装着し、電気刺激(NIHON KOHDEN社製のNeuropack S1において以下のパラメーターを用いた:duration:1ms, interval:50ms, 10train, strength:0mA〜5mA毎にmax 50mAまで)を与え、てんかん発作を誘発し、発作閾値を測定した。50mAで発作が誘発されなかった場合は発作閾値を60mAとして評価した。局所投与群のみ5, 12, 22週齢で行った。
発作出現率:Fisher正確検定
その他:Welchのt検定
により評価した。
脳標本作成:ペントバルビタールで深麻酔し、左心室からの4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1Mリン酸バッファー(pH7.4)注入し灌流固定した。固定後、脳を取り出して灌流固定液での半日の浸積固定後15%ショ糖を含む0.1Mリン酸バッファー(pH7.4)に移して冷蔵庫で組織化学実験まで保存した。
凍結ミクロトームで40μmの矢状断切片を作成し蛍光顕微鏡で脳各部位のGFP発現を確認した。GFPを発現している細胞の同定は以下のマーカーとの2重染色を行った。神経細胞;NeuNまたはMAP2、グリア細胞;GFAP、抑制性介在ニューロン;Parvalbumin
GFP確認と同様、40μmの矢状断切片を作成してFLAG(DDDDK)抗体染色により導入遺伝子NL2発現を確認した。FLAG抗体はアブカム株式会社より購入し、Alexafluor 488付き2次抗体を用いた画像処理により蛍光顕微鏡で発現を確認した。
海馬スライス標本を用いて虚血負荷時の細胞内Ca2+流入変化をrhod 2-AM(DOJINDOカタログ番号:R002 )の蛍光変化により測定した。虚血負荷により海馬で起きる細胞内Ca2+流入はELマウスがDDYマウスに比べてCA3 領域で有意な上昇を示し、CA3 領域における抑制系の脆弱性が示唆された。次に興奮抑制系である介在細胞のEL海馬における発現をparvalbumin抗体(カタログ番号:LS-C39101 )による免疫染色で組織学的に検討した。海馬各領域のparvalbumin陽性細胞数においてはELマウスとDDYマウスで有意差は認められず、シナプスレベルでの変化の可能性が示唆された。以上の結果に基づき、抑制系シナプス関連分子の遺伝子を発現するrAAVベクターを調製し、定位的海馬注入および血管内注入により同ベクターをELに投与し、FLAG抗体を用いる染色によって、組織学的に脳内分布を観察した(図1a、1b)。図1aに示すように、本発明のベクターの血管内投与によって海馬及び大脳皮質の神経細胞にFLAGタグ付NLGN2が広く発現していたため、rAAVによる遺伝子送達が良好であったことを確認できた。
配列番号2:ヒトニューロリギン2アミノ酸配列
配列番号3:マウスニューロリギン2ヌクレオチド配列
配列番号4:マウスニューロリギン2アミノ酸配列
配列番号5:ラットニューロリギン2ヌクレオチド配列
配列番号6:ラットニューロリギン2アミノ酸配列
配列番号7:Flagタグ付マウスニューロリギン2のヌクレオチド配列
配列番号8:Flagタグ付マウスニューロリギン2のアミノ酸配列
配列番号9:AAV1カプシドタンパク質Y445F変異体のアミノ酸配列
配列番号10:AAV2カプシドタンパク質Y444F変異体のアミノ酸配列
配列番号11:AAV9カプシドタンパク質Y446F変異体のアミノ酸配列
Claims (8)
- 組換えアデノ随伴ウイルス組換えベクターを含む医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、てんかんの治療のためのものであり、
前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、配列番号2、4もしくは6のアミノ酸配列、またはこれら配列と90%以上の同一性を有してニューレキシンと結合するアミノ酸配列を含むニューロリギン2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、
前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸配列中少なくとも1つ以上のチロシンがフェニルアラニンに置換されたものであって、445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するカプシドタンパク質、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中少なくとも1つ以上のチロシンがフェニルアラニンに置換されたものであって、444位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するカプシドタンパク質、または野生型のAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸配列中少なくとも1つ以上のチロシンがフェニルアラニンに置換されたものであって、446位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含む、
医薬組成物。 - 前記ポリヌクレオチドが、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター配列、L7プロモーター配列(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)、グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ2プロモーター(小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター)配列、グルタミン酸脱炭酸酵素(GAD65/GAD67)プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8、およびAAV9からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート(ITR)を含む、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、興奮性シナプスの興奮を抑制するためのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 脳内投与されるための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 髄腔内投与されるための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 末梢投与されるための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 神経精神疾患に係る化学療法剤と併用するための、請求項1〜7のいずれかに記載の医薬組成物。
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