SK264192A3 - Direct molecular cloning of modificated gen of eucaryotic cytoplasmic dna-virus - Google Patents

Direct molecular cloning of modificated gen of eucaryotic cytoplasmic dna-virus Download PDF

Info

Publication number
SK264192A3
SK264192A3 SK2641-92A SK264192A SK264192A3 SK 264192 A3 SK264192 A3 SK 264192A3 SK 264192 A SK264192 A SK 264192A SK 264192 A3 SK264192 A3 SK 264192A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
sequence
gene
virus
plasmid
dna
Prior art date
Application number
SK2641-92A
Other languages
English (en)
Inventor
Friedrich Dorner
Friedrich Scheiflinger
Michael Pfleiderer
Falko G Falkner
Original Assignee
Immuno Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/750,080 external-priority patent/US5445953A/en
Application filed by Immuno Ag filed Critical Immuno Ag
Publication of SK264192A3 publication Critical patent/SK264192A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opisovaný spôsob obsahuje stupne: I) modifikovanie za extracelulárnych podmienok DNA molekuly, obsahujúcej genóm prvého cytoplazmatického DNA-vírusu, takže sa získa modifikovaná DNA molekula obsahujúca modifikovaný genóm cytoplazmatického DNA-vírusu, H) zavedenie modifikovanej DNA molekuly do prvej hostiteľskej bunky, ktorá obaľuje modifikované DNA molekuly do infekčných viriónov a ΙΠ) izolovanie viriónov obsahujúcich modifikovaný vírusový genóm z hostiteľskej bunky. Hostiteľská bunka sa infikuje pomocným vírusom. Pri expresii sa modifikovaný vírusový genóm obaľuje infekčnými viriónmi. Sú opísané tiež nové vektory vírusu kiahní pre priame molekulárne klonovanie otvorených čítacích oblastí do miesta štiepenia reštrikčným enzýmom jedinečným vo vektore.
,· !
> L ____5
ΑΛ3Γ30 V .' AZSIVNAA OHd , am j I av^o
Pŕíiaé molekulárni klonováni modifikovaného genomu eukaryo^ “ tického cytoplasmatiekého MA-viru ' • | Tato prihláška je částečným pokračovaním prihlášky í
č. 07/750080 ze dne 26. srpna 1991, nyni opuátené. f ί» !
Oblast teohniky .3 6 x e z
GJgcrg.
> O -j
C L 6
T'$
f.
Tento vynález se tyká modifikovaných genomú eukaryot ických DNA-virú, které se replikujl v cytoplazme hostite1ské bunky, jako jsou napríklad víry ueätovic a iridoviry. Podrobnej! se tento vynález týká pŕimého molekulárního klonování modifikovaného genomu cytopiaematického DNA-viru, který je produkován modlflkováním vyčištčné DNA molekuly obsahu jloí génom cytoplazma tie kého DliA-viru za extracelulárních podmínek. Molekula modifikované DKA se pak pakážuj© (vbalí) do infekční ch virionú. v bunce infikované pomocným cytopiaamatiekým WA-virem, Ve výhodné® uspoŕádáni podl© tohoto vynálezu se frag^lnt cizí DNA obsehujicí žádaný gen vloží pŕímo do genomu DNA«viru neštovic v mleté štépani reštrikční endooukleasoUf ktorú je jedinečná ve vlrovém genomu. Modifikovaný DNA-vir se vbeli do virionú transfekcí do bunék infikovaných pomocným vlrem neštovio.
Doaavsdni stav techniky
Eukaryotické oytopiasmatieké DNA-viry zahrnuj! riizné víry neštovic e iridoviry nalézajici se u obratloveú e u hmyzu. Víry neštovic* které mají rekombinantní gencw, se používaj! pro expresi rozmanitých vložených genú. Ta^/viry neštovic se mohou používat pro produkoi biologicky aktivních polypeptidú (napríklad) v bunečných kulturách a pro dodávání vakc i nových antigenú pŕimo do sviŕecího nebo lidského imunitniho systému. Zdá se, Že koustrukne rekombinantních iridovirových genomú pro expresi cizlch genil neni dokumentovaná v odborné literatúre týkající se genetického inženýrstvi.
Konvenční techniky konstrukce rekombinantních genomú. viru neštovic obsehujicí cizi gény spočívaj! v rekombinaci reeoue ee by aohl být .«^Wei' subgenové -OM · . mé^l »>3ÍR3ra <*55^X5'-.
lííahsi^Jí^l&tŕíKifc ’ ά “c* % -rs.>iWW -”
Hím Av~ «'•q'' í ' ’· iPwwl^wWP·—·’’ & ,<. ’ i·· : : i_. ‘v' i ÍF-jí Xäi
PttnayMMžé TffiAl %#*«£& **Μ ' noštovic •M* ho génu s pXäfflal4^;^®|tei wa ,,'~hU4w-tP ηθδΙ&ν&φ,Μέ se vloM do wA
DNA a t^pJÄkyk>0< WÍW»cO > ‘“Γ·.^ — zž. ií.'í'í a>
Ä'w,
W.í í*' '\ »$Mr‘ γ '* *ť ' 4Λ * * »s A* *
S ľ l 1 J>· · 4
7/-¾
L í't>
vie dosud^a^^ klopea^^OBi oo. ObOÄ^' ' Jfe‘í'Aíí^?&í/í.
.•+tó MÍÄl arf+iJI
JW&
Qj í«
JT·»
Fí<
- 5 apúsobom extrecelulární xekombinac© DNA, ampllfikovat v bakteriálni bunc©, prácne isolovat a dobre vycistit pred t in, než bq pridá do hostitalské bunky infektovsné virem ne át o vie.
Jiným problémom dosavadní metodológie je nízký výtéžek rekombinéntních. genomú. To máže zpúsobit, že je nutné testová t stovky individuálnXoh virú, aby se nalezl jediný žádaný rekombinant. Nízký výtéžek souvisí 's nižným výskytom jednotlivých intracolulárníoh rekombinací spojených s požadavkem násobných udalostí tohoto druhu, oby se dosáhlo integrace insertního plasmidu do vírového génom· Výsledkom je, že vétšine vírových genomú získávaných zpúsoby intraoelulární re kombiné c e jsou rodičovské genomy, ktorým chybí cizí gen. často je tedy nutné zavést do genomx víru noätovic gen selektivního msrk&ru spolu s jakoukoliv jinou áádoucí sekvencí, aby se umožhila okamžitá detekce žádaných vzáo* nýoh rekombinantú bez potreby charakterizovať isolované DNA z početných klenu jednotlivých virú.
Vyčistené DNA cytoplesmových DNA s ouksryotickýoh víru nejsou schopný replika©®, jestliže se vloží do vnímavé hostitelské buňky zpúsoby, které iniciují infekci vírovými DNA, ktoré se replikuji v jádŕe. Tento nedostatok incíoktivity DNA cytoplesmových DNA virú vede ks skutočnosti, že vírová trsnskripce musí být iniciována v infektovaných bunkách vírové špecifickou RNA polymorasou, která je normálnč k dispoeici uvnití infektujících virionú.
Hcaktivaee DNA viru nežtovic, v nichž gonoaová dna uvnitr deaktivované, neinfekční částice viru neštovio je vbslena (pakážovéna) do infekčňích virionú koinfekcí živým pomocným virem neštovio, je známa desítky let· Napríklad viz Fenner a Woodroofes Vlrology 11. 185 ež 201 (1960). V roce 1981 Sem a Dumbell prekážali, Že isolovaná neinfekční gonomová DNA prvního víru neätovic miže být vbalena do infekčních virionú viru nežtovic v bunkách infektovaných druhým geneticky rozdílným vírom nestovic (Sem e Dumbollí Ann. Virol· (Inštitút Paeteur) 132S, 135 (1981)·)·Toto
vbaloní nahé DNA víru neštovic bylo poprvé porkázánô transf©kol nemodifikowné MA obsahující první génom pŕírodního víru noštovic ísolovené z vírtonú nebo infektovaných bunék do bunék infektovaných druhým ganomas v pŕírodé ee vyskytují cího víru neetovic. Avšak hetorologní pakážovánl (vbalování), pekažováni DNA z jednako rodu nestovic životaschopnými viriony jiného rodu (napríklad, ne ä to vie ptákú) nebylo dosud popsáno.
Použití intracelulární rekombinace pro skonštruovaní rekombinaatního genomu víru noétovic, ktorý expres! poskytuje g©ny víru nlkoliv neštovíc, bylo popaáno krátce po tom, qo Sam a Dumbell poprvé popsali intracelulární pakááování nahé MA víru neátovic do vírionú, víru nestavte © sískání markám fragmenty MA intraoelulární rakombinaoí (vie Panioali a Paolettii 1932 a Meckott a spol.t 1932.). V odborné literatúre následujícího dese t íle tí však neni popsáno piírné molekulárni klonování, t j. konetrukc© pouhým extraoelulárním genetickým inženýratvlm, modifikovaného genomu ktorékollv cytoplasaaové MA eukaryotického víru, zvlášté pak víru neštovic. V literatúre dokonce ani neni uveden rozšírený názor jakékoliv výhodnosti možné reallzace takového pŕímého klonování· Naopak, autoritatívni spis konštatuj©, že prímé molekulárni klonování neni praktické v eouvisloeti & genetickým inženýretvím virá neätovic, protožo MA víru neštovíc není infekční (1?. Fonnor, R. Vittek a K. R. Duabells The Raocviruses”, Acsdemic Preše, 1939 ·)· Podobné i j iné práce v tóto oblasti odepsali endonuldeasové štepení e religaci MA víru neätovic, i když rozoznali j istý potenciál infokcních vírú Izolovaných MA obsahujících rekombinantní génom víru neštovlc. Viz napríklad ižackett a Sjairhx J. Gen. Virol. 67 , 2067 až 2082 (1936)·). Nedávné souhrnné články navíc navrhly názor, že jediným proveditelným spôsobom konstrukc© rekombinantního ganoEU víru neštovic je zpúsob používajícĺ rekombinaci (viz Mlner a Hrubý x TIBTEGII 3, 20 až 2? (1990) a Boss a Flexnerx Ann. Rev. Xamnol.· 3θ5 e ž .524 (193?)·
Podstate vynálezu
Predmčtem tohoto vynálezu je tedy získať zpusob konetrukoe modifikovaných, genomu euksryotických cytoplsmatických DNA-vixú, zvlšté virú neštovic, který pŕekonává shore uvedená omezeni související s konvenčnimi technikami založenými na intraoelulární rekombinaoi.
Jiným predmetom tohoto vynálezu je zíekání technik konstrukee genomu cytoplasmatíckého DKA-viru, které poskytuj! podstatné vyšá! výtožky rekombin^ntú ne z atúvejioi metodológie·
Dal ä im. piedmétem tohoto vynálezu je získat zpúsob modifikovaní genomu cytoplasmatíckého DNA-viru prímou modifikací genomové vírové DO e intrnoelulární pekážovánímodifikované vírové DNA do virionú funkcí pomocného viru·
Dsläim pŕedmčtem tohoto vynálezu je získať zpúsoby kone t ruke e genomu c y topia strmie kého DNA-víru, který v jednom rekombinantním reakčním stupni poskytuje modifikované genomy se segment am cizi DNA vloženým v každé ze dvou možných orientací e modifikované genomy, které máji násobné inserce segmentu cizi DNA.
Ješté jiným pŕedmétem tohoto vynálezu je získať zpÄsob získání modifikovaných DNA molekúl vhodných pro pŕímé molekul^áni klonování cizich gonú do modifikovaného genomu topíasmatiekého DNA-viru, který obsahuje dvé části genomové vírové DNA produkované štépením endonukleassmi špecifickými pro sekvence v místš, které je jedinečným místem ve virovém genomu·
Ješté jiným pfedĽiétem tohoto vynálezu, je získáni cytoplazme tie kého DNA—viru, svlášté viru neštovic, který má modifikovaný génom obsahující cizi DNA vložen do jedinečného mletá štepení endonukleassmi špecifickými pro sekvence.
Ješté jiným píedmétem tohoto vynálezu je získáni
J
-W.rfíV’. ’X-W»· .
H. Κ* - “
ΟΛνϊ. <.. -'-, Μ··Λ ‘.>--’·.··*:<
.--..<í ': ;r * ~ ’v 0Λ r^- y* táM«Sŕ ' 7 _<21 ’, ’v^·- K^'y’b*· 'ν’Λ· í-.'.V. ν5·?ν^-^·:ί.->/i'’- ···<·· · · ľ- -. '
T- t&o^eúj-i£ ..k^P'St^ik©! ;á prenos génových ks-· do vlju íi®štoviC|
00.- »' ’’ · - ·-.λ. ;<·· U - · 20t^'··· '.a .· . -v/··’ ·,·.’ -· · ’·· *
-'Cv*- ‘-'·Γί·\. /' .-··,··: ./-v\ť>·.._;;_· -·;·/Λ·· .^/. .*>; . ,-/- ;.< . .
00-:/.- tohoto λ ;' -vynál^'^X^Íí^ tohoto :;.- •ďúksryotiakého cyX klonováním aôáif lícovaného ' spásob obsahuje nolekula obnodifu»> která vbalí ^^^feláh BOdiíi‘ ' 1/4
r.lf.’ťwjiísái. T^Vz‘i-ι r,
Aí**5\ ,twrtŕ’· ;; WwR| ;/ώϊ^.ί<^ΐΒ®« v .*ÄÍ <-.-*>-r-V HA '* --&· -.5^^¾¾¾^¾¾
J?, W*'“,ó r
u»ädoitíitf, že v pi4»aaä( ,_.
káprb aekVmoL,, .^ľaäpfíiáuíff
.. enBýíäj je sde popsána také jjakýkollv isosch.
S> .- ’
-< V-X;
:B ť/'0ík ',. SW^ÄOdifikbvánl «ólrô£ty ’žÄÄlie tohoto vsná-7*· f' ' '· ^•-•-'•h/ ’··$.-.-’·'’ ^'äí’s · ’í · ~-' f:·-” '*' · · ' ~·, · ·* '- - /'i*_ 'Λ-·- ·' \'^ζ''' '· ‘ ,* ‘j~, ''. ~ **'*'''V^’--^··· *’·.*.· ljti,.: fosfatoey pro
-špecifickou c-·.· . · : :^ 5;·; -.7-7/:2.--Jj/- í'> 3i;’>'.;--. --· > '- · ')$'';’' '9v^®vý ’«> n b·-’·' X v >Ύ 3 **·* r&.'M'l J ^Tr? * 57rK< * *» *. · ·^?íCS<r^^‘ rÄ » * U*? r&< «. ^rí’V x ^»S<'^*4·-* ' M *· ‘ * --**· '/& \ ^X/2 ,^’Tt, t > \ 1 - - V ' \*0 - W^ÄA. >·«’.
>: Λ- ' ' - ’ <\ - <-* t ’C·»* * V *v* 4»ζ ií - / , -* ' ·> 9-¾ C .-50-/-- - ;.<·-< .
MV---.z-<·'<·.' '/>> u ¢-^.:-/^-:, ŕíWzO£5/:· .?
1« !>V ~b-’ r\ U >r y í? < r ŕ>'
J p b ‘
StK...
Igg^DtiL' stupeň. iaodiA ^I^Qliniek obsahuje Bp^oc if ickou ' «xlif ikovánl Ο|ίΧ:^Ε®Α sekvenee prvc^DKA O^.Žtšpani enpnuk®$$Obe si pM tom fMS í£’X rU·
Λi
VÝ.’ŕí'jMŕi
ÍÄsŕ^Ŕ'ŕ
J·, ''.'ž·.''·1 >.-·: Kŕ> - '·* ’ %Λ ?·
Ί· ru vakcínie a .jedinečné místo znamená ;.terlální reštrikční endo&ukleazou Nôti reštrikční endOQukleasou ftmel· První génom :aké druhou. DNA sekvencl nevyskytujieí se mu eukarjotického cytoplssiaatiokého DNA-vltato druhá RNA eekvence obsahuje jedinečné . Napi.
ch nestarlo '' -.g^nom zosmeóá geaom vi ’ft» .
. mís to štepení ba
'. hebo bakteriálni . jšúŽs·· oheahôvat t ' .pMiozenč v geno:
/ ru, pri éomž u . ©isto. štôpeni· NapM’dad první génom múžo znamenat génom •Víru drúbažíGh nestarlo obsahujlei aekvenci génu β-galak- . tosldasy gsoherichiá coli a jedinečné místo znamená misto ľštépoaí bakteriálni reštrikční endonukleasou fíoti, které ·' jé uisisténo v tomto génu.
t . Λ •S' · ' · ίγυ
.... V jinýeh formách tohoto zpúsobu se pvvaí DNA sekven. jce vloMl do prvního vírového genomu mezi první místo StopeA·;η£·: , první ^donuklea^li špecifickou pro sakvencí a druhé misto štčpeni druhou endoauklaesou špecifickou pro sekvenoi.
ť';.0be laists štepení, prvé i druhé místo Štepení, %íňými áísty štépení v prvnlm vírovom genomu.· jsou JedlneÔv ···
A r
z.
fv :s ;' .-Podie jiných usporúdáni zpúsobu podlo tohoto vynálezu jalespoií část první DíU sokvonce, která je vložene dc prvníhogencmu, je pod transkripční kontrolou proaotoru. Tento ^pqpoiaotór Εϋΐζ,β být umísten do první DNA selcvence, ktorá je žýiyíošena ďo prvního vírového genomu. Promotor je umleté á'iaké v aodlflkovaném virovém genomu po sméru vlákna první eékvence, ktorá je vložená do prvniho génom, V nokpŕípedech je promotor vyuziván HNA polymerazou J^Ovaniou modifikovaným vírovým genome. Ťonto promotor môže í^-taM vhodný pro inieiaci transkripcie -CNA poly/aerascu ^'ÚlärjFOtiokého oy topia srna tie kého DíU-viru, ktorý má být. aodi< 3£«ip8Qvári·- Y nékter.ých pri pudoch promotor zahrnuje modifi/ýWoi. pžírôzéué se vyskytujícíiio proá«oru aukRryotiGkého /'ííýkoplamatického DsA-viru»
·. už. ? · > 'Ž*''* Ä í
Itituováni ^édifikování prvíiiho virovélio genomu môže
JEJtupon modifik^oe W molekuly podlo zpúsobu podie
Bé'íyynálesu môže obsahové t stupeň deletovám DNA sekl^^ŕ^Vhiho genomu. Tento stupeň také obsahuje stupeň ía sekvence prvniho genomu· i
také obsahovot stupne lufikování prvni hostitelské bunky druhým eukaryotickým cytopiasrnatiekým DNA-virem obsahujícíra druhý génom, který je expresován. Tím se modifikovaný vírový génom pakážuje do infekčnlch. virionô. Stupeň zavedení modifikované DNA molekuly do prvni hostitelské bunky se provádi asi jednu hodinu po stupni infikovaní prvni hostiteleké bunky druhým eukaryotickým cytoplasmatickým DNA-virem.
V jedné variantč tohoto spôsobu se prvni hostitelaká bunke výbere tak, aby exprese druhého genomu v prvni hostitelské buňce neprodukovala infekční viriony obsahujicí druhý vírový génom· Napríklad jestliže modifikovaný vírový génom znamená modifikovaný génom viru vakoínie a druhý go nom znamená génom noétovic, -výbere se prvni hostitelská bunka savčí bunka·
V rwkterýah zpusobech modifikování vírového genomu stupeň isolece infekčních virioná obsahujících modifikovaný vírový génom zahrnuje stupeň infikovaní druhé hostitelské bunky infekčními víri ony produkovanými prvni hostitelskou bunkou| to se provádi za takovýoh podmínek, aby exprese druhého genomu v druhé hostitelské buňce neprodukovala infekční viriony obsahujicí druhý génom. Napríklad jestliže modifikovaný vírový génom je modlfikován genomem viru vakoínie, druhý génom môže být genomen· viru drúbežích neštovic a druhá hostitelská bunka je savčí bunkou· kodifikovaný vírový génom také obsahuje gen funkční hostitelské oblasti potrebný pro produkci infokeních virionú v druhé hostitelské buňce e drn-hému genomu chybí takový gen funkční hostitelské oblasti. Tato ilustrace je dáca pŕíklsdemt kdy modifikovaný vírový génom znemená modifikovaný génom viru vakoínie obsahujlei gen funkční hostitelské oblasti· Produkuj! se tak infekční viriony v lidské buňce a druhou hostitelskou bunkou je lidská bunka.
Podie jiného zpáeobu modifikovaný vírový génom obsahuje gen selektivuího morkeru, druhému genomu chybí gen selektivního markeru a stupoň lufikování druhé hostitelské bunky» se provádi za podmínek, které jsou selektívni pro gen expresujíci gen selektivního markeru. S výhodou exprese génu
selektivnúho markeru v druhé hostiteleké buňce propdjčuj© druhé hostitelské buňce resist©nc>. na cy t o toxickou látku, které je prítomna bôbom, infektování v tekových hladinách, které jsou postačujúci pro selekci genomu, který expresí poskytuje gen eelektivního markoru.
Podie jiného aspektu tohoto vynálezu s© získává modifikovaný oukaryotický cytoplašmetieký DNA-virus produkovaný pŕímýra molekulárni© klenov ním modifikovaného vírového genomu podie zpúsobň zde shora souhrnnč uvedených.
Jošté jiný aspekt tohoto vynálezu se týká modifikace ekuaryotického cytoplasme tie kého DNA-viru obsehujúcíhó modifikovaný vírový génom, píl Čemž tento modifikovaný vírový génom obsahuje» I) první génom prvého eukaryotlckého cytop la sme tie kého DRA-viru. Tento prvnú génom sestává z músta štepení endonukleesou spesifickou pro sekvenci e toto zuústo Štčpení je jedinečným mústem v první® gonomu. Modifikovaný génom dále obsahuje II) prvnú DNA ôekvoncl vloženou, do jedinečného místa prvnúho ganoisu.
Podie hlavního usspoíádání podlo vynálezu prvnú DNA aekvenoe jo sekveuce, která se nevyskytuje pŕirozené v gonomu eukaryotického cytoplasmatického DNA-vira, V nekterých prípade^*, výhodných prípadoch, první génom znamená genoui viru vakcinie a jedinečné místo znamená islsto Štepení bakteriálni reštrikční endonukloasou vybranou ze skupiny sestávajúcl z Nôti a Smel·
Prvnú génom mÚže obsahovo t druhou DNA sekvenci, ktorú se nevyskytuje prirozonš v genomu eukary etického cytoplasmatiakého DNA-vlru. Druhá sekvence DNA obsahuje jedinečné místo ätčpení. V jednom príkladu první génom znamená génom viru drábežúch neätovic obsahujúcich druhou ΓΝα sekvenci Saoherúchia ooli génu Č-galsktcsúdasy s jedinečným mís tern štépení v tomto génu je místo štšpení bakteriálni endonukleasou Notx·
V nékterých modifikovaných, virech podie tohoto vynálezu alespoň část uvedené první DNA sekvence, která je vložená
- 10 do jedinečného misia ätépeni, je pod. trsnekripcní kontrolou promotoru. Tento promotor je umistén v první DNA sek— venci, ktera je vložená do prvniho genomu. V nékterých pŕípadech první génom znamená génom viru neštovic a promotor obsahuje promotor viru neštovic, bučí pŕirozene se vyskytujícl promotor víru neátovic nebo jeho modlfikací.
Ještš jiný aspekt tohoto vynálezu se týká modifikaoi eukeryatického cytopiasrnatického DNA—viru obsahuj í cí ho modifikovaný vírový génom, kde tento modifikovaný vírový génom obsahuje I) první génom prvniho euka ty o t-.okého oy topia optického DNA-viru. Tento první génom obsahuje první místo štepení endonukleasou špecifickou pro první sekvenc! e druhé místo Štžpení endonukleasou špecifickou pro druhou sdkvenci. Každá 8 tšchto mist je jedinečným místern v prvním genomu.
Modifikovaný gemom v tomto modifikované® viru dále obsahuje H) první DNA sek^vnci vloženou do prvniho genomu mezi první jedinečné místo e druhé jedinečné místo. V nék— terých formách tohoto modifikovaného viru první DNA eekvenee se nevyskytuje pŕírozené v genomu eukaryotlckého oytopiasrnatiekého DNA-viruj v nekterých prípadoch první génom obsahuje druhou DNA sekvenci pŕirozené se nevyskytující v eukeryotiokém cy topia srna tie kém DNA—víru· Tato druhá DNA sekvence obsahuje první DNA sekvenc! vloženou mezi první jedinečné místo a druhé jedinečné místo. Napríklad tento modifikovaný vír múže obsahovať první génom, který je genomem viru vackínie, a obš místa Štepení, první místo štepení a druhé místo štepení, jsou mlaty štšpení bakteriálni reštrikční endonukleasou, která je vybrána ze skupiny seatávsjíci s Nôti, Smal, Apel a RerlI.
Ješté j iný euksryotický cytopiasm©tický DNA-virus seetává z taodifloveného vírového genomu, který obsahuje I) první génom prvniho eukaryotiokého oytoplasmatického DNA-viru. Tento první génom obsahuje první DNA sekvenci a teto první DNA sekvence obsahuje první místo Štčpení endonukleasou špecifickou pro sekvenci, které j© jedinečným rnlstém štepení v tomto modifikované^ virovém genomu. Tento génom tohoto modifikovaného viru dále obsahuje II) promotor, který je umístén
1.1 tak, že BÍJA sekvence vložená do jedinečného rrísto ätépení ve virovém genomu je pod transkripč-ní kontrolou promoteru* V jistýcb formách chybí této první DNA ©ekvenoi štart kodon translaoe mezi promotoram a jedinečným insertním Mstem* Touto první MA sekvenoí múže být sekvence píirozene se nevyokytující v cytoplasmovém eukaryotickém DKA-viru. Tento modifikovaný vírus znamená vírus, v némž první© genomem je génom viru vekcínie a první DIíA sekvence obsahuje násobné klonovaci místo obsahujicí místo štépení bakteriálními restrikčními endonukleasaM Nôti, Smel, xpal e HsrXl.
Jeáéč jiný aspekt tohoto vynálezu se týka modifikovaného eukaryotického oytoplaemetického DNA-vlru podie tohoto vynálezu, kde exprese první sekvence v modifikované© virovém genoou (vložená sekvence, o ktorou 3e jedná) v hostitelské bunco vede k produkci proteinu*
Podie Jiného aspektu se tento vynález týka také DNA molekuly obsahujíci modifikovaný vírový génom modifikovaného viru podie tohoto vynálezu. Zvlášté nékteré formy táto DNA molekuly obsahuj! jeden konce modifikovaného vírového génom»’ euka ry etického cy topia elastického DN.A~vi.ru, v nšiaž X) koneo modifikovaného vírového genorau obsahuje DNA sekvenci pŕirozene ae nevy^aytujicí v genomu eukaryotického cytoplaematickéhc DNA-viru* V této DNA molekule II) modifikovaný vírový génom obsahuje místo štepení endonukleaeou špecifickou pro eokvenci, které je jedinečným ©istom Štepení v tomto modlíikovaném virovém genomu, 0 111) molekula DNA má konec, který je homologní s koncern, který && produkuje štépeníe jedinečného ínista v modlíikovaném virovém genomu endonuklcasou špecifickou pro sekvanci.
V aéktorých formách této DNA molekuly sekvence prirození εβ nevy$£?ytujicí v genomu eukaryctickélio oytoplasmstického DNA-viru obsahuje miato štípaní endonukleasou špecifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem štepení v tomto modlíikovaném. virovém ganomu*
Ješté jiný a^sekt tohoto vynálezu se týka sestsvy pro primá molekulárni klonovánl modifikovaného vírového geuomu
- 12 oytoplasiaové DNA ©ukaryotického víru obsahující í I) vyčistené DNA molekuly podie tohoto vynálezu, II) DNA ligasu e III) roztoky pufxu e reakčních cinidel vhodných pro ligaoi DNA segmentu, takže se získá modifikovaná DNA molekula? obsahu j lei modifikovaný vírový génom· V jedné fonač tato s©stava dále obsahuje plasmid obsahujici kazetu pro expres! génu obklopenou mlaty štšpení endonukleesou špecifickou pro eekvenci, která jsou slučitelná e insereí této kazety do jedinečného mista žtépení modifikovaného vírového genomu kódovaného DNA molekulou v sestsvé. Tato sestavs múže dále o bsahovat první hostitslskou bunku a druhý vír vhodné pro pnkážování modifikovaného vírového genosu do infekčnich virionú.
Podie dalšího a'^sektu se tento vynález týká plssmidu obsahujícího DNA segment, který má na obou koncích místo žtčpeni bakteriálni reštrikční endonukleesou Nôti. DNA segment v tomto plasmidu obsahuje místo štepení endonukleasou špecifickou pro sekvenci, které je v tomto plasmidu jedinečné. Príklad tohoto plasmidu, jak je to ukázáno na obrázku 1.3» je oznacen pN2 a obsahuje sekvenci sekvence číslo 1. DNA segment v tomto plasmidu môže dále obsahovat gen selektivniho markeru pod transkripční kontrolou promotoru víru neštovic. Mezi takové plasmldy patrí napríklad plasmidy, které jsou označený pN2-gptn obsahuj sekvenci Číslo 2 e pN2-gptb obsahujicí sokvenci Číslo 3·
J iný plasmid podie tohoto vynálezu obsahuje DNA segaent, který dále obsahuje promotor víru ncšt^pvic odštepitelné napojený na DNA sekvenci obsahujicí mís to čtépení re straní endonukleesou. DNA segment vložený do tohoto ty istá štepení je tedy pod transkripční kontrolou tohoto promotoru. Mezi príklady patrí plesaidy označené pAX-32, které obsahuj! sekvenci číslo U a plasmid pA2-S2, který obsahuje sekvenoi číslo 12. Príkladom ta kovey plasmidu, který obsahuje dále gen selektivního ma r ker u pod kontrolou oddeleného promotoru víru neštovic, je plasmid pN2gpt-S4, ktorý obsahuje sekvencl číslo 14.
Ješte jiný plasmid obsahuje segment genomu víru no Š tovie t který obsahuje gen thymidin-kinasy tohoto víru neštovic· Tento gen thymldin-lcinasy je modifikován tak, u by preventívne bránil expres! aktívni Wymidin-kinaay, jako je napŕíkled v plasmidu osnsčeném pHindJ-2 obsehujícím sekvenci číslo 4 e pHindJ-J obsahujicím sekvenci Číslo 5·
Jiný ^bsmid obsahuje promotox víru neštovic odstepitelné navázaný na tratia lační štart kodon· Tento translačni štart kodon bezprostredne následuje pžeddruhým mistem štepení reštrikční endonukleaeou, které Je vhodné uspoŕádáno tak, aby umožňovalo translaci otevŕené čtecí oblasti vložené do mícta štepení druhou reštrikční endonukleseou. príklady tohoto plasmidu patrí plasmidy označené pAl—Si obsahu j io í sekvenci číslo 9, pA2—81 obsahující sekvenci č· 10 a pleamld pN2gpt-S3A obsahujícl sekvenci číslo 13·
Jeden konkrétni plasmid, tohoto typu dále obsahuje DNA sekvenci kodující lidský protrombinj W sekvence je odstúpite Iné napojene na promotor víru neštovic č štart kodon, Jak Je to ilustrováno na obrázka 5·! plasmideia označeným pAlSl-PT. Tento plasmid obsahuj® sekvenci číslo 15·
J iný plaamid dále obsahuje DNA sekvenoi kodujíeí lidský plasminogen včetnč translačního štart kodonu, kde DNA sekvence Je odstepitel^i napojená na proaotor víru neštovic. ^ak ukazuje obrázek 5.2, príkladom tohoto plasmidu Jsou plasmidy odvozené od pH2gpt-84, Jako je napríklad pN2gpt-GPg, •lasuinogen a obsahujicí sekvenci číslo 17, ujlcí lya-plasmlnogen a obsahujicí sekvenci číslo 13«
Ještč jiný plasmid podie tohoto vynálezu, Jak shora uvedeno, dále obsahuje DNA sekvenci kodujíoí vír lidské imunitní nedostetečnosti (HIV) gpl60, včetnč translačniho štart kodonu, která Je odžtepi&elnč napojene bb promotor víru neštovic, jak je to ukázáno na obrázku 5.4, p la ami des pN2^pt-gp!60 obsahu jí c im sekvenci Číslo 19· A konečné, jiný plasmid obsahuje DNA sekvenci kodujici lidský von áillebrendGv faktor, jak Je to ukázáno na obrázku 6.2.
' . · .. ^· /:··:.·ρ '-·</:<- ·;·/ ·.?/···· .-χ
- 14 Tento príklad je ozná δ© η plasmid pvWF. Obsahuje eekvenci číslo 20.
Nčkteré plasinidy podie tohoto vynálezu obaahujl místo štepení ©ndonukleasou špecifickou pro sekvenci, které je jedinečné v genomu víru neátovic. Príklady jsou uvedený na obrázku 4,3, včetnč pAO obsahu jlcího eekvenoi číslo 6, pAl obsahujÍGÍho sekvenci číslo 7 s pA2 obsahujíoího sekvenci číslo 3«
J iný plasmid obsahuje modifikovaný EooRI K fragment DNA viru vakcínie z ushož byl deletován gen KÍL hostitelské oblasti· jak je to uvedeno na obrázku 3.1. .Dvéma príklady jsou pEcoK-dhr obsahuj í cí sekvsnci číslo 21. a pdhr-gpt Obsahující sekvenci číslo 22·
J iné predmety, rysy a výhody tohoto vynálezu se ozrejmí z následujicího podrobného popisu· Tom by však málo být rozumeno takf že podrobný popis a speoifioké príklady· i když predstavuj! výhodná xwpoŕádání podie tohoto vynálezu, jsou uvedená pauze jako ilustraoe neboí rázné zmény a modif i ks c e v duchu a rozsahu tohoto vynálezu bcdou odboruíkám. zrejmá z tohoto podrobného popisu·
V následující Části tohoto spisu budov, stručné popsány pripojené obrázky·
Obrázek 1.1 ilustruje expres! gená markeru modifikovanými genomy viru neštovic získanými reaktivací DNA nahého viru neštovic. Je ukázán stŕíbrem obarvený polyakrylamidový gel proteinil pripravených v kultúre supernatantä bunčk infektovaných pakážovanými viry (vpPg δ. 1 až vpPg č· 3) a pŕirodnim typem viru (WT) jako kontrola· horní šípka ukazuje pás msrkeru plasminogenu, dolní šípka pás hlavnílio sekretovahého proteínu markeru 35K vakcíniSo Pásy 1 e 9 znamenaji proteiny markeru, pásy 2 a 10 znamenaj! štandard lidského plasminogenu (10 ng)> pás 3 znamená rekombíant vPgD vakcinie (zdroj pakážované DNA), pásy 4 až 7 a 11 až 14 znamenaj! vpPg Č. 1 až 8 a pásy 8 a 15 znamenaj! vakcín nli pŕirodniho typu (WR WT)«
- 15 E^c. ·
E'ŕr?
It ’Áf ** ks
Obrázok 1.2 je schematický diagram ilStrující molekulárni klonováni genomú viru neštovic obsahuj 1c ich kazetu génu pro expresi génu markeru (F.»0011 gpt gen) sa kontroly promotorem viru vakcinie· t,·
Obrázek 1.5 je schematická ilustraoe konstrukce plašmidd (pN2-gpta a pN2-gptb), ktoré jsou prekursory pro konstrukci kazet pro expresi genáf inserci promotoru a otovŕené čtecí oblasti· Takové kazety jsou určený pro pŕímý molekulový transfer do vektorú víru vakcinie pomoci jedinečného insertniho mista a génu selektovatelného markeru (gpt) ŕlsený promotorem viru vakcinie. KOS znamená násobné klonovaci misto· Ρ7·5 znamená promotor génu poly peptidu 7·% vakcinie e PH znamená promotor gemi polypeptidu llK vakcinie· Šípky ozačujl smery transkripce od promotoru.
Obrázok 1.4 ukazuje, že ganomy viru neätovic, produkované pŕimým molekulárnlm klonovánim, obsahuj! kazetu génu avloženého do jedinečného <SotX) Mate Štepená í jah|úkazuji Southernovy blotové. analýzy pŕes plak pfeeižté7Írových DNA rozštépeoýoh pôsobenia endonukleasy HindlII sondy gpt-genai· Pás 1 znamená DNA markeru (DNA fágu rozžtépená pôsobenia HindlH), pásy 2 a 5 znamenaj! pŕlrodniho víru vakcinie (W) rozštépenoa pôsobením J^ándHI (500 ng a 100 ng), pásy 4 až 9 znamenaj! DNA bunék yfínfektóvaných platy podie 2·1·1 až 7·1«1» pásy 10 až 12 .7 znamena jl DNA bunék infektovanýoh plaky podie 10.1.1 až 712·1«1· Sipty ukazuj! velikosti restrikčnlch fragmentú mar-*
'
-•v?’ -W í - V \v>Obrázek 1·5 dále ilustruje štruktúry modifikovaný ch DNA ; ’Vlru noštovic pomoci Southemovýoh blotú DNA (rozštepených pôsobením Nôti) bunék infektovaných riiznými isoláty a hybridizovaných sondou gpt-genu. Pás 1 znamená DNA mä^eere (DNA Xá^u imabda rozétépená púsobenim HindlII), pás 2 znamená ΠΚΑ píirodnlhó víru vakcinie (WB) rozätépenou pôsobením (5° as)·· 5 až 3 znamenaj! DNA bunék infektovanýoh ^Jj^wnfiiOSiQ'VanýiBi plal& podie 2·1·1 e£ 7·1·1> pásy 9 až U v^ameioBiji ΪΚΑ bunék infektovaných plaky podie 10*U ež .r ·/' z, ϊ· rf.t- ,·.--· '·, -ΧΓ!Κι<^ί<γ5»Τ* ’·’\4; *iŕíí»?‘^^?.Λ·«5·2·:'·;λ·Α\ΖΛ* ’.v · '·.·' .·-·- :. -· ’ i f·
-ΐί? ^.'‘Z'?*'·· zZ-Zí ··· ·...,,·' » . · ’.j.*;,,. .Λ.
·Ζ·7.'1'. · -ij·.·.
*. 16— ' . č. ·
Obrázek l.ô xifcxzí^e srovxiéní J3ÍA zprírodní (iVT) vakeíniea mdifxkovfíaéhoMom(vp7)3>Afragaeatň, které jsou rozätšpeny uvdei^Ä^ endomkUasami a oddôleny ' naagsrosov&a gelut!bvy&^ Mšy 1 a 2 aitótiaeQjaáX ^ a vpyy^p^^^^ P^^®^^ ^1»“^· $ a 4 ;-8áaiaenááÍ''W ^á|^á^'.-MnáXIIt pásy 6 a 7 znsuaônají ^evÄ^átôpexiésGU^aenS pôsobenia HindlIIa $b&i1--$ásyt7 ^B;a;p^.;r0zétSpené pôsobením PstI, a zlô 8Md^háá|: ·ί;'M í fWt/Sas^Pa^· pôsobením a vffl rosätépené ' rez*
St^pe^j^^ levéstoné osnačují • va^ijš^^^se^áät vakcín oznsčují ^z vMlr^^t^9Ä^ťM>žp^^^X/W/'Sfji>bi5éänlä±zási deeetiné rn neplné pásy. V .: ·' '-' ' 'sfe .· $.’4'···-'·'; ' ZC'Zí’át· ' .'Z·..·.'
- ;gelu uvedeného ózna&Mi valístí raršru»z'' z^í- j -¾ C·. .'-.. . .
analýzu DNA ^:^&8Í^fliÄŽ^é^^^\|äk^^^^nou:pôsQbeniia , j 11 > ·.· „· ľ.·«??”“.’Jj>l X’..i; L* <<·’.·»* J.“·? AizRi í ---'^ ’ v-t‘. flv'·* •••’i7*?:^·' '. •ľr'S'eľ ’· . ·.-'<_ «. . '. -·. ' &} '-«Ý'ZVZ 7-¾¼ .>)·>' ''- Oi Λ, 'ty' tytyty
- . . ' '7^
-i
-W ^íÄÄO^Ä . Z; jS^Ptí ÄÄJÍŕ’iÄtŠ
.. .... .,.,...,_ ................. .
P/2 -analýza ste j· sondy SÍJ^Swé^^Ä'ébrázka'l.a# pás pás . ...^,. ....... i l5 zna^
-e fág' ¢2 <.:V'Z 4·.^:Χ·<>.?»».«^&··.*.·Α·.- ...
«·.
ti!
I
J y'·''· <*s ' •t
-••ť· .ú />·*.·< .:
•v:
u. «s1 •‘h · <
'í“
Λ ·* x * ’ < j .·.?· Λ r' ..’ .rf'···-'' s ,ď
A’ <
>ť£ ν,Λ' '<·’ s;*?’’-· ’ nounebodvčma .sr;
’ yf ?
v.
»·.> ..>»•I·'
V •í1· i
.p\ <r.' ť,·.· ;ιϊ·.
.·/:
í‘K y;,ίώ ,v
T5“ r
Ha>
&· k n * p£jey,z :. -••λ»»!· ♦’-c .·-'—-h->·— »./r ? r
*· - Μ» ««'-'· ΣΤ>· ľ» ?B :».<* > A>·£·.··..»»·;.··.*·^14 ·,4.:λ’ι'ινϊ·'Γ' -ι'· .''·»?*·.ί5*Ί. : * fc- ·> & <„7 > 't' ^JŽ* . ť'1 viru nestavia extracelulárním genomovým inženýrstvim a iatreoelulárnlm pakážováním· Kazeta genu sestávající e gpt génu kontrolovaného promotorem víru ve kel nie, se ligu, ja e pravým raménkam (ra) a levým raménh^č (la) W viru vakcínio rozštépené v jedinečnom místč pôsobenia endonukleaey SmsI. ^ekážování se provádí pomocným virem drúbežích neétovic (kmeň HP1.441) ve fibroblasetch kudtecího zárodku. PI znamená promotor génu viru vakoínie kodujíoi polypeptid ô molekulové hmoté 7 500«
Obrázek 3· 2 ukazuje, že seatrojené genomy viru vakcinie pakážované pomocným virea drúbežích neštovio obsahuj! očekávaný insert v jedinečném sistč štépení Smal, jak bylo stanovené analýzou Southemovým blotem· Oelkévá DNA ieolovená z infektovaných bunšk se rozôtépí púsobením HindlII a biet se hybridizuje sondou gpt-genu· Pásy 1 až 8 znamenaj! DNA z bunek infektovaných plaky označenými F12.2 až F12.9, pásy 9 až 1? znamenaj! plaky F13.1 až F15«5m pásy 14 a 15 znamenaj! DNA, ktorá je isolována s neinfektwvanýoh bunčk nebo s bunek infektovaných virem vakoínie (® pfirodního typu), ktorá je rozátSpena pôsobením HindlII a pás 16 znamená markery (DNA fágu lsmbda rozčtépená pôsobením HindlII)· IMA v pásu 8 seVJhybridizuje, pretože vírový isolát č· F 12.9 se nereplikuj©.
Obrázek 3«3 ukazuje schématioký nástin očakávaných struktur modifikovaných genomú vakoínie, které maj! génovou kazetu vloženú do jedinečného mlsta Smal9 zvlášté modifikované HindlII A” fragmenty virú s jednou nebo dvoma insercemi. H znamená místo štépení reštrikční endonukleasou HindlII a S znamená místo štčpení reštrikční endonukleasou Smal. čísla označuj! velíkosti fragmentÚ HindlII· U tech, které jsou uvedený tučným písmom, se očekává, že hybridizují sondou gpt-genu· Kazeta gpt-genu sestává z promotoru víru vakoínie (o velíkosti asi 300 párú nukleotidú) oddelených vnitŕním míetem HindlII z gpt eekvencí (asi B00 párú nukleotidú). Šípky označuj! smčr tranekripoe gpt-genu*
Obrázek 4.1 ukazuje schematický plán konštrukcie vektoru
- 19 vdTK viru vakcinie s modifikovaným genem thymidin-kinssy (tk). O-W znamená prírodní (WT) ’H?estern Reserve” (WN) kmeň viru vekcinie (VV). Na obrázku 4.1A je ukázán zpúnob používa j lei pouze prímou molekulárni modifikaci genomu viru vakcinie, včetnč delece nežádoucích míst Nôti e 8mal. Na obrázku 4.1B je nastínén alternatívni prístup pro deleci místa Nôti tcchnikemi ziskáváni marfcaru s virem vakoínie a modifikovaným plasmidem· Na obrázku 4.10 je uveden alternatívni zpôsob delece miate Smôl získávánim markeru·
Obrázek 4.2 ilustruje konstruováni vektoru (vdTK) víru v ako iní©, jehož gen thymidin-kinasy (tk) je nahrezen násobným klonovacim zaistem. Šípka označuje počátck a smér tranz— kripoe génu víru vakcínie tk (VV-tk) do HindlII J fra@asntu klonovaného v plasmidu pHindJ-1* Gen tk je nahrazen a konečný plasmid pHindJ3 se použije pro vložení modifikovaného HindlII S fragmentu do viru vakcinie.
Obrázek 4.3 nestína je konstrukoi plesmidô. (pál a pA2), které jsou prekursory konstrukce kazety pro expres! génu inserci promotoru a otevŕené čtoci fáze* Ts.kpvé kazety jsou vhodné pro molekulárni pženos do vektoru vakôlni© vtCT pfirným (násilným) klonovánlm.
Obrázek 4.4 ilustruje konstrukci plesmidá (pAl-Sl a pA2—31) obsahujících kazety pro expresi génu vhodných pro aeooiaci otevŕenýoh čtecich oblasti ee syntetickým promotoreu víru neštovic (SI) a štart kodonem translaee· lyto kazety jsou určený pro pŕimý molekulárni prenos do vektoru víru vokcinie vdTK násilným klonováním. Promotor 81 je pŕítomen v rúznýsh orlentacích ve dvou plasmldeoh, jak označuj! šípky, které ukazuj! smár trenskripie.
Obrázek 4.5 ncstiňuje konstruováni plasmldá (pAl-S2 a pA2-S2) sestávajioich z kazet exprese génu, které Jsou vhodné pro asoeíaoi otevŕenýoh čteoioh oblastí, které má ji štart kodon translace, sa syntetickým promotorem víru neštovic (32), pred prlmým molekulárni© prenose© do viru vaku í nie vdTK. násilným klonováním. Promotor 82 je pfitomen
v rdzných orientecích ve dvou plasmidech, jak označuj! čipky, které ukazuj! smér tr&kripco.
Obrázek 4,6 ukazuje konstrukci plcsmidú pN2-gpta a pN2—gptb,
Obrázok 4.7 ukazuje konstrukci plasiaidú (pN2-gpfc-S3A a pK2-gpt-S4) obsahujicí kazety exprese gem, ktorým buň ohyb! (S3A) nebo které maj! (S4) štart kodoji traneluce. se syntetickým promotorem (S3At poprípade 34), pred prí~ mým molekulárnom pfenosem do jedinečného místa ve vektoru víru vakcínie vdTK. Zkratky jsou uvedený na obrázku 1.5.
Obrázok 5.1 ilustruj® konstrukci kazet exprese génu (pAlSl-PT) pro expres! lidského pro trombónu ve vektoru víru vakoínie vdTK. Zkratky maj! stojný význam jako na obrázka 1.5. Sipky označuj! smér transkripcií.
Obrázek 5.2 predstavuje konstrukci plašimldu s kazetou exprese génu (pN2gpt-GPg) pro expres! lidského glw-plasminogenu ve vektoru viru vakcínie vcíTK. S4 znamená syntetický promotor víru nestovio. Ostatní skratky máji stejný význam jako na obrázku 1.3·
Obrázok 5·3 ukazuje konstrukci plasmidu s kazetou expres© génu (plí2gpt-IPg) pro expres! lidského lys-plesminogenu ve vektoru viru vakoínie vdTK. Zkrat^S máji význam stojné jako na obrázku 1.3.
Obrázok 5.4 na s t im j e konstrukci plasmldu s kazetou exprese génu (pN2gpt*gpl60) pro expres! antigénu lidského viru UíIVgplSO) ve vektoru víru vakcínie vdTK. Zkr&tky máji stejným význam jako je ahora uvedená na obrázku 1.5.
Obrázok 5.5 ilustruje pfístup k testování modifikovaných Virú vakcínie pripravených pŕímým molekulárni^ klonováním založenéa na protiproudé lasera! gem markeru (E.coli lacZ gen), ktorá udčluje vizuálne rázuý fenotýp (modrý plak v© erovnání s normálními bílými plaky vír á, jimž chybí lacZ gen).
- 21 Obrázek 5.6 ilustruje konstrukci plssmidu pTZS4—lacZa a pTZS4-lecZb.
Obrázek 6*1 ilustruje konstrukci vektoru viru vakcinie (vS4) s prlmým základni® klonoveGÍa míetem pod kontrolou silného pozdniho promotoru viru vakcinie (84).
□brázek 6*2 ukazuje konstrukci modifikovaného viru valce í nie (wJF) pro expres! von-Jill©brendov© faktoru prímou molekulárni inserci otevŕené čteci oblasti do vektoru viru vakcinie vS4. v<F znamená c DNA von-ί? 111 o br a ndove faktoru. Sipky označují smér transkripoo^promotoru S4*
Obrázok 7.1 ilustruje vliv množstvá pridané DNA na nakáž o vání DNA viru vakcinie pomocným vírom drubožích neštovic do savčích bunék (CV-1), v nichž se vír drúbožích neétovic nereplikuje úplné. Pét kul tur bylo infektováno virem drábežích noČtovie a následné trenafektováno vyznačenými množstvimi DNA viru vakcinie* První sloupec znamená kulturu bez pridané DNA & bez viru drúbeších neätovic, pátý sloupec znamená hulturu bez pridané DNA, ale infoktovanou vírom drúbežích nestovic.
Obrázok 8.1 na s tlmi je konstrukci viru v® kôlni© (vdhr) vhodného pro použití jako pomocný vir b rozsáhlými mitacemi hostitele, které zabranújí replikaci v néktorých lidských bunečných linlích* lír-gen znamená gen hostitelské oblasti umlátený v ScoKI K fragmentu viru vakcinie* Ostatní skratky máji stojný význam jako na obrázku 1*3·
Obrázok 9*1 ukazuj® konstrukci plasmidä pfí2gpt-P2 a pP2gpl60WJ* Sipky uvnitf plaemidô ukazuj í siaär tranakripce pflslugnýah genô.
Obrázok 9.2 je schematický nástin konstrukc© viru vP2-gpl60íffi-A a vP2-gpl60W-B.
Obrázok 9.3 ukazuje mapy PstX-S-fragmentu viru vakcínio pŕírodniho typu a Pstl-fragmentá chimernich víru .c ,-...· ·. . . ·*- * ·. - ;,·; ·Λ/-ľ-. · ? . ·.-·-* χ'·
... <--·,·' ' .’· ’ c .< v:/··. -'· '· ' ίΛ\·' .'·>>.·' p :‘f. ·· · -<:.<··· . · -ή
- 22 obsahujících gpl60 gény. Čipky označuj! smer tranakripce génu gpl60. Čísla označuj! ve11kosti fragmentu v tisícich páreoh nukleotidú·
Obrázek 9.4 ukazuje konstrukol plasmidú pselP-gpt-L2· čipky označuj! smér transkripce príslušných genú.
Obrázek 9·5 A) ukazuje konstrukci plasmidú pselB-gplôOW a obrázek 9.5 B) ukazuje sekvenci kolem translačnich štart kodonú pŕírodního (sekvenoe čísla 75) a modifikovaného (sokven.ce číslo 75) gpl60-genu·
Obrázek 9.6 je schematický nás t in konetrukoe chimerních virú vakcínie vsel£-gpl60MA a vP2-gp!60MIU čipky označuj! smšr transkripce gpl60-genu<
Obrázek 9.7 je mapa SaXX-F-fragmentu yľiru vakcínie prirodnlho typu e SaXI—fragmentú chimemíoh virú vakcínie vselB-gpl60Míá a vPír-gplôOMRB. čipky ukazuj! sašr transkripce gp2.6O-.genu· čísle označuj! velikostl fragmentu v tisícich páreoh nukleotidú.
Obrázek 10.1 A) ukazuje strukturu plasmidú pN2-gptaProtS. Kazeta dvou genú sostávajío! z gpt génu kontrolovaného Ρ7·5 promotorem vakcínie (Ρ7·5) a génu lidského proteinu S (leuProtS) kontrolovaného syntetickým promotorem viru neštovic (selP) je obklopená rcstrikčními siaty Nôti. Obrázek 10.1 B) ukazuje sekvenoe kolem translačních štart kodonú génu pŕírodního proteinu S (eekvence číslo 77) a génu proteinu S v chlmerách (sekvenoe číslo 79).
Obrázek 10.2 ukazuje Southernovu hlotovcu analýzu chimerních virú vakcínie nesoucích gen proteinu S. A) Celková bunéčná i>A rozôtépená púsobením Sací a hybŕidizované Sací fxags&ntem vakcínie pŕírodního typu· B) Stojný materiál rozštčpený púsobením N o tí a sondovíaný sekvenoemi lidského proteinu S. C) Schematický nástin Sacl-I—fragmentu pŕírodního typu a chimerního Sací—fragmentu po ligeci insertu.
Obrázek 10.3 ukazuje «esternovu blotovou analýzu od plasmy odvozeného proteinu S (pdProtS, pásy 1 a 2) a rokombinantniho proteinu S (rProtS). Supernatanty bunéčné kultúry (10 mikrolitrô) bunčk SK Hopi byly analyzovány po inkubačnich periódach 24 až 72 hodiny·
Obrázok 11,1 ukazuje strukturu plasmidu pK2gpta-FIX. Kazeta dvou gená sestávajicí z gpt génu kontrolovaného P7.5 promotorem vakcínie (P?.5) a génu lidského faktoru IX kontrolovaného syntetickým cromotoroem viru neštovic (selP) je obklopená restrikčními mlaty No ti .
Obrázok 11.2 ukazuje Southemovu blotovou analýzu chimorních virú nesoucíoh gen lidského faktoru IX· A): Celkové bunečné DNA rozštčpené pôsobením Sfu a hybridízované sondou génu lidského faktoru IX (plasmid pBlu&jripWXX)· Ve všech dsmiaisoláteah (Č· 1 až 6, 9 s 10) mSl insert oriontael “á”, m znamená marker# W-$T/WB znamená vakcinie pŕirodního typu, WR-kmon· B)J Piodpovédené genomové štruktúry chimerních virú.
Obrázek 11.3 ukazuje Sesternovu blotovou analýzu od plasmy odvozeného faktoru IX (pdFIX, pásy 1 a 2) a rekombínantního faktoru IX, získaného expreeí chimornÍB vírení vakcínie v bunkách VERO. Supernstanty bunečné kul tury (10 yul) se analyzuj! po dvaesedmdesátihodinové inkubsci. δ, 1 a 6, 9 a 10 znamenaj í isoláty plskÔ, pd FIX znamená od plasmy odvozený faktor IX.
Obrázok 12,1 ilustruje konstrukci chimerního viru drubežích neštovic f-env-IIIB pŕímým molekulárni® klonovánlm Hl VIIX B env génu.
Obrázok 12.2 A) utezuje Southernovy bloty Sspí-fragémtnú. isolátd chimérního viru drôbežich neštovic ukezujici inserty env génu. Pásy 1 až 12 znamenajl virové isoláty f-LPg-1, pásy 13 ® 14 znamenájí HP1.441 a f—TK2a (negatívni kontrol ly), pás 15 znamená SspI štép (10 ng) pN2gpt-gp!60 (positivní kontrola). Obrázok 12.2 B) ukazuje reštrikční mapy Ss^L fra^ieatá ínsertu ve dvou mo>uých orientaoíah v chimerním viru drábežich neštovic. Síela oznsfiujl velikosti Ssp I-fragmentú. v tisícich párech nukleotidô, Šípky označuj! orienta c i insertu, která odpovidá smeru trsnskripce transkripcií Jednotky gplGO,
Obrázek 12.3 ukazuje expres! IHV obalových glykoproteinú. ve fibroblasteoh kuŕooích zárodku (^esternovy bloty). Pásy 1 až 8 znamenaj í virové isoláty f-LI'2a až h, pásy 9 a 15 známe na j i štandard gp!60 (poskytnutý A. Mittererem, Iiamuno Ag, Qrth/donau, Rskousko), pásy 10 až 13 znamenaj! virové iooláty f-lF2Í a á 1, pás 14 znamená proteiny markeru, pásy 16 a 17 znamenaj! viry neátovic drúbeže HP1.441 a f-TK2a (negatívni kontroly).
Obrázek 12.4 ukazuje detekci HXV gp41 produkovaných chimerními viry vakcinie^ infektovaných fibroblasetch kuŕecího zárodku (Wsternovy bloty). Pásy 1 až δ znamenaj! virové isoláty f-LP2a až h, pásy 9 a 15 znamenaj! stsndard gplGO, pásy 10 až 13 znamenaj! virové isoláty f—IiF2i až 1, pás 4 znamená proteiny markeru, pásy 16 a 17 znamenaj! viry drdbežich noôtovic HP1.441 e f-TK2a (negatívni kontroly)·
V následujíci části tohoto spisu jsou podrobne popsána výhodná uspoŕádáni tohoto vynálezu.
Tento vynález znamená první konotrukci modifikovaného geuomu cytoplssmové DNA eukaryotického viru, jako je napríklad vír neštovio, úplné mimo hranici živé bunky. Tato konatrukee se nestaví tak, že se použije vírová genomová DNA, která se rozštep! endonukleasou špecifickou pro sekvenci a potom se religuje c i z! DNA. Výsledná modifikovaná DNA se pak pakážuje do infekčních vlrionú viru nestovic trsnsfeko! do hostiteľských buaék infektovaných jiným vírom neštovic, který slouží jako pomocný vir.
Tento vynález umožňuje rúzné stratégie získávání vektorú z cytopiasmeé^^/ch eukeryotickýchlvirá, které byly dŕíve aplikovány na jiné DNA-víry pro ŕešeni rušných probléiad v genetické® inženýrstvl. Napríklad prístup pMmého klqnování nabizi možnost klouováa! genú pŕimo do cytoplasmdé^mÄ-virá, jako jsou napríklad viry neátovic, které nemohou být klono vány v bakteriálni e h systémoch, úž proto, že jsou pro bakteriálni syetémy pŕí/iS velké nebo proto, že jsou pro baktérie toxické a nebo že jsou v bakterííeh ne s 111 é. Pŕímé molekulárni klonování dovolujo vot&i pŕenoet než zkonstruování vírových gônom^, za optimálnich podmínok máže zvýsit ryohlost klonování e produkuj! so také rdzné konstrukce v jediné ligečni smési, které máji násobné inserty s rúznými orientacemi. To umožňuje rycliié testovaní (skxíning) uspofádání, které poskytuje optimálni exprosi cizího gemu
Pojem eukaryotický cyteplsemetický DO-viros”, jak j® zde použiváu, zahrnuje jak iridovlry tak víry nežtovic. Mezi iridovlry'* patrí jakykoliv, vírus, který je klasifikován jako vírus tx-idy Irldoyiridže, jako je napríklad virue africké aorodky preset, o v*ké viry obojáiv®lnikú a víry hmyzu, Mezi víry nežtovía patfi jakýkoliv Člen rodu Pox včetušpodrodu Jhordouoxvírídiae (víry neétovic o brat love ú) s Ľa t ojko poxv í r idi s>e (viry neštovic hmyzu)· Vi z napfíklad B. kos© v B. N· Fields, D, M. Knipe a s pol· Virology” 2v3Q (Raven Prees, 199^)· tóezi viry neétovio o br© t lovca. (; ;hpr do poxvir idi?e jlci rody, z nichž néktoré zvláštni príklady (uvedené v závorkách) jsou zde diskutovaný i Orthopoxvirus (vakcinie), Avipoxvirus (vírus, drdbežíoh neštovic), Qepripoxvlru© (neštovioe ovoí), Leporipoxvirug (firbom králikd (Shope), myxom) ® Suiooxvirus (neštovice preset). En t omopoxvii* idi s e zahrmxji tri rody: A, B s C.
Podie jednoho aspektu tohoto vynálezu ae získává zpú©ob prípravy modifikovaného ôuknryotického cytoplafímatického DNA-vlru pŕíi^ým moleMílárnim klonováuim modifikovaného genomu c.-topl?.smotického ϊ^Ά—viru. Tento zpdxob zahrnuje stupeň xaod Lfikováni za oxtracalularních podminek vyčistené DNA molekuly obsahující první gonom cytopleametiekého DNA—viru· Pripraví ee tak modifikovaná. molekula DNA, ktorá obsahuje génom ©ytopl^srnatichého JNa-vítu·
Vyčišténá .DO molekula vhod nív pro a <d í. j'ike i podie tohoto vynálezu se pripravuje, napríklad isoloci génom©vé
DNA z částeček víru podie štandardních zpdsobú isolace geno— mové DNA 2 cy topia snového .
zde dále uvedený príklad 1. Nékteré nebo všechny ty to vyčistené DNA molekuly se mohou pripravoval molekulárním klenováním nebo chemickou syntézou·
Modifikovaní vyčištšné DNA molekuly, která obsahuje vírový génom podie tchoto vynálezu, zahrnuje provedení jakékoliv dédičné zmeny v DNA sekvenci tohoto genomu. Mezi takové zmeny patrí, napríklad, vložení DNA sekvonce do tohoto genom, delece DNA z tohoto genomu nebo substítuce DNA v tomto genomu j inou DNA sekvenci. leto DNA sekvence, která je vložená, vy na oháňa nebo substituován», se skládá z jednoho DNA páru nuklootldň nebo více než jednoho 1MA páru nukleotldú.
Podie tohoto aspektu vynálezu ae stupeň mcrôifikování DNA molekuly, která obsahuje první génom DNAviru, provadí jakoukoliv technikou, která je vhodná pro extracelulárnl modifikovaní sekvenoe DNA molekuly. Napríklad modlíikovánl DNA molekuly podlo tohoto vynálezu zahrnuje modlíikováni vyčistené DNA molekuly fyzikálním mutagenm, jako je napríklad ultrafialové svštlo, nebo chemickým rautagenem. V oblasti genetického inženýrství jsou dobre známy čotné metódy extracelulární mutagenese vyčistených DNA molekúl,
Podie j iného uspoŕádání stupeň modifikování DNA molekuly zahrnuje spojení segmentu DNA za vzniku modifikované DNA molekuly, která obsahuje modifikovaný vírový génom· Podie jednoho aspektu tohoto vynálezu ne které nebo všechny DNA segmenty napojené spolu za vzniku modifikované DNA molekuly e® produkujl štšpenlm DNA molekuly obsahující první vírový génom nukleasou, s výhodou nukloasou špecifickou pro sekvenci. Nekteré nebo všeohny DNA segmenty napojené spolu za vzniku modifikované DNA molekuly se produkuj! také chemickou syntézou dobre známymi spáooby.
V né ktorých uspoŕádáních stupeň spojování DNA eegmen-^tá za vzniku modifikované DNA molekuly obsahuje extracelulání
stupeň ligace takových DNA segmentá mezi sobou pomoci liga— sy, jako je napríklad ba&riální nebo nckteriofágová ligase, podie obecné známych metód rekombinaoe DNA. Tento stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje také zreagování kone ň DNA sogmentCL, které byly vyštépeny z DNA molekuly obsahuj!* cí první génom víru, fosfataBOU, napríklad telecí strevní fosfátesou« Tento enzým odstraňuje fosfátové zbytky a zabraňuje Vedy opätovnému navázán! (religaci) DNA segmentu, získaného štepením DNA molekuly, s j iným takovým segmentom·
V alternatívni^ prístupu spojovaní DNA segmentu se nekteré nebo všechny DNA segmenty spojí extraoelulárním anelovánim kohesivních koncu, které jsou dostatočné dlouhé, aby waožuily transfekci modifikované DNA molekuly do hostitelské bunky, kde dochází k ligaci apelovaných DNA segmentu,
V jiném uspoŕádáni tohoto zpdsobu stupeň SKxäfíkován! DNA molekuly obsahují c í génom prvního víru zahrnuje stupeň spojení alespoň nékolíka DNA segmantá, které se získaj! Stúpením genomové DNA molekuly prvního víru s dalälm DNA segmentom· Získá se tak modifikovaná DNA molekula· Ve výhodné® uspoŕádáni tohoto ^pektu podie tohoto vynálezu tento stupeň obsahuje štepení genomové vírové DNA molekuly ©ndonukleasou špecifickou pro sekvenci v Jedinečném mlate Stúpení genomu prvního viru· Pískaj! se tak dvé DNA raménka genomové vírové DNA. Tato dvé raménka se pak spojí (ligují) s cizí DNA, která obsahuje sekvenoi, o ktorou se jedná. DNA sekvence, o ktorou se jedná, jak je zde popsána sekvence cizího DNA segmentu, ktorá se liguje a raménky vírové DNA,
DNA sekvence, o ktorou se jedná, obsahuje sekvenci eeatáva-
rá se nevyskytuje pŕírozené v takovém genomii,, a dále, sek* venoe, o ktorou se Jedná, mážo obeahovat pouze aekvence,
, kde ta ková sekvenc e je vložená do mista v gsi takové/cytoplasmové DKa-viru, ktoré se liš! od mista, v ··’.-ΖγΓλ. \ Ά: ’ v·’:'/» δ'·' .A A'·.
némž se tato sekvene© pžirozené nacházl.
.·J .
Anavíc* ínseroe prirazené se vyskytujíaí vírové sekvence* o ktorou se jedná* z jedné DNA víru do j iné nebo z jedná části jéďJbphň Vírového genco&i do j iné části tohoto genomu* nutné ^tyoM áel&venci, ktorá s© nevyskytuje prirozené v ge^jomacytopísemové^^ DNA.-víru podl© tohoto vynálezu pri napojení vírového genosu a inserovsné vírové sekvence, o kterou se jedná*
Tento cizí DNA segment, ktorý se liguje se dvema raménky genomové vírové DM* obsahuje konce, které jsou síu* čitelné pro ligaqi & konci ramének vírové DNA· Témito slwSiteInými konci nohou být doplnkové kohesitní kone© nebo ssrovnené 'konce·* Stupeň ligaee tohoto spúšobu pos^tuje modifikovanou DNA molekulu, které obsahuje -geniáš p^vního viru ste eekvejwi slzí DNA vložené do genoma víru v jedinečná® místo Štépeni*
Toto uspoMďání, .pH nč®ä ee Wi sokvenoe vkládá do genoau prvního víru, je Me ilustrovárw bíibo j iné, zpúsobu vložoní kazoty esprese genu ^ygen^m víru vakclnle v jedinečné® ©isté štčpeníbakteriálMéndonuklea' souNotl nebo Smal,. jak je topopeánovpHkledul* respek- tivo v príkladu $, Toto wpofádání je príkladom vložení kazety génu do gehoM rekomblnantního vek' toru. viru drábežích . neštovic v jedinečné®, ÄW|Sí?épeni Notl v sekvoíiai bakteriálního genu genomreko^inifintni- .... ho víru drôbežích neôtoVia, jak j© .to: popsáno v pMkledu 2*
Vložení (inserce) eisí w do jedinečného mlsta vganoau ©ytoplsemové DNA (mksryotického víru pcúletähbto vyn&* leeujo užitočné proexprooi šádauéhoprofeijau#svláété ' · ··'*' * . “ ..,·'··’ ’’ · '” - J-x. *.· ŕ-'”:·, lid^kého proteinu.NapMklad plíklcd^popieujelnserci genhpro plnsminogen, protrombin e glykoprotein 160 víru lidské Imunitní nedostatočnosti XHiy;;g^^ý^'^edineÔnte : aistfľétépenl vektoru ví^-'vakúá^ie' a'ja^ii^'^^le^nýoh- ’ ;. aWdifikovanýchvird 'yatóíniej/pro ·;ρΗρΓζνη Whtpproteind* .?^^^Í^;.jH?ot®Íny ^tu«* · rách''tyj&í iid- -.
Xŕ./í ·Χ’7%ν'. u·%-·..' *··>£--· -%.·'..-.:- ^. · <; -y .- r-,..-;;...-,. .. >=. '-.·ζ:·--:·<;· '··· :’-·^Ζ^'/^··. ώ f·: -G.·--: λ ;- '.
..Α··Ά·· -- V ·?. ŕ’ ..‘4·.ύτ· . 5--^--- . ‘’ťtj^jSv^íí ’»,-· ·.<. ·..
i29 dnou, která obsahuje modifikovaný vír podie tohoto vynálezu.
V nekterých uspoŕádáníeh stupeň modifitováaí vírového genomu insercí DNA sekvenc© obsahuje zavedení nebo odstránení funtoe ganu markeru pro rozlíšení modifikovaného vírového genomu od prvního vírového genomu. Podie jednoho tatového uspoŕádání DNA sekvenc© vložená do prvního vírového genomu obsahuje gen selektlvního martoru e stupeň isolaae jjnfekčních modifikovaných virioná víru neštovio produkovaných první hostitclstou bunkou obsahuje stupeň inľektování druhé hostite Iské bunky t&nito infekcními viriony za podmínek, kdy dochází k seletoi genomu víru neštovic, ktorý ©xpresí poskytuje gen selektivního martoru® Ve výhodném uspoŕádáni tohoto prístupu podie tohoto vynálezu exprese génu selektívniho markeru v druhé hostitelské bunoe udšlujs druhé hostitelské buňce ιό s iste no i os cytotoxictou látku* Tato látka je prítomna bohém infoktováni druhé hostitelské bunky v hladinách, které jaou dostatočné pro seletoi genomu víru noštovic, ktorý expresí poskytuje gen selektivaUao martoru. V tomto pŕípedé tato látka vyber© (selektuje) modifikovaný vírový génom, ktorý má vložeu gen selektívneho maxkeru, ale nitoliv génom, ktorému chybí tento gen markeru.
Inserce DIU sekvenc© obsahujloí gen selektivniho martoru pro rozlíšení modifikovaného vírového genomu od prvni— ho vírového genomu je zvláštč užitočná, jeatliže g©nosová DNA molekula prvního víru j® rozštepená v jedinečnéa míst-š štepení a tedy výsledná raménks vírové MA se prevdupodol>né neliguji (znovu neváži) bez vložení 1MA zekvence, ktorá je žádána. lento prístup je ukásán na príkladu spôsobu vložení génu pro enzým xanthin-guauin-f osf oribosyl-trcuef©rasu Escž&lchia coli (dálo zde označovaný gpt gen) dot mimo j iné, genomu víru vatoínie nebo genomu víru dr&bežích neštovic v jadinečnéra místč štčpení Notl, jak. je to popsáno v pŕíklsdech 1, respektíve 2.
Zpúsob odstraňováaí funto© génu martoru z prvního vírového genomu pro rozlíšení modifikovaného vírového génom od prvního genomu je uveden v príkladu 2. ‘ento
I.
•V ‘1· · 4. .‘c.3Ô zpúsob s© týká inserce cizí DNA sekveuce do genomu viru drú— bežlch neštovio v místš Nôti v E. c pil Isoží génu kxjdujícím β-galaktosidasu. Jak j© to popsáno v príkladu 2 (neštovice ptákú), inserce DNA sekvence do tohoto.místa prerušuje lacZ kodující ssženci a zabraňuje tedy produkci 0-galaktosidasy. Exprese tohoto enzýmu poskytuje fenotypmodrý plak pro vír nesoucí lacZ gen. Kodifikovaný vírový génom, který' nose v tomto mlate inserci DNA sekvence, vykazuje fenotyp bilého plaku. Timto zpúsobem se odlíši modifikovaný vír od prvního viru, V jiném uspoŕádání zpúsobú podie tohoto vynálezu se funkční E.coli lacZ gen pŕenese do vektoru s jiným génom, o který se jedná. Slouží pak jako marker modifikovaných virú, které obsahuj! žádaný ínsert.
V ješté j iných usporádánioh podie tohoto vy nálezu stupeň modifíkování DNA molekuly obsahuje zavedení nového mletá štépení nBdonukleosou špecifickou pro sekvenci do prvního vírového genomu. Jeden príklad tohoto usporádáni obsahuje vložení oizl dna obaahujlcl syntetický DNA llnker* do exietujicího jedinečného mletá v prvnlm genomu viru neštovic, jak je to popsáno v príkladu 6« Tento 1 in ker obsahuje násobné klonovaoí místo, obsahující nekolík uist štepení úzce pfilehlých, která jsou užitečná pro vložení cizí DNA do modifikovaného genomu viru neštovic. Msta štepení v násobném klonovscím mleté s výhodou nejsou prítomna v prv* nim virovém genomu a tedy Jsou jedinečnými v modifikovaná vírové© génom.
Podrobné j i - stupeň modifikování DNA molekuly obsahujíci první vírový génom zahrnuje také vložení DNA sekverwemozi první a druhé místo štepení nuklecoou špecifickou pro sekvenci. Podie Jednoho takového usporádání první vírový génom obsahuje násobné klonovací místo obsahujíci misia š tepe nx, která jsou jedinečná v prvnlm virovém genomu. Podie tohoto zpúsobu štépenl DNA molekuly, která obsahuje .pivní 'vírový génom ve dvou takových jedinečných místech v njásobném klonowcim mlsté, poskytuje dve raménka vírové DNA, která máji kohesivnl konce, které nejsou slučitelné s ligací navzájem mezi sebou* DNA segment mezi témito dvema
- 31 · jedinečnými nísty štépení v náaobném klonovacím míste ©e odstráni od rozštčpených ramének vírové DNA, napríklad vysrážonÍEi téchto ramének ethanolem, jak je to popsáno pri inserci génu, lidského protrombinu do modifikovaného vektoru viru neétovio v príkladu 5·
Vložení DNA segmentu do vírového gencmu mezi dve jedinečná mista stopení je užitočné pro násilné klonování DNA insertd, které máji kohesivní konce elučitelné s liga C í s každým ,raménkem vektoru. J inými slovy, tento zpúsob» obsahující štepení vírové DNA ve dvou místech, je užiteČný pro zvýšení výtéžku vírových genomú* které pocházejí od liga c o ramének vírové DNA, ve srovnánl s rsménky pripravenými štšpením vírové DNA v jediném mlstš, pretože rsménks podie tohoto zpúacbu nemaj! hrnce elučitelné s ligací. Tento násilný zpúsob klonování také rídl orientaoi DNA vložené do modifikovaného vírového genomu, protožé pemze jedno raménko vírové W» je slučitelné s ligecí s každým s koncu, vložené DNA·
Zpúsob násilného klonování podie tohoto vynálezu je ukázán napríklad vložením kazety exprese génu obsahující gen lidského protrombinu do násobného klonovacího mlsts vektoru viru vakoínie, jak je to popeáno v príkladu 5.
Ve výhodném uspofádání DNA segment mesi dvéne jedinečnými místy štepení v prvnlm virovém genomu neai podstatný pro replikaci prvního vírového génom a tedy tni delece této sekvence ani její náhrada jlným DNA segmentem nezabráni replikaci výsledného modifikovaného genornu. Tento DNA segment Ize také nahradit DNA segmentem obsshujicím takovou část tcto sekvence, která je podstatná pro vírovou replikacl, svázanou s další DNA s okvetie í, která s e má vlož i t do prvního vírového genomu·
Podie j iného aspektu tohoto zpásobu. stupeň modif ikovánl prvního vírového genomu obsahuje aliminaci nežádoucího místa Štépení endonukleasou špecifickou pro sekvenci. Kodifikace tohoto typu ee mohou provádet opakované, jestliäe je to nutné* napríklad pro vynechání prebytočných mlst štšpenl nekterými nukleasami, činu so ziská modifikovaný vírový génom, ktorý ná Jedinečné místo štepení pro príslušnou nukleasu.
Zpôsoby, které jsou zvláštč· vhodné pro odstránení mís t štépenl z vírového génom, jsou dobre známy odbor nikam. Patrí mezi né rúzné spôsoby obvykle mís tne rízené mutegenese. Jedním zq zpôsobu odstránení mlsta štepení endonukleesou z vírového genomu, je extracelulární zpracování genomové Vírové DNA, aby se tak vybraly mutanty genoiaových DNA molekúl, které jsou resistentní na Štepení príslušnou endonukleasou.
Jiným zpusobem odstránení mlsta štépení z vírového génom je ligace rozštépené vírové DNA molekuly s DNA segmentom, napríklad syntetickým DNA segmentom, který obsahuje koneo slučitelný e liga cí s rozštepenou viAou DNA, ale ktorému chybí část rozpoznávací sekvence pro nukleasu, ktorá Štepí tuto vírovou DNA. Podie tohoto zpôsobu místo štépaní eadonukleasou špecifickou pro sekvcmei, která štepí vírovou DNA, obsahuje rozpoznávací sekvenei pro nukleasu, která se nechásl mimo sekvence obklopující kohsnivnl kanec v sekvencích bezprostredne pfiléhajiclch ke kohôsivnlm koncôrn. Tento syntetický linker obsahuje kohe— eivní konce slučitelné s lige c i e raménky vrrové DNA rozštšpené v jediném mleté. Avšak tato sekvence bezprostredné pfiléhajícl k jednomu kohesivnímu konci syntetického insertu ee líši od rozpoznávací sekvence, která Je požadovane pro štépení enzymem, který štépi vírovou DNA. Ligace tohoto konce syntetického DNA segmentu s vírovým raménkam tedy nevytvárl znovu funkční mlsto pro stopení nukleasou, která štepí vírovou DNA. Príklad tohoto spôsobu odstraňování mlsta štepení z vírového gonomu je uveden v príkladu 4, kdy ee syntetický DNA fragment obsahu j lei násobné klonovací místo vloží do jedinečného mlsta štepení virovco genomu.
Aby se zabránilo deaktívocl vírového genoau jako dôsledku modifikaoe, je zrejmé, že modlíikace vírového genomu podie tohoto vynálezu se musí provádet v tekové oblasti vírového
·.... ·. <.*>., · ’ . . .----3-.
w
-í , ··.
ŕ ’ ?
·'<:'· ·,..·Ύ''·· .. - F:1.’··;;£. .*·>···;
·-·· ..... -- »4>·
BSŕfkW .....pro níltipllkstri -víru v bupxo anožbni výslednéζ \χΐ> j* ’ ho mdlflfeôveného vlrn* itenl genómoVé ôplhsit im-vira oh·· pro nultíplikaoi Iff¥. Wf podie ť'/A·':/·;
\,--tág \·4 •Λ'
S^aá;v podie ' tohoto apdeobu, patrí sekveooe aesl gény ^.intergeno.^SÄ^I'^zObíastlí-Ä-^éiveópeí^náríite^hejapu-potfebné pro· ^í.·./'··;··· ·/£.·;·.... ,-..-- 5 r -, ž; ;?λ£.£;·\'···;.< :. ľ, · '' $á52 P y. .-r- .75 > >··’5· '.-/ ·'' ífW^: WdÍ£lkw$Jd vy braného ©ýtoplassatiokéhó PIlÄ-viru . podie pripraví aéjiaáa·’- Μϊών^ wdifilcace · irit©a> Wý|iáai^GÍ. ipfekčních §||f|f f|feíizw toato e980·“
J||g^|gg|ÄÍgg|^^ DNA a ©na- l||||jlg®||^:^^ ®s&y :'riw1i£&£&2&«^ «X.'VSwwÄ'fcA
ÍHí pfttiBýa ». ^WWÄS^ÄÄh^whi«>ÍÄŠŕíÄwS?®él· koástiúlsBl genomi bbtliiÄ®SSSSBOSV .>.;-·. - .f ,·1“»«.:Α.έ} Γ·. .· -S *-* ,'·.’ . V4.'Tsr\~rAv-’’5'ľfli? ·>?···;- 4· f .·' //;////'.. ';//// //'./· λ·< í f í&afe. ^Μ^^ο^“ϊ5·5?5*:<;ίχ«ΐΐ^® «..: . . * ·.. ·, :,„ y·::; / . · .. ;
Byly popsáay á isté nepodstatné genonové oblastí víru vynálezu.
eW-®^áíS^fW^^^Ä#ÄÄ^;'4W «^»·
-•t.; ^.v.>;tu .·· · r w.;-··.?·-*·.1 -: .'^v-’.-v; · -•.f.* .^^tí·.:.·.^·.'·· 'ý; V . # · ·,'·;-- .;···. i:
0^¾¾¾^¾¾¾^¾^¾^¾¾^.......
ÍSäÄO^žä^^BÄÍfiBW®®®ÄeštťRS tó'· .'i
J4
DNA sokvenee, která je vložená do prvniho vírového genomu, pod transkripční kontrolkou promotoru. V nôkterých uepoŕádánúoh je tento promotor umístán v DKA sekvenol, ktorá je vložená do prvního vírového genomu a tedy kontroluje trans— krúpei této čisti vložené DNA eekvonee po srižru vlákna od promotoru. Príklade© tohoto postupu je inseroe gonovó kazety obsahujúci promotor funkčné uevázaný ne. otevŕenou čtecí oblaet do génom víru neátovic, jak je to popsáno v pí'íkledeoh 1 e ž 5·
V j iné® výhodné© usporádání je promotor kontrolujúci transkripei DNA aekvexice, která j© vložená do prvního vírového genamu, umístén v modifikované© vírové® genoiau proti saôru vlékna vložené DNA nekvonca. Tento prístup je ilustrován inserci o DNA kódujúci protein lidského von Willebrandova faktoru do násobného klonovacúho miste, které je funkčné navázáno ne promotor proti smčru vlákno vo vektoru viru vakcinie, jak je to popsáno v príkladu 6.
V nčkterých uspoŕádánÍGh je promotor kontrolu j í e í vloženou DNA sekveuaí roseznáván ESA polyxaeraaou kódovanou modifikovaným vírovým gwnomeci. 'Tento promotor môže být rozeznáván pouze SNA polymeraeau kodovanou, jiným genomem, napríklad jiným vírovým genomem nebo bunečným genomem, Tom, to SNa polynierasou môže být napríklad polymrasa T7 bakteriofágu, která je kodována j iný© genomem cytóplasmové DNA-vira nebo genomam modifikované hostitelnké bunky· Poly mera sa T7 a promotor byly použitý napríklad u rekoiabinantních virô neštovic pro zvýšení exprese vložené DNA sekvenoe· Víz napríklad íUerst T· K. a spol.s J· Mol* Biol· 2Q5, 333 až 346 (1939). T? SNA polymerasa na oddelené© génom, se používá pro zabránení exprese DNA sekvénoe vložené do modifikovaného genomu viru neátovic vyjma toho, kdy je oddéloný génom pž'ítomen·
V ježte jiných uapoíádáních je proaotor kontrolujúci insert vhodný pro iniciaci transkripoe ©KA polymerasou oytoplasha tie kého DNA-vlru. V nékterých uapofádánlch promótor obsahuje modifikaci DNA sekvence prirazené se
- 35 vyskytujícíhc vírového promotoru. Príkladom jednoho tekového uspoŕádání je použití syntetického” promotoru viru vakcínle, jako je napríklad ”SJA” nebo ”S4 promotor popsaný mimo jiné v príkladu 5 a príkladu 6.
Konetrukce genorau eukaryotického oytopiasrnatiekého DNA-viru podie tohoto vynálezu dále zahrnuj® stupeň zavedení modifikované DNA molekuly obsahující modifikovaný vírový génom do první hostitelské bunky» která pakážuje modifikovanou DNA molekulu do virioná modifikovaného eukaryotiekého oy topia sme t íc kého DNA-viru. kodifikovaná DNA molekula se za vede do první hostitelské bunky spôsobe© vhodný® pro tranefektování t é to první hostitelské bunky DNA molekulovou, napr. zpúsoby, které jsou známy odborníkom, trsnsfekca jiných DNA do srovnatelnýoh hostltelských bunšk. Napríklad ve výhodné® uspoŕádání se modifikovaná DNA molekula zavádí do prvni hostitelské bunky technikou srážení fosforečnane® vápenatým podie Grahame e van der Hbe: Virology ^2, ½ až 467 (1973).
V® výhodné® uspoŕádání tohoto z-pdeobu prípravy aiodifikovaného eukaryotiekého oy tepla srna tichého DNA-viru dále obsahuje stupeň infíkování první hostitelské bunky druhým ©y toplasma tie kým DNA-virem. obsahu jíc im génom druhého oytoplaeraatiekého DNA-vlru, který exprezí pa kážu J e modifikovanou DNA molekulu do infelxních virionú, modifikovaného cytoplazmetíckého DNA—víru· Pri zpúsobu, který zahrnuje infikováni první hoetiteleké bunky druhým virem e® zavedení rekamblnsntní DNA molekuly do první hostitelské bunky provádl b výhodou asi jednu hodinu po infíkování hostitelské bunky druhým virem.
V jiném uspoŕádání podie tohoto vynálezu podie tohoto zpásobu se nutné pakážování do první hostitelské bunky provede j iným genetickým prvkom než úplným genomem druhého vi.ru, jako je napríklad plasmid nebo jiný expresní vektor vhodný pro transformování první hostitelské bunky a expresování Žádaných funkoí pomocného viru. Použití nevirového genetického prvku pro dosažení pomocných funkcí umožňuje
-36 prípravu geneticky stabilních pomocných bunék, které neprodukuj í infekční pomocný vir. Použití této pomocné bunky jako první hostitelské bunky pro pakážování modifikované DNA molekuly s výhodou produkuje pouae viriony obsahujici tyto modifikované DíriA molekuly.
Pri zpúsobu, pri nemž dochází k infekci první hostitelaké bUnky druhým virem, ee druhý vír výbere tak, že exprese druhého vírového genornu v první hostitelaké bunoe pa kážu j e modifikovanou DKa molekulu do infekčnich virlonu obsahujících modifikovaný vírový génom. Podie tohoto vynálezu je možné uakutečnit intracelulární pakážovánl modifikované DžíA obeahující génom eukaryotlckého cytoplasmatického lÄiA-viru transíekcí do bunék infikovaných blízae príbuzným vírom. Ne príklad DNA prvnlho víru rodu neštovic se pa kážu j e hosti— telekou bunkou infikovanou druhým virem neätovic atejné podčeledi víru neštovic, až už se' stojného nebo rdzného rodu·
V jietých uspofúdáních exprese druhého vírového genomu v první hoatitelské buňc® poskytuje infekční viriony obes— hujíci druhý vírový génom tst-ejno jako modifikovaný vírový génom, K túto situaci dochází, napríklad v prípade hcmologního pakážování DNA prvniho viru neštovic jednoho rodu druhým vírem s tajného rodu· I když tr^nsfektovaná DNA by se mohla teoreticky pakážovat píímo, t j. bez transkripce transfektoveného genomu, hoinologní pakážování txansfoktované DNA molekuly možná zaberú je trsuskripci a replika c i jak transfektované DNA tak DNA pomocného víru. Tato situtíce ja iluatrována mimo jiné homologním pakážovánim DNA víru ne é to vie v príklade ch 1 a 2.
i
I i
Avšak v jiných uspoŕádáních exprese druhého vírového genoam v první hoatiteleké bunoe neprodukuje infekční videný obcchujici druhý vírový gemom, V prípade heterolognlho pékÁáování, napríklad pasívni pakážovaní samotné nemuže pro— dukovat životaschopné vírové častice z transfektevené DNA. V takovém prípad© je výhodný druhý (pomocný) vír, který
I poskytne nna polymérasu, ktorá rozeznává trsnafektovaňou DNA jcko templát a tedy slouži pro inioiaci transkripoe a ^'•*7 \
* ’ ’ nakonec replika c i -trensfektované DNA. Tento prípad, je príkladom. reaktívnee modifikovaného genomu vektoru viru neátovic (vakcinie) pomoc nýia virem ptačich aeštovic (drúbežíoh neštovis) v savčí první hostitelská bunce, v níž vir ptačich neétovic není schopen produkoval infekční viriony obsahujíoí génom viru ptočích neštovic, jak je to popeáno v príkladu 3.
ŕ· •r:;·’ 't . ..·?
J ·. r « ·.
. <ť.
a \ .
•>L ·' <..V í
A-^ľ
Použití heterologního viru pro pakázování modifikované DNA molekuly, jako je napríklad použití viru neétovic drúbeže nebo víru myších ne š to vie (e ktr omelie) jako pomocného viru pro konstrukci víru vakcinie, s výhodou minimalizuje rekoirbiasčnl udalosti mezi pomocným vírovým genomem a trensfektovsným ge nociam, který je pŕltomen pfi tom, když homologní sekvence blizce príbuzných virú Jsou prítomný v jedné bunce. Víz Fenner a domben (1958) a Fenner (1959)·
V jistých uspoŕádáních spôsobu, kdyáe pomocný vir používá pro DNA pakážováni, stupeň isolování infekčních virion»l obsahojících modifikovaný vírový génom obsahuje stupeň infikovaní druhé hostitalské bunky infekčnámi viriony produkovanými první hostitelskou bunkou· Druhá hostitelská bunka se s výhodou infikuje zs takových podminek, Že expres! druhého vírového genomu v druhé hostitelská bunce e?. nep.rodukují infekční viriony obsahujlcí druhý vírový génom· JÍnýiäi slovy - druhá hostitelská bunka je infikována sa pod· laínek, které selektuj! replíkaci modifikovaného víru, nileoliv pomocného viru. Fi'úkledem tohoto zpúsobu je zpúsob, pH nemž modifikovaný génom znamená modifikovaný génom viru vakcinie, druhý génom znamená génom víru drúbežích neštovic a druhá hostitelská bunke znemená ssvčí bunku. Podie tohoto zpúsobu se modifikovaný vir vyčistí pros plak v kulturách sevčí hostitelské bunky, v nichž vir drúbežích neštoVio neprodukuje infekční viriony, jak Je to popsáno v príkladu. 3.
V jiném uspoíádání, v némž druhá hostitelská bunka se infikuje za podmínek, kdy docházi k selekci modifikovaného a Virui' modifikovaný vírový génom obsahuje funkční gen hosJj^ät^eleké oblasti potrebný pro produkci infekčních vir i onú X
Ž X ·· ·' y//·-·'· ' v drahé hostiteIské buňce. Druhému vírovému genomu ohyb! tento funkční gen hostiteľské oblasti. Toto uspoŕádání je ilustrováno zpusobem, pri nômž modifikovený vírový génom znamená modifikovaný vírový génom vakcíni© obsahujici funkční gen hostitelské oblasti potrebné pro produkci viru vakcinie v lidské (MRG 5) buňce, ktorá se použlvá jako druhá hostitelské bunka, jak je to popsáno v príkladu 8.
V ješté jiném usporádání zahrnújieím selekci modifikovaného víru v druhé hostitelské buňce modifikovaný vírový génom obsahuje gen selektívni!© markeru, ktorému chybí génom druhého víru a stupeň infikování druhé hostitelské bučky se provádí za podal ne k, ze ktorých dcohásl k selekci vírového genomu expresujícího gen selektívni!© markeru. Napríklad exprese génu selektlvního markeru v druhé hostitelské buňce môže této buňce udélit rasistenci na cy t o toxickou láiku. Tato látka se dodá béhem infikování druhé hostitelské bunky v takových hladinách, které postažují pro aelekci vírového genomu expresujícího gen selektívni!© mar— keru· Tento prístup je ukázán ne príkladu, spôsobu vložení génu pro E. coli gpt gon do genomu viru vekeínio, jako napríklad v príkladu 1, nebo genomu viru drubežích neštovic, jako napríklad v príkladu 2j v obou prípadoch se používá pomocný vir, ktorému chybí gen selektlvního markeru*
V ješté jíném usporádání zahrnujícíia seiekci modifikovaného víru v druhé hostitelské buňo© obsahuje modifikovaný vírový gen^deleoi génu selektlvního laarkeru, který j® pŕitomen v druhém virovém genomu. V tomto pMpadŠ se stupeň infikování druhé hostitelské bunky provádí za podmínek, za ktorých dochází k selekci vírového genomu expresujleího gen selektlvního merkeru. Napríklad exprese génu thymidin-kinasy (tk) víru neštovic v druhé hostitelské buňce (tj. hostitelské bunka negatívni na thymidin-kinasu) zpdsobuje, že druhý (pomocný) vir je eensltivnl na metabolický inhibitor, 5-broB-deoxyifldin· Príklad 4 popisuje použití techto inhibitorú báhem infikování druhé hostitelské bunky | dochází tak k selekci vektoru viru vakcínie (vdTK),
- 39 v nomí·; je tk gen deletován a nehrázen násobným klonovaoim místem·
Jiný aspekt tohoto vynálezu se týká ©ukaryotického eytoplasme tie kého DNA—viru obsahuj ic lho modifikovaný vírový génom. Modifikovaný génom cytoplasmatiokého DNA—viru podie tohoto vynálezu obsahuje r&zné sekvence DNA, které jsou od sebe odlišitelné, napríklad rutinní hybrid!zecí nukleovými kyselinami nebo DNA sekvenovánim.
V néktorých uspoŕádáníah modifikovaný vírový génom obsahuje první génom prvního eukaryotlckého cytoplasmatického DNA—víru. Tento pivní génom obsahuje sásto štčpení endonukleasou špecifickou pro sekvenci, které Je jedinečným místem Stúpení v první® genomu. V tomto uspoŕádáni ty sekvence modifikovaného génom, které obsahuj! první vírový génom, jsou homologni s genomem prirozéné se vykutú jiciho eukary^ického cytoplasmstického DNA-Viru. Dále pak jsou sekvence tohoto prvního víru prerušený DNA sekvenci, o ktorom se zde Jedná.
Pro stanovení, jestli tato sekvence je vložená do jedinečného mista štépení v prvnín virovém g^aoinu, jak Je to potrebné pro uspoŕádáni modifikovaného vírového génom, se sekvence, které bezprostredne obklopíjl insert, srovnaji se sekvenoemi mista Stúpení endonukleasou špecifickou pro sekvenci.
V Jedné forme tohoto uspoŕádáni, v nemá DNA sekvence je vložená do jedinečného mista š tú pení prvního vírového génom, je vložená sekvence v prvnim virovém genoxau obklopená dvéma identickými neporušenými mlsty ätépení endonukleasou špecifickou pro sekvenci· Toto dvá míst®. jsou jedinými mletý pro tuto nukleaeu v úplném modif ikovaném génom. Každé z téchto dvou míst obsahuje spojené části rozštépených mist a prvního vírového genoxau a vložené DNA sekvence.
Podrobuj i lze uvést, že každé vlákno dvojvláknové DNA obsahujicí místo étépeni endonukleasou špecifickou pro eekvend môže být povsžováno za vlákno, které obsahuje sekvenci úplného xaista štepení (¾¾) sestávající ze sokvenee levého .místa štepení (8^) a sekvence pravého mís ta Štepení (Sg) oddelených monofosÉátovou väzbou, které je prerušeno štšpením príslušnou nukleaaou· V j istých formách tohoto uspoí-ádáni inserce Τ«4Λ sekvence do jedinečného reetrikČniho misia reprodukuje dve úplná místs obklopujíoí insert.
V j iných, formách tohoto uepoŕádáni však inserce DNA sekvon.ce do jedinečného misia štšponl nevytváíí znovu pôvodní místo štepení na každé® konci vložené DNA sekvence. Viz ne— príklad zpúsob odstrenování místa štepení, který je popsán v príkladu 6« Vložená DNA môže být tedy obklopená na jedno® konci (napríklad na levém konci) úplným míetem štepení (SjSg), zstímeo pravý koneo končí sekvonci, která se líši od príme navázané na Sg sekvenci v první® vírové® génom. Obecné j i - v jakérnkoliv modifikované® vírové® genomu podie tohoto vynálezu bude DNA sekvence vložená do jedinečného misia v první® virovém genomu obklopená dvéma párovými čáetmi (S^ a Sp) xaíst sté pení, která bg nevyskytuj! v modifikované® virovém genomu mimo vloženou DNA.
V j iných uepoŕádáních modifikovaný vírový génom sestáVá z DNA sekvence, která je vložená mezi dvS jedinečná iaísta v první® virovém genomu. V tomto pŕípadé, jestliže první vírový genem znamená prirazené se vykšytujicí génom eukaryotlckého cytoplazmatiekého DHA-viru, insert bude obklopon vírovými sekvencemi oddelenými od cizí DNA zekvence alespoň rozpoznatelnou S·- a Ss časti dvou rôzných pôvodnich mlst štéponi.
V dolšich u«poŕádáních modifikovaný vírový génom obsahuje jedinečné místo ôtépení umísténé v DNA sekvenci, která se nevyskytuje pŕirozane v gonomu eukaryotiokého plaemetického DNA-viru. V tomto prípade tato oizí DNA sekvence neni oddôlena od pŕírodních vírových DNA sekvenci rozpoznáteInou SL ® častí míst štepení. V jistých formách tohoto uspoŕádání je první cizí DNA sekvence prerušená druhou cizl DNA sekvenci vloženou do jedinečného mletá štépenl v první sekvenci mebo laszi dvé ta ková mletá v první sekvenci·
V tiohto uspoi'ádánich je druhá cizi DNA sekvence oddélena od první oizí DNA sekvence rozpoznáte Inou 8- e Sp části mís t štépenl endonukleasou špecifickou pro sekvenci. V tomto pripadá váechny sekvence obklopujioí tuto druhou cizí DNA sekvenci obsahuj! génom prvního viru podie tohoto vynálezu.
7©zi výhodná uspoŕádání modifikovaného eukary etického plastatického DNA—viru podie tohoto vynáé^zu patrí první hlavní uspoŕádáni, v némž modifikovaný vírový génom obsahuje
I) první génom prvního eukary etického plastatického DNA-viru* který obsahuje misto štepení ^donukleasou špecifickou pro sekvenci. Toto misto je jedinečným místem v prvním vi~ rovém gonoiau. Kodifikovaný vírový génom podie tohoto uspoiádánl obsahuje také II) první DNa sekvenci, o ktorou se jedná· Tato DNA sekvenc© je vložená do jedinečného mista v první® génom eukaryetického oytoplasmatického DNA—víru·
V jedná variaci tohoto prvního uspožúdání modifikovaného eukary etického cy topia srna tie kého DNa-vítu první vírový génom obsahujíoí jedinečné misto znamená pŕirozenč ae vyekytujici vírový génom. Tato variace je zde ukázána ne príkladu modifikovaného génom viru neätovio obsahujicího prirazené se vyekytujici génom viru vakcínie* který má jedinečná misto stopení (jedinečná mista štepení) bakteriálními restrikčními endonukleaaaml Nôti a Siual, jak je to popaáno v príkladu 1 a v príkladu 3· V tomto uspoŕádání je príklade® první DNA sekvence* o ktorou se jedná* které je vložená do jedinečného mista* E· poli gpt gen íízený pŕirozané se vyskytujícím proMotorem viru vakcínie vložený do Nôti mista (príklad 1) nebo Smal mista (príklad 3) genomu viru vakcínie.
Ve druhé formé tohoto prvního uspoŕúdení modifikovaného víru první vírový génom obsuhujloi jedinečné isínto obsahuje také druhou DNA sekvenci pŕirozené se nevyskytujlcí ve vírové® genomu. Tato druhá DNA sekvence dáls zahrnuje jedinečné misto pro vložení první DNA sekvonce. Tato ve— risnta je zde ukázána na príkladu modifikovaného génom ,42 víru drúbežích neštovic obsahujícího DNA sekvenci koďující gen Eecherichie opil β—galaktosidasy, jak je to popsáno v px-íkltídu 2. Touto bakteriálni gen zahrnuje míeto štepení bakteriálni reštrikční endonukleasoti Hot I, které je jedinečné v modifikovaném genomu víru drubežích nestovic, a j© tedy zvlášté vhodný pro vložení sekvenci cizích DNA.
V j iné variante tohoto prvního uspoŕádání modifikovaného víru eLes?on čáat první DNA sekvence, která j© vložená do jedinečného mletá štepení, je pod transkripční kontrolou promotoru.V nekterých prípadoch je promotor umistčn v první Ma sekvenci, která je vložená do prvního vírového genomu. K tomu dochází napríklad tôhdy, jestliže vložená DNA obsahuje génovou kazetu včetné promotoru ε funkčné napojeného génu, jak je to popsáno, mimo j iné, v príkladoch 1 a 2.
V druhém uspoŕádáni modifikovaného cytoplasmatického DiU-viru podie tohoto vynálezu modifikovaný vírový génom obsahuje 1) první vírový génom obsehujlcí první a druhé místo štepení endonukleasou špecifickou pro sekvenci, kde každé z téchto míst je jedinečné v prvním virovém genomu.
V jedná výhodné variante tohoto uspoŕádání první vírový génom obsahuje násobné klonovací mís to sestavoné z nékolika jedinečných míst štepení.
V tomto druhém uspoŕádání modifikovaný vírový génom obsahuje také II) první DNA sekvenci pŕirozenš a© nevyskytující v genomu eukaryotického cytoplesmatického DNA-viru. Teta DNA sekvenc© je vložená do prvního vírového genomu mezi první e druhé jedinečné micto štépení.
v
Ve t&tim uspoŕádání modifikovaného cy topia srna tie kého DNA—viru podie tohoto vynálezu modifikovaný vírový génom obsahuje I) první vírový génom obsahujlci první DO sekvenci prirobené s© nevyk^ytující v genomu eukaryotického cytoplasmstického MA-viru. Teto MA sekvence obsahuj© aiísto štepení endonukleasou špecifickou pro sekvenci, které je jedinečným místem v modií ikovaném virovém genomu. kodifikovaný vírový génom podie tohoto uspoŕádání dále obsahuje II) promotor umsténý tak, že -DNA sekvence, vloženú do jedinečného místa, je pod transkripční kontrolou proaotoru. První DNA sekvehce nemá štart kodon translece mezi proaotorem a jedinečným místem použitým pio ineerai DNA sakvence. Fŕíkledani tohoto uepoŕádání je vektor viru vekcíníe (vS4) popsený v príkladu. 6, který má promotor syntetického viru neetovic umístén tak, že tento promotor kontroluje transkripci DNA sekveace vložené do násobného klonovaoího míste určeného pro vložení otevŕených čtecieh oblastí.
Jiný aspekt tohoto vynálezu se týká DNA molekuly obsahu jíc í modifikovaný virový génom modifikovaného oukeryotického oytoplasmatického DNA-viru podie tohoto vynálezu. Ve výhodném usporádáni se tato DNA.molekule pripravuje extrakel genoaových DNA molekúl z vír lonu modifikovaného eukar y etického cytopí®srnatiekého DNA—viru podie tohoto vynálezu nebo z bunôk infikovaných modifikovaným vírom podie tohoto vynálezu. Spúsoby, které jsou vhodné pro éxtrahování modifikovaných vírových genomových DNA s virionu, jsou známy odborníkom· Nevie jsou vhodné zpásoby prípravy DNA euksryotiokých cy topia srna tie kých DNA-virá popsány v príkladu 1 tohoto spisu.
Jeáté jiný aspekt tohoto vynálezu se týká genomových DNA ramének ©úkoryetického cytoplastatického DHA-viru podie tohoto vynálezu. Tato genomová DNA raméaka jsou užitečná pro pŕímé molekulárni klonování vírových genomu. obsahujících ciel DNA. .b'odorbnóji se tento aspekt podlo vynálezu týká dvou DNA molekúl, levého & pravého genomového raaénka modifikovaného vírového genomu eukaryotických cy topia snia tichých DNA-vird. Pri praktické® provádéni shora popsaného pŕímého klonování podie tohoto vynálezu buu jedno nebo obe tato raménka seetúvají zcela z DNA sekvence, která se pŕirozeno vyskytuje v cytoplasmatickém DNA-viru. Ale nová DNA molekula zde popisovaného afektu podie tohoto vynálezu je modifikované rsménko; vírového genomu, j inými slovy je to DNA molekula obsahující jeden konec modifikovaného vírového genomu e uka ry o tichého cytopiasrnatichého DNA—víru. Tento konec modifikovaného vírového genomu. obsahuje DNA sekvenci,
- 44 o kterou sa jedná, ktorá odlišuje tuto DNA molekulu od genômových raméuek sestávajícich pouz© ze sekvenco, ktorá s© píirozené vyskytuje v cytoplasmatickém DNA-viru. Nevie, modifikovaný vírový génom, od neho ž je nové raménko odvozeno, obsahuje jedinečné misto stopení endonukleasou špecifickou pre aekvenci. Dále, toto DNA molekula má konec, ktorý ja homologní s produktom stopení jedinečného míste v modifikované© virovém genomu endonuklessou špecifickou pro sekvenci·
Ve výhodné© uspofádání se tato DNA molekula obsahující genomové raménko pripravuje Štepením ganomové DNA modifikovaného víru v Jedinečné© ©isté endonukleasou špecifickou pro sekvenci. Tato DNA molekule so ©uže pŕipravovst také modifikovaním J iné DiU molekuly. Získá se tak konec, který Je homologní s koncern pripraveným štepením jedinečného místa v modifikované© virovém genoffiu. Napríklad DNA molekula podie tohoto afektu podie tohoto vynálezu se múže pripravít z ramének pŕirozenč se vyskytujíclho vírového raménka, napríklad ligaci se syntetickým adapterem”, DNA segmente© obaahující© kohesivní kanec odvozený od ©iste štepení, které není prítomno v první© virovém genomu. V tomto pŕípadČ konec prvniho vírového genoxau a ligovaný adaprot spoločné obsahuj! jeden konec modifikovaného vírového génom.
Tato príslušná DNA molekula ze nezískává Štepením modifikované vírové genomové DNA, ale obsahuje konec, který je homologní s koncern, který se získává stépením jedinečného mista v modifikované© virovém genoau.
V jinér uspoiádání modifikovaného vírového ŕeménke DNA podie tohoto vynálezu, DNA sekvence novyskytující se pŕirozcné v ganomu eukaryotiokého cytoplasmetichého DNA—víru obsahuje ©isto štepení endonukleasou špecifickou pro sekvenci, které je jedinečné v modifikované© vírové© génom. Toto ©isto štepení dále obsahuje sekvenci levého Metá štepení pro lové genomové raménko nebo sekvenci pravého místa Štepení (¾) pro pravé genomové DNA raménko· Tím se ziská úplná sekvence ©íata ätopení (8^8β), která je jedinečná v Kodifikované© virovém gonoau. Príkladom tohoto usporádúni; jsou mimo jiné DNA raménka pripravená z v© kto r u víru dribesich neštovíc bakteriálni reštrikční endonuklea.sou Notl, jak je to popsáno v príkladu 2 nebo raménka vektoru viru vakcinie (vS4) rozštopeného v kterémkoliv s nékolika jedinečných míst vloženého násobného klonovacího mletá, tak jak je to popsáno v príkladu 6.
Ještš jiný aspekt tohoto vynálezu se týká eeetsvy pro prímé molekulárni klonování modifikovaného vírového génom eukaryotického cytopiasrnatiekého DNA-viru. Tato sestsva obsahuj© I) vyčlštSné DNA molekuly podie tohoto vynálezu, Tyto molekuly obsahuj! bud genomová vírová DNA raménka podie tohoto vynálezu nebo úplný neporušený modifikovaný vírový génom podie tohoto vynálezu nebo obojí. Vírová DNA reménko jsou užitočná pro pHmou ligaci e oizírni DNA segmenty, které so mají klonovať, zatimeo neporušené vírové DNA se používaj! pro klonování po štepení napríklad endonukleseou špecifickou pro sekvenci v místé, které je jedinečné v niodífikovaném virovéra genomu.
Tato sestav® dále obsahuje II) DNA lige&u e III) roztoky pufra nebo jiných reakčních činidel vhodných pro ligeci DNA sGgaentú. Získá se tak modifikovaná DNA molekula obsahující uvedený modifikovaný vírový génom* Vhodný puťr a vhodná reakční činidla pro ligoc! jsou popsána napilklad v pri kladu 1,
V jednom uspofádání tato sestava dále obsahuje plasmid obsahující kazetu exprese «snu obklopenou mletý štepení endonukleesou špecifickou prc^sekvenci. Jestliže se štépl príslušnou endonukleesou špecifickou pro sekvenci místa obklopujlci kazetu, produkuj! se konce, které jsou slučitelné s insereí této kazety jedinečného mista ôtžipenl modifikovaného vírového genomu, který je kodován DNA molekulou.
V jiném usporádání tato klonovncí sestava dále obsahuje první hostitolskou bunku a druhý (pomocný) vír vhodný pro pekáč ovárd modifikovaného vírového genomu do infekční ch virionú.
Ječté J iný aspekt tohoto vynálezu se týká plasmidú* které jsou zvláhtč vhodné jako mezlprodukty pre kons trúfol modifikovaných v® ktorá. cytoplesia? tie kého DNA-viru podie tohoto vynálezu. Podls jednoho U3porádání podie tohoto vynálezu podie tohoto ^>ektu se získává plasmid obsahující DľU segment* který má na koncích stojné nieto štéponí endonukleaeou špecifickou pro sekvenni. Toto mís to je také jedinečným místea v prvnlm genomu cytopiasmatiekého DO-viru podie tohoto vynálezu. Tento DMA segment obsahuje násobné klono’l
Veci místo obsahujíci. nekolik tčsnú pŕllehlých míst štepení ^donukleasou špecifickou pro sekvenci* ktorá. jsou v tomto / plaemidu jedinečná a jsou tedy užitorycá pro lnserci oizích
DNA eegmentú do plaemidu.
Tento plesmid je užitočný pro vložení genú do jedinečného míste Štepení DNA segmentu pro následný prenos tohoto segmentu do Jedinečného mlsta štSpení cytopl«smetiokého DNA-vir? žpáoobem pfímého molekúlárnlho klonování podie tohoto vynálezu. Jako príklad tohoto plesmidu Ize uvéet /plesmid pN2 (víz príklad 1* obrázok 1.3)» který ná DNA seg/ ment obsahujte! násobné klenovácí nieto obklop© no aísty Nôti pbsshující náaledující další míst® étčpení baktoríálnlmi restrikčnÍBii enzymy v uvedené® poradíš Xbal* Spel* BamHI, Smal* Isti, EcoRI* EcoHV* HindlIX a Ciel.
Jiný plasmic. podie tohoto vynálezu obsahuje DNa sogment* který má na koncích místo štepení, které je jedinečný® mletom v cytoplfcSB&tickém TRU viru. DNA segment tohoto plasmidu také obsahuje nekolik mlat etčpenl rostrikčniiai enzymy* která jsou v tomto plcsmidu jedinečná. Tento DNA segment dále obsahuje gen selektivního markeru (napr. E. opil gpt gen) z«< tror^rlpční kontroly promotorem cytopiasma.tichého DNA-viru (napr. promotorem P7.5 viru vakcín!©). Príklady tšchto plaemidá jsou dva plesmidy označené pN2—gpta a TN2-gptb» které obsahuj! DNA segment obklopený mlaty Nôti a obsahující E.ooll gpt gen za tranakriponí kontroly proáotrem viru vakoínie. Tento plesmld :byl vytvoben insereí kazety promotor—gan do mletá Smel plasnidu pN2, jak je to popsáno na obrázku 1.3.
V další modifikeci shora uvedeného plesieidu DNA segment dále obsahuje druhý promotoi víru neštovic oporetivnč napojený ne DNA sekvenci obsahující mís to štepení reštrikční endonukleascu, Príkladem tohoto plasmidu je plasmid pN2gpt-S?A (obrázek 4.7), který lze použiť pro vložení otevŤených čtecích oblasti, jimž chybí jejich vlastní iniciační kodon, pro prenos do vektoru viru vakcínie. Podobné Ize roužít plssaid pN2gpt-S4 (obrázek 4,7) pro .vložení úplných otevfoných čtecích oblasti vcetné štart kodonu AUG-trnnslace.
V jiném usporádání tento plasmid obsahuje DNA sekvenci kodujíci lidský plasminogen, kde DO sekvence je odštépitelné napojene na promotor víru neštovic a štart kodon. Príklade® tohoto plasmidu jo plasmid pN2gpt-GPg, kodujíci lidský glu-plasminogen, a plasmid pN2gpt-ĽPg, kodujíci lys-plasminogen, kde kodujíci oblast pro snlnokysaliny 1 až 77 lidského plasminogenu je vyneohán© (obrázek 5.2 a 5.3).
V príbuzné formé tento plasmid dále obsahuj® DNA sekvenci Íhující vir lidské imunitní nedoststečnosti (HľV) gpl60, kde DNA sekvence je odétépitelné napojene na promotor viru neštovic a štart kodon. Jako príklad lze uvést plasmid pN2gpt-gpi6Q, který má gpl6C gen kontrolovaný syntetickým promotorem viru vakcícle 34 (obrázek 5·'·'·)«
Jíný plasmid pod.1 tohoto vynálezu obsahuje segment genomu cytoplaskatickéhj iMA-vlru, v nemá jc umístén vírový gen thymidin-kinasy (tk). V tomto plasmidu je modifikována (deletována) kodujíci oblast tk génu, sby s® zabránilo expres i aktivního tk-enzymu. Tento plasmid je užitočný jako meziprodukt pri konštruovaní vektoru cytoplasmetiského DNA-viru, který má defektni tk gen využitím konvenční®h znásobil vzniku mrkeru, jak je to popsáno pro tk gen viru vak·· cínie použitím plasmidu pHIndJ-3. V pŕíbuzném usporádání plasmid obsahující modifikovanou oblast tk génu cytoplazmatiekého DNA-vlru, obsahuje násobné klonovncl místo obsehujΙοί nékolik úzee pŕilehlých míst štepení endonukleasou špecifickou pro sekvenai, která je jedinečná v tomto plasmidu, Dále, každé z téchto r^ist je nepíítomno v cytoplesmatíckém.
DNA—viru, do néhož laá být vložená modifikovaná obi©st tk génu. Po inaerci modifikované oblasti tk génu, obsahující tato jedinečná místa, do vírového genomu, jsou tedy tato miňte užitočná pro inaerci oizíoh DNA segmentu do ganomu cytoplasrna tiekého DNA—viru nesouciho modifikovanou ohlast tk génu sspúsobem prímého klonování podie tohoto vynálezu.
Príkladom tohoto plasmidu, který obsahuje oblest modifikovaného tk-genu obsahující násobné klonovací míeto, je plesmid phindJ-5, v némž modifikovaná oblá s t tk génu viru vakcínlo plasmidu pHindJ2 má vloňeno násobné klonovací místo s jedinečnými místy Nôti, Smal, Apsi n Peril0 obklopené místy Sfil (obrázek 4.2). Aby se dále usnadnílo násilné klonováni v® vektoru viru vakcínie, každé 2 techto dvou Sfil míst se upraví tak, aby bylo jedinečné ve vektoru. Provede se to tak, že se využije premenlivá povaha Sfil rozpoznávaní sekvonco, jak je to podrobnéji uvedeno v prí^žLadu 4.
V ježte jlném wspoŕádání plasmid obsahuje místo štepení nukleasou špecifickou pro JWenci, které je jedinečné v genomu tohoto víru. Takové plssmidy jsou zvláete vhodné pro konstrukci kaze t exprese génu pro prenos do vektoru, který má shora uvedené jedinečné místo. Plasmid pAO je príkladom záklačLniho plasmidu, který obsahuje hlavní klonovací místo obsahujicí jedinečná místa hlavního klonovacího míst® vektoru vdTK viru vakcínie (obrázok 4,3). Pro inserci DNA eegmentú, napríklad fragmentu syntetického nebo pŕirodnlho promotoru, byly navrženy príbuzné pla smidy pAl a pA2. Ty t o plasmidy byly zkonstruovány vložením pAO linkeru obsahujlcího druhé násobné klonovací místo enzyrnú, které noštepí pAO, do místa Xhol. Oba plasmidy mají stojnou strukturu až na orientaoi druhého násobného klonovacího místa (obrázek 4.5).
V jeste jiném uspoŕádání plasmid obsahuje promotor víru neštovic odštšpitelne navássný na translačiaí oblá ©t štart kodonu, p x-i čemž po tomto štart kodonu bezprostredne násle— duje druhé místo štepení reštrikční endonukleasou, které je vhodné usporádáno tak, aby umožnilo translaci otevŕené otočí oblasti do druhého rniata štepení podie tohoto vynálezu. Príkladom tohoto plasmidu jsou plosmidy pAl-Sl a pA2-SJ4
- *9 které poskytují silný syntetický promotor 81 viru neštovic včetné tronslečniho štart kodonu, po némž následuje jednoduché ScoRI inisto vhodné pro inserci otevŕených čtecich oblasti, které nemaj! asociovaný štart kodon (obrázek 4.4), ŕlssmidy pAl—32 a p A 2—S2 jsou podobné plasmidu* pAl-Sl a pA2-SI, ale a® ji jiný promotor viru neštovic, S2 (obrázek 4.5).
V podobné® uspoŕádáni shora uvedený plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kodující $Bký protrombin, v nčmž uvedená DNA sekvence je odštépitelné napojená na uvedený promotor viru neštovic a uvedený štart kodon. Pŕíkladem tohoto pleaaldu je plasmid pAlSl-PT (obrázek 5*1), v n&sž je raodifikovsná protroabinová oblast vložená d > jediného EcoRX mista plasmidu pAl-fíl,
Jiný plasmid podie tohoto vynálezu obsahuje modifikovaný ScoRI K fragment DNA viru veke í nie, z néhož je deletován gen KÍL hostitelské oblasti. Pomocný virvdhr, jemu z ohyb! jak gen KÍL tak U?L hostitelské oblasti se skonštruuje z C7L-negativního kmene WB-6/2 ziskáni® mrkeru s modifikovaným EooRI K fragmente®, z nóhož je deJ^ován gen KÍL hostitelské oblasti. Víz obrázek 8.1. Tento modifkovaný EcoKI fragment obsahuje gen selektivniho ma r karu (E. coli gpt gen) pro usna drieni eelekee rekombinantnicth WS-6/2 genocíd obsahujícich modifikovaný EcoRI K fragment použitím intrccelulárního získání marjceru, jak je to popsáno Samem a Dumbellem (1931)· Príklade® plasmidu je plasmid označený pEcoK-dhr (obrázek 3.1).
V daläím stupni se pEcoK-dhr lineerizuje pôsobením Nôti a liguje se s každou P?·5 - gpt gen (o 1100 párech nukleotidú) odvozenou od plasmidu pN2-gpta (príklad 4) štepením púsobenim Nôti. Výsledný plasmid pdhr-gpt (obrázek 3.1) se používá v pokusoch získáyání mar karu pro generaci pomocného viru^zpúsobea získávánl märkeru podie Sama e Duew bella (1931).
Tento vynález je zde dále popsán pomoci následujícíoh ilustrujícich prikladá.
- 50 V aásledujících príkladoch jsou nškteré konstrukce ilustrovaný tabulkami, kde jsou uvedený jej ich vlastnosti· V tšchto tabulkách jsou použivány náeledujíci skratky»
ODS znamená kodujicí sekvence rc znamená neverení komplementárni sekvábe rcCDS znamená reversni komplementárni kodujicí sekvence, arabská čísla udávají polohy nukleotidô
ATG znamená translační štart kodon
OBL ID znamená identifikátor v EMBL DATOaNK
Príklady provedeni vynálezu
Príklad 1
Primé molekulárni klonování cizí DNA obsahuj íc í gen selektivniho markeru (gpt E· celí gen) do jedinečného (Notl) mi s ta štepení v genomu viru neštovic (va^íníe)
Tento príklad demonštruje príme molekulárni klonování kazety exprese génu do genomu víru neštovic podie tohoto vynálezu intracelulárním pakázováním geneticky sestavené DNA viru neštovic. Tento príklad dále ilustruje použití postupu genetické selekce pro účinnou isolaci modifikovaných virô vakcíni© obsahující vložený gen selektlvního markeru· Pokusné výsledky také odhalují, že k rokambinaci doohází často mezi DO, ktorá má být pskážováne, a DNA infikujíciho pomocného víru béhem pekášování, jestliže DNA pomocného viru je homologní s DNA, ktorá má být pakážována·
Podrobnej! uvodeno - první pokus prímého molekúl árního klonování níže sd© popsaný ukazuje, že kazeta génu markeru (gpt-gen) so môže vložít jako Nôti reštrikční fragment do DNA víru vakcínie rozštépené pôsobením NotI, nečeš se pakážuje do savčich bunek infikovaných virem vakcínie· Jeden z dovití zkoux&ených plakô obsahoval vir, který má pfedpovédénou otrukturu jediného insertu gpt-genu s Ha“ orlentscí (víz obrázok 1.11). Štruktúre tohoto klenu (označená vp7) byls stabilní pri repllkaoi ve velkém mčritku v neprítomnosti selekčního činidlo·
V® druhé sérii klonovaclch pokusú mdlo osekávanou štruktúru sedia z dvsnácti skoumanýeh plakú. Tato šerie však obsahovala čtyŕi malé plaky (E1 až E4) pomalú replikujicích virú, i když s výhodou tyto plaky se obvykle nevyberou pro praktické použití podie tohoto vynálezu. Za selektivních podminkh byly získány také rekombinanty e násobnými inserty génu selektivního markeru· Stabilita techto násobných laser-í tú nebyla zkoumáne v neprítomnosti selektivniho činidla, o némž je známo, že stabilizuje Jisté nestabilní štruktúry. Viz Falkner a Mosss J* Virol» 64. 3108 ež 3111 (1990).
Relativnč;/ nízký výtéžek pŕedpovudéných štruktúr uení očekáván na základe známých pŕlmých zpúsobú genetického inženýretví pro místné špecifické štepení a ligaei DNA molekúl. IvŠak príslušná sekvence vybraná pro vložení do tohoto modelového systému, kazetu gpt-genu, obsahovala DNA sekvenci viru vskcínie P?.5 promotoru, která je ho&ologní se dvémp ©ndogenními promotory ve vektoru veke í nie, které ŕídí dva geuy polypeptidu viru vskoínie o 7 >00 párech nukleotidú, umísténé v prevrátených koncových opakovánich genomu vakcínie. Víz Vonka tesá n B., Beroudy B. ki. a Moss B. s G©11 805 až 313 (1931). Tento P?·5 promotor byl použit pro konstrukei rekombinantú viru vakcíni© konvenční intxacelulároí rekombinaoí a lze ho stabilné integrovst do génu thymidinkinasy vakcínie (tísckett a Smith (1936)·)· Príležitostné se však bohém analýz konvenčních rekombinantú objevují submolární množství DNA fragmentu, která mohou pocházet ze sekúnd ár nich rekombinací. JestliŽe se P7.5 promotor vloží blízko endogenních 17· 5 promotorú (tj. v rozmazí nékolika tisíc párú nukleotidú), jsou stabilní pouze ty rekombinanty, které moji pŕevrácenou opakovanou sfcrukturu. Využitím tohoto pozorování byl vyvinut zpúsob deleoe založený na inserci tandemového opakování segmentu P7.5 promotoru (Spehaer D., Drillien R. a Lococq J.-.P, s J. Virol. 64. 52? aá 533 (1990)·)·
V tomto prípadé inserce kazety gpt—génu do místa Nôti viru vakcínle je vzdálenost mezi P7.5 promotory levého pŕevráceného konceového opakování a vložené kazety asi 30 000 párú nukleotidú, oož je pravdepodobne dost blízko na to, aby to spôsobilo destabilizujíoí sekundárni rekombinace. Ve skutočnosti pouze štruktúry nékolika pomelú se replikujících máji insert e ’’b” orientací”, kter.ý by produkoval tandemové opakování uspoŕádání vloženého a endogenního promotoru. Vzácný výskyt téchto atruktur lze tedy nejpravdépodobnéji vysvetlit blízkosti waisténí P?·5 promotorú, kazety kazety gpt-genu a ©ndogenních P7.5 promotord a známou nesta— bil i tu tandémové se opaku jících kopil promotoru P?· 5·
Naopak vir vp? e nékteré dalSí ieoláty (Al, A4, 01 a 02) moly inserty e V orientací a byly stabilní· Štruktúrni analýza jednoho isolátu, 04, odpovídala dvojitému insertu hlava-pats.
Titry pakážovaných na gpt-gen positivních virá v druhé sérii klonovacích pokúsil (pét ráznych vzorká) byly približné 1.10^ plak tvorících jednotek (pfu) ne 3·10θ bunék, zatímco v prvním pokusu byl pro stojný počet bunék získán titr 1 až 2,102 plak tvoŕícich jednotek, Titr modlfikocaných virá bude ovlivnen nékolika faktory. Mezi ty to fakt^py patrí úČinnost ligoce, účinnost pakážování, reakční podmínky, podmínky kultivace pri klonovacím procesu a péče, která je vénována oddélování vektorové DNA o vysoké molekulové hmote behem postupu. Ze stendardnlch podmínek niže zde popssných se obvykle oo«kávají titry asi 10^ jednotek tvoŕicich plak na 8.106 bunék.
I když tento príklad ukazuje, že pro inserci cizí DNA Ize použit jedinečné intergenové místo Nôti víru vekeínie, ilustruje také potrebu uvažování o tom, zda navržený insert máž© obsahov®t vírové sekvence typu a orientace, které jsou známy nebo pravdepodobné zpusobují nestabilitu modifikovaných virá. Inserty, kterým chybí homologie s vírovými sekvencemi blízko míste inserce (napríklad v rozmazí 60 000 párá nukleotidá) by mély být výhodné z dôvodu stability.
Také inserty, které obsahuj! pouze kŕátké sekvence syntetického promotoru, které jsou rozeznávány transfer ipčníia systémom vektoru, jsou výhodné ve srovnání s tämi, které obsahují dlouhé segmenty vírové DNA vôetné pŕirozených promotorá vírového vektoru· Víz napríklad dále uvedený pronotor 81 v príkladu 4.
V tomto a ve tŕech následujících pŕíkladech se používaní následující materiály e zpdsoby, pokud není uvedeno jlnek.
čiétení viru neetovio a DNA: Vír vakcinie (pŕírodniho typu kmene Wh (Nestern Reeerve), Americká sbirka typô kultúr (Američan Type Culture Colloction, ATCG) č· VK 119) se vyčistí pes dva po soba násladující saeharosové grsdienty podie ľ^cketta a e pol. v D. fô. Gloverss ”DNa Gloning. A Preotical Approach., str. 191 až 211 (IRL Press, 1985). Vírová DNA se pripraví postupe® s proteinasou K-SDS podie Gross-Bellarde e spol.s Eur. <J. Biochem. 36« 32 až 23 (1973).
Sentavení isolované DNA viru neátovic. Vírová DNA (typicky 2 až 5 raikrogramô) se rozÉtépí príslušnými množetvimi jedné nebo vice endonukleas špecifických pro sekvenci (napríklad bakteriálni reštrikční endonukleasou Nôti), poprípade ee nechá zreagovať s telecí stravní a&liokou fosfatssou (Boehringer, Inc.) e vyčistí extrakci fenolem a vyerdžaním ethenolea podie rutinnich zpusobd rekombinace DNA. Výsledná vírová DNA raménka se ligují s péti- až padesátinásobkem molárního nadbytku DNA fragmentu, Irterý má být vložen, s konci, které jsou elučitelné s ligací s vírovými raménky. část této ligační reakce se analyzuje gelovou elektroforesou s inversi pole.
Podrobnej i - v druhé sérii pokúsil (A aá E) níže popsané se 2 ^ug DNA vakcinie, která nebyls nechána reagovať s f osia tasou, rozštépené pôsobením Nôti, ligují se 200 až 600 ng lasertu kazety gpt-genu v objemu 30 yUl 8 5 až 15 jednotkami T4 ligasy čtyŕicet osm hodín pri teplotč 12 °C, jak je to souhrnné uvedeno v trbulce I.
* 6
In vivo pakážování v eavčích bunkách s 3. .0 bunék africké zelené opice (C.¥-l) se infikuje pomocným virem (buä vakcinie WE prírodního typu nebo virem ®E 6/2 nebo j inými víry, jak je to uvedeno) v množstvi 0,2 plak tvofícioh jednotek ns bunku dve hodiny. Po úvodním prílkazu pakážování neporušenou DNA isolovaňou z virionô se použije 20 yUg vírové (vPgD) WA, Pro pakážování extracelulárnč sestavených genomu ee použije 1 mikrogram DNA vyčištáné z ligačni reakoe· D;;a se transfektují do bunék arážeoí technikou fosforečnane® vápenatým (Graham F. L. a van der Eb: 1975·)· Tyto bunky se inkubují patnáot minút ze teploty místnosti· Potom se k bunkám pridá 9 ml média (DMEM, 10 % toleciho plodového séra, glutamín a antibiotika) na 1 ml sxaženiny. Po čtyrech hodinách se médium vyméní a v inkubaoi ee pokračuje dalši dva dny.
Násobní surový vir se pripraví podie standardních postupu (Hackett a spol. x 1985)· Testování plaku a výbér pôdni nek pro E. coli gpt gen jsou známy odborní&ha (víz t Falkner a MossiJ· Virol. 62, 1349 až 1854 (1938) a Boyle a Coupar* Gene 65, 125 až 128 (1933)·
Gelová elektrof or esa s inversním polem (FIGE) s Vírová
DNA se delí na 1% agarosovém gélu v pufru ľris/octen/EDTA (40mM iris/20mk ledová kyselina octová/2m&i EDTA, pH 8,0) s dodávkou proudu regulovanou mikropočítačom (Oonsort íáodel
E79O). Pro rozdelení celé oblasti fragmentô tyly postupné programy ^sobem, který je zde nyní uvedeiH^5 hodin pri 7V/cm puls vpred (F) 6 vteŕin, zpétný pule (R) 3 vteŕiny, prestávka 1 vteŕinaj program 2i hodin pri TV/cxu puls F 4 vteŕiny, R 2 vtefiny, prestávka vteŕinu; program 3» 5 hodín pri 7V/om, F 2 vteŕiny, R vteŕinu, prestávka 1 vteŕinu a program 4 s 5 až 10 hodin pri TV/om, F 3 vteŕln, R 4 vteŕiny a prestávka 1 vteŕinu.
Konstrukce plasmidu pN2x Plasmid Bluscript II SK (Strata gene, Inc.) se rozštépí pôsobením HindlII s liguje se s Notl linkery (Pharmacia, Inc·)· Výsledný plasmid, pN2, má násobné klonovací místo obklopeno misty Nôti.
Podrobne-j i - násobné klooovací místo pN2 soetává z následujícíeh mís t v uvdeném poradí t Nôti, Xbel, Spel, BaraíII, Smel, PstI, EcoRI, Eco.RV, HindlII, Dial a Kotl.
- 55 Vložená sekven.ce Nôti linkeru pN2 s dvacet baží 5*- © 3obklopuj íc í ch oblastí pBlusoriptu II SK (Strategene, Inc·, La Jolla* USA) jsou uvedený v sekvenci číslo 1· Sekvenc© iasertu zaδiná v polozo 21 e končí v poloze 23 (První zbytek T na j’-konai odpovídá poloze číslo 2266* poslední zbytek G” na 3 '-konci odvpovidá poloze číslo 2J13 pla smidu pN2.).
Konstrukce plasmidú pN2-gpt© a pN2-gptb: HpeX-Dral fragment o 1100 páreoh nukleotidú (obsahujíci P? .í? promotor-gpt génovou kazetu) se isoluje s plasmidú pTKgpt—Fla (Felkner a Kosa s 1938·) a vloží sa do mista Smal plasmidú pN2 (obrázek 1.3). Dva výsledné plasmidy jsou orientficními isomery. Označí se pN2-gpta a pK2-gptb. Kazeta P? .3 promotor viru vakcínie - E.coli gpt-gen a dvacet baží 5*- a 3'-obklopujících oblastí plasmidú pN2 jsou pro pN2-gpta uvedený v sekvenci číslo 2· Xnsert zač iná v poloe 21 a končí v poloze 1113· A-zbytek tranalačního iniciačního kodonú gpt-genu odpovídá poloze 519« T-sbytk translacního stop kodonú gpt-genu odpovídá poloze Číslo 975 (První G zbytek na 5'-konei odpovídá poloze číslo 2227* poslední HT” zbytek na 3'-konci odpovídá poloze číslo 3359 plasmidú pN2-gpta.).
Reversní doplnková forma kazety Ρ?·5 promotor viru vakcínie - E.coli gpt gen © 20 nukleotidú 5*- e 3'-obklopujlcích oblastí pN2 jsou pro pN2-gptb uvedený v sekvenci číslo J· Ineert za č iná v poloze 21 a končí v poloze 1113· T-zbytek (reveraní doplnčk) tr&nalačního iniciačního kodonú GAT odpovídá poloze 615. A-zbytek (reversní doplnčk) translačního stop kodonú gpt génu odpovídá poloze číslo 159«
J iné štandardní techniky rekombinantní ffiíA analýzy (Southernúv blot* PAGE* zárezová transleoe* aapriklad) se provádejí zpúsobem podie literatúry (J· Sambrook a spol. t ’Koleculsr Cloning”* Cold flpring Harbor La bor©tory Preša 1939·).
Pakážování nahé vírové DNA í Pro stanovení podmínek potrebných pro pakážování DNA nahých vitú, neštovic pomocným virem s© neporušená DHA isolovená z vírionú rekombinantu víru vakcínie (vPgD) trensfektuje do opičích bunék (CV-1) infikovaných pomocným vírení (vakcínie O pžírodnlho typu)· Vybraný r©kombinéntní vír má nékolík snadno testovátelných fenotypových markerô. Ctenom v ?gD tody inkorporuje do mista vírová thymidin-kinasy (tk) gen markeru resistenee na látku (gen enzýmu xa nthin-guanin-f osf or i bosý 1- transfere sa Esche— richia coli, t j. gpt gen) e gen proteinu vhodné detegovateIného markôru (lidský plasminogen). Tento vír byl pôvodné zkonstruován z kmene víru vakcíni© LWR 6/21 Moss a spol· s J. Virol. 40. 337 ež 395 (1960), který má <&eci asi 9000 párá nukleotidô a tedy expres! neposkytuje gen vírového hlfívního sekrotovaného 352 proteinu, popsený Kbtwalem a spol·s Satur® 335· 176 až 173 (1938)·)· Očekávaný fenotyp pskážovaného víru je ted-yi tfe-negativní (t j. replika c e v prítomností bromdeoxyuridinu), gpt-positivní (1$. replikace v prítomnosti mykofonolové kyseliny a xanthinu), expres! poskytuje gen lidského plasminogenu a expres! neposkytuje Bskretovsný 35K protein.
Bylo analyzováno osia gpt-pošitívních plakô z© shora uvedeného pokusu pskážování· Vše<
negatívni a jak uka .©uje obrázok 1.1, všechny expres! poskytovely plasminogen· S© s t g tčchto isolátô (pásy 5» 6, 7, U, 12 a 14) expres! neposkytovaly 35 K sekrétov©ný protein vakcínie a tedy vykázo valy všechny vlastnosti transfektované genomové DNA. Dve z téohto plskd expresí poskytuj! také marka? 352 proteinu (pásy 4 a 13), jde tedy o rekombinanty pomocného pŕirodního víru (Pásy 3 a 15) e vklad vírových genomú.
Tento pokus ukázal, že MA nahého víru neetovio extrahovaná z virionô se pakážuje, jestliže je trensfektována do bunék infikovaných pomocným v Ír ©m za testovaných podminek. Tyto podmínky byly proto použitý pro transfekce genomové MA víru neštovio, která byla modifikována prímým molekulárnim klonovánim, jak ukazuje obrázok 1.2«
Pakážovánl extraeelulárné sestavené DNA víru neštoviot Gemom víru vakcínie obsahuje jedine nieto štepení endonukle' * . A,'; - ·' - ·>' * ' '-'.Á‘--J yž/ *j ·' ,;'1' ^-7;’X * 57 * sou Nôti špecifickou pro sekvenci v oblasti známé jako Hindlll F fragment. Zkoumání sekvence kolem tohoto mlate (Goebel a spol*: 1990·) odhalilo, že Je umisténa v intergenové oblasti, u níž je nepravdepodobné, že by by la podstatná pro vírovou \ replikaci. Skonštruuje se ks sete exprese génu merkoru ve dvou plfísraidJii (pN2-gpts e pN2-gptb| obrázek 1.3) inšereí £· poli gpt génu do obou možných orientaci. Cien gpt so kontroluje promotorem génu viru vakcinie kóduj í c la protein o molekulové hmoté 7 500» jak popisuje dochran sspol. s J. Vlrol. 54. 30 až 37 (1985) (labelovaný PI n® obrázku 1.2 a P7.5 ne o^bázku 1.3). Kazeta génu celého markeru je umístena ne jediném Nôti fragmentu o 1100 pároch nukleotidôtčchto plasmidä. Tento reštrikční fragment z pN2-gpt® se liguje s WR DNA pfirodnlho typu rozštépené pôsobením Nôti a txansfektuje se do bunék, které byly infikovény pomocným virem (WR).
V prvním pokusu klonování se provede analýze Southernovým blotem genomových struktur plakô fenotypové gpt-positivnich progenu. Virové isoláty se trikrát prečistí pros plak a emplifikujl se zs gpt-selelsoe. DNA fragmenty rozštčpené pôsobením HindlII bunék (CV-JL) infikovaných rôznymi viry se rozdčlí na 1a egsrosovém gélu kombiné c í normálni elektroforesy a gelové elektroforesy s inversním polom. Ciel se pak blotuje a hybridlzuje P-znaôenou DNA vakcinie íVR a značenou sondou obsahujíci gpt sekvence. Výsledky potvrdily, že všechny klony fonotypioky positivnl na marker obsahovely gpt insert o 1100 párech nukleotidô.
Obrázok 1.4 ukazuje bloty HindXlI DNA fr&^aentú. z bunék infikovaných dovi ti vírovými isoláty (sloupce 4 až 12), plaky 2.1.1 až 7.1.1 a 10.11 až 12.1.1. Byl pozorován očakávaný HindUI fragment o 800 pároch nukleotidô, ktorý obsahuje gpt-sekvenoe. V pásoch 2 ® 3» kde byle nenesená DNA viru pŕírodního typu rozštepená pôsobením HindlII, ne byle viditôlná žádná skrížená hybridizaoe s vírovými sekvencemi.
V ďalším pokusu byly celkové DNA z kutlury bunék GV—1 rozštépeny pôsobením Notl (kultura bunék CV-1 byle infikována dovití rôznymi pleky). Southsrnúv biet rozdé/oných fragmentu je uveden n® obrázku 1.5. Néočekávanč byly ve vetšli Š vírových isolátil viditelné dva pásy, pfedpovčdéný insert o HOO párech nukleotidú. a druhý * velký fragment. Jenom plak c. 7.1.1 (pás 8) vykazoval očakávaný jediný pás o 1100 párech nukleotidú. I když hybridizační signál vétšího fragmentu je stejné silný ve všech zkoumaných DNA, intenslta pásu o 1100 párech nukleotidú ae menila od DNA k DNA. To ukazuje na možnost, že insert o 1100 párech nukleotidú múže být v r&zaýah genomech pfítomen v rúzných molárnlch ©nožstvích. Kontrola víru pŕirodního typu (eloupec 2) se nehybriäzovala sondou gpUgcnu.
Stejný blot se hybridizujo sondou DNA vi.ru vakcinie. Očekává se vznik tfí fragmentú o velikosti asi 145 000» 45 000 s 1 100 páril nukleotidú. Bylo však zjišténo, že vedie osekávaných fragmentú byl identifikován také fragment b asi 5000 párech nukleotidú. Jenom plak, který ja označen 7.1.1, neposkytl tento^očekávaný fragment o asi 5000 párech nukleOtidú.
Orientace DNA ineertu ve vybraných sestaveoých genomech vakcinie byle zkoumána také Southernovým blotovánim. Jak je ukásáno na obrázku 1.2, insert ve vírových WIA sáže Mt bua ”®** nebo *bw or leniac i, které jsou odlišltelné žtépením DNA príslušnými restrikčnlM ensymy. Podie predbežných analýz se zdálo, že isolát 7.1.1, který ty označen jako kloň vp7, má ganomovou etrukturu očakávaného modifikovaného viru. Byl tedy rosmnožen a vyčištšn. I®A tohoto klenu by la srovnána s DNA víru prírodního typu štepením nekolika restrikčníaí ©nzymy a rozdélením na agaresovém gélu golovou elektroforesou s inversnim polom (obrázek 1.6). V Moli sítépu vp7 obarvenám ethidiurnb^Mdem (sloupec 2) pouze fragmenty o 145 000 párech nukleotidú a 45 000 páreoh nuklectidá obsshovaly dostatočné množstvi DNA tak, aby byly vlditelné. Plás, který byl vyhodnocen jako insert o 1100 párech nukleotidú, obsahoval pouze asi 3 ng ONA. Hybridlzací gpt-spacifíckou sondou byl však sjičtén slabý pás o 1100 párech nukleotidá (obrázek 1.7, aioupec 2).
-59V© štšpech získaných pôsobení© HindXXI byly pozorovány očakávané pásy o 1400 pároch nukleotldô a 300 párech nuldbotidú, Jak bylo pŕedpovôdéno, pás o 300 párech nukleotldô ee hybridizuje sondou gpt—génu (obrázek 1.6 a 1.7, eloupeo 4)· Pri dvojnásobné© štčpení pôsobenia Nôti a HindlII byl pozorován očakávaný pás o 300 párech nukleotldô (obrázek 1.6 a obrázek 1,7 9 sloupec 6)·
Ve štepoch vp7 DNA pôsobenia PstI byl pozorován osekávaný fragjaent o 4100 párech nukleotldô. obsahuJící gpt sekvence (obrázek 1.6 e 1.7* sloupec 3| pás obarvený ©thidium— bromide© o 4100 párech nukleotldô na obrázku 1.6 je ve skutočnosti dublet fiagmentú o 4100 párech nukleotidech, z nichí jeden obsahuje gpt insert). Po štepení pôsobením jak PstI tak Nôti sa kazeta gpt génu uvolní jako fragment o 1100 párech nukleotldô (obrázek 1.6 a 1.7, sloupec 10).
Obrázky štépú, které se získají pôsobení© techto a ďalších restrikčnich endonukleas, včetnč Sali (obrázek 1.6 a obrázek 1.7, sloupce 12), jsou v souladu s interpretácii o Vp7 je stabilné modifikovaný vír, který má gpt-gen integrovaný do Nôti ©istá génom viru vakcínie v a orientaci (vis obrázek 1.11).
Druhé šerie klonovacich pokus ô byly provádčny za xníxnč modifikovaných podmínek (viz tabulka I e shora uvedené spôsoby). Bylo provedeno pčt rôzných ligačních reakcí (A až S) obnahujících konštantní množství DNA vektoru vakcínie rozštépené pôsobením Nôti e zvyšujíci se množství vložené DNA. Pakážování bylo provedeno za stsndardních podaínek v bunkách CV-1 infikovaných víre© vakcínie. Titry virú vakcínie poeitilíoh na gpt byly ve všech prípadoch l.lOplak tvorícich Jednotek na 3«10b bunčk. Populace plaku ve všsch pokusoch klonováni byla heterologní, pokud jde o velikosts esi polovina ©šla normálni velikost, zatímco druhá polovina ©cla menši než normálni velikost.
Tabulka I
Vliv pomeru insertu k vektorové DNA ne výtežek modifikovaných virá
pokus: A B C D B
vektorová IMA rozätépená púso-
beniia Nôti (yug) 2 2 2 2 2
insert gpt-genu ( /Ug) o, 2 0Jf2 0,¾ 0,4 o,á
molární nadbytok insertu 17 17 54 34 51
T4 ligasa (jednotek) 5 15 5 15 15
gpt-positivnich virú
(105 pfu/3.106 bunek) 1, 12 0,96 1,16
0,8Q 0,96
Bylo isolováno dvanáet plakú pošitíválch na gpt, po štyroch v každé se tri sérii označených A, G a E, které obsahovaly osia plakú o normálni velikosti (velké) (A1 až A4 a G1 až 04) a čtyŕi malé plaky (EX až E4)s> Každý z techto plskÚ byle analyzován inflkovánim bunék CV-1 v gpt-selete* tivalia médiu, ieolovánlm celkyeh bunečných DNA a jej ich rozštépenim rastrikônlmi endonukleassml, oddelením fragmentú FIGE a blotovánim ne nitrocelulosovó membráne.
Na obrázku 1.3 jsou vzorky SNA rozštepené púsobenim Nôti hybrldizované sondou DNA viru vakcinie (A1 až 4, sloupce 1 až 4t Cl až 04, slaupce 5 gž 8 e E1 sž E4, ©loupce 9 až 12). Vzhledem k pŕedávkování gélu jsou tyto j?ásy ponékud rozmazané, ale jejich rysy jsou zŕetelnč viditolné. Hlavni signál poskytuje pásy o 145 000 párech nukleotidú a 45 000 párech nukleotidú. V néktorých téchto vzorcich lze vidét slabý pás neznámého púvodu o asi 5000 párech nukleotidú. Pás o 1100 párech nukleotidú, obsehujici kazetu P7.5 promotor-gpt-gen, tvorí pouze 0,6 % vírového genomu a obsahuje pouze 300 párú nukleotidú hybridísujíci sekvence (tj· Ρ7·5 pramotor). 0 tomto pásu nelze očakáva t, že poskytne detegovntelný hybridizační signál za použitých podialnek. Pri deläí axposici biotu, jestliže jsou včtší pásy značne pŕeexponovány, pásy o 1100 párech nukleotidú se stály viditelné.
- 61 Pokud jd© o fenotyp malých, plakú, malé plaky El, EJ a E4 poskytovaly pouze slabé hybridizační signály (obrázek
1.3, sloupce 9 až 12)« To ukazuje, že vír se v tčchto placích nereplikoval tak intensivnč, jako je roplikován v pleci© h o normálni velikosti (sloupoe 1 až 3). Isolát E2 neprodukoval detegovatelné množstvi DNA (sloupec 10).
Vzorky, které jsou uvedený na obrázku 1*3, byly ábridifcovány také sondou gpt-genu (obrázek 1*9). Očekávaný jeden hybridizační signál byl získán s gteky Al, A4, 01, Q2, 04, EJ e E4 (obrázek 1«9, sloupce 1, 4, 5, 6, 3, 11 a 12), Plsk A2 (sloupec 2) mšl gpt-gon integrovaný do pásu o 43 000 pároch nuklectidú (Slabý pás o 14J 000 pároch nukleotidú múže pocházet od znečistení druhým ídLnoritniia druhom nebo od sekundárních rekombinaci·). Plek AJ (sloupec J) má sekvonco gpt-genu integrovány do pású o 143 000 pároch nukleotidú a 43 000 pároch nukleotidu, zatímeo plek 03 (sloupec 7) má integrovány ty to sekvence do pásu o 143 000 pároch nukleotidú e do mlate Nôti. Plaky A2, AJ a GJ jsou Možná ty rekombinanty, které vznikly nelegitímni intrscelulácní rekombinaoí homologníoh eekvencí prítomných v insertu kazety modelového génu a v pŕovráconých opakováních vírové IBA.
Pokud jde o sondu DNA viru vakcínie, malé plaky E1 až E4 poskytovaly pouze slabší hybridizační sigisály (obrázok 1.9, sloupce 9 až 12), což znamená, že vír v teohto placích ne nereplikoval tak intensivne, jako se replikuje v placích o normálni velikosti. DNA viru pŕirodnlho typu a DNA neinfikovaných OV-1 bunšk se nohybridizo^yly sondou gpt-genu (obrázek 1,9· sloupce 1J a 15)·
Or leniace a počet kopil inšertú gpt-genu se stanovuj! štepenie vzorkú uvedených na obrázku 1.9 pôsobením Pstl e Southernovou blotovou analýzou· Očakávané velikosti nových Pstl fragment ô, pocháze jících od inserce gpt-genu, jsou uvedená na obrázku 1.11. Hybridizaoe sondou gpt-genu odhalila, že sestava plakú Al, A4, Cl a 02 (obrázek 1*10, sloupoe 1, 4,5 a 6) obsahuje jediný Pstl fragment o 4100 pároch nukleotidd, jak bylo očekáváno pro jeden insort v e” oriontací (obrázok 1.11). U pláka E1 byl slabý hybridizační signál
·, x v . '< ·*£<: i-·· ' ·· : . ·. ·7νΓ.> ; ., ·< ·-
od pásu o 21 ooo párech nukleotidú, který byl pozorován pouze pil dlouhýoh exposicioh blotú, v souhlasu e ”b” Orientací insortu gpt·» génu.
Štruktúry vírových DNA z p la kú. 04 e EJ (obrázok 1.10, sloupce 8 a 11) byly v souhlssu s dvojitou tandemovou insercí v **b orientaci. V tomto prepadá byly očekávány hybridizujíci fragmenty o 21 000 a 1 100 párech nukleotidu (obrázok 1.11). Štruktúra viru v plaku E4, který obsahuje dva fragmenty o 4 100 a 1 100 párech nukleotidú, je v sou— hlasu e tandemovou insercí dvou gpt-genii v wa” orientaci. DNA z p la kú AŽ, AJ a OJ vykazovala složitéjžisestavu, eož ukazuje na inserce do násobných mist, které nebyly dále analyzovány.
Souhrnnô lze rici, že v druhém klonovacím pokusu pčt z ôsmi plakú o n^omální velikosti mélo genoiaové štruktúry, které byly očekávány pro laserci jediné kazety gpt-genu do jedinečného míste Nôti genomu víru vakolnie» Pomalej! rostoucí plaky o malé velikosti vykazovaly nestabilní štruktúry, které byly ztraceny béhem následujíoích stupnú čištšní preš plaky.
Pfíklsd 2
Pi’ímé molekulárni klonování génu selektlvního markeru (£· coli gpt) do jedinečného místa štepení (Nôti) modifikovaného genomu víru ptačích neštovic (kloň f-TK2a viru drúbežích neštovic)
Tento príklad ilustruje obecnou použitelnost pPímého molekulárního klonování modifikovaných genomú. aytopiastatických DNA-virú tím, že ilustruje aplikaci na modifikované genomy vlrú ptačích neštovic, které jsou geneticky nestavený in vitro a pakážovány in vivo. Viry ptačích neštovic mají ncjvétší genoiay z čeledi neštovic. Génom viru drábežích neštovic (FPV) má velikost ssi 300 000 párú nukleotidú a proto FPV rekombinanty, které expresí poskytuj! cizí gény, jsou skonštruovaný pauze technikami ziskáváni merkeru
Obi 'V'^iľ.Jív/í·
'. ·» · ί' ή'
Iviz napríklads Boyle (1938), Taylor a spol. s Veccine 2« W? až 5θ5 (1938).1.
I * a Qoupar: Vírus H®s
120. 343 až 356
ς..ώ· As·’ λ
Tento príklad ilustruje prípravu modifikovaných virô . drôbežlch neetovic pŕimým molekulárnim klonováním kazety ';..' exprese génu sestávájici z promotoru viru neštovic, který λ ý''eméruje JS. coli gpt gen do jedinečného misťa Nôti v genomu rekombta^ viru drúbožlch neétovic, f-TK2a. Toto Nôti mlsto je umísténo v locZ génu, který byl již dŕíve vložen rakcmbinantu intracelulámi rekombinsci. Sestave<:>' ...... ·*.'·:
pakážuj© v primárnioh fibroblasteeh kufeclho zárodku infikovaných HP2 pomocným viren drôbežlch neštovio, . .>.^tí0ý;/se replikuje pomalej! než rekombinant f-TK2a. Selekce 7Í.ľ-^^äôitlvnich plakô vede k isolaci sestavenýoh virú drôv((^éilch>neétovíc· Jelikož gen laoZ merkeru je desaktívován ylM^ci do mlsta Nôti, proganový vír je odliSitelný od veJ&torovéhoviru, jemuž chybí insert, bezbarvým fenotypom jZ ;·’ - n .·.. · ¥«·<. .'· ' ·.:
J^íjSlSténi víru drôbežích nastovic s DNA t čistení ee proS^Mti?ná01édujlcím spôsobom. Vír drôbežlch neStovic (FPV) •*s i.; * Xj ' „•..i-tÄ > · .£*»* ľ'V *
* <J^· * S<ľ *
ä .4
-.^¾. .
** modrých plakô na expres! lacZ génu.
S’.t :: ·
----- - __________-_____ - — -- ·- ^I^^Jmlslédujlcím spôsobom. Vír drúbežích neStovic (FPV) (Kayr a Maličkí i Zentralblatt f· Veterinarmedisin, až 12 (1966),) a atenuovaný kmeň BP1<441 --δίβίο 441 HP1) byly sískány od A. Maýrg (Mníchov)· B^S^gitóíiéžlch neétovic kmeň HP2 byl odvosen od HP1.441 C-άί'áií^béi^li p$es plek. Primárni fi^boblasty kuŕeclho zárodku ô^^&(gli^Kbyly pripravený podie spôsobu, který je popsán v evť^-#'M|^lpateniOTé pŕihlááoe č. 0 333 807, Bunky byly kult!’*UÔfcÄÍrô v médiu 199 pro tkánovou kulturu (TGM199» Gibco
MoplnŠném 5 % plodového teleclho séra, glutimínem e
Vírus drôbežleh nežtovic byl vyčíštén dvéma šacha r osovými geadienty podie Joklika W. K.:
až 13 (1962). Vírová DNA by la pripravene s proteinaaou K/SDS pódle Grose-Bellerda a spol.í -^.?:A^l^rWÍJBioeheBi« >, 32 až 38 (1975).
-'.'Λ \ - <s^. g .·
- '^é*·J·''.f’·/·- .
vektoru viru drôbežlch neštovic (f-TK2a) s- T ’íť ^^é^JÔéSným. (Nôti) mistom št&penl ve vloženém DNA segmentu t
K,:· ;.. ·.
.' ŕ. ..
- 64 Do intergenové oblasti mezi tk-gen a 3*-orf viru dr&bežích neštovic se vloží tk-gen viru vekcíni© spolu s E.coli lacZ génom. Plasiaidy p'ÍLm-VVtlB e pTKE-Wtkb byly zkonstruovány klonovánim funknčího tk-g©nu viru veke í nie do meziproduktového plasmidu pTKm-sPll. Po intracelulární rekombinaci pTKm-VVtka e pTKm-VVtkb s DNA Viru drúbežich neštovic pfírodního typu se vytvoŕily dve nové FPV vektory nazvané f-TK2a a f-TK2b. Každý vektor obsahuje dva funkční tk-geny, endogénni FFV gen a vložený tk-gen viru vatasínie* Vedie vloženého lacZ génu kterýkoliv z nich rnážo být použit Jako nepodstatné mís to pro vložení cizí DNA. Msto Nôti v lacZ génu je jedinečným místem štepení ve vektoroch f-TKäs a f-TK2b a je tedy výhodné pro pŕlmé molekulárni klonování cizí DNA do tš^cto vektord. Všechny podrobnosti konstrukc© vektorá drdbežích neštovic, f-TK2e a f-TK2bw jsou popsány v USA patentové pŕihlášce nazvané MRekombinsintni vír dráhe ži ch neštovic” (Scheiflinger a spol.), v níž jsou uvedený priority ekvivalentní s Evropskou patentovou prihláškou podanou současné 8 touto prihláškou. Celý obsah táto pri* hlášky je zde zahrnút jako citace.
In vivo pakážovánl v ptačích bunkách: 8.10^ bunék GEF se infikuje 0,2 plak tvoŕicich jednctek/buňku pomocného viru (HP2) dvo hodiny. Po£ .pakážováni sestavených FPV geno— má se použije 1 mikrogrem vyčisteného ligačního reakčního produktu, Bunky se trensfektují DNA technikou erdžaním fosforečnanom vápenatým (Graham a van der Eb: 1973·) s inkubují se patnáct minút za teploty mistnosti. Osm mililitru média (TCML99, 10 % plodového teleaiho aera0 glutsmin a antibiotika) na 1 ml sraženiy^ ee pridá k bunkám. Po čtyŕech hodinách se nedium vymení a dále se inkubuje dve dny. Zásoby surového viru se pripraví podie etandardnioh postupu (Mačkett a spol. t 1935·)· Analýza plakal a gpt-selekce se provádéjí podie zpilsobu, který popsal Scheiflinger a spol.: 1991.
Pfimé molekulárni klonování do jedinečného mista štepení Nôti genomu viru drúbeáích neštovic: Rekombisntní PPV kmeň f—TK2e (Scheiflinger a spol.: 1991.) á® vhodný jako
-65 vektor pro prím© klonovánl kazety génu, napr· modelové kazety gpt génu jak zde popsáno, do jedinečného mís ta štepení Nôti. Toto Nôti mi sto vektoru je kódu jí c i oblast lacZ génu, který slouži jako barevný marker pro testování (vyhledáváni), který je desaktivován po vložení génu* LecZ-positivnl víry tedy tvorí modré plaky v prítomnosti chroa^enního substrátu (X-gal), zatímeo víry s inserty v tomto NotX místŠ vykazuj! fenotyp bílých plakô. Génom vektoru Í-TK2® zahrnuje gen thymidin-kinasy (tk) víru vakcínie, který slouži také jako alternatívni oblast pro inseroi génu. Jak laaZ gen tak tk gen byl vložen do genomu víru drQ.bežich neätovic v intorgenervé oblasti mezi gen thymldin-kinasy víru drubežíoh neštovio a 3*-otevrenou čtecí obdbst konvenčními spôsoby (Sohelflinger a spol*: 1991).
Sestavy DNA rozštépené pôsobením Nôti byly získány pro gonomové DNA FPV virá HP1.441 © vekt^ového kmene f—TK2a (obrazek 2.1). HP1.441 byl odvozen od virulentního PPV kmeň© atenuaoí seriálovým pasážováním ve fibroblestech kuŕeoího zárodku· HP1.441 znamená 441. pasáž HP1« Používá se jako vakcínový kmeň proti vira dräbežích neštovie (Mayr & Maličkí, 1966.)· Dobre se adaptuje pro rýchlou replika©! v bunečné kul tufe·
DNA z HP1.441 se analyzuje jako reference pro FPV vektorový kmeň f—TK2a, který je derivátem HP1.4-41. Reštrikční analýza DNA HP1.441 (obrázek 2.1, sloupca 1 a 2) ukázala, že tento kmeň nemá žádná Notl mís ta· Stčpeni vektorové f-TK2a DNA pôsobením Nôti vede ke dvčma valivým fragmentôm o asi 10O 000 pároch nukleotidá a 200 000 párech nukleotidá (obrázok 2.1, aloupec 4).
Primá molekulárni konstrukce víru drábežích nestovic, který expres! poskytuje igpt-gent Modelová kazeta exprese génu obsahu jí c í E. poli gpt gen byla zkonstruována v plasmidu pNS-gpts, který obsahuje gpt gen ŕízený íiasnýsi/pozdním promotorem víru neštovic obklopeným mlaty Nôti (obrázek 1.3)·
Pro klonování do vektoru f-TK2a se kazeta gpt-genu vystrihne z jeho plasmidu a liguje so s geuowou DNA z f-TK2a
. rozštšpenou pôsobením KotI, jak je to nastínčnc na obrázka
do bunšk CEP, ktoré jsou infikovány virem drubežích neštovic· Pluky, které jsou poši ti vní na gpt e které zústávsjl bílé po prevrstvení vrstvou / obsahující X-gal, se dále analyzuj í Southemovým blotováním z po infíkování fibroblastú kuŕecího zárodku· Isóluje se celková bunéčná DKA a oddšlené Nôti fragmenty se podrobí Southernovu blotování ^P-znaňsnýai DNA pomoa^ného viru drúbežích neštovic (HP2) a sekvenci gpt génu, jak je to popsáno v príkladu 1« Gpt—-£>ositivní víry obsahující gpt gen v v Nôti frsftntu o 1100 párech nukleotidú ukazuj!^ že ve stupni klonování došlo ke správné ligaci·
Príprava modifikovaných virú a obémn orientecemi vzorkú v jednom konetrukčním stupni: Tento príklad ilustruje také to, jak mohou být isolovány víry s jednou kopil vložené kazety génu v kterékoliv oriente©i a rovnéž i víry obsahující více kópií vloženého génu z jediného stupnš pŕímého mole ká lárnlho klonování· Orientaoe DNA insertľu ve vybraných genomech geneticky seataveného víru drúbežích neštovic se stanoví Southernovým blotováním DNA rozštépenýeh príslušnými restrikcnízai enzymy· Jak ukazuje obrázek 2*2, môže mít DNA vložená do vírové DNA buú en nebo b oráentaci· Pri predbežné analýze počtu inšertú a orientace modelovou kazetou génu sa celková DNA bunek infikovaných vybranými plnky rozstšpí reštrikční®! endonukloaeami vial a Nôti a rozdelí se na 0,3^ agarosovém gélu, Blot se hybridizuje sondou gpt génu a sondou viru drúbežích neštovic· V DNA vzorci ch rekombínantních virú, které se roštépí pôsobením Notl, se gpt kazeta vystrihne jako fragment c 1100 párech nukleotidú· Stôpení DI?A, které máji insert s a- nebo b-orlentaci, pôsobením Clal také vede k rozdílným charakteristickým fragmentom hybridizujícím se sondou gpt génu, jak to bylo stanoveno ze struktur uvedených na obrázku 2·2·
Príklad 3
Heterologní pakážování geneticky sestavených genomových DNA viru neštovic (vakcínie) pomocným virem ptečich neštovic
-. 67 (drúbežích neštovic) a následná selekce rekombinantú. v hosti— telskýeh bunkách druhú, v nichž se pomocný vírus nemúže replikovat.
Hoterologní pakážovóní DNA víru neÉtovío, napríklad I&ážovéni DNA viru neštovic virem ptačíoh neštovic, neby1o dosud popa áno. Tento príklad však ukazuje, že in vivo pakážování extracelulárne sestavené DNA viru vakoínie lze docílit virem drúbežích neštovic ve fi^Joblastech kuŕecího zárodku· Použití vektorového viru* který má jinou hostitolskou oblaat než pomocný vír, poskytuje jednoduchý a účinný postup čištení sesteveného viru v jednomstupni analýzy pŕes plak. V tomto príkladu se tedy rekombinantni virus neätovic isoluje analýzou pros plak na savčich (CV-1) bunkách* které plné nepodporuj! replikaci pomocného viru ptačích neätovic. Zahrnutí doiainentního selektivního markeru do DNa vložené do vektoru s výhodou usnadnuje použití selektivnich podmínek analýzy preš plak pro eliminaci viru obsahujícich vektorovou DNA, které chybí žádaný insert·
J inou výhodou prístupu heterologního p<ikážování je sníž@ná mošnost rekombinace vektoru s pomocnými víry· Napríklad víry neštovic a ptačích neätovic patrí k rúzným rodúm* máji rúzné morfológie* rúznč snadné možnosti replika o e a sdíleji pouze minimálni homologii sokvencí, jak na to ukazuje chabej í cí skrížená hybridizac© za štandardní ch hybridizačních podmínek· Homologní rekombinaoe genomú virú ptačioh neštovic a neštovic (vakoínie) je tedy nepravdepodobná. Použití tšchto dvou virú môže prakticky odstranit nežádouci rekombinace* ke ktorým často docházi mezi homologními seke^noemi blízce príbuzných virú ÍFenner a Combeni Virology £* 530 až 548 (1958), Fennert Virology 8« 499 až 507 (1959)«J· Alternatívni® prístupom preventivního zabránení rekombinací vektoru s pomocným vírom b&hem pakážování je použivání rekombinací deficitních vírových kmeňu nebo hostitelských bunék.
V tomto príkladu modelová kazeta exprese obsahující gen merkaru (E. coli gpt gen ŕízený promotorem viru neätovic) by la vložená extracelulárne do jedinečného Smel rníste DNA víru veke í nie. Použití tohoto res.trikčního enzýmu
- „68 pro štepení vírové DNA poskytuje zarovnané konce, které mohou být ligovány s inserty DNA se zarovnanými konei pripravenými jakoukoliv jinou nukleasou, která produkuje zarovnané konce na bo napríklad použitím polymerasy nebo exonukleasy se vytvorí zarovnané konce z insertu, který má jednovláknové konce·
Pro ptkážování se geneticky nestavená genomová DNA transfektúje do hostitelských bunôk infikovaných virem drúbežích neštovic, v nichž mohou replikovat jak viry vakcínie tak víry drúbežíoh neštovicífibroblasty kuŕecíhu zárodku). Jelikož hostitalské rozmezí pomocného viru drúbežíoh neštovic je omezeno na ptačí bunky, klony viru vakcínie se vyberou vyčištšním progénu z transfektovaných bunôk ne savši hoetitelské bunky (bunky CV-1 ledvin africké zelené opice) čistením pŕes plak. Pro ísolaci pouze modifikovaných virú vakcínie se pouáijí simultánni selekse na expresi gpt génu. Na rozdll od konvenčního zpúsobu získávání rekombinantú víru neštovic, kde do jednoho intracolulárního genetického skrížení Ize obvykle vložít pouze jednu kopil cizího génu v jediné orientaci, v tomto príkladu byly jako produkty jediné extracelulárnl genomové Kodifikační reakoe identífikovány obe možné orientace jediného insertu stejnš jako dvojí inaeroe modelové kazety génu,
Experimentálni výsledky v tomto príkladu ukazuj!, že účinnost pakážování ligováných DNA viru vakcínie pomocným virem drúbežích neštovic byla velmi nízká ve srovnání s pakážovánlm neporušené DNA víru vakcínie virem drúbežích nešX ii, tovic, které poskytuje výtéžek v rozmezi J.lCr až 1,10 plak tvoŕiclch jednotek ne 6«10ô fibroblastú kuŕeoího zárodku po tŕech dneoh replikaoe. V jednom pokusu pakážování (produkujíaím plaky označené ”FL2 šerie* víz výäe) byl vý2 težek pakážovaných modifikovaných virú 9,10 plak tvoŕícich jednotek a v druhé® pokusu (produkujícim plaky Fl?” šerie) 5.1O2 plak tvoŕiclch jednotek na 6·10θ kuŕecíoh bunék. Jedni dôvodení tohoto relatívne níakého pakážování v tšehto pokuseoh je chybejici defosforylační zpracování vektorových DNA ramének* která proto byla schopná se nepešné religovat bez jakékoliv inserce. Toto spracovaní bylo vynecháno, protože defosforylace DNA fragmente se zarovnanými konci je obvykle neúčinná. Tento problém lze prekoná t koastrukcú tskových kmenä virú. hosti tele, které mají násobná místa štčpenú s pfečniva júcimi konci, která umožňují pŕímé (“násilné1*) klonovánú. Tím se znečnč zlepší účinnosť vkládání cizúch DNA fragmentú.
Jiným faktorom, který ovlivnuje účinnosť pakážování, je interference mezi pomocným a pakážovacím virem na bunečné úrovni. Za štandardní ch podmíaek pakážování behem tri dnu, inkubece pomocné/viru (viru drúbežích neštovic) obvykle repliku jí na titry asi 1.10a p la k tvorí c ich jednote k na
6.10 fibroblostú. kuŕecího zárodku. Velký nndbytek viru drúbežích neštovic ve srovnáni s pakážovaným virem vakcinie vytváfí podmínky, které poskytují negatívni interferenční jevy a inhibuje replika c i pakážoveného viru.
Tato interference je minima! izována tím, že se použiji pro pakážování savčí bunky v kombinaci s pomocným virem drúbežích neštovic, jak je to popsáno v príkladu 7. V tomto pŕípadč hosti telské bunky nepodporujú plné replikaci pomocného viru drúbežích neštovic. Ačkoliv nebylo deláno žádné testování ligovéné DNA víru vakcinie na účinnosť pakážování virem drúbežich neštovic v savčí hostitelské bunce, výtčžek
V keždém vírovém rekombinantu generované© iutracelulární rekombinací s daným insertním p lesa idem ná ineert jednu orientaci závisející na poleritČ homolognich obklopujúcich oblastí v tomto plasmidu. Diky transkripčním interferenční® jevúm (napríklad Ink a Pickup, 1989)· hladiny exprese génu vložených do vektoru víru neštovic závisí na orientaci oízího génu vzhledem k vírovému genomu. Je tedy žádoucí získať v jednom reakční® stupni modifikované víry s jakoukoliv možnou orientecú. Jedna z výhod postupu v tomto príkladu je to, že obč možné orlentaoe vložené DNA jsou získány v jedné ligačaí reehoi, umožňující bezprostrednú testování variant.
-w ~ které maj! nejvyšší úroveň exprese. Výhodná orientace kazety tohoto príkladu ve vybrané© Sňal inaarčnía mleté víru vakcínie Je «b” orientace, Jak bylo prokázúno skutočností, že vétšina modifikovaných vlrô mčla tuto genomowu strukturu. V této kazete Je P7.5 promotor kontrolujioí cizi gen v pfevrácené opakovací orientaci vzhledem k endogenníau génu polypeptidu o molekulové hmoté 7500. Jak bylo diskutováno v príkladu. 1, endogénni gény polypeptidu o molekulové hmotč 7500 jsou umístony v pŕevrácených koncových opakováních genomu vakcínie· Vzdálenost Ρ7·5 promotoru gpt génu od P7.5 promotoru v levém koncové© opakováni Je asi 20 000 párô nukleotidu· Orientace a” by mála být tedy méaé stabilní a mále by se získávet ménš často v souladu s pcEorováním, že tato orientace byla nalezená pouze dvakrát. Vírové isoláty F13.4 (orientace a) a vF12.5 (orientace b) byly však množený ve velkém ©eritku s gpt selekcí a bylo zjišteno, že majl stabilní predpovedané štruktúry. Zbývá stanovit stabilitu rušných struktur obsahujících násobné inserty bes selekce.
Ligaoe obsahovaly ne kolikanásobný nadbytok insertu k vektoru. Tím se usnednuj® inserae více kopli kazety, Jak to bylo pozorováno. Kení však jasné, proč v tomto príkladu byla dvojitá inserae časté j ší než v príkladu 1· Vzhledem k vnitŕním rekombinacím se očekává, že jsou stabilní jenom nékteré kanfiguraco násobných insertu. Pro vyhodnotení stability virô násobných insertô a optimálneho poméru vektoru k insertu na ne stabilitu a hladinu exprese, které závisí ne počtu kopil, lze provést další štúdie, pokud je to potrebatt pro každou konstrukci, podie toho, jak je to popsáno v této pfrihláŠce.
Čišténí viru s ENAi Byly použitý víry a spôsoby uvedené v príkladu 1 a v príkladu 2.
Sestavování vírové DNA i Vírová DNA vyčišténá z virionô se rozštep! pôsobením Smal a vyčistí se Jednou extra kel fenolom a trenú. extrakoemi chloroformom. V první© výše uvedené© pokusu se dva ©ikrogramy rozštepené DNA viru ligují se 400 nenogramy (34-násobný molárni nadbyte k) fragmentu insertu (Hpai-Dral fragment o 1100 párech nukieotidú vy štepený z
- ' , ·ν ·- '· r - . ·:... .-y· y_<
• · plasmidu pTKgpt-Pls) v objemu 30 mikrolitrú 40 hodin s 15 jednotkami T4 ligasy (Boehringer, íno.). hrubý pokus ligacs byl proveden za stojných podmínek až ns to, že se použije sedmnáctinásobný molárnl nadbytok Smal insertu o 1100 párech nukleotidú a 5 jednotak ligaey.
v * la vivo hetorologní pakážování ptaoích bunkáchí Fibroblasty kuŕeoiho zárodku (6.106) byly infikovány pomocným vírom (0,5 plok tvorí c ich jednotek na bunku fiP1.44]) e inkubovány dve hodiny. Do infikovaných bunék se transfektují dve mikrogremy ligované DNA. Pak ee pokračuje stejné jako je to shora popaáno pro postup homologniho pakážování v príkladu 1.
Ukážka pakážování modifikované DNA viru vakcinie pomocným vírom drúbežíoh neštovic: Návrh tohoto pokusu je ukázán na obrázku 3.1. Geaomová IBA viru vakcinie by la pripravene z víri onú. vyčišténím sacharosovým gradientem, rozštšpena reštrikční endonukleasou QmnI a ligována s kazetou ciziho génu se zarovnanými konci. Mgovaná DNA se tranefektuje do fibroblastú kuŕeciho zárodku infikovaných virem drúbežíoh neštovic pro pakážování. Progenový vír se identifikuje analýzou plakú ns savčíoh (CV—1) bunkách, ktoré nepodporuj! úplnou replikací viru drúbežích neštovic za vziíku infekční ch vírloná.
Podrobnéji - nejdŕív© se Hpal-Dral ftagment nesoucí kazetu modelového génu (obsabujlcí gpt gen ŕlzený Ρ7·5 promotorem viru vakcinie) vyStepi z plasmidu pTKgpt-Fls (Falkner a Mosss 1938.) a ligujo ee pŕímo do jedinečného místa Smel viru vakcinie pŕírodniho typu (kmeň Ό)· Výbere se gpt gen, který umožní positivní selekci modifikovaných viru (3oyle & Coupars 1988 a Falkner a Mossi 1988.). Jediné Smal mís to v DNA viru vakcinie je umistčno v otevŕené čteoi oblasti A51R v HindlII A fragmentu genomu· A51R gen je nepodstatný pro vírovou replikaci v bunečné kultúre (Goebel a spol.: 1990·)·
Ligovaný materiál se trsnsfektuje do fibroblastú kuŕeciho
zárodku infikovaných pomocným virem drúbežích neštovio. Po troch dnech se bunky isoiují e pripraví se surový zásobní vírus. Pakážovaný vírus vakcínie se identifikuje analýzou plakú. na línii bunék (CV-1) ledvin africké zelené opice v médiu, které výbere bunky infikované vírom nesoucím gpt gen. Toto reakční schéma zabráni virúm obsahujícim samoligovanou DNA víru vakcínie pŕírodního typu tvorí t plaky, ale umožňuje tvorení plakú modifikovanými víry, které obsahuj! vloženou kazetu modelového gpt génu· \
V\
V puvodnich pokusoch byla četnost pakáževání nízká.\ >
Títr gpt-positivního víru vakcínie v surovém zásobní® sta-A vu pripravené® z 6.106 fibroblastú kuŕecího embrya byl v\ rozmezl 1.10^ až 1.10^ plak tvoŕícich jednoVek.
/
Tŕináct gpt-positivních plakú bylo amplifikováno za gpt-selekce v bunkách CV-1, Isoluje se celková DNA infikovaných bunék, rozštep! se pôsobením HindXII, rozdelí se na 0,7% agarosovém gélu a analyzuje se Southernovým blotovánim sondou gpt-génu, Jak ukazuje obrázek 3.2, bylo získáno nékolik virú, které mély sestavy blotu pŕedpovédéné pro rúzné modifikované genomové štruktúry.
Ve sloupcíoh 2, 4, 11 a 13 (odpovídajicich plakú® č· 112,3» F12.5» 113·3 a F13*5) je viditelný jeden hybridizujícl fragment o sal 45 000 párech nukleotidä, který je očekáván, jestliže je do vírového genomu vložená jedna kópie fezety génu v b” or len ta o i (víz obrázek 3.5)· Ve všech prípadoch je prítomný také očakávaný nový fragment o >200 pároch nukleotidú a objevuje se také, jestliže jsou stejné MA jako na obrázku 3.2 testovány pomoci sondy víru vakcínie·
Dva víry, jejichž sestava je v eouladu s rts orientací, byly zíokány ve sloupcích 7 a 12 (odpovídající píekúm č. 112.8 a 113.4), kde je očekáván jediný gpt-hybridizujíc! fragment o asi 5700 párech nukleotidú. Fragment s 5700 páry nukleotidú ve sloupci 7 je viditelnojéí pri delšíoh expoaicich auto-radiografu. Sestax'a, ktorá je vidét v© sloupci 5 (plak 112*6), máše predstavovat jediný inse.rt v Ha” orien-
- 75 ~ taci, ale očakávaný pás o 5700 párech nukleotidú je z neznámých dúvodú ponékud vetší.
Gestave tri vírových isolátú je v souladu e tandemovou insercí v ·'© orientaoi (sloupce 1, 6 a 10 odpovídající plakúra č. F12.2, PI 2. 7 a F13.2). V téchto pŕipsdech jeou očekávány dva gpt—posltivai hybridizujíci fra@aentyt o 5700 párech nukleotidú a 1100 párech nukleotidú (víz také obrázek 3.3)· Fmgaenty o 5700 párech nukleotidú a 4100 párech nukleotidú byly také pozorovaný v ekvimolárnich množstvách u vírové DNA v biotu hybridizcvanéra sondou viru vekcíni®·
Génom isolátu ve aloupci 3 (plak č* F12.4) možná obsahuje insert tandemových duplikátú v b orienteci. V tomto prípadé se očekává, že dva fragmenty o 45 000 párech nukleotidú a 1100 páreoh nukleotidú se hybridlzují gpt-genem.
Vírová DNA ve eleupci 9 (plak Š« Flý.l) múže obsahoval dvojitou inserci hlave-hlava. V tomto prípadé se oČekává frage^nt o 45 000 párech nukleotidú a 5700 párech nukleotidú hybridizujíci se sondou gpt-genu. Nevie by však teková DNA mšla obsahovat nový fragment o 600 páreoh nukleotidú, který se hybridizuje sondou DNA vakcín!®· Tento fragment byl skutočné detegován na blatu hybridizovaném sondou vakcinie. Nicméné očakávaný fragment o 5700 párech nukleotidú byl 0 náoo menší než predpovedaný a poskytoval hybridizační signál, který je slabší než bylo očekáváno. Potvrzeaí štruktúry tohoto rekombinantu vyžaduje tedy podrobné j Ši analýzur
Ďalší analýza odhalila, žq víry F12.7 a F12.3, které byly interpretovány jako víry s dvojitou inserci tandemu V struktur, a vírus F12.4, který byl lnterpretován jako vírus s dvojitou inserci tandemu Mb struktur, maj! ve skutočnosti násobné tandemové inserty v a a b orienteoi. Southernove blotová analýze na otázku j· 2 nerozlišuje mezi inserty dvojitého tenderau a násobného tandemu.
- 74 Príklad 4
Konstrukce vektoru viru neátovic (vakcínie) (vdTK) ε Mdlcim hlavním klonovscím místern a plaemidil ee slučitelnými kazetami exprese
Tento príklad demonštruje eplikaci zpôsobú. podie tohoto vynálezu pri tvorení nových klonovací ch vektorú. virú než tovie prímou molekulárni. modífíkací e klonovánim existujících genomú. víru ne Št o vie. Tento príklad popisuje vektor viru vakcinie (vdTK), ktorý umožňuje ŕíženou inserol (tj. násilné klonování) cizích génu do krátkeho segmentu násobného klonovacího místa obsahujícího místs štšpení rúznými nukleosami, pri čemž každé z nich je jedinečné v genomu vektoru· Násilné klonování odstraňuje potrebu postupu výberu (selekce) nebo testování pri odlíšení žádaných rekombinentá od viru vektoru, jemuž chybí insert, nehoň neslučitelnost DNA koncú. rozštépených ráznymi nukleasami bráni religaci vektorových raaének bez cizího insertu· Prístup s násilným klonovánim j© nejúčlnnejáím zpusobem vložení cizího génu do vírového vektoru·
Sídiel vektor vdTK se vytvorí vložením násobného klonovacího mí&ta (obsahující jedinečná místa KotI, Smul, Apal a Rsrl) do mlsta génu thymidin-kinasy (tk) víru vakcínie (viz obrázek 4« 1a)· Toto nepodstatné místo je místem nejčsstčji používaným pro vložení oizích geníl do víru vakcínie, hlavnČ kvôli tomu, že je možná positivní selokce tk—negatívnich virô. Jestliže se tedy DNA ligovéného vdTK vektoru pakážuje tk-positivnim pomocným virem, môže se z nadbytku pomocných virú vybrat vektorový vírus. A dále# vložení cízí DNA do tk-místa víru vakcínie konvenčními zpôsoby obecné vede ke etabilnim rekombinéntôm·
Násobné klonovací místo nového vdTK vektoru obsahuje místa ätčpení Nôti a Smôl, která jsou v tomto vektoru jedinečná· Pred vložením násobného klonovacího míste se misia štčpení Nôti a Smal, která pred tímto vložením existuj! ve
viru vakcinie prírodního typu (kmeň &E), vynechaj! prímými molekulárními modifikacemi podie tohoto vynálezu. Viry, které máji žádené modifikaoe, se detegují testovacími (vyhledávacími, skríning) technikami, které jsou založený na PCR metodé (pplynerase chain reaction) ampllfikace sekvencí špecifických nukleových kyselín.
Tento príklad popisuj© také radu pfemidú, které usnadnují expreei DNA kódujíoich úplné nebo cástečné otev£ené čtecí oblasti ve vektoru vakcinie vdTK. Tento vynález v sobč zahrnuje inserci otevrené čtecl oblasti pŕímo do exprosního vektoru viru neštovlc, který má všechny príslušné regulační prvky vhodné umlsténé pro expresi vložené otevrené čtecl oblasti· Avšak tento vdTK vektor nemá takové regulační sekvence pro expres! vložené otevhené čtecl oblasti, které chybí jej! vlastní transkripčnl a translační signály. Plesmidy podie tohoto vynálezu podie tohoto príkladu tedy poskytuj! vhodné kazety exprese genú pro rutinní navázání otevŕených čtecich oblasti na promotory viru neštovic a poprípade na translačni štart kodon. Otlčená Čtecí oblast a souvisejicí regulační sekvence jsou tedy efektívne pfeneseny do vdTK vektorového hlavniho aista klonování násilným klonovánim. kodifikované viry, které maj! insert v jakékoliv orientaci, se mohou získa t použitím jednoho ze dvou plasmidú, které msjí kazetu exprese se žádsnou orientaol v jeho hlavním mistč klonování. Kazety exprese génu plasmidú, jejichž príklady jsou zde uvedený, msji dvé uhnízdéni fady mist štépcnl restrikčnlmi enzymy, oož usnednuje klonování otev^ených Čtecich oblasti do vdTK vektoru. Tyto kazety máji hlavni nieto klonování, které obsahuje etejná jedinečná místa, jako hlavni místo klonování vdTK vektoru. A na vie, ve stredu tohoto hlavniho mís ta klonování tyto kazety obsahuj! rúzná místa často se vyskytujlcích Štépioích enzymú, která jsou užitočná pro vložení otevŕenýoh čtecich oblasti do kazet. DNA, které jsou vložený do kazet pomoci často se vyskytujlcích rnist stčpení, jsou obklopený iia kterékoliv strane nékolika rúznými misty, která jsou vhodná pro násilné klonování kazety do hlavniho místa klonování vdTK vektoru.
J? j
- 76 Tento príklad také popisuje kazety exprese gená vhodné pro vložení do jediného jedinečného místa ve vektoru vdTK Víru vakcínie. Pro pŕekonání stiížené klonovací účinnosti pri použivání jediného enzým pre štépení DNA kazety exprese téchto pls smidu. obsahuj! E. coli gpt gen jako selekční marker»
Vektorový systém vdi’K vakcínie se s výhodou používá Ve spojení s heter-olognim pskážovacím postupom popsaným v príkladoch 3 a 7« Plasmidy obsahujíoí gpt msrker se mohou použíwt také s homologním pomocným virem, kterém chybí gp^: aaŕk»r# Príklady konstrukcí pro expresi poly^eptidd, používající vdTK vektor a príbuzné plasxaidové systémy jsou zdeuvedeny niže v príkladu 5·
Jedle ©hora uvedených výhod expresní kazetové plssmidy podie tohoto vynálezu poskytuj! také prostŕedek pro pi ekonání obetného problému neslučitelnosti mezi konci rozétepených vektorovýeh DNA víru neštovio s mnohá DNA inserty, jako ’ W k obvyklému použití segmentu DNA syntetického jkgsptoru· Isolace DNA fragmentd, které kóduj! OteVŕéfliéčteoí oblasti» je obvykle usnadnčna tím, že se peužíwjí restrikčuí endonukleasy, ktoré máji rozeznávací 7-.které jsou krátké a náhodné se vyskytuj! ve vyso:Wóhj^ekvénoích ve všech pŕírodních DNA sekvencíeh· Ne druzJtó<<tŕan§tekové často se vyskytující štépicí enzymy obvykle pro účinné pŕlmé klonováni do tak velkých ge’jóÍto'Jsou napríklad genomy víru neštovic, protole t«fϊ vkäjé' ehzýiay étépí velké DNA na mnoho fragzentd· K relégeci s·té^hb^ýíŕagientú. by docháselo v náhodném poradí za vzniku 1 hél&likB neporušených vírových genomú· Insertní mís ta ve . vektoru vakoínie s výhodou znamenaj! mista štepení ne príliš '..dáótó se vyebytujicích Stépíoich restrikčních endonuk:z^Onáivkteňé se pravdepodobné obecné nepoužívaj! pro isolaci y^^^e^iitÄ'ietevfené otec! oblasti nebo DNA insertu. Zde uzVe^névÍ^ó^^ prekonávaj! tuto obecnou neslučítelnost efektívni inserce fragmentu z často se vyžtSpících enzymd do plasmidu a následující účinný -Wktoru-vekclnie použitím žtéplcích enzýmu, které -ty. '
MZWSWZWä 'í •S ' : VT? 'Z · '·!
se často nevyskytuj!.
Delec® jedinečného místo štépeni Notl viru vakcínie prírodní ho typu (<R)í Jedinečné místo Štepení Notlaviru vakcínie lze odstrsnit t? k, že se do tohoto místa vloží segment Notl deleôní adaptor, který má kohesivní konoe slučitelné s ligaci s DNA rozštépenou pôsobením Notl, ale které ohyb! eekvenoe potrebné pro rozpoznávání Notl endonukleesou· dekjvence tvorené lisovanými kohesivními konci vírové DNA rozštépené pôsobením Notl, vírové DNA a adaptéru nejsou štépitelné pôsobením Notl. Tento adaptér obsahuje také nčkolík vybraných míst štepení restrikčními endonukle— asami pro ŕisenou lnserci DNA fregmentú.
Pod^robneji - 1 mikrogram DNA viru vaknínie STR prírodního typu se rozštépí pôsobením Notl a liguje sa s jedni® mikrogramem dvoj vláknového Notl-delečního edaptorú. Tento adeptor sestává ze dvou částočne doplňových vláken: odNl (sekvence Identifikační číslo 16) a ooN2 (sekvence identifiá kacní číslo 23). Strední část tohoto editoru obsahuje mista štepení restrikčními endonukleesami Stul, Dral, Sspl a EcoRV. Anelované adaptorové ollgonukleotidy se používaj! pro ligační reakee. Lisovaný materiál se transfektuj© do fibroblastú kuŕeciho zárodku infikovaného vírom drúbežích neštovic a pakážuje se jak je to popsáno v príkladu J.
Alternatívni postup deletováni jediného Notl mista viru vakclnie (kmeň WR) je nastínčn na obrázku 4.1, panel B. V prvním stupni 3e DNA víru vakclnie rozštépí pôsobením Sací. Saol *Ί fragment se isoluje na nízkotající egsrose a klonuje se do Sgigl mista vhodného plasmidu, jako je napríklad pTZ19R (získa telného od firmy Pharmacia, lac.)· Výsledný plasmid, pTZ-Seel, se rozštep! pôsobením Notl, nechá se zreagovet s Klenowovou polymerasou, aby se doplnil na pŕečnívsjleíoh koní^ch a re ligu j e se. Ligovéný materiál se transfektuj© do bunék E. coli (HB 101). Standardnlmi klonovacími postupy se isolují kolonio. Výsledný plasmid, pTZ-SaddN, má deletováno místo Notl a používá se v pokusu reversni gpt—selekce jak je to popsáno X ea a esom S. N., Kotwalem u. a
láosssem B.: Virology 178. 626 e ž 630 (1990) spôsobom upraveným následujícím zpusobem: CV-1 bunky (3.106) se infikuj!
0,2 plek tvorícími jednotkami vírového isolátu vp7» viru vakcínie, který byl integrován do jediného místa NptI kazety gpt-gemi (víz príklad 1). Potom se sraženina fosforečnane® vápenatým, která obsahuje 20 yug TfäA z modifikovaného Sací fragmentu pripraveného z plasiaidu pTZ-JaeldN transfektuj© do bunék. Tyto bunky se dále zpracují jak je to popeáno v pekážovacím postupu v príkladu 1. Zásobní surový vírus se použije pro infikováni myších bunék STO (získaných z Amer^lké sbirky typô kultúr (Američan Type Culture Collection), Rockville, M., ATCC č. CRL 1503) v prítomnosti 6-thioguaninu (6-TG). Toto je negatívni selektívni postup, který vyžaduje ztrátu gpt-genu u viru, který se replikuje (Xssacs a s pol o, 1990.) a vede tedy v tomto prípadu k integraci modifikovaného Sací “1 fragmentu a tudíž k deleci gpt—génu. Všes plakúm, které r ©stou v prítomnosti 6-TG, by mšl chybe t gpt-gen a Bely by obsahovst modifikovaný Sací I fragment. Odhadnutý výtéžek je v rozmeaí 0,1 a 0,2 % se všech plakú (tj. normálni frekvence rekombinantô v tomto typu pokusu získávání markeru). Jelikož selekčnl postup je mimorádné účinným po s tupej;; (Isaaes a spol.t 1990'«)» nepfedpokládá se, že by identifikace presných struktur vyžadovala zkoumáni velkého počtu klonô. Alv se však pro deleci jediného Notí viru veko ínie použije shora uvedený první postup nebo tento alternatívni postup, pro identifikování žádané konstrukce se môže použit následujicí testovací postup.
Identifikace PCR-testováním víru (vdN), který má dele, tován misto Notls KÍony viru vakcinie, které mají deletovány mís to Nôti, ae mohou identifikoyat analýzou plskô rostoucích v bunečné linii (CV-1), která nepodporuje rôst pomocného víru drôbežích neštovic. IMA virô v jednotlivých pleci eh se «na lyžuj í PCR-testovací metodou následujicí® spôsobom.
Prvním prímerem pro PCR rčakci je oligonukleotid odNl (sekvence identifikační Číslo 16), druhým primerem je odN3 (sekvence identifikační číslo 24). &fät£fíce. druhého primeru je umisténa v genomu víru vakcinie asi 770 páril nukleotídô ?ϊτ. ·· ·' * . ·. · ?’ ’··*Γιί? . ..
po smeru vlákna sekvence prvniho primeru· Templátôm je celková DNA z 1.106 G*V—1 bunek infikovaných polovinou víru jediného p la ku. DNA se pripraví standardními technikami. Pro 'f PCR reakci se použije asi 50 ng· PGH reakce se prov podle standardních technik komerčné dostupnými PGK ses^yami. 'v Poeitivní PCR reakce produkuj! DNA fragment o asi 7?9 pá- \ rech nukleotidú. lakový vírus, který má deletováno mi^fc^Hotl, ·'$ se označuje vdN”. ; \
Delece jedinečného restrikcniho místa Srna í λ virUYjV^s·' cínie vdN« kmeň viru vakcínie obsahuje jediné SmaX nbLsw v otevŕené Čtecí oblasti (A51&)» které neni podstatné proV\. replikaci víru v bunéčné kultúre (Goebél s spol·» 1990)· I když se toto misto môže poučít pro vlo£eňi'.čizihp· gejsý'i'··.^ .'·Vx·· tomto'príkladu je však toto míato deletováno ve t ŕíeiho se mnohostranné j šlho vektoru.viru všksinie·>··\ ;.. nového jedinečného místa Srna! -jakočásti *. ·’’.'·.
klonovaciho místa· >·;
\ \ ί
- \
DNA vdB viru (1 yug) se tedy rozätépl púsobenlm ligu je so nadbytkem hexasierovéhó linkeru* kteiý Májvgj vecí sekvenci pro reštrikční endonukleasu HindXXI ( 5*-aagcíMS-3*)· Inserce tohoto llnkeru db místa víru vakcínie vede k destrukci sekvence rozezníV8jÍCi| a k zavedení nové HÍndXXI rozpoznávací sekwe^ Λ teriál se. pakášuje do cva bunék, které byly iňf drúbežích neštovic, jak je to popsáno v pj^LklaiSn

Claims (14)

tovat také podie postupu nesilneného na ob modifikováním klonovaného -fragmentu DNA VÍÄ^Ií pŕimého modifikováni úplné DNA vlini.yakblaí^ se DBÁ viru vakcínie ŕozätépí púsobei^ ment se isoluje z nízkotajlcl agarosy,.e Sali vhodného plasmidu,s: jako je sííapHklÄÄ od firmy Pharmapia, Ιηο#)* Výsledný ? místa Staal, jedno v násobnámklonovacl® sekvencích veke í nie (obrázek 4.1, paneíj T částečnč rozitépl púsobenim SmaX a .. . ' následujícim postúpenú první vlákno, I^Scel linker (sekvence identifikační číslo 25) ε jeho doplnkové vlákno, I Seel linker 2 (sekvence identifikační číslo 26). Správný plasmid, který má deletováno íaíste Smal v sekvencíoh vakcínie, se identifikuje štepením pôsobením Smel a 1-SceI. Konečný plasmid, ρΓΖ-Salí’dS, se použije pro zavedení deleoe Smel do genomu víru vakoánie s použitím pokusu reverend sclekce gpt-genu, jak je to popsáno pro deletování místa. Nôti až na to, že výhodným virem, který má být modifikován, je isolát F12.5 vírus, který ja integrován do jediného Smôl míste kazety gpt-genu (víz príklad 3). Výsledná inserce mi sta pro endonukleasu I~SceI je výhodná pro píímé molekulárni klonovánl, protože tento enzým, leolovauý z kvasínek, rozeznává 13-merní sísto a tedy štšpi náhodné DNA sekvence mimoŕádne sŕídka. Napríklad I-Scel Stépí génom kvssinek kenom jednou (Thierry A., Perrin A., Boyer J.M Fairhead ú., Dujon B., Frey B. a Bohmitz Gr: Nucleia Acids Res. 19, 139 až 19θ 0-991)·)· X-SceX je komerčné dostupná od Soehringer, Ino. IwSoel niisto se s výhodou za vadí do vektoru, který nemá žádná predaj existující mists pro tento enzým. Vy tvárí sa tím nový vektor s jediným místem, které môže být použito pro génové inseroe. Msto štépenl pásobenilrScel, s£ už DNA viru vakcínie nebo DNA jinýeh vektorô, môže být stonoveno rutinní reštrikční analýzou vektorové DNA. Jestliže se používa tento alternatívni postup pro deleci místa Smal z DNA viru vakcínie, poradí stupňô pro zkonstruování vektoru vďT< je následujícís delece místa Sme I vedoucí k viru udS (viz výne), delece místa Nôti inaercí kazety Nôti gpt-gen (viz príklad 1) do jediného Nôti míste viru vdS klonovánim a pakážováním, což vede k viru vdftNrpt, reversní eelokce (gpt-selekoe) jsk shora popsáno a použitím vdSNgpt a pTZ-SacldN jako subatrátô pro pokus získání mer— keru s delsce tk-genu, jak je to naetínäno níže v tomto príkladu. Alternatívni postup, podie kterého byl vektor vdTK - 81 skutečné zkonstruován, je náslodující· Místo Srna! viru vsk— cínie pMrodního typu se deletuje. Vytvorí se tek mezi-produkt - vírus vd8« V druhé® pokusu se deletuje místo Nôti viru vakcinie pfirodniho typu. Vytvorí a& tak mezíprodukt - vírus vdH. Vírus vdSN byl sískán koinfekcí bunék DV-1 oboma víry s PCR-testovánim rekombinantního víru (který byl vytvolen jednoduchým genetickým skrížený© postupe®), životnosť ražných mezi produkt u. byle stanovene titracemi. Tabulka 4.1A ukazuje výsledky po to®, co jednotlivé isoláty z vdN klonoveciho pokusu byly vyčistený pétkxát pŕes plak (aby bylo jisté, že byly získány klony bez viru pHrodníhotypu) e potom emplifikovány. Po titraci byly surové vírové kmeny z první cmplifikace společné s kontrolou priľodDiho typu (,’čR-čT) použitý pro infikování OV-1 bunék v množství 0,1 pfu/buňku. Ty to bunky se po 48 hodinách isolují e použiji se pro prípravu kmenú, které se pŕetitrují. Tyto výsledky jsou uvedený v tabulce 4.13. Isoi-ty -vdN/Al č. 6.1111 e vdN/Al č. 10.1111 byly označený jako klony vdN č. 6 s vdN č. 10 a použitý pro prípravu víru ve velkém meritku. Tabulka 4.2A ukazuje výsledky po tom, co jednotlivé isoláty vdfí klonovacího pokusu byly päťkrát prečištóny pŕes plek s potom amplifikovány e zti^trovány· Pro infikování bunék CV-1 v ranožství 0,1 plak tvoŕicich jednotek ns bunku byly použitý surové kmeny z první aapliííkace spolue s prírodní kontrolou (dB-M*). Bunky byly isolovány po 43 hodinách. Výsledné surové zásoby byly pŕetitrovány· Tyto výsledky jsou uvedený ne obrázku 4.2B. Isoláty vdS č 7.11 byly označený jako klony vdfí č. 2 a vdS č.7 e použitý pro prípravu víru ve velkém merítku. V každé® pŕipcde se vírový isolát, který vykazuje nejlepši rastové vlastnosti, výbere pro ampliíikaci e pro kultivaoe ve velkém zaeritku. Tabulke 4.1 Štúdie životaschopnosti vírového iaezlproduktu vdK A) Titr po první aiaplifikaci šesti vírových vdN-isolátú (plakú tvoŕíoích jednotek no ml surového kmene) t vdM/Al č.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C
Sací fragment viru vakcínia wt S 3.9 N 3.2 S
I___________________________________________________________________________II
1 1 Q4S.Q.Q j . ó L 6 g 0 ' } •f·? ?
-<-----in vivo pakážování savčich bunek (CV-1) infektovaných virem drúbežích neštovic gpt selekce čistení pŕes plaky vselP-gpl60MN-viry
Obrázek 9,6
Schematický nástin konstrukce víru. vselP-gplôOMNA a vP2-gpl60MNB paten í<ví 3
HA / w a prírodní SalI-F-fragment α P7.s-gpt oca sclP-gplGO
S 10.3
I__
1 _ TT spel
- rozätépit púsobením Pvuli 0amH
- ligová t ;NotI
I
Noll linkery plasmidú pTZS4-lacZa/b
Psll
P7.5 pn) pBluescript
Amp
- isolovat Nôti fragment o 1200 pn (4200 pN2gpt-S4
Stul Smo1 locZ pripravit Smal/Stul fragment o 3300 pn z placZN*
Páso-NoU
Pstl
P 7.5
Xbal Spel BamH pTZgpt-S4 pTZ r
f5700 pn;
Noll pTZ
Noll p7ZS4lacZa (7000 pn) pT2
PATENTSERVIS
1 or i
EcoRI Ec . lacZ
PTZ-N (2500 pn)
-isolovat Notl fragment o *»4oi» v.
S°Vat pripravít EcoRI fragment o JOOO pn z pTZgpt-FlsP (3000 pn)
1200 pn
Xbal Spel BamHI
Psll ‘>7.5
NOtl pTZgpt~53A (3700 pn) r
Am o
PTZ ľ I or i ’eeí® x °οφ
EcoRI
CC CL
ÚŔAD
C VYN'ÁLE' A OBJEVY o: a.
Obrázek 5·5 f lorí
W <&ľl ~74
-EcoRI
Ncol, Smel Stul, RsrlI Apal, SÍIK2)
Noll
Xbal
1 (4200 pn) \ i 'J . Λ
EccíU Ncol Sval Stul
Rsrll Apal S£il(2>
Štruktúra promotoru SR:
_________ ŕ IfoU EcoRJj Ncol Sňal Stul Rsrll Apal Sfil (2)
Obrázek 4.7
Konstrukce plasmidu pAlSl~H?
pl/ u ty L
Scal
Stll(1) Notl Smal szll pBluescript
PA1-S1
C3200 pn z
Protromóin EcoRI '11 7.5
PTKgptrozštépit pôsobením EcoRI ligovát ’
Pŕipravit rozštépit pôsobením Ecol -u fragment protrombin< cDNA o 2000 p
Protrombin
EcoRI
PBluescript
Scal coRI II
Obrázek 5.1
PATENTSERVIS
PRAHA
Konstrukc© plasmidú. pN2gpt-GPg
Plasmlnogon otl mal phPias6 (5500 on)
Pstl
P7.5 ” Hpal
EcoRI, Ncol Smal, Stul Rsrll, Apal Síil(2)
Xbal Spel BamHI
N o 11
Smal
Scal ' pBluscript rozštepit pôsobením Balí a pŕipravit cDMA fragment Glu-plasminogenu o 2500 pn
Gíu-Plasmlnogen
Nael Scal /pN2gpt-S4 (4200 nnj pBluescrif rozštépit púsobením Hp·
C) a ~7í í I - cn O I tO i Ií7> < ___
>· CM M LU >- 0' << ω n X CO m o > O CM C) Cť ík a —»- -· - —1
Obrázek 5*2 patľntssrvis ľCe Pla M>3sm k t &
Nc°f(2)
Pn)
DhpIa
I oNcol a oNco2 ''Vfuescr/pf
- pripravit jednovláknovou DNA
- zavést sousední místo Ncol a deletovat vnitrní Nco (2) mutagenesí oligonukleotidy 'Nc°i(V
Srnu/
I^cqi
Pstl
P/.5 ^bal sPel P^rnl··, ' N
Ρβ/υ
Scai 'LPg
P)
X phDplas ^«uepit pôsobením Smal
- částečne rozštepit púsob>
- isolovat Ncol/Smal LPg c o 2200 pn
Ncol ^cqi p^gPt.
Pf^^o i^Z | Sma/
Stu/ kodující
77 mistne pomoci
- deletovat sekvenci aminokyseliny 1 až níženou mutagenesí oligonukleotidu oNco3
Ppa/
Sľ?'·'-«/
Xbai sPet
No//
Z£ý7-?Z_
Konstrukce plasmidu pN2gpt-gpt60
M13mp18 ώ
- rozštépit
- pripravit mpPEenv (10800 pn) pôsobením EcoRV
HIV-gptl60 cDNA fragment o 25θθ pn ligovat coRV
Xbal Spel BamHI
Notl
Hpal EcoRI, Ncol Smal, Slul Rsrll, Apal Sfil(2)
Scal
- rozštépit pôsobením Hpal pN2gpt-S4 (4200 on_) pBluescript
HIV-gp16O
P7·^ k Stul y/h. /Rsrll, Apal 9pt f pN2gpt- iVsíil(2) Xbal gp160 /y^Notl Spel^xM ko/00 pn; (. Notl pBluescript Nael Scal
Obrázek 5*4
Sj’E'/r
Amp
PTZ19R (2900. pn) 'PV M/ít -4 L
Konstrukce plasmidu pTZgpt-SJAlacZ
EcoRI
Ncol, Smal
Stul, Rsrll
Apal. Sľi 1(2)
Notl
I
- rozštépit pôsobením r Pvull
- ligovát Notl linkerý
Xbal Spel
BamH pN2gpt-S3A (4200 pn) pBluescript r
Amp
Amp
1.
MCS ri
Sal F fr. (13OOO pn) rozátépit púšbbením Smal
Sali
Smal ligovát pTZ-SalF (I59OO pn) «»
- rozštúpit pôsobením Smal
- vložit I-Sce I linkery
Obrázek 4-.1C (15900 pn) ••7» Ό i
>D
Csl cr>
N
L1J có >· u>
Oť a.
A OBJLVY
Konstrukce plasmidu pHind J-3
VV-HindlII J
- delece W-tk kodu.jíci sekvence inutagenesí srny č kou pomoci oligonukleotidu odTK
I
Hlíst restrikčních.
i |O ťXl
CD • CG <X.
Cl. < >úí vdTK
Obrázek 4.2
Konstrukce plasmidú. pAl a pA2 ty LQ pBluescrlpt >
- rozštepeni púsobením Sací a Asp718
- nahrazeni násobného klonovaciho mista pBluescript II SK adaptorem sestávájícim z oligonukleotidú.
P-A(O.l) a P-A(0.2) c 5000
Scal' )
Sfil( 1) NoU Smal Xhol Rsrll Apal Sti 1(2) pBluescripI
- rozštépit púsobením Xhol
- vložit adaptor sestávajici z oligonukleotidú P-A(l.l) a P-A(1.2)
- isolovat obe orientace tP*· bi
UJ ·<* x
CO
CM
C) O' n.
•<r.
o.
^^ŤÉNTSÉRVfST
PRAHA
Konstrukce plasmidu pAl-Sl a pA2-S2
A)
Sfll(1) AJdol Notl f Psll. Hpal Smal _/ EcoRI, Ncol Rsrll \ . BamHI, EcoRV Apal XHIndlII, Slul S(il(2) >Sall
(JOOO pn)
Z^pBluoscript
- rozštépit pusobenim Ndel a BamHI
- vložit anelované oligonukleotidy
P-P2ml.l a P-P2ml.2
B)
Štruktúra promotoru SI:
TACGGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAGTAA TTGTAAAGAA GAAAACGAAA CTATCAAAAC CGTTTATGAA
ATGATAGAAA AAAGAATATA AATAATCCTG ΤΛΤΤΠΑβΠ TAAG7AACAG TAAAATAATG AGTAGAAAAT
EcoRI ΑΟΤΑΤΠΤΠ· ATAGCCTATA AATCATGAATľCG
Obrázek 4.4
Konstrukce plasmidu pAl-S2 a pA2-S2
A)
Γ sill( 1) yNÓOl / e° / 'Pstl. Hpal r Smal_/ EcoRI, Nool Rsrll \ BamHl. EcoRV Apal ' \ HindlII, Slul Slil(2) Sali u PA1 \s( 3000 ,pn) Sca pBluescript
r SHI(1) . / Nofl / ! Smal/ Rsrll X. Apal \ Sfll(2) Sali Slul. HindlII EcoRV. BamHl Ncoí. EcoRI <Hpal, Pstl Ndel P A2 'L· 5000 on) ScaP^ pBluescript
rozštépit púsobením Hpal a EcoRI vložiť anelované oligonukleotidy P-artP(5) a P-artP(6)
B)
Štruktúra promotoru S2:
Pstl EcoRI
GGGAAGCrrT ΠΤΓ'ΠΤΓΓΤ TTTTTTTGGC ATATAAATAG GCTGCAGG AATTC vektor DNA
Obrázek 4,5 ••—t·—5»«»»
·;>- Cxi h í I n U.J >>► UJ X >ÍE Ό CO CO >· 0 CXJ 0 Cť CL
PATENTSERVIS
.....'•«aha
Konstrukce plasmidú pN2-gpta a pN2~ pn2-gptbb
Nôti — rozštépit pôsobením HindlII — vložit Nôti insert ligovát pBluescript rozštépit pôsobením Hpal/Dral
- rozštepit pôsobením pn
Xba —
Spe
BamHI pripravil P7«5 promotor~gpt kazetu, o 1100 e;e
No 11
Nael
Xba —
Spe
BamHI otl pBluescript
Pstl
EcoRI, EcoRV HindlII. Clal pBluescript s 11
EcoRI, EcoRV HindlII. Clal
Obrázek 4.6 (XI cr>
X en tXJ
'y.. M UJ —i >· Q Id < Z- ~1 HK co •.n ·> o o < u: Q.
j
Konstrukce plasmidú pN2gpt-S3A pN2gpt-S4
-Osti
EcoRI, EcoRV indlll. Clal
Xba —
Spe BamHI pBluescnpt pN2-gptb (4060 pn) rozštepit pôsobením
PstI a Clal vložit anelované ,r oligonukleotidy
P-artP(7) a P-artP(8)
Xbal Spel 8amH coRI
Ncol. Smal Slul, Rsrll Apal, Sfil(2) pN2gpt-S3A (4200 pn) pBluescript
Sial
Štruktúra promotoru Sj5A
S3A
W & f1-^L· rozštepit púsobenim PstI a Clal vložít anelované oligonukleotidy P-artP(9) a P-artP(lO)
Hpal
EcoRI, Ncol Smal, Stul Rsrll, Apal
Sfil(2)
Xbal Spel BamHI
Scal escripl
7pN2gpt-S4
1.
1 2345 678 9 10 11
1) modifikovaní za extraoelulárnich podmlnek vyčičténé DNA molekuly» ktorá obsahuje prvni génom prvnpo eukaryotlokého cytoplazmatlokého DNA-viru, člmž se získá modifikovaná DNA molekula» ktorá obsahuje uvedený modifikovaný vírový génom,
IX) zavedení uvedené modifikované DNA molekuly do prvni howtltelské bunky, která pakážuje uvedený modifikovaný vírový génom do iníekčnich virionô., s
III) ioolaoi lúfekčních virioná obsahujících modifikovaný vírový génom z prvni hostitelské bunky·
1. Zpusob priprovy modlí1kovaného eukaryotickéhô oytopiastatického ^ϊΑ-viru pŕímým molekulárni© klonováním modifikovaného vírového gonamu, vyznačuj í©i se t i © t &o tento zpásob zahrnuje stupne 8
1 5 (2) informaoe o sokvonoi identifikační Čislo 84» (i) vlastnosti sekvencej (A) délka» 5 aminokyselín (B) typt aminokyselina (D) topologiei lineárni (113 typ molekuly: protein (xi) popis sekvence» aekvenae Glu Arg Val Asn identifikační čislo Ôl·» ‘•í’ ’l
i.'
P A T K N T O V Ä N í R O K Y
1 5 (2) informaca o sekvenci identifikační číslo 33» (1) vlastnosti sekvonee:
(A) délka» 17 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina ' “’r;*s**ÄVCV» (0) druh vlákna j dvouvláknová (D) topologie: lineárni 1 (11) typ molekuly: jihá nukleová tysellna (A) dopie: syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezproatÍOdni zdroj» (B) klom faktor IX vFIX č. >
(ix) povalia» (A) názov/klíč: CDS (B) umlátení 3.-17 (xi) popis sekvonoe* sekvence identifikační Čislo 33»
CC ATG GAG CGO GTG AAC
Met Glu Arg Val Asn
1 5 (2) inforinac© o sekvenci identifikační číslo 31:
(í) vlastnosti sekvenoeí (A) délka: 17 pári nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (0) druh vlák.na$ dvouvláknová (D) topologic» lineárni (11) typ moloka&y: j iná nukleová kyseline (A) popis: syntetický DNA oligonukleotld (víl) bezprostrední zdroj t (B) kloň t prírodní faktor IX (ix) povaha:
(A) název/klíč: CDS (B) umlstční» 3...17 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 81» ΪΤ ATG OAG CGO GTG AAC
Met Gin Arg Val Asn 1 5 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 82» (i) vlastnosti sekvence» (A) délka: 5 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topologies lineárni (ii) typ molekuly: protein (xl) popis sekvence» sekvence identifikační Číalo 82: Met Gin Arg Val Asn
1 5 infornwoe o sekvenoi identifikační číslo 78s (i) vlastnosti sokvenoe:
(A) dólkai 5 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: protein (xi) popis eekvenoe: oekvenco identifikační Číslo 78: /Met Arg Val Leu Gly / 1 5 / (2) informace o sekvonoi identifikační Číslo 79:
(i) vlastnosti ©ekvenoe:
(A) délka: 18 páril nukleotidú (B) typ: nukleová kysolins (C) druh vlákna: dvouvláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNa oligomikleotld (vil) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: Protein S v chimerách (ix) povaha:
(A) názov/klíč: CDS (B) uMstšni: 4«·13 (xi) popis sekvenoe* sakvonce identifikační Číslo 79* GCC ATG GCG GTC CTG GGT
Met Ala Val Iiou Gly l
.1- 182 -
CAAGGGAATT GACCTGGTTT GGCATCTTCT CCACCAACAA CCCGAGTGAA GTCATTAAAT 3000 GATTGGGTGC TTTGAGTGAT GTTATCCAAA ATGGTTTCAG CTTCAGTAGA ATTTACATAG 3060 TCCACATCAG GAAAAACAGT CTCAGCACGG GTGAGCTTAG AAGTTTGTGA AACAGAAACT 3120 CTTCCACATG GAAATGGCAC TGCTGGTTCA CAGGACTTCT GGTTTTCTGC AAGTCGATAT 3180 CCCTCAGTAC AGGAGCAAAC CACCTTGTTA TCAGCACTAT TTTTACAAAA CTGCTCGCAT 3240 CTGCCATTCT TAATGTTACA TGTTACATCT AATTCACAGT TCTTTCCTTC AAATCCAAAG 3300 GGACACCAAC ATTCATAGGA ATTAATGTCA TCCTTGCAAC TGCCGCCATT TAAACATGGA .3360 TTGGACTCAC ACTGATCTCC ATCAACATAC TGCTTCCAAA ATTCAGTTGT TCTITCAGTG 3420 TTTTCAAAAA CTTCTCGTGC TTCTTCAAAA CTACACTTTT CTTCCATACA TTCTCTCTCA 3480 AGGTTCCCTT GAACAAACTC TTCCAATTTA CCTGAATTAT ACCTCTTTGG CCGATTCAGA 3540 ATTTTGTTGG CGTTTTCATG ATCAAGAAAA ACTGTACATT CAGCACTGAG TAGATATCCT 3600 AAAAGGCAGA TGGTGATGAG GCCTGGTGAT TCTGCCATGA TCATGTTCAC GCGCTCCATG 3660 GAGGCCTTAT TTATATTCCA AAAAAAAAAA ATAAAATTTC AATTTTTAGA TCCCCCAACT 3720 TAAGGGTACC GCCTCGACAT CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA 3780 ACTGATACAA TCTCTTATCA TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGAATAGCC ATATGCCGGT 3840 AGTTGCGATA TACATAAACT GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCGCTTTTT ATAGTAAGTT 3900 TTTCACCCAT AAATAATAAA TACAATAATT aatttctcgt AAAAGTAGAA AATATATTCT 3960 AATTTATTGC ACGGTAAGGA AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACGGATGA TCCCCAÄGCT 4020 TGGACACAAG ACAGGCTTGC GAGATATGTT TGAGAATACC ACTTTATCCC GCGTCAGGGA 4080 GAGGCAGTGC GTAAAAAGAC GCGGACTCAT GTGAAATACT GGTTTTTAGT GCGCCAGATC 4140 TCTATAATCT CGCGCAACCT ATTTTCCCCT CGAACACTTT TTAAGCCGTA GATAAACAGG 4200 CTGGGACACT TCACATGAGC GAAAAATACA TCGTCACCTG GGACATGTTG CAGATCCATG 4260 CACGTAAACT CGCAAGCCGA CTGATGCCTT CTGAACAATG GAAAGGCATT ATTGCCGTAA 4320 GCCGTGGCGG TCTGGTACCG GGTGCGTTAC TGGCGCGTGA ACTGGGTATT CGTCATGTCG 4380 ATACCGTTTG TATTTCCAGC TACGATCACG ACAACCAGCG CGAGCTTAAA GTGCTGAAAC 4440 GCGCAGAAGG CGATGGCGAA GGCTTCATCG TTATTGATGA CCTGGTGGAT ACCGGTGGTA 4500 CTGCGGTTGC GATTCGTGAA ATGTATCCAA AAGCGCACTT TGTCACCATC TTCGCAÄAAC 4560 CGGCTGGTCG TCCGCTGGTT GATGACTATG TTGTTGATAT CCCGCAAGAT ACCTGGATTG 4620 AACAGCCGTG GGATATGGGC GTCGTATTCG TCCCGCCAAT CTCCGGTCGC TAATCTTTTC 4680 AACGCCTGGC ACTGCCGGGC GTTGTTCTTT TTAACTTCAG GCGGGTTACA ATAGTTTCCA 4740 GTAAGTATTC TGGAGGCTGC ATCCATGACA CAGGCAAACC TGAGCGAAAC CCTGTTCAAA 4800 CCCCGCTTTG GGCTGCAGGA ATTCGATATC AAGCTTATCG ATACCGTCGC GGCCGCGACC 4860 TCGAGGGGGG GCCCGGTACC CAATTCGCCC TATAGTGAGT CGTATTACGC GCGCTCACTG 4920 GCCGTCGTTT TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT 4980
- 183
GCAGCACATC CCCCTTTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGATCGCCCT '5040 | TCCCAACAGT TGCGCAGCCT GAATGGCGAA TGGAAATTGT AAGCGTTAAT ATTTTGTTAA 5100 [ AATTCGCGTT äaatttttgt TAAATCAGCT οατγγτγγαα CCAATAGGCC GAAATCGGCA 5160 AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA 5220 ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 5280 L É AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 5340 ŕ GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC 5400 ŕ j CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 5460 t ľ CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 5520 t AGGGCGCGTC AG 5532 í;
(1) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 49 páru, nukleotidú.
(1)vlastnosti sekvence!
(A) délka: 55párú.nukleotldú (B) typi nukleovákyselina (G) druh vlátaffi í jóďnovláknová (D); topologie i; lineárni (ii) typ molekuly: jinánokleová kyselina (A) popis: syntetický JDBA oligonukleotid (vii)bezprostrednízdroji (B) klen: P-artP(12) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 39:
GGCCGGGATT TATATGCCAAAÁAAÁAAAAA AAAAAAAAGC T5KXJQA2AAA 50
AAOGf 55 (2) inforaace o sekvenci identifikační Číslo 40:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka i 93 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina i
·'?
> ·'·*·V 'i' ·. .
' p .
- 1>1 * exprese byly provádény ve fibroblestech kuhecího zárodku (GHF). Kcnfluentní xaonovretvy GEF se infikuji 0,1 plak tvoÄ· cích jednotek na bunku ráznýoh vírových surových kmenú s nechájí se rúst pšt dná. Na 10% polyakrylamídových gelech se oddélí celkové bunečné proteiny, pŕenesou se na nitrocelulosové membrány e dále se postupuje jako je to uvedeno na počátku části Príklady provedení vynálezu'*· weetornúv blot, který ukazuje na expresi gplôO, gpl20 a gp41, je uveden na obrázoích 12.5 a 12.4. Všechny vírové iaoláty, vyjaa f-LF2e, indukovaly expres! env glykoproteinú. Vírus f-liF2e byl negatívni také v Southornové blotu a nenese tedy eekvence génu ®?160.
Konetrukce fenv-IIIB» Dva mikrogramy WA vektoru f-TK2s hostitelského víru (príklad 2) s© rozôtépí pôsobením Nôti a ligujl se s 500 ng kazety genú, obsshující P.7 prcmotor/gpt gen a S4-promotor/gpl60 gen· Ligace se provádí v objemu 20 mikrolitrú. s péti jednotkami ligasy Štyri dny pri teplote 12 °G. Ligační smes se transfektujo do 6.106 CEF infikovaných 0,5 pfu HP2 na' bunku isolátu drúbežích neátovic získaného čištením HP1.441 phes plak· Po inkubační dobé pét dná byl pŕipraven surový kaen (konečný objem jeden ml), který byl amplifikován. Surový kmeň se titruje ne CEF na doskách se šesti jamkami a nechá se rúst pét dná sa gpt-aelekoe (25 /Ug/ml aykcfenolcvé kyseliny, 125 ng xanthinu)· Bunky, u nichž minimálni ŕedšní vedie k viditelnému ©ytoρε thi c kému efektu, byly ieolovány a dvakrát emplifikovány podie stojného postupu· Surový kmeň, který se zíeká z druhé , na amplifikace, se ztiztuje CEF v prítomnosti gpt-selekce· Výbere se dvanáct jednotlivých plakú (f-LF2e-l).
fiesternovy bloty gplčOi Westernovy bloty byly délány v podstaté stojným zpúsobem , jako to popaeli Towbin a spol. (shora uvedená cltoce^PM. dgtekci gpl60/gpl20 byle první protilátka ©yáí monoklonálňdL?^rotilátka (Du Post, Inc· č· ΚΕΑ 9305) použitá v fedční 1 « 500· Pro detekoi gp41 byla použite lidská anti-HTV-gp41 3Dô hab (poskytnutá K Katingorem, IJnivereitat fur Bodonkultur, Inst fur Angewandte Mikrobiológie) v ŕedční 1 i 500. Druhou protilátkou byl kozí protl^myší IgG (H+L) kondenzovaný a alkalickým fosfáte® (BioRad* Inc. č· 170-6520) použitý v íodéní 1 : 1000» Reakční činidle (BCIP s RBT) e postupy barveni byly od firmy iromega* Inc.
Sazna® sekvenci (1) Obecné ínformaoe:
(i) žadatel: Dorner F·, Scheiflinger F., Falkner F· G.,
Pflelderer M.
(ii) Název vynálezu 1 Prímé molekulárni lílonování modifikovaného gonosoi euknryotického oy topia srna tie kého DNA-viru (iii) : počet sekvenci t 84 (iv) : Korešpondenční adresa:
(A) adresáti Foley a Lardner (B) ulice: 1300 Diagonál Road* Suite 500 (C) mesto: Alexandria (D) štát: Va« (E) zemét USA (F) poätovní smerovací číslo: 22313-0299 (v) forma počítačového vyjádrení:
(A) typ média: flopy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: FC-DOS/láS-DOS (D) software: PatentXn Release č, 1.0* verše č. 1.25 (vi) údaje o pŕihlášce:
(A) číslo prihlášky: 07/750*080 (B) dátum podánli 26. srpne 1991 (C) klasifikacet neznámi (vili) ínformaoe o zástupol/agentovi:
(A) jméno: Bent Stephen A.
(B) registrační číslo: 29 763 (0) odkaz (docket number) 30472/106 M (ix) informace o telekomunikační® spojení:
(A) telefón: (703) 836-9300 (B) fax: (703) 683-4109 (d) telex: 099149
- 135 (2) Informece o sekvenci identifikační číslo 1:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délkaí 48 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druhá vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pN2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 1: TCAAGOTTAT CGATACCGTC GGGGCCGCGA CCTCGAGGGG GGGOCCGG 48 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 2:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1133 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pN2-gpta (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 2:
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AACTTAAGGG TACCGCCTCG ACATCTATAT ACTATATAGT 60 AATACCAATA CTCAAGACTA CGAAACTGAT ACAATCTCTT ATCATGT3GG TAATGTTCTC 120 GATGTCGAAT AGCCATATGC CGGTAGTTGC GATATACATA AACTGATCAC TAATTCCAAA 180 CCCACCCGCT TTTTATAGTA AGTTTTTCAC CCATAAATAA TAAATACAAT AATTAATTTC 240 TCGTAAAAGT AGAAAATATA TTCTAATTTA TTGCACGGTA AGGAAGTAGA ATCATAAAGA 300 ACAGTGACGG ATGATCCCCA AGCTTGGACA CAAGACAGGC TTGCGAGATA TGTTTGAGAA 360 TACCACTTTA TCCCGCGTCA GGGAGAGGCA GTGCGTAAAA AGACGCGGAC TCATGTGAAA 420 TACTGGTTTT TAGTGCGCCA GATCTCTATA ATCTCGCGCA ACCTATTITC CCCTCGAACA 480 CTTTTTAAGC CGTAGATAAA CAGGCTGGGA CACTTCACAT GAGCGAAAAA TACATCGTCA 540 CCTGGGACAT GTTGCAGATC CATGCACGTA AACTCGCAAG CCGACTGATG CCTTCTGAAC 600 AATGGAAAGG CATTATTGCC GTAAGCCGTG GCGGTCTGGT ACCGGGTGCG TTACTGGCGC 660 GTGAACTGGG TATTCGTCAT GTCGATACCG TTrGTATTTC CAGCTACGAT CACGACAACC 720
134
AGCGCGAGCT TAAAGTGCTG AAACGCGCAG AAGGCGATGG CGAAGGCTTC ATCGTTATTG 780 ATGACCTGGT GGATACCGGT GGTACTGCGG TTGCGATTCG TGAAATGTAT CCAAAAGCGC 840 ACTTTGTCAC CATCTTCGCA AAACCGGCTG GTCGTCCGCT GGTTGATGAC TATGTTGTTG 900 ATATCCCGCA AGATACCTGG ATTGAACAGC CGTGGGATAT GGGCGTCGTA TTCGTCCCGC 960 CAATCTCCGG TCGCTAATCT TTTCAACGCC TGGCACTGCC GGGCGTTGTT CTTTTTAACT 1020 TCAGGCGGGT TACAATAGTT TCCAGTAAGT ATTCTGGAGG CTGCATCCAT GACACAGGCA 1080 AACCTGAGCG AAACCCTGTT CAAACCCCGC TTTGGGCTGC AGGAATTCGA TAT 1133
1 až 2217
2218 až 2225
2226 ež 3659
5660 ež 3713 popis J ; ;
Bluscript XI SK-sekvence (Stratagene) Nôti místo 1
FIX sekvence v rc orientaci. Otevíená Čted
I obléet zečíná v poloze 3659 rc TAO štart kodónem a končí v poloze 2276 rc AE stop kodonem syntetický časný pozdní promotor viru vskcínie v rc orientaoi obklopený iícol «istom (poloha 3656) e napojené ôglII/BamHI místo (poloha 3703 až 3713)· NcoX místo nes® FIX rc štart kodon TAO
3714 až 4214
4215 a š 4848
4849 až 4856
4857 až 5532 sekvence Ρ7·5 promotoru viru vekeínie
S. coll gpt sekvence· ORF začiná v poloz® 4215 ATG štart kodonem a končí v poloze 4671 TAA stop kodonem
Nôti místo 2
Bluesoript II SK-sekvence (Stratagen©)
Inserce cDNA lldského faktoru IX do j&diného NotXzaiste viru vakcíniei Pred insercí oDNa faktoru IX do viru vakcínie se tato oDNA vloží do plaamidu pN2-gpta· Síská se tak plasiaid pN2gpta-JTX (obrázek 11.1A, sekvence identifikační číslo 72). Pro získáni optimálni souvlslosti sekvenci syntetického promotoru vakcínie oblasti kodujici faktor IX se 5*-*u®pŕekládaná oblast faktoru IX deletuJe zavedením nového Ncol i
místa se štart kodonom faktoru IX a napojením tohoto Ncol místa s HcoX míetera poskytnutým promotorem. Tato mutace vede k mutovanému signálnímu peptidu (obrázek ll.lfí). V prírodní» faktoru IX je druhou aminokyselinou signálního peptidu glutaminový «bytek, zatímco v pN2gpt8-FIX Je druhou aminokyselinou zbytek kyseliny glutemové.
- 127
Nôti fragment, který obsahuje kazety gpt-genu a génu faktoru IX, so ligu j e s vektorovými resónty vakcinie a trans· fektuje se do savčlch CV-1 bunék infikovaných FRV. 2a tšchto pc’dmínek w.ltiplikoval pouzé pakážovený vírus vakcinie. Surové vízové kmeny, které byly pripravený po pčtidenní inkubaci, se ztitrují v píitomnosti a v neprítomnosti mykofe— nolové kyseliny (iíPA). Tlmto postupe® se rozlíši chimérui forma viru od zpétne ligovaného pŕírodního víru. Bylo siH /f ekáno 5.10 plak tvorícich jednotek na 10 hostitelských i 6 bunák v pŕípsdč, že by la prítomna &PA a 5· 10 plak tvoŕlcích jednotak na 10° hostitelských bunSk v pripadá, že nebyla pŕí temne ffi?A. V tomto príkladu bylo asi 1 % z vírových plakú chimerních virú. Deset gpt-pôoitivních isolátú bylo dvakrát vyčičténo pros plak, byly vykultivovány mtiXé surové kmeny a ty byly použitý pro iňfikování CV-1 bur«čk. Celková DHA byla pflprevena s ôsmi bunéôaých kultur infikovaných príslušnými vírovými iaoláty, rosštópenn restrikčními enzymy Sful, Ndel, Nôti a podrobená analýze Southernovýia blotea·.
Sful step, hybridizovaný sondou faktoru IX, umožnil sta novení orieataoe vložené IBA, protože Sful Stipí inserty a— symetricky. Ve všech ôsmi isolátech byly inserty v ’*aH-orientaci (fragmenty o 6J00 párech nukeotidú a 4600 pároch nukleotidú, víz obrázok 11.2). To znamená, že tato konfigu rece je silné výhodná. Ndel (Nôti) fragmenty,byly hybridtoovány také sondou faktoru IX. V tomto pripadá prevažoval fragment o 656 000 pároch nukleotidú (kazeta Nôti génu, o 3300 pároch nukleotidú), což potvrzuje predpovedanou štruktúru.
Exprese lidského faktoru IXt 2 osial isolátú jednotlivých plakú. byly vykultivovány surové kmeny, které se pcužijí pro inílkovánl rúzných ©ovčích bunečných línii. 5·10θ buntik v 10om ŕetriho miskách se infikuje 0,1 pfu/buňku v prítomnosti média bez aera (Dh’fôo) s 50 mikrogramy vitamínu K v 1 ml. Infikované bunky se inkubují 72 hodiny, dokud se bunky nesečnou odtahovot odo dno Potriho aisek. Supernstanty se spojí, bunéčné fragmenty se odstráni odetho^ováním a množství FIX se stanoví sestavou pro test ELISA od firmy
Boehringer íSennhelm, SRN (eeetava číslo 1360299). Knožství antigénu Γ.ΪΧ a aktivity faktora XX jsou uvedený v tebulce 11«1«
Deset läikralltTu súpermi tentu z bunék Vero Ize analyzov s t t;.'ké w@aternovýia bloteal pomoci 50 ng ha FIX odvozeného od lidské plasmy, j s ku štandardu a isyšího polyklonálního séra eneoifickoého pro hu FIX (Axeli)· hloty byly obsrveny konjugátei» alkalické foafctssy s kozím protimysim polyklonálním serem (Dekop©tte) a NBT/BG1P jako eubetrátem. Jak ukazuje obrázek 11· 3, rekosabinertní materiál migroval jako široký pá© podobný st-ančerdnímu faktoru IX odvozenému od plešiny· Srážecí testy částečnč vyčleténého faktora IX ^ôzeného od bunék Vero akázály, že asi 50 % materiálu je aktívni faktor IX. Vírový isolát číslo 5» ktorý je označen vF'XX Č. 5» byl kultivován ve velkém mexdtku a byl pouŽit pro dalsí pokusy·
Jako v pripadá ahiaernÍGh vlrú proteinu S (príklad 10), faktor IX, který expreeí poskytuje chiméry, mól inserty v jedné výhodné orientaoi.
i ' ' ' l
Frdtein gonu, o ktorý nám jdo (faktor IX a protein S), byl tranakribován sprava doleva, t j· ve stejném smšru jako gény nahroimsdšné kolem mista fíotl. hdá se tedy, že silné tranekribovaué jednotky musí být séra ženy ve výhodné® eméru transfertpo®, jestliže se klonuje do oblasti Notl· Víry s touto konfigurecí, o které jde, jaou silné výhodné a výkazují nejlepSí rastové vlastnosti· Smés tranfcripce kazety druhého génu, P7.5-gTPt-genu, byl zleva doprave· Segment F?· 5 promotoru j© tedy v InvertOvé opakovací konfigunaci vzhle.1 dem k vediejžírnu ©ndogenníiau, génu, který kóduj© protein o molekulové hmotč 75θΟ, tj. pčekávaná stabilní konfigurace je výhodná. Jelikoä nebyly nalezený žádné chiméry s opačnou orientací, ’V’-orientace je! pravdepodobné nestálá· Vložení skôr© uvedených kazet génu v ”b’*-oriontaoi in vivo rekombinecí by selhalo. To vede k jshybnému vysvetlení, že intergenové oblest Hotl j© podstatná pro vírový rúst· Tato situaoe ilustruje jednu z výhod prístupu piixaého klonovánií tvorí B© pouze dovolené” etruktuty.
·<···. • '' 'ľ - i . ’',.· ' >·.. ... -ť ' -129-
t. .
'□.ožením knzet jediného Holého génu se získají obô orientaoe a multimery (príklad 1), za tíme o vložením kezet slo— žitého génu (ráznč traÄcribované kazety dvou genú s homologfe· emi vnitfních gená, jako je napríklad segment P?«5 promotoiu) se tvorí výhodné štruktúry.
ľestování bunék na optimálni expres! faktoru XX ukázá— lo, že infikování bunék CV-1 a SK Hopi vede k nejvyšším hladinám antigenú. Materiál z bunék CV-l mél nejvétší urážecí účinnosti (tabulka 11.1), což ukazuje, že tato bunečná línie má účinné post-transleční kodifikační systémy. Eaktor IX byl již dííve získáván v konvenční vakcín!í expres! pomoci
57.5 proaotoru a bunék HepGŽ e BHK (dc le Šalie a äpol., 1985). Bunečné línie e lepšími rústovýml vlastoostmí, jako jeou napríklad bunky Vero aÍQV-lj poskytovaly vyšší úboven exprese u zde uvedených vird dlhy zlepšeným promotorúm s zpňflobám. Nevie se zdá, že delece 5'-neprekladané oblasti cl>NA faktoru XX a modifikBcé eignálního peptidu maj! pošití vní vlivy ns úroveň sekreoe a exprese· ' I
Tabulka 11.1 i
Exprese faktoru IX v rúzných bunečných liniíeh bunéčná line ATOC č. antigén i aktivita pomír(%) (mj</10* bunék) SK Hepl (HTB52) 310 ; 133 22,5 Vero (0CL81) 500 : 282 56,4 Chnng j. (CCKL3) 190 100 52,6 ov-i (OCL?O) 850 129θ 151,8 11K13 (00L37) 300 460 153,5
1?7*5 vakcínie) e použiji se pro in vitro molekulárni klonování a pekážování jak je to popsáno v príkladu. 10. DalSÍ vlastnosti tohoto plasmidu jsou uvedený v následujíoí tabulee«
Plasmid pN2gpta-FIX (5552 páŕú nukleotidú) (sekvence identifikační číslo 72) uiaístení:
1’ .'t!·
Analýza s© ladže provádet tiské tak, že se 10 yul super— na ta a tu bunek Vero analyzuje T/eeternový® blotovánis so štandarde® 50 ng proteinu S odvozeného od lidské plešiny a s ajršía polyklonálním eere® špecifickým pro “hu Prot S Axeli) (obrázok 10.3). Blotý se obarvi kozí® proti-myšl® polyklonálním aere® konjugoVaoým s alkalickou fosfoatasou (Dakopatte) a NBT/BCIF jako že se 10 /U1 super— cubatrátem.
Vyčistení rekombinentnihp pro t sinú S ze supernat&ntá bunščné kul tury se provédí podie neÍlom a cpol· (1990)« posilu popsanéhc Grin<
Tabúl ks 10*1
bunečná línie ATCC č. ajednotgk LuProtS na 10b bunšk SK Ropl (HTB52) r 750 Vero (OCL 81) , 127 vhang, ja tern! (CCL 1J) 155 CV-1 (CCL 70) 450 WI 58 ícci, 75) [ 440 ) i Príklad 11 j i 1 ’ '1 Konstrukce nových chimérnich' víru vakcínie kodujicich lid-
ský faktor IX a exprese rekodbinantního faktoru IX
Ί která obsahuje cDNa lidského gén, každý kontrolovaný pramotore®
Kazeta se dvéma gény, krevního faktoru IX a gptvakcínic, se klonuje do jedinečného mís ta Notl genomu. víru vakcínie iTH o pakážuje se ý srivčích bunkách infikovaných pomocným virexa drúbežlch neštovic. Lidský faktor XX byl získán expresl v nekolika typeoh bunék.
tí I í!
Ί
Lidský srážecí faktor EX je glykoprotein o molekulové hmoté 56 000, který se účastní fcegulace erážení krve. Tento p — JL· Ά J -Λ- * ..J ·. >· t *- l _ » _ lť !*!U L . — - . . ... * V . . _ . · · j» a * . > .
_ _ · . ' !,T
L. . 1.____1_________„L- ___‘
V,|| výoh zbytkú, glykosylaei, iHaydroxylsci kyseliny aspareI i
„ _ „.. <>-v—--------“-----------’ jJ> __·»__ ___ťy__> a_______ Λ_. a_ „ - w v — —” ππτ —---—™- — --j srážecí faktor podléhá složitým posttr©nelační® soďlfikcclm:
na vitamínu K· závislé hptóboxylaci prvních dvanásti glutomových zbytkú, glykosylaei, J-biydroxylsoi kyseliny asparcgové a opracování proteinu n©«mínové® konci ÍDavle E i
f” ,u f
“Th© Blood Copgulstiom Fec
I
I .p 1 i;ore s íTirombosis, Colraan R porucha krvácivostl související II _
Theír cDNAty Gen.es end Ex* . ' ' '% W*f Hiršh
1 až 2217
2218 b š 2225
2226 až $938
49J9 až 4992
4993 až 5*93
1 ide ký protein S (vPratS) a exprese rokombinantního proteinú S
Tento príklad ilustruje konstx-ukci rokombinantuiho proteinu St který se ziskává expres! chimerním virem vakcinie. Lidský protein S J© glykoprotein o molekulové hmoté 70 000, který funguje pri rogulaci srážlivosti krve (DiSoipio s spol.; SlocheMstry 18, 89 až 904 (1979)·)· cDNA > genomová DIU proteinú S byly Monovány%h6 rektor izovúny Mndwall a spol. t Proo. Mati· Acsd. Sci., USA 83. 6716 (1986), Hoskins a spol·t Proc. Natl. Aoad.· Sci., USA 34, y^ (1937), Ebenhardt a spal.: Biochemlstry 29, ?351 (1990) a Sahmidel a sppl·: Biochemistry 2£, 7345 (1990).1.
Brdský protein S, normálne syntetizovaný jako protein o molekulové hmote 23 000 v jatoraíoh a andotíheliáliích bunkách (DiScipio sován ve stálých 293 bunék a bunčk línie adenovirem) za den (Grimell a tému mycích 012?
a spol·: shoi*a uvedená cita.ce.·) . jíé expre? · bunečných liniích odvozených od l^dských kvočku (trsasformoveriá búaéčná v hladinách 7 mikrograiml na 10° ^uiiek spol.: 31^1 76. 2546 (1990)·) nebo y eysbunčk/virus papilomu v podobných hladinách exprese Ofclag spol4 Eur. J. Bioohem. 187, 737 (1990}.).
glykosylaci.
Protein, který byl odvozen od pozdžji uvedených búnšk, l^yl vétší než protein S odvozený z plasmy, možná číky odchylné
121
Zde uvedená exprese proteínu S používá koze tu se dvéma gény obsahuj í cí komplementárni D1M 1 ide kého krevního faktoru proteínu S e gnt génu, v obou pfípadech kontrolovaných promotorem vakcíníe· Tato kazeta byle klonována do jedinečného mís ta Notl a py.kážována v savčích bunkách infikovaných pomocným virem drubezlcli neštovic· K expres! lidského pro· telnu S v infikovaných .bunkách Vero dochází v urovních čtyri až éest mikrogramú na 10 bunék·
PM testování bunek na optimálni expresi proteínu chimerním virem vakcínie se použije pčt riizných liostitelsl^ch bunečných línii, Pi J8 (lidský mebryonální plieni fibroblaet), bunky 0V-1, bunky Vero (bunky ledvin opič), jaterní bunky Ohang a SK Hepl. Prot©in S byl nerozlíšiteiný od proteínu odvozeného z plasmy podie aékolika kritérií s rekombinantní materiál odvozený od infikovaných bunčk tét-o bunečné línie vykazoval stejné elektroforetick© migrační sestavy a stojné chromá tografic ké ©lúčni profily jako proteín S odvozený od plasmy. To ukazuje. Že došlo ke správne post-translsční modiflkaci tohoto kumplexního glykoproteinu. ^yto zpásoby jsou podrobnéji popsány níže*
Konstrukce plasmidu pN2—gpta-FrotSs jednovláknová DNA, která se pripraví z plasmidu pBluescript-ProtS a která obsahuje cDNA kodujicí lidsky proteín S (poskytnutý H· T. A· *AjGillivrayem), se pôuáij© pro mutsgenizování oblasti kolom translačního štart kodonu oblasti kodujicí proteín S v Ncol mleté (OQATGG). iáutagenní príšer o^rotSl (sekvence identifikační číslo 63) má sekvenci 5'—AGC GAG GAG GGC CAT GGG GAA GCG OGC-3*· Bäutagsnese se provádí podie postupu, který je uveden v mutagenízaČnim protokolu (Amershaa, Inc.). Signálni paptid je mutován tak, že se druhá aminokyselina zmení z Arg na Ala (obrázek 10. lô a sekvenoe identifikační číslo 77 a 79)· Tím so zavede fícol místo, které je potrebné pro dalčí klonování, a ATG štart kodon se vuese do optimálni polohy pro trauslaoi. Tím se muže zlepšit sekreo© proteínu S· c .'DM A proteínu S se pak vystrihne jako Mcpi-Notl fragment a vloží se do insertního plasmidu pTKgpt-sel? vakclnie ' -122 - ·' ” ·'/ (Falkner a spol·» vis výše.). Získa se silný syntetický promotor vakcínie. Kase ta promotor-gen proteinu S se pak vystrihne jeko BglII-NotI fragment a vloží se do plesmidu pN2-gpt© (príklad 1)· Zlská se tak pleacíd pN2-gptaProtS(sekvenoe identifikační číslo 67)· Ďalší vlastnosti této konstrukee jsou uvedený v následující tebuloe·
PlfisMd pNP-gptsľrot 8 (6311 pári nakleotidô) (sekvence identlfikaôní číslo 63·) umístén!»
1 fiž 5357 2306 až 2851 2851 2395 3081 ež 5523 3358 až 3526 3527 až Λ2ΖΖ
J222is___________ pS2gpt—84 sekvence rcCDS E* ooli gpt génu
T rc iníciačního kodonu TAC gpt génu
A rc stop kodonu TTa td 17· 5 proxnotoru vakcinie sekvence P2 proxnotoru podie evropské prihlášky Avipox intergenic región” pS2gpt-S4 sekvenoe'~
Plasmid piäNenv2s Plasmid pWenvl poskytl R, Gallo (Nstional Cencer Inštitúte, Bethesda, Meryland). Obsahuje gpl60-gen HIV W-kmene klonovaného jako EcoRE-Pvall fragment o 3100 párech nukleotidä w vektoru pSP?2 (Proatôga, Inc·)· EooRI-Asp?13 fragment o 600 párech nukleotidd z pMKenvl se nahradí EcoRI-Asp718 frfigmentem o 130 páreoh uukieauidu.
Odstráni se tak velké části 5*-nepbekládané oblasti gp!60genu. Tento fragment o 130 páreoh nukleotid^ se generuj© PCfí použitím plasmidu pWenvl jako teaplátu a oligonukleotidu P-MN(l) a P-W(2) jako priserd. První primer P-MN(l) zavedl navíc xaísto Stul jeden pár nukleotidú proti smčru vlákna štart kodonu· Sekvence IM® (1) (sekvenoe identifikační číslo 43) je sekvenoe 5 '-AGCTAGCTGA ATTCAGGCCT GATGAGAGTG AAGGGGATCA GGAGGAATTA TCA-3Í sekvenoe 1MS(2) (aekvenoe identifikační číslo 4$) je sekvence 5 '-OATCTGATGC AGAAAATAGA GTGGTGGTTG-3*· Výsledný plasmid se označí pWenv2, Pro vyloučení caitací byl PCK generovaný fragment in tomto plasmidu sekvenován primery P-eeq (2) (sekvence identifikační číslo 50) 5*-CTG TGG GTA CAO AGG CTT GTG TGG COC-3* a P-Seq(3) (sekvenoe identifikační číslo 51) 5*-CAA TTT TTO TGT AGC ACT ACA GAT C-30
Plasmid pP2-gpl60W: Stul-Pvull fragment o 2700 párech nukleotidá obsahujicl B® gpl60-gen, který byl isolován z plasmidu pMNenv-2, s© vloží do Hpel místa plasmidu pS2gpt-P2.
Získá se tak plasmid pP2-gpl60MN (sekvenoe identifikační číslo 69).
- 113 Ghimernl víry vP2-gpl60^A e vP2-gpl6Q^B byly skonstruovány násleäujícím postupe©? Smal-fragment, který obsahuje kazety P2-gpl60 ® p7.5“gpt»g3n, s© vloží pŕímýin raolekulárním klonováním do jediného Smel místa hostitelského kmene vdTK vakcínie (príklad 4). Sískají se chiaerní víry v?2-gpl60^4 a vPa-gplôOjg^B (obrázok 9.2). vdTK viru vakcínie z príkladu 4 se rozštšpí v jediné© Smal míaté a liguje se se Satósety fragmente© o 4000 párech nukLeotidu, který obsahujeVí-7.5gpt gen e P2-gpl60-gen. Kaen WR 6/2 vakaínle se rozštépi v jediné© Smel místé (Noti) a liguje se se Sňal (Nôti) fragnentea o 4000 párech nukleotidii, který obsahuje kazety P/.S-gpt—gen a P2-gpl60-gea. Postupy klonování jsou ahore popsány v príkladu 1. Ve víru vF2-gpl60^A ee gpl60-gen trabskribuje ve stejném améru jako gény kolem vírového génu thymidln-kinaay. Ve víru vPS-gplôO^B se gen gplGO transkribuje v opačném smeru. Jelikož vlivy polohy génu nohou ovlivn.it hladiny exprese v konstrukcích vakcínie, Srna! (KotI)-fre@Beut se také vloží (obsahující kazety p2-gpl60 a E/.^-gpt-gen) do Smel (Nôti) Msts kmene O 6/2. Pakážování in vivo se provádí podie shora popsanéhc príkladu 3.
Štruktúra ohimerních virôJ Pro potvrzeni teoretických struktur chimerních virô (obrázek 9.3) by la prevedená analý*26 Southernovým blotovánlm. DNA vyčistených vird se roštépi pôsobením Pstl. Výsledné fragmenty se rozdôlí na agarosovém gélu, pŕenesou se na nitrocelulosovou membránu á hybridizují se sondou génu thymidin-kinasy (tk) a gpl60-genu. U sondy tk-genu v pŕípadč vPk-gplGO^A jeou viditelné predpovčdčné fragmenty o 6900 pároch nukleotidô a 14 300 párech nukleotidú.· U vP2-gpl60^B jsou viditelné pŕedp^ovédéné fragmenty o 8700 pároch nukleotidii e 12 500 párech nukleotidú. U sondy ^gl6O-gonu (pMN envl) je viditolný predpovčdéný fragment 0 14 300 párech nukleotidô u vPa-gplôO^A e o 8700 párech nukleotidii u vP2~gplG0^B. To potvrzuje integraci kaze t cizích genô ve dvou r daných orientácie©·
Štúdie expres© s chimerními víry vP2-gpl60^,A & vP2—gplGO^Bt Pro srudie exprese byly vy brány bunky Vero. kultivace bunšk, infikování chimér nimi viry a čištení xe-
- 114 kombin&ntního ρ^160 proteinu so provádí tak, jak je to popsáno shora Barrettem a spol·
Veeternovy bloty gpl(iOs Wsternovy bloty se provádejl v podstate tak, jak je to popsáno Towbinem a spol.e Proc. Natl· Acad. Sci. USA 33· 6672 až 6676 (1979)· Prvnl protilátkou je myší monoklonální enti-HIV-gpl2O protilátka (Du Pont, Inc. č· NSA 9505) používaná ve zŕedéni 1 i 300· Druhou protilátkou je kozí-protimyší IgG (H+L) kondenzovaný s alkalickou fosfetasou (BioRad. Inc·, Č. 170*6520) používaná v© zŕedéni 1 : 1000. Reakční činidla (BCIP/NBT) a postupy vybnrvování jsou od firmy Promegs, Inc·
Konctrukc© plasmidu pselF-gplôOM a oliimerního viru vselP-gpl60|^ i V tomto príkladu byl použit syntetický časný /pozdní promotor sali? (sekvence identifikační číslo 70) (S« Chakrabarti a B. žtoss, víz evropská patentová prihláška číslo 91 114 300,-6, Rakombinantni vírus drú. beží c h neštovic), který je jedním z nejsilnejäíoh známých prwaotorú. viru vakolnie pro expres! gpl60-genu kmene HIV-1 ž®. Dejdŕíve se zkosntruuje plasmid pselF-gpt-L2 (obrázek 9*4)· Tento plasmid obsahuje selB-promotor, po nemž náslectoje násobné kloiiovad misto pro inserci oizích genô, buď jako úplné nebo neúplné otevrené Čteoí oblasti, a translační stop kodony ve všeoh čtecích ŕázích následôvané časným trsnskripčním stop signálem viru vakoínie, ΤΤΤΤΤΝΪ (Rohrmann a spol*: CeU 46· 1029 až 1035 (1936).). Kazete P?.5-gPt-gen j© umísténa vedie promotoru a slouží jako dominantní selekčni marker (Felkner a spol.: J· Virol. 62, 1349 iž 1854 (1988).), Kazety selSHprozaotor/marker jsou obklopený mlaty Štépení restrikčními endonukleasami, které jsou jedinečné v genouni víru vakcín! e (Sfil, Nôti, RsrII) a mohou být vystŕiženy jako fragmenty se zarovnanými konci (napríklad stépením púsobením Hpal a SnaBI). Aby bylo možné vložit gpl60-gen do pselD-gptXi2, zavedie se kolem translečnlho štart kodonu místo Ncol. Tato mutsce vede k substitucí aminokyseliny arginin (AGA) aleninsm (GCC)· Tato rautsoe v druhé aminokyselina signúlnlho peptidu prsvdépodobno neinterferuje s účinnou expresi gpl50-genu· Postup klonování a sekvence okolo pŕírodního a
- U5 e modifikocaného gplGQ-genu je nsstínéna ne obrázku 9.5. Aby se tato ciuteoe zavedie do gpl60-íenut byl zménčn PCR-generovaný eousední fragment. Konštrukcie plasmidá je podrobneji popsána níže.
. I
Plesiaid pL2s Pri konstrukci pleamidu pD2 se Xbal—Clal fragment plasmidu ρΤ&3 o 600 pároch nukleotidú (^oss e spol.: Rature . 91 (1990).) substituuje Xbel-Clal adsptorovým fragmentem aestávajicím z ^nelovených oligonukčeotidú o-5*2 (sekvence identifikační číslo 52) 5*-0GA TTA CGT AGT TAA CGC GGC CGO GGC CTA GCC GGC CaT AAA AAT-3*e 0-5** (sekvence identifikační číslo 53) 5*-CTA GST TTT TA T GGC CGG CTA GGC CGG GGC CGO GTT AAC TAC GTA AT-3'. Výsledný pla smi dový meziprodukt, který se získá z tohoto stupne klonováním, se nazývý phl. AatlX-Sphl fragment o 8*0 pároch nuklootidú (části nekodujících gpt-sekvencí) se substituuje AatlX-Sphl adeptorovýa fragmente® sestáva jícím z a ne lovanýc h oligonukleotidú o—5*1 (sekvence identifikační číslo 5*) 5'-CTT TTT CTG CGG CCG CGG AŤA TGG CCC GGT CCG GTT AAC TAC GTA GAC GT-3* e 0-5*3 (sekvence identifikační číslo 55) 5*—CTA CGT AGT TAA CCG C~AC CGG GCC A TA TAG GCC GCG GCC GCA GAA AAA GCA TG-3*. Výsledný plesiaid se nazývý pL2.
Plasnid pTZ-D2i Xbal-Sphl fragment (sestávající se segmentu T7-promotor-EMC-T7-terminátor, násobné klonovací místo a kazeta P7.5-gPt-gsn) se nechá zreagovat s klenowovou polymsrasou a vloží se mezi PvulI místs plaemidu pTZ19R (Pharntacia* Inc.), Výsledný plaamid byl nazván pTZ-L2 (sekvence identifikační Číslo 64). D©lši vlastnosti to— hr to plasmidu jsou uvedený v tabulce níže.
Plasaid pTZ-L2 (4701 pár ú nukleotidú) (sekvence identifikační číslo 6*)
umístänís 1 až 55 56 až 108 popis: pTZ19R sekvence (fharmaeia) linker I v rc orientsci (5TNT, Nôti, Sfil, RsrIX, Hpal, SneBI a AatlI)
116
110 až 360
361 až 1338
1339 až 1344
1 až2226 pK2gpt-S4 sekvence sekvence identifikačního čísla 14. Poloha 1 odpovídá prvnicni nuklcotidu G 5*-TGGCACTTT TCGGGGAAAT—J*·
2227 až 2236 Smal-adaptor 5*—CTAGCCCGGG—3'
2396 až 2851 rcCDS E.coli gpt génu
2851 T ro iniciačního kodonu TAC gpt génu
2395 A rc stop kodonu TTA
3081 až 332? ro Ρ?·5 promotoru vakcínie
3358 až 345i 84—promotor sekvence identifikační číslo 14 (oligonukleotid B-artP(9) viz strana 8L2 )
2237 a ž 4145 pN2gpt-S4 sekvence sekvence identifikačního čísla 14
Plasmid pS2gpt-P2: 34-promotorový segment plasmidu pS2gpt-S4 se odstráni štäpeníia pôsobením PstI a Hpal a nahradí se PstI—Hpal P2-promotorovým segmentom o 172 páreeh nukleotidô. Tento promotorový segment se generuje PCR plasmidom pTZgpt-P2a (Falkner a spol,: evropská patentová prihláška číslo 91 114 300.-6, 26» srpna 1991) jako templát a oligonukleotidý P-P2 5'(1) s B-P2 3*(1) jako príšery. PGR-produkt byl rozetepen pôsobením PstI a Hpel a ligován s velkým fragmente© plesmidu pS2gpt-S4 rozštépený© pôsobení© PstI a Hpal. Sekvence P-P2 5(1) (sekvence identifikační číslo '44) je: 5*—GTAOGTACGG CTGCAGTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAG-JÍ sekvence B-P2 3*(1) (sekvence identifikační čísle 45) je: 5*-T0TGACTGAC GTTAACGäTT TATAGGCTAT AAAAAATAGT ATTTTCTAGT-3*· Presná sekvence PCR fragmentu byla potvrzena sekvenováním konečného plasEiidu, označeného pS2gpt-P2 (sekvence identifikační číslo 63)® Jako sekvence prlmeru byla použitá P-SM(2) (sekvence identifikečničíslo 4^, 5*-6TC TTG AGT ATT GGT ATT AC-3*s P-SM(3) (sekvence identifikační číslo 47), 5*-CGA AAC TAT GAA AAC GCT TTA TG-3*. Ďalší vlastnosti plasiaidu pS2gpt-P2 jsou uvedený v následující tabulee.
- 112 Plasxaid pS2gpt~P2 (4277 párá nukleotidá) (sokvonce identifikační Číslo 6J) umlstční
1 až 3529
2396 až 2851
28>1
2395
3084 až 3323
3358 ež 3526
3534 až 6001
3534
6102
6173 až 6926 popíš___________________ pS2gpt—P2 sekvence roCDS E. celí gpt génu
T rc inicicčního kodonu TAC gpt génu A rc stop kodonu ΤΤΑ rc Ρ7·5 promotoru vakcínie sekvenc© P2 promotoru podie evropské prihlášky Avipox Intergenie región”
CDS HIV-1 kmene W gplÔO sekvenc© (Ma ID HBEGmflíC)
A iniciačního kodonu ATG z gpl60®
T stop kodonu TAA z gpl60W pS2gpt-P2 sekvence
Plasmidy byly tkonstruovány následujícími postupy.
Plasmid pS2gpt-S4: Plaemid pN2gpt-S4 (príklad 4) se rozštepí pôsobením Xbal a ligu j e se Smel-adept or em (sekvenoe Identifikační Číslo 43: 5'-CTaGCCGGGG-3') deaktivujícím misto Xbal a tvoŕicím misto SmsI. Výsledný plasmid se oznsčí pS2gpt—S4 (sekvenoe identifikační číslo 62). Ďalší vlastnosti plasraidu jsou uvedený v následující tabulce.
- 111 Basmid pSRgpt—34 (4145 páril nukleotldô) (sekvence identifikační číslo 62) umistení: popis:
1 a obrázok 4.6,
Konstrukce pla smidu pNJgpt-S^A: Rodičovský olasaiid pN2gptb se rozštep! pôsobením PstI a Ciel a liguje se se sekvencí syntetickým linkerem sestávájícím z ollgonukleotidú P-artP(7) & P~artP(3) (sekvence identifikační číslo 40), Výsledný plasmid s® označí pN2gpt-S3A#
Seke^hoe syntetického promotoru plesmidu p$2gpt-S3A (odpovidajicí oligonukleotidu P-artP(7) a dvacet nukleotidá 5 - a 3*-obklopujících oblastí z pN2—gptb jsou uvedený pro pN2gpt-S>A v sekvenci identifikační číslo 13. Vložená ΓΚΑ sekvence zacíná v poloz® 21 e končí v poloze 107 (První MT zbytek na 5*-konci odpovldá poloze číslo 3323, poslední ”An zbytek na 3'-konci odpovídá poloze číslo 3454 plasmidu pN2gpt-S5A.)·
Konstrukce plaamidu pH2gpt—S4í Plesmid pK2~gptb se rozštep! pôsobením ?BtI a ClaX s liguje s® a sdaptorovou sekvenci sestávajicí z oligonukleotidu P-artP(9) e P-artP(lO) (sekvence identifikační číslo 41). Výsledný plasiaid se označí pN2gpt-S4,
Sekvence syntetického promotoru z p.H2gyt-S4 (odpovídá91 jíci oligonukleotidu F-ar tp) e dvacet nukleotidú 5*« a 3*obklopujícich oblasti pNSgptb Jsou uvedený pro pN2gpt-S4 v sekvenci identifikační Číslo 14, Vloáoná DNA sekvence žací ná v poloz© 21 a končí v poloz© 114 (Pivní **T’’ zbytek na konci odpovidá nukleotidú číslo 3320, ^bledni A zbytek na 3-konei opodpídá poloz© nukleotidú číslo .3461 plasmidu pK2gpt—SA»).
Príklad 5
Exprese polypeptidú ve vektoru vakcinie (vdTK) prímou molekulárni inserci kaze t exprese génu
Tento príklad demonštruje snadnost, s níž mohou být klonované gény vložený do vektoru (vdTK) viru vakcinie podie tohoto vynálezu pri ryohlém vy tvorení konstrukci exprese viru neStovie pomoci primá molekulárni inserc© kazet exprese génu popsaných v príkladu 4. Zde je popeáno použití systému vdí'K vektor-kazeta pro vytvorení konstrukcí expresu j í c í ch nékolik príslušných modelových polypeptidá včstné lidských krevníoh proteinú (protrombin e varianty plasminogenu) a antigénu lidského viru (HIV gplGO).
Konstrukce modifikovaného viru vakcinie (vFTl), který expres! poskytuje lidský protrombin# Lidský protroisbin (PT) slouží jako model pro expres! cizího proteinú ve vektoru viru vekcí í© pol^e tohoto vynálezu. Dŕíve bylo ukázáno, že e DNA kóduJíci protrombin je expresov© čelná konvenčné zkonstru ovaným rekombinantním virem vakcinie, Jak je to poďpáno v patentové pŕíhláäc© PCT/EP91/OO139 (Palkner a s pol.
(rslknerova prihláška”.), tento celý popis J© zde zahrnut jeko eitace.
Modifikovaná protrombinová cDŇA se vyätlpne jako EcoSX fragment o 2006 párecl^nukleotidú z plasmidu pTKgpt-PľHBb a vl<>» ži se do jedinečného EcoRI místs plasmidu pAl-Sl (Príklad 4t obrázek 4.4). Získá se tak plasmid pAlSl-PT (obrázek 5.1).
V expresní kazete tohoto plasmidu je protrombinová oDNA ŕízaníä syntetickým promotorom SI víru nestovic, který to ké poskytuje translsční iniciační kodon.
Sekvence lidského protrombinu je publikována í Degen
S. J, F., ^«cGillivray R. T. A. a Davie E.i Bioohsmistry 22, 208? až 2097 (I903). Tato sekvence j© dostupná z EMBO Data Library pod identifikátore® (ID) HSTfíRl. Sekvence v ID HSTHR1 nen! úplná. Chybí ji prvních 19 párfi. nukleotidú oblasti kodující protrombin. Autori tohoto vynálezu sekvenovali Ghybčjicí část c DNA v ID HSTKR1 a výsledek je zde uveden níže. Vzhledem ke innoha modifikacím s zmenám nukleotidú je úplná sekvence zde uvedeného cJW klanu lidBkého protrambinu včetne SI promotoru a dvaoeti nukleotidú obklopujících sekvenci plasmidú uydena v sekvenci identifikační číslo 13.
Konštrukční®! stupni nastínénými ve Falknerové pŕihláäce. (PQ'ľ/EB-91/00139) s© cDNA modifikuje následujícím zpúsoberní zavedou se dva dslčí kodony (nukleotidy Č. 22 až 27), goŽ vede k inkorporaci dvou nových aminokyselín. 5'-Kepre kládaná sekvenc© se odstráni zavedením BcoRI aíetas nukleotid číslo 1965 až 1965 (č. 1920 až 1922 ID MRI) se zmení z TGG na GAA místné rízenou mtagenesi.
Jedna zmčna pi/áú nukleotidú byle nelezene v PT-oWA. To vede k novému mlstu N^cIí nukleotid Číslo 52$ (číslo 432 v ID MSTHR1) je zmenén na A z C. V tomto pripadá jde o tichou mutaci, protože kodon OCO (Pro) je zrnénčn na CCA (Pro), coä vede k novému místu NcoX. (První nukleotid sekvenc© identifikační číslo 15 z pAlSh-PT odpovídá nukleotidú číslo 2394, poslední nukbotid odpovídá nukleotidú č. 4 >31 úplné sekvence plasmidú pAlSl-PT).
Pro prenos do vektoru vdTK vakcínie se fezeta vyštípne z plasmidú pAlSLPT pôsobením endonukleas Nôti e Rsrll a isoluje s© po delení na gélu nízkotajfaí agarosy. DNA vektoru vdTK viru se rozštep! púsobením Nôti a Rsrll, extrahuje se fenole® a vysráži s© ethafcolem· Bčhem stupne srážení ethanolem se ztretl malý NotX-BsrlI spojující fragment násobného klonovflcího mista DNA vektoru, feuaónfe vektoru vakcínie se ligují s dvacetinásobným molárni® pŕebytkem kazety. Pakážování ligované DNA viru vakcínie pomocným virem drúbežích neštovic v kuracích bunkách je popsáno v príkladu 3.
- 93 Pakážované víry z plodil získaných infikovaním íľV-l bunék jsou plaky opát vySistené& Pripraví se tak malé silové kmeny· Vírové isoláty ae mohou dále analyzovat Southernovým blotovánÍEi a analýzou expresl, jsk je to popsáno ve Falknerové pŕihlášoe. Vírový isolát, který má správnou gonoinovou štruktúru pro ineerci c DNA protrombinu, se označí vPTl. Podobný rekombinantní vírus vakcínie, ' který se pripraví získaním markeru, indukoval expresi protrombinu v bunkách Vero na úrovních aktivít asi 50 až 60 Mlijednotek/ml supernatantu bunečné kultury. Viz Falknerova prihláška.
Konstrukce víru vakcínie (vGP'gl), který expres! poskytuje lidský glu—plfiEffiiinogenj Aminový konec prírodní formy plas•uinogenu (Fg) zečíná aminokyselinou glu (glutsmová kyselina). Nezývá se proto glu-plasminogen (glu^-Pg). Částečno opracovaná forma plcamino génu, které chybí prvních 77 aiainokyselín na aminovém konci (aktivačnl peptid) se nazýva lyeplasmlnogea (lys-Pg). Afinite lys-Pg k jeho substrátu fibrínu je mnohem vyšší než afinita glu-Pg, Ksvie, rekombinantní lys-Pg je značne stabilnejší než glu—g v supernatantech bunečných kul tur inf i kovaných (konvenční®) rekombinantnÍBi rekombinéntem vakcínie neeoucim gen glu-Pg.
Úplná c DŇA lidského plasminogenu (včetné transleôního štart a stop kodonu) se vyštípne z plasmidu. (phPlas-6) jako Ball-Smal fragment. Sekvence lidekého plaaminogenu jiá byla publikovane Forsgrenem fei, Radenem B., Israelssonem M., Lsrssoneín K. a Hedenem L, 0. t FEBS Lettere 213, 254 až 260 (1937). Je prístupná z EMBO Data Idbrary (GenBank) pod identifikátore:®. (ID) HSPKGR. Sekvence tohoto □fesĽiidu tedy nebyly zarazený ve zde uvedené sekvencl, protože tento plasmid není jediným sdrojem sekvence DNA plasminogenu. Kodující oblast táto sekvenc© plasisinogenu se však Uší od publikované sekvence alespoň v jednom nukleotidu: Zbytek A” v poloze číslo 112 (ID BSPíáGR) odpovidá zbytku G v DŇA zde uvedené, což znamená substituci aminokyslin (I^s^Glu).
cDNA plaeainogenu se vloží do Hpal místa plasmidu
- 94 pN2gpt-S4 (príklad 4, obrázek 4.7)» který byl vybrán pro zkonstruování kazety exprese génu se selektovstelným markerem, protože cDNA plasminogenu obsahuje dvč Apel místa e jedno RsrII místo e nedovoluje tedy použit kazety exprese navŕšené pro násilné klonováni. Výsledný plssmid byl označen pN2gpt-GPg (podie obrázku 5.2)·
Oblast napojení promotoru S4 zahrnujicí iniciační kodon plasminogenu (nukleotid číslo $2 této sekvence» nukleotid č išlo 55 v IB HSPMGR) je pro pN2gpt-GPg uvedená v sekvenci identifikační číslo 17. Kódujíoí oblast glu-plasminogenu byle v seznamu setesncí vynechána. Tato sekvence pokračuje stop kodonem (nukleotid č. 55 této sekvence, nukleotid číslo 2435 v ID HSPMGR) a dvaoeti péti nukleotidy 3*-nepŕekládené sekvence plasxainogenu. Po této sekvenci nasleduje 29 nukleotidu násobného klonovacího místa phFlasô a dvaoet nukleotidô násobného klonovacího Biísts plasmidu pN2gpt-S4.
Aby se prebdie kazeta génu glu-plesaiaogenu do genomu víru vakcinie, Nôti fragment plasmidu pN2gpt-GPg, který obsahuj® dva gény a jejich promotory (F7.5 promotor kontrolující gpt-selekcní marker e S4-promotor kontrolující gen glu-plasminogenu)^ se isoluje z gélu nízkotající egarosy a vyčistí se. Tato kazeta se liguje s reménky vdTK DNA viru vakcinie rozštepené pôsobením Nôti. Pakážování a čiäténí pŕes plak je popsáno v príkladu 3· Vírus, který má správnou strukturu vložené kazety génu plssminogenu, se označí vH2gpt-GPg. Tento vírus se použije pro expres! plasminogenu v bunkách CV-1, jak je to popsáno pro analogický virus vakcínic skonštruovaný technikami zíkánl xaarkeru. Sekretovaný glu—Pg v eupernstantech bunečné kul tury byl detegován ns úrovni asi 1,5 yUg/ΙΟθ bunék 24 hodin po infikovaní konvenčné skonštruovaným virem vakcinie za stenderdních podminek kultivace vektoru viru vakcinie pri expres! oisiah proteinu v kultuŕe buisok. Glu-plasminogen v supernatnntu kultury bunek byl detegovstelný pouze v prítomnosti inhibitoru proteasy (5D mikrogramú na mililítr aprotininu).
Konstrukce viru vakcinie (vU;gl), který expres! posky- 95 tuje lidský lys-plaaminogen: Sekvence, která kóduje lys— plasminogen, se pripraví delecí oblasti o 231 páru nukleotidá kodujících prvních 77 eminokyeelin (Glu 1 ©ž lys 77) plssminogenu s úplné cDNA plssminogenu, jak je to ukázáno na obrázku 5»3· Tato sekvence se vloží do kazety exprese génu z plasmidu (pNSgpt—S4), ktorý má gen selektivního laarkeru (E· coXi gpt). Ziská se tak plasmid, který j© oznečen pN2gpt-LPg (obrázek 5·3)·
V tomto plasmidu je presekvenco (kodujicí signálni peptid, který sprostredkuje sekreci) primo napojen/ne první nukleotid lys i nového zbytku 73 v plasminogenu. Místo štéponí nového signálního peptidu vytvorené napojením, je podobné mnohá znáiným signálním laístúm štepení. Víz napríklad von Heinjeí Eur· J. Blochem. 133· 17 až 21 (1933)«
D<,. místa iniciačního kodonu c DNA Pg bylo zavedene také raisto Nool, aby se usnadnilo klonování do jediného Kcoi místs plasmidu pH2gpt-S4 © aby se dosáhlo optimálni souvislosti promotoru s oblasti, která kóduje Pg. Aby se usnadnilo vyštépení Pg c DN A pôsobením Noál, jedno ze dvou vnitfních míst Ncol míst (Ncoi(2), obrázek 5*3) se deletuje z PgCDNA následujícim postupem.
Plasmid phPlasG se prenes© do E, coli kmene N&522· Jednovláknová DNA se pripraví superinfekcí pomocným fágem i£L3KO7· První kolo mutagenese se provede se dvéma oligonukleotidy, oNcol a oNcoR. Použije se jednovláknová phPles 6 DNA jako templát s komerčné dostupnou sestavou pro mutagenese (Amersham, Inc.)· OligonukleotidcNcci pŕevádí dva Ä-zbytky proti smeru vlákna štart kodonu plasmlnogenu na dva C-zbytky. Ziská se tak Kcol mís to kolem štart kodonu bez menení oblasti kodujicí presekvenci plasminogenu. Oligonukleutid oNco2 pŕevádi T zbytek na C zbytok ve vnitŕnim Nool místé (Ncol(2)) Pg c DNA· Dôjde tak k tiché mutaci, která desaktivuje toto Ncol raisto·
Kodujicí oblast aminokyselín 1 až 77 plssmlhogenu se deletuje ve stupni smyčkové mutagenese použitím oligonuh-96leotidu oNco3 o 42 párech. nukleotidô. Všechny mutace byly potvrzeny sekvenováním a reštrikční analýzou.
Plasmid phLplas, který má tri mutaoe, se linearizuje pôsobením Smal a částečne se rozžtópí pôsobením Ncol· Isoluje se fragment Nool-Smal o 2200 párech mlkleotidô a vloží se do plasmidu pN2gpt-S4, který se rozčtšpí pôsobením iicol s Smal. Výsledný plasmid se označí pNdgpt-I<Fg.
Kvôli mnohé modifikacím cDNA plasminogenu v pN2gpt-LPg jo úplná sekvence Ncol-Smal fragmentu plasmidu pDplas včetné dveceti nukleotidô ‘54 promotoru a 20 nukleotidô p la saldové oblasti plasmidu pN2gpt-S4 po sméru vlákna uvedená v sekvenci identifikační číslo 13· Sekvence cDNA plasminogenu by la modifikovaná následujícím z pňa o berní dva A-zbytky v polohách čéslo 19 e číslo Ό (nukle^oidy číslo 53 a 54 v ID HSP&GP.) se zmení na dva Q-zbytky. Získá s© tak místo Ncol. Nukleotid číslo 21 v tomto číslování (mikleotid číslo 55 v ID HSP ©Git) znamená A-zbytek štart kodonu plasminogenu, oukleotid číslo 2220 (nukleotid číslo 2485 v ID HSPKGB) znamená T-zbytek ston kodonu, nukleotid číslo 111 v ID HSP8SGB (nukleotid číslo 77 v tomto číslování) e® napojí e nukleotidem číslo 343 v ID HSPMGE (mikleotid číslo 78 v tomto číslování)· Dôjde tsk k deleci sekvence kódu jí c í aktivačni peptid”. T-zbytek číslo 926 (nukleotid číslo 1191 v ID HSPhiGP) se začni na C—z by t ek (konzervatívni výmena), což vede ke zmizení vnitŕniho místa Ncol.
Pro prenesení kazety ©snu lys-plasminogenu do genomu viru vakcinie se Noi>X fragment plasmidu piídgpt—LPg, který obsahuje kazetu exprese génu obsahující dve kombincce promotor-gen (Ρ?·5 promotor - gpt-gen a Š4 promotor - gen lysplesminogenu) ligu j o s vdTK vektorovou DNA víru vakcinie rozštč’penou pôsobením Nôti e pa kážu j © se jak je to shors popsáno v príkladu 7· Isolát, který má príslušnou atraktoru vložené kazety génu, označený vN2gpt-IiPg, se použije pro expres i lys-plasiainogenu v bunkách CJV-1 za podmín^© použitých čLííve pro konvenčné skonštruovaný rekombinant za stsndardnich podMhek kultivsce expresních vektorô viru vakcinie· V bunečné kul tuhe se tak produkuj! proteiny, Se— kretovaný lys-Pg v supernatantech bunečné kulu^ry se deteguje ne úrovni asi 1,0 až 2,0 bunék po dvsceti č ty í hodinách od infekce konvenční© rekombinantem. Lysplaexainogen v supernatentu bunščné kul tury byl stabilní bez pŕidání inhibitoru proteasy·
Konstrukce víru vakcinie (vgpl60-l) pro prípravu glykoproteinu 160, viru lldaké imunitní nedostatočnosti (HIV gpioo)expreaí: Úplná otevŕeaá čtecí oblast glykoproteinu HIV gpl60 se ziskň na ScoRV fragmentu o 2500 pároch nukle— otidá vy štepením z replikační formy (RF) ΣΜΑ fágu Ml 3 ImpPEenv, /uerst e. spol,: Mol, Celí· Bicí. £, 2533 e ž 254-4 (1997. J· Tento fragment se vloží do plasmidu pN2gpt-S4, jak je to nastíneno na obrázku 5.4. Ve výsledné© plasmidu pN2gpt-gp!60 je gen gplOO kontrolován syntetický© promotorem S4 viru vakcínie.
Sekveace HXV gp!60 byla publikovaná Rataerera L. e spol.í Náture 313, 277 až 284 (1935)· Sekvence klonu BH3 je dostupná z EMBO Dáte library (GeoBank) pod identifikátore© (ID) ΗΓ/Η33Η3, Proto není sekvenoe gpl60 zahrnuté v cekveaci identifikační číslo 19, ale oblást spojení S4 promotoru a ScoPI IIXV-gpl60 fragmentu včetné iniciačniho kodonu génu gpl60 (nukle o t id číslo 28 v této aekvenoi, nukleotid Číslo 226 v 11) HTVHJBH8) je uvedená. EcoRV HXV-gpl60 fragment se aachází proti e©ôru vlákna od mpPEenv fágu Ml3 (replikační forma), jak popisuje JAxorst T, R·, Karí P. e Moss B. i Mol, Gell, Biol, £. 2533 až 2544 (1987)· Tato sekvence pokračuje stop kodonoa (nukle o t id číslo 31 v této sekvenci, nukleotid Číslo 2279 v ID HIVH3BHB) e polovinou EcoHV lalsts po smeru vlákna. Po této sekvencl následuje dvacet nukleotidú násobného klonovacího ©leta plasmidu pH'2gpt-S4, Prvnl nukleotid (T) této sekvenoe odpovídá nukleotidu Číslo 3368» poslední nukleotid (G) odpovídá nukleotidu číslo 5973 v ísokvenci pN2gpt-gpl60,
Pri prenosu kazety exprese génu HTV gpl€>0 do genomu viru vakcinie s© Nôti fia@aent obaahujíoí obe kombinéce gsn-proxaotor (1'7.5 promotor - gpt selekční marker a S4 promótor - gen gplGO) ligují o DNA vektoru vdTK viru vakoínie rozetépenou pôsobením Nôti a pakážují se, jak jo to popsáno v príkladu 7. Xsolát, který má správnou strukturu insertu kazety, označený vN2gpt-gpl60, se použije pro exproei gplGO v bunkách africké zelené opice (Vero) za podiaínek, které byly džíve popaány pro konvenčné zkonstruovaný rekombinant (Barrett a spol.» AIDS Research and Hôrna n Retroviruees 6, 159 až 171 (1989).).
Konstrukce vektoru viru vakoínie pro testovánl modifikovaných virú neeouoich ínsero© koinsorcí l&eZ génu» Ičco testování inserce koinsercí E. coli lacZ génu v kombinaci s prístupe® primého klonování je užitočnou modelovou kons t ruke í plaamid pTZgpt-SjAlaaZ (obrázok 5.5). Plasxaid pTZ19R (Pharmacia, Inc.) se rozštep! pôsobení® Pvul. Pripraví se velký vektorový fragment o 25OO párech nukleotidô ® ten se liguj© s Nôti linkery (Boehringer, Inc·). Výsledný plasmid pIZU< má deloci násobného klonovacího mists, které je umístšno v sekvencích alfa doplnkového peptidu v plasmidu pT219R. Jsou proto vylouoeny možné rekomblnace mezi sekvencami alfa doplnkového peptidu a lacZ geneia, který ee má vložit do pTZ-lí.
Pri konstruování kazety exprese génu pro pŕísé molekulárni klonování se Nôti fregmont o 1200 párech. nukleotiďu, obsahu jicí kazetu gpt-genu a S3A promotor, vy štepí z pR2gpt-SJA (ρί-iklad 4) a vloží se do pTZ-ii. Získá se tsk p la smíd pTZgpt-SjA, EcoRI lacZ fragment o 3000 párech nukleOtidú (vystrižený z plasmidu pTKgpt-Fls0j Falkner a hoss: 1988.) se vloží do jediného EcoRI aísta plaamidu pTKgpt-S3* •AlacZ. Výsledný plasmid se označí pTZgpt-S^AlacZ.
h’otl fragment tohoto plesmidu o 4400 párech nukleotidú, sestávaJicí ze dvou genú markeru (E« coli gpfc e lacZ), s© liguje s DNA viru vdTK rozätčpené pôsobením Notl (príklad
1,1.108 pfu/ml
B) Titr po druhé amplifikacU
VdN/Al Č. vdH/Al č. VdN/Ál δ, 2.1111 4.1111 6.1UI 3,6.10 pfu/ml 2,5.108 pfu/ial 5,9.10^ pfu/ml vdN/Al č. 8.1111 4,2.1ο·7 pfu/ml VdN/Al δ. 10.1111 4,3.108 pfu/ml vdJi/Al δ» 12.1111 2,2.10-3 pfu/ml 5,4. 108 pfu/ml
Tabulks 4.2
Štúdie životaschopnosti virových msziprouukta vdS
A) Titr po prvjaí amplifikaci potí živých vdS-virových isolátú (pfu/ml surového kmene)
vdS č. vdS č. vdS č. 2.11 3.11 4.11 4,1.10? pfu/ml 6,5.10? pfu/ml 3,0.10? pfu/ml VdS č. 5.11 2,7.10' pfu/ml vdS č. 7.11 4,7.10? pfu/ml
B) Titr po druhé amplifikacii
vdS ô. 2.11 1,6.10'; pfu/ml vdS δ. 3.11 1,4.108 pfu/ml vdS δ. 4.11 8,0.10? pfu/ml vdS v c. 5.11 1,3.10° pfu/ml vdS Č. 7.11 lfi7.103 pfu/ml WR-A ST 2,8.10 pfu/ml
Identifiksce viru (vdSN), který má deletováno místo Saal, PCB—testovánlm» Xlony vdSN viru vakcínie, kt-eré mají mís to Smal deietováno, byly identii’ikováay PCR testovaním následujícím zpúsobem.
Prvnim primerem pro PCB reakci je oligonukleotid odS2 (sekvence identifikační číslo 27) a druhým primerem j® oligonukleotíd oďS3 (sekvence identifikační číslo 23). Sekvence oligonukleotidu od«2 je uoístônc v genomu vekcínic nsi 340 p áru nukleotidú proti smeru vlákna ou misia SmaX. Sekvence oligjaukleotidu odS3 J© umísténa asi 340 párú. nukleotidú po sméru vlákna tohoto mista, Templátem je celková DNA bunék CV-1 infikovaných plakem víru Jak shcra popsúno pro vdN identifikácie PCB-ampllfikovaný pás o asi 680 pórech nukleotidá se testuje na vnimavost na Srna! s resistenoí na 3:nal ätšpení indukující insercl HindUI nebo ISceJ linkeru, zfltímoo prírodní kontrolní DNA je štópena na dva kuey o asi 340 párech nukleotidá. Vírus vakclnie, který ná žádsncni inšerel linkeru v raiste Smal, s e označí vdOE,
Delece kodujicí oblasti génu thymiúln-kiacsy z víru vakcínie vdSNi Z víru vakcinie vd£N byl vyvinul nový vektorový kmeň (označený vdTK) náhradou génu thyiaidin-kineey (tk), který je umístčn v geneticky stabilní oblasti genomu vakcínie, segmente© obsahujícim nékolik míst stúpení Jedinečnou reštrikční eridonukleasou (obrázek 4*1A).
Nejdŕíve se deievuje sekvence kodujíci thymidin-kinasu (tk) z plasmidu (pHindJ-1), který obsahuje segment genomu Vakcínie (HindXll J segment), v nomž J© úniatČn tk-gen (viz obrázek 4.2). Do mista tk-genu se pak vloží násobné klonoveol místo s jedinečnými mís vy Nôti, Smel, Apal a Rsrll, obklopené mís ty Sfil. 4skonec se pfenese modifikovaziý seg ment viru do genorau vdSN viru vekeínie, který se pak označí vdTK (obrázek 4.1a). Aby se násilnú klonování dále usnadnilo, obš mista JSfil se stenou jedinečnými mís ty ve vektoru tím, že s® vyuá l Je pŕirozená povalu; rozpoznávací sekvence
Sfil (GGGCNNNN'NGGGE). Sekvence dvou následujícíí Sfil(l), GGCGGGGT'aGGCú ofiX míst jsou pak (sekvence xdentifikeč- 84 ní číslo 29) a Sf11(2), GGCuATAT*AGGCC (^kvence identifikační číslo >0). Tento plasmid, který obsahuje konečnou modifikaci tk-genu (pHlndJ-3), se skonštruuje z prekursorového plasmidu pHind.J-1 smyčkovou imitagenesí. D* leče tk-genu se potvrdí sekvenační analýzou»
Konstrukce prekursorového p la smidu pHind.J-1: DMa viru vakoínie prírodniho typu se rozžtčpi pôsobením HindlII. Výsledné fragmenty se rozdélí na 0,8% gélu nlzkotající agarosy. Fragment HindlIX J se vyštepi pod ultrafialovým svčtlem a pripraví se podie stendardnich technik· Tento fragment se vloží do jediného HindlII místa plasmidu pTZIPR (Pharapcia,Inc.). Získá se tak(HindJ-l· ftonstrukce plesmidu pHindJ-2í Plasmid pHindJ-1 se transfektuje do E. c o 11 kmene ΝΜ$22. Jeduovláknová DHA se pripraví superinfekcí pomocným fágem MIJKO? podie protokolu dodávaného firmou Pharmacis. Jednovláknová DNA slouží jsko templát pro mistne rí2onou mutageuesi s primerem odTKl (sekvence identifikační číslo 31)· Tento primer je doplnkový k promotorové oblasti a k oblasti kolem trenslačniho stop kodonu tk-genu. Ve stredové části obsahuje jedinečná reštrikční místs BaiaíH, Hpei, Nrul a EgoRI. Postup muiageneee se provádi se sestsvou pro mutagenesi dodávanou firmou Ameráham, Inc· podie príručky dodávané dodavatelem.
Pro konstrukoi pHindJ-2 byly popsána sekvence tk-genu v práci $eira J· P. e ižosse B·: J· Virol, 46» 5J0 až 537 (1983)· Sekvence tk- génu je dostupná v EMBL Dáte Library pod identifiteačním osnačením (ID) PVHINDJ, Sekvence vektorové části (pTZ19H) plasmidu je dostupná od firmy Pharniacia, Inc· Sekvence kolem deletovaného génu thymidin-kina sy (tk-gen) víru vakoínie v plesiaidu pHindJ-2 je uvedená v sekvenci identifikační Číslo 4. 5*-Oblast tk-genu (nukleotidy číslo 1 až 19 v tomto seznamu, nukleotidy č. 454J až 4561 v ID PVHXNLJ) je následována jedinečnými restrikčnimi mi s ty Bamlil, Hpal, Nrul © EooRI a 3*- oblastí tk-genu (nukleotidy Číslo 44 až 67 v tomto seznamu, nukleotidy č· 5119 ež 5142 v ID PVHUOJ). Nukleotidy číslo 4562 až 5U8 v ID PVHINLJ,
- 85 které obsahuj! část tk-p^áotoru é oblast; kodující tk-gen, jsou v pHindJ-2 delotovány.
Konstrukce plasmidu .pHindJ-Js Plasmid pHindJ-2 se rozštépi pusooeniíi BsmHI a EooRI. Vloží se dvouvláknový linke? obsahu, jicí Jedinečná reštrikční mís ta Nôti, Smal, Rsrll 0 Apal, kteru jsou obklopená raisty Sfil. Tento linker sestává e oligonukleotidu í-^(l) (sekvence identifikační číslo 32) © P-J(2) (sekvence identifikační číslo 33).
iAodifikované sekvence plasiaidu pHindJ-3 je uvedenw v sekvenci identifikační číslo >. Vložené násobné klonovecí mlatu odpovídá oligonukaotife B-J(l). Vložená sekvence zsčiná v poloz® 21 e konči v poloz© 99. ObkLopující sekvence jsou svejné jako je to popsáno výče u HindJ-2.
r í ó vložení tk-delece do viru vakcínie se plasmid pfíindJ-3 rozšúepí pôsobením HindlII. Pri pokusu získaní merkeru se použije obráconý HindlII J fragment 3 který má deleoi tk—génu, jak je to popsáno Saraera e Dumbelle.m (1981). Víry, které mají deletován tk-gen, se isoluji tk-negativni selekcí (iáackett e spolu 1982) a identifikuJí se následným PCR-1 e s t ováníin ·
Podrobnej i - modifikovaný HindlII fragisent, prítomný v HindJ-3t se vystúpi pôsobením HindlII a isoluje ee ne gélu nískotsjící sgarosy. Získání r éteru s© provádl v podeta'v* tč tak, jak je to popaáno Samem e Dumbellem (1931) s následojící mi modlíika černi. 5.1Q& bunšk OV-1 se infikuje 0,2 plak tvoríoich Jednotek ne bunku vdSN viru vakcínie· Po jednohodinové inkubaci se jeden milllitr sraženiyJn fosforečnane© vápenatým obsahující 1 ^ug modifikovaného HindlII J fragmentu transfektuje do infikovaných bunék. Po dvou dnech rôstu so pripraví podie postupu shora popsaného v príkladu 1 surový vírový kmeň a titruje se na lidské 14 JB tk-negativní bunky v prítomnosti broMleoxyuridinu (BrdV) jak popaali Msckett a spol. v roce 1982. Tk-negetivní plnky se mohou dále analysovat PdE testovánlm.
Identifikace viru s delecí thymidin-kinasy (vdTK)
- 56 « leotíd od'PK2
Prvním primerem pro i-CR roskei jo cligonuk,kvencl identifikační číslo .34), sekvence, která ja umístén asi 306 páru nukleotidú. proti siačru vlák na tk-genu.» Druhý primer, oďlKjí (sekvenci identifikační číslo 35) je umístén esi 220 páru nukleotidú po asiäru vlákna 8top kodosu tk-genu. Templátem je celková DNA bunék GV-1 infikovaných plakeiu viru, jak je to popsáno pro vdN testování. /ifliplifikačni produkt, ktorý pochází od viru majiciho deleci tk-genu, má esi 520 páxú nukleotidú, zetíraco prírodní kontrole poskytuje fragment o asi 1100 párech nukleotidú.
Konstrukce plasmídú obsahujúcich kazety axprsso génu pro prenos do vdTZ vekvOrui Plasmíd pAO je základni plasmid, ktarý obsahuje hlavní klonoveci mís tu vektoru ubsanujicí jedinečná mís ta hlavního klonovacího vektoru vďl'K víru v® točí nie. Plssmid. pAO byl zkunstruován aahrazením násobného klonovacího inístc komerčné dostupného plasmidu segmente© obsahujícíifi jedinečná místa vektoru vdTK je to llustrOVciiiô ns oox’ázKu 4.3· ©isto «hol, jak
Podrobnéji - pri deletováni násobného klenovácího místa plasmid rozštep! púsobenim dacl a Asp718.
7elký vektorový fragment se ligujo s adsptorea obaehujioím aaalované oligonukleotidy
P-A (0.1) (sekvanca identifikační číslo 36) a P-i (0»2) (sekveac® identifikační číslu 37)·
Ly
Násobné klonov-ící m isto pAO (odpovídájicí oligWklcutidu P-A(O.l) e 20 nukleotidú 5*· θ ý'-obklopujících ob-estí pBluesoript Ix S.Eh jsou uvedený v sekveuci identifikační číslo 5. Insert zaciná v poloz® 21 u končí v poloze 95
ÍSl'3 (První A zbytek na 5*-konei odpovídá poloz© číslu 2187, poslední G” zbytek h® >-konci odpovídá polčas číslo 2301 plasmidu pAO.)«
Konstrukce plasmidú pAl e pA2s PInsmidy pAl a pA2 byly nevrženy pro inserci 1MA oegmentú, napríklad fregmentú syntetickéhoTpMroáního proiaotoru. Byly zkonstruovány vložením linkeru obsahujícího druhé klonovací místo často štepících
137 enzymú, které nežtčpl páO, do Khol místa pAO. Oba plasmidy máji stojnou struki-uxu až a& orientaci druhého násobného klonovacího rnista (obrázek 4,3),
PlasjBlä pA'D se rozätépi pôsobením Xhol a liguj© se s adaptorem obsahujícím anolované oligonukleotidy P-i(l.l) a Ρ-Α(1.2)» Βτΐ-· iaolovány obä možné orientace adaptéru e označený ρ/l s pA2.
oligonuklectiich oblastí číslo 7.. lasert zbytek 'k/’. zbytek Násobné klonovecí místo pil. odpovídajíoi du P-A(l.l) e 20 nukleotldú 5*- s 3*-ubklopujiu pAO jňou uvedený v sekvenci identifikační zač Iná v poloz® 21 e konči v poloze 33 (První Kv’! na 5*fcOQ‘3Í odpovída poloze číslo 2222, poslední na 3*-koncl odpovídá poloze 2324 plesmidu píl·.)·
Násobné klonovací misto pá 2 (odpovídající uligo^ukleotídu P-A(l,2)) a 20 aukleotidú 5*- δ 3*~obklopujíuich oblastí pá 2 jsou uvedený v sekve^ni identifikační číslo 10· In-, sert zn’iné v poloze 21 s končí v poloze 195 (První 5G” zbytek. n« 5*-'konci odpovídá polo.©® 22.52, •í , / *♦.·%.*< L— poslednx u , zbytek ns 3'-konci odpovidá poloze číslo 2466 plasmidu.- pA©-Dl#).
Konstrukce pl-ssmidú pál—Sl s pA2-Slt Plesmidy pftl-Sl a pá2-31 poskytují silný syntetický promotor 51 víru neétovic zahrnujicí trsnslacní štart kodon nasledovaný jediným KooPI míetem vhodným pro ínsarci otevrených c tooícli oblasti, které ne*nají esualovaný štart kodoru ©roaotor 51 aodifikovsaé verše silného pozdního promotoru víru nočtcvic vznaasnáho P2.
PlasLiidy píl-Sl t pŕU-Sl se ziskcjí vložením fragmentu prvního dvcnivláknového promotoru do mists Ndel o BamiíX pAl klenovéním (obrázek 4r4s panel a), Fodrpbvektor pál se rozStepí pôsobením Kdal a BamHI s liguje se s suaptorem sestáva jí c im z auélovaných oligonukleotldč F-k©iil,l a P-P2ral,2. Výsledný vlr.Sin.id se označí ρΛΙ-51.
O t;
nebo pá ’i násilným ne j i Ise uvóst, ži
Ľ?
Sekvence y y n t e t i okého promotoru w pá1-51 oligonukleotidu P-Pdral·!} a 20 nukleotidu 5*~ <, Gv< p o vída J í c í a 3*- obklo— pujícícb oblasti pAl jsou uvedený v sekvenci identifikační číslo 9. laseri začiná v poloze 21 s končí v poloz® 193 (Ihevni WJM insert >'-konci odpovída poloz® číslo 2228, poslední ”G” zbytek ηε J'-konci odpovída poloz© číslo 2440 plasmidu pál-Si.),
Vektor pA2 se rozšlčpí pusob3cím iMel a BamHI s liguje se s adaptérom sestavajicí® z mutovaných olXgon.ufrleotidú P-kkml.l a P-P2BJ1.2, jako shora pro pAl-Sl. Výsledný plasmid se oznečí pAS-uL.
Sekvenee syntetického promotoru z pA2W.il (odpcvid*jici oligonukleotídu. P—Khs.1.2) e 20 nukleotidú 5*- s j'-obklopujiciô'h oblastí pA2 jsou uvedený v sekvenci identifikační ČÍGlo 1G. insert začína v poloze 21 a končí v poloze 195 (První 'V zbytek ua ; -konci odpovída ooloze Číslo 2252, poslední :u” zbytok na y'-konci odpovída poloze číslo 21466 pibSmÍGU p.w — ol. ) ·
Konstrukoo plasxaidú pá1—82 e pá2-S2 í Plasmidy p.Al-S2 e pá 2—82 obsaiiují silný syntetický promotor 82, modifikovanou verši silného pozdnlha promotoru viru neštovic (popísaného ňsvisonem a bossom: u. kol. ôiol. 210, 771 až ??A (ly '>>).)· íyto plesmrdy no poskytuj! translačnl štart kodon £ promotorem e jsou tady vhodné pro inserci úplných otevŕených čtecich oblastí, která zahrnuj! stsrt kodon· Proiaotory máji ražné oriantace vzhladcm k vdTK. hlavnímu klonovecimu mistu v téchtu dvou plasnideoh. rlasmidy pAl-S2 a pA -S2 se získavaji násilným klonovánim fragmentu druhého dvouvláknového prowloru do «.-Ist iipox a EcoHI pál a pá 2 (obrázek kcobnéji - plasmid pál se rozštépi púsobeEccľÍi ε liguje se se sekvenci syntetického
L c nelov®né oligonukleotidy P-srtP(5) a
-»j? pléígí’»4.cí c·c oznsči pAl—Ä>2.
oekvencc syntetického promotoru z pál-82 (odpovídajici oligonuklsotidu . P-artP(5) a 20 nukleotidú 5'- a 3*—obklopujících oblasti pál jsou uvedený v sekvenci identifikační číslo 11. Insert začiná v poloze 21 a konči v poloze 68.
- 39 (První T zbytek na 5'-konci odpovídá poloze číslo 2240, poslední A” zbytok na 3'-konci odpovídá poloze číslo 232? plesaldu. pAl-í>2,).
Podobné plasmid pA2 se rozčtčpí pôsobením enzýmu Hpel a EcoHI s liguje se s snelovanými oligonukleotidy P-artP(5) a P-art P (6) Jako u pAlS2. Výsledný plasmid se označí pA2—S2. Sekvence syntetického promotoru z pA2-S2 (odpovidající oligonukleotidu P-artP(6)) a dveoet nukleotidú 5'- a j'-obklopujících oblastí z pA2 jsou uvedený v sekvenci identifikační číslo 12· Insert zsčíná v poloze 21 a končí v poloze 72. (První ”T zbytek ns 5'-konci odpovídá poloze číslo 226J, poslední ”A zbytok ns 3'-konci odpovídá poloze číslo 2354 plasmidu pA2-S2)·)·
Po vložení otevŕené čteci oblasti do kteréhokoliv z plasmidu pAl-Sl, pA2-Sl, pAl-S2 nebo pA2-S2, lze úplnou kazetu exprese vyštepit e násilným klonovánim vložiť do odpovídájícich míst ve vektoru vdTK viru. Kazeta múže být vložená do genomu viru v j®kékoliv orientaci podie toho, jaký klonovací plasmid se použije.
Konstrukc^plasmidu obsahujících kazety expres® se selektivním ms^rerem (pN2gpt-S3A a pN2-gpt-S4) 1 Vedie shors popsených plasmidú určených pro násilné klonování byly zkonstruovány dve do lží plcsmidy pro prenos genú do jedinečného (Nôti) místa ve vektoru viru neštovic pomoci génu E.coli gpt selektovaťeIného msrekeru. Vedie shora popeaných promótora SI e S2 poskytuj! také dva další promotory víru neštovic.
i'lesmid pN2gpt-SjÁ (obrázek 4.7) lze použi t pro vložení otevŕených ctecích oblastí, jimž ch-bi jejich vlastni iniciační kodon. Gény, které se msjí pŕenést do víru vakcínie (gpt marker s otevrená čtecí oblast), se mohou vystúpiť bučí pôsobením h'otl samotné nebo pôsobením dvou enzymú, napríklad No t i a Smal (nebo RsrII nebo Apel). Vyatépený fragraent se pak vloží do odpovídájícího místa (odpovídájících míst) vektoru vdTK viru.
- $0 ľlasfflid pM2gpt-S4 (obrázek $.7) lze použít pro vložení úplných otevŕenýoh ôteoích oblestí zahrnujících AUG translaČní štart kodon, Ty to kazety obsahujíci gen gpt-narkeru e otevŕenou δ točí oblast se ©obou vyätéplt jak chorá popa áno pro pN2gpt-S3A, Promotory S3A a S4 jsou modifikovanými versexai silných pozdnlch promotorú víru rieätovic.
Ty to pla smidy byly zkonstruovány tak, že se nejdríve pripraví plesmidy pli2-gpte a pN2-gptb (obrázok 4*6), které obsahujl E* coli gpt gen rízený P?, 5 promotorem viru vakcínie obklopeným nč kolike jedinečnými restrikenimi místy včetne Nôti (obrázek 1*3)· Inserc® S3A nebo S4 promotorového fragmentu do jedinečných míst PstI a dial v pN2-gptb poskytuj© plaeiaidy pN2gpt-S3A a pKTgpt—S4.
Konstrukce plasmidá pNTgpta e pN2gptbi viz príklad
1,5.10 8 pfu/ml
1,0.10^ pfu/ml
2^1-pL
Konstrukce W vektoru vS4
Notl ) vdľK
- rozštépit púsobením Notl
- vložit adaptor sestávají z anelovaných oligonukleotidú
P-artP(ll) a P-art((12) w-PCR testovaní
Štruktúra promotor-adaptoru v vS4
S4 > Nôti
GGCCACGTTTTTATGGGAAGCTTTTTTTTTTTT’rTT'ľ'rTTTGGCATATAAATCGC GGCCGC
TGCAAAAATACCCT'ľCGAAAAAAAAAAAAAAAAAÄAACCGTATATTTAGCGCCGG cg
Óbrázek 6.1 “Π 'p (/ 2^1-U- to
O1 C-4 bl UJ x cc * O Λ—1 ΟΊ a < -J <í. td —> X '<k en CO o o 1 ° o e*» in f CXi x ! <r CC- i a.
patentservis
Φ rs CŤ trunce kmene wW'F viru vakcinie
Obrázek 6.2 p!/ JTÝ7 ~Ť2titr .106 pridaná DNA viru vakcinia n 71 vo pakážováni DNA 3 drúbežích ή vakcínie bunkách (CV-1) neštovic v savcích
Obrázek 7.1 ôostc
CXJ
C)
x.
có
0M
M
UJ > —j .>· -.r UJ ;·.· ~i • CO > o
Q C n:
Q.
Konstrukce plasmidu pEco-dbr
Nael
- isolovat jednovláknovou DNA
- smyčková mutagenese oligonukleotidem P-hr(J)
VV-EcoRI K
EcoRI
Scal
Nael
EcoRI
FP-tk pEcoK-dhr (9000 υη) rozštépit násobením Notl f
ÁARí’ROV
ΑΖ3ΐγί·,λΛ Ondavy n
EcoRI
V-EcoRI K
Scal pTZ
Nael.
FPV-tk -iszan ro%3tepi^ priprav it
3otl vr— sec ° pdhr-gpt íl· ► vdhr
EcoRI
FPV-tk
Obrázek 8.1
Konstrukce plasmidú pS2gpt-P2 a Pp2gptl60MN
Hpal EcoRi, Ncol Smal, Stul Rsrll, Apal Sfil(2)
Xbal Spel BamHI
Scal
-Xbal ,
-Smal adaptor (CTAGCCCGGG) pN2gpt-S4 (4200 pn) pBluescrípt
Smal
Spel BamHI
Hpal
EcoRi, Ncol Smal, Stul Rsrll, Apal Sfil(2)
Scal fpS2gpt-S4 (4200 pn) pBluescrípt
Asp718
EcoRi _0·6 gp 1 60mn
Scal
P2 promotorový fragment o 17 P □MNenvi fllgo q
Smal Spel
BamHI
Hpal EcoRi, Ncol Smal, Stul Rsrll, Apal Sfil(2)
I
- substituovat BcoBI-Asp713 fra^ieat o 600 pn PCR-generovaným ScoIL·-Asp718 fragmentem o 130 pn
I
Obrázek 9.1/1 CIP DMC %
pBluescrípt
Asp718
Stul 0.1
...... | EcoRi __ΐρ,ι ó ;
jMsraoV
Az3’1VNAA Ofcd * ávyn pMNenv2
Smal Spel n do Hpal místa oS2gpt-?2
L (i g pS2gpt-P2 scrípt
EcoRi, Ncol, Smal, Stul, Rsrll, Apal, Sfil(2), Notl
Konstrukce chimerních viru vP2-gp!60MNA a vP2~gp!60MNB +
Smal
Rsrll
Apal
Sni(2) sni(n vP2-gp!6OMNB
Obrázek 9.2/1CIP DMC
Schematický nástin konstrukce virú vP2-gp!60MN~A a vP2—gplôOMN—B i
ío
CM M a> W >_ a UJ X c —> >QÍ a?> CO o o CM O < n·; 1 0„
Pstl-E-fragment (prírodní vir)
P 5.8 E
I I
17.2
PstI-fragmenty v vP2-gpl60MNA
P 6.9 L.-w-·-»
2.
2.0
0.6
PATENTSERVIS
Obrázek 1.5
-pt/ oZÓ Ý/ -?2.
V u, v XV PJ : r- í. O' ' o < <2- tD PO' <_ rn c 2 > >'O -< m N -<
K)
Obrázek ΐ·6
PATENTSERVlS · h k&6 •υ >
O τη c_ m c
ϋ ;υ <3 X) > O' i C\J <ί Cľ· U cO —J ^ó< > X O. ä •r >« r“ m o CO Ό . CO N (y) lo ·< 4 7 _ _lf_ . _ -W|
y
Obrázek 1*7 5 ÚŔAD PRC VYNÁLEZY ’ ' A OcJEVY
2.3
.....--2-1-:. |_ .. ;ľ.....2 .. 3 ,
- NOtj genomová DNA viru/.vakcínie ľ róžštépé-it(ptóóbeníirh uspwox.ylav e ;
▼ Nôti, defosforylovat la | t ra ( F —--·-- .......==^
P1 gpt
J TV .....- —'
Nôti Nôti ”a” orientace +
gpt P1
Notl> * <NotI ---------, b” orientace
- transfektovát do pomocného viru infektované bunky in vivo pakážování modif ikova ného vírového genomu selekce na vir obsahující gen gpt
Obrázek 1.2 ty 2£>Ú -ÍL
I i I í . Konstrukce plasmidú pN2-gpta a 1 pNÉ-gptb
NXI rozštépit pôsobením - vložit Notl linker
Scal pBfuescript (2960 pn)
.. rozštépit pôsobením Smal
K>
Nael
Xba — Spel BamHI
Notl pBluescript
Pstl EcoRI, Clal
Nôti pN2-gpta (4060 pn)
J:•Ί i
C’ > o
HindlI <A>
X 'JD :o σ’
I >· CJ'
CC O i
tk pTKqptFls rozštépit.pôsobením Hpál/Dral pripraví t P?· 5 promotor,-gpt gen kazetu o 1100 pn
Xba—;
Spel
BamHl· pBluescript
Stl EcoRI, lal pN2-g ptb (4060 pn)
Obrázek 1.3
PATENTSERVfS
Obrázek 1·4 pť ZCV ~Ϊ2-
-υ O yy x r- > o o < o *- > i >' o <r r -< m N <
2« Zpíisob podie bodu 1» vyznačující se tím» že stupeň modifikovaní DNA molekuly sa oxtraoelulárních podmínek obsahuje stupeň štepení DNA molekuly ondonulcloaeou špecifickou pro sekvenci· ?· Zpúeob podie bodu 1, vyznačujíoí ee tí©» Že stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje stupeň vložení prvni DNA sokvenoe do prvniho genomu.·
(2) informácie o sekvonoi identifikační číslo 80:
(i) vlastnosti sokvenoe:
(A) délkn: 5 aminokyselín
136 (B) typ: aminokyselina ;
(D) topologiei lineárni (ii) typ molekuly» protein (xi) popis eekvenco» sekvence identifikační číslo 30: Met Ala Val Leu Gly
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 73» (i) vlastnosti sekvence:
(A) clélka : 14 páru nukleotidu (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: dvouvláknová (B) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: prírodní gpl60MN (ix) vlastnosti:
(A) název/klíč: CDS (B) umísténí: 3·«14 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 73:
CA ATG AGA GTG AAG ’ 14
Liet Arg Val Lys (2) informace o sekvenci identifikační číslo 74:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4 aminokyseliny (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 74:
Iviet Arg Val Lys
- 134 (2) informaoe o sekvenci identifikační číslo 751 (i) vlastnosti sekvenceí (A) délka: 14 párú nukleotidú (B) typ» nukleová kyselina (C) druh vlákna» dvojvláknová (D) topologie» lineárni (ii) typ molekuly i jiná nukleová kyselina (A) popis» syntetický DNA oligonukleotid (víl) bezprostrední zdroj» (B) kloň» gplôO ve viru vselP-gpl60 (ix) povaha» (A) název/klíča CD3 (B) umíetční» 3.. 14 (xi) popis sekvence» sekvence identifikační číslo 75»
CC ATQ GCC GTG AAG 14
Met Ale Val Lys (2) informac® o sekvenci identifikační Číslo ?6» (i) vlastnosti sekvenční (A) délksa 4 aminokyseliny (B) typ» aminokyselina (D) topologie» lineárni (ii) typ molekuly» proteín (xi) popis sekvonce: sekvence identifikační číslo 76»
Met Ala Val Lys (2) informao® o sekvenci identifikační číslo 77» (!) vlastnosti sekvenoei (A) délka» 13 párú nukleotidú (B) typ» nukleová .kyselina (C) druh vlákna» dvoj vláknová (D) topologie» lineárni (ii) typ molekuly» jiná nukleová kyselina (A) popis» syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj» (B) kloň» Protein S pŕírodniho typu
GAA (2) (ix) povaha» (A) názôv/klič: CDS (B) umístenis 4««18 (xi) popis sekvenoe: sekvenaé. identifikační č^jXo 771
ATG AGG GTC CTG GGT
Mét Arg Val Leu Gly
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 70:
(2) informace o sekvenci identifikační Číslo 68í (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 27 páru, nukleotidú.
(2) iní'orinace o selcvenci identifikační číslo 67í (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 5811 páru nukleotidu (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vi i) bez pr o st ŕe d ni zdr o j:
(B) kloň: pN2-gpta ProtS
- 172 - (xi) popis sekvence:
sekvence identifikační číslo;67·
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60 CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120 GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT tcccttt-γγγ GCGGCATTTT 180 GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240 TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300 TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA agttctgcta TGTGGCGCGG 360 TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420 ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480 GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540 CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600 ctcgccttGa TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660 CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACÄACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720 CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780 TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840 GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900 TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG aaatagacag ATCGCTGAGA 960 TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020 AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080 atctcatgac CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200 CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260 TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320 CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380 TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500 CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560 GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620 CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680 GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800 CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
- 174 -
TTCATTCTTA AGCTGAACTT CAATCTTTCC ACCACGAAGT GCAATCAGGA GCCACGCTGA 3900 GTGATCGATA GATTCTGCGT ACAGTATCAC GCCTTCTGAA TCATATGTCC GGAAATCAAA 3960 TTCTGCTGAA AATCTGCTGA TTTCTGGCAA ACGAAATTTT AAATATAAAA CAACCCCTGC 4020 AAACTGCTCC GCCAAGTAAA GTAATTCATA CTTTGTGTCA AGGTTCAAGG GAAGGCACAC 4080 TGAAACAACC TCACAACTCT TCTGATCTTG GGCAAGTTTG AATCCTTTCT TCCCATCACA 4140 ATAGCAAGTG TAACCTCCAG GGTAATTGAC ACAAAGCTGA GCACACATGT TCTCAGAGCA 4200 TTCATCTATA TCTTCACAAG actttgattt GAGATTATAT CTGTAGCCTT CGGGGCATTC 4260 ACATTCAAAA TCTCCTGGGA TGTTCTTGCA CACAGCTGTG CCACAAATGC TTGGCTTCAA 4320 AGAGCATTCA TCCACATCTT TACAATCTTT CTTATTTGAA AGCATAACAA aaccattttt 4380 ACAGGAACAG TGGTAACTTC CAGGTGTATT ATCACAAATT TGACTGCAAC CTCCATTTAT 4440 ATTTGAGGGA TCTTTGCATT CATTTATGTC AAATTCACAC TTTTCTCCTT GCCAACCTGG 4500 TTTACAAGTG CAAGTAAAAG AAGCTTTTCC ATCTTTGCAG CTCATATATC CATCTTCATT 4560 GCATGGCAGA GGACTACACT GGTCTGGAAT GGCATTGACA CAGCTTCTTA GGTCAGGATA ' 4620 AGCATTAGTT GACTGACGTG CAGCAGTGAA TAACCCAGTT TGAAAAGAGC GAAGACAAAC 4680 TAAGTATTTT GGATAAAAAT AATCCGTTTC CGGGTCATTT TCAAAGACCT CCCTGGCTTC 4740 TTCTTTATTG CACAGTTCTT CGATGCATTC TCTTTCAAGA TTACCCTGTT TGGTTTCTTC 4800 AAGTAAAGAA TTTGCACGAC GCTTCCTAAC CAGGACTTGT GAAGCCTGTT GCTTTGACAA 4860 AAAGTTTGCC TCTGAGACGG GAAGCACTAG GAGGAGACAC GCCAGCAACG CCCCGCAGCG 4920 CCCACCCAGG ACCCCCATGG AGGCCTTATT TATATTCCAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΆΑ TAAAATTTCA 4980 ATTTTTAGAT CCCCCAACTT AAGGGTACCG CCTCGACATC TATATACTAT ATAGTAATAC 5040 CAATACTCAA GACTACGAAA CTGATACAAT CTCTTATCAT GTGGGTAATG TTCTCGATGT 5100 CGAATAGCCA TATGCCGGTA GTTGCGATAT ACATAAACTG ÄTCACTAATT CCAAACCCAC 5160 CCGCTTTTTA TAGTAAGTTT TTCACCCATA AATAATAAAT ACAATAATTA ATTTCTCGTA 5220 AAAGTAGAAA ATATÁTTCTA ATTTATTGCA CGGTAAGGAA GTAGAATCAT AAAGAACAGT 5280 GACGGATGAT CCCCAAGCTT GGACACAAGA CAGGCTTGCG AGATATGTTT GAGAATACCA 5340 CTTTATCCCG CGTCAGGGAG AGGCAGTGCG TAAAAAGACG CGGACTCATG TGAAATACTG 5400 GTTTTTAGTG CGCCAGATCT CTATAATCTC GCGCAACCTA TTTTCCCCTC GAACACTTTT 5460 TAAGCCGTAG ATAAACAGGC TGGGACACTT CACATGAGCG AAAAATACAT CGTCACCTGG 5520 GACATGTTGC AGATCCATGC ACGTAAACTC GCAAGCCGAC TGATGCCTTC TGAACAATGG 5580 AAAGGCATTA TTGCCGTAAG CCGTGGCGGT CTGGTACCGG GTGCGTTACT GGCGCGTGAA 5640 CTGGGTATTC GTCATGTCGA TACCGTTTGT atttccagct ACGATCACGA CAACCAGCGC 5700 GAGCTTAAAG TGCTGAAACG CGCAGAAGGC GATGGCGAAG GCTTCATCGT TATTGATGAC 5760 CTGGTGGATA CCGGTGGTAC TGCGGTTGCG ATTCGTGAAA TGTATCCAAA AGCGCACTTT 5820
-.175 -
GTCACCATCT TCGCAAAACC GGCTGGTCGT CCGCTGGTTG ATGACTATGT TGTTGATATC ’ 5880 CCGCAAGATA CCTGGATTGA ACAGCCGTGG GATATGGGCG TCGTATTCGT CCCGCCAATC 5940 TCCGGTCGCT AATCTTTTCA ACGCCTGGCA CTGCCGGGCG TTGTTCTTTT TAACTTCAGG 6000 CGGGTTACAA TAGTTTCCAG TAAGTATTCT GGAGGCTGCA TCCATGACAC AGGCAAACCT 6060 GAGCGAAACC CTGTTCAAAC CCCGCTTTGG GCTGCAGGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA 6120 TACCGTCGCG GCCGCGACCT CGAGGGGGGG CCCGGTACCC AATTCGCCCT ATAGTGAGTC 6180 GTATTACGCG CGCTCACTGG CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT 6240 TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA 6300 GGCCCGCACC GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGAAATTGTA 6360 AGCGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC attttttaac 6420 CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG 6480 AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC CAACGTCAAA 6540 GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CTAATCAAGT 6600 TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT 6660 AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA 6720 GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC 6780 GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCA G 6811
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 65:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka : 3878 páru, nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pselP-gpt;~L2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 65:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
166
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180 TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240 CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300 CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360 TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420 GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480 ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540 GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600 ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660 TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720 GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780 TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840 ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900 TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960 TCACATGAGT CCGCGTCTTT 1TACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020 CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080 TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140 AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200 TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC aactaccggc ATATGATAAA ÄAGTCGACTT 1260 AATTAATTAG gcctctcgag CTGCAGGGAT CCACTAGTGA GCTCCCCGGG GAATTCCCAT 1320 GGAGGCCTTA TTTATATTCC AAAAAAAAAA AATAAAATTT CAATTTTTAT CGATTACGTA 1380 GTTAACGCGG CCGCGGCCTA GCCGGCCATA AAAATCTAGC TGGCGTAATA GCGAAGAGGC 1440 CCGCACCGAT CGCCCTTCCC AACAGTTGCG CAGCCTGAAT GGCGAATGGG AAATTGTAAA 1500 CGTTAATATT TTGTTAAAAT TCGCGTTAAA TTTTTGTTAA ATCAGCTCAT TTTTTAACCA 1560 ATAGGCCGAA ATCGGCAAAA TCCCTTATAÄ ATCAAAAGAA TAGACCGAGA TAGGGTTGAG 1620 TGTTGTTCCA GTTTGGAACA AGAGTCCACT ATTAAAGAAC GTGGACTCCA ACGTCAAAGG 1680 GCGAAAAACC GTCTATCAGG GCGATGGCCC ACTACGTGAA CCATCACCCT AATCAAGTTT 1740 TTTGGGGTCG AGGTGCCGTA AAGCACTAAA TCGGAACCCT AAAGGGAGCC CCCGATTTAG 1800 AGCTTGACGG GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGAGC 1860 GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT CACGCTGCGC GTAACCACCA CACCCGCCGC 1920 GCTTAATGCG CCGCTACAGG GCGCGTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC 1980 CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA. GACAATAACC 2040 CTGATAAATG CTTCAATAAT ATTGAÄAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC ATTTCCGTGT 2100 CGCCCTTATT CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGTT TTTGCTCACC CAGAAACGCT 2160
167
GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA GTGGGTTACA TCGAACTGGA 2220 TCTCAACAGC GGTAAGATCC ttgagagttt TCGCCCCGAA GAACGTTTTC CAATGATGAG 2280 CACTTTTAAA GTTCTGCTAT gtggcgcggt ATTATCCCGT GTTGACGCCG GGCAAGAGCA 2340 ACTCGGTCGC CGCATACACT attctcagaa TGACTTGGTT GAGTACTCAC CAGTCACAGA 2400 AAAGCATCTT ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC AGTGCTGCCA TAACCATGAG 2460 TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA GGACCGAAGG AGCTAACCGC 2520 TTTTTTGCAC AACATGGGGG ATCATGTAAC TCGCCTTGAT CGTTGGGAAC CGGAGCTGAA 2580 TGAAGCCATA CCAAACGACG AGCGTGACAC CACGATGCCT GCAGCAATGG CAACAACGTT 2640 GCGCAAACTA TTAACTGGCG AACTACTTAC TCTAGCTTCC CGGCAACAAT TAATAGACTG 2700 GATGGAGGCG GATAAAGTTG CAGGACCACT TCTGCGCTCG GCCCTTCCGG CTGGCTGGTT 2760 TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC GGTATCATTG CAGCACTGGG 2820 GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT TATCTACACG ACGGGGAGTC AGGCAACTAT 2880 GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT AGGTGCCTCA CTGATTAAGC ATTGGTAACT 2940 GTCAGACCAA GTTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCATT TTTAATTTAA 3000 AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT AACGTGAGTT 3060 TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT GAGATCCTTT 3120 TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG 3180 TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCh. GCAGAGCGCA 3240 GATACCAAAT ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT 3300 AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA 3360 TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG CGCAGCGGTC 3420 GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCr ACACCGAACT 3480 GAGATACCTA CAGCGTGAGC ATTGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA 3540 CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG 3600 AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG AGCGTCGATT 3660 TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG CGGCCTTTTT 3720 ACGGTTCCTG gccttttgct GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT TATCCCCTGA 3780 TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC 3840
GACCGAGCGC AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAG
3878
- 168 - (2) inforraace o sekvenci identifikační číslo 66:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 64?6 páru, nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pselP-gplôOMN
(xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 66: AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60 TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120 GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180 TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240 CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300 CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360 TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420 GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480 ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540 GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600 ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGT1TCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660 TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720 GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780 TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840 ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900 TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA. AACCAGTATT 960 TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020 CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080 TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140 AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200 TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGATAAA AAGTCGACTT 1260 AATTAATTAG GCTGGTTCAG CTCGTCTCAT TCTTTCCCTT ACAGTAGGCC ATCCAGTCAC 1320
16$)
ACGTT'TTGAC CATTTGCCAC CCATCTTATA GCAAAGCCCT TTCCAAGCCC TGTCTTATTC 1380 TTGTAGGTAT GTGGAGAATA GCTCTACCAG CTCTTTGCAG TACTTCTATA ACCCTATCTG 1440 TCCCCTCAGC TACTGCTATA GCTGTGGCAT TAAGCAAGCT AACAGCACTA CTCTTTAGTT 1500 CCTGACTCCA ATACTGTAGG AGATTCCACC AATATTTGAG GACTTCCCAC CCCCTGCGTC 1560 CCAGAAGTTC CACAATCCTC GCTGCAATCA AGAGTAAGTC TCTGTGGTGG TAGCTGAAGA 1620 GGAACAGGCT CCGCAGGTCG ACCCAGATAA TTGCTAAGAA i TCCATGCACT AATCGACCGG 1680 ATGTGTCTCT GTCTCTCTCT CCACCTTCTT CTTCGATTCC TTCGGGCCTG TCGGGTCCCC 1740 TCGGAACTGG GGGGCGGGTC TGCAACGACA ATGGTGAGTA TCCCTGCCTA ACTCTATTCA 1800 CTATAGAAAG TACAGCAAAA ACTATTCTTA AACCTACCAA GCCTCCTACT ATCATTATGA 1860 atatttttat ATACCACAGC CAATTTGTTA TGTCAAACCA ATTCCACAAA CTTGCCCATT 1920 TATCCAATTC CAATAATTCT TGTTCATTCT TTTCTTGTTG GGTTTGCGAT TTTTCTAGTA 1980 ATGAGTATAT TAAGCTTGTG TAATTGTCAA TTTCTCTTTC CCACTGCATC CAGGTCATGT 2040 TATTCCAAAT ATCATCCAGA GATTTATTAC TCCAACTAGC ATTCCAAGGC ACAGTAGTGG 2100 TGCAAATGAG TTTTCCAGAG CAACCCCAAA ACCCCAGGAG CTGTTGATCC TTTAGGTATC 2160 TTTCCACAGC CAGGACTCTT GCCTGGAGCT GCTTGATGCC CCAGACTGTG AGTTGCAACA 2220 TATGCTGTTG CGCCTCAATG GCCCTCAGCA AATTGTTCTG CTGTTGCACT ATACCAGACA 2280 ATAATAGTCT GGCCTGTACC GTCAGCGTCA CTGACGCTGC GCCCATAGTG CTTCCTGCTG 2340 CTCCTAAGAA CCCAAGGAAC AGAGCTCCTA TCGCTGCTCT TTTTTCTCTC TGCACCACTC 2400 TTCTCTTTGC CTTGGTGGGT GCTACTCCTA ATGGTŤCAAT TGTTACTACT TTATATTTAT 2460 ATAATTCACT TCTCCAATTG TCCCTCATAT CTCCTCCTCC AGGTCTGAAG ATCTCGGTGT 2520 CGTTCGTGTC CGTGTCCTTA CCACCATCTC TTGTTAATAG TAGCCCTGTA ATATTTGATG 2580 AACATCTAAT TTGTCCTTCA ATGGGAGGGG CATACATTGC TTTTCCTACT TCCTGCCACA 2640 TGTTTATAAT TTGTTTTATT TTGCATTGAA GTGTGATATT GTTATT'rGAC CCTGTAGTAT . 2700 TATTCCAAGT ATTATTACCA TTCCAAGTAC TATTAAACAG TGGTGATGTA TTACAGTAGA 2760 AAAATTCCCC TCCACAATTA AAACTGTGCA TTACAATTTC TGGGTCCCCT CCTGAGGATT 2820 GATTAAAGAC TATTGTTTTA TTCTTAAATT gttcttttaa TTTGCTAACT ATCTGTCTTA 2880 AAGTGTCATT CCATTTTGCT CTACTAATGT TACAATGTGC TTGTCTTATA GTTCCTATTA 2940 TATTTTTTGT TGTATAAAAT GCTCTCCCTG GTCCTATATG TATCCTTTTT CTTTTATTGT 3000 AGTTGGGTCT TGTACAATTA ATTTGTACAG attcattcag ATGTACTATG ATGGTTTTAG 3060 CATTATCAGT GAAATTCTCA GATCTAATTA CTACCTCTTC TTCTGCTAGA CTGCCATTTA 3120 ACAGCAGTTG AGTTGATACT ACTGGCCTAA TTCCATGTGT ACATTGTACT GTGCTGACAT 3180 TTTTACATGA TCCTTTTCCA CTGAACTTTT tatcgttaca mTAGAATC GCAAAACCAG 3240 CCGGGGCACA ATAGTGTATG GGAATTGGCT CAAAGGATAT CTTTGGACAA GCTTGTGTAA 3300
170
TGACTGAGGT ATTACAACTT ATCAACCTAT AGCTGGTACT atcattatct ATTGATACTA 3360 TATCAAGTTT ATAAAGAAGT GCATATTCTT TCTGCATCTT ATCTCTTATG CTTGTGGTGA 3420 TATTGAAAGA GCAGTTTTTC ATTTCTCCTC CCTTTATTGT TCCCTCGCTA TTACTATTGT 3480 TATTAGCAGT actattattg GTATTAGTAG TATTCCTCAA ATCAGTGCAA TTTAAAGTAA 3540 CACAGAGTGG GGTTAATTTT ACACATGGCT TTAGGCTľTG ATCCCATAAA CTGATTATAT 3600 CCTCATGCAT CTGTTCTACC ATGTTATTTT TCCACATGTT AAAATTTTCT GTCACATTTA 3660 CCAATTCTAC TTCTTGTGGG TTGGGGTCTG TGGGTACACA GGCTTGTGTG GCCCAAACAT 3720 TATGTACCTC TGTATCATAT GCTTTAGCAT CTGATGCACA AAATAGAGTG GTGGTTGCTT 3780 CTTTCCACAC AGGTACCCCA TAATAGACTG TGACCCACAA TTTTTCTGTA GCACTACAGA 3840 TCATTAATAA CCCAAGGAGC ATCGTGCCCC ATCCCCACCA GTGCTGATAA TTCCTCCTGA 3900 TCCCCTTCAC GGCCATGGAG GCCTTATTTA TATTCCAAAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΤΆ AAATTTCAAT 3960 TTTTATCGAT TACGTAGTTA ACGCGGCCGC GGCCTAGCCG GCCATAAAAA TCTAGCTGGC 4020 GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGAATGGCG 4080 AATGGGAAAT TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA 4140 GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA 4200 CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG 4260 ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT 4320 CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG 4380 GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA 4440 AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA 4500 CCACCACACC CGCCGCGCTT ÄATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG 4560 GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC 4620 TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA 4680 TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG 4740 CTCACCCAGA AACGCTGGTG AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG 4800 GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC 4860 GTTTTCCÄAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGTTG 4920 ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT 4980 ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG 5040 CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC 5100 CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT 5160 GGGAACCGGA GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ÄTGCCTGCAG 5220 CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC 5280
171
AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC 5340 TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA 5400 TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG 5460 GGAGTCAGGC AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA 5520 TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT actcatatat ACTTTAGATT GATTTAAAAC 5500 TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA 5640 TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT 5700 CTTCTTGAGA TCC-ΓΓΓΤΤ-ΓΓ CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC 5760 TACCAGCGGT GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 5820 GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC 5080 ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG 5940 CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG 6000 ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA 6060 CGACCTACAC CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCATTG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG 6120 AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA 6180 GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT 6240 GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA 63UU GCAACGCGGC CTTTTTACGG TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC 6360 CTGCGTTATC CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG 6420 CTCGCCGCAG CCGAACGACC GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAG 6474
. (2) infoxfflfióe o sekvenci identifiksční číslo 36:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka9 55 párú nukleotidú (B) typ s nukleová kyselina (G) druh vlákna* jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popist syntetický SNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroji (B) kloní P-artP(ll) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 33:
GGGCAGGTTT TTATGGGAAG ΟΤΤΤΤΤΤΤΤΤ ΤΤΤΤΤΪΤΤΤΤ TGGCATAW $0
ATCáC 55 . (2) inforaece o sekvenciidentifikačni číslo 39:
(2) informaoe o sekvenci identifikační číslo 23:
(i) vlastnosti sekvenc©:
(A) délka# 26 párá nukleotidá (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologi©: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: odS3 (xi) popis sekvenoe: sekvenoe identifikační Číslo 23: TGTGAGGCCT AáTAGACCTC TGTACA 26
- 14? (2) informace o sekvonci identifikační Číslo 231 (i) vlastnosti sekvences (A) délkai 13 páru nukleotidá (B) ty p í nukleová kyseline (C) druh vlákna t jodnovláknová (D) topologieí lineárni (ii) typ molekuly: j iná nukleová kyseline (A) popiss syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) klom Sfll (1) (xi) popis sekvence« sekvence identifikační číslo 29 s
GGCCGGCTAG GCC 13 (2) infonmaoe o sekvenoi identifikační čislo 3θ» (i) vlastnosti sekvence’:
(A) Úélkes 13 párá mikleotidá (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jodnovláknová (D) topologiei lineárni (íl) typ molekuly: j iná nukleová kysalina (A) popist syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroji (S) klen: Sfil (2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační čislo 30* GGQGATATAG gcc 13 (2) informace o eekvanci identifikační číslo 31* (i) vlastnosti sekvence:
(A) délkai 66 párá mikleotidú.
($) typ: nukleová J^selins (Q) druh vlákne: jodnovláknová (D) topologi©: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová l^seliiaa (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: odTKl (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 31: GAGTCGATGT AACACTTTCT AGAGGATCCG TTAACTQGGG AGAATTCCAT $0 CAQGTTAGAA AATGCG 66
- 143 (2) inforEfiOQ o sekvenci identifikační číslo 32:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 79 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyseline (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: jednovláknová (11) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: P-J(l) (si) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 32:
GATCOGC-CCG GdAGGCOGC GGCCGCOCGG GTTTTTATCT CGAGACAAAA $0
AGAOGGAGCG GGCGGGGGGA TATAGGGQG 79 (2) infOTissce o sekvenci Identifikační číslo 33* (i) vlastnosti sekvence* (A) délka: 79 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: P-J(2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 33»
AASTOGGCOT ATATGGOCGG GOGCGGSGGG TCTTmGTC UCGAGA3AAA 50
AAČOCÚGOCG G0GGCGGCG5 AGCCGGCCG 79 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 34:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka t 13 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselins (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: odTK2
-W’· \ (xi) popis sekvence: sekvence identifikační, číslo 34:
agaagccgtg ggtcattg (2) inforsace o sekvenci identifikační číslo 35'<
(D vlastnosti sekvence:
(Λ) délka: 21 párú nukleotidú (3) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly s jiná nukleová kyselina (A) popisi syntetický DNA oligonukleotíd (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: odTK3 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 35: TAGCGTGTQG CTGTAACTTA C 21 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 35:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 75 párú nuHeotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DKA oligonukleotíd (vil) bezprostrední zdroj:
(B) klom B-A(O.l) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 36: AGGCOGGCTA GGCOGCGGOC GCCCGGGTTT TTATOTGQAG AGAAAAAGAC GGACCGGGOC OGGCCATATA GGOCA (2) informace o sekvenci identifikační číslo 37» (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 33 párú nukleotidú (B) typ: jiná nukleová l^selina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ií) typ molekuly: jiná nukleová kyseline (A) popis: syntetický DNA oligonukleotíd bezprostrední zdroji (B) íW^aj (xiX popi^^^k^^cá^^kvence identifikační Sigio _J7:
ÁA CCCGGGOQ ·;€ΓΰΟ008έζ^^^^Ο^ΐ’0αΦ;·..
(2) lnformace o sekvenci identifikační číslo 26e (i) vlastnosti sekvenc©:
(á) délka: 13 párä nukleotidú (B) typ t nukleová kyselina (G) druh vlákna i jednovláknová (D) topologie* lineárni (ii) typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) popis i syntetický DNA ollgonukleotid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) klom I-ScgI linker 2 (xi) popis sekvence: sekvenc© identifikační číslo 26: ATTAGCOTGT TATCCCTA 18 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 27:
(i) vlastnosti sekvenc©:
(A) délka: 23 párú nukleotidá (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákne: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiňá nukleová kyselina (A) popína syntetický DNA oligonuklootid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: odS2 (xi) popis sekvenc©: sekvenoe identifikační Číslo 27: GSATAAAGTC GGACTATTGT TCT 2?
(2) informace o sekvenci identifikační číslo 19::
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: >6 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni
- 145 ~ (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pN2gpt-gpl60 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 19:
TTTTTGGCAT ATAAATCGTT ATCCACCATG TAAGATAACG AATTCCATGG CCCGGG 56 (2) informece o sekvenci identifikační číslo 20:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 331 páru nukleotidíi (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pvWF (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 20:
TTTTTTTTGG CATATAAATC GCGGCCGCGG GTGGTTGGTG GATGTCACAG CTTGGGCTTT 60 ATCTCCCCCA GCAGTGGGAT TCCACAGCCC CTGGGCTACA TAACAGCAAG ACAGTCCGGA 120 GCTGTAGCAG ACCTGATTGA GCCTTTGCAG CAGCTGAGAG CATGGCCTAG GGTGGGCGGC 180 ACCATTGTCC AGCAGCTGAG TTTCCCAGGG ACCTTGGAGA TAGCCGCAGC CCTCATTTGC 240 AGGGGAAGAT GTGAGGCTGC TGCAGCTGCA TGGGTGCCTG CTGCTGCCTG CCTTGGCCTG 300 ATGGCGGCCG CCCGGGTTTT TATCTCGAGA C 331 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 21:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 50 páru nukleotidú.
(B) typ: nukleová kyselina (0) druh, vlákna: jednovláknová (D) typológie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pEcoK-dhr (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 21:
ATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCGG TAATTAGATT CTCCCACATT
144 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 22:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1209 páru nukleotidú.
(B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: synteticky DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pdhr-gpt (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 22:
ATTAGCGTCT. CGTTTCAGAC GCGGCCGCTC TAGAACTAGT GGATCCCCCA ACTTAAGGGT 60 ACCGCCTCGA CATCTATATA CTATATAGTA ATACCAATAC TCAAGACTAC GAAACTGATA 120 CAATCTCTTA TCATGTGGGT AATGTTCTCG ATGTCGAATA GCCATATGCC GGTAGTTGCG 180 ATATACATAA ACTGATCACT AATTCCAAAC CCACCCGCTT TTTATAGTAA GTTTTTCACC 240 CATAAATAAT AAATACAATA ATTAATTTCT CGTAAAAGTA GAAAATATAT TCTAAT1TAT 300 TGCACGGTAA GGAAGTAGAA TCATAAAGAA CAGTGACGGA TGATCCCCAA GCTTGGACAC 360 AAGACAGGCT TGCGAGATAT GTTTGAGAAT ACCACTTTAT CCCGCGTCAG GGAGAGGCAG 420 TGCGTAAAAA GACGCGGACT CATGTGAAAT ACTGGTTTTT AGTGCGCCAG ATCTCTATAA 480 TCTCGCGCAA CCTATTTTCC CCTCGAACAC TTTTTAAGCC GTAGATAAAC AGGCTGGGAC 540 ACTTCACATG AGCGAAAAAT ACATCGTCAC CTGGGACATG TTGCAGATCC ATGCACGTAA 600 ACTCGCAAGC CGACTGATGC CTTCTGAACA ATGGAAAGGC ATTATTGCCG TAAGCCGTGG 660 CGGTCTGGTA CCGGGTGCGT TACTGGCGCG TGAACTGGGT ATTCGTCATG TCGATACCGT 720 TTGTATTTCC AGCTACGATC ACGACAACCA GCGCGAGCTT AAAGTGCTGA AACGCGCAGA 780 AGGCGATGGC GAAGGCTTCA TCGTTATTGA TGACCTGGTG GATACCGGTG GTACTGCGGT 840 TGCGATTCGT GAAATGTATC CAAAAGCGCA CTTTGTCACC ÄTCTTCGCAA AACCGGCTGG 900 TCGTCCGCTG GTTGATGACT ATGTTGTTGA TATCCCGCAA GATACCTGGA TTGAACAGCC 960 GTGGGATATG GGCGTCGTAT TCGTCCCGCC AATCTCCGGT CGCTAATCTT TTCAACGCCT 1020 GGCACTGCCG GGCGTTGTTC TTT1TAACTT CAGGCGGGTT ACAATAGTTT CCAGTAAGTA 1080 TTCTGGAGGC TGCATCCATG ACACAGGCAA ACCTGAGCGA AACCCTGTTC AAACCCCGCT 1140 TTGGGCTGCA GGAATTCGAT ATCAAGCTTA TCGATACCGT CGCGGCCGCG GTAATTAGAT 1200
1209 tctcccaca
MS (2) informsee o sekvenci identifikační číslo 23s (i) vlastnosti sekvences (A) délka® 26 párä nukleotidú (B) typ® nukleová kyseline (C) druh vlákna s jednovláknová (D) topologiet lineárni (ii) typ molekuly® jiná nukleová kyselina (á) popis i syntetický KU oligonukleotid (vil) bezprostrední zd^roj® (B) kloň® odN2 (xi) popis sekvence® sekvence identifikační číslo 231 GGCCGATATC ΦΤΑΑΤΤΤΑΑΛ AGGGCT 26 (2) informece o sekvenci identifikační číslo Mi (i) vlastnosti sekvence® (A) délka® 24 párú nukleotidú (B) typ® nukleová kyselina (C) druh vlákna® jednovláknová (D) topologie® lineárni (ii) typ molekuly® jiná nukleová kyselina (A) popis® syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj® (B) kloň® 0dN3 (xi) popis sekvence® sekvence identifikační číslo 24® CÓAA5®KA0 GTGGGTTACA TCAG 24 (2) informace o sekvenci idetifikační číslo 25® (i) vlastností sekvence® (A) délka® 13 párú nukleotidú (B) typ® nukleová kyselina (Q) druh vlákna® jednovláknová (D) topologie® lineárni (ii) typ molekuly® jiná nukleová k^jáliúa..
(A) popis® syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj® (B) kloň® 1-SeeI linfcer 1 (xi) popis sekvence® sekvence identifikační číslo 25® TAGGGATAAC AGGGTAAT 13
J’; *·’* '· ·*< y» ;.<··‘v? -:*>·’.· · > ·' ‘ • : >*.'· ·'· 'T. - 146 -
(2) Informace o sekvenci identifikační číslo 4:
(i) Vlastnosti sekvenceí (A) délka t 66 páru, nukleotidú (B) typ í nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (Ľ) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pHindJ-2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační Číslo 4;.
CGCATTTTCT AACGTGATGG GATCCGTTAA CTCGCGAGAA TTCTGTAGAA 50
AGTGTTACAT OGACTC 66 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo 5: (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka : 127 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pHindJ-3 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 5:
CGCATTTTCT AACGTGATGG GATCCGGCCG GCTAGGCCGC GGCCGCCCGG50
GTTTTTATCT cgagacaaaa agacggaccg ggcccggcca TATAGGCCCA100
ATTCTGTAGA AAGTGTTACA TCGACTC127 (2) Informace o sekvenci identifikační Číslo 6:
(i) vlastnosti sekvence:
(.A) délka: 115 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni
IJ6 (11) typ molekuly 8 jiná nukleová kyseline (A) dopid: syntetický DNA oHgonukleotid (vil) bezprostrední zéroj» (B) klon« pAO (xl) popis sekvenceí aekvence identifikační číslo 6s
AGGGAACAAA AGCTGGAGGT AGGáOGGGTA GGCCGCGGCG GCCCGGGTTT JO
TTATCTCGAG AOAAAAAGAC ggacoggggg CGGCGATATA GGCCAGTACG 100 GAATTCGGOO TATAG i; 115 (2) Informaoe o sekvenci identifikační číslo 71 (i) vlastnosti sekvence:
(A) diUcas 103 páry nukleotidá (B) typ» nukleová kyselina (C) druh vlákne» jednovláknová (D) topologie: lineárni (11) typ molekuly» jiná nukleová kyselina (A) popis» syntetlelý DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj» (B) kloní pAl (ad.) popis sekvenGet sokvence identifikační číslo 7«
CGGCCGCCCG GGTTTTTäTC TGGACATATG CTGGAGTTAA CGAATTOGAT 50 GGGGATCGGA TATCAAGGTT AGGOCTGTCG ACGTCGAGAC AAAAAGACGG 100 AOC 103 (2) Informaoe o sekvenci číslo 8» (I) vlastnosti eekvence» (A) délke* 103 párá nukleotldd (B) typ t nukleová kyselina (Q) druh vlákna» jednovláknová (D) topologie» lineárni (II) typ molekuly» j iná nukleová kyselina (A) popis» syntetický DNA oligonukl&otid (vil) bezprostrední zdroji (B) kloňt pA2 (xi) popis sekvencet eekve^ne identifikační číslo 8»
CGGCCGOOOG GGTTTTTATC TOGACGTCGA CAGGCCTAAG CTTGATATCG 50
GATGCOCATG GAATTCGTTA ACTGOAGCAT ATGTCGAGAC AAAAAGAQGG 100
ACC 103
157 (2) inforaece o sekvence identifikační číslo 9» (i) vlastností sekvence:
(A) délkae 213 párú nukleotidú (B) typ: nukleová, kyselina (C) druh vlákna i jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly i jiná nukleová kyseline (A) popis i syntetický DNA oligonuklectid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) klen: pAl-Sl (xi) popis sekvence: sekwnc© identifikační číslo 9« k
CCCGGGm® tatctcgaga sacgggttgg tataggqgag aaotaagtaa50
TTGTAAAGAA GAAAAOGAAA CTAWGAAAAC CGTTTATGAA ATGATAGAAA100
AÄAGOTATA AATAATGCTG TATSCTAGTT TAAGTAACäG SEäAAATAATG150
AGTAGAAAAT ACTATTTTTT ATAGCGTATA AATCATGAAT TCGGATCCGA200
ÍATGAAGCTT AGG213 (2) informace o sekvenci číslo 10:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délks* 215 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyseline (0) druh vlákna : jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický oligonukleotid (vil) bezprostrední Zdroj:
(B) kloní pA2—Sl (xi) pojkj sekvence: eekvence identifikační číslo 10:
OAGGCCTAAG OTTGATATGG GATOCQAATT GATGATTTAT AGGGTA1AAA 50 AAATAGTATT TTGTACTGAT TATTTTACTG ΦΤΑΟΦΤΑΑΑΟ TAAAATAGäG 100 GATTATTTAT ΑΤΤΟΤΤΤΤΦΤ CTATGATTTG ATAAAOGGTT TTGAíÄiTTT 150 GGTTTTGTTC TTTAGAATTA CTTAGTTGTC CGQTATACCA AGGCGTATGT 200 ggagacaaaa agacg 215 (2) informace o sekvenoi identifikační číslo 11:
(i) vlastnosti eékvôno©:
(A) dálks: 88 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyeelina
- 138 .
l· (O) druh vlákna t jednovláknová (D) topologiea lineárni (ii) typ molekuly t jiná nukleová kyselina (A) popis i syntetický I®U oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroji (B) kloňt pAl-S2 (xi)í popis eekvence: sekvence identifikační číslo 11t TCTCGAGATA TGCTGOAGTT GGGAAGGTTT ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTTTTGGO $0 ATATAAATAG GCTGGAGGAA TTCGATGGGG ATGCGATA 88 (2) inforaace o sekvenci identifikační číslo 12« (i) vlastnosti sekvences (A) délkfií 92 párd nukleotidii (B) typ» nukleová kyseline (C) druh vlákna i jednovláknová (D) topologiet lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselins (A) popis! syntetický 1ΜΑ oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroji (B) kloní pA2—S2 (xi)i popis sekvenoei sekvence identifikační Číslo 121
TTGATATCGG ATOCCCATGG AATTGCTGQA GGCTATTTAT ATGCCAAAAA 50
ÁAAAAAAAAA AAAAAGCTTC OOAACTGCAG CATATGTCGA GA 92 (2) informece o sekvenci identifikační číslo 13« (i) vlastnosti sekvenoet (A) délkai 127 párú nukleotidá (B) typ s nukleová kyselina (0) druh vlákna s jednovláknová (D) topologiet lineárni (ii) typ molekuly: j iná nukleová Kyselina (A) popis« syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroji (B) klom pK2gpt-SjA (obrázok 4,7) (xi) popis sekvenoot sekvence identifikační číslo 13«
TAGCGWAAG TTGGGCTGCA GAAGOTTTTT TTllWTTTT TTTŤTGGQAT 50
ATAAATGAAT TCCATGGCGC GGGAAGGCCT OGGACCGGGC GQGGOGATAT 100
AGGCCAGOGA TACCGTGGOG GCCGGGA 12?
- 139 - (2) inf.ormace o sekvenci identifikační číslo 14:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 134 párú nukleotidú (3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotíd (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pN2gpt-S4 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 14:
TAGGGTTAAG TTGGGCTGCA GAAGCTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGCAT 50
ATAAATOGTT AACGAATTCC ATGGOCGGGG AAGGCCTOGG ACCGGGGCCG 100
GCGATATAGG GCAGCGATAG GGTGGGGGCC GCGA 154 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 15:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1988 párú nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis syntetický DNA oligonukleotíd (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pAlSl-FT
(xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 15 í TTTTATAGCC TATAAATCAT GAATTCCGCG CACGTCCGAG GCTTGCAGCT GCCTGGCTGC 60 CTGGCCCTGG CTGCCCTGTG TAGCCTTGTG CACAGCCAGC atgtgttcct GGCTCCTCAG 120 CAAGCACGGT CGCTGCTCCA GCGGGTCCGG CGAGCCAACA CCTTCTTGGA GGAGGTGCGC 180 AAGGGCAACC TAGAGCGAGA GTGCGTGGAG GAGACGTGCA GCTACGAGGA GGCCTTCGAG 240 GCTCTGGAGT CCTCCACGGC TACGGATGTG TTCTGGGCCA AGTACACAGC TTGTGAGACA 300 GCGAGGACGC CTCGAGATAA GCTTGCTGCA TGTCTGGAAG GTAACTGTGC TGAGGGTCTG 360 GGTACGAACT ACCGAGGGCA TGTGAACATC ACCCGGTCAG GCATTGAGTG CCAGCTATGG 420 AGGAGTCGCT ACCCACATAA GCCTGAAATC AACTCCACTA CCCATCCTGG GGCCGACCTA 480 CAGGAGAATT TCTGCCGCAA CCCCGACAGC AGCAACACGG GACCATGGTG CTACACTACA 540 GACCCCACCG TGAGGAGGCA GGAATGCAGC ATCCCTGTCT GTGGCCAGGA TCAAGTCACT 600
140 -
GTAGCGATGA CTCCACGCTC CGAAGGCTCC AGTGTGAATC TGTCACCTCC ATTGGAGCAG 660 TGTGTCCCTG ATCGGGGGCA GCAGTACCAG GGGCGCCTGG CGGTGACCAC ACATGGGCTC 720 CCCTGCCTGG i CCTGGGCCAG CGCACAGGCC AAGGCCCTGA GCAAGCACCA GGACTTCAAC 780 TCAGCTGTGC AGCTGGTGGA GAACTTCTGC CGCAACCCAG ACGGGGATGA GGAGGGCGTG 840 TGGTGCTATG TGGCCGGGAA GCCTGGCGAC TTTGGGTACT GCGACCTCAA CTATTGTGAG 900 GAGGCCGTGG AGGAGGAGAC AGGAGATGGG CTGGATGAGG ACTCAGACAG GGCCATCGAA 960 GGGCGTACCG CCACAAGTGA GTACCAGACT TTCTTCAATC CGAGGACCTT TGGCTCGGGA 1020 GAGGCAGACT GTGGGCTGCG ACCTCTGTTC GAGAAGAAGT CGCTGGAGGA CAAAACCGAA 1080 AGAGAGCTCC TGGAATCCTA CATCGACGGG CGCATTGTGG AGGGCTCGGA TGCAGAGATC 1140 GGCATGTCAC CTTGGCAGGT GATGCTTTTC CGGAAGAGTC CCCAGGAGCT GCTGTGTGGG 1200 GCCAGCCTCA TCAGTGACCG CTGGGTCCTC ACCGCCGCCC ACTGCCTCCT GTACCCGCCC 1260 TGGGACAAGA ACTTCACCGA GAATGACCTT CTGGTGCGCA TTGGCAAGCA CTCCCGCACC 1320 AGGTACGAGC GAAACATTGA AAAGATATCC ATGTTGGAAA AGATCTACAT CCACCCCAGG 1380 TACAACTGGC GGGAGAACCT GGACCGGGAC ATTGCCCTGA TGAAGCTGAA GAAGCCTGTT 1440 GCCTTCAGTG ACTACATTCA CCCTGTGTGT CTGCCCGACA GGGAGACGGC AGCCAGCTTG 1500 CTCCAGGCTG GATACAAGGG GCGGGTGACA GGCTGGGGCA ACCTGAAGGA GACGTGGACA 1560 GCCAACGTTG GTAAGGGGCA GCCCAGTGTC CTGCAGGTGG TGAACCTGCC CATTGTGGAG 1620 CGGCCGGTCT GCAAGGACTC CACCCGGATC CGCATCACTG ACAACATGTT CTGTGCTGGT 1680 TACAAGCCTG ATGAAGGGAA ACGAGGGGAT GCCTGTGAAG GTGACAGTGG GGGACCCTTT 1740 GTCATGAAGA GCCCCTTTAA CAACCGCTGG TATCAAATGG GCATCGTCTC ATGGGGTGAA 1800 GGCTGTGACC GGGATGGGAA ATATGGCTTC TACACACATG TGTTCCGCCT GAAGAAGTGG 1860 ATACAGAAGG TCATTGATCA GTTTGGAGAG TAGGGGGCCA CTCATATTCT GGGCTCCTGG 1920 AACCAATCCC GTGAAAGAAT TATTTTTGTG TTTCTAAAAC TAGAATTCGG ATTCGATATC 1980 AAGCTTAG 1988 (2) informace o sekvenci identifikační Číslo (i) vlastnosti sekvence: (A) délka: 26 páru nukleotidu 16:
(B) typ: nukleová kyselina (C) druh, vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineá_ní (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: odNl (xi): popis sekvence: sekvence identifikační čislo 16:
GGGCSGGCCT TTTAAATTAA GATATC
- 141 (2) inforir.ace o sekvenci identifikační čislo 17:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 111 páru nukleotidú (3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pN2gpt-GPg (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 17:
TTTTTGGCAT ATAAATCGTT CCAGTCCCAA AATGTAATTG GACGGGAGAC AGAGTGACGC (
ACGCGGCCGC TCTAGAACTA GTGGATCCCC CAACGAATTC CATGGCCCGG G 1] (2) infornace o sekvenci identifikační Číslo 18:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 2296 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) : popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pN2gpt-ĽPg (xi): popis sekvence: sekvence identifikační číslo 18:
ATAAATCGTT AACGAATTCC ATGGAACATA AGGAAGTGGT TC'ITCTACTT CTTTTATTTC 60 TGAAATCAGG TCAAGGAAAA GTGTATCTCT CAGAGTGCAA GACTGGGAAT GGAAAGAACT 120 ACAGAGGGAC GATGTCCAAA ACAAAAAATG GCATCACCTG TCAAAAATGG AGTTCCACTT 180 CTCCCCACAG ACCTAGATTC TCACCTGCTA CACACCCCTC AGAGGGACTG GAGGAGAACT 240 ACTGCAGGAA TCCAGACAAC GATCCGCAGG GGCCCTGGTG CTATACTACT GATCCAGAAA 300 AGAGATATGA CTACTGCGAC ATTCTTGAGT GTGAAGAGGA ATGTATGCAT TGCAGTGGAG 360 AAAACTATGA CGGCAAAATT TCCAAGACCA TGTCTGGACT GGAATGCCAG GCCTGGGACT 420 CTCAGAGCCC ACACGCTCAT GGATACATTC CTTCCAAATT TCCAAACAAG AACCTGAAGA 480 AGAATTACTG TCGTAACCCC GATAGGGAGC TGCGGCCTTG GTGTTTCACC ACCGACCCCA 540 ACAAGCGCTG GGAACTTTGC GACATCCCCC GCTGCACAAC ACCTCCACCA TCTTCTGGTC 600
142
CCACCTACCA GTGTCTGAAG GGAACAGGTG AAAACTATCG CGGGAATGTG GCTGTTACCG 660 TTTCCGGGCA CACCTGTCAG CACTGGAGTG CACAGACCCC TCACACACAT AACAGGACAC 720 CAGAAAACTT CCCCTGCAAA AATTTGGATG AAAACTACTG CCGCAATCCT GACGGAAAAA 780 GGGCCCCATG GTGCCATACA ACCAACAGCC AAGTGCGGTG GGAGTACTGT AAGATACCGT 840 CCTGTGACTC CTCCCCAGTA TCCACGGAAC AATTGGCTCC CACAGCACCA CCTGAGCTAA 900 CCCCTGTGGT CCAGGACTGC TACCACGGTG ATGGACAGAG CTACCGAGGC ACATCCTCCA 960 CCACCACCAC AGGAAAGAAG TGTCAGTCTT GGTCATCTAT GACACCACAC CGGCACCAGA 1020 AGACCCCAGA AAACTACCCA AATGCTGGCC TGACAATGAA CTACTGCAGG AATCCAGATG 1080 CCGATAAAGG CCCCTGGTGT TTTACCACAG ACCCCAGCGT CAGGTGGGAG TACTGCAACC 1140 TGAAAAAATG CTCAGGAACA GAAGCGAGTG TTGTAGCACC TCCGCCTGTT GTCCTGCTTC 1200 CAGATGTAGA GACTCCTTCC GAAGAAGACT GTATGTTTGG GAATGGGAAA GGATACCGAG 1260 GCAAGAGGGC GACCACTGTT ACTGGGACGC CATGCCAGGA CTGGGCTGCC CAGGAGCCCC 1320 ATAGACACAG CATTTTCACT CCAGAGACAA ATCCACGGGC GGGTCTGGAA AAAAATTACT 1380 GCCGTAACCC TGATGGTGAT GTAGGTGGTC CCTGGTGCTA CACGACAAAT CCAAGAAAAC 1440 TTTACGACTA CTGTGATGTC CCTCAGTGTG CGGCCCCTTC ATTTGATTGT GGGAAGCCTC 1500 AAGTGGAGCC GAAGAAATGT CCTGGAAGGG TTGTGGGGGG GTGTGTGGCC CACCCACATT 1560 CCTGGCCCTG GCAAGTCAGT CTTAGAACAA GGTTTGGAAT GCACTTCTGT GGAGGCACCT 1620 TGATATCCCC AGAGTGGGTG TTGACTGCTG CCCACTGCTT GGAGAAGTCC CCAAGGCCTT 1680 CATCCTACAA GGTCATCCTG GGTGCACACC AAGAAGTGAA TCTCGAACCG CATGTTCAGG 1740 AAATAGAAGT GTCTAGGCTG TTCTTGGAGC CCACACGAAA AGATATTGCC TTGCTAAAGC 1800 TAAGCAGTCC TGCCGTCATC ACTGACAAAG TAATCCCAGC TTGTCTGCCA TCCCCAAATT 1860 ATGTGGTCGC TGACCGGACC GAATGTTTCA TCACTGGCTG GGGAGAAACC CAAGGTACTT 1920 TTGGAGCTGG CCTTCTCAAG GAAGCCCAGC TCCCTGTGAT TGAGAATAAA GTGTGCAATC 1980 GCTATGAGTT TCTGAATGGA AGAGTCCAAT CCACCGAACT CTGTGCTGGG CATTTGGCCG 2040 GAGGCACTGA CAGTTGCCAG GGTGACAGTG GAGGTCCTCT GGTTTGCTTC GAGAAGGACA 2100 AATACATTTT ACAAGGAGTC ACTTCTTGGG GTCTTGGCTG TGCACGCCCC AATAAGCCTG 2160 GTGTCTATGT TCGTGTTTCA AGGTTTGTTA CTTGGATTGA GGGAGTGATG AGAAATAATT 2220 AATTGGACGG GAGACAGAGT GACGCACGCG GCCGCTCTAG AACTAGTGGA TCCCCCGGGA 2280 AGGCCTCGGA CCGGGC 2296
(2) Informace o sekvenci identifikační číslo 3í (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 1133 páru nukleotidu (B) typ : nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid.
(vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pN2-gptb (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 3*
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AAAGCGGGGT TTGAACAGGG TTTCGCTCAG GTTTGCCTGT 60 GTCATGGATG CAGCCTCCAG AATACTTACT GGAAACTATT GTAACCCGCC TGAAGTTAAA 120 AAGAACAACG CCCGGCAGTG CCAGGCGTTG AAAAGATTAG CGACCGGAGA TTGGCGGGAC 180 GAATACGACG CCCATATCCC ACGGCTGTTC AATCCAGGTA TCTTGCGGGA TATCAACAAC 240 ATAGTCATCA ACCAGCGGAC GACCAGCCGG TTTTGCGAAG ATGGTGACAA AGTGCGCTTT 300 TGGATACATT TCACGAATCG CAACCGCAGT ACCACCGGTA TCCACCAGGT CATCAATAAC 360 GATGAAGCCT TCGCCATCGC CTTCTGCGCG TTTCAGCACT TTAAGCTCGC GCTGGTTGTC 420 GTGATCGTAG CTGGAAATAC AAACGGTATC GACATGACGA ATACCCAG1T CACGCGCCAG 480 TAACGCACCC GGTACCAGAC CGCCACGGCT TACGGCAATA ATGCCTTTCC ATTGTTCAGA 540 AGGCATCAGT CGGCTTGCGA GTTTACGTGC ATGGATCTGC AACATGTCCC AGGTGACGAT 600 GTATTTTTCG CTCATGTGAA GTGTCCCAGC CTGTTTATCT ACGGCTTAAA AAGTGTTCGA 660 GGGGAAAATA GGTTGCGCGA GATTATAGAG ATCTGGCGCA CTAAAAACCA GTATITCACA 720 TGAGTCCGCG TCTTTTTACG CACTGCCTCT CCCTGACGCG GGATAAAGTG GTATTCTCAA 780 ACATATCTCG CAAGCCTGTC TTGTGTCCAA GCTTGGGGAT CATCCGTCAC TGTTCTTTAT 840 GATTCTACTT ccttaccgtg CAATAAATTA GAATATATTT TCTACTTTTA CGAGAAATTA 900
- 135 -
ATTATTGTAT ΤΤΑΤΤΑΤΤΓΑ TGGGTGAAAA ACTTACTATA AAAAGCGGGT GGGTTTGGAA 960 TTAGTGATCA GTTTATGTAT ATCGCAACTA CCGGCATATG GCTATTCGAC ATCGAGAACA 1020 TTACCCACAT GATAAGAGAT TGTATCAGTT TCGTAGTCTT GAGTATTGGT ATTACTATAT 1080 AGTATATAGA TGTCGAGGCG GTACCCTTAA GTTGGGCTGC AGGAATTCGA TAT 1133
2.1111 vdN/Al č. 4.1111 vdN/Al č. vdlVAl δ. vdN/Al ô. vdh/Al č.
3·;
B) mapy SspI resktirknčích fragmentú chimerních. virú drúbežích neštovic o co •P a ω ♦H h o
I *>
aj
Φ o co p d ω •ri R O J ľo ca
Obrázek 12.2B
--------''Vd,
AA3r0O'y ΑΖ3Μ'ΑΛ
Ro í:
PATENTSERVIS
PRAHA /
X) O Ό <u U—. bC ΓΜ ΓΜ CM r^i CM ΓΜ CM ä ä ä ä k í—j ä b ut uL uL .· ·£*> .' - gpl60 gp!20 '•Míl - v. ľ· tsťa ijflŕ ik*·-
03&OQ í·' L 6 ς 0 •r3
B) met gin arg val asn oŕírodní faktor IX: ττ atg cag cgc gtg aac met glu arg val asn faktor IX vFIX č. ?: C£_AIfi_GAG cgc gtg aac
Obrázek !!♦!
I I ’
ΛΛ3Γ30 V~.......,
ΑΖ3ΊΥΝΛΛ O b d o vy n a” orientace
5500 m ?n
b orientace 7400 on 7 CO p n Sful 1 p7.5 j. Sful Sful 1. 1 W génom í gpt 1 FLX |
Notl selP Notl
Obrázek 11.2
Southernova blotová analýza chimér faktoru IX pd FIX
3.
45.4 ( 4.
H
3.0 2.2
AW'U
Pst O fragmentt pŕírodního viru jediná inserce a orientace jediná inserce »· . . u t .< i , .
”b orientace dvojná inserce tandem 'a' dvojná inserce tandem b” dvojná inserce pata-pata dvojná inserce hlava— hlava·
PAtENTSERVlS PRAHA
Obrázok 1.11
ÚŔAD
PROVYNÁLEZY AOBJEVY
Obrázek 2,1 ^ot * pravé raménko (ra) j
TJ :-n & o
OBJEVY r m l-J ·<
cx* > o to w o
X. S
O to bO levé raménko (la) • i ' h j h 11 ľľi i-'ťgawaftaiggWfcM (VV-tk lacZ 2.enomov^ viru drôbežích (f-TK2a) neštovic
I rozštépit pôsobením Notl, ’ defosforylovat ra
Notl P gpt Notl ra l/V-ŕk lacZ lacZ “a” orientace
-transfektovat do pomocným virem infektovaných fibroblastu kuŕecího zárodku in-vivo pakážování modifikovaného vírového genomu selekce na gpt positivni a lacZ negatívni vir
PATEní: .
λ . ---‘ V iO '-αΒλαηα
Obrázek 2.2 )
CO o< C-.
levé t
raménko (la) S?aI pravé raménko (ra) i >
genomová DNA viru vakcinie rozštépit pôsobením Smal | la ra :—~ ί la ligovat t
pi gpt ra .1-1 ..I...... J a-orientace gpt PI bVorientace
- transfektovat do fibroblastú kuŕecí bunka in vivo pakážování modifikovaného vírového genomu
I selekce viru obsahujícího gpt gen v savčích bunkách
Obrázek 3*1
3.0
N P
(3) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: seJJ? promotor (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo-70í
TATGAGATCT AAAAATTGAA ATTTTATTTT TTTTTTTTGG AATATAAAT 49 (2) .informace o sekvenci identifikační číslo 71:
(i) vlastnosti sekvence: ; (A) délka: J4 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná. nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: oFIX.l (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 71: TCATGTTCAC GCGGTGCATG GCCGCGGCCG GAGC 34 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 72:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 5532 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední adroj:
(B) kloň: pN2gpta-FIX (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 72:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60 CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120 GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 1S0 GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240 TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG atctcaacag CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300 TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360 TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420 ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480 GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540 CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG gatcatgtaa 600 CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660 CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720 CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780 TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840 GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
181
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960 TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020 AGATTGATTT AAAACTTCAT ΤΓΊΤΑΑΤΤΓΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTÄG 1140 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200 CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260 TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320 CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380 TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500 CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560 GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620 CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680 GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800 CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860 AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920 AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG attcattaat 1980 GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040 TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100 TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160 CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220 GCCGCTTGTT AATTTTCAAT TCCAATGAAT TAACCTTGGA AATCCATCTT TCATTAAGTG 2280 AGCTTTGTTT TTTCCTTAAT CCAGTTGACA TACCGGGATA CCTTGGTATA TATTCCATAT 2340 TTGCCTTTCA TTGCACACTC TTCACCCCAG CTAATAATTC CAGTTAAGAA ACTGGTCCCT 2400 TCCACTTCAG TAACATGGGG TCCCCCACTA TCTCCTTGAC ATGAATCTCT ACCTCCTTCA 2460 TGGAAGCCAG CACAGAACAT GTTGTTATAG ATGGTGAACT TTGTAGATCG AAGACATGTG 2520 GCTCGGTCAA CAAGTGGAAC TCTAAGGTAC TGAAGAACTA AAGCTGATCT CCC1TTGTGG 2580 AAGACTCTTC CCCAGCCACT TACATAGCCA GATCCAAATT TGAGGAAGAT GTTCGTGTAT 2640 TCCTTGTCAG CAATGCAAAT AGGTGTAACG TAGCTGTTTA GCACTAAGGG TTCGTCCAGT 2700 TCCAGAAGGG CAATGTCATG GTTGTACTTA TTAATAGCTG CATTGTAGTT GTGGTGAGGA 2760 ATAATTCGAA TCACATTTCG CTTTTGCTCT GTATGTTCTG TCTCCTCAAT ATTATGTTCA 2820 CCTGCGACAA CTGTAATTTT AACACCAGTT TCAACACAGT GGGCAGCAGT TACAATCCAT 2880 TTTTCATTAA CGATAGAGCC TCCACAGAAT GCATCAACTT TACCATTCAA AACAACCTGC 2940
(3) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: ofrotSl (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 68:
ACCCAGGACG gccatggcga agcgcgo
176 (2) iní'orná c e o sekvenc i identifikační číslo 69:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 6926 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (u) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pP2-gpl60MN (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 69:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60 CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120 GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180 GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240 TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300 TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360 TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420 ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480 GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540 CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600 CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660 CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720 CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780 TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840 GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900 TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960 TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020 AGATTGATTT AAAACTTCAT ΤΤΤΤΑΑΤΊΤΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200 CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260 TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320 CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380 TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
íhwíw
- 177 -
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560 GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620 CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680 GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800 CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860 AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920 AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980 GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040 TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100 TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160 CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220 GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280 GCTCAGGTTT gcctgtgtca TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340 CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400 CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460 GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520 TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580 CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640 GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700 CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GČAATAATGC 2760 CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820 TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880 CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940 AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000 AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060 CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120 CTTTTACGAG AAATTAATTA TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180 GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240 TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300 ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC C CTTAAG TTG GGCTGCAGTT 3360 GTTAGAGCTT GGTATAGCGG ACAACTAAGT AATTGTAAAG AAGAAAACGA AACTATCAAA 3420 ACCGTTTATG AAATGATAGA AAAAAGAATA TAAATAATCC TGTATTTTAG TTTAAGTAAC 3480 AGTAAAATAA TGAGTAGAAA ATACTATTTT TTATAGCCTA TAAATCGTTC CTCATGAGAG 3540
- 178 -
TGAAGGGGAT CAGGAGGAAT TATCAGCACT GGTGGGGATG GGGCACGATG CTCCTTGGGT 3600 TATTAATGAT CTGTAGTGCT ACAGAAAAAT TGTGGGTCAC AGTCTATTAT GGGGTACCTG 3660 TGTGGAAAGA AGCAACCACC ACTCTATTTT GTGCATCAGA TGCTAAAGCA TATGATACAG 3720 AGGTACATAA TGTTTGGGCC ACACAAGCCT GTGTACCCAC AGACCCCAAC CCACAAGAAG 3780 TAGAATTGGT AAATGTGACA GAAAATTTTA ACATGTGGAA AAATAACATG GTAGAACAGA 3840 TGCATGAGGA TATAATCAGT TTATGGGATC AAAGCCTAAA GCCATGTGTA AAATTAACCC 3900 CACTCTGTGT TACTTTAAAT TGCACTGATT TGAGGAATAC TACTAATACC AATAATAGTA 3960 CTGCTAATAA CAATAGTAAT AGCGAGGGAA CAATAAAGGG AGGAGAAATG AAAAACTGCT 4020 CTTTCAATAT CACCACAAGC ATAAGAGATA AGATGCAGAA AGAATATGCA CTTCTTTATA 4080 AACTTGATAT AGTATCAATA GATAATGATA GTACCAGCTA TAGGTTGATA AG'ITGTAATA 4140 CCTCAGTCAT TACACAAGCT TGTCCAAAGA TATCCTTTGA GCCAMTCCC ATACACTATT 4200 GTGCCCCGGC TGGTTTTGCG ATTCTAAAAT GTAACGATAA AAAGTTCAGT GGAAAAGGAT 4260 CATGTAAAAA TGTCAGCACA GTACAATGTA CACATGGAAT TAGGCCAGTA GTATCAACTC 4320 AACTGCTGTT AAATGGCAGT CTAGCAGAAG AAGAGGTAGT AATTAGATCT GAGAATTTCA . 4380 CTGATAATGC TAAAACCATC ATAGTACATC TGAATGAATC TGTACAAATT AATTGTACAA 4440 GACCCAACTA CAATAAAAGA AAAAGGATAC ATATAGGACC AGGGAGAGCA TTTTATACAA 4500 CAAAAAATAT AATAGGAACT ATAAGACAAG CACATTGTAA CATTAGTAGA GCAAAATGGA 4560 ATGACACTTT AAGACAGATA GTTAGCAAAT TAAAAGAACA ATTTAAGAAT AAARCAATAG 4620 TCTTTAATCA ATCCTCAGGA GGGGACCCAG AAATTGTAAT GCACÄGTTTT AATTGTGGAG 4680 GGGAATTTTT CTACTGTAAT ACATCACCAC TGTTTAATAG TACTTGGAAT GGTAATAATA 4740 CTTGGAATAA TACTACAGGG TCAAATAACA ATATCACACT TCAATGCAAA ATAAAACAAA 4800 TTATAAACAT GTGGCAGGAA GTAGGAAAAG CAATGTATGC CCCTCCCATT GAAGGACAAA 4860 TTAGATGTTC ATCAAATATT ACAGGGCTAC TATTAACAAG AGATGGTGGT AAGGACACGG 4920 ACACGAACGA CACCGAGATC TTCAGACCTG GAGGAGGAGA TATGAGGGAC AATTGGAGAA 4980 GTGAATTATA TAAATATAAA GTAGTAACAA TTGAACCATT AGGAGTAGCA CCCACCAAGG 5040 CAAAGAGAAG AGTGGTGCAG AGAGAAAAAA GAGCAGCGAT AGGAGCTCTG TTCCTTGGGT 5100 TCTTAGGAGC AGCAGGAAGC ACTATGGGCG CAGCGTCAGT GACGCTGACG GTACAGGCCA 5160 GACTATTATT GTCTGGTATA GTGCAACAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCC ATTGAGGCGC 5220 AACAGCATAT GTTGCAACTC ACAGTCTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAGTCCTGG 5280 CTGTGGAAAG ATACCTAAAG GATCAACAGC TCCTGGGGTT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC 5340 TCATTTGCAC CACTACTGTG CCTTGGAATG CTAGTTGGAG TAATAAATCT CTGGATGATA 5400 TTTGGAATAA CATGACCTGG ATGCAGTGGG AAAGAGAAAT TGACAATTAC ACAAGCTTAA 5460 TATACTCATT ACTAGAAAAA TCGCAAACCC AACAAGAAAA GAATGAACAA GAATTATTGG 5520 AATTGGATAA ATGGGCAAGT TTGTGGAA'TT GGTTTGACAT AACAAATTGG CTGTGGTATA 5580
179
TAAAAATATT CATAATGATA GTAGGAGGCT TGGTAGGTTT AAGAATAGTT TTTGCTGTAC 5640 TTTCTATAGT GAATAGAGTT AGGCAGGGAT ACTCACCATT GTCGTTGCAG ACCCGCCCCC 5700 CAGTTCCGAG GGGACCCGAC AGGCCCGAAG GAATCGAAGA AGAAGGTGGA GAGAGAGACA 5760 GAGACACATC CGGTCGATTA GTGCATGGAT TCTTAGCAAT TATCTGGGTC GACCTGCGGA 5820 GCCTGTTCCT CTTCAGCTAC CACCACAGAG ACTTACTCTT GATTGCAGCG AGGATTGTGG 5880 AACTTCTGGG ACGCAGGGGG TGGGAAGTCC TCAAATATTG GTGGAATCTC CTACAGTATT 5940 GGAGTCAGGA ACTAAAGAGT AGTGCTGTTA GCTTGCTTAA TGCCACAGCT ATAGCAGTAG 6000 CTGAGGGGAC AGATAGGGTT ATAGAAGTAC TGCAAAGAGC TGGTAGAGCr ATTCTCCACA 6060 TACCTACAAG AATAAGACAG GGCTTGGAAA GGGCTTTGCT ATAAGATGGG TGGCAAATGG 6120 TCAAAACGTG TGACTGGATG GCCTACTGTA AGGGAAAGAA TGAGACGAGC TGAACCAGAA 6180 CGAATTCCAT GGCCCGGGAA GGCCTCGGAC CGGGCCCGGC CATATAGGCC AGCGATACCG 6240 TCGCGGCCGC GACCTCGAGG GGGGGCCCGG TACCCAATTC GCCCTATAGT GAGTCGTATT 6300 ACGCGCGCTC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCGTTACCC 6360 AACTTAATCG CCTTGCAGCA CATCCCCCTT TCGCCAGCTG GCGTAATAGC GAAGAGGCCC 6420 GCACCGATCG CCCTTCCCAA CAGTTGCGCA GCCTGAATGG CGAATGGAAA TTGTÄAGCGT 6480 TAATATTTTG TTAAAATTCG CGTTAAATTT TTGTTAAATC AGCTCATTTT TTAACCAATA 6540 GGCCGAAATC GGCAAAATCC CTTATAAATC AAAAGAATAG ACCGAGATAG GGTTGAGTGT 6600 TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT AAAGAACGTG GACTCCAACG TCAAAGGGCG 6660 AAAAACCGTC TATCAGGGCG ATGGCCCACT ACGTGAACCA TCACCCTAAT caagtttttt 6720 GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG GAACCCTAAA GGGAGCCCCC GATTTAGAGC 6780 TTGACGGGGA AAGCCGGCGA ACGTGGCGAG AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA AAGGAGCGGG 6840 CGCTAGGGCG CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC GCTGCGCGTA ACCACCACAC CCGCCGCGCT 6900 TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTCAG 6926
3.1111
-4- 2.3 <- 2.0
Obrázek 5·2
PATENTSERVJS ';'..·.ΡΚΑΗΑ ' (s?
4.4
-4— 9.4
-4- 23
4.1
21.1
21.1
NP N . PN __J l--^ ý
4=
4.1 1.1 20
4.1
NP
P N __ I PN \ P N 1------------------------- 1 -------------------------1
4 . 4
4» Zpúsob podie bodu 3* vyznačuj!©! e e tím» že prvni DNA sekvence je vložené do prvniho genomu v mleté ätčpeni endonukleaeou špecifickou pro sekvenci·
4?
·;*· . ''·\-{'’ ·
zÍL ': .. :?.
·...·!
··. Ä • ·. .·* ‘ ’ · Λ· »· ' :<
• £* Λ
-?
* (¾ ί'ϊίί1^
155 r lineárni jiná nukleová kyselina (D) topologieí (11) typ molekuly a (A) popis í syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroje (B) klom B-SM(2) (xi) popis eekvence: eekvence Identifikační číslo 46a GTCTTGäGTA ®TG®£A®EAC 20 (2) lnfonaíace o sekvenci identifikační číslo 471 (i) vlastnosti sekvenceí (A) délka i 23 páril nukleotidá (B) typ s nukleová kyseline (C) druh vlákna í jednovláknová (D) tOpologlet lineárni (11) typ molekuly t j iná nukleová kyselina (A) popisi syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) klene P-SM(>) (xi) popis eekvencet eekvence Identifikační číslo 47 e
CGAAA02AT0 AÄAACGCTTT ATG 23 (2) inforaace 0 sekvenci identifikečnl číslo 48« (i) vlastnosti sekvencet (A) délka t 53 párú. nukleotidd (B) type nukleová kyseline (0) druh vlákna a jednovláknová (D) topologiee lineárni (ii) typ molekuly e j iná nukleová kyselina (A) popisI syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroja (B) kloň e P-W (1) (xi) popis sekvenees eekvenc© identifikační číslo 48: agctaggtga attcagggct catgsgagtg aaggggatca GGAGGAATTA TGA 53 (2) infoTEaoe o sekvenci identifikační číslo 49s (i) vlastnosti sekvenoea (A) délkaj 30 párd nukleotidČ (B) type nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová
154 (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly : jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: IMäN (2) (xi) popis sekvence: sekvenoe identifikační číslo 49:
GATCTGATGG AQAAAATAGA GTGGTGGTTG 30 (2) inforjoac® o sekvenci identifikační číslo 30:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 27 párú nukleotidá (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: j iná nukleová kyseline (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: P-seq(2) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 50: CTGTGGGTAC AGAGGCTTGT GTGGCCC 27 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 51 (i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 25 párú. nukleotidd (B) typ: nukleová kyselina (0) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselín» (A) popis: syntetický DNA oligoaukleotid (νϋ) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: P-seq(3) (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 51: (^ATTTSTCT GTAG0ACTAC AGATC 25 (2) informaee o sekvenci identifikační číslo 52:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 45 párä nukleotidô (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie* lineárni (11) typ molekuly* jiná nukleová kyselina (A) popis* syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroji (B) kloní 0-542 (xi) popis sekvenoe* sekvenoe identifikační číslo 52c
CGATTACGTA GTTAAGGGGG GC
GGTA GCCGGOOATA AAAAT (2) informace o sekvenol identifikační číslo 53:
(I) vlastnosti sekvenoe*' (A) délka* 47 párú nukleotidá (B) type nukleová tyseline (C) druh vlákna! jednovláknová (D) topologie* lineárni| (II) typ molekuly * j iná nukleová kyselina (A) popis: syntetický I$A oligonukleotid (Vil) bezprostrední zdroj i (B) kloní 0-544 (xi) popis sekvenoe: sekvenoe Identifikační číslo 55*0
CTAGAŠTm ATGGCOGGGT AGGCCGSGGG CGCGTTAACT feOGTAAT 4? \ (2) ínformaoe o sekveuci identifikační číslo 54* (1) vlastnosti sekvenoe* (A) délka* 50 párá nukleotidú (B) typ* nukleová kyseline (C) druh vlákna * ^jednovláknová (D) topologie! lineárni (ii) typ molekuly* jiná nukleová kyselina (A) popis* syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroj* (B) kloň* 0-541 (xi) popis sekvenoet sekvenoe identifikační číslo 54* CTTTTTCTGC GGGGGCGGAT ATGGW8GGT GGGGTTAACT ACGTgGACGT >0 (2) informsoe o sekvenei identifikační číslo 55» (i) vlastnosti sekvenoe* (A) délka* 53 párá nukleotidô (B) typ* nukleová kyseline (C) druh vlákna* jednovláknová (D) topologie* lineárni e
-.. ... :· '
-156 * (ii) typ molekuly t jiná nukleová kyselina (A) popis s syntetický DNA oligonukleotid (vil) bezprostrednízdroj s (B) kloň: 0-5*5 (xi) popis sekvence* sekvence identifikační číslo 55
GTACGTáGTT aaccggaccg ggccasatag gccgcgggcg cagaaaaagc a®g 53 (2) informaoe o sekveací identifikační číslo 56s (i) vlastnosti sekvencei (A) délka: 51 párá nukleotidá (B) typ* nukleová kyselina (C) druh vlákne s jednovláknová (D) topologiet lineárni (ii) typ molekuly t -jiná nukleová kyselina (A) popisi syntetický DHA oligonukleotid (vil) bezprostrední zdroji (B) klom o-selPX (xi) popis sekvence* sekvence identifikační číslo 56*
CGATAAAAAT TGAAATTTIA TTGGAATATA AATAAGGCCT C 51 (2) Informece o eekvenci identifikační číslo 57* (1) vlastnosti sekvence* (A) délka* 53 párá nukleotidá (¢) typ* nukleová kyselina (C) druh vlákna s jednovláknová (D) topologiet lineárni (11) typ molekuly* jiná nukleová kyselina (A) popis* syntetický DNA oligonukleotid (víl) bezprostrední zdroj* (B) klont o-seim (xi) popis sekvence i sekvenoe identifikační číslo 57*
CATGGAGGCC ΤΤΑΤΤΤΑΪΑΤ TGGAAAAAAA AAAAATAAAA ΤΤΤΟΑΑΤΤΤΤ TAT 53 (2) inforaace o sekvencl Identifikační Číslo 58* (i) vlastnosti sekvence* (A) délka s 14 párá nukleotidá (B) ty pi nukleová kyselina (Q) druh vlákna* jednovláknová (D) topologie * lineárni (ii) typ molekuly» jiná nukleová kyselina (á) popis® syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj* (B) kloní O-830 (xi) popis sekvence® sekvence identifikační číslo 58# ϊαΟΑΟΤΤΤΤΤ ATGA 14 i
I
I (2) informace o sekvenci identifikační číslo 59# (i) Vlastnosti sekvence* (A) délka® 12 párú nukleotidú (B) typ® nukleová kyseline (0) druh vlákna® jednovláknová (D) topologiet lineárni (ii) typ molekuly® jiná nukleová kyselina (á) popis® syntetický KU oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj® (B) kloň® 0-857 (xi) popis sekvence® sekvence identifikační Číslo 59® TATGAWiAA AO 12 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 60® (i) vlastnosti sekvence® (A) délka l 40 párú nukleotidú.
(B) typ® nukleová kyselina (C) druh vlákne® jednovláknová (D) topologie® lineárni (ii) typ molekuly5 jiná nukleová kyselina (A) popis® syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj® (B) klen® 0-N00I (xi) popis sekvence® sekvence identifikační Číslo 60®
GAGCAGAAGA OAGTGGCOAT GGCCGTGAAG GGGATGAGGA 40 (2) inforxnaoe o sekvenci identifikeční člalo 61* (i) vlastnosti sekvence* (A) délka® 30 párú nukleotidú (B) typ® nukleová kyselina (C) druh vlákna® jednovláknová (D) topologie1 lineárni
15 8 (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: ollsil (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 61:
C'ATAAAďTGA TTATATCCTC ATGCA'TCTGT
JO (2) iní’ormace o sekvenci identifikační číslo 62:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4145 páru nukleotidú (B) typ: nukleová kyselina (G) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pS2gpt-S4 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 62:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60 CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120 GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180 GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240 TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300 TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360 TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420 ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480 GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540 CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600 CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660 CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720 CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780 TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840 GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900 TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGAQAG ATCGCTGAGA 960 TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
- 159 ·;·. /í'1 ,u . ;.· '· · '. .?:-v 6V: ·Σ;Λ·.·.' '-> ?ϊ: '..v?.s í·::’.·. .2?5ľ-·.··..· ·;··.·
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200 CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260 TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320 CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380 TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500 GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620 CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680 GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800 CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860 AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920 AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980 GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040 TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100 TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160 CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220 GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280 GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340 CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400 CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460 GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520 TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580 CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640 GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700 CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760 CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820 TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880 CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940 AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000 AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAG CTT GGGGATCATC 3060
f
- 160 -
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120 CTTTTACGAG ΑΑΑΤΤΑΑΊΤΑ TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180 GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240 TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300 ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGAA 3360 GCTTTTTTTT rrrrrrrrrr TTGGCATATA AATCGTTAAC GAATTCCATG GCCCGGGAAG 3420 GCCTCGGACC GGGCCCGGCC ATATAGGCCA GCGATACCGT CGCGGCCGCG ACCTCGAGGG 3480 GGGGCCCGGT ACCCAATTCG CCCTATAGTG AGTCGTATTA CGCGCGCTCA CTGGCCGTCG 3540 TTTTACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC 3600 ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC. 3660 AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGAAAT TGTAAGCGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC 3720 GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC 3780 TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG 3840 TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA 3900 TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC 3960 ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA 4020 CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT 4080 AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC 4140
GTCAG 4145 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 63:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka: 4277 páru nukleotidu (B) typ: nukleová kyselina (C) druh vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotid (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pS2gpt-P2 (xi) popis sekvence: sekvence .identifikační číslo 6$i
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT
120
180
GTGGCACTTT
TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT
161
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT. 240 TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300 TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA agttctgcta TGTGGCGCGG 360 TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420 ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480 GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540 CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600 CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660 CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720 CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780 TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840 GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900 TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGAC'AG ATCGCTGAGA 960 TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020 AGATTGATTT AAAACTTCAT ΊΤΓΤΑΑΤΤΤΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200 CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260 TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320 CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380 TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500 CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560 GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620 CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680 GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800 CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860 AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920 AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980 GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040 TGAGTTAGCT cactcattag GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100 TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160 CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
- 162 -
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC i 2280 GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340 CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400 CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAA.TC CAGGTATCTT 2460 GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520 TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580 CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640 GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700 CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760 CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820 TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880 CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940 AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000 AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060 CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120 CTTTTACGAG ΑΑΑΤΓΑΑΤΤΑ TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180 GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240 TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300 ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGTT 3360 GTTAGAGCTT GGTATAGCGG ACAACTAAGT AATTGTAAAG AAGAAAACGA AACTATCAAA 3420 ACCGTTTATG AAATGATAGA AAAAAGAATA TAAATAATCC TGTATTTTAG TTTAAGTAAC 3480 AGTAAAATAA TGAGTAGAAA ATACTATTTT TTATAGCCTA TAAATCGTTA ACGAATTCCA 3540 TGGCCCGGGA AGGCCTCGGA CCGGGCCCGG CCATATAGGC CAGCGATACC GTCGCGGCCG 3600 CGACCTCGAG GGGGGGCCCG GTACCCAATT CGCCCTATAG TGAGTCGTAT TACGCGCGCT 3660 CACTGGCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC 3720 GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC 3780 GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGAA ATTGTAAGCG TTAATATTTT 3840 GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT TTTAACCAAT AGGCCGAAAT 3900 CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT 3960 TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC GTCAAAGGGC GAAAAACCGT 4020 CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG 4080 GTGCCGTAAA GCACTAAATC GGAACCCTAA AGGGAGCCCC CGATTľAGAG CTTGACGGGG 4140 AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 4200 GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC TTAATGCGCC 4260
GCTACAGGGC GCGTCAG
4277
163 (2) informace o sekvenci identifikační číslo 64:
(i) vlastnosti sekvence:
(A) délka; 4701 páru nukleotidú (3) typ; nukleová kyselina (0) druh vlákna; jednovláknová (D) topologie: lineárni (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetický DNA oligonukleotíd (vii) bezprostrední zdroj:
(B) kloň: pTZ-L2 (xi) popis sekvence: sekvence identifikační číslo 64:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60 TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120 GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180 TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240 CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300 CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360 TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420 GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480 ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540 GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600 ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660 TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720 GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780 TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840 ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900 TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960 TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020 CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080 TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140 AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200 TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGGCTAT TCGACATCGA 1260 GAACATTACC CACATGATAA GAGATTGTAT CAGTTTCGTA GTCTTGAGTA TTGGTATTAC 1320 TATATAGTAT ATNNNNNNGG TAACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1380 NNNNNNNAGA TCTCGATCCG GATATAGTTC CTCCTTTCAG CAAAAAACCC CTCAAGACCC 1440
164
GTTTAGAGGC CCCAAGGGGT TATGCTAGTT attgctcann NNNNNNNNGT CGACTTAATT 1500 AATTAGGCCT CTCGAGCTGC AGGGATCCAC TAGTGAGCTC CCCGGGGAAT TCCCATGGTA 1560 TTATCGTGTT TTTCAAAGGA AAAAAACGTC CCGTGGTTCG GGGGGCTCTN NNNNNNNNNN 1620 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1680 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1740 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1800 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1860 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1920 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1980 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2040 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2100 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NCCGCTAGAG GGAAACCGTT GTGGTCTCCC 2160 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GATCGATTAC GTAGTTAACG CGGCCGCGGC 2220 CTAGCCGGCC ATAAAAATCT AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT 2280 CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGGAAATTGT AAACGTTAAT ATTTTGTTAA 2340 AATTCGCGTT AAATTrTTGT TAAATCAGCT cattttttaa CCAATAGGCC GAAATCGGCA 2400 aaatccctta TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA 2460 ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 2520 AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 2580 GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC 2640 CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 2700 CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 2760 AGGGCGCGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 2820 TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA atgcttcaat 2880 AATATTGAAA TTGCGGCATT AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT 2940 TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 3000 CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA 3060 TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC 3120 TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTGTTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 3180 ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 3240 GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA 3300 ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG 33G0 GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG 3420 ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGCAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 3480
- 165 -
GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG . 3540 TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG 3600 GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT 3660 CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC 3720 AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 3780 CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ΑΤΤΤΓΤΑΑΤΤ TAAAAGGATC TAGGTGAAGA 3840 TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA G1TTTCGTTC CACTGAGCGT 3900 CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC tttttttctg CGCGTAATCT 3960 GCTGCTTGCA AACAÄAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC 4020 TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC 4080 TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC 414 0 TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG 4200 GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT 4260 CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG 4320 AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG 4380 GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT 4440 ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG 4500 GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT 4560 GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA 4620 TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT 4680 CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA G 4701
.4.’ ~ -V (o) <ii) typ nolokúlyi jiná nukleová kyselina sekvenoo idéntifikačxd číslo 40 i
GGOTGGaCTA 5EATGGCCGGG CCmGTCCGA GGCCTTCXG GGGCäTGGAA
TTCAT2TATA TGGCAAAAAA &AÄAAAAMA AAAAGCTTCT GCA (2) inforaaoe o sekvenci identifikační Číslo 41Λ (i) vlastnosti sekvences (A) délkat 97 páxô nukleotidú.
(B) typt nukleová kyselina (C) druh vlákne» jednovláknová (p) topologiei lineárni (ii) typ molekuly» jiná nukleová kyselina (A) popis t syntetický DNA oligomikleotid (vil) besprostŕednl sdrojt (B) klon» F-artP(lO)
Od) popis sekvenoes sekvence Identifikační Sialo 41» QGCTGGOCTA TATGGCGGGG CGTCGGAGGC CTTCGCGGGC WSÓÄáSSO JO GT2AACGATT TäTäTGCCAA ΑΑΑΑΑΑΑΛΑΑ AAAAAÁAAGG TTíXKrCA 97 ΐ·
-S-;
'· Sŕ.
-•_7 '<· •t· *j.‘> *
4 Jedna jednotke odpovídá 5/Ug FIK ne ml lidské plazmy ♦
Pfíklad 12
Konntrukoe chlmerniho viru drúbežích neštovic f—enviXXlB a exprese rekombinentních RIVIIIB obcalových proteínu w fibroblaetech kuieaího zárodku ' ’ l' ( ,
J <
Nedávno byla pepsána príprava gpl.60 ve velkéiä méritku v sxpresuím systému víru vakcinie - bunky Vero (Bar r e 11 a spol·, ! J
Ί
1989)· Jelikož vírus vakcínie je ještč pathogenní pro mnohé obratlovc© včetne savoú a vírus drubežích neštovic je omezen pokud jde o hostitele na ptačí hostitele, vyvinuli $ae expresní systém, který je zsložen na ptsčích neštovieloh (USA patentová prihláška 07/734 741 a její G1P). Byly zkonstruovány ohimerní víry drubežích neštovic pŕísiým molekulárni© klonován!©· Ti© lze expresí získat obalový gen HIV-1 IIXB isolátu (Ratner a apol., 1985·)· V tomto rekoabinaatnim viru je env gen kontrolován silný© syntetický© pozdní© promotore©· Pri pri pravé obalových glykoproteinô se ohimerní vírus drôbežích neštovic použije pro infíkování agregátu bunečných kultur kužeciho zárodku (Jteundt a spol. i PCTZvVO 91 709 937·)·
Konetrukc® a štruktúra chimerního víru drúbežích neštovic f-envIIIB: Pri konstrukci f-envIIIB (obrázek 12.1) se kazeta se dvéma gény» obsahující P?.5 promotor/gpt gen a S4-prcmotor/gpl60 gen» vystrihne jako Nôti fragment z plasmid» pN2gpt—gplôO (príklad 5)· Tato kazeta se liguje s genomovou DKA viru drúbežích neštovic f-TK2a (príklad 2) rozštôpenou pôsobením Nôti. Ohimerní vírus se isoluje podie postupu, který je popsán na počátku prikladá prevedení vynálezu· Výsledná celková DNA (z fibrobloetú kuŕeciho zárodku infikovaných dvenáati rôznými plaky) se rozôtépí pôsobením SspI a dále se analyzuje Southernovým blotováním a hybridizací isolovený© gplôO fragmente© jako sondou (obrázek 12.2A). V jedenásti prípadoch, byly nalezený predpovédéné segmenty o 3700, 1000 a 800 párech nukleotldô. To ukazuje, že gplôO gen byl integrován v “b“ orienteci (obrázek 12.2B)· Jeden vírový isolát, f-LF2e, nehybridizoval gpl60 sondu·
Skutečnoat, že existuje jedna výhodná orientace insertu, vede k možnosti, že vírus s *’b**-orienteel Je výhodnejší pokud jde o rúst ve srovnánl s rte”-oriantaoí| a-orientace môže být dokonca nestabilní. To, že se vírovému vektoru ponechá možn^ot vybrat nejlepší orientaci, môže být považováno za výhodou prístupu pfímého klonování.
Štúdie exprese s ohimerní© víre© f-envIIIBs Štúdie
4 W. (red,), J.. B. Lippincott pression”, homostohis and j·» Msrdsr V. J. a Salzmsin Co. (1937).]. Hemofílie B,
4) e vloží se do pTZ-N. Získá se tak plasmid pTZgpt-S4. Smal-^tul IscZ fragment o 3300 párech nukleotidú se vystrihne z plasmidu placZN*, který byl zkonstruován štepením plasmidu pFF-Zsart (evropská patentová prihláške č· 91 114 J00.-6, Rekombinantní vírus drúbežích neštovic) pôsobením Notl a ligaoí píT-Zsart s oligonukLeotidem P-Notl (5*-GGCCAT-J*)· Tento Smal-Stul lacZ fragment o 3J00 párech nukleotidú byl vložen do jediného Smal místa plasmidu pTZgpt-S4. Výsledné plasmidy se označí pTZS4-lacZa a pTZS4-lsGZb.
HotI fragment tohoto plasmidu o 4500 párech nukleotidú byl ligovén s DiU viru vdTK rozštúponou pôsobením Eotl e pakážován jak shora uvedeno.
Kombinac® lacZ a gpt-selekce v jediné© klonovací© stupni nepogsytuje žádnou výhodu, protože všechny gpt-positivní plaky budou obsahovať lacZ gen. Pro konstrukci virú, které maj! inserco v rúznýoh mlatoch, j® však žádoucí druhý zpúsob testovaní. Markeram, který se výbere jeko prvni (výhodnejší), je gpt laarkerj lacZ testovánl nabízi alternatívni zpúsob detelcoe insertú, napríklad jeetliže cílový vírový génom již obsahuje kópii selektovatelného markeru, jako je napríklad 1· goli gpt gen.
Pri tomto testovaná so dve xal zrodení 1 : 10, 1 í 100, resp· 1 t 1000 surových vírových fcmonú pripravených po pakážovánl (viz príklad 3 výšo) vysej! na tŕicet velkých (o prúmčru
4). Podmínky lige c e s pakážování jsou popsány v príkladu 3.
Odhadnutý výtesek modifikovaných virú. v pfípadč gpt-selakce je popsán v príkladu 3.
99 Ďalší vektor viru ve ke í nie byl zkonstruován následujicíra apúsobem· ŕlasmidy pTZS4—lacZs a pTZS4—lacZb poskytuj! užitegné modelové konstrukce (obrázek 5.6)· Plasmid pTZN s® zkonatruuje jak shora uvedeno. Kazete exprese génu, No ti fragment o 1200 párech nukleotidú obsshujíci kazetu gpt-genu a S4 proaotor, se vystrihne z pN2gpt-S4 (príklad
5.
—— 44.9 1.1 5.7 H H H i -0— — 1 L..-.//-·. —1 1 Ί~ ~~ 11 1
H .
dvojitá inserce tandem b orientace
5. Zpúujob podie bodu 4, vyznač u jíoí s© tím» že ©istom štčpení endonukleaeou špecifickou pro sekvenci je jedinečné ©isto v prvni© genomu.
5*9* až 6127
6128 až 6235
6236 až 6811 popis s sekvence Bluescript II-SK (Stratagene) místo Nôti 1 sekvence ProtS v ro orlontaci, otevŕená čtecí fáze (oblast) zo č iná v políze 4933 rc TáQ štart kodonu e konči v poloze 2910 rc ATT stop kodonu syntetický časný pozdnl promotor viru vakoÍDie v rc orienteci obklopený Noci místem (poloha 4935) a napojené aglII/BamKImlstô (poloha *987 «Ž 4992). Ncol místo nose 2rot S ro štart kodon TAC sekvence P7»5 promotoru viru vakcínie E. coli gpt sekvenoe· ORP za c iná v poloze 5494 ATG štart kodonem a končí v poloze 595θ TAá stop kodonera.
Nôti ©isto 2 sekvence Bluscript XI SE- (Stratagene)
V tomto plasmidu gpt-gen kontrolovaný ŕ'7.5 promotorem víru vakcínie a g DNA protein S Jsou trauakribovány rozdílné a jsou obklopený místy Nôti.
Xnserce c DNA lidského proteinu S do Jediného mista Nôti viru vakcínie za vzniku vProtSi Notl-fragaient, sestá— vajloí z kazet gpt génu a génu proteinu S, se liguje s raménky vektoru vakcínie a transfektuje s& do s&včíoh CV-1. bunék infikovaných FPV. Za techto podaínek se multiplikovelpoug© pakážovený vírus vakcínie· Pcdrobnéjl - MA vakcínie pžiróďuího typu kmene WE (1 mikrogram) ee rozžtépí pôsobením NotX«
Enzým s® dessktivuj© teplé® pri 65 °C po dobu tíicoti minút· Vektor zo ligu j e preš noo š jedni® aikrograme® kazety gutiá «pt-Protôic S o J800 páreeh nukleotidú (vyštépené jako fragasnt z plasaúdu pN2gpta-ProtS) w 30 mikrolltrsoh Domoc* jodaotek T4 DNA llgaay· i
Surové virové kueny pripravené po péti dňoch inkubao® se ztitrují v prítomnosti a v uopxi temnosti sykofenoiové kyseliny (MPA), Tento postup rozlišuje ehlmrní vírus od zpétné narážaného viru prírodnlio typu. S KPA bylj získáno 4 «10^ a bez &PA bylo zlskáno 6.1X plak tvorfch jednotek na 10$ jjoetitelskýôh buc-ak. í Asi 6 až 7 % vírových pluku byly ohimerni viry. Dese t s gpt-pôsltivniah iselátu bylo dvakrát preSlštXno px-®s plel, byly nechaný vyrôst w. ^slé surové ksety a byly použitý! pre infikování bunék CF*X« By la piipravana osiková DNA, rozátépena restrikčníai enzymy Beel a Nôti a podrobená analýze Southornový® blotováním (obrázek 10.2)· Sací štäp, hybridizovaný klonovsnýn ^oífl fragmente® (plaamid pT&-SeoX, príkl€id4), umožnil stahbvit ori0nt«ce vložené DNA, protože Sací štepí inBerty®syastrioky. Ve.-viech desethisQlátech byly inserty v ’’á-o* rlentaci (fregaenty © 6300 á 4600 pároch nnkleotidô, vis obrázek 10«2A a Q). To ukazuje, žo háková kunfigurace je silné výhodná· Notl-fregaenty byly hybridízovány proteinu S. V tomto prlpadč byle uvolnčna kazetô ; o 3800 párochnukleotidú (obrázek 1Q»2B).
sondou NotX génu
Expres® lidekého proteinu S chiaarnl® virem vakcinie s Byly aechány vyrCist surové . kmny z gpt-positivQÍch. chimerních vi r ô e použitý pro infikováni rázných ssväíoh bunSčpýQh línii· féonovrstvy 5.10° bunék se infikuj! 0,1 pfu na bójku v prítomnosti média bes nero (Mi) doplneného o 50 yUg/nl vitamínu K e inkubuji se 72 hodiJay· Odebere se giipernátant. Antigén proteinu S se stenoví sestavou pro tent SLtBA oct firmy Boehringer ^ennheim, SM (sestave číslo 5 · ‘ ' .
1350264). MpcŽstvi syntetizovaného proteinu S jsou uvedená v tabule e 1 v míli jednotkách (jedna jednotka odpovídá
23 yug proteinu S). I f -·« l·
6.
6.7
6.7
6. Zpílsob podlo bodu 5» v y z n a č u j í c í s e tím, že stupeň modifikování DNA molekuly obsahuje stupeň použití fosfatasy, pri ktoré© se odstráni fosforečnánový zbytek z konce DNA segmentu, který se pripraví Stôpenim DNA molekuly endonukloasou špecifickou pro sekvenci v jedinečné© mleté·
1Θ9 <.
6.1111
7 8 9 10
7' ľ. L f> í 0 ;
-. ; η·.·-τΓ · τπ í η λ*ΤΤΓΤΓΜΓ*·’”^ '
Konstrukce chimerního viru drúbeŽích neštovic f-env IIIB pŕímým molekulárni© kloaovájním
Obrázek 12.1
W -^L·.
oiyd .
ΛΛ3Γ80V
AZHIVNÁA Od d, dvyn
016.0 a •Í;P (I
Sputhernova blotová analýza in vitro klonovaných virú drúbežích neštovic
Obrátok 12.2A
7.1 modifikovaný Sacl-fragment ve virech expresujicích protein S S 4.6 6.3S
I____________________________| 1 „. J ZZZ|I
N 3.8 n
Obrázek 10.2 paTentservis / i
λΛ3Γί?0 V (
Áľ;-.ny ;<AA O Íl d a’van i
Obrázek 10·?
£ r Prot S 00 ž je -C je Έ. (N 00 v ΓΜ ·& sa; t · 1 2 3 4 5
03Jtoa f·?
PATENTSERVIS
Štruktúra plasmidu pN2gpta-FIX
A) pTZ
..Marsov , λ 3 I \* í\ /> A 0 <] nvyn <' ε . x ε c
7.
Obrázek ý/
Hind III A fragment pŕirodního viru vakcínie jediná inserce a orientace jediná inserce b” orientace dvojitá inserce tandem “a-orientace dvojitá inserce .pat?,-o;? ta dvojitá inserce
> — C 1 Γ\ί N CH Q UJ > '-> ,O '*••1' UJ * I - ,ó en o < -ľ CO • ΙΟ CO š> o in < CM O *«i Qí ž , ......... ____ G. •Qľ 0.
Ncti
Sňal ,__________________________________________________________________________________________________________________I_______________________________s (___________________ ) WR-wt DNA
- rozštepit pôsobením Nôti
- vložit Nôti deleční adaptor
- PCR testovaní
V
Sňal ( I ) vcN
- rozštepit pôsobením Smal
- vložit. HindlII linker se 6 pn
- PCR testováni
V ( ) vdSN — získaní markeru
- BUdR selekce
- PCR testováni
Nôti ) vdľK
Obrázek 4.1A
CD x
en
M íjj
J X> <· u.‘ ·>·· —> •J CQ ·> o
O
X o.
•<r
0.
pv
- rozštépit pôsobením Nôti
- zreagovat 3 Klenowovou
- ligovát polymerasov
Obrázek 4.1B
Amp
Sací pTZ-5acldN o ,a
PATENTSERVIS
Konštrukcia''plasmidu pTZ-SalFH
./7 '-' .ď-u: j i o 1 s e·' '.t í m , Že obsahuje eekvônoi identít >yy fikečni číslo 67· . 7-2% ‘ ' ' . ' :2:7
Modifikovaný virue vakcinie podie bodu 79» osnačený vPrtjSS ,-ú V y sna Č u jici se tím , „Žá dále obsahuje J..'-7' DNA sekvenci obsahujici část plasmidy. -ρΜ2^^^.. kčddj£ci y lidský proteín S a obuahujíci seWencl iden^^ijkbčúl čišly 67, ktorá leží mezi dvčma mís ty ét Spení eylonukieesou KotI, pfi čemž poslední uvedená sekvence j® vložená do vdTK v mistč Stopení endonukleesou Nôti,
Plasmid podie bodu 53, v y ž n a č u j i O í < 0 ® t i m •ľ •ŕ· • ·;
' 9a* že tento plasmid dále obsahuje DNA eekyoáói-koďújloi lidelý· faktor IX, phi Čemž posledné uvedená;.!$&^kvenoe je Odžtčpltelnč napojená na promotor víru neš^ovio e starč kpdon· ? ->’ y i.
? í ‘ .
í
- 203 Y:
A. ’ ·
99.
í.
.,,·· · -ty^:, ' ty .''>
X'lBsiaid pbdl® bodu 9θ, označený pN$Kp'tsw®IJ, jak je na obrázku 11.1, kodující lidaký y z n á’č^uO ?W j i o í a e -t i m , že obsahuje; BQWánbi: idontiflÄa^' ni Číslo 72. ·- ' ' .' >7γΥΥΥΥ ' ·ν s ···.’ ..· ' ' '-V'.;., ..
·' '. ... .ty'typtypty
Modifikovaný víru® vakcínie podie bodu-\0$dadený
V ý z n a č u j í o 1 š'e tí m;
MAjekveuci obsahujíci čáet pi®smidu.;·’·' lídaký faktor IX a.obsahujlcí sekyenqi;ldán^Í^kéČiQÍ’\čOY-b'' Íóa72»· ktorá leží mezi dv&aa mletý Notl^ ·' pH' čemž, pôsiednč uvedená eetJb^ó7’^.'; :jÍ0^eiui'..do; ^·ΎVdTK v mlstč ätépeid endonukleafjou NotX>Y / • i.·..·' ‘ - . ’ ' , ' » ' Y' . · ' < i . · ’. ,Υγγ·'·' ;? ·. s * . 1 ·γ,_
101· Kodifikovaný vírus podie bodu 35, v ý ž n e $ u ý 'i. o í Y
/.. e‘:;e ' t 1 a . » Že genoa víru drdbeáÍak;n^<^o'-Ú^U· laije Ma oekvenoi kodující ,8W envIIIB sek$ L Ve no e Ksohérichíá coll p-galektozldasH^3^ Ä* V.ialstč':Y.
ôbépeni bakteriálni reštrikční endotínikioazou ’Motl·
102· Modifikovaný víru® dŕdbežioh naátovíó podie bodu 101, označený jako f-envIIIB, vyznačuj i o i; 4 o 'H Μ··> ža dále obsahuje čáct plafímiďu pR2gpt-gplSQ obsshujicl aokvenci identifikační číslb 19, která leží mezi mlaty átčponl endonukloanou KotI· • J.
.·
Obrásek 1·*
PATENTSERVIS ' PRAtíÄz.
‘•'ζββΓΛ?
σ’
I levé raménko (la), pravéraniénko(ra)
•/7 tím, Ž® se jako modifikovaný génom použlyá y<«llfikoyaný· gonoxa viru neštovio· >7· ý . r.
f,,’7·· · ' . .·.<’<*’ .< . . , '*'::/·' · ... . ... -.jW.
.' ·:···... ’. ' '> . Í7 .- .-^M'Plwiid podie bodu 68, jak je uveden uá ? čei^ {^2^^160^ e obsahu jici ©ekv®noi 'Idexáí&ž^ní äiáío-||| ' .. .···' ··.·. .’·- '·-;'. .-..·; .y . - K' :·', 2' .r ' . 27 2:2·:-· 222;· ;
^• /Modifikóvaijý vírus vakcinie podie bodu -7^:- 't.’yf ž\h;a '& u • s θ t i m ....,. 'ž® dále. obsahuje. ^A'/flekvOnci ‘ ·· .'-kydajici vírus lidské imunitní nodostä,t^C^yi.-'^fcy)/;;.j·' .7 SDľWp pH Černi uvedená sekvoheo obsahyjyrtú..číei./píáfiml**· i yWvpi^gpt-gylGO obsahujicího sekvenci id^Hf ikäií.'Čisto 7 |cterá leží mezi mletý átčpeni endôžÄyážôU'-'iBsal'í· ·· .kdá 'poslední uvedená sekyence je vložená do vdTK v míatč / /Žt&pohi éndonukleaeou Sme X·
..77 f ; ' <9y.j P^aámld· podie bodu 53, v y z n a č u j i o 1 s e ti • jy $®nto plasmid dále obsahuje M aokvenci kodujlel ^../‘^ŕáiein 8,,_ pri čomž posledné uvedená DNA ,ydŕ : j •ytčpltelnô napojená.-na' promotor víru hežt^iy'/axÄ.táWlabdo ^iebmlťl podlo bodu 95, označený pN2-gptaľ»0tŠ, jak j® uve./y.. dehp na obrátku 10«l, kodujíci lidský 'prótéiu S> y y z b a ·?
7. Spôsob podlo bodu 6, v y z n a δ u J 1 o 1 © © tím, že se jako první génom používá génom viru vekôlni© a že ee jako Jedinočnó místo používá raisto štčpení bakteriálni reštrikční endonukleasou No ti nebo místo štepení bakteriálni reštrikční endonukltóasou Sinal.
8.7
8. Spôsob prípravy podlo bodu 7,vyznačující se t i m , že první génom obsahuje druhou DNA sekvenci, která 8e nevyskytuje pŕirozenč v gonomu eukaryotlckého aytopiasmstiokého DNA-viru a že tato druhá DNA sekvonoe obsahuje jedinečná místo štčpení.
8 X ohromosomem, jo zplsobehá ncitaci faktoru IX. Pacienti s hemofílií jsou prôbčžnč iiléčoni náhradou fsktorem IX odvozeným od plcsmy. [ l· ' oDNA a genomová DNA fä c&akterizovány. FIX. byl z! ných liniíoh ĹBusby a spolJ inan a spol.: J. Biol. ChasU spol. s Eur. J. Bíochem. 17c!.,1 565 (1922) a Gin
Biol. Chem. 265. 144 (19$oii .]« Byla popsána také exprese *··*·^* Π '· i · faktoru XX v rekombinantech vt.kcínie ide ls
Náture 516, 263 (1935).3. | jl ktorá IX (TFIX) byly klonovány a škáván expres! ve stálýcb bunéč1Náture 316» 2?1 (198$), Kauf261, 9622 (1986)» Baliand e
s. spol.« J·
Šalie q spol.:
V náslodujioí části tohoto spieu. budou strukcs plasmidu.
I í
Plasmid pN2gpte-Fixi Τ» A. MasGillivrayem) se ; pôluescript-FIX pTMp iMoss a spol popsány konýlX cDNA (laskavä áajýštčpí pôsobením EcoRI z plasmidu a liguje só o EcoRI linoarizovsným plssmidam Náture '548. 91 (1990).]. Z rekombinantní· ho plasmidu se isoluje je;d|ovláknová DNA insert ve správné oriente© i
CCATGG) do oblasti koden; FIX ATG stort kodonu olígonukleotideia sprostredkovanou místné f!ženou mut®ganes! pomoci o. ľ ligonukleotidu oFEX.l (sekvence identifikační číslo 71: 5*-TCA 2GT TCA CGS GCT CCA TGG CCG CGG CCG CAO C-5') a komerční sestavou pro mutegiánesi (Amersham, In©., sestava číslo PPN 1523.). Vektor á! FIX Ναοί ^ísto se spojí, insert DNA se isoluje rozštčpeníi pôsobením Ncol e Nôti a liguje so s vektorem pTRgpt-sel^ rozštepe (Falkner a spol.i viz výšn z plasmidu pôsobením BglXÍ poskytnutá R _____ . J, která obsahuje FIX
L.1 Nôti misto se závode (místo [ y:1““ *·~~ — -—-O''*·” J ným pôsobením Ncol/NotI
·). Kazeta promotor/FIX s© vyŠtepí n ľlotl e liguje se s vektorem • Z t é to konHotl obsahujíoi FXX cDNa (pod kon— pN2-gpte linaarizovaným 3amHI/NotI (piíklhd 1) strukce ae isoluje kazetu trolou promotoru selP) a gpt gen (pod kontrolou promotoru
- 126 1 ' i
8,5 cm) Petriho misek (10 Pe-triho misek pro jedno zradení). Test modrého plaku se provádí podie štandardní ch postupú (Ohakrabarti S., Broohling K# a Moss 8,: Mol. Celí· Biol. ä, 340J až J409 (1935).).
- 100 -
Pŕíklsd 6
Konetrukee vektoru (vS4) viru vakcípie s ridícía hlavním klonovacím místeia za transkripční kontroly silného pozdního promotoru viru vakcínie
Tento príklad popisuje klonovací vektor (vS4) viru vakcinie, který je navržen pro príínau molekulárni insercí úplné čtecí oblasti (otevŕené čteci oblasti) do hlavniho klonovacího mista, které je funkčné navázáno na promotor viru vakcinie· Použití tohoto vektoru podie zpúsobú podie tohoto vynálezu umožňuje insercl gend prime do vektoru viru hqštovic bez oddeleného zkonstruován! insertního plasmidu, jak je to potrebné pri konvenční® konštruovaní rokombinsntních virtl neštovic intraoelulární rekombinaci. Tento vektor také obcházi potrebu oddeleného zkonstruováni kazety exprese génu pro prenos do vektoru viru vakcinie prímou molekulárni insereí, jak je to shora popsáno.
Hlavní klonovscí misto vektoru 84 je umísténo v geneticky stabilní centrálni oblasti genomu viru vakcinie a obsahuje nôkolik mlat štepení, která jsou jedinečná v tomto vektoru, což umožňuje prímou inserci. 84 promotor bezprostredne proti smeru vlákna hlavního kloncvaalho mista je silná syntetická variante pozdního promotoru víru vakcinie· Tento expresní vektor je vhodný pro pŕimé klonování a pro expres! velkých otevŕených čtecich oblasti, které obsahuj! tranaS^ní stert kodon, jak je to zde ilustrováno cDIíä, která kóduje litLský krevní protein, von WiXlebranddv faktor (vWF).
Kbnstrukce vektoru vS4 viru vakcinie: Adaptér, který obsahuje syntetický promotor 34 viru vakcinie, se viol! do vektoru vdTK viru vakcinie (príklad 4, obrázek 4.1) v jedinečné)# mleté Notl (obrázek 6.1). Inserci se desaktivuje místo Nôti proti smeru vlákna, zatímeo misto Nôti po aiačru vlákna zostává funkční jako jedinečné klonoveci místo.
Podrobnéji - DNA (1 /Ug) vektoru vďi'K (príklad 4, obrázek 4.1) se rozžtčpí pôsobením fíotl a liguje se s (0,5 yug) endlovanými oligonukleotidy P-artP(ll)
-101 (sekvence identifikační číslo 38) e P—artP(12) (sekvence identifikační číslo 39). Ligační smes se pa kážu je a plaky se identifikují jak je to popsáno v príkladu 3. Rieky se PCNtestují jak shore popsáno (príklad 4, identifikece viru vdTK PGR tefitováním). Isolát, který má insert se správnou oricntecl, se označí vS4.
Xnserce cDNA von Willebrandova faktoru do vS4í Plasmid pvW obsahuje úplnou c DNA von ^lllebrandova faktoru obklopenou místy Notl. Sekvenoe lidského vO by la publikována# Bouthron D. a spol.: Nucl. Acids Nes. 14. 7125 e ž 7123 (1936). Tato sekvence je dostupná z EMBO Iteta Library pod ideatifikátorem (ID) HSVWFR1. Sekvence identifikační číslo 20 ukazuje napojení v genomu viru wWF vírového 84 promotoru a 5 '-nepŕekládané oblasti c DNA WF v plasmidu pvWF až translačnímu štart kodonu (nukleotid číslo 249 v této sekvenci, nuileotid číslo 100 v ID HSVaTRl). Oblast kódujicí vWF byle v této sekvenoi vynechána. Sekvence pokračuje stop kodonem (nukleotid číslo 252, nukleotid číslo 3539 v 10 E3VWPR1) b 3*-nepŕekládanou sekvenci až k Notl mistu (nukleotid číslo 304) s dvacetí nukleotidy píekryvu s 3'-oblasti vvíT vírového genomu.
vW cDNA fragment se uvolní púsobením Notl, isoluje se e ligu je s vS4 vektorovou DNA, která je rozätépene púsobením Notl a zpracována s fosfataeou, jak ilustruje obrázek 6.2.
Jeden mikrogram ligované DNA se pa kážu, j e jak je to popsáno v príkladu 7. Plaky se vyberou a analyzuj! se >CRtestováním. Prvním primerem pro PQR reakci je oligonúkleotid odTK2, který je umístšn asi >00 párú nukleotidú proti smeru vlákna tk-genu, reversní primer ovOl je umísten v génu vW? asi 50 párú nukleotidú po smeru vlákna iniciačního kodonu. K PGR amplifikaci dochází pouze tehdy, jestliže vWF insert má správnou orientacl vzhledem k S4 promotoru ve vektoru. PCfí-positivní plaky se identifikují s dále se aaalyzují. Jestliže výtéžek zadaného modifikovaného viru je nízký, rádové 0,1 až 0,01 %, potom mohou být identiflkovány
- 102 in situ spôsoby hybridizace plaká prispôsobenými podie téch, které jsou známy z litere tury· Viz napríklad Villareal L·· Ρ» a Berg P,í Science 196, 183 ež 185 (1977).
Vírový kloň, který má oDNA ínsert podie PGR nebo hybridizace a který vykazuje osekávanou reštrikční sestnvu pri štépení pôsobením PvuII, ee označí w^l··'. Takové vektory se mohou testová t na expres! von Willebrančlova faktoru spôsoby, jak je to popsáno pro jiné lidské proteíny v príkladu 5» upravenými podie príslušných zásad genetického inženýrství, které jsou dobre známy odborníkúm.
Príklad 7
Heterologní pskážování genomové DNA víru neštovic (vakcínie) pomocným vírom ptačích neštovic (drôbežích neštovic) a souČasná selekoe modifikovaného viru v hoatitelských bunkách druhá, v nichž se pomocný vírus nemôže replikovat.
Príklad 3 popisuj© pskážování modifikované DNA viru vekcíni© pomocným víre© drubežích neštovic v ptačlch bunkách a následnou isolaci pinká progenu viru v savčíoh (CV-1) bunkách, v nichž se pomocný vírus ptačlch neštovic nemôže replikovat. Tento príklad Ilustruje pskážování DNA viru vakcínie drába žírni neštovicemi pŕímo v CV-1 bunkách, číiaž se umožní současné pskážování a výber hostitele pro pakážovaný vírus. Vedie eliminace pávodního^Víru^pomocného kmene progenu, tento postup obcházi požadavek prípravy primárních kultur fibroblastá kuŕecího zárodku pro každý pokus pskážování. Místo toho se také mohou pro pskážování viru vakcínie pomocným virem drábežích neštovic použít kontinuálni savči bunečné línie, které se obvykle používaní pro replíkaci víru vakcínie.
Je známo, že vírus drôbežích neštovic (FPV) se repUkuje v ptačlch bunkách, žádný Živý progenový vírus nebyl získán z infikovaných savčích bunčk. Presný bod v áivotním cyklu STV, pri nšmž dochází k selhání repliksce v savčích bunkách, není známý. Je však známo, že FPV produkuje v sa v-
Čloh bunkách vírové proteiny a dokonca indukuje ochrannou imunitu, jestliže se používá jako živá vakcína (Taylor a epol, i Vaccine 6. 4§7 až 503 (1983)· Nicméné však dosud ne by lo ukázáno, že PPV má sohopnost pakážovat heterologni genomovou DNA viru neétovic, zvláštš prímo sestavenou DNA viru vakcínie.
V odvodním pokusu se CV—1 bunky (5*10^) infikuj! jednou plak tvoria! jednotkou (pfu) na bunku víru drábežích neštovic (kmeň HP1.441) a inkubují so jednu hodinu· Potom ee ara ženina fosforečnanom vápenatým (jeden mililitr obsahující jeden mikrogram DNA víru vakcínie pHrodního typu) transfektuje do infikovaných bunšk· Po patnácti minútach sa teploty místnosti se pridá 10 ml média (JÄí, 10 % plodového telecího séra)· Bunky se inkubují č ty H hodiny a médium se vyméní. Bunky se pak inkubují šest dná· Pripraví se tak surový vírový kmeň· Progenový vírus se titruje ne CV-1 bunky. Typické p laky vakcínie byly viditelné po dvou dnech.
Závislosť účinnosť pakážování na množstvá genomové vírové DNA byly stenovována pro DNA v množstvách od 0,1 do 10 mikrogramá ns 5·10θ CV-1 bunčk. Viz obrázek 7.1. Knožstvi DNA více než 1 mikrogram (napríklad 10 mikrogramô.) poskytovala surovou sra ženinu fosforečnane® vápenatým, což suižuje účinnosť trsnsfekoe v hodnotách pfu/yug vnesené DNA. Viz obrázek 7.1.
výtšžku
Závisí os ťv^ákážovsného viru vakcínie na dobé inkubace pakážovánl byl^i analyzována s použitím konstentního množstvá DNA viru vakcínie prírodního typu (1 ^ug) e konstantnlho množstvá pomocného viru FPV (1 pfu/bunku) za shora popsaných podmínek pro pôvodní pokus v tomto príkladu s tím, že médium pridané 15 minút po trsnsfekci bylo vymenéno po Čtyfech hodinách a že bunky byly potom inkubovány další jeden až pet dná pred prípravou surového vírového kmene (celkový objem 2 ml). Virový kmeň z kontrolnich bófek infikovaných pouze FPV a inkubovaných pét dná neposkytl žádné viditelné plaky. Tento pokus byl trikrát zopakován. Typický výslédek Je uveden níže v tsbulce 7.1.
- 103
Tabulka 7.1
Vllv inkubační doby ne výtéžek viru vakcín!© z DNA pakážování pomocný© víre© drúbežích neštovic v savčích (CV-1) bunkách
inkubační doba titr (hodiny) (pfu/ml) 24 1,0.102 48 4,6.104 72 5,0.105 96 5,0.106 120 2,1.107
Titr pakážovaného viru vekoínie, detegovaného analýzou plekti na savčích (CV-1) bunkách, se postupné zvyšoval od asi 102 plak tvorícich jednotek na ml po 24 hodinách do asi 2.107 po 120 hodinách. Inkubační doby v r o zrna zí od 43 do 72 hodin poskytovaly vhodné hladiny pa károvaného viru vskciaic (mezi 10 a 10 pfu/rnl) a jsou tedy vhonfdé pro rutinní pakážování DNA viru veke í nie víre© drúbežich neôtovic v savčích bunkách.
DNA vskcínie m£še být pakážován© v savčích bunkách nepodarená infikovaných virem drába ží c h ne š to vie. Již bylo ukázáno, že vírus drubožích neštovic múže infikovat také savČí bunky, ale vírový životui cyklus není v téchto netypických hostitelských bunkách úplný. Podie typu bunék se vírový rilst zastaví buú v časné© nebo v pozdním stupni a nevytvorí se životaschopný vírus drúbežieh neštovic (Saýlor a spol·, 1988·)· Tato zjišténí byl© príčinou výskumu pekáŽovánl DNA vakcín!® v kontinuálni savčí bunečné línii·
Koníluentni monovrstvy bunék CV-1 se infikují 0,05 pfu na bunku FPV kmene HP1.441. Potom se transfektuji ligsčni fíméeí sestávejíci z dna viru vakcínie rozštepené púsobenim Nôti. Podrobnéji - DNA vakcínio (1 mikrogram) se rozštepí púsobenim Nôti a liguje se s uvedenými množstvimi DNA (kazeta P7.5 gpt génu). Jedinečné ©isto Nôti ve viru vakcín!© je umíetšno v intergenové oblasti v HindlII F fragmentu
- 104 (Goebel a spol.x Virology 179, 247 (199θ)·)· tŕldenní inkubaci oe bunky isolujl a surový vírový kmeň se t i t ruje na CV-l-buňkách v prítomnosti (^MPA) s v nepŕltomaost (—MPA) gpt-selektivního média. Výsledek je souhrnné uvdéun v tabule e 7.2.
Tebulka 7.2
Titry po nezdarené® pakážování
pokus Č. insert (ng) titry CpfUzlO^/ô.lO^ bunčk) chiméry <») - MPA* ♦ MPA 1 200 17*2 1,6 5.3 2 200 42,3 5,1 12,3 3 400 64,0 3*8 5,9 4 400 26*8 3,8 14,2 5 210*0
* MPA znamená xnykofenolová kyselina
Nejduležitéj šíra výsledkem bylo, že vírus drúbežích neštovic by mohl pakážovat modifikovanou DNA vakcínie v bunččném typu* který bráni jeho vlastním» rústu. Na vie, výtčžek chimernlch plakú byl v rozmezl 5 až 10 %. Toto srovnáni je pŕíznivé ve srovnání s klasickou in vi vo ιό kombinační technikou* pri níž obvykle asi 0*1 % z celkového množství plakú jsou rekombinsnty. ligoce vektorovýc ramének samotných (tabulka 7.2, pokus č. 5) vede k vyéäímu titru pri srovnání s ligačnimi pokusy 1 až 4 s insertem* možná proto* že chybejí znečišténiny, které jsou prítomný v molekulách insertu vyčistených na agarose*
K é které z izolovaných virú byly vyčištčny pros plak a byly dále cha rektori zovány. Vyká zo valy typické HindlII reštrikční seetavy viru vakcínie a nevie pásy oiziho génu charakteristické pro dve možné oriente c e jediného insertu. Pri inserci do mista Nôti nebyl pozorován žádný virus s násobnými inserty.
Heterologní pskážováné ohiiaerní víry vakcínie se
- 105 nehybridizují skrížené s viremdrôbežích neštovic. Pro štúdium vlivú heterologního pakážovúni virem drubežích neštovic (FPV) ne struk tur n chimerních viru vakcín!© se DNA isolátô F15.4, FI2.5, I1J.2 e . F12.4 spolu s DNA čtyí vyčistených isolátô z Nôti klonovacího pokusu e kontrol viru drôbežích neštovic rozštépi pôsobenia HindlII. Výsledné fragmenty se rozdelí elektroforesou a e ne lyžuj í se Southernovou hybridizaci sondou viru drubežích neštovic pripravenou z virj^oaá vyčistených pŕes gradient sachsrosy. Nebyla pozorována žádná zkrížená hybridizace viru vatasini© s FPV DNA.
PMklad 8
Homologní pakážovúni sestavené DNA viru vakcinie autantom hostitelské oblasti viru vakcinie (vdhr), který neni echopen replikace v lidské bunečné línii
Tento príklad ilustruje koná t ruke i a využití pomocného viru neštovic obschujici delece, které omesují jeho hosti telský rozsah, zvlášte schopnost replikovat v jistých bunečných liniich. Modifikovaný vírus vakcinie bez pomocného viru lze pŕipravit pskážováním vektorové DNA a tímto mutanfcním pomocným virem a isolováním klenu sestaveného viru infikováním príslušných lidských bunék.
Tento mutantní pomocný vírus je odvozeň od mutantô hosti telské rady viru vakcinie, které nejsou schopný replikovat s® v rôzných lidakých bunkách s ktoré mají pozménéné cytopethické účinky n© mnoho j iných bunék, ješ jsou dovolený pre infekci pŕírodním virem vakcinie (víz napríklad Drillen a spel.t Virology 111, 48£5 až 499 (1981).). Podrobnej! rečeno - génom tohoto pomocného viru obsahuje mutace dvou génu hostitelských oblastí, které spoločné zabranújí replikaei v lidakých (£ffic 5) bunkách, v nichž pouze genomy viru vakcinie mají alespoň jeden neporušený gen hostitelské oblasti, který môže replikovat.
Konstruirce mutovaného víru vakcinie hostitelské oblasti vdhr: Genomové umistení a DNA sekvence jednoho génu viru
- 106 vakcínie potrebného pro replikaci v liaských bunkách byla popsána Gillardem s spol. s Proc. Deti. Acad. Sal. USA 83· 5573 až 5577 (1936). V nedávné dobé byl tento gen oznáčon KÍL (Goebel e spol,: 1990.)· Byl zmapován druhý gen hostitelské oblasti víru vakcínie (Perkus a spol.: J« Virology 6ž» 3829 až 3656 (1990)·)'·· Tpéto druhý gen (označený podie Goebela a spol. (1990) jako 07 L) leží v oblasti zahrnujioí části HindlII C a Hladili N fragmentô. Tato oblast je deletována ve viru vakcínie kmene 'VH6/2 (kose a spol· : J· Virol. 40, 337 až 395 (1931)·)· KmeniWB6/2 tedy chybí gen C?L hostitelské oblasti·
Pomocný vírus* jemuž chybí jak it tak C7L gen oblasti hostitelô, se skonštruuje z 07L-negstivního kmene WR-6/2 získáníia markeru o modifikovaným EcoRI K fragmentem, z nčhož je delotován KÍL gen hostitelské oblasti· Víz obrázok 3.1· Tento modifikovaný EcoRI K fragment obsahuje gen eelektivního markeru (E. coll gpt gen), který usnadnuje selekci modifikovaných W-6/2 genomú. obsahujicich modifikovaný EcoRI K f.agment využitím Intrsoelulárního získávání markeru, jak to popsali Sem a Dumbell (1981)· Podminéný lethálni mutant, ktorému chybí schopnost rôst na lidských bunečných liniích, byl popaán také Perknaanem a spol· (1989)·
DNA.
Podrobnéji - EcoRI K fragment víru vakcínie pŕírodního typu je subklonován do plasmidu pí’R-tklôi. Výsledný plasmid se označí pFP-KcoKl. Gen KÍL hostitalské oblasti viru vakoínie (Gillard a spol· 1986) se deletuje. Součesnš se zevede jedinečné misto Nôti smyčkovou mutagenesí pomoci oligonuklootidu P-hr(3) (sekvenoe identifikační číslo 42)· Výsledný plasmid se označí pEcoK-dhr.
Plasmid pFP-tkl8i se skonštruuje modifikací plasmidu pFP-tk-10.4 (viz Felkner a spol·» Evropská patentová prihláška číslo 89303837·?, publikovaná evro^W patentová prihláška 0 338 801, príklady 3 «· 8| celý objev této prihlášky j© zde zahrnut jako odkaz). Plasmid pFP-tkl0.4 se rozétčpi pôsobením Ncol a liguje se s edantorem obsahujícím endlované nukleotidy P-Ncol(l) a P-Scol(2)· Výsledkem je zavedení
107 násobného klonovocího laista do jediného Nco mletá FPV tk— -g©nu s místy štepení reEtrikČními endomikleasami EcoKI, Nôti e HindlII.
Sekŕ^ce viru vakcinie by la publikováne Goebelem 6. J. a spol. í Virology 179. 247 až 266 (1990). Je dostupná z EMBO Dáte I4.br ©ry” (GenBank) pod čísle® M35O27. Sekvence génu KLD hostitelského rozmezí viru vakoínia by la publikována Gillerdem S. a spol.: Droc, Natl* Acad. Sci. USA 3£, 5573 e ž 5577 (1936) a je dostupná z EälBO Dáte Library” pod identifikátore® (ID) PXVaCMHO. Kóduj íc í sekvenca génu KÍL tedy není zahrnutá v sekvenci identifikační Číslo 21. Gen KÍL v pEcoK-dhr je deletován a je nahrazen Nôti mlate®. Oblást napojení mezi PXVACMHG sekvenci a vložený® Nôti siste® (nukleotidy Číslo 1 až 20 této sekvence odpovídají bakleótidáa čísla 72 až 91 V ID PXV/CMHC). Oblašt kódujici KÍL se dele tuje a nahradí se Nôti siete® nasledovaným dvéma G zbytky (nukleotidy číslo 21 až 30 v této sekvenci). Sekvence obsahuje obklopující oblsst o 20 párech nukleotidÚ (nukleotidy číslo 31 až 50 v této aekvenoij nukleotidy č. 944 a š 965 V ID PXVAOHC).
V dalši® stupni se pEcoK-dhr linearizuje pôsobením Nôti a ligujo se e kazetou F7.5-gpt-gen Θ 1100 pároch nukleotidô odvozenou od plasmidu pH2-gpta (príklad 4) štšpením pôsobením Nôti. Výsledný plasmid pdhr-gpt se použije pro generaci pomocného viru vdhr.
Kazete Nôti (obsahující kazetu P7.5 promotor - gpt—gen) vložená do pEcoK-dhr e 20 nukleotidô 5*- a 3*-obklopujících oblastí jsou pro pdhr-gpt uvedený v sekvenci identifikační číslo 22. Obklopující oblá s t (nukleotidy číslo 1 až 20 této sekvence) odpovídá nukleotidôm Číslo 72 až 91 v ID PXVACL1HC (viz sekveno© identifikační Číslo 21 pro EcoK-dhr). Vložená DNA sekvsnoe zsčíná v poloze 21 (první G”—zbytek místa Notl) a končí v poloze 1139 (poslední C-zbytek miste Noti), A^zbytek trenslačního iniciačního kodonu gpt-genu odpovídá poloze číslo translačního stop kodonu gpt-ganu odpovídá poloz® číslo 1004. Sekvence obsahuje
- 108 dvecet nukleotidá obklopujicí oblasti (nukleotidy číslo 1192 až 1209 této sekvence, nukleotidy číslo 944 až 961 -V ID PXVACmc). Dve G zbytky číslo 1190 e 1191 této sekvence odpovidají polohám 29 a JO vpEooK-dhr.
Pri prenosu EcoK fragmentu do viru vakcínie se plasmid transfektuje do primárnich fibraPlastových bunék ktyrecího zárodku infikovaných delečním autsntem viru vakcínie λΦ-6/2. kodifikované víry se vyberou jeko gpt-positivnl (pomoci mykofenolové kyseliny). Gpt— positivní víry s® vyčistí preš plak (trikrát)) v CEF bunkách a označí se vdhr.
Charakterizece pomocného viru vdhr» Štruktúra gpt-positivního viru vekcínle vdhr se analyzuje Southernovým blotováním a testy hostitelské oblasti. Vírus vdhr je schopný tvorí t plaky na fibroblastech kuracího zárodku a na dvou oplčich bunečných liniioh (BS040 a Vero), ale je defektivní pri replikaci v lidské bunečné línii MRC-5.
Pakášováni vestevené DNA viru vakcínie využitím su t a rítu hostitelské oblasti vdhr jako pomocného víru. Konstrukce pro expres! c 1)NA, která kóduje lidský protrombin, demonštruje užiteônost tohoto prístupu. Produkt z ligační smesi popsané v príkladu 5, obrázok 5.1, se transfektuje do fibroblastú kurecího zárodku infikovaných vdhr jako pomocným virem. Po dvou dnech se bunky isoluji s pripraví se surový vírový kmeň. PakáŽovaný vírus se testuje tvorbou plaku na lidských (MRG 5) bunkách, v nichž žádený virus vakcínie repliku je, ale mutovaný vdhr pomocný vírus nereplikuje.
Po troch dnech se bunky obarví neutrálni červení. Vyberou sa plaky pro dal ši analýzu Southernovým blotovánlm. 1dentifikují se modifikované klony víru vakcínie, které máji žádoucí strukturu. Očekávány jsou také víry, které podlehly rekombinaci s vyeoce homolognia pomocným víre®.
Príklad 9
Konstrukce nových chimerních víru vakcínie kodujícloh HIV gplGO (vP2-gp!6O^A , vPa-gplôO^yB a vselP-gplôO^) a
- 109 exprese rekombinantu gpLGO^ v bunkách Vero
Tento príklad ilustruje konstrukci IIIV-l^ isolátu prímým molekulárni® klonováním rekombinantu viru vakcinie pro prípravu gplGO ve velkés méfítku. Príprava gpl60 isolátu HlVyjg· popsnná Ratnerem a spol. s Náture 313. 277 aá 284 (1935)· využitím konvenčné skonštruovaného exresního vektoru viru vakcinie, byle popsána Barrettem a spol·s AIDS Research and Humsn Hetroviruses £, 159 až 171 (1989). Isolát HIVjjjjj však vzácnou variantou. Úsilí vyvinoui vakcíny, ktorou jsou založený ne HIV obalových ptoteinech, by mdlo za hr nová t representativnéjší HIV-1 isoláty, jako je napríklad IsN-isolát· Gurgo a spol·« Virology 164, 531 až 536 (1988), Carrcw a spol· í Aids Research end Husian Retroviruses £, 831 ež 839 (1991)· Zde uvedené vektory viru vakcinie byly proto zkonstruovány pŕímý® molekulárni® klonovánim tak, aby expres! poskytovely gpl60 protein HIV^ isolátu·
Konstrukce plasmidu pP2-gpl60^ a chimerních vlrú vP2-gptl60^ a νΡ2-βρ160^Βι Stratégie vložení gpl6C-genu do viru vakcinie zahrnuješ 1) modifikováni gpl6Q-genu odstránením velké 5*-nepŕekládané oblasti (5*-D®K) a zavedení vhodného klonovacího místa proti smeru vlákna štart kodonu, ii) klonováni modifikovaného gplfcO-genu po sméru vlákna silného pozdaího P2-promotoru viru drubežich neštovic (evropská patentová prihláške č. 91 114 3OO.-6, 26· srpna 1991) a ilí) vložení fragmentu se zarovnaným koncern, který obsahuje kazety P2-gpl60 e P7.5-gpt-gen, do jediného místa štepení reštrikční endonukleaeou príslušných kwná vírového hostitele, napríklad do Smal laísta hostitelského kmene vdTK vakcinie (príklad 4), Smal nebo N o ti míst kmene Ό 6/2 vakcinie (Moss a spol.s J. Virol· 40, 38? (I98I)·) nebo kmene WR vakcinie pŕííodního typu.
Pro tyto účely se zavede nové Smal místo do plasmidu pNSgpt—S4 (príklad 4). Výsledkom je plasmid pS2gpt—S4 (obrázek 9.1, sekvence identifikační číslo 62). Potom byl S4 promotor vymčnčn za P2-promotor· Získal se tak plasmid pS2gpt—P2 (sekveuce identifikační číslo 63)· Tento plesmid umožňuje klonování úplné otevíené čteci oblasti (orfs), ale môže být použit také pro klonování neúplné orfs, které chabí jeji vlastní štart kodon. Štart kodon se získá napríklad tak, že se klonuje do jediného Nool mi s ta (CGATGG) tohoto plasmidu. Ko^trukc® plasmidu a virú je podrobné popadne níže. Pri modliaci gpl60-g®nu se PGtl-generovaný sousední fragment zmení na kazetu gp—160—génu s minimálním 5*-tfTH. Tato kazeta je prítomna v konečné konštrukcii, plasmidu pP2-gpl60yg (obrázek 9.1, sekvence identifikační číslo 69)· Ďalší vlastnosti plasmidu jsou uvedený v následujlci tsbulce.
Plesmid pP2gpl60mn (6926 páru nukleotldô) (sekvence identifikační číslo 69)s umlátení___
8,0.10? pfu/ml 4,0.10? pfu/ml
9.4
9· Spôsob pHpravy podie bodu 3, vyznačujíoí se tím , že se jako první génom používá génom viru drôbežích nečtovic obsahujlcí sekvenci Escherlchla c ¢11 p-galsktrosidasovóho génu a že so jako jedinečné místo átépení používá míato ôtôpení bakteriálni reštrikční endonukloasou Nôti.
9,0.10^ pfu/ml
10 1.1 12 13 14 15 16
Westernova blotová analýza/gpl60 exprese ve fibroblastech kuŕeciho zárodku chimérnimi viry drúbežich neštovic ÁA3raov A23ivnaa oyd ! .j 6 . x τ ?
(?<0q }: Mi g 0 í /
I
I
Obrázek 12.3 <u (N
O xO
Q.
BO fx| CM ä ä o xO α
M<T r—4 Cu x
Ctf CM
H gp41
10 9 6 5 4 3 2 •ti .· ! . 4 i. .Ί 4 · « · ~ Λ — , a. 4 -Λ »
ippi ΑΛ3Γ80V ΑΖ3ΊΫΝλΛ Odd dvyn K 1 n 1 a i 2 6 X 6 l (USP a .. m 1 .. í: L 6 ζ <1 I f? tr—rr r—r· ”· »*· —r< •‘l·“' *' ’
Obrázek 11.3
Westernova blotová analýza exprese faktoru IX v bunkách Vero
ΡΑΤΕΜΓί
i.
PRAHA / ý
Z b X CZ
C1SP3
10 11 12 13 14 15
PATENTSERVIS
Obrázek 1.9
ZóŕWZϋκΆΟ PRO VYNÁLEZY A OBJEVY ftt H
O »-· t-· >j ľJ
OD O 1,0 O GJ
-J CD
Obrázek 1*1θ
ČJ.
Do-gt®
. , ,
ÚŔAD
PRO VYNÁLEZY p AOBJEVY
10 11 12 13 14 15
Obrázek 1·θ
71/ Z0HD
ÚRAD
10. Zpúsob prípravy podlo bodu J, vyznačující se t 1 m , Že První DNA sekvonae j© vložená do prvního genomu viru mezi první mlsto stúpaní první endonukleasou špecifickou pro sekvenci a druhé místo ôtčpení druhou endonukloaeou špecifickou pro sekvenci.
10.1111
11 12 13
11.4
14.3 v vP2-gpl60MNB
11. Spôsob prípravy podlo bodu 10, v y z n a č u j i o í s e t í m , ž© Jak první tak druhé místo ätčpeni j® jedinečné v první® genomu.
12.5
Obrázek 9*5/1 CIP DMC
Konstrukce plasmidu pTZ-12, α>οα pTM3 I
- substituovat Xbal-Cla fragment 500 pn Xba-Clal adaptorem t pLl
- substituovat Aatl-Sphl fragment
800 pn Aatl-Sphl adaptorem
T-?
800 pn Aatl-Sphl t
fl ori
Amp
Aatll, SnaBI, Hpal, Rsrfl, Sfil, Notl, 5TNT, Sphl
Xbal, 5TNT, Sfil, Notl, Hpal, SnaBI al
Ncol, EccRI, Smal,
Sad, Spel, BamHl, Pstl, Xhol, Stui TAATTAATTAA, Sali
Hpal
Ndel
S
Sfi, Not, Hpal, SnaBI, r
Amp
Ncoí, EccRl, Smal, Sad, Spel, BamH, Pstl, Xhol, Stul TAATTAATTAA, Sali pílili NT, Ndel
P7.S
Aatll, SnaBI, Hpal, Rsrfl, Sfil, Notl ♦
substituovat Sall-Ndel fragment o 239 pn Sall-Ndel 5TNT adaptorem
- vložit kazetu Xbal-Sphl T7-marker gen mezi PvuII místa pTZ19R
Sfi, Not, Hpal, SnaEJI, Clal r
Amp
Ncol, EcoRI, Smal, Sad, Spel, BamH, Pstl, Xhol. Stui TAATTAATTAA, Sali — Hpal _______
Ndelgubstituovat T7emc Clal—Ncol fragment gpt selP-Clal-Ncol fragmentem
Aatll, SnaBI,
Hpal, Rsrfl,
Sfil, Notl
Ncd, EccRI, Smal, Sad, Spel, BamHl, Pstl, Xhol, Stu( TAATTAATTAA, Sali
J
Sfi, Not, Hpal, SnaBI, Clal
Ndel pTZselP •L2
Obrázek 9.4 ty
Konstrukce plasmidu pseÍP-gpl6OMN prírodní gplôOMN:
A)
O1£PA
Sfi, NoC, Hpal, SnaBI,
Aatll, SnaBI, Hpal, Rsrll, Sfil, Nod
Ncof, EcoRI, Smal, í Sad, Spd, BamHl, F*stl, Xhd, Stuf TAATTAATTAA, Sali 7ΤΓΓΤΝΤ, NM
I P7.5 ó ľ.
vložit EcoRI^PvuII fragment o 3100 pn pMNenvl do EcoRI-Stul míst pselP-gpt-L2
Hpal, SnaBI Sfil, Notl gpl6OMN
Aatll SnaBI pal (Pvull/Stul) Sal, TTI í I NT, Ndel •substituovat Ncol-Nsil fragment o 800 pn PCR~ generovaným Ncol-Nsil fraoientem o 310 pn pselPgp160MN (6400 p72
Pn)P7.5
Clal pTZ
Hpal, SnaBI Sfil, Notl ' ' .-.G k 2 gpl60MN
P7.5 pselPαρι 60.1 (Pvull/Stul)
Sal, TTTTTNT, qpt Ndel
Aatll
SnaBI pal
B) jplSOW pŕírodnihc t--pu ' gp 160 v vsel.P-gpl60~viruí
HET ARG YAL LYS
CA ATG AGA.GTG AAG
HET ALA VAL LYS
Ncol
Obrázek 9»5
PATENTSERVíS -«aha ' /
Konstrukce chimerních viru vselP-gplôOMNA a VselP-gplôOMNB
ĽZZJ P7.5-gpt
B33 selP-gpl6O
ΛΛ3Γ30V
AZ3im;A □«</, ovyn í ί !
z 6 . x τ z .
t ~........... . . . .......I....·:— USAAA.'W.A — ) vselP-gpl6OMNA +
vselP-gp!6OMNB
12. Spôsob podlo bodu 3, vyznač u jioí bo tím, že alespoň Část první DNA sekvence, která je vložená do prvního genomu je pod transkripční kontrolná promotoru.
12.1111
13.4
Smal S j;I λΛΉΓΒΟν azs’ivnaa oad t avyn (
Sall-fragmenty v vselP-gpl60MNA c 6 . x ε z tr.is.oq
S 13.0
Sall-fragmenty v vselP-gpl60MNB
S 11.6
S O·4 S ~<β5.4 s
Cbrázek 9*7
Štruktúra plasmidu pN2-gptaProtS f!/
A) huProtS pTZ
OlížP.q.
T?
B) prírodní protein
S:
protein S v chimér ách. í
met arg val leu giy GAA ATG AGG GTC CTG GGT met ala val leu gly GCC AT.G_ _G.CG GTC CTG GGT
Ncol
Obrázok 10.1
PATENTSERVIS
Ο j ...'------1___________ 'i/.y </.
λΑ3ΓΒ0~ν
Aľ.inyw.;./', ο a ď
GWjn | _Λτ»χ»»5 ---- . η___, ’
I *, č b X £ z J (Π£οα j ί
Ί o Γ. L li g
13· Spôsob podie bodu 12, vyznačujlcí se tím, Že promotor je umístčn v první DNA sekvenci, která je vložená do prvního genomu.
14. Spôsob podie bodu. 12, vyznačujíci se tím, že promotor je umistén v modifikovaném vlrovém genomu proti smčru vlákna první DNA sekvence, která je vložená do prvního genomu.
190
15« Zpúsob podie bodu 12 , vjzneóujicí e e t 1 a , že promotor je využíván RNA polymérasou kódovanou modifikovaným vírovým genomam.
16· Zpúsob podie bodu 15, vyznačujici s e tím, Že promotor je vhodný pro inioiaoi trenskripoo RNA polymerasou uvedeného suka ry o t ie kého cytoplasmetiokáho DNA-viru.
17· Zpúsob podlo bodu 15, vyznačujíol se tím, že promotor obsahuje modifikaci pŕirozenč se vyskytujíciho promotoru eukaryetického cytoplaňmetiekého DNA-viru.
18« Zpúsob podie bodu 1, vyznačujici se tím, Že stupeň modifi'kování DNA molekuly obsahuje stupeň deletovánl DNA eekvence a prvního genomu.
19· Zpúsob podie bodu 1, vyznačujici se tím, že stupeň modiflkování DNA molekuly obsahuje stupeň eubstituováni DNA sekvence z prvního genomu·
20« Zpúsob podie bodu 1, v y s n e č u j í o í a e tím, že stupeň infikování první hostitelské bunky druhým eukaryotickým cytoplaematlokým DNA-virem obsahuje druhý génom, který je expresován, modifikovaný vírový génom se tak pakážu je do infekčníoh virionú.
21« Zpúsob podie bodu 20, vyznačujici se tím, Že stupeň zavedení modifikované DNA molekuly do prvné hosD titalské bunky se provádi asi jednu hodinu po stupni infikovaní první hostitelia ké bunky druhým ouksryotiokým oytóplafímatlókým DNA-virem·
22« Zpúsob podie bodu 20, vyznačujici s e tím, že se expresi druhého genomu v první hostitelské buňce neprodukuj! infekční viriony obsahující druhý génom·
2J. Zpúsob podie bodu 20, vyznačujici se tím, že se jako modifikovaný vírový génom používá modifikovaný génom viru vakcinie, jako druhý génom génom viru drúbežích
- 191 nečtovio s jako první hostitslská bunka sa víl bunka.
24* Zpúsob podie bodu 20, vyznečujloi ee tím, že stupeň isolováni infekčnlch vírionú obsahujiciah modifikovaný vírový génom obsahuje stupeň inflkovánl druhé hostitelské bunky infekôními viriony produkovanými první hostltelskou bunkou za takovýoh podmínelc, kdy exprese druhého genomu v druhé hostitelské buňoe neposkytuje infekční viriony obsahujici druhý génom*
25* Zpúsob podlo bodu 24, vyznačujlol se tím, že s® jak© modifikovaný vírový génom použivá modifikovaný génom víru vakcínie, jako druhý génom génom víru drú beží ch ne fit o vie s jako druhá hostitolská bunka sovčí bunka·
26· Zpúsob podie bodu 24, vyznečujíoi se tím, Že modifikovaný vírový génom obsahuje funkční gen hostitelské oblasti, ktorý je potrebný pro to, aby se v druhé hostitelské buňoe produkovaly infekční viriony a druhému genomu chybí funkční gen hostitelaké oblasti·
27. Zpúsob podie bodu 26, v y z n a č u j í o í se tím, že ee jako modifikovaný vírový génom použivá modifikovaný génom víru vakcínie obsahujíoí funkční gen hostitelské oblasti, ktorý je potrebný pro to, aby so v lidské buňoe produkovaly infekční viriony a jako druhá hostitelské bunka s® použivá lidská bunka·
28. Zpúsob podie bodu 24, vyznačujicí so tím, že modifikovaný vírový génom obsahuje gen sélekčního markeru, druhému génu chybí gen selekčniho markeru e stupeň ínfikováni druhé hostitelské bunky se provádi za podminek, ktoré vedou k výberu genomu, ktorý expres! poskytuje gen selokčniho markeru,
29. Zpúsob podie bodu 24, vyznačujioi se tím, že exprese génu eelekôniho inarkeru v druhé hostitelské buňco udéluje druhé hostitelské buňoe resisténei na oytotoxIckou látku, ktorá je béhern lnfikováni druhé hoatitol- ské bunky píl t oraná v takové hladine, které je dostotečná pro výber genomu, ktorý expres! poskytuje gen solekčDÍho rasrkeru.
30. Modifikovaný eukaryotický cytoplnamatický DNá-virus, v y z n © ô u j i c i s θ t i a , že sa pripravuj© príiaýa molekulárni® klonování® modifikovaného vírového genomu podlo spôsobu podie ktoréhokoliv s bodô 5» 11 nebo 14«
31« Modifikovaný ouknryetický cytoplasmatichý DNA-virus obsahu jloí modifikovaný vírový génom, vysnačujioi e e t í a 1 že modifikovaný vírový génom obsahuje:
I) první génom prvniho oukaryotiokého oytoplasma tie kého DNA-vlru, pM oomž první génom obsahuje místo étčpeni endonukleasou špecifickou pro sekvonci e toto místo štôpeni je jedinečným místom v tomto vírové® genomu, e
II) první DNA sekvenci vloženou do tohoto jedinečného místa Stépení v prvním genomu·
32· Modifikovaný vírus podie bodu 31, vysnačujíoi s e t i m , že první DNA sekvence se nevyskytuje pŕiroeenč v genomu ©úkoryotlokého oy tople sme tie kého DNA-viru.
334 Modifikovaný vírus podie bodu 32, vysnačujioi s e tím , že se jako první génom používá génom víru vakcínie e jedinečným Metom je místo Stúpení bakteriálni endonukleasou, ktorá je vybrána ze skupiny sestávejloi e Notl a Smel.
34· Modifikovaný vírus podie bodu 32, vysnačujiol s e t i m , že první génom obsahuje druhou DNA ©ekvenoi, ktorá se nevyskytuje prirobené v genomu oukaryotlakého oytoplesmatiekého DNA-viru, a tato druhá DNA ookvonee obsahuje uvedené jedinečné místo·
35· Modiflkovený vírus podie bodu 34, vysnečujíeí oo t 1 m , že se jako první sokveno© používá génom viru drôbežích nestovio obsahujícl druhou DO sekvenci génu 0-galaktosidaey Esaherlohia ooli e jedinečným ··· v
r
- 193 jaíffiťeá Jo mlato ätéponí bakteriálni reštrikční endontikl©— asou Iíotl. \
Modifikovaný vírus podie bodu 32, vy Wlň ú j í o íá e e t i m , že alespoň část prvni DNA sekvence, ktorá j© vložená do Jedinečného místa, je pod transkripčni kontrolou promotoru.
37· Modifikovaný vírus podlo bodu 36, vysaaôujicí s e t i in , ž© promotor j© umístčn v prvni DNA sekvenci, ktorá je vložená do prvniho genomu.
38. Modifikovaný vírus podie bodu 37» vyznačujlgi so tím , že so jako prvni génom používá génom víru neštovic a promotor obsahuje modlfikaci pMrozené se vyekytujíoího promotoru viru neôtovio.
39· Modifikovaný ©ukeryotidsý oy topia srna tichý DNA-Virus obsahu j i o í modifikovaný vírový génom, vyznačujici s e t í ra , že tento modifikovaný vírový génom obsahuje i
I) prvni génom prvniho ©ukaryotického cytoplazma tiokéhe DNA-viru, kde tento prvni génom obsahuj© prvni mlsto štčpení prvni endonukloasou špecifickou prybekvenci a druhé misto štepení druhou endonukleasou špecifickou pro sekvenci a každé z uvedených mist čtépeni j© Jedinečným místern v prvnim genomu, e
II) prvni DNA sekvend vloženou do prvniho gonomu mezi prvni jedinečné rnlato a druhé jedinečné misto·
40. Modifikovaný eukaryotický oytoplnematický DNA-virus podlo bodu 39» vyznačujici se tím, Že prvni DNA sekvence se pŕirozenô nevy&ôytuje v genomu oukaryotického cytoplasmatiekého DNA—víru·
41, Modifikovaný vírus podlo bodu 40, vyznačujici s e tím , že prvni génom obsahuje druhou DNA sekvenci, která s© pfirozenč nevyskytuj© v genomu oukaryotiokého cytoplasmatiokého DNA-viru a druhá DNA sekvence obsahuje prvni DNA sekvenci vloženou mezi prvni jedinečné misto e druhé jedinečné mioto
42* Kodifikovaný vírus podlo bodu 41, v y z n a č u j i o i \ s e t i m , že ao jako první génom používá génom víru v vakcinie & že první mís to stúpení i druhé místo štepení ' y znamenaji místa Štépení bakteriálni reštrikční ondonukíéa- \ \ \ \ \ aou, .která je vybrána zo skupiny nuklaes sestávajioi \ ' a Nôti, Smal, Apal e Rnrll. \ \ , Λ \
43. Modifikovaný oukaryotlcký oy topia aiua tie ký DNA-virus obsahu jioi modifikovaný virový génom, v y s n a δ u j í o i e e t í m , žo tento modifikovaný virový g®noa obsahu- i , 1\ je I) první génom prvního ©ukaryotiekého cytóplsematického \ DNA^vlru, kde tento první génom obsahuje prvni DNA sekven- \ Gi a tato prvni DNA sekvence obsahuje misto stúpení ©ndo-ý nukleasou špecifickou pro sekvenci, které j® jedinečný®' mistoja štSpenl v modifikovaném virovém genomu, aK
XI) promotor, který je umístún tsk, Že DNA sekvence vložená do jedinečného místa je pod trfuiGkripčnl kontrolku promotoru, pri čemž prvni DNA sekvenci chybí tranníačníj štart kodon mezi promótorom a jedinečným mís tom·!
j
I ’ l
44. Modifikovaný virus podie bodu 43, vy z n ® Č u j í c 1 s e tím , že první DNA sekvence s© nevyskytuje pri- rosené v genorau eukaryotického aytopiasmatichého J^A-viru. ; * \ ' \ ,\
45. Modifikovaný vírus podie bodu 44, v y z n a δ u j,i c í s e tím , ž© se jako prvni génom používá génom viru vakcinie a äo první DNA sekvence obsahuje násobné klenová o í misto obsehujlcí místa stúpení bakteriálni reštrikční endonukleasou Noťí, Smel, Apel a Rsrll.
46. DNA mol^ula, vyanačujicí se ť í m , žo obsahuje modifikovaný virový génom modifikovaného; viru po- :
dle bodu 30.
47. DNA molekula, vy zna č u j í c i se tí m , že obsahuje modifikovaný vírový génom modifikovaného víru podie kteréhokoliv z bodú 31» 39 nebo 43*
43. DNA molekulu, vyznač u j i c í se t i n , So obsahuje jeden koneo modifikovaného vírového genomu eutoryotického oytopiasmetiekého DNA-vlru, pri čemž
I) tento konoo modifikovaného vírového genpm obsahuj® DNA sekvenci, která so pMrozanô nevyskytuje v genomu eukaryotiokého oytoplasmatiekého DNA-viru,
II) modifikovaný vírový gonora obsahuje misto štepení ondonukleasou špecifickou pro sekvenci, ktoré je jedinečným místem v tomto modifikované® virovém genomu, a
III) DNA molekula má konoc, ktorý je hoiaologni s koncern, který se získé ätčponim uvedeného jedinečného mista v modifikovaném vlrovém genomu endonukleasou špecifickou pro sekvenci.
49. DNA molekula podlo bodu 43, v y z n o č u. j i c i s e t i m , že DNA sekvence nevyskytni j ic i se pŕirosenč v génom eukaryotického cy tŕplo sme tie kého DNA-viru obsahuje misto š trápení endonukleasou špecifickou pro sokvenoi, které je jedinečným míetem v modlíikovsném vlrovém genomu.
50* Sestava pro piimé molekulárni klonováni modifikovaného vírového genomu eukaryctického ayboplasmatiokého DNA-viru, vy znač u j lei se tím* Že obsahuje:
I) vyčiätčnou DNA molekulu podie bodu 43 nebo bodu 49,
II) DNA ligasu a
III) roatoky pufru a reakčníoh činidol vhodných pro ligeci DNa segmentú za vzniku modfikovsué DNA molekuly obsahujlcl modifikovaný vírový génom.
51* Sestava podie bodu 50» v y z n a č u j í o í c e tím, že dále obsahuj© plasmid obsahuj lei kazetu expresu génu obklopenou mlaty ňtépení endomxkloasôu špecifickou pro sekvenci, která jsou slučitalná s ineerci uvedené kazety do jedinečného mista átčpenl mod.ulievaného vírového genoinu kódovaného DNA molekulou.
52. Sestava podie bodu 50» v y z n a č u j i c 1 so t i m , ž® dále obsahuje první hostlt-elskou bunku a druhý vírus vhodný pro pakážováni modifikovaného vírového genomu do
- 19& infdkčních virlonô.
53· Plasmid, v y z n a č u j 1 o 1 s e t í a , že obsahuje segment DNA, který má ©isto štóponí bakteriálni reštrikční cndonukleasou. NotX na každém konal, pri čemž uvedený DNA segment obsahuje misto štepení endonukleasou špecifickou pro sokvenci., které j® jedinečné v uvedené© plasmidu.
54. Plasmid podie bodu 53, jak je uveden na obrázku 1.3· který je označen pN2, vyznačujioí s e t i m , že obsahuje sokvenoi identifikační číslo 1.
55· Pletmid podie bodu 53, vyznaôujioí se tím, Že DNA segment dále obsahuje gen sslekčníhc marksru pod transkripôni kontrolou promotoru viru neštovic.
56. Plasmid podie bodu 53, jak je uveden na obrázku 1.3, v y — značujíci se tím, že je vy brán se skupiny plásmidú ozntičených pN2-gpta obsahuj ícioh okvenoi identifikační číslo 2 a pN2-gptb obaahujioích sekvenoi identifikační číslo 3.
57. Plasmid podie bodu 55» v y z n a č u j í o 1 se tím, že W segment dále obsahuje druhý promotor víru neštovia odštčpitelnč napojený na DNA sekvenci obsahujioi misto štčponl reštrikční endosukleasou.
58. Plasmid podlo bodu 57» jak je uveden na obrázku 4.7» který jo označon pN2gpt-S4, vyznaôujíoí se tím, žo obsahuje sokvenoi identifikační číslo 14.
59· Plasmid podie bodu 57» vyanačujici se t im , že dále obsahuje tranalačni štart kodon odštčpitelné napojený na DNA aekvcnci, ktorá obsahuje misto štépeni reštrikční endonukleasou.
60. Plasmid podie bodu 59, jak Jo uvodon na obrázku 4.7, označený pN2gpt—S3A, v y z n a č u j í a i s e tím, Že obsahuje sekvonoi identifikační číslo 13.
- 197 -
61. Piasmíd, v y z n a Ô u J í c í se tím » žo ob- sahuje první hlavni .klonovpcl Msto obsahující jedinečná místa druhého hlsvního klonovacího místo vektoru viru vakoínie, označeného vdTK, který je vy brán z následajíoi skupiny plasmldú uvedených no obrázku 4.3« pAO obsahujlolho eakvonci identifikační číslo 6, pAl obsahu jí c iho sekvenol identifikační čislo 7 n pA2 obsahujloiho sekvenci identifikační číslo 8.
62. Flasmid podlo bodu 61, vyzná čujíoí se tím, Že dále obsahuje promotor viru nečtovio a translační štart kodon odštčpitolné napojený na první hlavná klonovaoí místo, jak ukazujo obrázok 4.4, který je vybrán ze skupiny plasmidil: pAl—81 obsahující sekvenci identifikační Číslo 9 a pA2~81 obsahuJíol sekvenci identifikační číslo 10,
63· Plasmid podie bodu 61, vyznačuj! o í se tím, že dále obsahuje promotor víru noätovic odčtepitelnš napojený na první hlavní klouovaaí místo, jak ukazuje obrázek 4.5, který je vybrán zo skupiny plasmidáí pAl-S2 obsahující sekvenci identifikační číslo 11 a pA2-S2 obsahujíci sekvenci identifikační číslo 12.
Plssmid podie bodu 62, vy znač u j i o í se tím, že tento plasiaid dále obsahuje DNA sekvenci kódujíci lid— aký protrombin, v némž je tato DNA sekvence odčtépitelná napojene na promotor viru noätovic a štart kodon.
65. Plasmid podlo bodu 64, Jak je uveden na obrázku 5·!, označený jako plosiaid pAlSl-PT, vyznačujlcí se tím , že obsahuje sekvenci identifikačná Číslo 15·
66. Plarwiid podlo bodu 53, vyznačujioí se tím , Že tento plasmid dále obsahuje DNA sekvenci kodujídi Xidský plasminogen, v ntaá Jo tato sekvono© DNA odštôpitelnč napojene na promotor viru noätovic a štart kodon·
67. Plaemid pudlo bodu 66, vyznačujíoí se tím , žo je vy brán z této skupiny plasmidúe pN2gpt-GPg,
- 198 - jak jc uvedsn na obrázku 5.2, který kóduje lidský glu-plasminogsn a který absôiiuje Sekvenci identifikační člalo 17, a pNS-gpt-Ľťg, jak je uvoden na obrázku 5*3p který kóduje lys -ploeminogon o ktorý obsahuje sekvenci identifikační číslo 18.
68. Plasmid podlo bodu 53» vyznač u jící so tím, že tento pltwĽiid dálo obsahuje DNA sekvenci, ktorá kóduje viru.’j lidské imunitui nedostatočnosti (HIV) gp!60, pM
Čomž tato sekvehce je odätépltelaé napojene na promotor Viru aeátovio u atort kodos·
69. Plesmid podlé bodu 68, jak je uvoden n® obrázku 5.4, označený pN2gpt-gpl60, v y z n a č u J i c í 8® tím, áe obsahuje sekvenci ideuoiľ'ikaČĽií číslo 19«
70. Plasmid, v y z n a č u j 1 c i so tí m , äe obsahuje modifikovaný EcoRÍ K fragment DNA víru vakcinie, z nčhož je delotován genKÍL hostitelské oblasti.
71. Plaemid podlo bodu 70, jak je uvedon na obrázku 3.1, vy— s n « Č u j i c í so t i m , že je vy brán s této skupiny plasmidáa pBco&-dhr obsahu jícího sekvenci identifikační číslo 21 u pdhr-gpt obsahujícdho sekvenci identifikační číslo Ä
72» Plasmid, v y » n a č u J i c í s e tím , že obsahuje segment genoiauVlru neštovic, ktorý obsahuje gen thymidln-kinasy víru neštovic, pri čoitó gen tiiymidin-klnssy je modlfilcován tak, aby zabránil expres! aktívni thymidln-kísfiey.
73» Plasmid podie bodu 72, jak jo uvoden na obrázku 4.2, vy anačujícl se tím ,žojc vybrán z této skupiny plosmidô: pHlndJ-2 obsahujloiho sekvenci identifikační číslo 4 u pRindJ-3 obsahu jícího aokvenci identifikační číslo 5*
74. Modifikovaný vírus vakcinie, vyznačujícl so ' — 199 '!· . ·.· .1/.,...f ' - .
tím, že obsahuje modifikaci genomu víru vakoinie prírodní- '·/ ho typu, který má jediné aiisto ístoponi bakteriálni reštrikční endonnkleasou Nôti, pri Čemž toto uvedená modifikaoe Odstraňuje toto jediné misto ätépeni.
75· Modifikovaný vírus vokoínlo podlo bodu 74, který je popsán na obrázku 4.1A e který je osnačen vDN·
76· Modifikovaný vírus vakoinie, vyznačujici se t i m , žo obsahuje modiťikaoi genomu viru vakoinio pŕirodniho typu, který má jediné ©isto čtčpenl reštrikční endonukleasou Smnl, pri čomž uvedená modiflkace odstraňuje toto jodiuó juisto átépení·
77· Modifikovaný vírus vakoinio podie bodu 76, který je popsán na obrázku 4.1A a který je ožnačoa vdSN.
78· Modifikovaný vírus vakoinle, vyznačujici s e t i m , že obsahuje modlfikaci genomu viru vekoinie pŕirodniho typu, ktorý má je<Wé ©isto Stopení bakteriálni reštrikční ondonukloasou NotX, jediné ©isto štepení bakteriálni reštrikční endonukleasou fímal q gon t&ymidln-kinssy, pri óemž tato modlfikaoo zahrnuje i v č
I) modlíiknoi, která odstraňuje ©isto štpeni bakteriálni reštrikční endonukleasou NotX,
II) modifikaoi, která odstraňuje ©isto pro bakteriálni reštrikční endonukleasu Snial a
III) modlfikooi, ktorá obsahuje inseroi v génu thy©idin-klnasy, který obsahuj© jediné mloto štčponl bakteriálni reštrikční endonukleasou botl a jediné misto Stépeni bakteriálni reštrikční ondonukleasou Smal*
79· Modifikovaný vírus vakoínio podlo bodu 78, který j© popsán na obrázku 4.1A a který je označen vdTK*
80, Modifikovaný virus veke í nie podlo bodu 79, označený vPTl, vyznačujici s e t i m , že dále obsahuje DNA sekvonoi, která kóduje lidský protrombin, pri čemá .tato sekvenae obsahuje část plasmidu pAlSl-PT obsahujioiho
200 solcvond identifikační Číslo 15» která leží mení mlaty átčpani éndonukloasami Notl a BsrXX, kde poslední uvedená sekvence Je vložená do vdTK mezi mletá Stúpení endonukleasaíai Notl a BsrII.
81« Modifikovaný virue vokcínxe podlo bodu 79, označený vGPg, v y z n a č u J í c 1 s e tí m , že dále obsahuje DNA sekvenci, která obsahuje Část pltrnmidu pNagpt-GPg kodujloí lidnký glu-plnuiainogon o obaahujíoi sekvenci identlfikačnl Číslo 17» ktorá leží mezi mínty ôtépenl ondonuklesaami Notl, kde poslední uvedená sekvenc© Jo vložená do vdTK v místč štčponí endonuklossou Notl.
82. Modifikovaný vírus vakcinie podlo bodu 79, označený VLPgl, vyznačujíci se tím , Že dále obsahuje tu část plasmidu pN2gpt-XJ?g kodujícl lys-päasiaindgen a obaahujíoí ookvoncl identifikační číslo 16, která leží mezi dvčma mlaty Stúpení endonuklnusani Notl, kde poslední uvedená sekvonac Jo vložené do vdTK v mlstč Stúpení enďonukleeeíou Notl.
83. Modifikovaný virus vakcinie podie bodu 79# vy z n a č u — j í c i s e tím , žo dále obsahuje DNA sekvenci kočlujicí viruc lldské imunitní nedostatočnosti (Hl V) gp!60, pri čemž uvedená sekvence obsahuJo čáatbplasmidu pN2gpt-gpl60 Obsahujiolho sekvenci identifikační číslo 19* která leží mezi mletý žtúpeiii endonukleasou Notl, lode poslední uvedená sekvenoe je vložená do vdTK v místč Čtčpeni endonukleasou Notl.
84. Modifikovaný vírus vckcínúc podlé bodu 79, označený vS4, vyznačujte! s o tím , ž© dále obsahuje DNA sekvenai kcdu.jioi syntetloký promotor 84 viru nečtovio, pfi čemž uvedená DNA sekvence obsahuje sekvenci ollgouukleotldu P-artáP(ll) sekvenoe identiflkačnlho čísi® 38, Me poslední uvedená sekvenae Je vložená do vdTK v miato stúpení oudonuklee.iou Notl.
85· Modifikovaný vírus vakcinie podlk bodu 84, Označený wW,
- 201 vyznačujici so tím » Žo dále obsahuje DNA sekvencl kódujioí lidský von Willebrandúv faktor, pri čefflž uvedená DNA sekvence obsahuje část plasmidu pvWF obsahujíoi sekvencl identifikační číslo 20, která leží mezi mlaty čtôpení ©ndonukleasou Nôti, kde poslední uvedená sekvence je vložená <ΐο ve* v místč štčpsni endonukleasou Nôti·
86· Kodifikovaný virus vakcín!©» označený vdhr, vyznačující s e tím, že obsahuje modifikovaný génom, ktorému chybí jak funkční gen KÍL hostitelské oblasti tak funkční gen C?I» hostitelšké oblasti, pfi Čemž uvedený modifikovaný génom obsahuje génom C/L-nogativního kmene víru veke í nie (CT-6/2), který má sekvenoi identifikační Číslo 22 vloženú do KÍL místa viru vakoínie píírodniho typu V mleté génu KÍL.
87. Modifikovaný vírus pripravený podie bodu 30» v y a nečuj í o í s e t 1 m » že exprese první sekvence v hostitelské buJnce ved© k produkci proteinu»
88· Modifikovaný vírus pripravený podie bodu 31 nebo 59, v y n n a Č u j í c í e e tím, že exprese první sokvenc® v hostitelské bunoe vode k produkci proteinu.
89· Modifikovaný virus podie bodu 3θ» vyznsoujíoí ne. t í m > žo s® jako modifikovaný vírový génom poušivá modifikovaný r^nom viru nečtovio·
90· Modifikovaný virus podie kteréhokoliv s bodá 31, 39 nebo *3, vyznačujici se tím » že se jako modifikovaný vírový génom používá modifikovaný génom víru neátovlo.
91· DNA molekula podie bodu *6, vyznačujici se tím , žo so jako modifikovaný vírový génom použivá modifikovaný génom víru nečtovio·
92· DNA molekula podie bodu *7, vyznačujici se ' χ·
'.... ' á ' . ·, · . ... ' .-i íj .
13$5 až 1438
1489 až 1558
1559 až 2131
2132 ©Ž 2187
2190 až 2242
2243 až 4701
E.coli gpt sekvence v rc orientácii gpt otevrená čtecí oblaet začíná rc TAC stsrt kodonem v poloz© 860 a končí rc AT4! stop kodonem v poloz© 403 ρ7·5 promotorová sekvenoe viru vekeínie v rc orientaci
Epal místo mezi T7 terminátor©© bekteriofágu a p7.5 promotorem viru vakclnie sekvenoe terminátora T7 bakteriofágu v rc orientaci (Studier a spol·) násobné klonovscí místu v rc orientaci (Sali, transakční stop hodony pro všechny tri ot©— vŕené ctecí oblasti, Stul, XhoX, PstI, BaxsHI, Spel, Sací, Smel, EcoRL, NcoX) sekvence 5-neprekladané oblasti viru eneefalomyokarditidy (EM-virua) () v rc Orionteci sekvence promotoru í'7 bakteriofágu v rc orientaci () linker II v rc orientaci (SnaBI, HpaX, Nôti, Sfil, 5TNT) pTZ19H sekvence (Pharmacie)
PI© smidy PTZselP-L2 ® pselP-gpt-Ιώ: Clsl-Ncol fragment o 600 páreoh nukleotidú (sekvence T?-proDiotor-EMC) se nahra dí syntetickým promotorovým fragmente© sestávsjícím z ©nelovených oligonukleotúdu oselPI (sekvence identifikační Číslo
561 S'-CGA TA A AAA TTG AAA TTT TA T TTT TTT TTT TTG GAA TAT AAA TAA GGC CTC—3í 51-mer) a o-selPII (sekvence identifikační ČÍ01O 57 s 5'-CAT GGA GCC GTT .OT TAT ATT CCA ΑΛΑ AAA AAA AAT AAA ATT TCA ATT TTT AT 3*)· Výsledný plesmidový mezipro ti fragmentu Ρ7·5 promotoru z 280 páru nulťbeotidú na 130.
SalX-Ndel fragment o 239 párech nukleotidú se substituuje SalIrNdei adsptorem obsahujúcim anelované oligonukleotidy o—830 (sekvence identifikační Číslo 53s 5*-TCG ACT TTT TAT CA-3*) e 0-857 (sekvence identifikační číslo.59« 5*-TAT GAT AAA AAO-3*), Výsledný plaamid se nazývá paelP-gpt-L2 (setedukt pTZselF—L2 ješte obsahuje T7-terminátor ® Hpal laisto, j •Jyrťyz/íw* které byly odstránený v následujícím stupni klonováni/casného trenskripčnlho stop signálu vakcinie a snlžoníia velikos117 vence identifikační Číslo 65)· Další vlsstnosti této konstrukce Jsou uvedený v tabulee níže.
Plasmid pselP-gpt-L2 (33?8 páru nukleotidú) (sekvence identifikační číslo 65) \
umísténí: popis í 1 až 55 pTZ19K sekvence (Farmacia) 56 až 103 linker I v rc orieataci (5®T, Nôti, Sfil, RsrXI, Spal, SnaBI, Aatll) 110 ež 360 E. coli gpt sekvence v rc orieataci, otevŕená čteci fáze začíaá ro TA C štart kodonom v poloz© 360 a končí rc ATT stop kodonem v poloz© 403 861 ez 1245 sekvence promotoru p7.5 viru. vakcínie v rc orientaci počinejíci p7.5 vnitŕním Bdel mint©m v poloze 1241 1246 až 125b časný trsaskripční stop signál viru vakcínie v rc orientaoi obklopený Bdel místern (polohe 1245) a SaU mís tern (poloha 1253) 1259 e ž 1322 násobné klonovscí sísto v rc orieataci (Sali treoslační stop kodoay pro všechny tri čteci oblasti, Stal, Xhol, PstI, BamHI, Spel, SocI, Sraal, EcoRI, Ncol) 1323 až 1374 syntetický česný pozdní promotor viru vakcínie v rc orieataci obklopený místem Ναοί V polose 1317 s Clal místem v polohe 1370 1375 sz 1414 linker II v rc orientaci (SnaBI, HpsI, Nôti, Sfil, JTHT) 1415 až 3373 sekvence pTZ19R (Pharmacia)
Plasmid pa©lP-gpl60>Tí env gen o >100 párech avklootidd, obsahující EcoRI-PvuII fragment plasmidu pWenv-I, se vloží dl plasmidu pselP-gpt-12, který ju rozi tépen pôsobenia EcoRT a Stal· Získá ee meziprodúktový plasaid pselP-gplôO.l. Kcol-Nsil fragment plssmidu pselP-gplGO o 800 párech nukleotidô se substituujo PCR-generovaným rícol-físil fragmente® o J10 párech nukleotidú. Získá se tak konečný plssmíd pselP-gplôOjgji (sekvence identifikační číslo 66). Belší vlastnosti tohoto plasmidu jsou uvedený v následující tabulee.
118
Plasmid psel'ŕ-gplôOMá (6474 párik nukleotidú.) (sekvence identifikační Číslo 66)
unieteníi 1 až 55 56 sž 1^8 poloha í pTZ19R sekvence (Pharmaoia) linker I v rc orientaci (5THT, Sfil, RsrII, Hpal, S no BI, AatlI) 110 až 860 E. coli gpt sekvenc® v rc orientaci, gpt otevrená Čtecí fáze začíná v poloze 860 rc
TAB štart kodonem a konči v poloze 403 rc
861 sž 1245
1246 až 1258
1259 až 3916
3917 až 3970
3971 až 401$
4016 až 6474
ATT stop kodonem sekvance promotoru ρ7·5 viru vakcínie v rc orientaci počínající p7.5 vnitŕnim místern Ndel v poloze 1241 časný trankripční stop signál viru vakcínie v rc orientaci (poloha 1245 až 1252) obklopený Ndel místern v poloze 1241 a Sali mís tom v poloze 1253
IUV-MH env gen v rc orientaci, ORF začíná v poloze 3916 rc TAO štart kodonem a končí v poloze 134-8 rc ATT stop kodonem syntetický pozdní časný promotor viru vakcínie v rc orientaci obklopený Kcol Matom (polohe 3913) a Ciel mís tern (poloha 3966) linker II v ra orientaci (SnaBI, Hpal, Nôti, Sfil, 5TNT) pTZ19R sekvenc® (Pharmacia)
Pro PGR-reskoi byly použitý prime ry o—RcoI (4o-aer) (sekvenee identifikační číslo 60)í 5*-GAG CaG AAG AOA GTG GCC ATG GCC GTG AAG GGG ATC AGG A-3' a o-Nsil (30-mer) (aekvence identifikační číslo 61)í 5'-CAT AAA CTG ATT A TA TOC TQA TGC ATG TGT-3'· Pro další klonování se POR produkt rozštépí pôsobením Ncol a Nsil.
Ghimerní viry vselP-gplGO^A a vselP-gpl60^B byly zkonstruovány následujícím zpúaobemi Hpal-fragS^nt sestávajíci z kaze t selP—gplGO a P7· 5-gPt-gen se vloží príiným
119 siolekulárním klonovánim (obrázok 9.6) do jediného mletá Smel kmene WR0/2 vakcini© l&oss e c pol. s J. Virol. 40. J37 až 395 (1931).J, který je vysoo© atenuoveným kmene© viru vakcínie íviz Buller a spol.í Náture 317 . 803 až 315 (1985)«J. Kmeň WR 6/2 viru vakcíni© LMoss a spol.í víz výôe.J se rozštep! v jediné© Smal ©isté a liguje se s Hpel fragmente© o 4000 párech nukleutidu, který obsahuje kazety F7.5—gpt—gen s selP-gpl60-gen. Postup klonování je stojný jeko shora pope áno v príkladu 1.
Výsledné chimerní víry, veelP-gpl6Q^jA e vselP-gplôOj^fí, se vyčistí a dále se charakterizují. Ve viru veelP-gpl6Q^A se gpl60-gen prepisuje v® stejném emšru (zleva doprava) jakô gény nehromadené kolem ínsertuího ©iste 1A51R otovrená čteci oblestj Coebel a spol. i Vírology 179. 247 až 266 (199o).J. Ve viru vsellP-gplôO^B so gen gpl60 prepisuje v opačné© smeru. Postup in vivo pakážování je stejný jako shora popsáno v príkladu 3.
Štruktúra chimornloh viru: Teoretické etruktury chimerních viru (obrázok 9*7) byly potvrzeny analýzou Southernovým blotováníxa. DNA vyčistených virô se rozátópl pôsobením Sali. Fragmenty se rozdelí na agarosové© gélu, prenesou se na nitrocelulosovou membránu a hybridizují so sondou SalF-fragmentu vakcíni® (pTZ-SelF) a sondou gpl60-genu (pWenv-1). Sondou SslF-fregmsntu byly'SrselP-gpieo^jA viditelné pŕedpovčdšné fragmenty o 6100 párech nukleotidú a 10 700 párech nukleotidú. U vselP-gplôO^B jsou viditelné pŕedpovčdéné fragmenty o 3500 párech nukleotidô a 13 700 párech nukleotidú. U sondy gp-160-genu jsou vidét stojné fragmenty,ale fragment o 10 /00 pároch nukleotidô u vselP-gplGO A a fragment o 3500 párech nukleotidô u vselP-gpieO^B poskytuj! méné íntensivní signály, protože pouze asi 400 párú nukleotidô z každého fragmentu je homolognich se sondou.
Jelikož príme klonování také vede k integraci tandemových vícemerních struktur, DNA téchto víru se také rozštep! púsoberíin Xbal, která ne štepí vloženou DNA,, Xbal prírodní fragment má velikost 447 párú nukleotidô.. Integrace jedné
120 kópie insertu o velikoeti 3800 páril nukleotidú vede k fla@aontu se 4300 páry nukleotidú. Ve vícemernich strukturách se velikoet fragmentu o 4306 pároch nukleotidú. zvýši o pri— rústky 3800 páril nukleotidú.
Štúdie exprese s chimernimí viry vselB-gplôOj^ a \ vselF-gplôOj^Si Pro štúdie exprese se použij! buňkj Vero.
Rúst bunek, infikován! chimsrními viry ε čiätení rekombinántniho gplôO proteinú se právali podie BerÄts e. spoL s vis výäe.
Príklad 10
Konstrukce nových ahimernícih virú vakcinie, které kóduj!
14 15
Westernova blotová analýza/gp41 exprese ve fibroblastech. kuŕecího zárodku chimerními viry drúbežích neätovic
----------------Ί
I Ίρ^' ΛΛ3Γ30V , A23'1VNÁA 08d , á vy n
SK2641-92A 1991-08-26 1992-08-26 Direct molecular cloning of modificated gen of eucaryotic cytoplasmic dna-virus SK264192A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/750,080 US5445953A (en) 1991-08-26 1991-08-26 Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome
US91473892A 1992-07-20 1992-07-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK264192A3 true SK264192A3 (en) 1995-08-09

Family

ID=27115227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK2641-92A SK264192A3 (en) 1991-08-26 1992-08-26 Direct molecular cloning of modificated gen of eucaryotic cytoplasmic dna-virus

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6265183B1 (sk)
EP (1) EP0561034B1 (sk)
JP (1) JPH06261763A (sk)
AT (1) ATE181108T1 (sk)
AU (1) AU652467B2 (sk)
BR (1) BR9203322A (sk)
CA (1) CA2076839C (sk)
CZ (1) CZ264192A3 (sk)
DE (1) DE69229390T2 (sk)
FI (1) FI111384B (sk)
HU (1) HU219369B (sk)
MX (1) MX9204926A (sk)
NO (1) NO310306B1 (sk)
PL (1) PL295733A1 (sk)
SI (1) SI9200190A (sk)
SK (1) SK264192A3 (sk)
YU (1) YU79092A (sk)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
EP0753581A1 (en) 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
AU5446700A (en) * 1999-05-28 2000-12-18 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector
US20040063653A1 (en) * 2000-12-21 2004-04-01 Shiver John W. Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 pol and modified hiv-1 pol
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
EP2388015A1 (en) 2000-03-02 2011-11-23 Emory University DNA expression vectors and methods of use
EP1372710B1 (en) * 2001-03-08 2009-10-14 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Mva expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
US7223740B2 (en) 2001-05-23 2007-05-29 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of VEGF for atrial disease treatment
WO2002095038A2 (en) * 2001-05-23 2002-11-28 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of vegf for disease treatment
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
AU2002347317B2 (en) * 2001-11-30 2008-06-26 Isis Innovation Limited Vaccine
GB2382578A (en) * 2001-11-30 2003-06-04 Isis Innovation Fowlpox-based vaccine
AU2003203527A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-30 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Control of the ratio of lap to lip
EA012160B1 (ru) * 2002-05-16 2009-08-28 Бавариан Нордик А/С Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение
GB0215621D0 (en) * 2002-07-05 2002-08-14 Imp College Innovations Ltd Improved poxvirus vaccines
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
US20090098529A1 (en) * 2006-10-16 2009-04-16 Nanhai Chen Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
CN114262690A (zh) 2011-04-15 2022-04-01 吉恩勒克斯公司 减毒的痘苗病毒的克隆毒株及其使用方法
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
WO2014055960A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 Genelux Corporation Energy absorbing-based diagnostic and therapeutic methods employing nucleic acid molecules encoding chromophore-producing enzymes
WO2014127825A1 (en) 2013-02-21 2014-08-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament
US10238700B2 (en) 2014-01-02 2019-03-26 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
BR102015012334A2 (pt) * 2015-05-27 2016-11-29 Fundação Hemoct De Ribeirão Preto Fundherp processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea
CN116064669A (zh) 2016-01-08 2023-05-05 吉奥瓦科斯公司 用于产生对肿瘤相关抗原的免疫应答的组合物和方法
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
WO2024011250A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Viromissile, Inc. Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5155020A (en) 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5135855A (en) * 1986-09-03 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells
US5266313A (en) 1987-02-03 1993-11-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Raccoon poxvirus as a gene expression and vaccine vector for genes of rabies virus and other organisms
FR2619314B1 (fr) * 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
NL9020389A (nl) 1989-03-08 1991-12-02 Health Research Inc Systeem voor het in de gastheer selecteren van recombinant-pokkenvirussen.
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
JP2549224B2 (ja) * 1990-01-26 1996-10-30 イムノ・アクチェンゲゼルシャフト 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体
US5204243A (en) 1990-02-14 1993-04-20 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus internal cores
EP0953648A3 (en) 1990-09-25 2007-09-12 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line
US5863542A (en) 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
US5989561A (en) 1991-03-07 1999-11-23 Virogenetics Corporation Recombinant poxvirus-calicivirus rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) compositions and uses
KR100242671B1 (ko) 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
AU4560693A (en) 1992-07-30 1994-03-03 Akzo Nobel N.V. Non-shedding live herpesvirus vaccine
EP0805854A4 (en) 1995-01-13 2000-06-07 Virogenetics Corp IMMUNOGENIC COMPOSITIONS WHICH RECOMBINANT CONTAINED WEAKENED POX VIRUSES THAT EXPECT AN HTLV ANTIQUE

Also Published As

Publication number Publication date
ATE181108T1 (de) 1999-06-15
NO923323D0 (no) 1992-08-25
EP0561034A2 (en) 1993-09-22
US6265183B1 (en) 2001-07-24
CZ264192A3 (en) 1993-08-11
FI923828A (fi) 1993-02-27
SI9200190A (en) 1993-03-31
DE69229390T2 (de) 1999-11-11
MX9204926A (es) 1994-02-28
NO310306B1 (no) 2001-06-18
JPH06261763A (ja) 1994-09-20
EP0561034A3 (sk) 1995-04-26
PL295733A1 (en) 1993-05-17
DE69229390D1 (de) 1999-07-15
NO923323L (no) 1993-03-01
AU2126992A (en) 1993-03-04
CA2076839A1 (en) 1993-02-27
EP0561034B1 (en) 1999-06-09
CA2076839C (en) 2007-06-12
AU652467B2 (en) 1994-08-25
US6103244A (en) 2000-08-15
BR9203322A (pt) 1993-03-30
FI923828A0 (fi) 1992-08-26
HUT69927A (en) 1995-09-28
HU219369B (en) 2001-03-28
FI111384B (fi) 2003-07-15
YU79092A (sh) 1995-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI111384B (fi) Menetelmä modifioidun selkärankaispoxviruksen molekylaariseksi kloonaamiseksi, modifioitu virus, sen DNA ja sen käyttö
KR102604096B1 (ko) 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료
CN111344395A (zh) 产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法
KR102550926B1 (ko) 이중 항체 구축물을 발현하는 aav를 포함하는 조성물 및 이들의 용도
AU2020286323A1 (en) Co-stimulatory domains for use in genetically-modified cells
KR20180097631A (ko) 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법
KR20160138298A (ko) 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
KR20170108946A (ko) Fc 수용체-유사 5를 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
JP2023036921A (ja) 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
DK2768848T3 (en) METHODS AND PROCEDURES FOR EXPRESSION AND SECRETARY OF PEPTIDES AND PROTEINS
CN107849583B (zh) 使用细胞分裂基因座控制细胞增殖的工具和方法
AU2018235957B2 (en) Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins
CN111733174B (zh) 一种分离的核酸分子及其用途
CN112912112A (zh) 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途
CN113164560A (zh) 改善基因疗法的新工具及其用途
CN114990157B (zh) 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN114958762B (zh) 一种构建神经组织特异过表达人源snca的帕金森病模型猪的方法及应用
KR20220142502A (ko) 근육 특이적 핵산 조절 요소 및 이의 방법 및 용도
CN114958758B (zh) 一种乳腺癌模型猪的构建方法及应用
CA2515166C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
CA2558864C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
CN113260704B (zh) CYP4V2和RdCVF在制备药物中的用途
KR20220037964A (ko) 재조합 발생이 최소화된 유전자치료 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 및 상기 재조합 레트로바이러스를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN116323924A (zh) 具有最小化重组发生的基因疗法载体、包含载体的重组逆转录病毒和用于预防或治疗癌症的包含重组逆转录病毒的药物组合物
RU2779747C2 (ru) Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на подобный fc-рецептору белок 5, и их применение