TW202409285A - 使用ａａｖ載體之ｂ細胞淋巴瘤２相關抗凋亡３（ｂａｇ３）基因療法 - Google Patents

使用ａａｖ載體之ｂ細胞淋巴瘤２相關抗凋亡３（ｂａｇ３）基因療法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種例如使用腺相關病毒(AAV)載體之BAG3 (B細胞淋巴瘤2-相關抗凋亡3)的基因療法。該載體之啟動子可為MHCK7啟動子、心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)啟動子、熱休克蛋白70 (HSP70)啟動子或泛素C (UBC)啟動子。衣殼可以為AAVrh.74或AAV9衣殼或其功能變異體。在某些實施例中，該衣殼為AAVrh.74衣殼或其功能變異體。可使用其他啟動子或衣殼。本發明進一步提供諸如藉由靜脈內、冠狀動脈內、頸動脈內或心內投與該AAV載體之治療方法，及其他組合物與方法。

Description

使用AAV載體之B細胞淋巴瘤2相關抗凋亡3(BAG3)基因療法
心臟衰竭及心肌病均為嚴重危及生命的疾病。已表明基因B細胞淋巴瘤2相關抗凋亡3 ( BAG3)中之功能缺失突變會引起心肌病，例如擴張型心肌病(DCM)，包括BAG3相關擴張型心肌病、BAG3相關肌原纖維肌病、家族性分離擴張型心肌病及擴張型1hh心肌病(CMD1HH)。BAG3之下調亦與心臟功能障礙及心臟衰竭相關。
BAG3藉由用作與Hsp70之輔伴隨蛋白來介導伴隨蛋白輔助之自噬，藉由與Bcl-2偶合而阻斷細胞凋亡，藉由使肌動蛋白絲與Z線偶合來保持肌節完整性，且藉由連接β-腎上腺素激導性受體與L型Ca2+通道來增強β促效劑刺激之興奮-收縮。BAG3下調會破壞隨蛋白輔助之選擇性自噬(CASA)複合物，其介導諸如細絲蛋白C之心臟蛋白的轉換。
包括藥理學療法及心臟消融之當前治療模式對於BAG3不足心肌病患者仍然無效。因此，此項技術中對於治療BAG3相關疾病及病症(包括心肌病及其他心臟病症)之需要仍未得到滿足。本文所揭示之組合物及方法解決此需要。
本發明大體上係關於基因療法載體及使用表現BAG3之載體或其功能變異體的用於疾病或病症(例如心臟病或病症)之基因療法。
相關申請之交互引用
本申請案主張2022年4月22日申請之美國臨時專利申請案第63/333,798號之優先權權益，該申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。 關於序列表之聲明
與本申請案相關之序列表XML以XML檔案格式提供且特此以引用之方式併入本說明書中。含有序列表之XML檔案之名稱為ROPA_028_01WO_SeqList_ST26.xml。XML檔案為156,193個位元組且創建於2023年4月19日，且經由USPTO專利中心以電子形式提交。
本發明提供遞送編碼BAG3多肽或其功能片段或變異體之聚核苷酸的基因療法載體以及使用方法及其他組合物與方法。在特定實施例中，本發明係關於一種基因療法載體，其包含可操作地連接至編碼BAG3多肽或其功能片段或變異體之聚核苷酸的啟動子序列。在某些實施例中，啟動子為異源啟動子，亦即，不為哺乳動物細胞中 BAG3基因之正常或內源啟動子，或不為基因遞送載體(例如AAV)之正常或內源蛋白。在一些實施例中，BAG3為人類BAG3。
在一些實施例中，AAV載體為AAVrh.74載體。在一些實施例中，啟動子為MHCK7啟動子且AAV載體為AAVrh.74載體。在一些實施例中，啟動子為hTNNT2啟動子。在一些實施例中，啟動子為hTNNT2啟動子且AAV載體為AAVrh.74載體。在一些實施例中，啟動子為HSP70啟動子。在一些實施例中，啟動子為HSP70啟動子且AAV載體為AAVrh.74載體。在一些實施例中，啟動子為泛素C (UBC)啟動子。在一些實施例中，啟動子為UBC啟動子且AAV載體為AAVrh.74載體。在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子或雞β肌動蛋白啟動子。在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子或雞β肌動蛋白啟動子且AAV載體為AAVrh.74載體。在一些實施例中，BAG3為人類BAG3。
在一些實施例中，AAV載體為AAV9載體。在一些實施例中，啟動子為肌凝蛋白重鏈肌酸激酶7 (MHCK7)啟動子。在一些實施例中，啟動子為MHCK7啟動子，且AAV載體為AAV9載體。在一些實施例中，啟動子為hTNNT2啟動子。在一些實施例中，啟動子為hTNNT2啟動子且AAV載體為AAV9載體。在一些實施例中，啟動子為熱休克蛋白70 (HSP70)啟動子。在一些實施例中，啟動子為HSP70啟動子且AAV載體為AAV9載體。在一些實施例中，啟動子為泛素C (UBC)啟動子。在一些實施例中，啟動子為UBC啟動子且AAV載體為AAV9載體。在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子或雞β肌動蛋白啟動子。在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子或雞β肌動蛋白啟動子且AAV載體為AAV9載體。在一些實施例中，BAG3為人類BAG3。
本發明進一步提供藉由向個體投與本發明之基因療法載體來治療個體之疾病或病症的方法。在某些實施例中，該疾病或病症為心臟衰竭。在某些實施例中，該疾病或病症為心肌病，例如擴張型心肌病。在某些實施例中，疾病或病症為BAG3相關擴張型心肌病、BAG3相關肌原纖維肌病、家族性分離擴張型心肌病及擴張型1hh心肌病(CMD1HH)。
在某些實施例中，所治療之個體係在 BAG3基因中具有一或多個突變或截短之心臟衰竭患者。 BAG3之表現量在多種病因學(包括人類心臟衰竭)之逐漸衰竭的心臟中降低。基因 BAG3編碼蛋白B細胞淋巴瘤2-相關抗凋亡3 (BAG3)。BAG3涉及蛋白質品質控制(PQC)。PQC包含伴隨蛋白及蛋白質降解系統，包括幫助使蛋白質毒性降至最低的泛素-蛋白酶體系統(UPS)及自噬溶酶體系統。伴隨蛋白係藉由使錯誤摺疊之蛋白質再摺疊或藉由促進不適合於經由UPS或自噬再摺疊之錯誤摺疊或受損蛋白質降解而充當第一道防線。BAG3調節一類伴隨蛋白(HSP70家族)之ATP酶活性，且主要表現於橫紋肌中。
BAG3亦涉及伴隨蛋白輔助選擇性自噬(CASA)。CASA為運載物選擇性形式之自噬，其經由HSC70-BAG3-HSPB8複合物介導，且允許經由CHIP泛素連接酶泛素化由HSC70識別之所選蛋白質，並由自噬小體在突觸極蛋白2或DNAJB6存在下經由LC3轉接蛋白p62/SQSTM螯合。在肌肉中，BAG3經由其與HSC70及肌動蛋白成帽肌小節蛋白(肌動蛋白成帽蛋白β1)相互作用而對於維持肌節之結構及完整性尤其重要。
全基因體相關研究(GWAS)已在DCM患者中鑑別BAG3中之若干突變，諸如E455K。另外，小鼠模型(例如BAG3 cKO或BAG3 E455K KI)表明BAG3之功能缺失藉由使PQC在涉及心肌細胞之代謝及收縮功能之特定蛋白質亞群內衰減來誘導DCM發展。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於本文所描述之方法及材料之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文描述適合方法及材料。另外，本文所描述之材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。
本文所提及之所有公開案及專利均以全文引用之方式併入本文中，如同各個別公開案或專利特定地且單獨地經指示以引用之方式併入本文中一般。在有衝突的情況下，以本申請案(包括本文中之任何定義)為準。然而，本文所引用之任何參考文獻、文章、公開案、專利、專利公開案及專利申請案之提及並非且不應視為承認或以任何形式表明其構成有效的先前技術或形成全球任何國家之公共常識之一部分。
在本說明書中，除非另外指明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。術語「約」當直接在數目或數字之前時意謂數目或數字範圍加或減10%。應理解，除非另有指示，否則如本文所用之術語「一(a)」及「一(an)」係指所列舉之組分中之「一或多者」。應瞭解，替代物(例如「或」)之使用意謂替代物之一者、兩者或其任何組合。術語「及/或」應理解為意謂替代物中之一者或兩者。如本文所用，術語「包括(include)」及「包含(comprise)」同義地使用。
如本文所使用，術語「在個體中隨時間推移」係指在個體中發生之效應，持續約一天、約一個月、約一年、約十年及/或約數十年。
如本文所用，就多肽或聚核苷酸序列而言，術語「一致性」及「一致」係指該「查詢」序列與「本發明(subject)」序列比對(諸如由BLAST演算法產生之比對)中精確匹配殘基的百分比。除非另外說明，否則一致性係在目標序列之全長內計算。因此，若在查詢序列與本發明序列比對時，本發明序列中之至少x% (向下捨入)的殘基與查詢序列中之對應殘基精確匹配比對，則查詢序列與本發明序列共有「至少x%一致性」。當本發明序列具有可變位置(例如標示為X之殘基)時，與查詢序列中之任何殘基之比對視為匹配。可使用NCBI Blast服務(BLAST+版本2.12.0)進行序列比對。
如本文所用，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個核酸(例如DNA)區段之間的功能關係。通常，其係指轉錄調節序列相對於經轉錄序列的功能關係。例如，若啟動子序列在適合的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則其可操作地連接至編碼序列。一般而言，可操作地連接至所轉錄序列之啟動子轉錄調節序列在實體上鄰接於所轉錄序列，亦即其為順式作用的。然而，諸如增強子之一些轉錄調節序列無需在實體上鄰接於或緊鄰於其增強轉錄之編碼序列。
如本文所用，「AAV載體」或「rAAV載體」係指包含一或多種所關注之聚核苷酸(或轉殖基因)之載體，該等聚核苷酸由AAV反向末端重複序列(ITR)側接。此類AAV載體可複製及包裝至已經編碼及表現 rep及 cap基因產物之質體轉染的宿主細胞中之感染性病毒粒子(若存在)中。或者，AAV載體可使用已經穩定工程改造以表現 rep及 cap基因之宿主細胞包裝至感染性粒子中。
如本文所用，「AAV病毒體」或「AAV病毒粒子」或「AAV載體顆粒」係指由至少一個AAV衣殼蛋白及衣殼化之聚核苷酸AAV載體構成之病毒粒子。如本文所用，若粒子包含異源聚核苷酸(亦即除野生型AAV基因體(諸如待遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因)以外的聚核苷酸)，則其通常稱為「AAV載體粒子」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體粒子之產生必定包括AAV載體之產生，因此載體含於AAV載體粒子內。
如本文所用，「啟動子」係指能夠促進自真核細胞中之聚核苷酸起始RNA轉錄的聚核苷酸序列。
如本文所用，「載體基因體」係指由載體(例如rAAV病毒粒子)封裝之聚核苷酸序列，包括側接序列(在AAV中，反向末端重複序列)。術語「表現卡匣」及「聚核苷酸卡匣」係指側接ITR序列之間的載體基因體之一部分。「表現卡匣」意指載體基因體包含編碼可操作地連接至驅動表現之元件(例如啟動子)之基因產物的至少一種基因。
如本文所用，術語「有需要患者」或「有需要個體」係指有患上能夠用本文所揭示之重組基因療法載體或基因編輯系統治療或改善的疾病、病症或病狀的風險或患有該疾病、病症或病狀的患者或個體。有需要患者或個體可例如為經診斷患有與心臟相關之病症的患者或個體。個體可具有BAG3基因突變或BAG3基因或基因調節序列之全部或一部分缺失，其造成BAG3與HSP70之間的異常相互作用。「個體」及「患者」在本文中可互換使用。藉由本文所描述之方法治療之個體可為成人或兒童。個體之年齡可不同。
如本文所用，術語「變異體」係指與親本蛋白質相比具有一或多個胺酸取代、插入或缺失的蛋白質。如本文所用，術語「功能變異體」係指與親本蛋白質相比具有一或多個胺基酸取代、插入或缺失且保留親本蛋白質之一或多種所需活性的蛋白質。
如本文所用，「BAG3」、「BAG3分子」、「BCL2相關抗凋亡3 (BAG3)基因」、「BCL2相關抗凋亡3 (BAG3)分子」包括所有家族成員、突變體、cDNA序列、對偶基因、片段、物質、編碼及非編碼序列、有義及反義聚核苷酸股等。類似地，「BAG3」、「BAG3分子」、「BCL2相關抗凋亡3 (BAG3)分子」亦係指BAG3多肽或其片段、蛋白質、變異體、衍生物等。除非另有規定，否則術語「分子」涵蓋BAG3之核酸序列及胺基酸序列。
如本文所用，術語「片段」係指蛋白質片段。如本文所用，術語「功能片段」係指與親本蛋白質相比具有一或多個缺失且保留親本蛋白質之一或多種所需活性的蛋白質。在特定實施例中，片段可為蛋白質中缺乏胺基酸之N端及/或C端延伸段的一部分。片段可包含小於99%、小於95%、小於90%、小於80%、小於70%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%或小於20%之全長蛋白質。
如本文所用，「治療」係指改善疾病或病症之一或多種症狀。術語「預防」係指延遲或抑制或中斷疾病或病症之一或多種症狀發作或減緩BAG3相關疾病或病症(例如擴張型心肌病(DCM))之進展。
腺相關病毒(AAV)為複製缺乏型細小病毒，其單股DNA基因體長度為約4.7 kb，包括兩種約145個核苷酸的反向末端重複序列(ITR)。當藉由抗原決定基分類時，存在AAV之多種已知變異體，有時亦稱為血清型。已知AAV血清型之基因體的核苷酸序列。例如，AAV-1之完整基因體係以GenBank寄存編號NC_002077提供；AAV-2之完整基因體係以GenBank寄存編號NC_001401提供且提供於Srivastava等人，J. Virol., 45: 555-564 (1983)中；AAV-3之完整基因體係以GenBank寄存編號NC_1829提供；AAV-4之完整基因體係以GenBank寄存編號NC_001829提供； AAV-5基因體係以GenBank寄存編號AF085716提供； AAV-6之完整基因體係以GenBank寄存編號NC_00 1862提供；至少部分AAV-7及AAV-8基因體分別係以GenBank寄存編號AX753246及AX753249提供；AAV-9基因體提供於Gao等人，J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)中；AAV-10基因體提供於Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)中；且AAV-11基因體提供於Virology, 330(2): 375-383 (2004)中。AAVrh.74基因體之序列提供於以引用之方式併入本文中的美國專利9,434,928中。引導病毒DNA複製、衣殼化/封裝及宿主細胞染色體整合的順式作用序列(rep)包含於AAV ITR內。三個AAV啟動子(因其相對定位位置命名為p5、p19及p40)驅動兩個AAV內部開放閱讀框架編碼rep及cap基因的表現。兩個rep啟動子(p5及p19)結合單個AAV內含子之差異性剪接(在核苷酸2107及2227處)將引起自rep基因產生四種rep蛋白質(rep78、rep68、rep52及rep40)。rep蛋白質具有多個最終負責複製病毒基因體的酶促特性。cap基因係自p40啟動子表現，且其編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共同轉譯起始位點負責產生三種相關的衣殼蛋白。單個共同聚腺苷酸化位點位於AAV基因體之定位位置95處。AAV之生命週期及遺傳學綜述於Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)中。
AAV具有獨特特徵，使得其成為例如基因療法中用於將外來DNA遞送至細胞的引人注目之載體。AAV在培養物中感染細胞係不致細胞病變的，且對人類及其他動物之天然感染為沉默且無症狀的。此外，AAV感染多種哺乳動物細胞，使得有可能在活體內靶向多種不同組織。另外，AAV緩慢地轉導分裂細胞及非分裂細胞，且在該等細胞之生命期內可基本上保持轉錄活性細胞核游離基因體(染色體外元件)形式。AAV病毒基因體作為選殖之DNA插入質體中，其使得構築重組基因體變得可行。此外，由於引導AAV複製與基因體衣殼體之信號含於AAV基因體之ITR內，基因體(編碼複製及結構性衣殼蛋白，rep-cap)之內部約4.7 kb中之一些或全部可經外來DNA置換。為產生AAV載體，可反式提供rep及cap蛋白。AAV之另一顯著特徵為其展現高熱穩定性。其容易承受用於滅活腺病毒的條件(在56℃至65℃下保持數小時)，使得AAV之低溫保藏不那麼重要。甚至可將AAV凍乾。最後，經AAV感染之細胞對重複感染沒有抗性。
可用於實施本發明之基因遞送病毒載體可利用分子生物學技術中熟知之方法來構築。通常，攜載轉殖基因之病毒載體係由編碼轉殖基因之聚核苷酸、合適之調節元件及生產介導細胞轉導之病毒蛋白所需的元件組裝。此類重組病毒可藉由此項技術中已知之技術產生，例如藉由轉染包裝細胞或藉由用輔助質體或病毒短暫轉染而產生。病毒包裝細胞之典型實例包括(但不限於) HeLa細胞、SF9細胞(視情況具有桿狀病毒輔助載體)、HEK293細胞等。基於疱疹病毒之系統可用於產生AAV載體，如US20170218395A1中所描述。用於產生此類複製缺陷型重組病毒之詳細方案可見於例如W095/14785、W096/22378、美國專利第5,882,877號、美國專利第6,013,516號、美國專利第4,861,719號、美國專利第5,278,056號及美國專利第W094/19478號中，該等文獻中每一者之完整內容以引用的方式併入本文中。
本發明涵蓋與B細胞淋巴瘤2相關抗凋亡3 (BAG3)蛋白質或多肽相關的組合物及使用方法。在某些實施例中，所治療之個體具有一或多個BAG3基因突變或下調之BAG3 mRNA及/或蛋白質表現或含量。破壞與HSP70相互作用之BAG3中之突變或下調已知與心肌病及心臟衰竭相關，包括如Fang等人的 J Clin Invest. 127(8):3189-320 (2017)及Kieserman等人的 J Am Heart Assoc. 8(10) (2019)以及其他來源中所描述之疾病。因此，BAG3基因之病毒載體介導之遞送可用作BAG3相關人類疾病(諸如擴張型心肌病及心臟衰竭)之可行治療劑。
已在患有BAG3相關擴張型心肌病(CMD1HH)之人中鑑別 BAG3基因突變。(參見「CMD1HH」，NCBI MedGen)。此病狀為以左心室或心室心臟擴張為特徵之遺傳性心臟病。症狀包括呼吸困難、暈厥、暈倒、疲勞及胸痛。DCM可導致死亡且可影響兒童及成人。在某些實施例中，與野生型BAG3基因序列相比，BAG3突變包括核苷酸變異體同框插入。在某些實施例中，同框插入編碼胺基酸，例如非極性胺基酸。在某些實施例中，同框插入包含在位置160處添加丙胺酸之3-核苷酸插入。
在一些實施例中，BAG3包含一或多個胺基酸取代。例如，BAG3可具有相對於SEQ ID NO: 1編號之C151R胺基酸取代(Villard, E.等人Eur Heart J. 2011年5月；32(9):1065-1076中所描述)。
BAG3可包含改變BAG3蛋白-蛋白結合相互作用之一或多種胺基酸取代、插入或缺失(統稱為突變)。例如，BAG3 C151R可增加與肌動蛋白-結合蛋白細絲蛋白A、hippo路徑激酶STK38及E3泛素蛋白連接酶DDB1及TRIM21之相互作用，而與小熱衝擊蛋白HSPB7及輔伴隨蛋白DNAJB1之相互作用可減少。
在一些實施例中，BAG3蛋白包含位置C151處對參考BAG3蛋白之一或多個胺基酸取代。
在一些實施例中，BAG3包含一或多個胺基酸修飾，例如取代，包括(但不限於) PCT專利申請公開案第WO2015117010A號或第WO2019237002A1號、美國專利第11,236,389號或美國專利申請公開案第US20180296703號或第US20210254159號中揭示之任一者，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
人類BAG3之多肽及聚核苷酸編碼序列顯示於下： BAG3- 野生型 (SEQ ID NO: 1)-575 胺基酸 BAG3- 野生型 (SEQ ID NO: 2)-1728 核苷酸鹼基
在一些實施例中，BAG3蛋白包含與SEQ ID NO: 1至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽序列。在一些實施例中，BAG3蛋白包含與SEQ ID NO: 2至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在一些實施例中，BAG3蛋白為野生型或天然BAG3蛋白，例如人類BAG3。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子，其包含衣殼及載體基因體，其中該載體基因體包含可操作地連接至啟動子之編碼BAG3或其功能變異體之聚核苷酸序列。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子，其包含衣殼及載體基因體，其中該載體基因體包含可操作地連接至啟動子之編碼BAG3的聚核苷酸序列。編碼BAG3之聚核苷酸可包含與SEQ ID NO: 2至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。
本發明之AAV病毒粒子包含載體基因體。載體基因體可以包含表現卡匣(或用於基因編輯應用而不需要表現聚核苷酸序列之聚核苷酸卡匣)。
視情況，編碼載體基因體之聚核苷酸序列可包含Kozak序列，包括(但不限於) GCCACCATGG (SEQ ID NO: 11)。Kozak序列可與編碼BAG3蛋白或其功能變異體之聚核苷酸序列重疊。
在一些實施例中，Kozak序列為替代Kozak序列，其包含以下中任一者或由以下中任一者組成： (gcc)gccRccAUGG (SEQ ID NO: 13)； AGNNAUGN (SEQ ID NO: 45)； ANNAUGG (SEQ ID NO: 46)； ANNAUGC (SEQ ID NO: 47)； ACCAUGG (SEQ ID NO: 49)，及 GACACCAUGG (SEQ ID NO: 14)， 或與SEQ ID NO: 13、45、46、47、49或14中任一者具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致性。
在一些實施例中，載體基因體不包含Kozak序列。
載體基因體可包含5'及/或3'反向末端重複序列(ITR)。可使用任何合適的ITR。ITR可為來自與AAV病毒體中存在之衣殼相同的血清型或與衣殼不同的血清型的AAV ITR (例如AAV2 ITR可與具有AAV9衣殼或AAVrh74衣殼之AAV病毒體一起使用)。在各情況下，衣殼之血清型決定適用於病毒體之名稱。ITR一般為載體基因體中之大部分5ʹ及大部分3ʹ元件。載體基因體亦將通常以5ʹ至3ʹ次序含有啟動子、轉殖基因、3ʹ非轉譯區(UTR)序列(例如WPRE元件)及聚腺苷酸化序列。在變化形式中，載體基因體包括強化子元件(一般處於啟動子之5ʹ)及/或外顯子(一般處於啟動子之3ʹ)。在變化形式中，載體基因體包括綠色螢光蛋白(GFP)蛋白，一般處於轉殖基因之3ʹ。在變化形式中，本發明之載體基因體編碼用作基因編輯系統中之修復模板的部分或完整轉殖基因序列。在此類變化形式中，載體基因體可包含外源啟動子，或基因編輯系統可將轉殖基因插入至具有內源啟動子(諸如心肌或肌細胞特異性啟動子)之基因體中之基因座中。
在一些實施例中，5ʹ ITR包含與SEQ ID NO: 15至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 15
在一些實施例中，5ʹ ITR包含與SEQ ID NO: 16至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 16
在一些實施例中，5ʹ ITR包含與SEQ ID NO: 17至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 17
在一些實施例中，5ʹ ITR包含與SEQ ID NO: 18至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 18
在一些實施例中，3ʹ ITR包含與SEQ ID NO: 19至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 19
在一些實施例中，3ʹ ITR包含與SEQ ID NO: 20至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 20
在一些實施例中，3ʹ ITR包含與SEQ ID NO: 21至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 21
在一些實施例中，載體基因體包含一或多個例如與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 24至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的填充序列。 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24
在一些實施例中，編碼BAG3蛋白或其功能變異體之聚核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子為MHCK7啟動子。在一些實施例中，啟動子為TNNT2啟動子。在一些實施例中，啟動子為HSP70啟動子。在一些實施例中，啟動子為UBC啟動子。在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子或雞β-肌動蛋白啟動子。
本發明涵蓋各種啟動子之使用。適用於本發明之實施例的啟動子包括(但不限於)巨細胞病毒(CMV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子，或包含CMV強化子及雞β-肌動蛋白啟動子及兔β-血球蛋白基因(CAG)之部分的啟動子序列。在一些情況下，啟動子可為合成啟動子。例示性合成啟動子係由Schlabach等人 PNAS USA. 107(6):2538-43 (2010)提供。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 25至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 SEQ ID NO: 25.
在一些實施例中，編碼BAG3蛋白或其功能變異體之聚核苷酸序列可操作地連接至誘導型啟動子。誘導型啟動子可經組態以使得聚核苷酸序列回應於添加或積聚試劑或回應於去除、降解或稀釋試劑而經轉錄表現或不經轉錄表現。試劑可為藥物。試劑可為四環素或其衍生物中之一者，包括(但不限於)多西環素(doxycycline)。在一些情況下，誘導型啟動子為tet-on啟動子、tet-off啟動子、化學調節啟動子、物理調節啟動子(亦即，對光線存在或不存在或至低溫或高溫有反應之啟動子)。誘導型啟動子包括重金屬離子誘導型啟動子(諸如小鼠乳房腫瘤病毒(mMTV)啟動子或各種生長激素啟動子)，及來自T7噬菌體的在T7 RNA聚合酶存在下具有活性之啟動子。誘導型啟動子之此清單為非限制性的。
在一些情況下，啟動子為組織特異性啟動子，諸如能夠在比非心臟細胞中更高的程度上驅動在心臟細胞中表現的啟動子。在一些實施例中，組織特異性啟動子係選自任何各種心肌組織或細胞特異性啟動子，包括(但不限於)肌間線蛋白(Des)、α-肌凝蛋白重鏈(α-MHC)、肌凝蛋白輕鏈2 (MLC-2)、心肌鈣蛋白C (cTnC)、心肌鈣蛋白T (hTNNT2)、肌肉肌酸激酶(CK)及其啟動子/強化子區域之組合，諸如MHCK7。在一些實施例中，啟動子為環境刺激誘導性的。在一些實施例中，啟動子為熱休克蛋白70 (HSP70)啟動子。在一些情況下，啟動子為泛素啟動子。「泛素啟動子」係指在實驗或臨床條件下不具有組織特異性的啟動子。在一些情況下，泛素啟動子為以下中任一者：巨細胞病毒(CMV)、巨細胞病毒早期強化子元件、具有兔β-血球蛋白基因(CAG)之剪接受體之雞β-肌動蛋白基因內含子、泛素C (UBC)、磷酸甘油酯激酶(PGK)、真核轉譯伸長因子1α 1 (EF1-α)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、猿猴病毒40 (SV40)、B型肝炎病毒(HBV)、雞β-肌動蛋白及人類β-肌動蛋白啟動子。
在一些實施例中，啟動子序列係選自表3。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 31至48、115或116中任一者至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 31至48中任一者之聚核苷酸序列片段，例如包含SEQ ID NO: 31至51、115或116中任一者之至少25%、至少50%、至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的片段。例如，在一些實施例中，啟動子為由約SEQ ID NO: 116之UBC啟動子序列之前400個核苷酸組成的UBC啟動子之片段。 表 3
啟動子 序列 SEQ ID NO:
MHCK7 ACCCTTCAGATTAAAAATAACTGAGGTAAGGGCCTGGGTAGGGGAGGTGGTGTGAGACGCTCCTGTCTCTCCTCTATCTGCCCATCGGCCCTTTGGGGAGGAGGAATGTGCCCAAGGACTAAAAAAAGGCCATGGAGCCAGAGGGGCGAGGGCAACAGACCTTTCATGGGCAAACCTTGGGGCCCTGCTGTCTAGCATGCCCCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCCTGCATGCGAAGATCTTCGAACAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAG 31
人類心臟肌鈣蛋白T啟動子(無外顯子1) hTnnT2 / HTNNT2 CTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGT 33
人類心臟肌鈣蛋白T啟動子(具有外顯子1，帶下劃線) hTnnT2 / HTNNT2 CTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGT CCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCAGGATCTGTCGGCAG 32
小鼠α-心臟肌凝蛋白重鏈啟動子(αMHC) GGTACCGGATCCTGCAAGGTCACACAAGGGTCTCCACCCACCAGGTGCCCTAGTCTCAATTTCAGTTTCCATGCCTTGTTCTCACAATGCTGGCCTCCCCAGAGCTAATTTGGACTTTGTTTTTATTTCAAAAGGGCCTGAATGAGGAGTAGATCTTGTGCTACCCAGCTCTAAGGGTGCCCGTGAAGCCCTCAGACCTGGAGCCTTTGCAACAGCCCTTTAGGTGGAAGCAGAATAAAGCAATTTTCCTTAAAGCCAAAATCCTGCCTCTAGACTCTTCTTCTCTGACCTCGGTCCCTGGGCTCTAGGGTGGGGAGGTGGGGCTTGGAAGAAGAAGGTGGGGAAGTGGCAAAAGCCGATCCCTAGGGCCCTGTGAAGTTCGGAGCCTTCCCTGTACAGCACTGGCTCATAGATCCTCCTCCAGCCAAACATAGCAAGAAGTGATACCTCCTTTGTGACTTCCCCAGGCCCAGTACCTGTCAGGTTGAAACAGGATTTAGAGAAGCCTCTGAACTCACCTGAACTCTGAAGCTCATCCACCAAGCAAGCACCTAGGTGCCACTGCTAGTTAGTATCCTACGCTGATAATATGCAGAGCTGGGCCACAGAAGTCCTGGGGTGTAGGAACTGACCAGTGACTTTTCAGTCGGCAAAGGTATGACCCCCTCAGCAGATGTAGTAATGTCCCCTTAGATCCCATCCCAGGCAGGTCTCTAAGAGGACATGGGATGAGAGATGTAGTCATGTGGCATTCCAAACACAGCTATCCACAGTGTCCCTTGCCCCTTCCACTTAGCCAGGAGGACAGTAACCTTAGCCTATCTTTCTTCCTCCCCATCCTCCCAGGACACACCCCCTGGTCTGCAGTATTCATTTCTTCCTTCACGTCCCCTCTGTGACTTCCATTTGCAAGGCTTTTGACCTCTGCAGCTGCTGGAAGATAGAGTTTGGCCCTAGGTGTGGCAAGCCATCTCAAGAGAAAGCAGACAACAGGGGGACCAGATTTTGGAAGGATCAGGAACTAAATCACTGGCGGGCCTGGGGGTAGAAAAAAGAGTGAGTGAGTCCGCTCCAGCTAAGCCAAGCTAGTCCCCGAGATACTCTGCCACAGCTGGGCTGCTCGGGGTAGCTTTAGGAATGTGGGTCTGAAAGACAATGGGATTGGAAGACATCTCTTTGAGTCTCCCCTCAACCCCACCTACAGACACACTCGTGTGTGGCCAGACTCCTGTTCAACAGCCCTCTGTGTTCTGACCACTGAGCTAGGCAACCAGAGCATGGGCCCTGTGCTGAGGATGAAGAGTTGGTTACCAATAGCAAAAACAGCAGGGGAGGGAGAACAGAGAACGAAATAAGGAAGGAAGAAGGAAAGGCCAGTCAATCAGATGCAGTCAGAAGAGATGGGAAGCCAACACACAGCTTGAGCAGAGGAAACAGAAAAGGGAGAGATTCTGGGCATAAGGAGGCCACAGAAAGAAGAGCCCAGGCCCCCCAAGTCTCCTCTTTATACCCTCATCCCGTCTCCCAATTAAGCCCACTCTTCTTCCTAGATCAGACCTGAGCTGCAGCGAAGAGACCCGTAGGGAGGATCACACTGGATGAAGGAGATGTGTGGAGAAGTCCAGGGAACCTAAGAGCCAGAGCCTAAAAGAGCAAGAGATAAAGGTGCTTCAAAGGTGGCCAGGCTGTGCACACAGAGGGTCGAGGACTGGTGGTAGAGCCTCAAGATAAGGATGATGCTCAGAATGGGCGGGGGGGGGGATTCTGGGGGGGGGAGAGAGAAGGTGAGAAGGAGCCTGGAACAGAGAATCTGGAAGCGCTGGAAACGATACCATAAAGGGAAGAACCCAGGCTACCTTTAGATGTAAATCATGAAAGACAGGGAGAAGGGAAGCTGGAGAGAGTAGAAGGACCCCGGGGCAAGACATTGAAGCAAGGACAAGCCAGGTTGAGCGCTCCGTGAAATCAGCCTGCTGAAGGCAGAGCCCTGGTATGAGCACCAGAACAGCAGAGGCTAGGGTTAATGTCGAGACAGGGAACAGAAGGTAGACACAGGAACAGACAGAGACGGGGGAGCCAGGTAACAAAGGAATGGTCCTTCTCACCTGTGGCCAGAGCGTCCATCTGTGTCCACATACTCTAGAATGTTCATCAGACTGCAGGGCTGGCTTGGGAGGCAGCTGGAAAGAGTATGTGAGAGCCAGGGGAGACAAGGGGGCCTAGGAAAGGAAGAAGAGGGCAAACCAGGCCACACAAGAGGGCAGAGCCCAGAACTGAGTTAACTCCTTCCTTGTTGCATCTTCCATAGGAGGCAGTGGGAACTCTGTGACCACCATCCCCCATGAGCCCCCACTACCCATACCAAGTTTGGCCTGAGTGGCATTCTAGGTTCCCTGAGGACAGAGCCTGGCCTTTGTCTCTTGGACCTGACCCAAGCTGACCCAATGTTCTCAGTACCTTATCATGCCCTCAAGAGCTTGAGAACCAGGCAGTGACATATTAGGCCATGGGCTAACCCTGGAGCTTGCACACAGGAGCCTCAAGTGACCTCCAGGGACACAGCTGCAGACAGGTGGCCTTTATCCCCAAAGAGCAACCATTTGGCATAGGTGGCTGCAAATGGGAATGCAAGGTTGAATCAGGTCCCTTCAAGAATACTGCATGCAAGACCTAAGACCCCTGGAGAGAGGGGTATGCTCCTGCCCCCACCCACCATAAGGGGAGTGAACTATCCTAGGGGGCTGGCGACCTTGGGGAGACACCACATTACTGAGAGTGCTGAGCCCAGAAAAACTGACCGCCCTGTGTCCTGCCCACCTCCACACTCTAGAGCTATATTGAGAGGTGACAGTAGATAGGGTGGGAGCTGGTAGCAGGGAGAGTGTTCCTGGGTGTGAGGGTGTAGGGGAAAGCCAGAGCAGGGGAGTCTGGCTTTGTCTCCTGAACACAATGTCTACTTAGTTATAACAGGCATGACCTGCTAAAGACCCAACATCTACGACCTCTGAAAAGACAGCAGCCCTGGAGGACAGGGGTTGTCTCTGAGCCTTGGGTGCTTGATGGTGCCACAAAGGAGGGCATGAGTGTGAGTATAAGGCCCCAGGAGCGTTAGAGAAGGGCACTTGGGAAGGGGTCAGTCTGCAGAGCCCCTATCCATGGAATCTGGAGCCTGGGGCCAACTGGTGTAAATCTCTGGGCCTGCCAGGCATTCAAAGCAGCACCTGCATCCTCTGGCAGCCTGGGGAGGCGGAAGGGAGCAACCCCCCACTTATACCCTTTCTCCCTCAGCCCCAGGATTAACACCTCTGGCCTTCCCCCTTCCCACCTCCCATCAGGAGTGGAGGGTTGCAGAGGGAGGGTAAAAACCTACATGTCCAAACATCATGGTGCACGATATATGGATCAGTATGTGTAGAGGCAAGAAAGGAAATCTGCAGGCTTAACTGGGTTAATGTGTAAAGTCTGTGTGCATGTGTGTGTGTCTGACTGAAAACGGGCATGGCTGTGCAGCTGTTCAGTTCTGTGCGTGAGGTTACCAGACTGCAGGTTTGTGTGTAAATTGCCCAAGGCAAAGTGGGTGAATCCCTTCCATGGTTTAAAGAGATTGGATGATGGCCTGCATCTCAAGGACCATGGAAAATAGAATGGACACTCTATATGTGTCTCTAAGCTAAGGTAGCAAGGTCTTTGGAGGACACCTGTCTAGAGATGTGGGCAACAGAGACTACAGACAGTATCTGTACAGAGTAAGGAGAGAGAGGAGGGGGTGTAGAATTCTCTTACTATCAAAGGGAAACTGAGTCGTGCACCTGCAAAGTGGATGCTCTCCCTAGACATCATGACTTTGTCTCTGGGGAGCCAGCACTGTGGAACTTCAGGTCTGAGAGAGTAGGAGGCTCCCCTCAGCCTGAAGCTATGCAGATAGCCAGGGTTGAAAGGGGGAAGGGAGAGCCTGGGATGGGAGCTTGTGTGTTGGAGGCAGGGGACAGATATTAAGCCTGGAAGAGAAGGTGACCCTTACCCAGTTGTTCAACTCACCCTTCAGATTAAAAATAACTGAGGTAAGGGCCTGGGTAGGGGAGGTGGTGTGAGACGCTCCTGTCTCTCCTCTATCTGCCCATCGGCCCTTTGGGGAGGAGGAATGTGCCCAAGGACTAAAAAAAGGCCATGGAGCCAGAGGGGCGAGGGCAACAGACCTTTCATGGGCAAACCTTGGGGCCCTGCTGTCCTCCTGTCACCTCCAGAGCCAAGGGATCAAAGGAGGAGGAGCCAGGACAGGAGGGAAGTGGGAGGGAGGGTCCCAGCAGAGGACTCCAAATTTAGGCAGCAGGCATATGGGATGGGATATAAAGGGGCTGGAGCACTGAGAGCTGTCAGAGATTTCTCCAACCCAGGTAAGAGGGAGTTTCGGGTGGGGGCTCTTCACCCACACCAGACCTCTCCCCACCTAGAAGGAAACTGCCTTTCCTGGAAGTGGGGTTCAGGCCGGTCAGAGATCTGACAGGGTGGCCTTCCACCAGCCTGGGAAGTTCTCAGTGGCAGGAGGTTTCCACAAGAAACACTGGATGCCCCTTCCCTTACGCTGTCTTCTCCATCTTCCTCCTGGGGATGCTCCTCCCCGTCTTGGTTTATCTTGGCTCTTCGTCTTCAGCAAGATTTGCCCTGTGCTGTCCACTCCATCTTTCTCTACTGTCTCCGTGCCTTGCCTTGCCTTCTTGCGTGTCCTTCCTTTCCACCCATTTCTCACTTCACCTTTTCTCCCCTTCTCATTTGTATTCATCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTTCTCCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTGTGTCAGAGTGCTGAGAATCACACCTGGGGTTCCCACCCTTATGTAAACAATCTTCCAGTGAGCCACAGCTTCAGTGCTGCTGGGTGCTCTCTTACCTTCCTCACCCCCTGGCTTGTCCTGTTCCATCCTGGTCAGGATCTCTAGATTGGTCTCCCAGCCTCTGCTACTCCTCTTCCTGCCTGTTCCTCTCTCTGTCCAGCTGCGCCACTGTGGTGCCTCGTTCCAGCTGTGGTCCACATTCTTCAGGATTCTCTGAAAAGTTAACCAGGTGAGAATGTTTCCCCTGTAGACAGCAGATCACGATTCTCCCGGAAGTCAGGCTTCCAGCCCTCTCTTTCTCTGCCCAGCTGCCCGGCACTCTTAGCAAACCTCAGGCACCCTTACCCCACATAGACCTCTGACAGAGAAGCAGGCACTTTACATGGAGTCCTGGTGGGAGAGCCATAGGCTACGGTGTAAAAGAGGCAGGGAAGTGGTGGTGTAGGAAAGTCAGGACTTCACATAGAAGCCTAGCCCACACCAGAAATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCCCCCATAAGAGTTTGAGTCGACCCGCGGCCCCGAATTG 34
雞心臟肌鈣蛋白T啟動子(cTnT) GGGATAAAAGCAGTCTGGGCTTTCACATGACAGCATCTGGGGCTGCGGCAGAGGGTCGGGTCCGAAGCGCTGCCTTATCAGCGTCCCCAGCCCTGGGAGGTGACAGCTGGCTGGCTTGTGTCAGCCCCTCGGGCACTCACGTATCTCCGTCCGACGGGTTTAAAATAGCAAAACTCTGAGGCCACACAATAGCTTGGGCTTATATGGGCTCCTGTGGGGGAAGGGGGAGCACGGAGGGGGCCGGGGCCGCTGCTGCCAAAATAGCAGCTCACAAGTGTTGCATTCCTCTCTGGGCGCCGGGCACATTCCTGCTGGCTCTGCCCGCCCCGGGGTGGGCGCCGGGGGGACCTTAAAGCCTCTGCCCCCCAAGGAGCCCTTCCCAGACAGCCGCCGGCACCCACCGCTCCGTGGGA 35
人類肌酸激酶M(hCKM) CTCTCAGCCCTGGAAGTCCTTGCTCACAGCCGAGGCGCCGAGAGCGCTTGCTCTGCCCAGATCTGCGCGAGTCTGGCGCCCGCGCTCTGAACGGCGTCGCTGCCCAGCCCCCTTCCCCGGGAGGTGGGAGCGGCCACCCAGGGCCCCGTGGCTGCCCTTGTAAGGAGGCGAGGCCCGAGGACACCCGAGACGCCCGGTTATAATTAACCAGGACACGTGGCGAACCCCCCTCCAACACCTGCCCCCGAACCCCCCCATACCCAGCGCCTCGGGTCTCGGCCTTTGCGGCAGAGGAGACAGCAAAGCGCCCTCTAAAAATAACTCCTTTCCCGGCGACCGAGACCCTCCCTGTCCCCCGCACAGCGGAAATCTCCCAGTGGCACCGAGGGGGCGAGGGTTAAGTGGGGGGGAGGGTGACCACCGCCTCCCACCCTTGCCCTGAGTTTGAATCTCTCCAACTCAGCCAGCCTCAGTTTCCCCTCCACTCAGTCCCTAGGAGGAAGGGGCGCCCAAGCGCGGGTTTCTGGGGTTAGACTGCCCTCCATTGCAATTGGTCCTTCTCCCGGCCTCTGCTTCCTCCAGCTCACAGGGTATCTGCTCCTCCTGGAGCCACACCTTGGTTCCCCGAGGTGCCGCTGGGACTCGGGTAGGGGTGAGGGCCCAGGGGGCACAGGGGGAGCCGAGGGCCACAGGAAGGGCTGGTGGCTGAAGGAGACTCAGGGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACGTGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCACTTGGTCAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGGGCGTGAGCCCAGCCCCTGGGGCGGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCGGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAGAACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCCCTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCCAGGATACAGACA 36
人類β-肌動蛋白(HuBa) GCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGTC 37
雞β-肌動蛋白(CBA) GGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGA 38
巨細胞病毒(CMV) TGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG 39
巨細胞病毒(CMV) (第二版) TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGT 40
巨細胞病毒(CMV) (第三版) CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT 41
CAG啟動子(第一版) ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGG 42
CAG啟動子(第二版) CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG 43
人類EF1-α (EF1-α) CAACCTTTGGAGCTAAGCCAGCAATGGTAGAGGGAAGATTCTGCACGTCCCTTCCAGGCGGCCTCCCCGTCACCACCCCCCCCAACCCGCCCCGACCGGAGCTGAGAGTAATTCATACAAAAGGACTCGCCCCTGCCTTGGGGAATCCCAGGGACCGTCGTTAAACTCCCACTAACGTAGAACCCAGAGATCGCTGCGTTCCCGCCCCCTCACCCGCCCGCTCTCGTCATCACTGAGGTGGAGAATAGCATGCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTT 44
人類CamKIIa (CaMKIIa) ACTTGTGGACAAAGTTTGCTCTATTCCACCTCCTCCAGGCCCTCCTTGGGTCCATCACCCCAGGGGTGCTGGGTCCATCCCACCCCCAGGCCCACACAGGCTTGCAGTATTGTGTGCGGTATGGTCAGGGCGTCCGAGAGCAGGTTTCGCAGTGGAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTTGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGC 48
HSP70 CCTGCAGGGCCGCCCACTCCCCCTTCCTCTCAGGGTCCCTGTCCCCTCCAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTGAGCAGGGGGCGGCACTCTGGCCTCTGATTGGTCCAAGGAAGGCTGGGGGGCAGGACGGGAGGCGAAAACCCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCTCATCGAGCTCGGTGATTGGCTCAGAAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATAAAAGCCCAGGGGCAAGCGGTCCGGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTACCTTTTTCGAGAGTGACTCCCGTTGTCCCAAGGCTTCCCAGAGCGAACCTGTGCGGCTGCAGGCACCGGCGCGTCGAGTTTCCGGCGTCCGGAAGGACCGAGCTCTTCTCGCGGATCCAGTGTTCCGTTTCCAGCCCCCAATCTCAGAGCGGAGCCGACAGAGAGCAGGGAACCC 115
UBC GATCTGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGAAG 116
在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 31至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 32至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 33至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 34至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 35至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 36至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 37至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 38至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 39至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 40至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 41至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 42至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 43至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 44至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 48至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 115至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。在某一實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO: 116至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。
啟動子之其他說明性實例為來自猿猴病毒40之SV40晚期啟動子、桿狀病毒多面體強化子/啟動子元件、單純疱疹病毒胸苷激酶(HSV tk)、來自巨細胞病毒(CMV)之即刻早期啟動子及各種反轉錄病毒啟動子，包括LTR元件。此項技術中已知且一般可獲得多種其他啟動子，且可在諸如GenBank資料庫之序列資料庫中獲得許多此類啟動子之序列。
在一些情況下，本發明之載體進一步包含一或多種選自由以下組成之群的調節元件：強化子、內含子、聚腺苷酸信號、2A肽編碼序列、WPRE (土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件)及HPRE (B型肝炎轉錄後調節元件)。在某些實施例中，載體包含突變型或經修飾之WPRE (統稱為WPRE(x)，例如SEQ ID NO: 62至67或70中任一者中所揭示的WPRE或突變型或經修飾之WPRE，視情況為SEQ ID NO: 63中揭示之經修飾之WPRE (WPRE Mut6；參見Zanta-Boussif, M.、Charrier, S.、Brice-Ouzet, A等人，Validation of a mutated PRE sequence allowing high and sustained transgene expression while abrogating WHV-X protein synthesis: application to the gene therapy of WAS. Gene Ther 16,605-619 (2009). https://doi.org/10.1038/gt.2009.3))。在特定實施例中，經修飾之WPRE包含修飾WHV-X蛋白之起始密碼子，由此防止其表現。
在一些實施例中，載體包含CMV強化子。
在某些實施例中，載體包含一或多個強化子。在特定實施例中，強化子為CMV強化子序列、GAPDH強化子序列、β-肌動蛋白強化子序列或EF1-α強化子序列。前述序列為此項技術中已知的。例如，CMV即刻早期(IE)強化子之序列為SEQ ID NO: 50。 SEQ ID NO: 50
在某些實施例中，載體包含一或多個內含子。在特定實施例中，內含子為兔血球蛋白內含子序列、雞β-肌動蛋白內含子序列、合成內含子序列、SV40內含子或EF1-α內含子序列。
在某些實施例中，載體包含聚腺苷酸序列。在特定實施例中，聚腺苷酸序列為兔血球蛋白聚腺苷酸序列、人類生長激素聚腺苷酸序列、牛生長激素聚腺苷酸序列、PGK聚腺苷酸序列、SV40聚腺苷酸序列或TK聚腺苷酸序列。在一些實施例中，聚腺苷酸信號可為牛生長激素聚腺苷酸化信號(bGHpA)。
在某些實施例中，載體包含一或多種轉錄物穩定元件。在特定實施例中，轉錄物穩定元件為WPRE序列、HPRE序列、支架連接區、3ʹ UTR或5ʹ UTR。在特定實施例中，載體包含5ʹ UTR及3ʹ UTR。
在一些實施例中，載體包含選自表4之5ʹ非轉譯區(UTR)。在一些實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO 51至61中任一者至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 表 4
5ʹ 非轉譯區 序列 SEQ ID NO:
人類β-肌動蛋白外顯子/內含子 CGCGTCCGCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCGCCGCCAGGTAAGCCCGGCCAGCCGACCGGGGCATGCGGCCGCGGCCCTTCGCCCGTGCAGAGCCGCCGTCTGGGCCGCAGCGGGGGGCGCATGGGGCGGAACCGGACCGCCGTGGGGGGCGCGGGAGAAGCCCCTGGGCCTCCGGAGATGGGGGACACCCCACGCCAGTTCGCAGGCGCGAGGCCGCGCTCGGGCGGGCGCGCTCCGGGGGTGCCGCTCTCGGGGCGGGGGCAACCGGCGGGGTCTTTGTCTGAGCCGGGCTCTTGCCAATGGGGATCGCACGGTGGGCGCGGCGTAGCCCCCGTCAGGCCCGGTGGGGGCTGGGGCGCCATGCGCGTGCGCGCTGGTCCTTTGGGCGCTAACTGCGTGCGCGCTGGGAATTGGCGCTAATTGCGCGTGCGCGCTGGGACTCAATGGCGCTAATCGCGCGTGCGTTCTGGGGCCCGGGCGCTTGCGCCACTTCCTGCCCGAGCCGCTGGCGCCCGAGGGTGTGGCCGCTGCGTGCGCGCGCGCGACCCGGTCGCTGTTTGAACCGGGCGGAGGCGGGGCTGGCGCCCGGTTGGGAGGGGGTTGGGGCCTGGCTTCCTGCCGCGCGCCGCGGGGACGCCTCCGACCAGTGTTTGCCTTTTATGGTAATAACGCGGCCGGCCCGGCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGCAGCGGCTGCTCTTGGCGGCCCCGAGGTGACTATAGCCTTCTTTTGTGTCTTGATAGTTCGCCAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC 51
雞β-肌動蛋白外顯子/內含子+兔血球蛋白內含子 GTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC 52
SV40內含子 (嵌合內含子序列) GGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGC 53
5ʹ UTR-Syn1 Hs AGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGCTGTGCTCCTGGGCACCGCGCAGTCCGCCCCCGCGGCTCCTGGCCAGACCACCCCTAGGACCCCCTGCCCCAAGTCGCA 54
CMV IE外顯子 TCAGATCGCCTGGAGAGGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGTGGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAC 55
TPL-eBAG3 ( 腺病毒衍生之強化子元件) CTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAG 56
人類EF1-α內含子/外顯子 CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTCCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTGGAGCCAGGGGCGGGCCTTGCGCTTTAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACGTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAGGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGCCCGCGGCCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTCCAGGGGGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTGGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGGCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG 57
人類EF1-α，內含子A GTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAG 58
5' UTR人類CamKIIa TCAGAAGCCCCGGGCTCGTCAGTCAAACCGGTTCTCTGTTTGCACTCGGCAGCACGGGCAGGCAAGTGGTCCCTAGGTTCGGG 59
β-血球蛋白內含子 GTGAGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAG 60
SV40內含子(長形；帶下劃線的5ʹ及3ʹ延伸部分) TCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAA TTGTACCCGC 61
在一些實施例中，載體包含選自表5之3ʹ非轉譯區。在一些實施例中，載體基因體包含與SEQ ID NO 62至70中之任一者至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 表 5
3ʹ 非轉譯區 序列 SEQ ID NO:
 WPRE(x)(突變土撥鼠肝炎調節元件-第1版) AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC 62
 WPRE(x)(突變土撥鼠肝炎調節元件-第2版；WPRE Mut6) TCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCA 63
 WPRE(x)(突變土撥鼠肝炎調節元件-第3版) TTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCGCGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCCTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCCATGTATCTTTTTCACCTGTGCCTTGTTTTTGCCTGTGTTCCGCGTCCTACTTTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGCGGCTTTGGGGCATGGACATAGATCCCTATAAAGAATTTGGTTCATCTTATCAGTTGTTGAATTTTCTTCCTTTGGAC 64
CAAX TGTGTGATAATG 65
EES CTGTTCTCATCACATCATATCAAGGTTATATACCATCAATATTGCCACAGATGTTACTTAGCCTTTTAATATTTCTCTAATTTAGTGTATATGCAATGATAGTTCTCTGATTTCTGAGATTGAGTTTCTCATGTGTAATGATTATTTAGAGTTTCTCTTTCATCTGTTCAAATTTTTGTCTAGTTTTATTTTTTACTGATTTGTAAGACTTCTTTTTATAATCTGCATATTACAATTCTCTTTACTGGGGTGTTGCAAATATTTTCTGTCATTCTATGGCCTGACTTTTCTTAATGGTTTTTTAATTTTAAAAATAAGTCTTAATATTCATGCAATCTAATTAACAATCTTTTCTTTGTGGTTAGGACTTTGAGTCATAAGAAATTTTTCTCTACACTGAAGTCATGATGGCATGCTTCTATATTATTTTCTAAAAGATTTAAAGTTTTGCCTTCTCCATTTAGACTTATAATTCACTGGAATTTTTTTGTGTGTATGGTATGACATATGGGTTCCCTTTTATTTTTTACATATAAATATATTTCCCTGTTTTTCTAAAAAAGAAAAAGATCATCATTTTCCCATTGTAAAATGCCATATTTTTTTCATAGGTCACTTACATATATCAATGGGTCTGTTTCTGAGCTCTACTCTATTTTATCAGCCTCACTGTCTATCCCCACACATCTCATGCTTTGCTCTAAATCTTGATATTTAGTGGAACATTCTTTCCCATTTTGTTCTACAAGAATATTTTTGTTATTGTCTTTGGGCTTTCTATATACATTTTGAAATGAGGTTGACAAGTTA 66
HPRE ATAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCAGTAAACAGTATATGACCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACCTCATCGGGACCGACAATTCTGTCGTACTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGTCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGGCCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGCAATGTCATC 67
 R2V17 (HepB 衍生之強化子元件) TTCCTGTAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCAGTAAACAGTATATGACCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCTGGACTGGAGCAAACCTCATCGGGACCGACAATTCTGTCGTACTCTCCCGCAAGCACTCACCGTTTCCGCGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCCTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCCATGTATCTTTTTCACCTGTGCCTTGTTTTTGCCTGTGTTCCGCGTCCTACTTTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGCGGCTTTGGGGCATGGACATAGATCCCTATAAAGAATTTGGTTCATCTTATCAGTTGTTGAATTTTCTTCCTTTGGAC 68
3'UTR (血球蛋白) GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAA 69
WPRE(r) ATTCGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCC 70
在一些實施例中，載體包含選自表6之聚腺苷酸化(聚腺苷酸)信號。在一些實施例中，聚腺苷酸信號包含與SEQ ID NO 71至75中任一者至少75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的聚核苷酸序列。 表 6
聚腺苷酸化位點 序列 SEQ ID NO:
兔血球蛋白(pA血球蛋白-Oc) TGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGAACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATC 71
牛生長激素(pAGH-Bt-第1版) TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAATACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGGTTCCTCCTGGG 72
牛生長激素(pAGH-Bt-第2版) TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGGTTCCTCCTGGG 73
牛生長激素(pAGH-Bt-第3版) CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG 74
人類生長激素(pAGH-Hs) CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCCCAAGTTGGGAAGAAACCTGTAGGGCCTGC 75
說明性載體基因體描繪於圖1至8中且提供為SEQ ID NO: 107至114。在一些實施例中，視情況在具有或不具有ITR序列的情況下，載體基因體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 26至30及76至95中任一者共有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、MHCK7啟動子、SV-40嵌合內含子、BAG3轉殖基因、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 107或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。 SEQ ID NO: 107
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、hTNNT2啟動子、BAG3轉殖基因、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 108或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。 SEQ ID NO: 108
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、HSP70啟動子、BAG3轉殖基因、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 109或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。 SEQ ID NO: 109
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、MHCK7啟動子、SV-40嵌合內含子、BAG3轉殖基因、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 110或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。 SEQ ID NO: 110
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、TNNT2啟動子、BAG3轉殖基因、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 111或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。
SEQ ID NO: 111
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、HSP70啟動子、BAG3轉殖基因、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 112或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。 SEQ ID NO: 112
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、CMV啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子、嵌合內含子、BAG3轉殖基因、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 113或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。 SEQ ID NO: 113
在某一實施例中，載體基因體按5ʹ至3ʹ次序包含5ʹ ITR、UBC啟動子、BAG3轉殖基因、WPRE(x)元件、人類GH聚腺苷酸信號(hGH)序列及3ʹ ITR。載體基因體按5ʹ至3ʹ次序可包含聚核苷酸序列SEQ ID NO: 114或與前述中每一者共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之聚核苷酸序列。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAV9或AAVrh74載體中。在某些實施例中，此載體基因體封裝於AAVrh74載體中。 SEQ ID NO: 114
在各種情況下，WPRE元件可視情況存在或不存在。 腺相關病毒載體
適用於實施本發明之AAV載體可使用各種系統(包括基於腺病毒及無輔助病毒之系統)封裝於AAV病毒體(病毒粒子)中。AAV生物學中之標準方法包含以下中所描述之方法：Kwon及Schaffer. Pharm Res.(2008) 25(3):489-99；Wu等人 Mol. Ther.(2006) 14(3):316-27. Burger等人 Mol. Ther.(2004) 10(2):302-17；Grimm等人 Curr Gene Ther.(2003) 3(4):281-304；Deyle DR, Russell DW. Curr Opin Mol Ther.(2009) 11(4):442-447；McCarty等人 Gene Ther.(2001) 8(16):1248-54；及Duan等人 Mol Ther.(2001) 4(4):383-91。無輔助細胞之系統包括US 6,004,797、US 7,588,772及US 7,094,604中所描述之系統。
rAAV基因體中之AAV DNA可來自其中可衍生出重組病毒之任何AAV變異體或血清型，包括(但不限於) AAV變異體或血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.74及AAVrh10。假模式化rAAV之生產揭示於例如WO 01/83692中。亦考慮了其他類型的rAAV變異體，例如具有衣殼突變之rAAV。參見例如Marsic等人，Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)。各種AAV血清型之基因體的核苷酸序列為此項技術中已知的。
在一些情況下，rAAV包含自補基因體。如本文所定義，包含「自補」或「雙股」基因體之rAAV係指已經工程改造以使得rAAV之編碼區經組態以形成分子內雙股DNA模板之rAAV，如McCarty等人Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promoter efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Therapy. 8 (16): 1248-54 (2001)中所描述。在一些情況下，本發明涵蓋包括自補基因體之rAAV的用途，因為在感染(此類轉導)而非等待rAAV基因體之第二股的細胞介導之合成時，scAAV之兩個互補半部將締合形成準備立即複製及轉錄的一個雙股DNA (dsDNA)單元。應理解，代替rAAV中發現之完全編碼能力(4.7至6kb)，包含自補基因體之rAAV僅可保持該量之約一半(≈2.4kb)。
在其他情況下，rAAV載體包含單股基因體。如本文所定義，「單股」基因體指非自補基因體。在大多數情況下，非重組AAV具有單股DNA基因體。已存在rAAV應為scAAV以實現細胞之有效轉導的一些適應症。然而，本發明涵蓋可具有單股基因體而非自補基因體之rAAV載體，應理解，rAAV載體之其他基因修飾對於在目標細胞中獲得最佳基因轉錄可為有益的。
在一些情況下，rAAV載體具有血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10或AAVrh74。假模式化rAAV之生產揭示於例如WO 01/83692中。亦考慮了其他類型的rAAV變異體，例如具有衣殼突變之rAAV。參見例如Marsic等人，Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)。在某些實施例中，rAAV載體具有血清型AAVrh74。在一些情況下，rAAV載體具有血清型AAV9。在一些實施例中，該rAAV載體具有血清型AAV9且包含單股基因體。在一些實施例中，該rAAV載體具有血清型AAV9且包含自補基因體。在一些實施例中，rAAV載體包含AAV2之反向末端重複(ITR)序列。在一些實施例中，rAAV載體包含AAV2基因體，使得rAAV載體為AAV-2/9載體、AAV-2/6載體或AAV-2/8載體。
大多數已知AAV之衣殼基因的全長序列及序列提供於美國專利第8,524,446號中，該專利之全文併入本文中。
AAV載體可包含野生型AAV序列或其可包含對野生型AAV序列之一或多個修飾。在某些實施例中，AAV載體在衣殼蛋白內包含一或多個胺基酸修飾，視情況為取代、缺失或插入，視情況為VP1、VP2及/或VP3。在特定實施例中，當向個體提供AAV載體時，修飾使免疫原性降低。
rAAV之衣殼蛋白可經修飾以使得rAAV靶向所關注之特定目標組織，諸如心肌細胞。在一些實施例中，rAAV係直接注射至個體之腦室內空間中。
在一些實施例中，rAAV病毒體為AAVrh.74 rAAV病毒體。衣殼可為AAVrh.74衣殼或其功能變異體。在一些實施例中，AAVrh.74衣殼與參考AAVrh.74衣殼(例如SEQ ID NO: 100)共有至少98%、99%或100%一致性。在特定實施例中， rAAVrh.74 rAAV病毒體較佳靶向具有DCM之成人且具有比其他AAV血清型更大的安全性及/或功效。
在一些實施例中，rAAV病毒體為AAV2 rAAV病毒體。衣殼可為AAV2衣殼或其功能變異體。在一些實施例中，AAV2衣殼與參考AAV2衣殼(例如SEQ ID NO: 96)共有至少98%、99%或100%一致性。 SEQ ID NO: 96
在一些實施例中，rAAV病毒體為AAV9 rAAV病毒體。衣殼可為AAV9衣殼或其功能變異體。在一些實施例中，AAV9衣殼與參考AAV9衣殼(例如SEQ ID NO: 97)共有至少98%、99%或100%一致性。 SEQ ID NO: 97
在一些實施例中，rAAV病毒體為AAV6 rAAV病毒體。衣殼可為AAV6衣殼或其功能變異體。在一些實施例中，AAV6衣殼與參考AAV6衣殼(例如SEQ ID NO: 98)共有至少98%、99%或100%一致性。 SEQ ID NO: 98
在一些實施例中，rAAV病毒體為AAVrh.10 rAAV病毒體。衣殼可為AAVrh.10衣殼或其功能變異體。在一些實施例中，AAVrh.10衣殼與參考AAVrh.10衣殼(例如SEQ ID NO: 99)共有至少98%、99%或100%一致性。 SEQ ID NO: 99
在一些實施例中，衣殼蛋白由在質體上以反式供應至轉移質體的聚核苷酸編碼。野生型AAVrh74 cap之聚核苷酸序列提供為SEQ ID NO: 100。 SEQ ID NO: 100
本發明進一步提供AAVrh74 VP1、VP2及VP3之蛋白質序列，包括SEQ ID NO: 101至103，及其同源物或功能變異體。 SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 103
在某些情況下，AAVrh74衣殼包含SEQ ID NO: 101中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，rAAV載體包含多肽，其包含以下、或基本上由以下組成、或又進一步由以下組成：例如與SEQ ID NO: 101中所示之AAVrh74 VP1之胺基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大一致性之序列。在一些實施例中，rAAV載體包含多肽，其包含以下、或基本上由以下組成、或又進一步由以下組成：與SEQ ID NO: 102中所示之AAVrh74 VP2之胺基酸序列具有例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大一致性之序列。在一些實施例中，rAAV載體包含多肽，其包含以下、或基本上由以下組成、或又進一步由以下組成：與SEQ ID NO: 103中所示之AAVrh74 VP3之胺基酸序列具有例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，更通常90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大一致性之序列。
在一些實施例中，rAAV病毒體為AAV-PHP.B rAAV病毒粒體或其神經營養異體，諸如但不限於以下中所揭示之變異體：國際專利公開案第WO 2015/038958 A1號及第WO 2017/100671 A1號。例如，AAV衣殼可包含例如插入於編碼AAV9之胺基酸588及589的序列之間的來自序列TLAVPFK (SEQ ID NO: 105)或KFPVALT (SEQ ID NO: 106)之至少4個連續胺基酸。
衣殼可為AAV-PHP.B衣殼或其功能變異體。在一些實施例中，AAV-PHP.B衣殼與參考AAV-PHP.B衣殼(例如SEQ ID NO: 104)共有至少98%、99%或100%一致性。 SEQ ID NO: 104
本發明之rAAV病毒體中所用之其他AAV衣殼包含專利公開案第WO 2009/012176 A2號及第WO 2015/168666 A2號中所描述之彼等者。
在不受理論束縛之情況下，本發明人已測定AAVrh.74、AAV9載體或AAVrh.10載體將賦予載體所需心臟向性。不受理論束縛，本發明人已進一步確定AAVrh.74、AAV9載體或AAVrh.10載體可以向心臟細胞提供所需特異性。
在一態樣中，本發明提供包含本發明之rAAV病毒體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。
出於視情況藉由注射投與之目的，可採用各種溶液，諸如無菌水溶液。必要時，此類水溶液可經緩衝，且先用生理食鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等張。可在水中適合地與諸如泊洛沙姆(Poloxamer) 188之界面活性劑以例如0.001%或0.01%混合製備作為游離酸(DNA含有酸性磷酸根基)或藥理學上可接受之鹽的rAAV的溶液。亦可在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中以及在油中製備rAAV之分散液。在一般儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。與此相關，所採用無菌水性介質所有皆可容易地藉由熟習此項技術者熟知之標準技術獲得。
適合於可注射用途之醫藥形式包括(但不限於)無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情況下，形式必須為無菌的且必須為流體，達到存在可容易注射性之程度。其在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須防止諸如細菌及真菌之類微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇及其類似物)、其適合混合物及植物油之溶劑或分散介質。恰當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來實現。在多數情況下，其較佳地包括等張劑，例如糖或氯化鈉。可注射醫藥組合物之吸收延長可藉由使用延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠實現。
無菌可注射溶液藉由以下製備：將所需量之rAAV視需要與上文所列之各種其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。一般而言，藉由將滅菌之活性成分併入含有基礎分散介質及來自上文所列成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，某些製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其自其預先無菌過濾溶液產生活性成分粉末加任何另外所需成分之粉末。
在另一態樣中，本發明包含一種套組，其包含本發明之rAAV病毒體及使用說明書。
在一態樣中，本發明提供一種增加細胞中之BAG3活性的方法，其包含使細胞與本發明之rAAV接觸。在另一態樣中，本發明提供一種增加個體中之BAG3活性的方法，其包含向該個體投與本發明之rAAV。在一些實施例中，細胞及/或個體缺乏BAG3信使RNA或BAG3蛋白質表現量及/或活性，及/或包含BAG3中之功能喪失型突變。在一些實施例中，細胞及/或個體缺乏BAG3信使RNA或BAG3蛋白質表現量及/或活性。細胞可為心臟細胞，例如心肌細胞。在特定實施例中，個體為哺乳動物，例如人類。
在一些實施例中，該方法促進心臟細胞(例如心肌細胞)在細胞培養物中及/或活體內之存活。在一些實施例中，該方法促進及/或恢復心臟之功能。
在另一態樣中，本發明提供一種治療有需要個體之疾病或病症之方法，其包含向該個體投與有效量之本發明之rAAV病毒體。在一些實施例中，疾病或病症為心臟疾病或病症。說明性心臟病症包括心臟衰竭、擴張型心肌病(DCM)，諸如BAG3相關擴張型心肌病、BAG3相關肌原纖維肌病、家族性分離擴張型心肌病或1hh擴張型心肌病(CMD1HH)、肥厚性心肌病、心房微顫、心律不整、竇房結病、高血壓性心臟病、心肥大、心房纖維化、症狀性心房腔失調症候群(symptomatic sick sinus syndrome)、心房疾病及心肌梗塞。在某些實施例中，個體罹患DCM或處於DCM風險下。在特定實施例中，個體患有心肌病，例如擴張型心肌病(DCM)，諸如BAG3相關擴張型心肌病、BAG3相關肌原纖維肌病、家族性分離擴張型心肌病或1hh擴張型心肌病(CMD1HH)。在特定實施例中，個體係在BAG3基因中具有功能喪失型突變之哺乳動物，例如人類。在特定實施例中，個體係具有BAG3突變(例如E455K)之哺乳動物，例如人類。在特定方法中，用rAAV病毒體治療使得由rAAV病毒體編碼之BAG3蛋白表現在個體中，例如個體心臟或心臟組織中。在某些實施例中，用rAAV病毒體治療使得在個體心臟中可偵測到的BAG3蛋白質含量高至少兩倍、至少五倍、至少十倍或更多倍。
BAG3蛋白質至心臟的AAV介導之遞送可增加壽命，預防或減弱心臟細胞退化、心臟衰竭、結疤、減少之射出分率、心率不整、絞痛、運動不耐、絞痛(胸痛)、心源性猝死、勞累型肌痛及抽筋。BAG3蛋白質至心臟的AAV介導之遞送可展示藉由使用超音波心動圖顯象、病理性心電圖、心臟MRI、心臟活檢、陣發性心室心律不整減少及/或心源性猝死減少所偵測到的常見疾病過程改善，或預防該常見疾病過程。
本文所揭示之方法可提供在心臟中之高效生物分佈。其可導致心臟細胞(例如心肌細胞)之全部或相當大的部分持續表現。值得注意地，本文所揭示之方法可在AAV載體投與之後在個體一生中提供BAG3蛋白質之持久表現。在一些實施例中，回應於治療之BAG3蛋白質表現持續至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40年。
本發明亦涵蓋組合療法。特別考慮本發明方法與標準醫學治療(例如皮質類固醇或局部減壓藥物)之組合，與新穎療法之組合亦如此。在一些情況下，可用類固醇及/或免疫抑制劑之組合治療個體，以預防或減少對投與本文所描述之rAAV之免疫反應。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以個體每公斤(vg)總體重(vg/kg)約1×10 12與5×10 14個載體基因體(vg)之間或約1×10 12與6×10 14個vg之間的AAV載體的劑量投與。在一些實施例中，AAV載體係以約1×10 13與5×10 14vg/kg之間的劑量投與。在一些實施例中，AAV載體係以約5×10 13與3×10 14vg/kg之間的劑量投與。在一些實施例中，AAV載體係以約5×10 13與1×10 14vg/kg之間的劑量投與。在一些實施例中，AAV載體係以小於約1×10 12vg/kg、小於約3×10 12vg/kg、小於約5×10 12vg/kg、小於約7×10 12vg/kg、小於約1×10 13vg/kg、小於約3×10 13vg/kg、小於約5×10 13vg/kg、小於約7×10 13vg/kg、小於約1×10 14vg/kg、小於約3×10 14vg/kg、小於約5×10 14vg/kg、小於約7×10 14vg/kg、小於約1×10 15vg/kg、小於約3×10 15vg/kg、小於約5×10 15vg/kg或小於約7×10 15vg/kg之劑量投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。在一些情況下，可能有利的係，AAV rh74載體之用量高於AAV9載體。在一些實施例中，AAV載體，例如AVrh.74載體，係以至少約5×10 13vg/kg、至少約6×10 13vg/kg、至少約7×10 13vg/kg、至少約8×10 13vg/kg、至少約9×10 13vg/kg、至少約1×10 14vg/kg、至少約2×10 14vg/kg、至少約3×10 14vg/kg、至少約4×10 14vg/kg、至少約5×10 14vg/kg、至少約6×10 14vg/kg或至少約7×10 14vg/k之劑量投與。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以約1×10 12vg/kg、約3×10 12vg/kg、約5×10 12vg/kg、約7×10 12vg/kg、約1×10 13vg/kg、約3×10 13vg/kg、約5×10 13vg/kg、約7×10 13vg/kg、約1×10 14vg/kg、約3×10 14vg/kg、約5×10 14vg/kg、約7×10 14vg/kg、約1×10 15vg/kg、約3×10 15vg/kg、約5×10 15vg/kg或約7×10 15vg/kg之劑量投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以1×10 12vg/kg、3×10 12vg/kg、5×10 12vg/kg、7×10 12vg/kg、1×10 13vg/kg、3×10 13vg/kg、5×10 13vg/kg、7×10 13vg/kg、1×10 14vg/kg、3×10 14vg/kg、5×10 14vg/kg、7×10 14vg/kg、1×10 15vg/kg、3×10 15vg/kg、5×10 15vg/kg或7×10 15vg/kg之劑量投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以個體每公斤(vg)總體重(vg/kg)約1×10 12與5×10 14個載體基因體(vg)之間的AAV載體的劑量全身性投與。在一些實施例中，AAV載體係以約1×10 13與5×10 14vg/kg之間的劑量全身性投與。在一些實施例中，AAV載體係以約5×10 13與3×10 14vg/kg之間的劑量全身性投與。在一些實施例中，AAV載體係以約5×10 13與1×10 14vg/kg之間的劑量全身性投與。在一些實施例中，AAV載體係以小於約1×10 12vg/kg、小於約3×10 12vg/kg、小於約5×10 12vg/kg、小於約7×10 12vg/kg、小於約1×10 13vg/kg、小於約3×10 13vg/kg、小於約5×10 13vg/kg、小於約7×10 13vg/kg、小於約1×10 14vg/kg、小於約3×10 14vg/kg、小於約5×10 14vg/kg、小於約7×10 14vg/kg、小於約1×10 15vg/kg、小於約3×10 15vg/kg、小於約5×10 15vg/kg或小於約7×10 15vg/kg之劑量全身性投與。在一些實施例中，AAV載體，例如AVrh.74載體，係以至少約5×10 13vg/kg、至少約6×10 13vg/kg、至少約7×10 13vg/kg、至少約8×10 13vg/kg、至少約9×10 13vg/kg、至少約1×10 14vg/kg、至少約2×10 14vg/kg、至少約3×10 14vg/kg、至少約4×10 14vg/kg、至少約5×10 14vg/kg、至少約6×10 14vg/kg或至少約7×10 14vg/k之劑量投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以約1×10 12vg/kg、約3×10 12vg/kg、約5×10 12vg/kg、約7×10 12vg/kg、約1×10 13vg/kg、約3×10 13vg/kg、約5×10 13vg/kg、約7×10 13vg/kg、約1×10 14vg/kg、約3×10 14vg/kg、約5×10 14vg/kg、約7×10 14vg/kg、約1×10 15vg/kg、約3×10 15vg/kg、約5×10 15vg/kg或約7×10 15vg/kg之劑量全身性投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以1×10 12vg/kg、3×10 12vg/kg、5×10 12vg/kg、7×10 12vg/kg、1×10 13vg/kg、3×10 13vg/kg、5×10 13vg/kg、7×10 13vg/kg、1×10 14vg/kg、3×10 14vg/kg、5×10 14vg/kg、7×10 14vg/kg、1×10 15vg/kg、3×10 15vg/kg、5×10 15vg/kg或7×10 15vg/kg之劑量全身性投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以個體每公斤(vg)總體重(vg/kg)約1×10 12與5×10 14個載體基因體(vg)之間的AAV載體的劑量經靜脈內投與。在一些實施例中，AAV載體係以約1×10 13與5×10 14vg/kg之間的劑量經靜脈內投與。在一些實施例中，AAV載體係以約5×10 13與3×10 14vg/kg之間的劑量經靜脈內投與。在一些實施例中，AAV載體係以約5×10 13與1×10 14vg/kg之間的劑量經靜脈內投與。在一些實施例中，AAV載體係以小於約1×10 12vg/kg、小於約3×10 12vg/kg、小於約5×10 12vg/kg、小於約7×10 12vg/kg、小於約1×10 13vg/kg、小於約3×10 13vg/kg、小於約5×10 13vg/kg、小於約7×10 13vg/kg、小於約1×10 14vg/kg、小於約3×10 14vg/kg、小於約5×10 14vg/kg、小於約7×10 14vg/kg、小於約1×10 15vg/kg、小於約3×10 15vg/kg、小於約5×10 15vg/kg或小於約7×10 15vg/kg之劑量經靜脈內投與。在一些實施例中，AAV載體，例如AVrh.74載體，係以至少約5×10 13vg/kg、至少約6×10 13vg/kg、至少約7×10 13vg/kg、至少約8×10 13vg/kg、至少約9×10 13vg/kg、至少約1×10 14vg/kg、至少約2×10 14vg/kg、至少約3×10 14vg/kg、至少約4×10 14vg/kg、至少約5×10 14vg/kg、至少約6×10 14vg/kg或至少約7×10 14vg/k之劑量投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以約1×10 12vg/kg、約3×10 12vg/kg、約5×10 12vg/kg、約7×10 12vg/kg、約1×10 13vg/kg、約3×10 13vg/kg、約5×10 13vg/kg、約7×10 13vg/kg、約1×10 14vg/kg、約3×10 14vg/kg、約5×10 14vg/kg、約7×10 14vg/kg、約1×10 15vg/kg、約3×10 15vg/kg、約5×10 15vg/kg或約7×10 15vg/kg之劑量經靜脈內投與。
在一些實施例中，AAV載體(例如AAV9、AAVrh.74或AAVrh.10載體)係以1×10 12vg/kg、3×10 12vg/kg、5×10 12vg/kg、7×10 12vg/kg、1×10 13vg/kg、3×10 13vg/kg、5×10 13vg/kg、7×10 13vg/kg、1×10 14vg/kg、3×10 14vg/kg、5×10 14vg/kg、7×10 14vg/kg、1×10 15vg/kg、3×10 15vg/kg、5×10 15vg/kg或7×10 15vg/kg之劑量經靜脈內投與。在某些實施例中，以此等劑量中之任一者遞送的AAV載體為AAV9載體或AAV rh74載體。
患者中之功能改善、臨床效益或功效的證據可藉由以下方面之改善揭露：紐約心臟協會功能分類(NYHA類別)、超音波心動圖顯象(穩定或改良之心輸出量、左心室射出分率、短軸縮短率、左心室出口阻塞、左心室壁厚、左或右心室容積、速度時間積分、心室鬆弛時間常數、回流量及左心室舒張末期直徑減少、LVEDD及減少之右心室面積)、心電描記法(穩定或改良之ST-片段更改、T波反轉、Q波、心房微顫及/或室上性心動過速)、心臟MRI、心臟活檢、陣發性心室心律不整減少、心源性猝死減少，及/或進一步發展性心肌紊亂減少或缺乏。
有效劑量之組合物之投與可藉由此項技術中之途徑標準進行，包括(但不限於)全身性、局部、直接注射、靜脈內、心內投與。在一些情況下，投與包含全身性、局部、直接注射、靜脈內、心內注射。投與可藉由心臟導管插入術進行。
在一些實施例中，本發明提供有效劑量之rAAV及本發明組合物的局部投與及全身投與。例如，全身投與可投與至循環系統中，使得整個身體受影響。全身投與包括經由注射、輸注或植入非經腸投與。本文所揭示之組合物的投與途徑包括靜脈內(「IV」)投與、腹膜內(「IP」)投與、肌肉內(「IM」)投與、病灶內投藥、或皮下(「SC」)投與，或植入緩慢釋放裝置(例如微滲透泵、儲槽式調配物等)。在一些實施例中，本發明方法包含藉由靜脈內、肌肉內、動脈內、腎內、尿道內、心內、冠狀動脈內、心肌內、皮內、硬膜外、皮下、腹膜內、心室內或離子電滲投與來投與本發明之AAV載體或其醫藥組合物。
特別地，投與本發明之rAAV可藉由使用將rAAV重組載體轉運至動物之目標組織中的任何物理方法實現。投與包括(但不限於)注射至心臟中。在一些實施例中，該等方法包括將rAAV活體內投與至冠狀動脈循環血管中，諸如逆行冠狀動脈竇輸注。
在一些實施例中，本發明之方法包含心內遞送。輸注可使用專用插管、導管、注射器/針，使用輸液泵進行。投與可包含將有效量之rAAV病毒體或包含rAAV病毒體之醫藥組合物遞送至心臟。此等可例如經由靜脈內、肌肉內、動脈內、腎內、尿道內、心內、冠狀動脈內、心肌內、皮內、硬膜外、皮下、腹膜內、心室內或離子電滲投與實現。本發明之組合物可進一步經靜脈內投與。 rAAV投與之作用
在一些實施例中，本發明之rAAV投與對個體有有益作用。 壽命
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV可增加個體之壽命。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使壽命增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約200%、至少約300%、至少約400%或至少約500%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使壽命增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、約95%至約100%、約100%至約200%、約200%至約300%、約300%至約400%、或約400%至約500%。 射出分率
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV會限制個體中之射出分率減少、恢復射出分率及/或增加射出分率。在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移限制個體中之射出分率減少、恢復射出分率及/或增加射出分率。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使射出分率恢復及/或使射出分率增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將射出分率減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之射出分率恢復及/或使該射出分率增加至少約1% 、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之射出分率減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使射出分率恢復及/或使該射出分率增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之射出分率恢復及/或使該射出分率增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將射出分率減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之射出分率減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。 左心室射出分率(LVEF)
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之LVEF減少、恢復LVEF及/或增加LVEF。在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移限制個體中之LVEF減少、恢復LVEF及/或增加LVEF。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使LVEF恢復及/或使該LVEF增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將LVEF減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之LVEF恢復及/或使該LVEF增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之LVEF減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使LVEF恢復及/或使該LVEF增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之LVEF恢復及/或使該LVEF增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將LVEF減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之LVEF減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。 右心室射出分率(RVEF)
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之RVEF減少、恢復RVEF/或增加RVEF。在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移限制個體中之LVEF減少、恢復LVEF及/或增加LVEF。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使RVEF恢復及/或使該RVEF增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將RVEF減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之RVEF恢復及/或使該RVEF增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之RVEF減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使RVEF恢復及/或使該RVEF增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之RVEF恢復及/或使該RVEF增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將RVEF減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之RVEF減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。 右心室(RV)面積
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之RV面積增加、恢復RV面積及/或減少RV面積。在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移防止個體中之RV面積增加、恢復RV面積及/或減少RV面積。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止RV面積增加、恢復RV面積及/或使RV面積減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100% 。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止RV面積增加，恢復RV面積及/或使該RV面積減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移防止個體中之RV面積增加、恢復RV面積及/或使RV面積減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移防止個體中之RV面積增加、恢復RV面積及/或使RV面積減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約100%。 左心室(LV)面積
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之LV面積增加、恢復LV面積及/或減少LV面積。在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移防止個體中之RV面積增加、恢復RV面積及/或減少RV面積。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止LV面積增加，恢復LV面積及/或使該LV面積減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止LV面積增加，恢復LV面積及/或使該LV面積減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移防止個體中之LV面積增加，恢復LV面積及/或使該LV面積減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移防止個體中之LV面積增加、恢復LV面積及/或使LV面積減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%或約95%至約100%。 右心室(RV)速度時間積分(VTI)
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV會限制個體中之RV VTI減少、恢復RV VTI及/或增加RV VTI。在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移限制個體中之RV VTI減少、恢復RV VTI及/或增加RV VTI。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV恢復RV VTI及/或使該RV VTI增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將RV VTI減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之RV VTI恢復及/或使該RV VTI增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之RV VTI減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使RV VTI恢復及/或使該RV VTI增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之RV VTI恢復及/或使該RV VTI增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將RV VTI減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之RV VTI減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。 左心室(LV)速度時間積分(VTI)
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV會限制個體中之LV VTI減少、恢復LV VTI及/或增加LV VTI。在一些實施例中，投與本發明之rAAV會隨時間推移限制個體中之LV VTI減少、恢復LV VTI及/或增加LV VTI。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV恢復LV VTI及/或使該LV VTI增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將LV VTI減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之LV VTI恢復及/或使該LV VTI增加至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之LV VTI減少限制為小於約1%、小於約2%、小於約3%、小於約4%、小於約5%、小於約6%、小於約7%、小於約8%、小於約9%、小於約10%、小於約15%、小於約20%、小於約25%、小於約30%、小於約35%、小於約40%、小於約45%、小於約50%、小於約55%、小於約60%、小於約65%、小於約70%、至少約75%、小於約80%、小於約85%、小於約90%、小於約95%或小於約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV使LV VTI恢復及/或使該LV VTI增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移使個體中之LV VTI恢復及/或使該LV VTI增加約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV將LV VTI減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移將個體中之LV VTI減少限制為小於約1%至小於約90%、小於約20%至小於約80%、小於約30%至小於約80%、小於約40%至小於約80%、小於約50%至小於約80%、小於約1%至小於約2%、小於約2%至小於約3%、小於約3%至小於約4%、小於約4%至小於約5%、小於約5%至小於約6%、小於約6%至小於約7%、小於約7%至小於約8%、小於約8%至小於約9%、小於約9%至10%、小於約10%至小於約15%、小於約15%至小於約20%、小於約20%至小於約35%、小於約25%至小於約30%、小於約30%至小於約35%、小於約35%至小於約40%、小於約40%至小於約45%、小於約45%至小於約50%、小於約50%至小於約55%、小於約55%至小於約60%、小於約60%至小於約65%、小於約65%至小於約70%、小於約70%至小於約75%、小於約75%至小於約80%、小於約80%至小於約85%、小於約85%至小於約90%、小於約90%至小於約95%、或小於約95%至約100%。 左心室(LV)纖維化
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之LV纖維化增加及/或減少LV纖維化。在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之LV纖維化增加及/或減少LV纖維化。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止LV纖維化增加及/或使LV纖維化減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止LV纖維化增加及/或使LV纖維化減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之LV纖維化增加及/或使LV纖維化減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之LV維化增加及/或使LV纖維化減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。 右心室(RV)纖維化
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之RV纖維化增加及/或減少RV纖維化。在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之RV纖維化增加及/或減少RV纖維化。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止RV纖維化增加及/或使RV纖維化減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止RV纖維化增加及/或使RV纖維化減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之RV纖維化增加及/或使RV纖維化減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之RV纖維化增加及/或使RV纖維化減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。 心室性早期收縮(PVC)
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之PVC增加及/或減少PVC。在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之PVC增加及/或減少PVC。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止PVC增加及/或使PVC減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止PVC增加及/或使PVC減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之PVC增加及/或使該PVC減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之PVC增加及/或使該PVC減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。 非持續心室性心動過速(NSVT)
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體中之NSVT增加及/或減少NSVT。在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之NSVT增加及/或減少NSVT。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止NSVT增加及/或使NSVT減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止NSVT增加及/或使NSVT減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之NSVT增加及/或使該NSVT減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體中之NSVT增加及/或使該NSVT減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。 異位搏動
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止個體之異位搏動增加及/或減少異位搏動。在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體之異位搏動增加及/或減少異位搏動。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止異位搏動增加及/或使異位搏動減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，與未投與本發明之rAAV之個體或與基線相比，投與本發明之rAAV防止異位搏動增加及/或使異位搏動減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體之異位搏動增加及/或使異位搏動減少至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。
在一些實施例中，投與本發明之rAAV隨時間推移防止個體之異位搏動增加及/或使異位搏動減少約1%至約90%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約1%至約2%、約2%至約3%、約3%至約4%、約4%至約5%、約5%至約6%、約6%至約7%、約7%至約8%、約8%至約9%、約9%至10%、約10%至約15%、約15%至約20%、約20%至約35%、約25%至約30%、約30%至約35%、約35%至約40%、約40%至約45%、約45%至約50%、約50%至約55%、約55%至約60%、約60%至約65%、約65%至約70%、約70%至約75%、約75%至約80%、約80%至約85%、約85%至約90%、約90%至約95%、或約95%至約100%。 帶編號之實施例
實施例1.一種聚核苷酸，其包含表現卡匣及視情況存在之側接腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)，其中該聚核苷酸包含可操作地連接至啟動子的編碼B細胞淋巴瘤2-相關抗凋亡3 (BAG3)或其功能變異體之聚核苷酸序列，視情況其中該啟動子為異源啟動子。
實施例2.如實施例1之聚核苷酸，其中該啟動子為心臟特異性啟動子。
實施例3.如實施例1或實施例2之聚核苷酸，其中該啟動子為肌肉特異性啟動子。
實施例4.如實施例1至3中任一例之聚核苷酸，其中該啟動子為心肌細胞特異性啟動子。
實施例5.如實施例1至4中任一例之聚核苷酸，其中該啟動子為肌凝蛋白重鏈肌酸激酶7 (MHCK7)啟動子。
實施例6.  如實施例5之聚核苷酸，其中該MHCK7啟動子與SEQ ID NO: 31共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
實施例7.  如實施例1至4中任一例之聚核苷酸，其中該啟動子為心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)啟動子。
實施例8.  如實施例7之聚核苷酸，其中該hTNNT2啟動子與SEQ ID NO: 32共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
實施例9.  如實施例1至4中任一例之聚核苷酸，其中該啟動子為人類熱休克因子70 (hHSP70)啟動子。
實施例10. 如實施例9之聚核苷酸，其中該hHSP70啟動子與SEQ ID NO: 115共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
實施例11. 如實施例1至10中任一例之聚核苷酸，其中表現卡匣包含心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)基因之外顯子1，其中視情況地，hTNNT2啟動子及外顯子1一起與SEQ ID NO: 32共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
實施例12. 如實施例1至4中任一例之聚核苷酸，其中該啟動子為泛素啟動子，視情況為CMV啟動子或CAG啟動子或雞β-血球蛋白啟動子或UBC啟動子(SEQ ID NO: 116)。
實施例13. 如實施例1至12中任一例之聚核苷酸，其中表現卡匣包含聚腺苷酸信號。
實施例14. 如實施例13之聚核苷酸，其中該聚腺苷酸信號為人類生長激素(hGH)聚腺苷酸。
實施例15. 如實施例1至14中任一例之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)，視情況為突變或經修飾之WPRE (WPRE(x))，視情況為WPRE Mut6 (SEQ ID NO:63)。
實施例16. 如實施例1至15中任一者之聚核苷酸，其中表現卡匣包含編碼綠色螢光蛋白(GFP)之聚核苷酸序列。
實施例17. 如實施例1至16中任一粒之聚核苷酸，其中B細胞淋巴瘤2相關抗凋亡3 (BAG3)或其功能片段或變異體為全長或野生型BAG3。
實施例18. 如實施例1至17中任一例之聚核苷酸，其中BAG3為人類BAG3。
實施例19. 如實施例1至18中任一例之聚核苷酸，其中編碼BAG3的聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 2共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
實施例20. 如實施例1至19中任一例之聚核苷酸，其中編碼BAG3之聚核苷酸序列為人類BAG3聚核苷酸。
實施例21. 如實施例1至20中任一例之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含至少約3.0 kb、至少約3.2 kb、至少約3.4 kb、至少約3.5 kb、至少約3.7 kb、至少約4.0 kb、至少約4.1 kb、至少約4.2 kb、至少約4.3 kb、至少約4.4 kb、至少約4.5 kb、至少約4.6 kb、至少約4.7 kb、至少約4.8 kb、或至少約5.0 kb。
實施例22. 如實施例1至21中任一例之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含至多約3.1 kb、至多約3.3 kb、至多約3.5 kb、至多約3.7 kb、至多約3.9 kb、至多約4.1 kb、至多約4.2 kb、至多約4.3 kb、至多約4.4 kb、至多約4.5 kb、至多約4.6 kb、至多約4.7 kb、至多約4.8 kb、至多約4.9 kb、或至多約5.0 kb。
實施例23. 如實施例1至22中任一例之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含4.4 kb至5.0 kb、4.4 kb至4.9 kb或4.4 kb至4.8 kb，其中該聚核苷酸包含4.0 kb至4.6 kb、4.0 kb至4.5 kb或4.0 kb至4.4 kb，其中該聚核苷酸包含4.0 kb至4.3 kb、4.0 kb至4.2 kb或4.0 kb至4.1 kb，或其中該聚核苷酸包含3.0 kb至3.9 kb、3.0 kb至3.8 kb或3.0 kb至3.7 kb。
實施例24. 如實施例1至23中任一例之聚核苷酸，其中表現卡匣側接5'及3'反向末端重複序列(ITR)。
實施例25. 如實施例24之聚核苷酸，其中ITR為AAV2 ITR及/或ITR與SEQ ID NO: 15至21中任一者共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
實施例26. 一種基因療法載體，其包含如實施例1至25中任一例之聚核苷酸。
實施例27. 如實施例26之載體，其中該基因療法載體為重組腺相關病毒(rAAV)載體。
實施例28. 如實施例27之載體，其中該rAAV載體為AAVrh74或其功能變異體。
實施例29. 如實施例28之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 100共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
實施例30. 如實施例27之載體，其中該rAAV載體為AAV9或其功能變異體。
實施例31. 如實施例30之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 97共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
實施例32. 如實施例27之載體，其中該rAAV載體為AAV6或其功能變異體。
實施例33. 如實施例32之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 98共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
實施例34. 如實施例27之載體，其中該rAAV載體為AAVrh10或其功能變異體。
實施例35. 如實施例34之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 99共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
實施例36. 一種治療及/或預防有需要個體之疾病或病症的方法，其包含向該個體投與如實施例26至35中任一例之載體。
實施例37. 如實施例36之方法，其中該疾病或病症為心臟病症。
實施例38. 如實施例37之方法，其中該心臟病症為心肌病，視情況為BAG3相關之擴張型心肌病。
實施例39. 如實施例38之方法，其中該心肌病為肥厚性心肌病(HCM)(肥厚性)。
實施例40. 如實施例38之方法，其中該心肌病為擴張型心肌病(DCM)。
實施例41. 如實施例37之方法，其中該疾病或病症為心律不整，視情況為心房微顫或竇房結病。
實施例42. 如實施例37之方法，其中該疾病或病症為心臟衰竭。
實施例43. 如實施例36至42中任一例之方法，其中該個體為哺乳動物。
實施例44. 如實施例43之方法，其中該個體為靈長類動物。
實施例45. 如實施例44之方法，其中該個體為人類。
實施例46. 如實施例36至45中任一項之方法，其中與健康個體相比，該個體具有 BAG3基因突變及/或減少之 BAG3表現。
實施例47. 如實施例36至46中任一例之方法，其中該載體係藉由靜脈內注射、心內注射、心內輸注及/或心臟導管插入術投與。
實施例48. 如實施例36至47中任一例之方法，其中該投與使BAG3表現增加至少約5%。
實施例49. 如實施例36至47中任一例之方法，其中該投與使BAG3表現增加至少約30%。
實施例50. 如實施例36至47中任一例之方法，其中該投與使BAG3表現增加至少約70%。
實施例51. 如實施例36至47中任一例之方法，其中該投與使BAG3表現增加約5%至約10%。
實施例52. 如實施例36至47中任一例之方法，其中該投與使BAG3表現增加約30%至約50%。
實施例53. 如實施例36至47中任一例之方法，其中該投與使BAG3表現增加約50%至約70%。
實施例54. 如實施例36至47中任一例之方法，其中該投與使BAG3表現增加約70%至約100%。
實施例55. 如實施例36至54中任一例之方法，其中該方法治療及/或預防該疾病或病症。
實施例56. 如實施例36至55中任一例之方法，其中該方法包含投與有效量之該載體。
實施例57. 如實施例36至56中任一例之方法，其中該疾病或病症係與個體中之BAG3截短相關或由其引起。
實施例58. 如實施例36至57中任一例之方法，其中該方法包含投與包含有效量之載體的醫藥組合物。
實施例59. 如實施例36至58中任一例之方法，其中該方法包含向該個體投與約1×10 11個載體基因體與約1×10 13個載體基因體之間的載體，向該個體投與約1×10 12個載體基因體與約1×10 14個載體基因體之間的載體，或向該個體投與約1×10 13個載體基因體與約1×10 15個載體基因體之間的載體。
實施例60. 一種醫藥組合物，其包含如實施例26至35中任一例之載體。
實施例61. 一種套組，其包含如實施例26至35中任一例之載體或如實施例60之醫藥組合物，及視情況存在之使用說明書。
實施例62. 一種如實施例26至35中任一例之載體的用途，其用於視情況根據如實施例39至63中任一例之方法治療疾病或病症。
實施例63. 如實施例29至38中任一例之載體，其用於視情況根據如實施例36至59中任一例之方法治療疾病或病症。
實施例64. 一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 107至116中任一者共有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的聚核苷酸序列。
實施例65. 如實施例64之聚核苷酸，其中該啟動子為MHCK7啟動子。
實施例66. 如實施例65之聚核苷酸，其中該MHCK7啟動子與SEQ ID NO: 31共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
實施例67. 如實施例64之聚核苷酸，其中BAG3為人類BAG3。
實施例68. 一種基因療法載體，其包含如實施例64至67中任一例之聚核苷酸。
實施例69. 如實施例68之載體，其中該基因療法載體為重組腺相關病毒(rAAV)載體。
實施例70. 如實施例69之載體，其中rAAV載體為AArh74載體。
實施例71. 如實施例69之載體，其中rAAV載體為AAV9載體。
實施例72. 一種治療及/或預防經鑑別為在BAG3中具有突變或截短之個體之心臟病症的方法，該方法包含向該個體投與如實施例68至71中任一例之載體。
實施例73. 如實施例72之方法，其中該疾病或病症為心肌病，視情況為擴張型心肌病(DCM)。
實施例74. 如實施例72之方法，其中該心臟病症為心律不整，視情況為心房微顫或竇房結病，或BAG3相關之擴張型心肌病。
實施例75. 如實施例72之方法，其中該心臟病症為心臟衰竭。
實施例76. 如實施例72至75中任一例之方法，其中該個體為哺乳動物。
實施例77. 如實施例72至76中任一例之方法，其中該載體係藉由靜脈內注射、心內注射、心內輸注及/或心臟導管插入術投與。
本說明書中所提及及/或本申請資料表單中所列出之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利出版物均以全文引用之方式併入本文中。
根據以上內容應瞭解，雖然已出於說明之目的在本文中描述了本發明之特定實施例，但可在不偏離本發明之精神及範疇之情況下進行各種修改。 實例  實例1：臨床前轉殖基因表現
測試 圖 1 至 8中所示之載體。使用經培養心肌細胞(例如，誘導多能幹細胞心肌細胞、 iPSC-CM、AC16、HL-1、C2C12、H9C2)或能夠經由此等構築體轉染或轉導之其他細胞，活體外測試AAV載體或各別表現卡匣。藉由ELISA、免疫螢光法、免疫組織化學及西方墨點法評估BAG3轉殖基因蛋白質之表現。藉由PCR偵測載體DNA且藉由qRT-PCR偵測BAG3轉殖基因mRNA。
鑒於可能歸因於高水準之自發性細胞凋亡而難以有效維持培養物中之BAG3 KO心肌細胞，採用患者iPSC衍生之心肌細胞的基於細胞之研究可能極具挑戰性。為揭露BAG3轉殖基因之表現益處(在AAV載體轉導及/或用載體質體轉染之後)，使用C2C12、AC16及H9C2細胞及靶向BAG3之shRNA以便減輕/降低在心肌細胞分化之後此等細胞之細胞凋亡程度(藉由習知方法(例如TUNEL)量測)。
在封裝至AAV.rh74載體中之後測試 圖 1 至 3 及圖 8中所示之表現卡匣。使用經培養之CHO-Lec2 (標準突變細胞，其醣蛋白及神經節苷脂中唾液酸缺乏70至90%，使該細胞對AAV轉導更敏感)對所得AAV載體進行活體外測試。藉由西方墨點法評估BAG3蛋白質在經轉導之CHO-Lec2細胞中的後續表現。呈現說明AAVrh.74-BAG3介導之轉殖基因蛋白質表現(BAG3)的資料( 圖 9)。
UBC啟動子在CHO-Lec2細胞中藉由WB產生最高的BAG3表現量，其次是hHSP70及MHCK7。發現hTnnT2啟動子(「hTnT」)在此等條件下驅動較低量的BAG3蛋白質表現。基於此等結果，可以得出結論，AAVrh.74載體可以有效地表現BAG3蛋白質。 實例2：在BAG3 KO及BAG3 CKO小鼠中之臨床前活體內功效
使用突變小鼠心肌病模型活體內測試所選載體。BAG3-/-基因剔除小鼠模型表現出嚴重的DCM表現型且呈現一或多種人類疾病之DCM元件。BAG3-/-基因剔除小鼠(描述於例如Homma等人，Am J Pathol, 2006中)具有選擇性破壞小鼠bag3基因之單一反轉錄病毒插入。對BAG3-/-小鼠組織之組織學分析顯示骨胳及心臟組織異常，但其他部位沒有異常，表明可能存在肌病。在第1週生命期間，BAG3-/-基因剔除小鼠無法與其野生型(+/+)及異種接合(+/-)同胎仔畜素相區分。BAG3無效小鼠之心肌顯示退化性變化，其中心房受影響之程度大於心室。KO小鼠在第12天之後停止增重且相對於同胎仔畜顯得矮小，且所有BAG3-/-動物在第25天死亡。20日齡後，發現在BAG3-/-小鼠中取樣之所有肌肉中的肌纖維變性。BAG3-/-動物之肌肉之H&E染色之新鮮冷凍部分顯示肌纖維大小有明顯變化，其中有萎縮性纖維及嗜鹼性材料之細胞內堆積的跡象。在BAG3-/-肌肉中未觀測到發炎、肌壞死或其他營養不良型病理學異常。
亦可將Cre誘導性心臟特異性BAG3-/-基因剔除(亦稱為Bis-iCKO)作為中重度DCM表現型之小鼠模型進行測試。此小鼠模型表現出一或多種人類疾病之DCM元件且其特徵為具有心肌細胞特異性之他莫昔芬(tamoxifen)活化之BAG3基因剔除，且稱為「Bis-iCKO」(描述於例如Yun等人，Int J Mol Sci 2021中)。此小鼠模型允許控制BAG3表現缺失之開始、限制成年肌細胞中的BAG3缺失，且引發導致擴張型心肌病之分子及功能性事件的進展。Bis-iCKO小鼠出生時可存活；然而，其非常容易因DCM及心臟衰竭而過早死亡。雖然60%的Bis-iCKO小鼠存活至28天，但Bis-iCKO心臟的形態學及組織學分析顯示此等小鼠之心臟明顯增大。超音波心動圖顯象顯示，在缺乏BAG3之小鼠中，左心室(LV)收縮功能(短軸縮短[[FS]百分比)出現年齡依賴性下降。
以上或類似模型中之AAV介導之BAG3表現的益處將由以下證明：存活率增加、體重增加增大、心動回聲圖(例如LVESD、LVEDD)上觀測到的心肌病之正常進展的緩和、右心室及/或左心室之尺寸增大的緩和，及/或左心室射出分率及/或短軸縮短之典型降低的緩和。組織學分析將藉由減少疾病相關之肌纖維紊亂之出現、減弱心室擴張、減少心室壁薄化、減少凋亡細胞數目、減少DNA損傷及減少心臟絕對尺寸之疾病相關變化而顯示出益處。 實例 3 ： 橫向主動脈縮窄術 (TAC) 後活體內心臟衰竭的搶救
使用上文所描述之選擇AAV載體的AAV-BAG3基因療法基本上係如Knezevic等人(JACC, 2016)中所描述進行。AAV表現卡匣係使用不同衣殼血清型(諸如AAVrh.74及/或AAV9)活體內封裝及遞送。
小鼠TAC模型：小鼠之經主動脈收縮(TAC)係以實驗方式誘導之心臟肥大，其由壓力負荷過度伴後續心臟衰竭所引起。相比於心臟衰竭之其他實驗小鼠模型，TAC模型導致更可再現的心臟肥大及心臟衰竭發展之漸進時程。在小鼠體內TAC之後，射出分率及心臟功能之其他量度之逐漸下降與心臟BAG3含量之逐漸下降同時發生。將雄性C57BI/6J小鼠(大月4月齡)麻醉且藉由按第三肋間空間之層級進行前開胸術來觀測主動脈弓。藉由在主動脈弓之第一與第二主幹之間用一根28號針縫合絲線來進行收縮。為了保持一致性，藉由量測術後7天的左右頸動脈都卜勒速度的變化來量化收縮水準。左右頸動脈峰值速度比可在5.0至6.5範圍內，且2週TAC射出分率可在40%至50%範圍內。
超音波心動圖顯象功效之功能性證據：使用經胸超音波心動圖顯象在預定義的時間點(包括基線及TAC後的不同時間間隔)評估TAC模型中心臟獲益的生物活性及功效的證據。為了篩選適合該小鼠模型的具有足夠心臟衰竭的動物，在TAC後1週確定右頸動脈與左頸動脈峰值速度(RC/LC)的都卜勒比率，且彼等不符合標準的動物(RC/LC為5.0至6.5)被排除在研究之外。此外，在TAC後2週進行超音波心動圖顯象，且射出分率(EF)超出40至50%範圍的動物亦被排除在外。然後在TAC後第8週向藉由心動回聲圖具有適當都卜勒RC/EV及EF的小鼠(經靜脈內或經眼眶內)注射過度表現BAG3蛋白之AAV構築體或調配緩衝液(FB；載劑對照)。隨著時間的推移，與FB對照組相比，EF與FS顯著增加，因此在經AAV-BAG3處理之動物中療效將很明顯。超音波心動圖顯象將顯示注射了FB之小鼠的EF與FS隨時間逐漸下降。相比之下，將發現注射了AAV-BAG3的動物的EF與FS在治療後的數週內恢復至對照水準。組織學分析將顯示心肌纖維陣列紊亂減弱。
圖 1為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 107。
圖 2為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 108。
圖 3為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 109。
圖 4為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 110。
圖 5為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 111。
圖 6為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 112。
圖 7為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 113。
圖 8為示出載體基因體之非限制性實例的圖式。載體基因體之完整聚核苷酸序列為SEQ ID NO: 114。
圖 9顯示在經指定載體轉導之後BAG3在CHO-Lec2細胞中之表現。針對各載體使細胞經3E6 MOI轉導，且6天後，收集細胞裂解物且使用抗BAG3多株抗體(abcam ab225561 1:2,500)進行西方墨點法。
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Claims (77)

  1. 一種聚核苷酸，其包含表現卡匣及視情況存在之側接腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)，其中該聚核苷酸包含可操作地連接至啟動子的編碼B細胞淋巴瘤2-相關抗凋亡3 (BAG3)或其功能變異體之聚核苷酸序列，視情況其中該啟動子為異源啟動子。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其中該啟動子為心臟特異性啟動子。
  3. 如請求項1或請求項2之聚核苷酸，其中該啟動子為肌肉特異性啟動子。
  4. 如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中該啟動子為心肌細胞特異性啟動子。
  5. 如請求項1至4中任一項之聚核苷酸，其中該啟動子為肌凝蛋白重鏈肌酸激酶7 (MHCK7)啟動子。
  6. 如請求項5之聚核苷酸，其中該MHCK7啟動子與SEQ ID NO: 31共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  7. 如請求項1至4中任一項之聚核苷酸，其中該啟動子為心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)啟動子。
  8. 如請求項7之聚核苷酸，其中該hTNNT2啟動子與SEQ ID NO: 32共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  9. 如請求項1至4中任一項之聚核苷酸，其中該啟動子為人類熱休克因子70 (hHSP70)啟動子。
  10. 如請求項9之聚核苷酸，其中該hHSP70啟動子與SEQ ID NO: 115共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  11. 如請求項1至10中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含該心臟肌鈣蛋白T (hTNNT2)基因之外顯子1，其中視情況該hTNNT2啟動子及外顯子1一起與SEQ ID NO: 32共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  12. 如請求項1至4中任一項之聚核苷酸，其中該啟動子為泛素啟動子，視情況為CMV啟動子或CAG啟動子或雞β-血球蛋白啟動子或UBC啟動子(SEQ ID NO: 116)。
  13. 如請求項1至12中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含聚腺苷酸信號。
  14. 如請求項13之聚核苷酸，其中該聚腺苷酸信號為人類生長激素(hGH)聚腺苷酸。
  15. 如請求項1至14中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)，視情況為突變或經修飾之WPRE (WPRE(x))，視情況為WPRE Mut6 (SEQ ID NO:63)。
  16. 如請求項1至15中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣包含編碼綠色螢光蛋白(GFP)之聚核苷酸序列。
  17. 如請求項1至16中任一項之聚核苷酸，其中該B細胞淋巴瘤2相關抗凋亡3 (BAG3)或其功能片段或變異體為全長或野生型BAG3。
  18. 如請求項1至17中任一項之聚核苷酸，其中該BAG3為人類BAG3。
  19. 如請求項1至18中任一項之聚核苷酸，其中編碼BAG3之該聚核苷酸序列與SEQ ID NO: 2共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  20. 如請求項1至19中任一項之聚核苷酸，其中編碼BAG3之該聚核苷酸序列為人類BAG3聚核苷酸。
  21. 如請求項1至20中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含至少約3.0 kb、至少約3.2 kb、至少約3.4 kb、至少約3.5 kb、至少約3.7 kb、至少約4.0 kb、至少約4.1 kb、至少約4.2 kb、至少約4.3 kb、至少約4.4 kb、至少約4.5 kb、至少約4.6 kb、至少約4.7 kb、至少約4.8 kb、或至少約5.0 kb。
  22. 如請求項1至21中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含至多約3.1 kb、至多約3.3 kb、至多約3.5 kb、至多約3.7 kb、至多約3.9 kb、至多約4.1 kb、至多約4.2 kb、至多約4.3 kb、至多約4.4 kb、至多約4.5 kb、至多約4.6 kb、至多約4.7 kb、至多約4.8 kb、至多約4.9 kb、或至多約5.0 kb。
  23. 如請求項1至22中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含4.4 kb至5.0 kb、4.4 kb至4.9 kb或4.4 kb至4.8 kb，其中該聚核苷酸包含4.0 kb至4.6 kb、4.0 kb至4.5 kb或4.0 kb至4.4 kb，其中該聚核苷酸包含4.0 kb至4.3 kb、4.0 kb至4.2 kb或4.0 kb至4.1 kb，或其中該聚核苷酸包含3.0 kb至3.9 kb、3.0 kb至3.8 kb或3.0 kb至3.7 kb。
  24. 如請求項1至23中任一項之聚核苷酸，其中該表現卡匣側接5'及3'反向末端重複序列(ITR)。
  25. 如請求項24之聚核苷酸，其中該等ITR為AAV2 ITR，及/或該等ITR與SEQ ID NO: 15至21中任一者共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  26. 一種基因療法載體，其包含如請求項1至25中任一項之聚核苷酸。
  27. 如請求項26之載體，其中該基因療法載體為重組腺相關病毒(rAAV)載體。
  28. 如請求項27之載體，其中該rAAV載體為AAVrh74或其功能變異體。
  29. 如請求項28之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 100共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
  30. 如請求項27之載體，其中該rAAV載體為AAV9或其功能變異體。
  31. 如請求項30之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 97共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
  32. 如請求項27之載體，其中該rAAV載體為AAV6或其功能變異體。
  33. 如請求項32之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 98共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
  34. 如請求項27之載體，其中該rAAV載體為AAVrh10或其功能變異體。
  35. 如請求項34之載體，其中該rAAV載體包含與SEQ ID NO: 99共有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之衣殼蛋白。
  36. 一種治療及/或預防有需要個體之疾病或病症的方法，其包含向該個體投與如請求項26至35中任一項之載體。
  37. 如請求項36之方法，其中該疾病或病症為心臟病症。
  38. 如請求項37之方法，其中該心臟病症為心肌病，視情況為BAG3相關之擴張型心肌病。
  39. 如請求項38之方法，其中該心肌病為肥厚性心肌病(HCM)(肥厚性)。
  40. 如請求項38之方法，其中該心肌病為擴張型心肌病(DCM)。
  41. 如請求項37之方法，其中該疾病或病症為心律不整，視情況為心房微顫或竇房結病。
  42. 如請求項37之方法，其中該疾病或病症為心臟衰竭。
  43. 如請求項36至42中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
  44. 如請求項43之方法，其中該個體為靈長類動物。
  45. 如請求項44之方法，其中該個體為人類。
  46. 如請求項36至45中任一項之方法，其中與健康個體相比，該個體具有 BAG3基因中之突變及/或減少之 BAG3表現。
  47. 如請求項36至46中任一項之方法，其中該載體係藉由靜脈內注射、心內注射、心內輸注及/或心臟導管插入術投與。
  48. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該投與使BAG3表現增加至少約5%。
  49. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該投與使BAG3表現增加至少約30%。
  50. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該投與使BAG3表現增加至少約70%。
  51. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該投與使BAG3表現增加約5%至約10%。
  52. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該投與使BAG3表現增加約30%至約50%。
  53. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該投與使BAG3表現增加約50%至約70%。
  54. 如請求項36至47中任一項之方法，其中該投與使BAG3表現增加約70%至約100%。
  55. 如請求項36至54中任一項之方法，其中該方法治療及/或預防該疾病或病症。
  56. 如請求項36至55中任一項之方法，其中該方法包含投與有效量之該載體。
  57. 如請求項36至56中任一項之方法，其中該疾病或病症係與該個體中之BAG3截短相關或由其引起。
  58. 如請求項36至57中任一項之方法，其中該方法包含投與包含有效量之該載體的醫藥組合物。
  59. 如請求項36至58中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投與約1×10 11個載體基因體與約1×10 13個載體基因體之間的該載體，向該個體投與約1×10 12個載體基因體與約1×10 14個載體基因體之間的該載體，或向該個體投與約1×10 13個載體基因體與約1×10 15個載體基因體之間的該載體。
  60. 一種醫藥組合物，其包含如請求項26至35中任一項之載體。
  61. 一種套組，其包含如請求項26至35中任一項之載體或如請求項60之醫藥組合物，及視情況存在之使用說明書。
  62. 一種如請求項26至35中任一項之載體的用途，其用於視情況根據如請求項39至63中任一項之方法治療疾病或病症。
  63. 如請求項29至38中任一項之載體，其用於視情況根據如請求項36至59中任一項之方法治療疾病或病症。
  64. 一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 107至116中任一者共有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的聚核苷酸序列。
  65. 如請求項64之聚核苷酸，其中該啟動子為MHCK7啟動子。
  66. 如請求項65之聚核苷酸，其中該MHCK7啟動子與SEQ ID NO: 31共有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  67. 如請求項64之聚核苷酸，其中該BAG3為人類BAG3。
  68. 一種基因療法載體，其包含如請求項64至67中任一項之聚核苷酸。
  69. 如請求項68之載體，其中該基因療法載體為重組腺相關病毒(rAAV)載體。
  70. 如請求項69之載體，其中該rAAV載體為AArh74載體。
  71. 如請求項69之載體，其中該rAAV載體為AAV9載體。
  72. 一種治療及/或預防經鑑別為在BAG3中具有突變或截短之個體之心臟病症的方法，其包含向該個體投與如請求項68至71中任一項之載體。
  73. 如請求項72之方法，其中該疾病或病症為心肌病，視情況為擴張型心肌病(DCM)。
  74. 如請求項72之方法，其中該心臟病症為心律不整，視情況為心房微顫或竇房結病，或BAG3相關之擴張型心肌病。
  75. 如請求項72之方法，其中該心臟病症為心臟衰竭。
  76. 如請求項72至75中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
  77. 如請求項72至76中任一項之方法，其中該載體係藉由靜脈內注射、心內注射、心內輸注及/或心臟導管插入術投與。
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