KR20220020706A

KR20220020706A - Slitrk3 및 Nlgn2 억제제를 포함하는 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20220020706A
Application number: KR1020200101378A
Authority: KR
Inventors: 고재원; 엄지원; 김동욱
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2022-02-21
Also published as: KR102546560B1

Abstract

본 발명은 Slitrk3 및 Nlgn2를 표적하여 불안장애를 치료할 수 있는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Slitrk3 및 Nlgn2 억제제를 유효성분으로 포함하는 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 약학 제제에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 전전두엽 신경회로의 구조 및 활성을 조절하는 억제성 시냅스의 특성을 선택적으로 제어함으로써 불안증상에 관여하는 신경회로에 대한 지식을 제공하며, 상기 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자는 불안증세 및 행 동을 조절할 수 있는 신약 개발을 위한 치료표적으로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

Slitrk3 및 Nlgn2 억제제를 포함하는 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating anxiety disorder comprising inhibitor of Slitrk3 and Nlgn2}

본 발명은 Slitrk3 및 Nlgn2를 표적하여 불안장애를 치료할 수 있는 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Slitrk3 및 Nlgn2 억제제를 유효성분으로 포함하는 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.

불안장애(anxiety disorder)란 다양한 형태의 비정상적, 병적인 불안과 공포로 인하여 일상생활에 장애를 일으키는 정신질환을 통칭한다. 불안과 공포는 당면한 위험에 대한 경고 신호로써 정상적인 정서 반응이지만, 지나칠 경우 상황에 대한 적절한 대처를 더 어렵게 하고 정신적 고통과 신체적 증상을 유발한다. 불안으로 교감신경이 흥분되어 두통, 심장 박동 증가, 호흡수 증가, 위장관계 이상 증상과 같은 신체적 증상이 나타나 불편감을 초래하고 불안이나 걱정, 혹은 신체 증상이 직장 생활, 대인관계, 학업과 같은 일상 활동에 어려움을 초래하는 경우 불안장애로 진단할 수 있다. 구체적으로, 불안장애에는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 공황장애(panic disorder), 광장공포증(agoraphobia), 분리불안장애(separation anxiety disorder), 선택적 함구증(selective mutism) 등이 있다. 대표적인 불안장애인 공포장애는 특정 대상이나 상황에서 불합리한 공포를 느끼고 이 때문에 지속적으로 그 대상이나 상황을 회피하는 장애를 말하며, 사회공포증(social phobia), 고소공포증(acrophogia), 협소공포증(claustrophobia) 또는 예기불안(expectation anxiety) 등의 그 대상에 따라 많은 유형이 있다. 범불안장애는 일상적인 상황에서 광범위하고 지속적인 불안을 느끼는 경우를 말하며, 강박장애는 자신의 의지와 무관하게 어떤 특정한 생각이나 행동을 계속 반복하게 되는 경우, 정상적으로도 어느 정도의 강박적인 생각이나 행동이 있을 수 있다. 따라서 강박증상 때문에 생활에 방해를 받거나 심신이 괴로운 정도면 강박장애로 진단하며, 대개 정확성, 완벽성, 원칙주의 등 강박적인 인격의 특징을 같이 보인다. 외상후 스트레스 장애는 생명을 위협할 정도의 극심한 스트레스 즉, 충격적이고 두려운 사건을 당하거나 목격하는 등의 정신적 외상을 경험하고 나서 발생하는 심리적인 반응으로, 외상이 지나갔음에도 불구하고 계속해서 당시의 충격적인 기억이 떠오르고 그 외상을 떠오르게 하는 활동이나 장소를 피하게 되며 앞으로 닥칠 일에 대한 통제력을 상실하거나 공포감을 느낄 수도 있으며 자율신경계 증상을 동반하는 증상 등을 나타낸다. 또한, 공황장애는 심한 불안 발작과 이에 동반되는 다양한 신체 증상들이 아무런 예고 없이 갑작스럽게 발생하는 불안장애의 하나이다.

현재 불안장애의 치료에는 대체적으로 항우울제와 항불안제를 이용한 약물치료가 자주 이용된다. 항불안제는 즉각적으로 불안증상을 경감하기 위해 사용되며, 예컨대, 항불안제의 가장 대표적인 표적 단백질은 GABA(γ-aminobutyric acid) 시스템의 GABA-벤조디아제핀 수용체(GABA-benzodiazepine receptor)이다. GABA-벤조디아제핀 수용체에 벤조디아제핀이 결합하여 GABA의 친화성을 높이고, 염소이온(chloride ion)의 유입을 증가시켜 항불안 작용을 한다. 그러나, 벤조디아제핀은 과도한 근육 이완 및 진정 작용, 의존증 등의 다양한 부작용이 있어 주의가 필요하다.

불안장애에는 각기 다른 성격의 여러 정신질환이 속해 있어 원인을 한가지로 규정하기는 어려우나, 일반적으로 불안이나 우울과 같은 정서적인 부분을 담당하는 뇌 신경회로 내의 신경전달물질의 부족 또는 과다, 유전적으로 타고난 소인, 뇌영상 연구에서 밝혀진 뇌의 기능적 변화나 구조적 변화를 포함하여, 사회심리학적인 측면, 과거의 경험과 현재의 받아들인 정보를 해석하고 판단하는 인지행동적 측면 등이 병적인 불안을 일으키는 원인이 될 수 있다. 신경해부학적인 측면에서 불안장애는 전두엽(frontal lobe)과 변연계(limbic system) 기능의 문제로 추정되나, 주로는 전두엽과 같은 고위인지기능 중추보다는 변연계와 같은 감정중추의 기능 장애에 의한 결과로 생각되고 있다. 고위 기능을 담당하는 전전두엽 피질(prefrontal cortex)은 계획, 결정, 잠재적 행동 결과를 예측하고 사회적 행동을 이해하고 조절하는 데 중요한 부분이다. 안와전두엽 피질(orbitofrontal cortex)은 정보, 충동 조절, 기분 조절의 역할, 그리고 복내측전전두엽 피질(ventromedial prefrontal cortex)은 보상(compensation) 과정 및 감정의 내장(visceral) 반응을 담당하는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여, 외상 후 스트레스 장애는 이의 동물모델로 널리 사용되는 공포조건화 학습을 통해 측좌핵과 편도체를 비롯한 변연계(limbic system)가 매개하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 공포기억 재발에 전전두엽의 관련성이 대두되었고(Moussawi 외, Nat. Neurosci. 2009 (2):182-9), 편도체와 전전두엽의 글루타메이트 분비 및 수용체 발현의 변화가 공포기억의 유지에 중요한 것이 알려져 있다.

그러나 아직까지 불안증상을 조절하는 관련 신경회로 및 이의 작동 기전, 이를 조절하는 인자들에 대한 이해가 부족한 실정이므로, 불안증상에 관여하는 신경회로에 대한 연구가 더욱 진행되어야 하며, 이를 기반으로 불안증상 및 관련 행동을 효과적으로 제어할 수 있는 치료법의 개발이 필요한 실정이다.

상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 억제성 시냅스를 조절하는 것으로 알려져 있는 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자를 전전두엽 영역에서 각각 또는 모두 특이적으로 녹아웃시킨 마우스 3종을 이용하여 항불안증 행동특성을 분석하였다. 그 결과 각각의 유전자를 결손시킨 녹아웃 마우스의 경우 불안증상이 비정상적(불안증세의 비정상적 감소)으로 나타났으며, 두 유전자를 동시에 결손시킬 경우 비정상적으로 나타나는 불안 관련 행동이 정상적으로 회복됨을 확인하였는바, 불안장애 치료에 활용할 수 있는 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 Slitrk3(SLIT and NTRK like family member 3) 및 Nlgn2(Neuroligin 2)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Slitrk3(SLIT and NTRK like family member 3) 및 Nlgn2(Neuroligin 2)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 발현 억제제 또는 상기 각 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 억제제인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 Slitrk3 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Nlgn2 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 발현 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 mRNA에 각각 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 리보자임(ribozyme) 및 CRISPR/Cas9으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 활성 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 유사체, 압타머 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 불안장애는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 공황장애(panic disorder), 광장공포증(agoraphobia), 분리불안장애(separation anxiety disorder) 및 선택적 함구증(selective mutism)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일구현예로, 상기 약학적 조성물은 뇌 국소투여용인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 국소투여는 뇌의 전전두엽 피질(prefrontal cortex) 영역으로 투여되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 약학 제제는 뇌 국소투여용인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 Slitrk3 및 Nlgn2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 불안장애 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명에서는 전전두엽 영역에서 특이적으로 억제성 시냅스의 접착단백질인 Slitrk3 또는 Nlgn2 유전자를 조건부 녹아웃시킨 마우스 및 상기 유전자들을 모두 결손시킨 이중 녹아웃 마우스를 제작하였고, 상기 단일 녹아웃 마우스에서 불안증세가 비정상적으로 변화하며 두 유전자를 동시에 녹아웃시킨 마우스에서는 이러한 변화가 다시 정상적인 수준으로 회복됨을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따르면 전전두엽 신경회로의 구조 및 활성을 조절하는 억제성 시냅스의 특성을 선택적으로 제어함으로써 불안증상에 관여하는 신경회로에 대한 지식을 제공하며, 상기 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자는 비정상적인 불안증세 및 행동을 조절할 수 있는 신약 개발을 위한 치료표적으로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 내측 전전두엽 피질(mPFC) 특이적인 Slitrk3 조건부 녹아웃(cKO) 마우스를 제작한 결과로서, 도 1a는 Slitrk3^f/f마우스 제작을 위한 유전자 표적화 전략을 그림으로 도시한 것이고, 도 1b는 Slitrk3^f/f마우스에서 mPFC로의 국소 투여를 통한 아데노-관련 바이러스(AAV)-매개 EGFP-태그된 활성 및 비활성 Cre-재조합 효소의 전달 및 발현을 보여주는 결과이며(ACC: 전대상피질(anterior cingulate cortex); IL: 변연계 아래 피질(infralimbic cortex); PL: 변연전 피질(prelimbic cortex)), 도 1c는 WT, Slitrk3^f/+(Het) 및 Slitrk3^f/f 마우스의 PCR 유전자형 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 1d는 상기 도 1c에서 유전자형 분석에 사용된 정향 및 역방향 프라이머를 이용한 증폭 위치를 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 각 녹아웃 마우스의 뇌 조직 샘플을 이용한 정량적 면역블롯 결과를 나타낸 것으로, 도 2a 내지 도 2c는 각각 mPFC-특이적 Slitrk3^f/f(도 2a), Nlgn2^f/f(도 2b) 또는 Slitrk3/Nlgn2^f/f(도 2c) 마우스의 시냅스 관련 단백질의 발현수준을 면역블롯으로 분석한 결과 및 이의 정량결과를 나타낸 것이다.
도 3은 mPFC에서 Slitrk3의 녹아웃(cKO)이 억제성 시냅스의 손실을 유도함을 확인한 결과로서, 도 3a 내지 도 3d는 ΔCre 및 Cre 마우스의 전방 전대상피질(ACC), 변연계 아래 피질(IL) 및 변연전 피질(PL)에서 각각 흥분성 또는 억제성 시냅스 마커인 GAD65(도 3a), GABAAγ2(도 3b), GABAAα2(도 3b) 및 VGLUT1(도 3d) 각각의 발현을 면역조직화학염색법으로 분석한 결과 및 각 마커 단백질의 puncta 밀도 및 크기를 정량화한 결과를 나타낸 것이다(*** p <0.001).
도 4는 mPFC에서 Nlgn2의 녹아웃이 억제성 시냅스의 손실을 유도함을 확인한 결과로서, 도 4a 내지 도 4d는 ΔCre 및 Cre 마우스의 전방 전대상피질(ACC), 변연계 아래 피질(IL) 및 변연전 피질(PL)에서 각각 GAD65(도 4a), VGLUT1(도 4b), GABAAγ2(도 4c) 및 GABAAα2(도 4d) 각각의 발현을 면역조직화학염색법으로 분석한 결과 및 각 마커 단백질의 puncta 밀도 및 크기를 정량화한 결과를 나타낸 것이다(* p <0.05, *** p <0.001, **** p <0.0001).
도 5는 mPFC에서 Slitrk3/Nlgn2 이중 녹아웃이 억제성 시냅스에 영향을 미치지 않음을 확인한 결과로서, 도 5a 내지 도 5d는 ΔCre 및 Cre 마우스의 전방 전대상피질(ACC), 변연계 아래 피질(IL) 및 변연전 피질(PL)에서 각각 VGLUT1(도 5a), GAD65(도 5b), GABAAα2(도 5c) 및 GABAAγ2(도 5d) 각각의 발현을 면역조직화학염색법으로 분석한 결과 및 각 마커 단백질의 puncta 밀도 및 크기를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 3종류의 각 녹아웃 마우스의 행동실험에 대한 수행 전략을 간략히 도시한 것이다.
도 7은 mPFC-특이적 Slitrk3 녹아웃 마우스에서 본능적인 불안-관련 행동이 감소함을 확인한 결과로서, 도 7a는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 오픈-필드 실험 결과의 히트맵 이미지 및 각 마우스에서 기록된 전체 거리(Total distance), 속도(Velocity), 중심 영역으로 이동하는 빈도(Frequency) 및 중심에서 머무른 시간(Time in center)에 대한 정량적 결과이고, 도 7b는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 십자형 높은 미로 실험 결과의 히트맵 이미지 및 열린 팔로의 진입 횟수(Open arm entries)와 머무른 시간(Time in open arm)에 대한 정량적 결과이며, 도 7c는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 Y-미로 테스트 결과의 히트맵 이미지 및 자발적 교대(Spontaneous alternation)와 총 팔 진입횟수(Total arm entries)에 대한 정량적 결과이며, 도 7d는 상황적 공포 조건화 실험의 진행 개략도 및 각 조건에서 마우스의 동결반응(Freezing)을 백분율로 정량화한 결과이고, 도 7e는 3-챔버 테스트 결과의 히트맵 이미지, 및 사회성(Socialability)과 사회적 인지(Social recognition) 시간의 정량적 결과를 나타낸 것이다(**p < 0.01, ***p < 0.001).
도 8은 mPFC-특이적 Nlgn2 녹아웃 마우스에서 본능적인 불안-관련 행동이 감소함을 확인한 결과로서, 도 8a는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 오픈-필드 실험 결과의 히트맵 이미지 및 각 마우스에서 기록된 전체 거리, 속도, 중심영역으로 이동하는 빈도 및 중심에서 머무른 시간에 대한 정량적 결과이고, 도 8b는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 십자형 높은 미로 실험 결과의 히트맵 이미지 및 열린 팔로의 진입 횟수와 머무른 시간에 대한 정량적 결과이며, 도 8c는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 Y-미로 테스트 결과의 히트맵 이미지 및 자발적 교대와 총 팔 진입횟수에 대한 정량적 결과이며, 도 8d는 상황적 공포 조건화 실험의 진행 개략도 및 각 조건에서 마우스의 동결반응을 백분율로 정량화한 결과이고, 도 8e는 3-챔버 테스트 결과의 히트맵 이미지, 및 사회성과 사회적 인지 시간의 정량적 결과를 나타낸 것이다(**p < 0.01, ***p < 0.001).
도 9는 mPFC-특이적 Slitrk3/Nlgn2 이중 녹아웃 마우스에서 본능적인 불안-관련 행동의 정상 수준으로의 회복효과를 확인한 결과로서, 도 9a는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 오픈-필드 실험 결과의 히트맵 이미지 및 각 마우스에서 기록된 전체 거리, 속도, 중심에 들어가는 빈도 및 중심에서 머무른 시간에 대한 정량적 결과이고, 도 9b는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 십자형 높은 미로 실험 결과의 히트맵 이미지 및 열린 팔로의 진입 횟수와 머무른 시간에 대한 정량적 결과이며, 도 9c는 ΔCre 및 Cre 마우스에서 Y-미로 테스트 결과의 히트맵 이미지 및 자발적 교대와 총 팔 진입횟수에 대한 정량적 결과이며, 도 9d는 상황적 공포 조건화 실험의 진행 개략도 및 각 조건에서 마우스의 동결반응을 백분율로 정량화한 결과이고, 도 9e는 3-챔버 테스트 결과의 히트맵 이미지, 및 사회성과 사회적 인지 시간의 정량적 결과를 나타낸 것이다(**p < 0.01, ***p < 0.001).

본 발명자들은 전전두엽 피질 영역 특이적인 3종의 조건부 녹아웃(cKO) 마우스 즉, Slitrk3 cKO 마우스, Nlgn2 cKO 마우스 및 Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스를 제작하고, 이를 이용하여 Slitrk3 및 Nlgn2의 녹아웃에 의한 불안증세의 정상적인 회복효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 Slitrk3(SLIT and NTRK like family member 3) 및 Nlgn2(Neuroligin 2)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 이하 구체적인 실시예를 통해 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자를 함께 억제할 경우 불안증세가 정상적으로 회복되는 효과가 나타남을 in vivo 실험을 통해 확인하였다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 전전두엽 특이적 조건부 녹아웃(cKO) 마우스를 제작하였는데, 구체적으로 내측 전전두엽 피질에서 특이적으로 GABA 시냅스 접착단백질인 Slitrk3 및 Nlgn2이 각각 녹아웃된 마우스 및 Slitrk3/Nlgn2 이중 녹아웃 마우스를 제작하였고(실시예 2 참조), 상기 각 녹아웃 마우스의 뇌 조직 샘플로 면역블롯을 실시하여 표적 유전자가 녹아웃된 것을 확인함으로써 녹아웃 마우스가 잘 제작된 것임을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 3종의 녹아웃 마우스의 뇌 조직절편을 이용해 각 표적유전자의 녹아웃 결과에 다른 억제성 시냅스 및 흥분석 시냅스 마커의 변화 여부를 확인하였으며(실시예 4 참조), 상기 3종의 녹아웃 마우스 각각을 이용해 다양한 마우스 행동실험을 실시하여 Slitrk3 및 Nlgn2이 모두 녹아웃된 이중 cKO 마우스에서 불안증세가 회복되는 치료효과가 있음을 구체적으로 확인하였으므로(실시예 5 참조), 상기 2개 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 각 단백질은 불안장애를 치료하기 위한 표적으로써의 가능성을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 발현 억제제 또는 상기 각 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 억제제일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “발현 억제제”란 표적 유전자의 단백질로의 발현 저하를 야기하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 단백질로의 발현을 억제하는 것을 포함하며, 구체적으로 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 리보자임(ribozyme) 및 CRISPR/Cas9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 “안티센스 올리고뉴클레오티드”는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 본질적으로 이중가닥으로 구성되지 않는다는 점에서 siRNA 및 shRNA와는 차이가 있다.

상기 “작은 간섭 RNA(siRNA)”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다. 본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자는 Slitrk3 및 Nlgn2를 포함한다.

상기 “짧은 헤어핀 RNA(shRNA)”란 단일 가닥으로 50-60개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 즉, shRNA는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열이다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 15-30개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다. shRNA는 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 유전자 발현억제가 유전되도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작에 의하여 절단되어 siRNA가 된 후 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합한다. 이들 RISC는 mRNA에 결합하여 이를 절단한다. shRNA는 RNA 폴리머레이즈(polymerase)에 의해 전사된다.

상기 “CRISPR/Cas9”란 특정 유전자의 DNA를 인식하는 sgRNA(single-guide RNA)와 핵산분해효소인 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 이용하여 표적 유전자를 절단함으로써 유전자 편집을 유도하는 기술을 의미한다. Cas9 핵산분해효소에 의한 절단된 표적유전자는 세포의 DNA 복구시스템(DNA repair system)에 의해 회복되는데, 대표적으로 비상동말단연결(Non-homologous end joining; NHEJ) 경로에 따른 삽입/결실(Insertion/deletion; Indel) 생성으로 인한 프레임 시프트(frame shift) 현상은 유전자 녹아웃(knock-out) 결과를 야기한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “활성 억제제”란 표적 단백질의 기능 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 단백질의 기능이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 활성 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2단백질이 갖는 고유의 세포 내 기능을 억제하는 것을 의미하며, 구체적으로는 Slitrk3 및 Nlgn2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 유사체, 압타머 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 “항체(antibody)”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 폴리클로날(polyclonal) 항체 및 모노클로날(monoclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체), 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체), 이중 특이적(bispecific) 항체와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 본원발명에서, 항체는 항원결합능력을 가지는 단편. 예를 들어 Fab’,F(ab’)2, Fab, Fv alc rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 또한, 상기 용어는 재조합 단일 사슬 Fv 단편(scFv)을 나타내고, 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자, 디아바디, 트리이바디 및 테트라바디를 포함한다.

상기 “압타머(aptamer)”는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 불안장애를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 불안장애에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서, 상기 Slitrk3 유전자 및 Nlgn2 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자가 암호화하는 단백질은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 Slitrk3 단백질, Nlgn2 단백질 및 상기 단백질들의 기능적 동등물을 포함한다. “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3 또는 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. “실질적으로 동질의 생리활성”이란 포유동물의 전전두엽에서의 기능을 말한다.

본 발명에서, 불안장애는 불안이 정상과는 다른 비정상적인 수준으로 나타나는 정신질환을 통칭하는 것으로, 본 발명에 따른 불안장애의 치료는 상기 비정상적으로 나타나는 불안을 조절 즉, 감소 또는 증가시켜 정상적인 수준으로 회복시키는 것을 포함한다.

구체적으로, 불안장애는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 공황장애(panic disorder), 광장공포증(agoraphobia), 분리불안장애(separation anxiety disorder) 및 선택적 함구증(selective mutism)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 질환일 수 있으나, 상기 질환으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 Slitrk3 및 Nlgn2 억제제를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 주입 백과 같은 주입제, 에어로졸 제제와 같은 분무제, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 주입제, 분무제형, 액상제형 또는 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적에 따라 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 비강 또는 뇌를 포함한 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 불안장애 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 불안장애 예방 또는 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험재료 및 실험방법

1-1. 실험동물

실험동물의 사용 및 관리는 DIGIST의 동물실험윤리위원회의 승인을 받은 가이드가인 및 프로토콜(DGIST-IACUC-19051401-00, DGIST-IACUC-19121706-01)에 따라 표준 온도 제어 실험실에서 동물실험을 수행하였다.

Slitrk3 조건부 녹아웃 마우스는 Biocytogen Co., Ltd.(Beijing, China)를 통해 제조하였고, Neuroligin-2 (Nlgn2) 조건부 녹아웃 마우스는 Thomas C. Sudhof 박사(Stanford University, USA)로부터 제공받았다. 마우스는 12:12 명/암주기(오전 9시 점등) 환경에서 유지하고 물과 사료를 급이하였다. Floxed Slitrk3 (Slitrk3^f/f)는 엑손 2의 양측면에 loxP 부위가 오도록 제조하였다. 또한 Nlgn2 floxed 마우스와 Slitrk3^f/f 마우스를 교배시켜 Slitrk3/Nlgn2 이중 floxed 마우스를 제조하였으며, 마우스의 유전적 배경은 C57BL/6 N으로 유지시켰다.

1-2. 마우스 행동실험

수컷 마우스(12-13 주령)에 해당 AAV를 주사한 후 모든 행동 실험에 사용하였다. 상기 행동실험은 다음과 같은 순서대로 진행하였다: open-field, Y-maze, three-chamber, elevated-plus maze, 및 contexture fear conditioning test. 하기에는 각 행동실험에 대한 방법을 구체적으로 기재하였다.

1-2-1. 오픈-필드 실험(Open-field test)

마우스를 백색 아크릴 오픈 필드 박스(40 × 40 × 40 cm)에 넣고 어두운 곳 (0 lux)에서 30분 동안 자유롭게 환경을 탐색할 수 있도록 하였다. 자유롭게 이동하는 마우스의 중심 구역에서 이동 한 이동 거리 및 소요 시간을 탑 뷰 적외선 카메라로 기록하고 EthoVision XT 10 소프트웨어(Noldus)를 이용하여 분석하였다.

1-2-2. 십자형 높은 미로 실험(Elevated plus-maze test)

십자형 높은 미로 실험은 바닥에서 75cm 높이에 위치한 두개의 열린 팔(30 × 5 × 0.5cm)과 두개의 닫힌 팔(30 × 5 × 30cm)로 이루어진 십자 형태의 백색 아크릴 미로이다. 테스트를 위해, 마우스를 십자 형태의 미로의 중심에 놓고 5분 동안 자유롭게 움직이도록 하였다. 모든 행동을 탑 뷰 적외선 카메라로 기록하고 각 팔에서 머무른 시간과 교차 횟수를 측정하고 EthoVision XT 10 소프트웨어(Noldus)로 분석하였다.

1-2-3. Y-미로 실험(Y-maze test)

40cm 길이의 3개의 팔이 서로 120° 각도로 이루어진 Y 형태의 백색 아크릴 미로를 이용하였다. 마우스를 미로의 중앙에 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이도록 하였다. 마우스의 사지가 모두 팔 안에 있을 때 교차 수를 측정하였고, 마우스의 움직임은 탑 뷰 적외선 카메라로 기록하였으며, EthoVision XT 10 소프트웨어(Noldus)를 이용하여 분석하였다.

1-2-4. 사회적 상호작용 실험(Social interaction test)

마우스를 습관화를 위해 중앙 챔버에 10분 동안 놓아둔 후, 양쪽 챔버(새로운 마우스가 있는 사회적 챔버 및 플라스틱 물체가 있는 비사회적 챔버)를 개방해두었다. 시험 마우스를 10분 동안 3개 챔버간에 자유롭게 움직이도록 하였으며, 각 챔버에서 머무른 시간을 기록하고, EthoVision XT 10 소프트웨어(Noldus)를 이용하여 분석하였다.

1-2-5. 맥락적 공포 조건화 실험(Contextual fear conditioning test)

공포 조건화 챔버를 이용해 공포 조건화 테스트를 실시하였다. 훈련(training) 동안, 마우스에게 2분의 탐색 시간을 준 다음, 1분 간격으로 3회의 소리 및 전기자극(55 mA)을 주었다. 훈련 후 24시간이 지난다음 상황 테스트(context test)를 진행하였고, 훈련 48시간 후에 변경된 상황(altered context) 및 소리 자극을 주어 진행하였으며, 도 7d에 실험방법으로 그림으로 도시하였다.

1-3. 재조합 바이러스 생산

HEK293T 세포를 지정된 AAV 벡터, pHelper 및 AAV1.0(혈청형 2/9) 캡시드 벡터로 공동-형질감염시켰다. 72시간 후, 형질감염된 HEK293T 세포를 수집하여 PBS에 재현탁시킨 다음, 에탄올/드라이아이스(1회당 7분)에서 동결 및 37℃의 수조에서 해동(1회당 5분)을 4회 반복하여 세포를 용해시킨 다음, 용해된 샘플을 원심분리한 후 상층액을 수집하고 2.5M NaCl 용액에서 40% 폴리에틸렌글리콜과 함께 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 2000rcf에서 30분 동안 원심분리하고, 펠렛을 HEPES 완충액(20mM HEPES pH 8.0, 115mM NaCl, 1.2mM CaCl₂, 1.2mM MgCl₂, 2.4mM MKH₂PO₄)에 재현탁시킨 다음, 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하였다. 혼합물을 400rcf에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 새로운 EP 튜브에 수집하고 Amicon Ultra Centrifugal 필터를 이용하여 농축했다. 최종적으로 RT-PCR을 통해 생산된 바이러스의 역가를 측정하였고, 1X10¹⁰ infectious units/ul 보다 높은 농도를 사용하였다.

1-4. 바이러스 감염

마우스(~12주령)를 이소플루란(isoflurane)으로 마취시킨 다음, 바이러스 용액을 NanoFil 주사기 및 33게이지 바늘을 포함하는 Nanoliter 2010 인젝터(World Precision Instruments)를 사용하여 50 nl/min의 유속으로 주입하였다(주입량, 500 nl). 내측 전전두엽 피질(medial prefrontal cortex)을 표적으로 하는 정위 주입을 위해 사용된 좌표는 브레그마에서 전후방(AP) + 1.8mm; 내측-측면(ML), ± 0.4mm; 및 등-복부(DV), -2.1mm에 위치하였다. 한편, 면역조직화학적 분석은 5주 후에 수행하였다.

1-5. 항체

Slitrk3 펩타이드 서열(aa 263-281: TPFHFHGKDLREIRKTELC, 서열번호 5)을 사용하여 Slitrk3 특이적 다클론 항체를 제조하였다. 상기 면역원으로 토끼를 면역화시킨 다음, Slitrk3-특이적 항체 JK054를 동일한 펩티드가 고정된 Sulfolink 컬럼(Pierce)을 사용하여 친화성 정제를 실시하였다. 또한, 본 실시예에서는 하기 시판되는 항체를 사용하였다: 토끼 다클론 항-Slitrk3(Milipore); 토끼 다클론 항-Slitrk1(ProSci incorporated); 토끼 다클론 항-Slitrk2(ProSci incorporated); 토끼 다클론 항-Slitrk5(ProSci incorporated); 마우스 단클론 항-Nlgn1(클론 N97A/31; NeuroMab); 토끼 다클론 항-Nlgn2(Synaptic Systems); 토끼 다클론 항-Nlgn3(Synaptic Systems); 기니피그 다클론 항-VGLUT1(Millipore); 마우스 단클론 항-GAD67(클론 1G10.2; Millipore); 토끼 다클론 항-GABAARα2(Synaptic Systems); 토끼 다클론 항-GABAARΥ2(Synaptic Systems); 토끼 다클론 항-Nrxn1(밀리 포어); 마우스 단일클론 항-gephyrin(클론 3B11; Synaptic Systems); 마우스 단일클론 항-PTPσ(클론 17G7.2; MediMabs); 토끼 다클론 항-IgSF9b(Sigma); 마우스 단일클론 항-β-액틴(클론 C4; Santa Cruz Biotechnology); 및 토끼 다클론 항-TrkC(Cell Signaling).

1-6. 면역조직화학염색법

먼저 마우스를 1x PBS 및 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 이용해 순차적으로 경심관류로 관류시키고 뇌를 적출하여 밤새 고정시킨 후, 비브라톰(VT1200S; Leica)을 사용하여 뇌 조직을 천천히 40 μm 두께로 절단하고 1x PBS로 세척하였다. 이어서 뇌 조직 절편에 10% house serum, 0.2% 소 혈청 알부민 및 0.2% 트리톤 X-100이 함유된 차단 용액을 처리하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, GAD65(1:100), GABAAα2(Synaptic Systems; 1:500), GABAAγ2(Synaptic Systems; 1:500) 및 VGLUT1(Synaptic Systems; 1:500)에 대한 1차 항체를 처리하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후 상기 조직절편을 3회 세척하고, Cy3가 접합된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, PA, USA, PA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다음으로, 조직절편을 세척하고, Vectashield 마운팅 배지(Vector Laboratories)를 이용하여 슬라이드 글라스를 마운팅하였다. 40× 대물렌즈가 있는 공초점 현미경(LSM700, Carl Zeiss)을 사용하여 이미지를 얻었으며, 모든 이미지는 설정을 일정하게 유지하였다.

1-7. 통계분석

모든 데이터는 평균 ± 표준오차(means ± SEM)로 표시하였고, Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 데이터의 통계적 유의성을 평가하였다. N 값은 개별 도면 설명에 기재하였다. P-값이 < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 데이터 분석 및 막대그래프 작성에는 Prism7.0(GraphPad Software)을 이용하였다.

실시예 2. 전전두엽 특이적 조건부 녹아웃(cKO) 마우스의 제작

본 발명자들은 내측 전전두엽 피질(이하, mPFC)에서 특이적으로 GABA 시냅스 접착단백질인 Slitrk3 및 Neuroligin-2(Nlgn2)이 각각 녹아웃된 마우스 및 상기 Slitrk3와 Nlgn2이 모두 녹아웃된 이중 녹아웃 마우스를 제작하고자 하였으며, 이에 대한 보다 구체적인 설명은 상기 실시예 1-1에 기재하였다.

보다 상세하게, mPFC에서 특이적으로 Slitrk3이 녹아웃된 마우스를 제작하기 위해 Cre/loxP 시스템을 이용하였으며, 이를 이용한 Slitrk3 조건부 녹아웃 마우스 제작을 위한 유전자 표적화 전략을 도 1a에 도시하였다. 또한, 상기 loxP를 인식하는 Cre 재조합효소는 아데노연관바이러스(AAV) 벡터를 통해 mPFC로 전달하였다. 구체적으로, 실시예 1-3의 방법으로 생산한 Cre 재조합 효소를 발현하는 AAV 벡터를 실시예 1-4의 방법으로 마우스의 mPFC를 표적으로 하여 정위 주입하였으며, 표적 위치로 Cre 재조합효소가 잘 전달되어 발현되었는지 여부를 확인하기 위해 EGFP가 접합된 Cre 재조합효소를 발현하는 AAV 벡터를 주입한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 mPFC의 주요 하위영역인 전대상피질(anterior cingulate cortex; ACC), 변연계 아래 피질(infralimbic cortex; IL) 및 변연전 피질(prelimbic cortex; PL)에서 EGFP가 발현되는 것을 확인하였다. 이를 통해 AAV 벡터를 통해 Cre 재조합효소가 mPFC 부위로 잘 전달되고 발현된 것을 알 수 있었다. 또한, 상기 방법으로 제작한 Slitrk3 조건부 녹아웃 마우스(Slitrk3^f/f)의 유전자형을 분석한 결과, 도 1c 및 도 1d에서 볼 수 있는 바와 같이 Slitrk3^f/f 및 Slitrk3^f/+(Hetero) 마우스에서 358-bp 5’ loxP 및 327-bp 3’ loxP 특이적 PCR 생성물의 밴드가 관찰되었다.

실시예 3. mPFC 특이적 조건부 녹아웃(cKO) 마우스에서 표적 유전자의 녹아웃 확인

본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 얻은 3종의 mPFC 특이적 녹아웃 마우스(Slitrk3 cKO, Nlgn2 cKO, Slitrk3/Nlgn2 cKO)에서 적출한 뇌 조직 용해물을 이용해 면역블롯을 실시하여 표적 유전자 및 관련 유전자가 암호화하는 단백질의 발현수준을 분석하였다. 이때, 비활성(ΔCre) 및 활성 형태(Cre)의 Cre 재조합효소를 발현시킨 마우스에서 각 단백질의 발현수준을 비교하였다.

그 결과, 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같이 ΔCre를 발현시킨 경우와 비교하여 Cre를 발현시킨 경우 각각 Slitrk3 cKO 및 Nlgn2 cKO 마우스에서 Slitrk3 및 Nlgn2 단백질의 발현이 현저히 감소하여 거의 발현되지 않는 것을 확인하였고, Slitrk3/Nlgn2 cKO 마우스에서는 Slitrk3 및 Nlgn2 단백질 모두가 거의 발현되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 상기 각 마우스에서 표적 유전자가 발현되지 않는 것을 통해 각 녹아웃 마우스가 잘 제작된 것을 알 수 있었다.

실시예 4. mPFC 특이적 표적 유전자의 녹아웃(cKO)이 억제성 시냅스에 미치는 영향 분석

본 발명에 따른 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자는 GABA 시냅스 접착단백질로써 억제성 시냅스 발달을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본원발명에 따른 각 녹아웃 마우스의 mPFC 하위 영역인 전대상피질(ACC), 변연계 아래 피질(IL) 및 변연전 피질(PL)에서 각각 흥분성 또는 억제성 시냅스 마커(GAD65, GABAAα2, GABAAγ2 및 VGLUT1)의 발현수준을 면역조직화학염색법으로 분석하여 각 표적 유전자의 녹아웃이 억제성 시냅스에 미치는 영향을 분석하였다.

먼저, Slitrk3 cKO 마우스에서 Slitrk3 유전자 녹아웃에 따른 상기 마커들의 발현변화를 분석한 결과, 도 3a 내지 도 3d에 나타낸 바와 같이 ΔCre를 발현시킨 경우와 비교하여 Cre를 발현시킨 마우스의 경우 억제성 시냅스 마커인 GAD65 Puncta의 밀도가 ACC 및 PL 영역에서 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 Slitrk3 녹아웃이 mPFC의 일부 영역에서 억제성 시냅스의 손실을 유도함을 알 수 있었다.

다음으로, Nlgn2 cKO 마우스에서 Nlgn2 유전자 녹아웃에 따른 상기 마커들의 발현변화를 분석한 결과, 도 4a 내지 도 4d에 나타낸 바와 같이 ΔCre를 발현시킨 경우와 비교하여 Cre를 발현시킨 마우스의 경우 억제성 시냅스 마커인 GAD65, GABAAα2 및 GABAAγ2 Puncta의 밀도가 mPFC의 3개 하위 영역에서 모두 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 Nlgn2 녹아웃이 mPFC에서 억제성 시냅스의 손실을 유도함을 알 수 있었다.

마지막으로, Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스에서 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 녹아웃에 따른 상기 마커들의 발현변화를 분석하였다. 그 결과, 도 5a 내지 도 5d에 나타낸 바와 같이 상기 이중 녹아웃 마우스에서는 ΔCre 및 Cre를 각각 발현시킨 경우를 비교하였을 때 상기 4개 마커의 발현이 모두 변화하지 않는 것으로 나타났다. 특히, 상기 Slitrk3 cKO 및 Nlgn2 cKO 마우스에서 모두 감소한 GAD65는 이중 돌연변이에서 그 발현수준이 회복된 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, Slitrk3와 Nlgn2가 전전두엽 피질에서 억제 시냅스를 조절한다는 것을 알 수 있었으며, Slitrk3 및 Nlgn2가 이중으로 녹아웃된 경우에는 단일 녹아웃과 달리 억제성 시냅스에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. mPFC 특이적 녹아웃 마우스에서 행동 분석

본 발명자들은 상기 실시예에서 제작한 3종의 각 조건부 녹아웃 마우스를 이용해 행동실험을 진행하여 마우스의 본능적인 불안과 관련된 행동이 감소하는지 여부를 분석하고자 하였다. 이를 위해, 각각 Slitrk3 cKO, Nlgn2 cKO 및 Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스를 이용해 도 6에 도시된 과정에 따라 행동실험을 진행하였으며, 상기 실시예 1-2에 각 실험에 대한 내용을 기재하였다.

5-1. 오픈 필드 실험

먼저, ΔCre 및 Cre를 각각 발현시킨 각 cKO 마우스에 대하여 상기 실시예 1-2-1의 방법에 따라 오픈 필드 실험을 실시하였다. 이는 탁 트인 공간에서 마우스의 움직임을 관찰하는 간단한 테스트로, 실험용 마우스는 본능적으로 겁이 많아 섣불리 넓은 상자의 한 가운데로 나오지 않는 특성이 있어, 마우스의 이동량, 속도, 중심 구역으로의 이동을 통해 마우스의 불안 정도를 간접적으로 파악할 수 있다. 따라서 ΔCre 및 Cre를 각각 발현시킨 마우스에 대하여 상기 테스트를 진행하고 각각 박스 중심 구역으로 이동한 총 거리, 속도, 빈도 및 머무른 시간을 정량적으로 비교하고 움직임 변화를 히트맵 이미지로 나타내었다.

실험결과, Slitrk3 cKO 마우스의 경우 도 7a에서 볼 수 있는 바와 같이 Cre를 발현시킨 마우스에서 히트맵 이미지를 통해 총 움직임과 중심 구역으로의 이동이 증가한 것을 관찰할 수 있고, 정량적 결과를 통해 총 이동거리, 빈도 및 머무른 시간이 통계적으로 유의하지는 않지만 다소 증가된 것을 확인하였다.

Nlgn2 cKO 마우스의 경우에는 도 8a에 나타낸 바와 같이 Cre를 발현시킨 마우스에서 총 이동거리 및 속도가 유의하게 증가하였으며, 중심 구역으로의 이동 빈도 및 머무른 시간도 다소 증가한 것으로 나타났다.

또한, Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스의 경우 도 9a에서 볼 수 있는 바와 같이 통계적으로 유의한 수준은 아니지만 총 이동거리, 속도 및 빈도가 다소 증가한 것을 확인하였다.

5-2. 십자형 높은 미로 실험

십자형 높은 미로 실험은 높은 곳에 존재하는 십자 형태의 미로로써 마우스의 불안 정도를 파악할 수 있는 행동실험 중 하나이다. 상기 미로는 두 개의 열린팔과 두 개의 높은 벽으로 막혀있는 닫힌 팔로 구성되며, 마우스를 십자형 미로의 가운데로 놓으면 마우스는 본능적으로 겁을 먹고 벽으로 막힌 안전한 닫힌 팔의 안으로 움직이며, 열린 팔 통로로의 진입 및 머무른 시간을 통해 불안 정도의 감소여부를 평가할 수 있다.

실험결과, Slitrk3 cKO 마우스의 경우 도 7b에서 볼 수 있는 바와 같이 열린 팔 통로로의 진입 횟수가 다소 증가하였고 머무른 시간은 통계적으로 유의하게 증가하였으며, 히트맵 결과를 통해 ΔCre 마우스의 경우 열린 팔 통로로의 이동이 없었으나 Cre 마우스에서 열린 팔 통로로의 이동이 이루어진 것을 알 수 있었다.

Nlgn2 cKO 마우스의 경우에도 도 8b에서 볼 수 있는 바와 같이 열린 팔 통로로의 진입 횟수가 다소 증가하였고 머무른 시간은 통계적으로 유의하게 증가하였으며, 히트맵 결과를 통해서도 열린 팔 통로로의 이동이 눈에 띄게 증가한 것을 확인하였다.

Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스의 경우 도 9b에 나타낸 바와 같이 열린 팔 통로로의 진입횟수 및 머무른 시간에서 ΔCre와 Cre를 마우스 간에 차이가 나타나지 않았으며, 히트맵 이미지에서도 차이가 없는 것을 확인하였다. 이를 통해 Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스의 경우 상기 단일 cKO 마우스에서 나타나는 불안 증상의 비정상적인 감소가 야생형 마우스에서 본능적으로 나타나는 불안 수준으로 회복된 것을 알 수 있었다.

5-3. Y-미로 실험

Y-미로 실험은 작업 기억(working memory)을 평가할 수 있는 행동실험으로, 작업 기억은 특정 사건을 토대로 빠르게 기억을 형성하고 현재 유효한 정보와 필요 없는 정보를 빠르게 구분해 내는 능력을 요구하며, 조현병에서 행동의 유연성이 감소했거나 또는 반복행위가 강화되어 나타나는 현상으로 여겨진다. 상기 실시예 1-2-3의 방법에 따라 실험을 진행하고, 자발적 교대율(Spontaneous alternations, %) 및 빈도(Frequency)를 측정하여 ΔCre와 Cre 마우스를 비교하였다. 자발적 교대율이란 하나의 통로에 들어갔다 나올 때 다음 선택 가능한 두 개의 통로 중 이전에 탐험하지 않았던 새로운 통로를 선택하는 경우를 말하며 이는 마우스가 호기심이 많아 이전에 방문했던 통로보다는 탐험하지 않았던 새로운 통로를 선택하는 습성을 이용한 실험법이다. 따라서 이전에 들어갔던 통로로 다시 들어갈수록 작업기억력이 감소한 것으로 평가하였다.

그 결과, Slitrk3 cKO 마우스의 경우 도 7c에 나타낸 바와 같이 ΔCre와 Cre 마우스 간에 정량분석 결과 자발적 교대율과 빈도에 유의한 차이가 나타나지 않은 것을 확인하였다.

Nlgn2 cKO 마우스의 경우에도 도 8c에서 볼 수 있는 바와 같이 정량적 분석 결과 ΔCre와 Cre 마우스 간에 유의한 차이가 나타나지 않은 것을 확인하였다.

또한, Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스의 경우도 9c에 나타낸 바와 같이 정량적 분석 결과 ΔCre와 Cre 마우스 간에 유의한 차이가 나타나지 않은 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해 Slitrk3 cKO, Nlgn2 cKO 및 Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스에서 유전자 녹아웃에 의한 기억능력 관련 부작용은 없는 것을 알 수 있었다.

5-4. 맥락적 공포 조건화 실험

공포에 대한 학습으로 기억을 측정하는 실험으로, 상기 실시예 1-2-6의 방법에 따라 실험을 진행하였다. 실험 결과는 마우스를 챔버에 넣고 소리 및 전기충격 자극을 주는 훈련과정 이후 마우스를 다시 동일한 챔버에 놓았을 때 나타내는 freezing 반응(Context), 마우스를 다른 새로운 챔버안에 두었을 때 나타내는 freezing 반응(Altered context) 및 소리 자극을 주었을 때 freezing 반응(Tone)을 각각 측정하였다.

실험 결과, Slitrk3 cKO 마우스의 경우 도 7d에 나타낸 바와 같이 상기 3가지 경우 모두에서 Cre 마우스의 freezing 반응이 유의하게 감소한 것으로 나타났다.

Nlgn2 cKO 마우스의 경우에 도 8d에서 볼 수 있는 바와 같이 Context 및 Tone 상광에서의 freezing 반응은 통계적으로 유의하게 감소하였으며, Altered context 경우의 freezing 반응은 유의하지는 않지만 약간 감소한 것으로 나타났다.

Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스의 경우 도 9d에 나타낸 바와 같이 Cre 마우스에서 Context 및 Altered context의 경우에는 통계적으로 유의하지는 않지만 다소 감소하는 양상을 나타내었으며, Tone의 경우 통계적으로 유의하게 freezing 반응이 감소한 것을 확인하였다.

5-5. 사회적 상호작용 실험

마지막으로, 본 발명자들은 마우스의 사회적 상호작용 실험으로 상기 실시예 1-2-4의 방법에 따라 3-챔버 실험을 진행한 후 마우스의 이동을 히트맵 이미지로 나타내었고, 사회성(Sociability) 및 사회적 인식(social recognition)을 정량화하여 그래프로 나타내었다.

실험 결과, Slitrk3 cKO 마우스의 경우 도 7e에 나타낸 바와 같이 Cre 마우스에서 사회적 상호작용(Social interation) 지수는 다소 증가하였고 사회적 새로움(Social novelty) 지수는 다소 감소하였으나 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.

Nlgn2 cKO 마우스의 경우에는 도 8e에서 볼 수 있는 바와 같이 사회적 상호작용 지수는 ΔCre 및 Cre 마우스간에 차이가 없었고 사회적 새로움 지수는 감소한 것으로 나타났다.

또한, Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스의 경우 도 9e에 나타낸 바와 같이 사회적 상호작용(Social interation) 지수는 다소 증가하였으나 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았고, 사회적 새로움(Social novelty) 지수는 통계적으로 유의하게 감소하였다. 즉, latency 결과에서 사회적 새로움을 찾아가는 S2로의 이동 정도를 살펴보면 Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스는 S1과 S2의 차이가 없어지는 것을 통해 사회적 새로움 지수가 감소했다고 볼 수 있다.

이러한 결과는 Slitrk3/Nlgn2 이중 cKO 마우스에서 사회적 새로움 효과가 회복하지 않고, 사회적 새로움 행동의 차이는 Nlgn2에서만 나타나는 행동 변화이며 Slitrk3와는 무관하게 일어난다는 것을 알 수 있다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating anxiety disorder comprising inhibitor of Slitrk3 and Nlgn2 <130> PD20-182 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2934 <212> DNA <213> Slitrk3 <400> 1 atgaaacctt ccatagctga gatgcttcac agaggaagga tgttgtggat aattcttcta 60 agcacaattg ctctaggatg gactaccccg attcccctaa tagaggactc agaggaaata 120 gatgagccct gttttgatcc atgctactgt gaagttaaag aaagcctctt tcatatacat 180 tgtgacagta aaggatttac aaatattagt cagattaccg agttctggtc aagacctttt 240 aaactgtatc tgcagaggaa ttctatgagg aaattatata ccaacagttt tcttcatttg 300 aataatgctg tgtctattaa tcttgggaac aatgcattgc aggacattca gactggagct 360 ttcaatggtc ttaagatttt aaagagacta tatctacatg aaaacaaact agatgtcttc 420 agaaatgaca ccttccttgg cttggaaagt ctagaatatc tgcaggcaga ttacaatgtc 480 attaaacgta ttgagagtgg ggcatttcgg aacctaagta aattgagggt tctgatttta 540 aatgataatc tcatccccat gcttccaacc aatttattta aggctgtctc tttaacccat 600 ttggacctac gtggaaatag 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Cys Phe Asp Pro Cys 35 40 45 Tyr Cys Glu Val Lys Glu Ser Leu Phe His Ile His Cys Asp Ser Lys 50 55 60 Gly Phe Thr Asn Ile Ser Gln Ile Thr Glu Phe Trp Ser Arg Pro Phe 65 70 75 80 Lys Leu Tyr Leu Gln Arg Asn Ser Met Arg Lys Leu Tyr Thr Asn Ser 85 90 95 Phe Leu His Leu Asn Asn Ala Val Ser Ile Asn Leu Gly Asn Asn Ala 100 105 110 Leu Gln Asp Ile Gln Thr Gly Ala Phe Asn Gly Leu Lys Ile Leu Lys 115 120 125 Arg Leu Tyr Leu His Glu Asn Lys Leu Asp Val Phe Arg Asn Asp Thr 130 135 140 Phe Leu Gly Leu Glu Ser Leu Glu Tyr Leu Gln Ala Asp Tyr Asn Val 145 150 155 160 Ile Lys Arg Ile Glu Ser Gly Ala Phe Arg Asn Leu Ser Lys Leu Arg 165 170 175 Val Leu Ile Leu Asn Asp Asn Leu Ile Pro Met Leu Pro Thr Asn Leu 180 185 190 Phe Lys Ala Val Ser Leu Thr His Leu Asp Leu Arg Gly Asn Arg Leu 195 200 205 Lys Val Leu Phe Tyr Arg Gly Met Leu Asp His Ile Gly Arg Ser Leu 210 215 220 Met Glu Leu Gln Leu Glu Glu Asn Pro Trp Asn Cys Thr Cys Glu Ile 225 230 235 240 Val Gln Leu Lys Ser Trp Leu Glu Arg Ile Pro Tyr Thr Ala Leu Val 245 250 255 Gly Asp Ile Thr Cys Glu Thr Pro Phe His Phe His Gly Lys Asp Leu 260 265 270 Arg Glu Ile Arg Lys Thr Glu Leu Cys Pro Leu Leu Ser Asp Ser Glu 275 280 285 Val Glu Ala Ser Leu Gly Ile Pro His Ser Ser Ser Ser Lys Glu Asn 290 295 300 Ala Trp Pro Thr Lys Pro Ser Ser Met Leu Ser Ser Val His Phe Thr 305 310 315 320 Ala Ser Ser Val Glu Tyr Lys Ser Ser Asn Lys Gln Pro Lys Pro Thr 325 330 335 Lys Gln Pro Arg Thr Pro Arg Pro Pro Ser Thr Ser Gln Ala Leu Tyr 340 345 350 Pro Gly Pro Asn Gln Pro Pro Ile Ala Pro Tyr Gln Thr Arg Pro Pro 355 360 365 Ile Pro Ile Ile Cys Pro Thr Gly Cys Thr Cys Asn Leu His Ile Asn 370 375 380 Asp Leu Gly Leu Thr Val Asn Cys Lys Glu Arg Gly Phe Asn Asn Ile 385 390 395 400 Ser Glu Leu Leu Pro Arg Pro Leu Asn Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Ser 405 410 415 Ser Asn Leu Ile Gln Lys Ile Tyr Arg Ser Asp Phe Trp Asn Phe Ser 420 425 430 Ser Leu Asp Leu Leu His Leu Gly Asn Asn Arg Ile Ser Tyr Val Gln 435 440 445 Asp Gly Ala Phe Ile Asn Leu Pro Asn Leu Lys Ser Leu Phe Leu 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Ala 660 665 670 Gly Leu Phe Ala Tyr Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Phe 675 680 685 Arg Ser Lys Arg Gln Glu Gly Val Asp Leu Thr Gly Ile Gln Met Gln 690 695 700 Cys His Arg Leu Phe Glu Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 705 710 715 720 Gly Gly Gly Arg Pro Thr Leu Ser Ser Pro Glu Lys Ala Pro Pro Val 725 730 735 Gly His Val Tyr Glu Tyr Ile Pro His Pro Val Thr Gln Met Cys Asn 740 745 750 Asn Pro Ile Tyr Lys Pro Arg Glu Glu Glu Glu Val Ala Val Ser Ser 755 760 765 Ala Gln Glu Ala Gly Ser Ala Glu Arg Gly Gly Pro Gly Thr Gln Pro 770 775 780 Pro Gly Met Gly Glu Ala Leu Leu Gly Ser Glu Gln Phe Ala Glu Thr 785 790 795 800 Pro Lys Glu Asn His Ser Asn Tyr Arg Thr Leu Leu Glu Lys Glu Lys 805 810 815 Glu Trp Ala Leu Ala Val Ser Ser Ser Gln Leu Asn Thr Ile Val Thr 820 825 830 Val Asn His His His Pro His His Pro Ala Val Gly Gly Val Ser Gly 835 840 845 Val Val Gly Gly Thr Gly Gly Asp Leu Ala Gly Phe Arg His His Glu 850 855 860 Lys Asn Gly Gly Val Val Leu Phe Pro Pro Gly Gly Gly Cys Gly Ser 865 870 875 880 Gly Ser Met Leu Leu Asp Arg Glu Arg Pro Gln Pro Ala Pro Cys Thr 885 890 895 Val Gly Phe Val Asp Cys Leu Tyr Gly Thr Val Pro Lys Leu Lys Glu 900 905 910 Leu His Val His Pro Pro Gly Met Gln Tyr Pro Asp Leu Gln Gln Asp 915 920 925 Ala Arg Leu Lys Glu Thr Leu Leu Phe Ser Ala Gly Lys Gly Phe Thr 930 935 940 Asp His Gln Thr Gln Lys Ser Asp Tyr Leu Glu Leu Arg Ala Lys Leu 945 950 955 960 Gln Thr Lys Pro Asp Tyr Leu Glu Val Leu Glu Lys Thr Thr Tyr Arg 965 970 975 Phe <210> 4 <211> 835 <212> PRT <213> Nlgn2 <400> 4 Met Trp Leu Leu Ala Leu Cys Leu Val Gly Leu Ala Gly Ala Gln Arg 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Gly Gly Pro Gly Leu Gly 20 25 30 Leu Gly Ser Leu Gly Glu Glu Arg Phe Pro Val Val Asn Thr Ala Tyr 35 40 45 Gly Arg Val Arg Gly Val Arg Arg Glu Leu Asn Asn Glu Ile Leu Gly 50 55 60 Pro Val Val Gln Phe Leu Gly Val Pro Tyr Ala Thr Pro Pro Leu Gly 65 70 75 80 Ala Arg Arg Phe Gln Pro Pro Glu Ala Pro Ala Ser Trp Pro Gly Val 85 90 95 Arg Asn Ala Thr Thr Leu Pro Pro Ala Cys Pro Gln Asn Leu His Gly 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Ile Met Leu Pro Val Trp Phe Thr Asp Asn Leu Glu 115 120 125 Ala Ala Ala Thr Tyr Val Gln Asn Gln Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu 130 135 140 Asn Leu Tyr Val Pro Thr Glu Asp Gly Pro Leu Thr Lys Lys Arg Asp 145 150 155 160 Glu Ala Thr Leu Asn Pro Pro Asp Thr Asp Ile Arg Asp Pro Gly Lys 165 170 175 Lys Pro Val Met Leu Phe Leu His Gly Gly Ser Tyr Met Glu Gly Thr 180 185 190 Gly Asn Met Phe Asp Gly Ser Val Leu Ala Ala Tyr Gly Asn Val Ile 195 200 205 Val Ala Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Val Leu Gly Phe Leu Ser Thr 210 215 220 Gly Asp Gln Ala Ala Lys Gly Asn Tyr Gly Leu Leu Asp Gln Ile Gln 225 230 235 240 Ala Leu Arg Trp Leu Ser Glu Asn Ile Ala His Phe Gly Gly Asp Pro 245 250 255 Glu Arg Ile Thr Ile Phe Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ser Cys Val Asn 260 265 270 Leu Leu Ile Leu Ser His His Ser Glu Gly Leu Phe Gln Lys Ala Ile 275 280 285 Ala Gln Ser Gly Thr Ala Ile Ser Ser Trp Ser Val Asn Tyr Gln Pro 290 295 300 Leu Lys Tyr Thr Arg Leu Leu Ala Ala Lys Val Gly Cys Asp Arg Glu 305 310 315 320 Asp Ser Ala Glu Ala Val Glu Cys Leu Arg Arg Lys Pro Ser Arg Glu 325 330 335 Leu Val Asp Gln Asp Val Gln Pro Ala Arg Tyr His Ile Ala Phe Gly 340 345 350 Pro Val Val Asp Gly Asp Val Val Pro Asp Asp Pro Glu Ile Leu Met 355 360 365 Gln Gln Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Asp Met Leu Ile Gly Val Asn Gln 370 375 380 Gly Glu Gly Leu Lys Phe Val Glu Asp Ser Ala Glu Ser Glu Asp Gly 385 390 395 400 Val Ser Ala Ser Ala Phe Asp Phe Thr Val Ser Asn Phe Val Asp Asn 405 410 415 Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Asp Val Leu Arg Glu Thr Ile Lys 420 425 430 Phe Met Tyr Thr Asp Trp Ala Asp Arg Asp Asn Gly Glu Met Arg Arg 435 440 445 Lys Thr Leu Leu Ala Leu Phe Thr Asp His Gln Trp Val Ala Pro Ala 450 455 460 Val Ala Thr Ala Lys Leu His Ala Asp Tyr Gln Ser Pro Val Tyr Phe 465 470 475 480 Tyr Thr Phe Tyr His His Cys Gln Ala Glu Gly Arg Pro Glu Trp Ala 485 490 495 Asp Ala Ala His Gly Asp Glu Leu Pro Tyr Val Phe Gly Val Pro Met 500 505 510 Val Gly Ala Thr Asp Leu Phe Pro Cys Asn Phe Ser Lys Asn Asp Val 515 520 525 Met Leu Ser Ala Val Val Met Thr Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr 530 535 540 Gly Asp Pro Asn Gln Pro Val Pro Gln Asp Thr Lys Phe Ile His Thr 545 550 555 560 Lys Pro Asn Arg Phe Glu Glu Val Val Trp Ser Lys Phe Asn Ser Lys 565 570 575 Glu Lys Gln Tyr Leu His Ile Gly Leu Lys Pro Arg Val Arg Asp Asn 580 585 590 Tyr Arg Ala Asn Lys Val Ala Phe Trp Leu Glu Leu Val Pro His Leu 595 600 605 His Asn Leu His Thr Glu Leu Phe Thr Thr Thr Thr Arg Leu Pro Pro 610 615 620 Tyr Ala Thr Arg Trp Pro Pro Arg Pro Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr 625 630 635 640 Arg Arg Pro Pro Pro Pro Ala Thr Leu Pro Pro Glu Pro Glu Pro Glu 645 650 655 Pro Gly Pro Arg Ala Tyr Asp Arg Phe Pro Gly Asp Ser Arg Asp Tyr 660 665 670 Ser Thr Glu Leu Ser Val Thr Val Ala Val Gly Ala Ser Leu Leu Phe 675 680 685 Leu Asn Ile Leu Ala Phe Ala Ala Leu Tyr Tyr Lys Arg Asp Arg Arg 690 695 700 Gln Glu Leu Arg Cys Arg Arg Leu Ser Pro Pro Gly Gly Ser Gly Ser 705 710 715 720 Gly Val Pro Gly Gly Gly Pro Leu Leu Pro Ala Ala Gly Arg Glu Leu 725 730 735 Pro Pro Glu Glu Glu Leu Val Ser Leu Gln Leu Lys Arg Gly Gly Gly 740 745 750 Val Gly Ala Asp Pro Ala Glu Ala Leu Arg Pro Ala Cys Pro Pro Asp 755 760 765 Tyr Thr Leu Ala Leu Arg Arg Ala Pro Asp Asp Val Pro Leu Leu Ala 770 775 780 Pro Gly Ala Leu Thr Leu Leu Pro Ser Gly Leu Gly Pro Pro Pro Pro 785 790 795 800 Pro Pro Pro Pro Ser Leu His Pro Phe Gly Pro Phe Pro Pro Pro Pro 805 810 815 Pro Thr Ala Thr Ser His Asn Asn Thr Leu Pro His Pro His Ser Thr 820 825 830 Thr Arg Val 835 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Slitrk3 peptide <400> 5 Thr Pro Phe His Phe His Gly Lys Asp Leu Arg Glu Ile Arg Lys Thr 1 5 10 15 Glu Leu Cys

Claims

Slitrk3(SLIT and NTRK like family member 3) 및 Nlgn2(Neuroligin 2)의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 발현 억제제 또는 상기 각 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 억제제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 Slitrk3 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 Nlgn2 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 발현 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 유전자의 mRNA에 각각 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 리보자임(ribozyme) 및 CRISPR/Cas9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 활성 억제제는 Slitrk3 및 Nlgn2 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 펩타이드 유사체, 압타머 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 불안장애는 공포장애(phobic disorder), 범불안장애(generalized anxiety disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder), 공황장애(panic disorder), 광장공포증(agoraphobia), 분리불안장애(separation anxiety disorder) 및 선택적 함구증(selective mutism)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 뇌 국소투여용인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 국소투여는 뇌의 전전두엽 피질(prefrontal cortex) 영역으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 불안장애 예방 또는 치료용 약학 제제.
제10항에 있어서,
상기 약학 제제는 뇌 국소투여용인 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
제11항에 있어서,
상기 국소투여는 뇌의 전전두엽 피질(prefrontal cortex) 영역으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
제10항에 있어서,
상기 약학 제제는 주사제형, 주입제형 또는 액상제형인 것을 특징으로 하는, 약학 제제.