SI9200190A - Direct molecular cloning of a modified eucaryotic cytoplasmic dna virus genome - Google Patents

Direct molecular cloning of a modified eucaryotic cytoplasmic dna virus genome Download PDF

Info

Publication number
SI9200190A
SI9200190A SI19929200190A SI9200190A SI9200190A SI 9200190 A SI9200190 A SI 9200190A SI 19929200190 A SI19929200190 A SI 19929200190A SI 9200190 A SI9200190 A SI 9200190A SI 9200190 A SI9200190 A SI 9200190A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
dna
virus
genome
sequence
modified
Prior art date
Application number
SI19929200190A
Other languages
English (en)
Inventor
Friedrich Dorner
Falko-Guenter Falkner
Michael Pfleiderer
Original Assignee
Immuno Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/750,080 external-priority patent/US5445953A/en
Application filed by Immuno Aktiengesellschaft filed Critical Immuno Aktiengesellschaft
Publication of SI9200190A publication Critical patent/SI9200190A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Direktno molekulsko kloniranje modificiranega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa
Pričujoča prijava je delna nadaljevalna prijava patentne prijave, serijska št, 07/750,080, vložene 26.avgusta 1991, ki je sedaj opuščena.
Ozadje izuma
Pričujoči izum se nanaša na modificirane genome evkariotskih DNA virusov, ki se podvajajo v citoplazmi gostiteljske celice, kot so poksvirusi in iridovirusi. Natančneje se izum nanaša na direktno molekulsko kloniranje modificiranega genoma citoplazemskega DNA virusa, ki nastane z modificiranjem molekule očiščene DNA, ki obsega genom citoplazemskega DNA virusa, pod ekstracelularnimi pogoji. Molekulo modificirane DNA nato zapakiramo v kužne virione v celici, okuženi s pomožnim citoplazemskim DNA virusom. V prednostni izvedbeni obliki pričujočega izuma vstavimo fragment tuje DNA, ki obsega želeni gen, direktno v genomsko poksvirusno DNA na cepitvenem mestu za restrikcijsko endonukleazo, ki je edino v virusnem genomu, in modificirano virusno DNA zapakiramo v virione s transfekcijo v celice, okužene s pomožnim poksvirusom.
Citoplazemski DNA virusi evkariotov vključujejo različne poksviruse in iridoviruse, ki jih najdemo v vretenčarjih in insektih. ' Poksviruse, ki imajo rekombinantne genome, so uporabljali za izražanje cele vrste vstavljenih genov. Take poksviruse lahko uporabijo npr. za proizvodnjo biološko aktivnih polipeptidov v celičnih kulturah in za oddajanje antigenov s cepivom direktno v imunski sistem živali ali človeka. Konstruiranje rekombinantnih genomov iridovirusov za izražanje tujih genov v literaturi, ki se nanaša na genetski inženiring, ni dokumentirano.
Običajne tehnike za konstruiranje rekombinantnih poksvirusnih genomov, ki obsegajo tuje gene, se deloma opirajo na in vivo (intracelulamo) rekombinacijo. Uporabo intracelularne rekombinacije sta najprej opisala kot postopek za reševanje markerja (marker rescue) s subgenomskimi fragmenti virusne DNA Sam & Dumbell,v4nrc. Virol. (Institut Pasteur) 132E: 135 (1981). Ta avtorja sta dokazala, da se da na temperaturo občutljivi mutant virusa vakcinije rešiti z intracelulamo rekombinacijo subgenomskega fragmenta DNA virusa kunčjih' koz. Metode, ki sta jih uporabljala za intracelulamo rekombinacijo, so še danes v uporabi.
Konstruiranje rekombinantnih virusov vakcinije, ki obsegajo ne-poksvirusne (tuje) gene, so kasneje opisali Panicali & Paoletti, Proč. Nat’l Acad. ScL U.S.A. 79: 49274931 (1982); Mackett, et al., Proč. NaflAcad. ScL U.S.A. 79: 7415-7419 (1982); U.S. patent No. 4,769,330. Natančneje, obstoječa tehnologija za izdelavo rekombinantnih poksvirusov obsega dve stopnji. Najprej pripravijo fragment DNA, ki ima področja, ki so homologna poksvirusnemu genomu, ki obdajajo tuji gen. Alternativno konstruirajo insercijski plazmid z in vitro (ekstracelulamo) rekombinancijo tujega gena s plazmidom. Ta plazmid obsega kratke sekvence virusne DNA, ki so homologne področju poksvirusnega genoma, kjer je končno zaželeno vstavljanje gena. Tuji gen vstavijo v plazmid na mestu, ob katerem leže bočno sekvence virusne DNA, in tipično navzdolno od poksvirusnega promotorja, ki bo kontroliral prepisovanje vstavljenega gena. V drugi stopnji uvedejo insercijski plazmid v gostiteljske celice, okužene s tarčnim poksvirusom. Gen nato indirektno vstavijo v poksvirusni genom z intracelulamo rekombinacijo med homolognimi virusnimi sekvencami v poksvirusnem genomu in delom plazmida, ki vključuje tuji gen. Nastali rekombinantni genom se nato podvaja, pri čemer nastane kužni poksvirus.
Tako je bil za vstavljanje vsakega določenega gena v poksvirusni genom doslej potreben poseben plazmid, ki je obsegal virusne sekvence, ki leže bočno ob genu, izbrane za želeno mesto vstavljanja. Težava pri tem načinu dela je, da je za vsak rekombinantni poksvirus potreben nov insercijski plazmid. Vsak plazmid je treba konstruirati z ekstracelulamimi metodami rekombinantne DNA, ga pomnožiti v bakterijski celici in nato s trudom izolirati in zelo natančno očistiti, predno ga dodajo gostiteljski celici, okuženi s poksvirusom.
Drugi problem pri obstoječi metodologiji je v tem pogledu nizek dobitek rekombinantnih genomov, zaradi katerega je lahko potrebno opraviti screning z več sto posameznimi virusi, da bi našli en sam želen rekombinant. Slabi dobitek je funkcija majhne pogostnosti individualnih dogodkov intracelulame rekombinacije, povezane s potrebo po mnogotemih tovrstnih dogodkih, da uspe vključitev insercijskega plazmida v virusni genom. To ima za posledico, da je večina virusnih genomov, ki nastanejo z metodami intracelulame rekombinacije, starševskih (prvobitnih) genomov, ki nimajo tujega gena. Zato je pogosto potrebno uvesti obenem s katerokoli drugo želeno sekvenco v poksvirusni genom selektiven markerski gen, ki omogoči takojšnjo ugotovitev prisotnosti potrebnih redkih rekombinantov, ne da bi bilo potrebno karakterizirati različne izolirane DNA iz številnih posameznih virusnih klonov.
Očiščene DNA evkariotskih citoplazemskih DNA virusov niso sposobne podvajanja, če jih uvedejo v dovzetene gostiteljske celice ob uporabi metod, ki sprožijo okužbe z virusnimi DNA, ki se podvajajo v jedru. To pomanjkanje kužnosti DNA iz citoplazemskih DNA virusov je posledica dejstva, da mora začeti virusno prepisovanje v okuženih celicah za virus specifična RNA polimeraza, ki je normalno na razpolago v kužnih virionih.
Reaktiviranje poksvirusne DNA, pri katerem so genomsko DNA v inaktiviranem nekužnem poksvirusnem delcu zapakirali v kužne virione z istočasno infekcijo z življenja sposobnim pomožnim poksvirusom, je znano že več desetletij. Glej npr. Fenner & Woodroofe, Virology 11: 185-201 (1960). Leta 1981 sta Sam in Dumbell dokazala, da se da izolirana, nekužna genomska DNA prvega poksvirusa zapakirati v kužne poksvirusne virione v celicah, okuženih z drugim, genetsko različnim poksvirusom. Sam & Dumbell, Ann. Virol. (Institut Pasteur) 132E: 135 (1981). To zapakiranje gole poksvirusne DNA so najprej dokazali s transfekcijo nemodificirane DNA, ki obsega prvi genom divjetipskega ortopoksvirusa, izoliran iz virionov okuženih celic, v celice, okužene z drugim genomom ortopoksvirusa, ki nastopa v naravi. Vendar doslej še niso dokazali heterolognega pakiranja, t.j. pakiranja DNA iz enega rodu poksvirusov (npr. ortopoks) z življenjsko sposobnimi virioni drugega rodu (npr. avipoks).
O uporabi intracelularne rekombinacije' za konstruiranje rekombinantnega poksvirusnega genoma, ki izraža ne-poksvirusne gene, so poročali kmalu potem, ko sta Sam & Dumbell prvič poročala o intracelularnem zapakiranju gole poksvirusne DNA v poksvirusne virione in reševanju markerja s fragmenti DNA z intracelulamo rekombinacijo. Glej: Panicali & Paoletti, 1982; Mackett, et al., 1982. V ustrezni literaturi naslednjega desetletja pa ni dokumentirano direktno molekulsko kloniranje, t.j. konstruiranje modificiranega genoma kateregakoli evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, zlasti poksvirusa, samo z ekstracelularnim genetskim inženiringom. V literaturi celo nikjer ni dokaza o zelo razširjenem priznavanju kakršnihkoli prednosti, ki bi jih lahko dosegli s takim načinom direktnega kloniranja. Prav nasprotno, splošno priznana Študija trdi, da direktno molekulsko kloniranje v kontekstu genetskega inženiringa poksvirusov ni praktično, ker poksvirusna DNA ni kužna. F. FENNER, R. WITTEK & K.R. DUMBELL, THE POXVIRUSES (Academic Press, 1989). Drugi delavci na tem področju podobno niso upoštevali endonukleolitske cepitve in religiranja poksvirusnih DNA, četudi so priznali potencial za reševanje izolirane DNA, ki obsega rekombinantni poksvirusni genom, s kužnim virusom, glej npr. Mackett & Smith, J. Gen. virol. 67: 2067-2082 (1986). Še več, najnovejše publikacije navajajo tezo, da so edini izvedljivi način za konstruiranje rekombinantnega poksvirusnega genoma metode, ki zahtevajo intracelulamo rekombinacijo. Glej Miner & Hruby, TIBTECH 8: 20-25 (1990) in Moss & Flexner, Ann. Rev. Immunol. 5: 305-324 (1987).
Glavna vsebina izuma
Zato je smoter pričujočega izuma dati na razpolago postopek za konstruiranje modificiranih genomov evkariotskih citoplazemskih DNA virusov, zlasti poksvirusov, ki premaga zgoraj omenjene omejitve, povezane z običajnimi tehnikami, ki temelje na intracelularni rekombinaciji. Drug smoter pričujočega izuma je dati na razpolago tehnike za konstruiranje genoma citoplazemskega DNA virusa, ki dajejo bistveno višje dobitke rekombinantov kot obstoječa metodologija.
Še nadaljnji smoter tega izuma je dati na razpolago postopke za modificiranje genoma citoplazemskega DNA virusa z direktno modifikacijo genomske virusne DNA in intracelularnim zapakiranjem modificirane virusne DNA v virione s pomočjo funkcij pomožnega virusa.
Še drug smoter tega izuma je dati na razpolago postopke za konstruiranje genoma citoplazemskega DNA virusa, ki dajo v enostopenjski reakciji rekombinacije modificirane genome, ki imajo segment tuje DNA vstavljen v vsaki od obeh možnih orientacij, in modificirane genome, ki imajo monogoteme vstavke segmenta tuje DNA.
Še nadaljnji smoter tega izuma je dati na razpolago molekule modificirane DNA, ki so primerne za direktno molekulsko kloniranje tujih genov v modificiran genom citoplazemskega DNA virusa, ki obsega dva dela genomske virusne DNA, nastala s cepitvijo s sekvenčno specifično endonukleazo na mestu, ki je edino v virusnem genomu.
Še nadaljnji smoter tega izuma je dati na razpolago citoplazemski DNA virus, zlasti poksvirus, ki ima modificiran genom, ki obsega tujo DNA, vstavljeno v edino cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo.
Še drug smoter ter izuma je dati na razpolago plazmide, ki olajšujejo konstruiranje in prenašanje genskih kaset v citoplazemski DNA virus, zlasti poksvirus, ob uporabi direktnega molekulskega kloniranja.
Pri uresničevanju teh in drugih smotrov smo v skladu z enim vidikom pričujočega izuma dali na razpolago postopek za pripravo modificiranega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa z direktnim molekulskim kloniranjem molekule modificirane DNA, ki obsega modificiran genom citoplazemskega DNA virusa. Ta postopek v smislu izuma obsega stopnje, v katerih (I) modificiramo pod ekstracelularnimi pogoji molekulo očiščene DNA, ki obsega prvi genom citoplazemskega DNA virusa, da nastane molekula modificirane DNA, ki obsega modificirani virusni genom, (II) uvedemo molekulo modificirane DNA v prvo gostiteljsko celico, ki zapakira molekulo modificirane DNA v kužne virione, in (III) pridobimo iz prve gostiteljske celice kužne virione, ki obsegajo modificirani virusni genom.
V skladu z eno izvedbeno obliko tega postopka obsega stopnja modificiranja molekule DNA pod ekstracelularnimi pogoji stopnjo cepitve molekule DNA s sekvenčno specifično endonukleazo. V skladu z drugo izvedbeno obliko obsega stopnja modificiranja molekule DNA stopnjo vstavljanja sekvence prve DNA v prvi virusni genom. To sekvenco prve DNA vstavimo s pridom v prvi genom na cepitvenem mestu za sekvenčno specifično endbnukleazo. Pripominjamo, da pomeni, kadar je določena sekvenčno specifična endonukleaza, kot npr. bakterijski restrikcijski encim, opisana tukaj z imenom, to ime tudi katerikoli izoshizomer imenovane nukleaze.
V danem primeru obsega stopnja modificiranja molekule DNA v skladu s tem postopkom tudi stopnjo uporabe fosfataze za odstranitev fosfatnega dela s konca segmenta DNA, ki nastane s cepitvijo molekule DNA s sekvenčno specifično endonukleazo.
V nekaterih izvedbenih oblikah tega postopka je prvi virusni genom genom virusa vakcinije in edino mesto je cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo No6tl ali za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Smal. Prvi genom lahko obsega tudi sekvenco druge DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, kjer obsega ta sekvenca druge DNA edino cepitveno mesto. Npr., prvi genom je lahko genom virusa kuijih koz, ki obsega sekvenco gena /3-galaktozidaze Escherichije coli in edino mesto je cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti, ki se nahaja v tem genu.
V drugih oblikah tega postopka je sekvenca prve DNA vstavljena v prvi virusni genom med prvim cepitvenim mestom za prvo sekvenčno specifično endonukleazo in drugim cepitvenim mestom za drugo sekvenčno specifično endonukleazo. V danem primeru je tako prvo kot drugo cepitveno mesto edino v prvem virusnem genomu.
V skladu z drugimi izvedbenimi oblikami postopka v smislu tega izuma je vsaj del sekvence prve DNA, ki je vstavljena v prvi genom, pod prepisovalno kontrolo promotorja. Ta promotor se lahko nahaja v sekvenci prve DNA, ki je vstavljena v prvi virusni genom. Alternativno se promotor nahaja v modificiranem virusnem genomu navzgomo od sekvence prve DNA, ki je vstavljena v prvi genom. V nekaterih primerih uporablja promotor RNA polimeraza, ki jo kodira modificirani virusni genom. Ta promotor je lahko primeren tudi za začetek prepisovanja evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, ki ga je treba modificirati, z RNA polimerazo. V nekaterih postopkih obsega promotor modifikacijo naravnega promotoija evkariotskega citoplazemskega DNA virusa.
Stopnja modificiranja molekule DNA v skladu s postopkom v smislu izuma lahko ob7 sega stopnjo delecije sekvence DNA iz prvega genoma. Alternativno obsega ta stopnja stopnjo nadomestive sekvence DNA prvega genoma.
Postopek modificiranja prvega virusnega genoma lahko obsega tudi stopnjo okuženja prve gostiteljske celice z drugim evkariotskim citoplazemskim DNA virusom, ki obsega drugi genom, ki se izraža, da zapakiramo modificirani virusni genom v kužne virione. S pridom izvedemo stopnjo uvedbe modificirane molekule DNA v prvo gostiteljsko celico približno 1 uro po stopnji okuženja prve gostiteljske celice z drugim evkariotskim citoplazemskim DNA virusom.
V eni varianti tega postopka izberemo prvo gostiteljsko celico tako, da izražanje drugega genoma v prvi gostiteljski celici ne povzroči nastanka kužnih virionov, ki obsegajo drugi virusni genom. Npr. tam, kjer je modificirani virusni genom modificirani genom virusa vakcinije in je drugi genom genom virusa kurjih koz, je izbrana prva gostiteljska celica sesalska celica.
V nekaterih oblikah postopka modificiranja virusnega genoma obsega stopnja pridobivanja kužnih virionov, ki obsegajo modificirani virusni genom, stopnjo okuženja druge gostiteljske celice s kužnimi virioni, ki jih je proizvedla prva gostiteljska celica. To izvedemo pri takih pogojih, da izražanje drugega genoma v drugi gostiteljski celici ne povzroči nastanka kužnih virionov, ki obsegajo drugi genom. Npr., če je modificirani virusni genom modificirani genom virusa vakcinije, je lahko drugi genom genom virusa kurjih koz in druga gostiteljska celica sesalska celica. Alternativno vsebuje modificirani virusni genom gen funkcionalnega kroga gostiteljev, ki je potreben, da nastanejo v drugi gostiteljski celici kužni virioni, in drugi genom nima tega gena funkcionalnega kroga gostiteljev. To ilustrira primer, kjer je modificirani virusni genom modificiran genom virusa vakcinije, ki obsega gen funkcionalnega kroga gostiteljev, ki je potreben zato, da nastanejo v človeški celici kužni virioni, in je druga gostiteljska celica človeška celica.
V drugih oblikah tega postopka obsega modificirani virusni genom selektiven markerski gen, drugi genom nima tega selektivnega markerskega gena in stopnjo okuženja druge gostiteljske celice izvedemo pri pogojih, ki izbirajo genom, ki izraža ta selektivni markerski gen. S pridom podeli izražanje selektivnega markerskega gena v drugi gostiteljski celici tej drugi gostiteljski celici odpornost proti citotoksičnemu zdravilu, ki je med okuženjem prisotno v ravni, ki je zadostna, da izbere genom, ki izraža selektivni markerski gen.
V skladu z drugim vidikom pričujočega izumh dajemo na razpolago modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus, dobljen z direktnim molekulskim kloniranjem modificiranega virusnega genoma v skladu z zgoraj povzetimi postopki.
Še drug vidik pričujočega izuma se nanaša na modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus, ki obsega modificiran virusni genom, v katerem obsega ta modificirani virusni genom (I) prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Ta prvi genom obsega cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo in to cepitveno mesto je edino mesto v prvem genomu. Modificirani genom nadalje obsega (II) sekvenco prve DNA, vstavljeno v edino mesto v prvem genomu.
V skladu z važnejšo izvedbeno obliko tega vidika izuma sekvenca prve DNA ne nastopa prirodno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. V nekaterih prednostnih primerih je prvi genom genom virusa vakcinije in edino mesto je cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz Noti in Smal.
Prvi genom lahko obsega sekvenco druge DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, in ta druga sekvenca DNA obsega edino cepitveno mesto. V enem primeru je prvi genom genom virusa kurjih koz, ki obsega sekvenco druge DNA gena /3-galaktozidaze Escherichije coli, in edino mesto v tem genu je cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti.
V nekaterih modificiranih virusih v smislu izuma je vsaj del te prve sekvence DNA, ki je vstavljena v edino mesto, pod prepisovalno kontrolo promotorja. Ta promotor se nahaja v sekvenci prve DNA, ki je vstavljena v prvi genom. V nekaterih primerih je prvi genom poksvirusni genom in promotor obsega poksvirusni promotor, bodisi promotor poksvirusa, ki nastopa v naravi, ali njegovo modifikacijo.
Še drug vidik pričujočega izuma se nanaša na modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus, ki obsega modificiran virusni genom, v katerem obsega modificirani virusni genom (I) prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Ta prvi genom obsega prvo cepitveno mesto za prvo sekvenčno specifično endonukleazo in drugo cepitveno mesto za drugo sekvenčno specifično endonukleazo. Vsako od teh cepitvenih mest je edino mesto v prvem genomu.
Modificirani genom v tem modificiranem virusu obsega nadalje (II) sekvenco prve DNA, vstavljeno v prvi genom med prvim edinim mestom in drugim edinim mestom.
V nekaterih oblikah tega modificiranega virusa se prva sekvenca DNA ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. V nekaterih primerih obsega prvi genom drugo sekvenco DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, in ta druga sekvenca DNA obsega prvo sekvenco DNA, vstavljeno med prvim edinim mestom in drugim edinim mestom. Za primer lahko modificirani virus obsega prvi genom, kije genom virusa vakcinije, in je prvo edino mesto in drugo edino mesto cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz Noti, Smal, Apal in RsrII.
Še drug modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus v smislu pričujočega izuma obsega modificiran virusni genom, ki obsega (I) prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Ta prvi genom sestoji iz sekvence prve DNA in ta sekvenca prve DNA obsega cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino mesto v tem modificiranem virusnem genomu. Ta genom tega modificiranega virusa obsega nadalje (II) promotor, kije na takem mestu, daje sekvenca DNA, vstavljena v edino mesto virusnega genoma, pod prepisovalno kontrolo promotoija. V določenih oblikah ta sekvenca prve DNA nima prevajalnega startnega kodona med promotoijem in edinim mestom za vstavljanje. Ta prva sekvenca DNA je lahko sekvenca, ki ne nastopa v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Primer takega modificiranega virusa je virus, v katerem je prvi genom genom virusa vakcinije in prva sekvenca DNA obsega mnogoterno mesto za kloniranje, ki obsega cepitvena mesta za bakterijske restrikcijske endonukleaze Noti, Smal, Apal in /farll.
Še drug vidik pričujočega izuma se nanaša na modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus v smislu tega izuma, v katerem je prva sekvenca v modificiranem virusnem genomu (vstavljena sekvenca, ki je zanimiva) izražena v gostiteljski celici, kar ima za posledico proizvodnjo proteina.
V skladu z drugim vidikom se pričujoči izuma nanaša tudi na molekulo DNA, ki obsega modificiran virusni genom modificiranega virusa v skladu s pričujočim izumom. Podrobno obsegajo nekatere oblike te molekule DNA en konec modificiranega virusnega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, v katerem (I) ta konec modificiranega virusnega genoma obsega sekvenco DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. V tej molekuli DNA (II) obsega modificirani virusni genom cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino mesto v modificiranem virusnem genomu, in (III) molekula DNA ima zaključek, ki je homologen z zaključkom, ki nastane s cepitvijo edinega mesta v modificiranem virusnem genomu s sekvenčno specifično endonukleazo.
V nekaterih oblikah te molekule DNA obsega sekvenca DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino mesto v modificiranem virusnem genomu.
Še drug vidik tega izuma se nanaša na komplet za direktno molekulsko kloniranje modificiranega virusnega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, ki obsega (I) očiščene molekule DNA v skladu s tem izumom, (II) DNA ligazo in (III) raztopine pufeija in reagentov, primernih za ligiranje segmentov DNA, da nastane modificirana molekula DNA, ki obsega modificirani virusni genom. V eni obliki obsega ta komplet nadalje plazmid, ki sestoji iz kasete za izražanje genov, ob kateri leže bočno mesta za cepitev s sekvenčno specifično endonukleazo, ki so kompatibilna za vstavljanje te kasete v edino cepitveno mesto modificiranega virusnega genoma, ki ga kodira molekula DNA v kompletu. Komplet lahko nadalje obsega prvo gostiteljsko celico in drugi virus, primeren za zapakiranje modificiranega virusnega genoma v kužne virione.
V skladu z nadaljnjim vidikom se nanaša ta izum na plazmid, ki obsega segment DNA, ki ima na vsakem koncu cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti. V tem plazmidu obsega ta segment DNA cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino v plazmidu. Primer takega plazmida, kot ga kaže sl. 1.3, označujemo pN2 in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 1. V tem plazmidu lahko obsega segment DNA nadalje selektiven markerski gen pod prepisovalno kontrolo poksvirusnega promotorja. Taki plazmidi vključujejo npr. plazmid z oznako pN2-gp/a, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 2, in plazmid pN2-^pib, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 3.
Drug plazmid v smislu izuma vsebuje segment DNA, ki obsega nadalje poksvirusni promotor, ki je operativno vezan na sekvenco DNA, ki obsega cepitveno mesto za restrikcijsko endonukleazo. Tako je segment DNA, vstavljen v to cepitveno mesto, pod prepisovalno kontrolo tega promotorja. Primera sta plazmid, označen pAl-S2, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 11, in plazmid pA2-S2, ki obsega sekvenco iz SEQ.
ID. NO. 12. Primer takega plazida, ki nadalje vključuje selektiven markerski gen, ki je pod kontrolo posebnega poksvirusnega pfomotorja, je plazmid pN2gp/-S4, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 14.
Še drug plazmid obsega segment poksvirusnega genoma, ki obsega gen timidin kinaze tega poksvirusa. Ta gen timidin kinaze je bil modificiran, da bi preprečili izražanje aktivne timidin kinaze, kot v plazmidih z oznako pHindJ-2, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 4, in pHindJ-3, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 5.
Še drug plazmid obsega poksvirusni promotor, ki je operativno vezan na prevajalni startni kodon. Temu startnemu kodonu sledi takoj drugo cepitveno mesto za restrikcijsko endonukleazo, ki je primemo prirejeno, da omogoči prevajanje odprtega bralnega okvira, vstavljenega v to drugo cepitveno mesto za restrikcijsko endonukleazo. Primeri tega plazmida vključujejo plazmid z oznako pAl-Sl, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 9, pA2-Sl, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 10, in plazmid pN2,gpr-S3A, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 13.
En poseben plazmid take vrste obsega nadalje sekvenco DNA, ki kodira humani protrombin, kjer je ta sekvenca DNA operativno vezana na poksvirusni promotor in startni kodon, kot je prikazano v sl. 5.1 s plazmidom z oznako plazmid pAlSl-PT, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 15.
Še drug plazmid obsega nadalje sekvenco DNA, ki kodira humani plazminogen, in vključuje prevajalni startni kodon, kjer je ta sekvenca DNA operativno vezana na poksvirusni promotor. Kot je prikazano na sl. 5.2, je primer za to plazmid, izveden iz pN2gpt-S4, kot pN2gpt-GPg, ki kodira humani glu-plazminogen in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 17, in pN2gpt-LPg, ki kodira lys-plasminogen in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 18.
Še drug plazmid v smislu tega izuma, kot zgoraj, obsega nadalje sekvenco DNA, ki kodira gpl60 virusa humane imunske pomanjkljivosti (HIV), vključno prevajalni startni kodon, operativno vezan na poksvirusni promotor, kot kaže sl. 5.4, s plazmidom pN2gpt-gpl60, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 19. Končno obsega še drug plazmid sekvenco DNA, ki kodira humani von Willebrandov faktor, kot kaže sl.
6.2, pri čemer ima en primer oznako plazmid pvWF, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 20.
Nekateri plazmidi v smislu tega izuma obsegajo cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, kije edino v genomu poksvirusa. Primeri so prikazani na sl.
4.3, vključno pAO, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 6, pAl, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 7, in pA2, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 8.
Še drug plazmid obsega modificiran EcoRI K-fragment DNA virusa vakcinije, iz katerega je z delecijo odstranjen gen KIL kroga gostiteljev, kot kaže sl. 8.1. Dva primera za to sta pEcoK-dhr, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 21, in pdhr-gpt, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 22.
Drugi smotri, značilnosti in prednosti pričujočega izuma bodo postali razvidni iz podrobnega opisa, ki sledi. Vendar se razume, da so podrobni opis in specifični primeri, ki sicer nakazujejo prednostne izvedbene oblike izuma, podani samo za ponazoritev, saj bo strokovnjak iz tega podrobnega opisa lahko razbral različne spremembe in modifikacije znotraj duha in obsega izuma.
Kratek opis risb
Sl. 1.1 ponazarja izražanje markerskih genov z modificiranimi genomi poksvirusov, ki nastanejo z reaktiviranjem gole poksvirusne DNA. Prikazan je s srebrom obarvani poliakrilamidni gel proteinov, nastalih v kulturi supernatantov celic, okuženih z zapakiranimi virusi (vpPg#l-vpPg#8) in s kontrolami divjetipskega (WT) virusa. Zgornja puščica kaže na trak plazminogenskega markerja, spodnja puščica na trak pretežno izločenega markerskega 35K proteina vakcinije. Progi 1 in 9, markerski proteini; progi 2 in 10, standard humanega plazminogena (10 ng); proga 3, rekombinant vakcinije vPgD (vir zapakirane DNA); proge 4 do 7 in 11 do 14, vpPg#l-8; progi 8 in 15, divjetipska vakcinija (WR WT).
Sl. 1.2 je shematičen diagram, ki ponazarja direktno molekulsko kloniranje poksvirusnih genomov, ki sestoje iz genske kasete za izražanje markerskega gena (gpi-gena E. coli) pod kontrolo virusnega promotorja vakcinije.
Sl. 1.3 je shematična ponazoritev konstruiranja plazmidov (pN2-gp/a in pN2-gpZb), ki sta prekurzoija za konstruiranje kaset za gensko izražanje z vstavljanjem promotorja in odprtega bralnega okvira. Take kasete so zasnovane za direktni molekulski prenos v vektorje virusa vakcinije ob uporabi edinega mesta za vstavljanje in izberljivega markerskega gena (gpt), ki ga kontrolira promotor virusa vakcinije. MCS = mnogotemo mesto za kloniranje. P7.5 = proinotor za gen 7.5K polipeptida vakcinije;
Pil = promotor za gen 11K polipeptida vakcinije. Puščice kažejo smeri prepisovanja od promotorjev.
Sl. 1.4 dokazuje, da vsebujejo poksvirusni genomi, dobljeni z direktnim molekulskim kloniranjem, kaseto markerskega gpt gena, vstavljeno v edino (Noti) cepitveno mesto, kot kažejo analize Southemovih prenosov plakno očiščenih virusnih DNA, razgrajenih z endonukleazo Hindlll ob uporabi sonde z gpt genom. Proga 1, markerske DNA (s Hindlll razgrajena DNA faga \); progi 2 in 3, DNA divjetipskega virusa vakcinije (WR), razrezana s Hindlll (500 oz. 100 ng); proge 4 do 9, DNA celic, okuženih s plaki, označenimi 2.1.1 do 7.1.1; proge 10 do 12, DNA celic, okuženih s plaki 10.1.1 do 12.1.1. Puščice kažejo velikosti restrikcijskih fragmentov markerja v kilobaznih parih.
Sl. 1.5 nadalje ponazarja strukture modificiranih poksvirusnih DNA ob uporabi Southemovih prenosov z Noti razgrajenih DNA celic, okuženih z različnimi izolati in hibridiziranih s sondo z gpt genom. Proga 1, markerske DNA (s Hindlll razgrajena DNA faga X); proga 2, DNA divjetipske vakcinije (WT), razrezana z Noti (50 ng); proge 3-8, DNA celic, okuženih z rekombinantnimi plaki, označenimi 2.1.1 do 7.1.1; proge 9-11, DNA celic, okuženih s plaki 10.1.1 do 12.1.1.
SL 1.6 kaže primerjavo DNA iz divjetipske (WT) vakcinije in DNA modificiranega klona (vp7) ob uporabi z etidijevim bromidom obarvanih fragmentov DNA, cepljenih z navedenimi restrikcijskimi endonukleazami in ločenih na agaroznem gelu. Progi 1 in 2, produkti razgradnje WT in vp7 z Noti; progi 3 in 4, produkti razgradnje WT in vp7 s Hindlll; progi 5 in 6, produkti kombinirane razgradnje WT in vp7 s Hindlll in Noti; progi 7 in 8, produkti razgradnje WT in vp7 s Pstl; progi 9 in 10, produkti kombinirane razgradnje WT in vp7 s Pstl in Noti; progi 11 in 12, produkti razgradnje WT in vp7 s Sall; proga 13, markerske DNA (ligirana in s Hindlll razgrajena DNA faga k; in fag φΧ, razrezan s Huelll). Puščice na levi kažejo velikosti fragmentov (v kilobaznih parih) razgradnih produktov vakcinije WT z Noti; puščice na desni markeije. Upoštevaj, da vsebujeta progi 1 in 2 okoli 10-krat manj DNA kot druge proge.
Sl. 1.7 ponazaija Southernov prenos gela, prikazanega na sl. 1.6, ob uporabi sonde z gpt genom. Puščice kažejo velikosti markerjev.
Sl. 1.8 prikazuje analize Southernovih prendsov DNA virusa vakcinije iz okuženih celic, razgrajenih z Noti in hibridiziranih s sondo virusa vakcinije. Proge 1-4, DNA iz celic, okuženih s plaki, označenimi A1-A4; proge 5-8, plaki C1-C4; proge 9-12, plaki E1-E4; proga 13, DNA vakcinije WT; proga 14, DNA neokuženih gostiteljskih celic CV-1; proga 15, markerske DNA (s Hindlll razgrajena DNA faga λ in fag φΧ, razrezan s Haelll).
Sl. 1.9 kaže Southemov prenos istih vzorcev kot v gelu, prikazanem na sl. 1.8, ob uporabi sonde z gpt genom. Proge 1-12, kot na sl. 1.8; proga 13, DNA neokuženih gostiteljskih celic CV-1; proga 14, DNA vakcinije WT; proga 15, markerske DNA (s Hindlll razgrajena DNA faga λ in φΧ, razrezan s //belil).
Sl. 1.10 kaže Southernov prenos istih virusnih DNA kot v gelu na sl. 1.8, cepljen s Pstl, ob uporabi sonde z gpt genom. Proge 1-12 kot na sl. 1.8; proga 13, DNA neokuženih gostiteljskih celic CV-1; proga 14, DNA vakcinije WT; proga 15, markerske DNA (s Hindlll razgrajena DNA faga λ in fag φΧ, razrezan s//fleIII).
Sl. 1.11 očrtuje shemo napovedane strukture modificiranih Pstl C fragmentov DNA virusa vakcinije z enojnimi ali dvojnimi vstavki kasete gpt gena. P = cepitveno mesto Pstl in N = cepitveno mesto Noti. Številke kažejo velikosti ustreznih Pstlfragmentov; mastno tiskane številke kažejo fragmente, za katere pričakujemo, da bodo hibridizirali s sondo z gpt genom. Puščice kažejo smer prepisovanja gpt gena (800 bp) s promotorjem virusa vakcinije (300 bp).
Sl. 2.1 kaže analize rekombinantnih genomov avipoksvirusa (kuije koze, fowlpox, FP) z razgradnjo z restrikcijsko endonukleazo Noti in ločenjem s FIGE na 1 %-nem agaroznem gelu. Proga 5, marker (HinbUI-fragmenti faga, nerazrezani fag k in vakcinija WR); progi 1 in 2, DNA virusa kurjih koz HP1.441, nerazrezana in razrezana z Noti; progi 3 in 4, DNA rekombinantnega virusa kurjih koz f-TK2a, nerazrezana in razrezana z Noti.
Sl. 2.2 ponazarja konstruiranje virusov kurjih koz, ki izražajo tuje gene, z direktnim molekulskim kloniranjem. Kaseto za gensko izražanje, ki sestoji iz gpt gena E. coli, ki ga kontrolira poksvirusni promotor (P), ligiramo z levim in desnim krakom (ra oz. la) DNA virusa kurjih koz (f-TK2a), dobljenih s cepitvijo z Vbil. Zapakiranje izvedemo s pomožnim virusom kurjih koz (sev HP2) v fibroblastih piščančjih zarodkov.
Sl. 3.1 ponazarja postopek za konstruiranje modificiranih poksvirusov z ekstracelulamim konstruiranjem genoma in intracelulamim zapakiranjem. Gensko kaseto, ki sestoji iz gpt gena, ki ga kontrolira promotor virusa vakcinije, ligiramo z desnim krakom (ra) in levim krakom (la) DNA virusa vakcinije, razcepljene na edinem mestu z endonukleazo Smol. Zapakiranje izvedemo s pomožnim virusom kurjih koz (sev HP1.441) v fibroblastih piščančjih zarodkov. Pl = promotor gena virusa vakcinije, ki kodira za 7,5 kDA polipeptid.
Sl. 3.2 dokazuje, da vsebujejo konstruirani genomi virusa vakcinije, zapakirani s pomožnim virusom kurjih koz, pričakovani vstavek v edinem cepitvenem mestu Smal, kot smo določili z analizami Southernovega prenosa. Totalno DNA, izolirano iz okuženih celic, smo razgradili s Hindlll in prenešeni material hibridizirali s sondo z gpt genom. Proge 1-8, DNA iz celic, okuženih s plaki, označenimi F12.2-F12.9; proge 9-13, plaki F13.1-F13.5; progi 14 in 15, s TTindlll-razgrajena DNA, izolirana iz neokuženih celic in celic, okuženih z virusom vakcinije (WR divjetipski); proga 16, markeiji (s Hindlll razgrajena DNA faga X). DNA v progi 8 ne hibridizira, ker se izolat #F12.9 virusa ni podvajal.
Sl. 3.3 kaže shematičen oris pričakovanih struktur modificiranih genomov virusa vakcinije, ki imajo gensko kaseto vstavljeno v edino mesto Smal, zlasti modificirane Hindlll A-fragmente virusov z enojnimi in dvojnimi vstavki. H in S so cepitvena mesta za restrikcijski endonukleazi Hindlll oz. Smal. Številke kažejo velikosti Hzndlll-fragmentov, pri čemer kažejo mastno tiskane številke fragmente, za katere pričakujemo, da bodo hibridizirali s sondo z gpt genom. Kaseta za gpt gen sestoji iz promotorja virusa vakcinije (z velikostjo okoli 300 bp), ki ga loči interno mesto Hind III od sekvenc gpt (okoli 800 bp). Puščice kažejo smer prepisovanja gpt gena.
Sl. 4.1 kaže shematičen načrt za konstruiranje vektoija vdTK virusa vakcinije, ki ima modificiran gen timidin kinaze (tk). WR-WT = divjetipski (WT) Westem Reserve (WR) sev virusa vakcinije (W). List A kaže metodo, ki uporablja samo direktno molekulsko modificiranje genoma virusa vakcinije, vključno delecijo neželenih mest Noti in Smal. List B kaže alternativen način dela za delecijo mesta Noti ob uporabi tehnik reševanja markerja z virusom vakcinije in modificiranim plazmidom. List C kaže alternativno metodo za delecijo mesta Smal z reševanjem markerja.
Sl. 4.2 ponazarja konstrukcijo vektorja virusa vakcinije (vdTK), ki ima gen timidin kinaze (tk) nadomeščen z mnogoternim mestom za kloniranje. Puščica kaže začetek in smer prepisovanja tk gena virusa vakcinije (VV-tk) v Hindlll J fragmentu, kloniranem v plazmid pHindJ-1. tk-gen smo hadomestili, kot je prikazano, in končni plazmid pHindJ-3 smo uporabili, da smo v virus vakcinije vstavili modificirani Hindlll J fragment.
SL 4.3 kaže konstruiranje plazmidov (pAl in pA2), ki sta prekurzorja za konstruiranje kaset za izražanje genov z vstavljanjem promotoija in odprtega bralnega okvira. Take kasete so primerne za direktni molekulski prenos v vektor vdTK virusa vakcinije ob uporabi usmerjenega (prisilnega) kloniranja.
Sl. 4.4 ponazarja konstruiranje plazmidov (pAl-Sl in pA2-Sl), ki obsegajo kasete za izražanje genov, primerne za združitev odprtih bralnih okvirov s sintetičnim poksvirusnim promotorjem (Sl) in prevajalnim startnim kodonom. Kasete so zasnovane za direktni molekulski prenos v vektor vdTK virusa vakcinije s prisilnim kloniranjem. Promotor Sl je prisoten v različnih orientacijah v obeh plazmidih, kot je prikazano s puščicami, ki kažejo smeri prepisovanja.
Sl. 4.5 kaže konstruiranje plazmidov (pAl-S2 in pA2-S2), ki obsegajo kasete za izražanje genov, primerne za združitev odprtih bralnih okvirov, ki že imajo prevajalni startni kodon, s sintetičnim poksvirusnim promotorjem (S2), pred direktnim molekulskim prenosom v vektor vdTK virusa vakcinije s prisilnim kloniranjem. Promotor S2 je prisoten v različnih orientacijah v obeh plazmidih, kot kažejo puščice, ki kažejo smeri prepisovanja.
Sl. 4.6 kaže konstruiranje plazmidov pN2-gpta in pN2-gptb).
Sl. 4.7 kaže konstruiranje plazmidov (pN2gp/-S3A in pN^gpi-S4), ki obsegajo kasete za izražanje genov, primerne za združitev odprtega bralnega okvira, ki mu bodisi manjka (S3A) bodisi ima (S4) prevajalni startni kodon, s sintetičnim promotorjem (S3A oz. S4), pred direktnim molekulskim prenosom v edino mesto v vektorju vdTK virusa vakcinije. Kratice kot v sl. 1.3.
Sl. 5.1 ponazarja konstruiranje plazmidne kasete za izražanje genov (pAlSl-PT) za izražanje humanega protrombina v vektorju vdTK virusa vakcinije. Kratice kot na sl.
1.3. Puščice kažejo smer prepisovanja.
SL 5.2 kaže konstruiranje plazmidne kasete za izražanje genov (pN2gp/-GPg) za izražanje humanega glu-plazminogena v vektoiju vdTK virusa vakcinije. S4 = sintetični poksvirusni promotor; druge kraticd kot na sl. 1.3.
Sl. 5.3 kaže konstruiranje plazmidne kasete za izražanje genov (pN^gpi-LPg) za izražanje humanega lys-plazminogena v vektorju vdTK virusa vakcinije. Kratice kot na sl. 1.3.
Sl. 5.4 kaže konstruiranje plazmidne kasete za izražanje genov (pN%pi-gpl60) za izražanje antigena humanega virusa (HIV gpl60) v vektorju vdTK virusa vakcinije. Kratice kot na sl. 1.3.
Sl. 5.5 ponazarja način dela za screening modificiranih virusov vakcinije, narejenih z direktnim molekulskim kloniranjem, temelječim na sočasnem vstavljanju markerskega gena (E. coli /acZ-gen), ki podeli vizualno razločljiv fenotip (modri plak v primerjavi z normalnimi belimi plaki virusov, ki nimajo ZacZ gena).
Sl. 5.6 ponazarja konstruiranje plazmidov pTZS4-/acZa in pTZS4-/acZb.
Sl. 6.1 ponazarja konstruiranje vektorja virusa vakcinije (vS4) z usmeijevalnim glavnim mestom za kloniranje pod kontrolno močnega poznega promotoija virusa vakcinije (S4).
Sl. 6.2 kaže konstruiranje modificiranega virusa vakcinije (wWF) za izražanje vonWillebrandovega faktorja z direktnim molekulskim vstavljanjem odprtega bralnega okvira v vektor virusa vakcinije vS4. vWF = cDNA von Willebrandovega faktorja. Puščica kaže smer prepisovanja od promotorja S4.
Sl. 7.1 ponazarja učinek množine dodane DNA na zapakiranje DNA virusa vakcinije s pomožnim virusom kurjih koz v sesalskih celicah (CV-1), v katerih se virus kurjih koz ne podvaja popolnoma. 5 kultur smo okužili z virusom kurjih koz in nato transfektirali s prikazanimi množinami DNA virusa vakcinije. Prvi stolpec kaže kulturo brez dodane DNA in brez virusa kurjih koz, in peti stolpec brez dodane DNA, toda okuženo z virusom kurjih koz.
Sl. 8.1. kaže konstruiranje virusa vakcinije (vdhr), primernega za uporabo kot pomožni virus, ki ima mutacije kroga gostiteljev, ki preprečujejo podvajanje v nekaterih humanih celičnih linijah, hr-gen = gen kroga gostiteljev, ki se nahaja v jBcoRI K-fragmentu virusa vakcinije; druge kratice kot na sl. 1.3.
t
Sl. 9.1 kaže konstruiranje plazmidov pS2gpi-P2 in pP2gpl60MN. Puščice v plazmidih kažejo smer prepisovanja posameznih genov.
Sl. 9.2 kaže shematski prikaz konstruiranja virusov vP2-gpl60MN-A in vP2gpl60MN-B.
Sl. 9.3 kaže mape Rsil-E-fragmenta divjetipskega virusa vakcinije in Psil-fragmentov himemih virusov, ki vsebujejo gpl60 gene. Puščice kažejo smer prepisovanja gpl60 gena. Številke kažejo velikosti fragmentov v kilobaznih parih.
Sl. 9.4 kaže konstruiranje plazmida pselP-gpi-L2. Puščice kažejo smer prepisovanja posameznih genov.
Sl. 9.5 A) kaže konstruiranje plazmida pselP-gpl60MN in sl. 9.5 B) kaže sekvence okoli prevajalnih startnih kodonov divjetipskih (SEQ ID NO:73) in modificiranih gpl60-genov (SEQ ID NO:75).
Sl. 9.6 je shematičen prikaz konstruiranja himernih virusov vakcinije vselPgpl60MNA in vP2-gpl60MNB. Puščice kažejo smer prepisovanja gpl60-gena.
Sl. 9.7 je mapa Sn/I-F-fragmenta divjetipskega virusa vakcinije in Sa/I-fragmentov himernih virusov vakcinije vselP-gpl60MNA in Vp2-gpl60MNB. Puščice kažejo smer prepisovanja gpl60-gena. Številke kažejo velikosti fragmentov v kilobaznih parih.
Sl. 10.1 A) kaže strukturo plazmida pN2-gptaProtS. Ob dvojni genski kaseti, ki sestoji iz gpt gena, ki ga kontrolira P7.5 promotor vakcinije (P7.5) in gena za humani protein S (huProtS), ki ga kontrolira sintetični poksvirusni promotor (selP), ležijo bočno restrikcijska mesta Noti. Sl. 10.1 B) kaže sekvence okoli prevajalnih startnih kodonov divjetipskega gena proteina S (SEQ ID NO:77) in gena proteina S v himerah (SEQ ID NO:79).
Sl. 10.2 kaže analizo Southernovega prenosa himernih virusov vakcinije, ki nosijo gen proteina S. A) Totalne celične DNA, razgrajene s Sacl in hibridizirane z divjetipskim SflcTfragmentom vakcinije. B) Isti material, razgrajen z Noti, preiskan s sekvencami humanega proteina S. C) shematičen prikaz divjetipskega Sacl-l-fragmenta in himernega Sacl-fragmenta po ligaciji vstavka.
Sl. 10.3 kaže analizo Westemovega prenosa iz plazme izvedenega proteina S (pdProtS, progi 1 in 2) in rekombinantnega proteina S (rProtS). Supematante celičnih kultur (10 jul) celic SK Hepl smo testirali po inkubacijskih časih od 24 do 72 h.
Sl. 11.1 kaže strukturo plazmida pN2gpta-FIX. Ob dvojni genski kaseti, ki sestoji iz gpi-gena, ki ga kontrolira promotor P7.5 vakcinije (P7.5) in gena za humani faktor IX, ki ga kontrolira sintetični poksvirusni promotor (selP), leže bočno restrikcijska mesta Noti.
Sl. 11.2 kaže analizo s Southernovega prenosa himemih virusov, ki nosijo gen za humani faktor IX. List A) Totalne celične DNA, razgrajene s Sful, in hibridizirane s sondo gena za humani faktor IX (plazmid pBluescript-FIX). V vseh osmih izolatih (#1-6, 9 in 10) je imel vstavek a-orientacijo; m = marker; W-WT/WR = divjetipski virus vakcinije, sev WR. List B) Vnaprej napovedane genomske strukture himemih virusov.
Sl. 11.3 kaže analize Westemovega prenosa iz plazme izvedenega faktorja IX (pdFIX; progi 1 in 2) in rekombinantnega faktorja IX, ki ga izraža himerni virus vakcinije v celicah Vero. Supematante (10 μΐ) celičnih kultur smo testirali po 72-urni inkubaciji. #1-6, 9 in 10 = številke plaknih izolatov; pd FIX = iz plazme izvedeni faktor IX.
Sl. 12.1 ponazarja konstruiranje himernega virusa kurjih koz f-envIIIB z direktnim molekulskim kloniranjem HIVIIIB env-gena.
Sl. 12.2 A) kaže Southemove prenose Sjpl-fragmentov izolatov himernih virusov kurjih koz, ki kažejo orientacije vstavkov env-gena. Proge 1-12, virusni izolati f-LFa-1; progi 13 in 14, HP1,441 in f-TK2a (negativne kontrole); proga 15, produkti razgradnje (10 ng) plazmida pN2gpt-gpl60 z Sspl (pozitivna kontrola). List B) kaže restrikcijske mape Sspl-fragmentov vstavkov v obeh možnih orientacijah v himernem virusu kuijih koz. Številke kažejo velikost Sjpl-fragmentov v kilobaznih parih. Puščice kažejo orientacije vstavka, ki sovpadajo s smeijo prepisovanja prepisovalne enote gpl60.
Sl. 12.3 kaže izražanje glikoproteinov ovojnicč HIV v fibroblastih piščančjih zarodkov (Westemovi prenosi). Proge 1-8, virusni izolati f-LF2a-h; progi 9 in 15, gpl60 standard (dobavil A. Mitterer, Immuno Ag, Orth/Donau, Avstrija); proge 10-13, virusni izolati f-lF2i-l; proga 14, markerski proteini; progi 16 in 17, virusa kurjih koz HP1.441 in f-TK2a (negativne kontrole).
Sl. 12.4 kaže ugotavljanje prisotnosti HIV gp41, proizvedenega s himemimi virusi vakcinije v okuženih fibroblastih piščančjih zarodkov (Westemovi prenosi). Proge 1-8, virusni izolati f-LF2a-h; progi 9 in 15, gpl60 standard; proge 10-13, virusni izolati f-LF2i-l; proga 14, markerski proteini; progi 16 in 17, virusa kurjih koz HP1.441 in f-TK2a (negativne kontrole).
Podroben opis prednostnih izvedbenih oblik
Pričujoči izum predstavlja prvo konstruiranje modificiranega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, za kakršnega je primer poksvirus, popolnoma zunaj meja žive celice. To konstruiranje smo izvedli ob uporabi izolirane virusne genomske DNA, ki smo jo cepili s sekvenčnospecifično endonukleazo in nato ponovno ligirali s tujo DNA. Nastalo modificirano DNA smo nato zapakirali v kužne poksvirusne virione s transfekcijo v gostiteljsko celico, okuženo z drugim poksvirusom, ki je rabil kot pomožni virus.
Pričujoči izum omogoča drugačne strategije za razvoj vektoijev iz evkariotskih citoplazemskih DNA virusov, ki so jih pred tem uporabljali pri drugih DNA virusih za reševanje različnih problemov genetskega inženiringa. Ta način z direktnim kloniranjem nudi npr. možnost kloniranja genov direktno v citoplazemske DNA viruse, kot v poksviruse, ki jih ni mogoče klonirati v bakterijske sisteme, bodisi zato, ker so za bakterijske vektoije preveliki ali so za bakterije toksični ali so v bakterijah neobstojni. Direktno molekulsko kloniranje omogoča večjo natančnost v primerjavi s konstruiranjem narejenih (konstruiranih) virusnih genomov in lahko pod optimalnimi pogoji zviša hitrost kloniranja in tudi proizvede v eni sami ligacijski reakciji različne konstrukte, ki imajo mnogoterne vstavke v različnih orientacijah, kar omogoča hiter screening pri iskanju aranžmajev, ki omogočajo optimalno izražanje tujega gena.
Kot ga uporabljamo v pričujočem kontekstu, vključuje izraz evkariotski citoplazemski DNA virus iridoviruse in pokšviruse. Iridovirus vključuje katerikoli virus, ki je uvrščen kot član družine Iridoviridae, za katero je primer virus afriške svinjske mrzlice, kot tudi nekateri virusi amfibij in insektov. Poksvirus vključuje kateregakoli člana družine Pojcviridae, vključeno s poddružinami Chordopoxviridae (poksvirusi vretenčarjev) in Entomopojcviridae (poksvirusi insektov). Glej npr. B. Moss v B.N. FIELDS, D.M. KNIPE ET AL. VIROLOGY 2080 (Raven Press, 1990). Hordopoksvirusi vključujejo med drugim tele rodove,' katerih posebne primere obravnavamo tukaj, kot je naznačeno v oklepajih: Orthopoxvirus (vakcinija); Λνίροχvirus (kurje koze); Capripoxvirus (ovčje koze), Leporipoxvirus (kunčji (Shope) fibrom, miksom); in Suipoxvirus (svinjske koze). Entomopoksvirusi obsegajo tri rodove: A, B in C.
V skladu z enim vidikom pričujočega izuma dajemo na razpolago postopek za pripravo modificiranega evkariotskega citoplazemskega'DNA virusa z direktnim molekulskim kloniranjem modificiranega genoma citoplazemskega DNA virusa. Ta postopek obsega stopnjo, v kateri modificiramo pod ekstracelularnimi pogoji molekulo očiščene DNA, ki obsega prvi genom citoplazemskega DNA virusa, da nastane modificirana molekula DNA, ki obsega modificiran genom citoplazemskega DNA virusa.
Očiščeno molekulo DNA, primerno za modificiranje v skladu s pričujočim postopkom, pripravimo npr. z izolacijo genomske DNA iz delcev virusa v skladu s standardnimi metodami za izolacijo genomske DNA iz evkariotskih citoplazemskih DNA virusov. Glej npr. primer 1 spodaj. Alternativno lahko vso molekulo očiščene DNA ali njen del pripravimo z molekulskim kloniranjem ali kemijsko sintezo.
Modificiranje očiščene molekule DNA, ki obsega genom virusa v obsegu pričujočega izuma, vključuje izdelavo katerekoli dedne spremembe v sekvenci DNA tega genoma. Take spremembe vključujejo npr. vstavljanje sekvence DNA v ta genom, delecijo sekvence DNA iz tega genoma ali nadomestitev sekvence DNA v tem genomu z drugačno sekvenco DNA. Sekvenca DNA, ki jo vstavimo, v kateri izvedemo delecijo ali ki jo nadomestimo, obsega en sam bazni par DNA ali več kot en bazni par DNA.
V skladu s tem vidikom izuma izvedemo stopnjo modificiranja molekule DNA, ki obsega prvi genom DNA virusa po katerikoli tehniki, ki je primerna za ekstracelulamo modificiranje sekvence molekule DNA. Modificiranje molekule DNA v skladu s pričujočim izumom obsega npr. modificiranjfe očiščene molekule DNA s fizikalnim mutagenom, kot ultravijolično svetlobo, ali s kemijskim mutagenom. Na področju genetskega inženiringa so znane številne metode za ekstracelulamo mutagenezo molekul očiščene DNA.
V drugi izvedbeni obliki obsega stopnja modificiranja molekule DNA združevanje segmentov DNA, da nastane molekula modificirane DNA, ki obsega modificirani virusni genom. V skladu z enim vidikom te izvedbene oblike pripravimo nekatere ali vse segmente DNA, kijih združimo, da nastane molekula modificirane DNA tako, da razcepimo molekulo DNA, ki obsega genom prvega virusa, z nukleazo, prednostno s sekvenčno specifično endonukleazo. Alternativno lahko pripravimo nekatere ali vse segmente DNA, ki jih združimo, da nastane molekula modificirane DNA, s kemijsko sintezo ob uporabi znanih metod.
V nekaterih izvedbenih oblikah obsega stopnja združevanja segmentov DNA, da nastane molekula modificirane DNA, ekstracelulamo stopnjo ligacije teh segmentov DNA ob uporabi ligaze, kot bakterijske ali bakteriofagne ligaze, v skladu z znanimi metodami rekombinantne DNA. V danem primeru obsega ta stopnja modificiranja DNA tudi obdelavo koncev segmentov DNA, odcepljenih iz molekule DNA, ki obsegajo genom prvega virusa, s fosfatazo, npr. telečjo črevesno fosfatazo. Ta encim odstrani fosfatne dele in s tem prepreči ponovno ligiranje enega segmenta DNA, nastalega s cepitvijo molekule DNA, z drugim takim segmentom.
V alternativnem načinu dela za združevanje segmentov DNA združimo nekatere ali vse segmente DNA z ekstracelulamo spojitvijo kohezivnih koncev, ki so dovolj dolgi, da omogočijo transfekcijo molekule modificirane DNA v gostiteljsko celico, kjer pride do ligiranja spojenih segmentov DNA.
V drugi izvedbeni obliki tega postopka vključuje stopnja modificiranja molekule DNA, ki obsega genom prvega virusa, stopnjo združevanja vsaj nekaterih segmentov DNA, nastalih pri cepitvi molekule genomske DNA prvega virusa, z dodatnim segmentom DNA, da nastane molekula modificirane DNA. V prednostni izvedbeni obliki tega vidika izuma obsega ta stopnja cepitev molekule genomske virusne DNA s sekvenčno specifično endonukleazo na edinem cepitvenem mestu v genomu prvega virusa, s čimer nastaneta dva kraka genomske virusne DNA. Oba kraka nato ligiramo s tujo DNA, ki obsega sekvenco, kije zanimiva.
Sekvenca DNA, ki je zanimiva, kot jo uporabljamo tukaj, da opišemo sekvenco segmenta tuje DNA, ki jo ligiramo s krakoma virusne DNA, obsega najprej sekvenco DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Alternativno obsega sekvenca DNA, ki je zanimiva, sekvenco, ki se pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, kot tudi sekvenco, ki se v takem genomu ne pojavlja naravno. Nadalje lahko obsega sekvenca, ki je zanimiva, samo sekvence, ki se pojavljajo naravno v evkariotskem citoplazemskem DNA virusu, kjer je taka sekvenca vstavljena v genomu tega citoplazemskega DNA virusa na mestu, ki je različno od mesta, kjer se ta sekvenca pojavlja naravno. Še več, vstavitev virusne sekvence, ki je zanimiva in ki se pojavlja v naravi, iz enega DNA virusa v drugega ali iz enega dela enega samega virusnega genoma v drug del tega genoma, bo nujno ustvarilo sekvenco, ki se ne pojavlja naravno v genomu citoplazemskega DNA virusa, v skladu s pričujočim izumom na spoju virusnega genoma in vstavljene virusne sekvence, kije zanimiva.
Segment tuje DNA, ki je ligiran z dvema krakoma genomske virusne DNA, obsega konce, ki so kompatibilni za ligacijo s konci krakov virusne DNA. Kompatibilni konci so lahko komplementarno kohezivni konci ali topi konci. Stopnja ligacije v tem posebnem postopku da molekulo modificirane DNA, ki vsebuje genom prvega virusa s sekvenco DNA tuje DNA, vstavljeno v genom prvega virusa na edinem cepitvenem mestu.
Ta izvedbena oblika postopka, v kateri sekvenco DNA vstavimo v genom prvega virusa, je tukaj za primer prikazana med drugim s postopkom za vstavljanje kasete za izražanje genov v genom virusa vakcinije na edinem cepitvenem mestu za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti ali Smal, kot je opisano v primerih 1 oz. 3. Primer za to izvedbeno obliko je tudi vstavljanje genske kasete v genom vektorja rekombinantnega virusa kurjih koz na edinem mestu Noti v sekvenci bakterijskega gena v genomu rekombinantnega virusa kurjih koz, kot je opisano v primeru 2.
Vstavljanje tuje DNA v edino mesto v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa v skladu s pričujočim izumom je uporabno za namene izražanja želenega proteina, zlasti humanega proteina. Primer 5 opisuje npr. vstavljanje genov za plazminogen, protrombin in glikoprotein 160 virusa humane imunske pomanjkljivosti (HIV gpl60) v edino cepitveno mesto vektorja virusa vakcinije in uporabo nastalih modificiranih virusov vakcinije za proizvodnjo teh proteinov. Tuje proteine lahko za pripravo očiščenih proteinov proizvedemo v celičnih kulturah ali za imuniziranje gostitelja s cepivom, ki obsega modificiran virus v skladu s pričujočim izumom, direktno v človeških ali živalskih gostiteljih.
V določenih izvedbenih oblikah obsega stopnja modificiranja genoma virusa z vstavljanjem sekvence DNA uvedbo ali odstranitev funkcije markerskega gena za razlikovanje med genomom modificiranega virusa in genomom prvega virusa. V eni taki izvedbeni obliki obsega sekvenca DNA, vstavljena v genom prvega virusa, selektiven markerski gen, in stopnja pridobivanja kužnih virionov modificiranega poksvirusa, ki jih je proizvedla prva gostiteljska celica, obsega stopnjo okuženja druge gostiteljske celice s temi kužnimi virioni pri pogojih, pri katerih se vrši izbiranje genoma poksvirusa, ki izraža selektivni markerski gen. V prednostni izvedbeni obliki tega vidika izuma podeli izražanje selektivnega markerskega gena v drugi gostiteljski celici tej drugi gostiteljski celici odpornost proti citotoksičnemu zdravilu. To zdravilo je prisotno med okuženjem druge gostiteljske celice v množini, zadostni za izbiranje genoma poksvirusa, ki izraža selektivni markerski gen. V tem primeru izbira zdravilo genom modificiranega virusa, ki ima vstavljen selektivni markerski gen in ki izbira proti kateremukoli genomu, ki tega markerskega gena nima.
Vstavljanje sekvence DNA, ki obsega selektivni markerski gen za razlikovanje med genomom modificiranega virusa in genomom prvega virusa, je posebno uporabno, če smo molekulo genomske DNA prvega virusa cepili na edinem cepitvenem mestu in bo verjetno prišlo do ponovnega ligiranja nastalih krakov virusne DNA brez vstavitve želene sekvence DNA. Primer za ta način dela je postopek za vstavljanje gena za encim ksantin-gvanin-fosforibozil-transferazo Escherichije coli (v nadaljevanju gpi-gen) v, med drugim, genom virusa vakcinije ali genom virusa kurjih koz na edinem mestu Noti, kot je opisano v primerih 1 oz. 2.
Postopek za odstranitev funkcije markerskega gena iz genoma prvega virusa za razlikovanje med modificiranim virusnim genomom in prvim genomom je s primerom prikazan v primeru 2. Ta postopek se nanaša na vstavljanje sekvence tuje DNA v genom virusa kurjih koz v mesto Noti, ki se nahaja v E. coli lacZ-genu, ki kodira za /3-galaktozidazo. Kot je opisano v primeru 2 (avipoks), pretrga vstavitev sekvence DNA v to mesto sekvenco, ki kodira za lacZ in s tem prepreči proizvajanje /3-galaktozidaze. Izražanje tega encima proizvede za virus, ki nosi /ucZ-gen, fenotip modrega plaka. V skladu s tem kaže modificirani virusni genom, ki nosi vstavek sekvence DNA na tem mestu, fenotip belega plaka, s katerim se modificirani virus razlikuje od prvega virusa. V drugih izvedbenih oblikah postopkov v smislu tega izuma prenesemo delujoči E. coli lacZ-gen v vektor z drugim genom, ki je zanimiv, da rabi kot marker za modificirane viruse, ki vsebujejo želeni vstavek.
V še drugih izvedbenih oblikah postopka v smislu izuma obsega stopnja modificiranja molekule DNA uvedbo novega cepitvenega mesta za sekvenčno specifično endonukleazo v genom prvega virusa. En primer te izvedbene oblike obsega vstavljanje tuje DNA, ki obsega sintetičen DNA-linker, v obstoječe edino mesto v genomu prvega poksvirusa, kot je opisano v primeru 6. Ta linker obsega mnogotemo mesto za kloniranje, ki sestoji iz več tesno skupaj ležečih cepitvenih mest, ki so koristna za vstavljanje tuje DNA v genom modificiranega poksvirusa. S pridom cepitvena mesta v mnogoternem mestu za kloniranje niso prisotna v prvem virusnem genomu in so zato v modificiranem virusnem genomu edina.
Še posebno vključuje stopnja modificiranja molekule DNA, ki obsega prvi virusni genom, tudi vstavljanje sekvence DNA med prvim in drugim cepitvenim mestom za sekvenčno specifično endonukleazo. V eni taki izvedbeni obliki obsega prvi virusni genom mnogotemo mesto za kloniranje, ki sestoji iz cepitvenih mest, ki so edina v prvem virusnem genomu. V skladu s to metodo daje cepitev molekule DNA, ki obsega prvi virusni genom na dveh takih edinih mestih v mnogoternem mestu za kloniranje, dva kraka virusne DNA, ki imata kohezivne konce, ki niso kompatibilni za medsebojno ligiranje. Segment DNA, kije med obema edinima cepitvenima mestoma v mnogoternem mestu za kloniranje, odstranimo iz krakov razcepljene virusne DNA, npr. z obarjanjem teh krakov z etanolom, kot je opisano za vstavljanje gena humanega protrombina v modificiran vektor poksvirusa v primeru 5.
Vstavljanje segmenta DNA v virusni genom med obema edinima cepitvenima mestoma je uporabno za prisilno kloniranje vstavkov DNA, ki imajo kohezivne konce, ki so kompatibilni za ligacijo z vsakim od krakov vektorja. Z drugimi besedami, ta metoda, ki obsega cepitev virusne DNA na dveh mestih, je koristna za povečanje dobitka virusnih genomov, ki je posledica ligiranja krakov virusne DNA, v primerjavi s kraki, pripravljenimi s cepitvijo virusne DNA na enem samem mestu, ker kraki iz te metode nimajo koncev, ki bi bili kompatibilni za ligacijo. Ta metoda prisilnega kloniranja tudi usmerja orientacijo DNA, vstavljene v modificirani virusni genom, ker je samo en krak virusne DNA kompatibilen za ligacijo z vsakim koncem vstavljene DNA.
Postopek prisilnega kloniranja v smislu izuma je prikazan npr. z vstavljanjem kasete za izražanje genov, ki obsega gen humanega' protrombina, v mnogo temo mesto za kloniranje vektorja virusa vakcinije, kot je opisano v primeru 5.
V prednostni izvedbeni obliki segment DNA, ki je med dvema edinima cepitvenima mestoma v prvem virusnem genomu, ni bistven za podvajanje prvega virusnega genoma, in zato niti delecija te sekvence niti njena nadomestitev z drugim segmentom DNA ne preprečuje podvajanja nastalega modificiranega genoma. Alternativno nadomestimo vmesni segment DNA s segmentom DNA, ki obsega tisti del vmesne sekvence, ki je bistven za virusno podvajanje, ki je povezan z dodatno sekvenco DNA, ki jo je treba vstaviti v prvi virusni genom.
V drugem vidiku pričujočega postopka obsega stopnja modificiranja prvega virusnega genoma odstranitev nezaželenega cepitvenega mesta za sekvenčno specifično endonukleazo. Tovrstne modifikacije lahko izvedemo, če je potrebno, znova in znova, npr. zato, da odstranimo odvečna cepitvena mesta za isto nukleazo, in s tem končno proizvedemo modificiran virusni genom, ki ima edino cepitveno mesto za določeno nukleazo.
Metode, ki so posebno primerne za odstranitev cepitvenega mesta iz virusnega genoma, so v stroki znane. Vključujejo različne splošne metode za mestno specifične mutageneze. Ena posebna metoda za odstranitev cepitvenega mesta za endonukleazo z virusnega genoma obsega ekstracelulamo obdelavo genomske virusne DNA, da izberemo molekule mutantne genomske DNA, ki so odporne proti cepitvi z relevantno endonukleazo.
Drug postopek za odstranitev cepitvenega mesta z virusnega genoma je ligiranje cepljene molekule virusne DNA s segmentom DNA, npr. sintetičnim segmentom DNA, ki obsega en konec, ki je kompatibilen za ligacijo s cepljeno virusno DNA, vendar nima dela razpoznavne sekvence za nukleazo, ki je cepila virusno DNA. V tej metodi obsega cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki cepi virusno DNA, razpoznavno sekvenco za nukleazo, ki se razteza onkraj sekvenc, ki jih obsegajo kohezivni konci, v sekvence, ki leže neposredno ob kohezivnih koncih. Sintetični vstavek obsega kohezivne konce, ki so kompatibilni za ligiranje s kraki virusne DNA, cepljene na enem samem mestu. Vendar pa se sekvenca, ki leži neposredno ob enem kohezivnem koncu sintetičnega vstavka, razlikuje od razpoznavne sekvence, ki je potrebna za cepitev z encimom, ki je cepil virusno DNA. Zato ligiranje tega konca sintetičnega segmenta DNA z virusnim krakom ne obnovi funkcionalnega cepitvenega mesta za nukleažo, kije cepila virusno DNA. Ta metoda za odstranjevanje cepitvenega mesta z virusnega genoma je prikazana v primeru 4 na primeru vstavljanja sintetičnega segmenta DNA, ki obsega mnogo terno mesto za kloniranje, v edino cepitveno mesto virusnega genoma.
Da preprečimo inaktiviranje virusnega genoma kot posledico modificiranja, je očitno, da je treba izvesti modificiranje virusnega genoma v skladu s pričujočim postopkom v področju virusnega genoma, ki ni bistveno za razmnoževanje virusa v celični kulturi pod pogoji, uporabljenimi za razmnoževanje nastalega modificiranega virusa. Genomska področja virusa DNA, ki obsegajo sekvence, ki so nebistvene za razmnoževanje v celični kulturi in sicer primerne za modifikacijo v skladu s pričujočimi metodami, vključujejo sekvence med geni (t.j. intergenska področja) in sekvence genov, ki niso potrebni za razmnoževanje modificiranega virusnega genoma.
Nebistveno mesto, primerno za modificiranje izbranega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa v skladu s pričujočim izumom, lahko indentificiramo tako, da izvedemo želeno modifikacijo in določimo, ali taka modifikacija pod želenimi pogoji okužbe moti podvajanje tega genoma. Natančneje, cepitvena mesta za restrikcijske encime v virusnem genomu, vključno edina mesta v tem genomu, identificiramo npr. z razgradnjo genomske DNA in analizo nastalih fragmentov, pri čemer uporabljamo postopke, ki so v stroki znani. Genom lahko pretrgamo s poskusno vstavitvijo kratkega sintetičnega segmenta DNA v izbrano tarčno cepitveno mesto s postopkom direktnega kloniranja v smislu pričujočega izuma. Če dobimo pri tem virus, ki obsega poskusni vstavek na izbranem tarčnem mestu, je to neposredna indikacija, da se nahaja tarčno mesto v nebistvenem področju tega genoma. Če na določenem genomskem tarčnem mestu ni uporabnega cepitvenega mesta, lahko alternativno tako mesto uvedemo ob uporabi bodisi direktnega molekulskega kloniranja ali konvencionalnega konstruiranja genoma na osnovi tehnik reševanja markeija. Če nam v tem primeru uspe dobiti virus, ki obsega vstavljeno cepitveno mesto na tarčnem mestu, to direktno kaže, da se nahaja tarčno mesto v nebistvenem področju, primernem za modifikacijo v skladu s pričujočim izumom.
Določena nebistvena genomska področja, primerna za izvajanje pričujočega izuma s poksvirusi, so bila že opisana. Glej npr. Goebel et al., Virology 179: 247-266 (1990), Tabela 1, katerega opis je s tem vključen tu kot referenca.
V nadaljnjih izvedbenih oblikah postopka je Vsaj del sekvence DNA, kije vstavljena v prvi virusni genom, pod prepisovalno kontrolo promotoija. V določenih izvedbenih oblikah se nahaja ta promotor v sekvenci DNA, ki je vstavljena v prvi virusni genom, in zato kontrolira prepisovanje tistega dela vstavljene sekvence DNA, kije navzdolno od promotoija. Primer za ta način dela je vstavljanje genske kasete, ki obsega promotor, ki je funkcionalno povezan z odprtim bralnim okviijem, v poksvirusni genom, kot je opisano v primerih 1 do 5.
V drugi prednostni izvedbeni obliki se nahaja promotor, ki kontrolira prepisovanje sekvence DNA, ki je vstavljena v prvi virusni genom, v modificiranem virusnem genomu navzgomo od vstavljene sekvence DNA. Ta način dela ponazarja vstavljanje cDNA, ki kodira protein humanega von Willebrandovega faktorja, v mnogoterno mesto za kloniranje, ki je funkcionalno povezano z navzgomjim promotorjem vektorja virusa vakcinije, kot je opisano v primeru 6.
V določenih izvedbenih oblikah prepozna RNA polimeraza, ki je kodirana z modificiranim virusnim genomom, promotor, ki kontrolira vstavljeno sekvenco DNA. Alternativno lahko prepozna ta promotor samo RNA polimeraza, ki jo kodira drug genom, npr. drug virusni ali celularni genom. Ta RNA polimeraza je lahko npr. polimeraza bakteriofaga T7, ki jo kodira drug genom citoplazemskega DNA virusa ali genom modificirane gostiteljske celice. T7 polimerazo in promotor so uporabili npr. v rekombinantnih poksvirusih, da bi izboljšali izražanje vstavljene sekvence DNA. Glej npr. Fuerst, T. R. et al., J. Mol. Biol. 205: 333-348 (1989). Zagotovitev T7 RNA polimeraze na ločenem genomu uporabljamo, da preprečimo izražanje sekvence DNA, vstavljene v modificirani genom poksvirusa, razen kadar je prisoten ločeni genom.
V še drugih izvedbenih oblikah je promotor, ki kontrolira vstavek, primeren za začetek prepisovanja z RNA polimerazo iz citoplazemskega DNA virusa. V nekaterih izvedbenih oblikah obsega promotor modifikacijo sekvence DNA virusnega promotoija, ki se nahaja v naravi. Eno tako izvedbeno obliko kaže primer uporabe sintetičnega promotorja virusa vakcinije, kot S3A in S4 promotoija, ki sta med drugim opisana v primerih 5 in 6.
Postopek za konstruiranje genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa v smislu pričujočega izuma obsega nadalje stopnjo uvedbe modificirane molekule
DNA, ki obsega modificirani virusni genom, v prvo gostitelj sko celico, ki zapakira modificirano molekulo DNA v kužne virione' modificiranega citoplazemskega DNA virusa. Modificirano molekulo DNA uvedemo v prvo gostiteljsko celico z metodo, ki je primerna za transfekcijo te prve gostiteljske celice z molekulo DNA, npr. po metodah, ki so v stroki znane za transfekcijo drugih DNA v primerljive gostiteljske celice. V prednostni izvedbeni obliki uvedemo npr. modificirano DNA v prvo gostiteljsko celico ob uporabi tehnike obarjanja s kalcijevim fosfatom po Grahamu in van der Ebu, Virology 52: 456-467 (1973).
V prednostni izvedbeni obliki obsega ta postopek za proizvodnjo modificiranega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa nadalje stopnjo okuženja prve gostiteljske celice z drugim citoplazemskim DNA virusom, ki vsebuje genom drugega citoplazemskega DNA virusa, ki se izraža zato, da zapakira modificirano molekulo DNA v kužne virione modificiranega citoplazemskega DNA virusa. V postopku, ki obsega okuženje prve gostiteljske celice z drugim virusom, izvedemo uvedbo molekule rekombinantne DNA v prvo gostiteljsko celico s pridom 1 uro po okuženju prve gostiteljske celice z drugim virusom.
V drugi izvedbeni obliki tega postopka dobavlja potrebne funkcije pakiranja v prvi gostiteljski celici genetski element, ki ni popolni genom drugega virusa, kot plazmid ali drug vektor za izražanje, primeren za transformacijo prve gostiteljske celice in izražanje potrebnih funkcij pomožnega virusa. Uporaba nevirusnega genetskega elementa za zagotovitev funkcij pomočnika omogoča proizvodnjo genetsko stabilnih pomožnih celic, ki ne proizvajajo kužnega pomožnega virusa. Uporaba take pomožne celice kot prve gostiteljske celice za zapakiranje modificirane molekule DNA daje s pridom samo virione, ki vsebujejo to modificirano DNA.
V postopku, ki obsega okuženje prve gostiteljske celice z drugim virusom, izberemo drugi virus tako, da izražanje drugega virusnega genoma v prvi gostiteljski celici zapakira molekulo modificirane DNA v kužne virione, ki obsegajo modificirani virusni genom. V skladu s pričujočim izumom je možno izvesti intracelulamo zapakiranje modificirane DNA, ki obsega genom evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, s transfekcijo v celice, okužene z zelo sorodnim virusom. Npr., DNA rodu prvega poksvirusa zapakiramo z gostiteljsko celico, okuženo z drugim poksvirusom iz poddružine istega poksvirusa, bodisi iz istega ali drugačnega rodu.
V določenih izvedbenih oblikah povzroči izražanje drugega virusnega genoma v prvi gostiteljski celici nastanek kužnih virionov, ki obsegajo drugi virusni genom kot tudi modificirani virusni genom. Do te situacije pride npr. v primeru homolognega zapakiranja DNA prvega poksvirusa iz enega rodu z drugim poksvirusom istega rodu. Čeprav bi tukaj transfektirano DNA teoretsko lahko zapakirali direktno, t.j. brez prepisovanja transfektiranega genoma, vključuje homologno zapakiranje transfektirane molekule DNA verjetno prepisovanje in podvajanje tako transfektirane DNA kot tudi DNA pomožnega virusa. To situacijo ponazarja med drugim homologno zapakiranje DNA poksvirusa v primerih 1 in 2.
Vendar pa v drugih izvedbenih oblikah izražanje drugega virusnega genoma v prvi gostiteljski celici ne povzroči nastanka kužnih virionov, ki obsegajo drugi virusni genom. V primerih, ki vključujejo npr. heterologno zapakiranje, pasivno zapakiranje samo ne more povzročiti nastanka življenja sposobnih delcev virusa iz transfektirane DNA. V takem primeru je ugodno izbrati drugi (pomožni) virus, ki da na razpolago RNA polimerazo, ki prepozna transfektirano DNA kot osnovo (podlogo) in s tem služi za to, da se začne prepisovanje in končno podvajanje transfektirane DNA. Ta primer je ponazorjen z reaktivacijo modificiranega genoma vektorja ortopoksvirusa (vakcinije) s pomožnim avipoksvirusom (virusom kurjih koz) v sesalski prvi gostiteljski celici, v kateri avipoksvirus ni sposoben povzročiti nastanka kužnih virionov, ki obsegajo genom avipoksvirusa, kot je opisano v primeru 3.
Uporaba heterolognega virusa za zapakiranje molekule modificirane DNA, kot je uporaba virusa kurjih koz ali virusa ektromelia (mišje koze) kot pomožnega virusa za konstrukte virusa vakcinije,ugodno minimizira dogodke rekombinacije med genomom pomožnega virusa in transfektiranim genomom, do katerih pride, če so v eni celici prisotne homologne sekvence zelo sorodnih virusov. Glej Fenner & Comben (1958); Fenner (1959).
V določenih izvedbenih oblikah postopka za uporabo pomožnega virusa za zapakiranje DNA obsega stopnja dobivanja kužnih virionov, ki obsegajo modificirani virusni genom, stopnjo okuženja druge gostiteljske celice s kužnimi virioni, ki jih je proizvedla prva gostiteljska celica. S pridom okužimo drugo gostiteljsko celico pod takimi pogoji, da izražanje drugega virusnega genoma v drugi gostiteljski celici ne povzroči nastanka kužnih virionov, ki obsegajo genom drugega virusa. Z drugimi besedami, drugo gostiteljsko celico okužimo pod takimi pogoji, ki izbirajo za podvajanje modificiranega virusa in proti pomožnemu virusu. To metodo ponazarja metoda, v kateri je modificirani genom modificiran genom virusa vakcinije, drugi genom je genom virusa kuijih koz in druga gostiteljska celica je sesalska celica. V tej metodi očistimo modificirani virus s plaki v kulturah sesalskih gostiteljskih celic, v katerih virus kurjih koz ne povzroči nastanka kužnih virionov, kot je opisano v primeru 3.
V drugi izvedbeni obliki, v kateri okužimo drugo gostiteljsko celico pod pogoji, ki izbirajo za modificirani virus, obsega modificirani virusni genom gen funkcionalnega kroga gostiteljev, ki je potreben, da nastanejo v drugi gostiteljski celici kužni virioni. Drugi virusni genom nima tega gena funkcionalnega kroga gostiteljev. To izvedbeno obliko ponazarja metoda, v kateri je modificirani virusni genom genom modificiranega virusa vakcinije, ki obsega gen funkcionalnega kroga gostiteljev, ki je potreben, da nastane kužen virus vakcinije v človeški (MRC 5) celici, ki jo uporabimo kot drugo gostiteljsko celico, kot je opisano v primeru 8.
V še drugi izvedbeni obliki, ki obsega izbiranje modificiranega virusa v drugi gostiteljski celici, obsega modificirani virusni genom selektiven markerski gen, ki ga drugi virusni genom nima, in stopnjo okuženja druge gostiteljske celice izvedemo pod takimi pogoji, ki izbirajo virusni genom, ki izraža selektivni markerski gen. Npr., izražanje selektivnega markerskega gena v drugi gostiteljski celici lahko podeli tej celici odpornost proti citotoksičnemu zdravilu. Zdravilo je med okuženjem druge gostiteljske celice na razpolago v množini, ki je zadostna, da izbira virusni genom, ki izraža selektivni markerski gen. Ta način dela ponazarja metoda za vstavljanje gena za E. coli gpt-gen v genom virusa vakcinije, kot v primeru 1, ali v genom virusa kurjih koz, kot v primeru 2, pri čemer uporabimo v obeh primerih homologen pomožni virus, ki nima selektivnega markerskega gena.
V še drugi izvedbeni obliki, ki obsega izbiranje modificiranega virusa v drugi gostiteljski celici, obsega modificirani virusni genom delecijo selektivnega markerskega gena, ki je prisoten v drugem virusnem genomu. Tu izvedemo stopnjo okuženja druge gostiteljske celice pod pogoji, ki izbirajo proti virusnemu genomu, ki izraža ta selektivni markerski gen. Npr., izražanje gena poksvirusne timidin kinaze (tk) v drugi gostiteljski celici (t.j. gostiteljski celici, ki je brez gena timidin kinaze), napravi drugi (pomožni) virus občutljiv za metabolični inhibitor 5-bromo-deoksiuridin. Primer 4 opisuje uporabo teh inhibitoijev med okuženjem druge gostiteljske celice, da pride do izbire vektorja virusa vakcinije (vdTK), v katerem je tk-gen odstranjen z delecijo in nadomeščen z mnogotemim mestom za kloniranje.
Drug vidik pričujočega izuma se nanaša na evkariotski citoplazemski DNA virus, ki obsega modificiran virusni genom. Modificiran virusni genom citoplazemskega DNA virusa v obsegu pričujočega izuma obsega določene komponente sekvenc DNA, ki se jih da razlikovati med seboj, npr. z rutinskimi metodami hibridizacije nukleinske kisline ali metodami določanja sekvenc DNA.
V določenih izvedbenih oblikah obsega npr. modificirani virusni genom prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Ta prvi genom obsega cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino' mesto v prvem genomu. V tej izvedbeni obliki so sekvence modificiranega genoma, ki obsega prvi virusni genom, homologne genomu naravnega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Nadalje so sekvence tega prvega virusa prekinjene s sekvenco DNA, ki je zanimiva, kot je definirano zgoraj.
Da bi določili, ali je ta sekvenca vstavljena v edino cepitveno mesto v prvem virusnem genomu, kot je potrebno za to izvedbeno obliko modificiranega virusnega genoma, primerjamo sekvence, ki leže neposredno bočno ob vstavku, s sekvencami cepitvenih mest za sekvenčno specifične endonukleaze.
V eni obliki te izvedbene oblike, v kateri je sekvenca DNA vstavljena v edino cepitveno mesto v prvem virusnem genomu, ležita bočno ob vstavljeni sekvenci v prvem virusnem genomu dve identični intaktni cepitveni mesti za sekvenčno specifično endonukleazo in ti dve mesti sta edini mesti za to nukleazo v celotnem modificiranem genomu. Vsako od teh dveh mest obsega kombinirane dele cepljenih mest iz prvega virusnega genoma in vstavljeno sekvenco DNA.
Podrobneje, za vsako verigo dvoverižne DNA, ki obsega cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, lahko smatramo, da obsega popolno sekvenco cepitvenega mesta (SL in SR), ki sestoji iz leve sekvence cepitvenega mesta (SL) in desne sekvence cepitvenega mesta (SR), kiju ločuje monofosfatni spoj, ki ga prekine cepitev z ustrezno nukleazo. V določenih oblikah te izvedbene oblike nastaneta z vstavitvijo sekvence DNA v edino restrikcijsko mesto ponovno dve popolni mesti, ki ležita bočno ob vstavku.
V drugih oblikah te izvedbene oblike pa vstavitev sekvence DNA v edino cepitveno mesto ne ustvari ponovno prvotnega cepitvenega mesta na vsakem koncu vstavljene sekvence DNA. Glej npr. metodo za odstranitev cepitvenega mesta, opisano v primeru 6. Tako lahko leži bočno ob enem koncu vstavljene DNA (npr. levem koncu) popolno cepitveno mesto (SL in SR), medtem ko se desni konec konča s sekvenco, ki se razlikuje od SL, direktno vezdne na sekvenco SR v prvem virusnem genomu. Na splošno bosta v kateremkoli modificiranem virusnem genomu v smislu izuma ob sekvenci DNA, vstavljeni v edino mesto v prvem virusnem genomu, ležala bočno dva ujemajoča se dela (SL in SR) cepljenega mesta, ki se ne pojavljata v modificiranem virusnem genomu zunaj vstavljene DNA.
V drugih izvedbenih oblikah obsega modificirani virusni genom sekvenco DNA, ki je vstavljena med dvema edinima mestoma v prvem virusnem genomu. Če je prvi virusni genom naravni genom evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, bo v tem primeru vstavek obdan z virusnimi sekvencami, ki so ločene od sekvence tuje DNA vsaj s prepoznavnimi deli SL in SR dveh različnih prvotnih cepitvenih mest.
V dodatnih izvedbenih oblikah obsega modificirani virusni genom edino cepitveno mesto, ki se nahaja v sekvenci DNA, ki se ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. V tem primeru te tuje DNA ne ločujejo od sekvenc naravne virusne DNA prepoznavni deli SL in SR cepitvenih mest. V določenih oblikah te izvedbene oblike je prva sekvenca tuje DNA prekinjena z drugo sekvenco tuje DNA, vstavljeno v edino cepitveno mesto v prvi sekvenci ali med dvema takima mestoma v prvi sekvenci. V teh izvedbenih oblikah je druga tuja DNA ločena od prvih sekvenc tuje DNA s prepoznavnimi deli SL in SR cepitvenih mest za sekvenčno specifično endonukleazo. V tem primeru obsegajo vse sekvence, ki obdajajo to drugo sekvenco tuje DNA, genom prvega virusa v skladu s tem izumom.
Prednostne izvedbene oblike modificiranih evkariotskih citoplazemskih DNA virusov v smislu izuma vključujejo prvo važnejšo izvedbeno obliko, v kateri obsega modificirani virusni genom (I) prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, ki obsega cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo. To mesto je edino mesto v prvem virusnem genomu. Modificirani virusni genom te izvedbene oblike obsega tudi (II) prvo sekvenco DNA, ki je zanimiva. Ta sekvenca DNA je vstavljena v edino mesto v genomu prvega citoplazemskega DNA virusa.
V eni varianti te prve izvedbene oblike modificiranega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa je prvi virusni genom, ki obsega edino mesto, naravni virusni genom. To varianto ponazarja tu modificiran poksvirusni genom, ki obsega genom naravnega virusa vakcinije, ki ima edina cepitvena mesta za bakterijski restrikcijski endonukleazi Noti in Smol, kot je opisano v primerih 1 in 3. V tej izved34 beni obliki je primer za prvo sekvenco DNA, ki je zanimiva, ki je vstavljena v edino mesto, E. coli gpt-gen, ki ga kontrolira promotor naravnega virusa vakcinije, vstavljen v mesto Noti (primer 1) ali v mesto Smal (primer 3) genoma virusa vakcinije.
V drugi obliki te prve izvedbene oblike modificiranega virusa obsega prvi virusni genom, ki obsega edino mesto, tudi drugo sekvenco DNA, ki se ne pojavlja naravno v virusnem genomu. Nadalje vsebuje ta druga sekvenca DNA edino mesto za vstavljanje prve sekvence DNA. To varianto ponazaija tukaj modificiran genom virusa kurjih koz, ki obsega sekvenco DNA, ki kodira gen za /3-galaktozidazo Escherichije coli, kot je opisano v primeru 2. Ta bakterijski gen vključuje cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti, ki je edino v modificiranem genomu virusa kuijih koz in je zato posebno primerno za vstavljanje sekvenc tuje DNA.
V drugi varianti te prve izvedbene oblike modificiranega virusa je vsaj del prve sekvence DNA, ki je vstavljena v edino mesto, pod prepisovalno kontrolo promotorja. V nekaterih primerih se nahaja promotor v prvi sekvenci DNA, ki je vstavljena v prvi virusni genom. To velja npr. takrat, če obsega vstavljena DNA gensko kaseto, ki vključuje promotor in funkcionalno vezan gen, kot je med drugim opisano v primerih 1 in 2.
V drugi izvedbeni obliki modificiranega citoplazemskega DNA virusa v smislu izuma obsega modificirani virusni genom (I) prvi virusni genom, ki obsega prvo in drugo cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, kjer je vsako od teh mest edino v genomu prvega virusa. V prednostni varianti te izvedbene oblike obsega prvi virusni genom mnogotemo mesto za kloniranje, ki obsega več edinih cepitvenih mest.
V tej drugi izvedbeni obliki obsega modificirani virusni genom tudi (II) prvo sekvenco DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, in ta prva sekvenca DNA je vstavljena v prvi virusni genom med prvim in drugim edinim cepitvenim mestom.
V tretji izvedbeni obliki modificiranega citoplazemskega DNA virusa v smislu izuma obsega modificirani virusni genom (I) prvi virusni genom, ki obsega prvo sekvenco DNA, ki se ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Ta prva sekvenca DNA obsega cepitveno mesto za sekvenčno specifično en35 donukleazo, ki je edino mesto v modificiranem virusnem genomu. Modificirani virusni genom te izvedbene oblike obsega fiadalje (II) promotor, ki je na takem mestu, da je v edino mesto vstavljena sekvenca DNA pod prepisovalno kontrolo promotoija. Ta prva sekvenca DNA nima prevajanega startnega kodona med promotoijem in edinim mestom, ki se uporablja za vstavitev sekvence DNA. Primer za to izvedbeno obliko je vektor virusa vakcinije (vS4), opisan v primeru 6, ki ima sintetičen poksvirusni promotor, kije na takem mestu, da ta promotor kontrolira prepisovanje sekvence DNA, vstavljene v mnogoterno mesto za kloniranje, ki je zasnovano za vstavitev odprtih bralnih okvirov.
Drugi vidik pričujočega izuma se nanaša na molekulo DNA, ki obsega modificiran virusni genom modificiranega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa v smislu izuma. V prednostni izvedbeni obliki pripravimo to molekulo DNA z ekstrakcijo genomskih molekul DNA iz virionov modificiranega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa v smislu izuma ali iz cehe, okuženih z modificiranim virusom v smislu izuma. Metode, ki so primerne za ekstrahiranje modificiranih virusnih genomskih DNA iz virionov, so v stroki znane. Poleg tega so opisane tu v primeru 1 primerne metode za pripravo DNA evkariotskih citoplazemskih DNA virusov.
Še drug vidik pričujočega izuma se nanaša na krake genomske DNA evkariotskega citoplazemskega DNA virusa v smislu izuma. Ti kraki genomske DNA so uporabni za direktno molekulsko kloniranje virusnih genomov, ki obsegajo tuje DNA. Podrobno se ta vidik izuma nanaša na dve molekuli DNA, levi in desni genomski trak modificiranega virusnega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Pri izvajanju zgoraj opisanega postopka za direktno kloniranje v smislu izuma lahko sestoji en krak ali oba kraka v celoti iz sekvence DNA, ki se pojavlja naravno v citoplazemskem DNA virusu. Toda nova molekula DNA v smislu tega vidika tega izuma je modificiran krak virusnega genoma, z drugimi besedami, molekula DNA, ki obsega en konec modificiranega virusnega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Ta konec modificiranega virusnega genoma obsega sekvenco DNA, ki je zanimiva, po kateri se ta molekula DNA razlikuje od genomskih krakov, ki obstoje samo iz sekvence, ki se naravno pojavlja v virusu citoplazemske DNA. Poleg tega obsega modificirani virusni genom, iz katerega izvira novi krak, edino cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo. Nadalje ima ta molekula DNA končni del, ki je homologen s produktom cepitve edinega mesta v modificiranem virusnem genomu s to sekvenčno specifično endonukleazo.
V prednostni izvedbeni obliki pripravimo to molekulo DNA, ki obsega genomski krak, s cepitvijo genomske DNA modifičiranega virusa na edinem mestu za sekvenčno specifično endonukleazo. Alternativno lahko to molekulo DNA pripravimo z modificiranjem druge molekule DNA, da nastane končni del, ki je homologen končnemu delu, ki nastane s cepitvijo edinega mesta na modificiranem virusnem genomu. Molekulo DNA v skladu s tem vidikom izuma lahko npr. pripravimo iz kraka naravne genomske virusne DNA. Potrebno molekulo DNA lahko izdelamo iz takega naravnega virusnega kraka npr. z ligiranjem na sintetični adaptorski segment DNA, ki obsega koheziven konec, izveden iz cepitvenega mesta, ki ni prisotno v prvem virusnem genomu. V tem primeru obsegata ta konec prvega virusnega genoma in ligirani adaptor skupaj en konec modificiranega virusnega genoma. V skladu s tem ta posebna molekula DNA ne nastane s cepitvijo modificirane virusne genomske DNA, vendar obsega končni del, ki je homologen s končnim delom, ki nastane s cepitvijo edinega mesta v modificiranem virusnem genomu.
V drugi izvedbeni obliki kraka modificirane virusne DNA v smislu izuma obsega sekvenca DNA, ki ne nastopa naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino v modificiranem virusnem genomu. To cepitveno mesto nadalje obsega sekvenco levega cepitvenega mesta (SJ za levi genomski trak ali sekvenco desnega cepitvenega mesta (SR) za desni krak genomske DNA, pri čemer je nastala popolna sekvenca cepitvenega mesta (SLSR), edina v modificiranem virusnem genomu. Ta izvedbena oblika je med drugim ponazorjena s kraki DNA, dobljenimi iz vektorja virusa kurjih koz z bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti, kot je opisano v primeru 2, ali s krakoma vektorja virusa vakcinije (vS4), cepljenega na kateremkoli od več edinih mest vstavljenega mnogoternega mesta za kloniranje, kot je opisano v primeru 6.
Še drug vidik pričujočega izuma se nanaša na komplet za direktno molekulsko kloniranje modificiranega virusnega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa. Ta komplet obsega (I) očiščene molekule DNA v smislu izuma. Te molekule DNA obsegajo bodisi krake genomske virusne DNA v smislu izuma, bodisi popoln, intakten modificiran virusni genom v smislu izuma ali oboje. Kraki virusne DNA so uporabni za direktno ligiranje na segmente tuje DNA, ki jih je treba klonirati, medtem ko so intaktne virusne DNA uporabne za kloniranje po cepitvi, npr. s sekvenčno specifično endonukleazo na mestu, ki je edino v modificiranem virusnem genomu.
Komplet obsega nadalje (II) DNA ligazo in (III) raztopine pufeija in druge reagente, primerne za ligiranje segmentov DNA, da nastane modificirana molekula DNA, ki obsega ta modificirani virusni genom. Primeren pufer in reagenti za ligiranje so opisani npr. v primeru 1.
V eni izvedbeni obliki vsebuje ta komplet nadalje plazmid, ki obsega kaseto za izražanje genov, ob kateri leže bočno mesta za cepitev s sekvenčno specifično endonukleazo. Če jih cepimo z ustrezno sekvenčno specifično endonukleazo, dajejo mesta, ki leže bočno ob kaseti, konce, ki so kompatibilni za vstavitev te kasete v edino cepitveno mesto modificiranega virusnega genoma, ki ga kodira molekula DNA.
V drugi izvedbeni obliki obsega komplet za kloniranje nadalje prvo gostiteljsko celico in drugi (pomožni) virus, primeren za zapakiranje modificiranega virusnega genoma v kužne virione.
Še drugi vidik pričujočega izuma se nanaša na plazmide, ki so posebno primerni za to, da rabijo kot intermediati pri konstruiranju modificiranih vektorjev citoplazemskega DNA virusa v smislu izuma. V skladu z eno izvedbeno obliko tega vidika dajemo na razpolago plazmid, ki obsega segment DNA, ki ima na vsakem koncu isto cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo. To mesto je tudi edino mesto v genomu prvega citoplazemskega DNA virusa v skladu s pričujočim izumom. Ta segment DNA obsega mnogoterno mesto za kloniranje, ki obsega več blizu skupaj ležečih cepitvenih mest za sekvenčno specifično endonukleazo, ki so edina v plazmidu in zato uporabna za vstavljanje segmentov tuje DNA v plazmid.
Ta plazmid je uporaben za vstavljanje genov v edino cepitveno mesto segmenta DNA za kasnejši prenos tega segmenta v edino cepitveno mesto citoplazemskega DNA virusa ob uporabi postopka za direktno molekulsko kloniranje v smislu izuma. Primer za ta plazmid je plazmid pN2 (glej primer 1, slika 1.3), ki ima segment DNA, ki obsega mnogoterno mesto za kloniranje, ob boku katerega leže mesta Noti in ki vsebuje cepitvena mesta za naslednje dodatne bakterijske restrikcijske encime v temle zaporedju: Xbal, Spel, ΒαηίΆΙ, Smal, Pstl, EcoRl, EcoRN, Hindlll in Clal.
Drug plazmid v smislu pričujočega izuma obsega segment DNA, ki ima na vsakem koncu cepitveno mesto, ki je edino mesto v citoplazemskem DNA virusu. Segment
DNA tega plazmida obsega tudi več cepitvenih mest za restrikcijske encime, ki so edina v plazmidu. Ta segment DNA nadalje dbsega selektiven markerski gen (npr. E. coli gpt-gva) pod prepisovalno kontrolo promotoija citoplazemskega DNA virusa (npr. P7.5 promotor virusa vakcinije). Primer za ta plazmida sta dva plazmida, označena kot pN2-gpia in pN2-gp/b, ki vsebujeta segment DNA, ob katerem leže bočno mesta Noti in ki obsega E. coli gpt-gen pod prepisovalno kontrolo P7.5 promotoija virusa vakcinije. Ta plazmid smo ustvarili z vstavitvijo kasete za gen promotoija v mesto Stnal plazmida pN2, kot je opisano na sliki 1.3.
V nadaljnji modifikaciji gornjega plazmida obsega segment DNA nadalje drugi promotor poksvirusa, operativno povezan s sekvenco DNA, ki obsega cepitveno mesto za restrikcijsko endonukleazo. Ta plazmid, za katerega je primer plazmid pN2gpi-S3A (slika 4.7) lahko uporabimo za vstavljanje odprtih bralnih okvirov, ki nimajo svojega lastnega kodona za začetek prenosa v vektor virusa vakcinije. Podobno lahko uporabimo plazmid pN2gpi-S4 (slika 4.7) zato, da vstavimo popolne odprte bralne okvire vključno s startnim kodonom za prevajanje AUG.
V drugi izvedbeni obliki obsega ta plazmid nadalje sekvenco DNA, ki kodira humani plazminogen, kjer je sekvenca DNA operativno vezana na poksvirusni promotor in startni kodon. Primera za ta plazmid sta plazmid pN2gpi-GPg, ki kodira humani glu-plazminogen, in plazmid pN2gpi-LPg, ki kodira lys-plazminogen, v katerem je kodirno področje za amino kisline 1-77 humanega plazminogena izbrisano z delecijo (sl. 5.2 in 5.3)
V sorodni obliki obsega ta plazmid nadalje sekvenco DNA, ki kodira virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV) gpl60, kjer je sekvenca DNA operativno vezana na poksvirusni promotor in startni kodon. Primer za to je plazmid pN^pi-gpl60, ki ima gpl60 gen, ki ga kontrolira sintetični promotor S4 virusa vakcinije (sl. 5.4).
Drug plazmid pričujočega izuma obsega segment genoma citoplazemskega DNA virusa, v katerem se nahaja gen virusne timidin kinaze (tk). V tem plazmidu je bilo kodirno področje tk-gena modificirano (odstranjeno z delecijo), da bi preprečili izražanje aktivnega encima za tk. Ta plazmid je uporaben kot intermediat v konstruiranju vektorja citoplazemske DNA, ki ima nepopolen tk-gen, pri čemer uporabimo običajne metode reševanja markerja, kot je opisano za tk-gen virusa vakcinije, ob uporabi plazmida pHindJ-3. V sorodni izvedbeni obliki obsega plazmid, ki vsebuje modificirano področje tk-gena citoplazemskega DNA virusa, nadalje mnogotemo mesto za kloniranje, ki obsega več blizu skupaj ležečih cepitvenih mest za sekvenčno specifično endonukleazo, ki sč edina v plazmidu. Nadalje je vsako od teh mest odsotno v citoplazemskem DNA virusu, v katerega je treba vstaviti modificirano področje tk-gena. Zato so po vstavitvi modificiranega področja tk-gena, ki obsega ta edina mesta, v ta virusni genom ta mesta uporabna za vstavljanje segmentov tuje DNA v genom citoplazemskega DNA virusa, ki nosi modificirano področje tk-gena, v skladu s postopkom direktnega kloniranja v smislu pričujočega izuma.
Primer za ta plazmid, ki obsega modificirano področje tk-gena, ki vsebuje mnogotemo mesto za kloniranje, je plazmid pHindJ-3, v katerem ima modificirano področje tk-gena virusa vakcinije plazmida pHindJ-2 vstavljeno mnogotemo mesto za kloniranje z edinimi mesti Noti, Smal, Apal in RsrII, ob katerem leže bočno mesta Sfil (sl. 4.2). Da bi še bolj olajšali prisilno kloniranje-v vektor virusa vakcinije, napravimo vsako od obeh mest Sfil za edino v vektorju s tem, da izrabimo spremenljivo naravo prepoznavne sekvence za Sfil, kot je podrobno opisano v primem 4.
V še drugi izvedbeni obliki obsega plazmid cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino v genomu tega virusa. Taki plazmidi so posebno primerni za konstruiranje kaset za izražanje genov za prenos v vektor, ki ima prej omenjeno edino mesto. Plazmid pAO je primer za osnovni plazmid, ki vsebuje glavno mesto za kloniranje, ki obsega edina mesta glavnega mesta za kloniranje vektorja vdTK virusa vakcinije (sl. 4.3). Sorodna plazmida pAl in pA2 smo zasnovali za vstavitev segmentov DNA, npr. fragmentov sintetičnih in naravnih promotoijev, in konstruirali smo ju tako, da smo vstavili v mesto Xhol plazmida pAO linker, ki obsega drugo mnogotemo mesto za kloniranje encimov, ki pogosto režejo, ki ne cepijo pAO. Oba plazmida imata enako strukturo, razen orientacije drugega mnogoternega mesta za kloniranje (sl. 4.3.).
V še drugi izvedbeni obliki vključuje plazmid poksvirusni promotor, ki je operativno vezan na startni kodon za prevajanje, kjer temu startnemu kodonu sledi takoj drugo cepitveno mesto za restrikcijsko endonukleazo, ki je primerno prirejeno, da omogoča prevajanje odprtega bralnega okvira, vstavljenega v drugo cepitveno mesto za restrikcijsko endonukleazo. Primer za ta plazmid sta plazmida pAl-Sl in pA2-Sl, ki priskrbita močan sintetičen poksvirusni promotor Sl, ki vključuje startni kodon za prevajanje, ki mu sledi edino mesto £c<?RI, primerno za vstavljanje odprtih bralnih okvirov, ki nimajo vključenega startnega kodona (slika 4.4). Plazmida pAl-S2 in pA2-S2 sta podobna plazmidoma pAl-Sl in pA2-Sl, vendar imata drugačen poksvirusni promotor S2 (slika 4.5).
V sorodni izvedbeni obliki obsega gornji plazmid nadalje sekvenco DNA, ki kodira humani protrombin, kjer je ta sekvenca DNA operativno vezana na ta poksvirusni promotor in ta startni kodon. Primer za ta plazmid je plazmid pAlSl-PT (slika 5.1), v katerem je modificirana protrombinska cDNA vstavljena v edino mesto £coRI plazmida pAl-Sl.
Drug plazmid v smislu pričujočega izuma obsega modificiran EcoRI K fragment DNA virusa vakcinije, iz katerega je z delecijo odstranjen gen KIL kroga gostiteljev. Pomožni virus vdhr, ki mu manjkata oba gena kroga gostiteljev KIL in C7L, konstruiramo iz seva WR-6/2, ki ne vsebuje C7L, s pomočjo reševanja markeija z modificiranim EcoRI K fragmentom, iz katerega je bil z delecijo odstranjen gen kroga gostiteljev KIL. Glej sliko 8.1. Ta modificirani £coRI K fragment obsega selektiven markerski gen (E. coli gpt-gen), da olajšamo izbiranje genomov rekombinantnega WR-6/2, ki obsegajo modificirani £coRI K fragment, ob uporabi intracelulamega reševanja markerja, kot sta opisala Sam & Dumbell, 1981. Plazmid, ki rabi za primer, označujemo kot pEcoK-dhr (slika 8.1).
V nadaljnji stopnji lineariziramo pEcoK-dhr z Noti in ga ligiramo z gensko kaseto z 1.1 kb P7.5-gpi, izvedeno iz plazmida pN2-gpia (primer 4) z razgradnjo z Noti. Nastali plazmid pdhr-gpi (slika 8.1) uporabimo pri poskusih reševanja markerja, da nastane pomožni virus vdhr v skladu z metodo reševanja markerja po Samu & Dumbellu, 1981.
Pričujoči izum je dalje opisan niže glede na naslednje ilustrativne primere.
V primerih, ki slede, so določeni konstrukti ilustrirani s tabelami, ki podrobno navajajo njihove karakteristike. V teh tabelah uporabljamo naslednje kratice:
CDS = kodirna sekvenca rc = obratna komplementarna sekvenca rcCDS = obratna komplementarna kodirna sekvenca arabske številke so položaji nukleotidov ATG = startni kodon za prevajanje
EMBL ID = označba v EMBL DATABANK
PRIMER 1 Direktno molekulsko kloniranje tuje DNA, ki obsega selektiven markerski gen (ppt-sen E. coli\ v edino cepitveno mesto (NotT) v genomu ortopoksvirusa (vakcinije)
Ta primer prikazuje direktno molekulsko kloniranje kasete za izražanje genov v genom poksvirusa, v skladu s pričujočim izumom, z intracelulamim zapakiranjem genetsko manipulirane poksvirusne DNA. Poleg tega ilustrira ta primer uporabo postopka genetskega izbiranja za učinkovito pridobivanje modificiranih virusov vakcinije, ki vsebujejo vstavljen selektiven markerski gen. Eksperimentalni rezultati tudi kažejo, da pride med pakiranjem pogosto do rekombinacije med DNA, ki naj bi jo zapakirali, in DNA kužnega pomožnega virusa, če je DNA pomožnega virusa homologna z DNA, ki naj bi jo zapakirali.
Podrobneje kaže niže opisani prvi eksperiment direktnega molekulskega kloniranja, da lahko kaseto z markerskim genom (gpi-genom) vstavimo kot Noti restrikcij ski fragment v DNA virusa vakcinije, razcepljeno z Noti, in nato zapakiramo v sesalske celice, okužene z virusom vakcinije. Eden od devetih preiskanih plakov je vseboval virus, ki je imel napovedano strukturo za en sam vstavek gpč-gena v a orientaciji (glej sliko 1.11). Struktura tega klona (označenega kot vp7) je bila med podvajanjem v velikem merilu v odsotnosti selekcijskega sredstva stabilna.
V drugem nizu poskusov kloniranja je imelo sedem od dvanajstih preiskanih klonov pričakovano strukturo. Vendar je ta niz vključeval štiri majhne plake (E1-E4) virusov, ki so se podvajali počasi, čeprav pri izvajanju pričujočega izuma ti prednostno normalno niso izbrani. Pod selektivnimi pogoji smo dobili tudi rekombinante, ki imajo mnogoterne vstavke selektivnega markerskega gena. Stabilnosti teh mnogotemih vstavkov nismo preiskovali v odsotnosti selektivnega sredstva, za katerega je znano, da stabilizira nekatere, sicer nestabilne strukture. Glej Falkner & Moss,/. Virol. 64: 3108-3111 (1990).
Relativno nizek dobitek napovedanih struktur ni pričakovan glede na znano natančnost metod genetskega inženiringa za za mesto specifično cepitev in ligiranje molekul DNA. Vendar pa je posebna sekvenca, ki smo jo izbrali za vstavitev v tem modelnem sistemu, kaseta z gpi-genom, obsegala sekvence DNA virusa vakcinije P7.5 promotoija, ki so homologne dvema endogenima promotoijema v vektorju vakcinije, ki kontrolirata dva gena 7.5 kD polipeptida virusa vakcinije, ki se nahajata v obrnjenih terminalnih ponovitvah genoma vakcinije. Glej Venkatesan, B., Baroudy
B. M. & Moss, B., Celi 25: 805-813 (1981). Ta P7.5 promotor smo uporabili, da smo konstruirali rekombinante virusa vakcinije z'običajno intracelulamo rekombinacijo, in lahko ga stabilno vključimo v gen timidin kinaze vakcinije. Mackett & Smith (1986). Vendar se tu in tam med analizami običajnih rekombinantov pojavijo submolske množine fragmentov DNA, ki so lahko posledica dogodkov sekundarnih rekombinacij. Kjer je P7.5 promotor vstavljen blizu endogenih P7.5 promotorjev (npr. znotraj nekaj kilobaz), so obstojni samo rekombinanti, ki imajo strukturo obrnjene ponovitve, in to opažanje smo izrabili, da smo razvili postopek za delecijo, ki temelji na vstavitvi tandemsko ponovljenega segmenta P7.5 promotorja. Spehner, D., Drillien, R. &. Lecocq, J.-P. J. Virol. 64: 527-533 (1990).
V pričujočem primeru vstavitve kasete za .gpi-gen v mesto Noti virusa vakcinije je razdalja med P7.5 promotorjema leve obrnjene terminalne ponovitve in vstavljene kasete okoli 30 kb, in verjetno je dovolj kratka, da povzroči destabilizacijske dogodke sekundarne rekombinacije. Dejansko so imele samo strukture z malo nestabilnimi, počasi se podvajajočimi kloni, vstavek v b orientaciji, ki bi povzročil nastanek razporeditve tandemske ponovitve vstavljenih in endogenih promotorjev. Tako lahko redko pojavljanje te strukture najverjetneje pojasnimo z bližino P7.5 promotorjev kasete z gpi-genom in endogenih P7.5 promotorjev in znano nestabilnostjo tandemsko ponovljenih kopij P7.5 promotorja.
Nasprotno pa so imeli virus vp7 in več drugih izolatov (Al, A4, Cl in C2) vstavke v a orientaciji in so bili stabilni. Analiza strukture enega izolata, C4, se je ujemala z narobe obrnjenim dvojnim vstavkom.
Titri zapakiranih virusov, ki so bili pozitivni na £pi-gen, so v drugem nizu poskusov kloniranja (pet različnih vzorcev) znašali približno 1 χ 105 pfu (plaque forming units = enote, ki tvorijo plake) na 8 χ 106 celic, medtem ko smo v prvem poskusu dobili od enakega števila celic titer 1-2 χ 102 pfu. Na titer modificiranih virusov bo vplivalo več faktorjev, vključno učinkovitost ligiranja in pakiranja, reakcijski pogoji in pogoji kultiviranja med postopkom kloniranja in obseg skrbi, ki jo posvetimo temu, da se med delom izognemo trganju visokomolekulske vektorske DNA. Na splošno pričakujemo pri niže opisanih standardnih pogojih titre okoli 105 pfu na 8 χ 106 celic.
Medtem ko kaže pričujoči primer, da lahko uporabimo za vstavljanje tuje DNA edino intergensko mesto Noti virusa vakcinije, ilustrira tudi potrebo, da upoštevamo, ali bi lahko predlagani vstavek vseboval virusne sekvence take vrste in orientacije, za katere je znano ali verjetno, da bodo povzročile nestabilnost modificiranih virusov. Zaradi stabilnosti je treba dati prednost vstavkom, ki nimajo homolognosti z virusnimi sekvencami blizu mesta za vstavljanje (npr. znotraj 30 kb). Zato imajo vstavki, ki vključujejo samo kratke sekvence sintetičnega promotorja, ki jih prepozna prepisovalni sistem vektorja, prednost pred tistimi, ki vsebujejo velike segmente virusne DNA, ki vključujejo naravne promotorje virusnega vektorja. Glej npr. Sl promotor v primeru 4, spodaj.
V tem in v vseh kasnejših primerih smo, razen tam, kjer je navedeno drugače, uporabili tele materiale in metode.
Čiščenje ortopoks virusa in DNA: Virus vakcinije (divjetipski sev Westem Reserve (WR); American Type Culture Collection No. VR 119) smo očistili z dvema zaporednima gradientoma saharoze v skladu z Mackettom et al. v D.M. GLOVER, DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, 191-211 (IRL Press, 1985). Virusno DNA smo pripravili po postopku s proteinazo K in SDS v skladu z GrossBellardom et al., Eur. J. Biochem. 36: 32-38 (1973).
Konstruiranje izolirane poksvimsne DNA: Virusno DNA (tipično 2 do 5 gg) smo cepili z ustreznimi množinami ene ali več sekvenčno specifičnih endonukleaz (npr. bakterijske restrikcijske endonukleaze NotT), obdelali v danem primeru s telečjo črevesno alkalno fosfatazo (Boehringer, Inc.) in očistili z ekstrakcijo s fenolom in obarjanjem z etanolom v skladu z rutinskimi metodami rekombinantne DNA. Dobljene krake virusne DNA smo ligirali s pet- do petdeset-kratnim molskim prebitkom fragmenta DNA, ki naj bi ga vstavili, ki ima konca kompatibilna za ligiranje z virusnimi kraki. Alikvot ligacijske reakcijske zmesi smo analizirali z gelsko elektroforezo v inverznem polju (FIGE).
Podrobneje, v drugem nizu spodaj opisanih poskusov (A-E) smo ligirali 2 gg z Noti razgrajene DNA vakcinije, ki je nismo obdelali s fosfatazo, z 200-600 ng vstavka gptgenske kasete v volumnu 30 gl s 5-15 enotami T4 ligaze 48 h pri 12°C, kot je povzeto v tabeli 1.
In vivo pakiranje v sesalske celice: 8 χ 106 celic (CV-1) afriške zelene opice smo okuževali 2 h s pomožnim virusom (bodisi naravnim virusom vakcinije WR ali virusom WR6/2 ali drugimi virusi, kot so navedeni) pri 0,2 pfu/celico. Za začetni prikaz pakiranja z intaktno DNA, izolirano iz virionov, smo uporabili 20 gg virusne (vPgD) DNA. Za zapakiranje ekstracelulamo konstruiranih genomov smo uporabili 1 jug DNA, ki smo jo očistili iz ligacijske reakcijske zmesi. Obe DNA smo transfektirali v celice s tehniko obaijanja s kalcijevim fosfatom (Graham, F.L. & van der Eb, 1973). Celice smo inkubirali 15 min pri sobni temperaturi in nato dodali na vsak ml oborine devet ml medija (DMEM, 10% fetalnega telečjega seruma, glutamin in antibiotiki). Po štirih urah smo medij zamenjali in inkubirali še dva dni.
Surovi virusni material smo pripravili v skladu s standardnimi postopki. Mackett et al., 1985. Plakni testi in selekcijski pogoji za E. coli gpt-g&n so v stroki znani. Glej Falkner & Moss, J. ViroL 62:1849-1854 (1988); in Boyle & Coupar, Gene 65:123-128 (1988).
Gelska elektroforeza v inverznem polju (FIGE).
Virusno DNA smo ločili na 1%-nem agaroznem gelu v tris/acetat/EDTA-pufeiju (40 mM Tris/20 mM ledaste ocetne kisline/2 mM EDTA, pH 8,0) ob oskrbi z električno energijo, ki jo kontrolira mikroračunalnik (Consort Model E790). Da bi ločili celoten spekter fragmentov, smo zapored izvedli štiri programe, kot sledi: program 1: 5 h pri 7 V/Cm, impulz za pomik naprej (F) 6 s, obratni impulz (R) 3 s, pavza 1 s; program 2: 5 h pri 7 V/cm, F 4 s, R 2 s, pavza 1 s; program 3: 5 h pri 7 V/cm, F 2 s, R 1 s, pavza 1 s; in program 4: 5-10 h pri 7 V/cm, F 8 s, R 4 s, pavza 1 s.
Konstruiranje plazmida pN2: Plazmid Bluescript II SK (Stratagene, Inc.) smo razgradili s Hindll in ligirali z TVozl-linkerji (Pharmacia, Inc.). Nastali plazmid, pN2, ima mnogotemo mesto za kloniranje, ob katerem leže bočno mesta Noti.
Natančneje, mnogotemo mesto za kloniranje v pN2 sestoji iz tehle mest v navedenem vrstnem redu: Notl,Xbal, Spel, BamHl, Smal, Pstl, EcoRI, £coRV, Hindlll, Clal in Noti. Sekvenca vstavljenega Votl-linkerja v pN2 in dvajset baz bočnih področij na mestu 5’ in 3’ plazmida pBluescript II SK- (Stratagene, Inc. La Jolla, USA) so prikazane na SEQ. ID. NO. 1. Sekvenca vstavka se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 28. (Prvi 'T' ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 2266, zadnji G ostanek na 3’-koncu položaju štev. 2313 plazmida pN2).
Konstruiranje plazmidov pN2-gpta in pN2-gptb: 1,1 kb Hpal-Dral fragment (ki vsebuje kaseto za P7.5 promoter-gpr gen) smo izolirali iz plazmida pTKgpt-Fls (Falkner & Moss, 1988) in vstavili v mesto Smal plazmida pN2 (slika 1.3). Oba nastala plazmida sta orientacijska izomera in smo ju označili kot pN2-gpia in pN2-gpib.
Genska kaseta P7.5 promotorja virusa vakcinije-£. coli gpt-gena in dvajset baz bočnih področjih na mestu 5’ in 3’ plazmida pN2 so prikazane za pN2-gpta na SEQ. ID. NO. 2. Vstavek se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 1113. A-ostanek kodona za začetek prevajanja gpi-gena ustreza položaju 519. T-ostanek prevajalnega stop kodona gpt-gena ustreza položaju številka 975. (Prvi C ostanek na 5’-koncu ustreza položaju številka 2227, zadnji T ostanek na 3’-koncu položaju številka 3359 plazmida pN2-gpfa).
Obratna komplementarna oblika kasete P7.5 promotoija virusa vakcinije E. coli gptgena in dvajset baz bočnih področij na mestu 5’- in 3’-plazmida pN2 so prikazane za pN2-gptb na SEQ. ID. NO. 3. Vstavek se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 1113. T-ostanek (obratnega komplementa) kodona za začetek prevajanja CAT ustreza položaju 615. A-ostanek (obratnega komplementa) prevajalnega stop kodona gpt-gena ustreza položaju številka 159.
Druge standardne tehnike analize rekombinantne DNA (npr. Southemov prenos, PAGE, prevajanje nicka) smo izvedli, kot je opisano. J. SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Zapakiranje gole virusne DNA: Da bi ustvarili pogoje, potrebne za zapakiranje gole poksvirusne DNA s pomožnim virusom, smo intaktno DNA, izolirano iz virionov vzorčnega rekombinantnega virusa vakcinije (vPgD), transfektirali v celice (CV-1) opice, okužene s pomožnim virusom (divjetipska vakcinija WR). Izbrani rekombinantni virus ima več fenotipičnih markerjev, ki se jih da zlahka stestirati. Tako je genom virusa vPgD vključil v mesto virusne timidin kinaze (tk) gen za marker za odpornost proti zdravilu (gen za encim ksantin-gvanin-fosforiboziltransferazo Escherichije coli·, t.j., gpt-gen) in gen za udobno ugotovljiv markerski protein (humani plazminogen). Ta virus so prvotno konstruirali iz seva virusa vakcinije (WR 6/2; Moss et al., J. virol. 40: 387-95 (1960), ki ima delecijo okoli 9 kb in zato ne izraža gena glavnega izločenega 35K proteina, ki ga opisujejo Kotwal et al., Nature 335: 176-178 (1988). Pričakovani fenotip zapakiranega virusa zato vključuje: tk-negativne (t.j. podvajanje v prisotnosti bromodeoksi-uridina); gpi-pozitivne (t.j. podvajanje v prisotnosti mikofenolne kisline in ksantina); take, ki izražajo gen humanega plazminogena, in take, ki ne izražajo izločenega 35K proteina.
Iz gornjega poskusa zapakiranja smo analizirali osem £pi-pozitivnih plakov. Vsi so bili tk-negativni in so, kot kaže slika 1.1, vsi izražali plazminogen. Šest od teh izolatov (proge 5, 6, 7,11,12 in 14) ni izražalo izločenega 35K proteina vakcinije in so tako vsi kazali karakteristike transfektirane genomskfe DNA. Dva od plakov sta tudi izražala
35K proteinski marker (progi 4 in 13) in sta bila zato rekombinanta med naravnim pomožnim virusom (proge 8 in 15) in vstopnimi virusnimi genomi.
S tem poskusom smo dokazali, da se gola poksvirusna DNA, ekstrahirana iz virionov, zapakira, če jo pod testnimi pogoji transfektiramo v celice, okužene s pomožnim virusom. Zato smo uporabili te pogoje za transfekcijo genomske poksvirusne DNA, ki smo jo modificirali z direktnim molekulskim kloniranjem, kot je prikazano na sliki 1.2.
Zapakiranje ekstracelulamo konstruirane poksvirusne DNA: Genom virusa vakcinije vsebuje eno samo cepitveno mesto za Noti sekvenčno specifično endonukleazo v področju, znanem kot Hindlll F fragment. Pregled sekvence okoli tega mesta (Goebel et al., 1990) je pokazal, da se nahaja v intergenskem področju, ki verjetno ni bistveno za virusno podvajanje. V dveh plazmidih (pN2-gpia in pN2-gpib; slika 1.3) smo konstruirali kaseto za izražanje markerskega gena tako, da smo vstavili E. coli gpt-gcn v vsaki od dveh možnih orientacij, gpt-gcn je bil pod kontrolo promotorja gena virusa vakcinije, ki kodira za 7.5 kDa protein, opisan v Cochran et al., J. Virol. 54: 30-37 (1985) (označen Pl v sliki 1.2 in P7.5 v sliki 1.3.). Celotna kaseta z markerskim genom je bila na enem samem 1.1. kb jVo/I-fragmentu teh plazmidov. Ta restrikcijski fragment iz pN2-gpia smo ligirali z divjetipsko DNA iz seva WR, razgrajenega z Noti, in transfektirali v celice, ki so bile okužene s pomožnim virusom (WR).
V prvem poskusu kloniranja smo izvedli analize Southernovih prenosov genomskih struktur plakov fenotipično gpi-pozitivnega potomstva. Virusne izolate smo trikrat plakno očistili in pomnožili pod gpr-selekcijo. S Tiindlll-razgrajene fragmente DNA celic (CV-1), okuženih z različnimi virusi, smo ločili na 1%-nem agaroznem gelu s kombinacijo normalne elektroforeze in gelske elektroforeze v inverznem polju. Gel smo nato prenesli (blotted) in hibridizirali z DNA vakcinije WR, oznamovane s 32P in z oznamovano sondo, ki je vsebovala gpf-sekvence. Rezultati so potrdili, da so vsi fenotipsko markersko-pozitivni kloni vsebovali vstavek 1.1 kb gpt.
Slika 1.4 kaže prenose fragmentov DNA, dobljenih s Hindlll, iz celic, okuženih z devetimi virusnimi izolati (proge 4-12); plaki 2.1.1 do 7.1.1 in 10.1.1 do 12.1.1). Opazimo lahko pričakovani 0,8 kb Hindlll fragment, , ki vsebuje gpf-sekvence. V progah 2 in 3, kamor smo nanesli s Hindlll razgrajeno DNA divjetipskega virusa (100 oz. 50 ng), nismo opažih navzkrižne hibridizačije z virusnimi sekvencami.
V naslednjem poskusu smo totalne DNA iz kultur celic CV-1, okuženih z devetimi različnimi plaki, razgradili z Noti. Southernov prenos ločenih fragmentov je prikazan na sliki 1.5. Nepričakovano sta pri večini virusnih izolatov vidna dva trakova, napovedani 1.1 kb vstavek in drugi, večji fragment. Samo plak štev. 7.1.1 (proga 8) je kazal pričakovani edini 1.1 kb trak. Medtem ko je signal hibridizacije večjih fragmentov enako močan pri vseh preiskanih DNA, je intenzivnost 1.1 kb traku variirala od DNA do DNA, kar kaže na to, da je lahko 1.1 kb vstavek prisoten v različnih genomih v različnih molskih množinah. Kontrola divjetipskega virusa (proga 2) ni hibridizirala s sondo gpt-gena.
Isti prenos smo hibridizirali tudi s sondo DNA virusa vakcinije. Pričakujemo tri fragmente z okoli 145 kb, 45 kb in 1.1 kb. Dobljeni vzorci prenosov so vključevali pričakovane trakove, vendar so kazali tudi dodaten trak z okoli 5 kb. Samo plak 7.1.1 ni imel nepričakovanega 5 kb traku.
S Southemovim prenosom smo preiskali tudi orientacijo vstavka DNA v izbranih konstruiranih genomih vakcinije. Kot kaže sl. 1.2, je lahko vstavek v virusnih DNA bodisi v a ali b orientaciji, ki se ju da razlikovati z razgradnjo teh DNA s primernimi restrikcijskimi encimi. Po predhodnih analizah smo izolat 7.1.1 označili kot klon vp7, in videti je bilo, da ima genomsko strukturo pričakovanega modificiranega virusa in smo ga zato pomnožili in očistili. DNA tega klona smo primerjali z DNA divjetipskega virusa (slika 1.6) z razgradnjo z več restrikcij skimi encimi in ločenjem na agaroznem gelu z gelsko elektroforezo v inverznem polju (sl. 1.6). V razgradnem produktu, dobljenem iz vp7 z Noti, obarvanem z etidijevim bromidom (proga 2), sta vsebovala samo trakova s 145 kb in 45 kb dovolj mase DNA, da sta bila vidna, ker smo ocenili, da vsebuje trak za 1.1 kb vstavek samo okoli 3 ng DNA. Vendar pa je hibridizacija s sondo, specifično za gpt, pokazala šibek trak z 1.1 kb (slika 1.7, proga 2)·
V razgradnih produktih s Hindlll smo opazili pričakovana trakova z 1.4 in 0.8 kb. Kot napovedano je 0.8 kb trak hibridiziral s sondo gpi-gena (sliki 1.6 in 1.7, proga 4). Pri dvojni cepitvi s Hindlll in Noti smo opazili tudi pričakovani 0.8 kb fragment (sliki 1.6 in 1.7, proga 6).
Pri cepitvi DNA iz vp7 s Pstl smo opazili napovedani 4.1 kb fragment, ki je vseboval gpt sekvence (sliki 1.6 in 1.7, proga 8; z etidijtevim bromidom obarvani 4.1 kb trak na sliki 1.6 je dejansko dublet 4.1 kb fragmentov, od katerih vsebuje eden vstavek gpt). Po cepitvi s Pstl in Noti smo kaseto z gpi-genom sprostili kot 1.1 kb fragment (sliki 1.6 in 1.7, proga 10).
Vzorci produktov, dobljenih z razgradnjo s temi in drugimi restrikcijskimi nukleazami, vključno Sall (sl. 1.6 in 1.7, proga 12), se skladajo s tolmačenjem, da je vp7 stabilen modificiran virus, ki ima gpt-gen vključen v mesto Noti genoma virusa vakcinije v a orientaciji (glej sl. 1.11).
Drugi niz poskusov kloniranja smo izvedli pod nekoliko spremenjenimi pogoji (glej tabelo 1 in metode, zgoraj). Pripravili smo pet različnih ligacijskih reakcij (A-E), ki so vsebovale konstantne množine DNA vektorja vakcinije, cepljene z Noti, in naraščajoče množine vstavljene DNA. Zapakiranje smo izvedli pod standardnimi pogoji v celicah CV-1, okuženih z virusom vakcinije. Titri gpi-pozitivnih virusov vakcinije so bili v vseh primerih okoli 1 χ 105 pfu na 8 χ 106 celic. Populacija plakov je bila v vseh poskusih kloniranja po velikosti heterogena: okoli polovica je imela normalno velikost, medtem ko je bila druga polovica manjša od normalne.
Tabela 1. Učinek razmerja med vstavljeno in vektorsko DNA na dobitek modificiranih virusov
poskus A B C D E
vektorska DNA, cepljena
z Noti (p-g) 2 2 2 2 2
vstavek gpi-gena (/xg) 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6
molski prebitek vstavka 17 17 34 34 51
T4 ligaza (enote) 5 15 5 15 15
gpi-pozitivni virus (105)
(pfu/8 χ 106 celic) 1,12 0,88 0,96 0,96 1,16
Izolirali smo 12 gpf-pozitivnih plakov, po štiri v treh nizih, označenih niz A, C in E, ki obsegajo 8 normalno velikih (velikih) plakov (Al-4 in Cl-4) in 4 majhne plake (El4). Vsakega od teh plakov smo analizirali tako, da smo v .gpi-selektivnem mediju okužili celice CV-1, izolirali totalne celične DNA in jih razgradili z restrikcijskimi nukleazami, ločili fragmente s FIGE in jih prenesli na nitrocelulozno membrano.
V sl. 1.8 so prikazani vzorci DNA, razgrajene z Noti, ki so bili hibridizirani s sondo z DNA virusa vakcinije (Al-4, proge 1-4; Cl-4, proge 5-8; El-4, proge 9-12). Zaradi preobremenitve gela so se trakovi nekoliko razmazali, vendar so bistvene značilnosti razločno vidne. Glavni signal sta dala trakova 145 kb in 45 kb. V nekaterih od vzorcev je viden šibak trak z okoli 5 kb neznanega izvora. Trak z 1.1 kb, ki obsega gensko kaseto P7.5-promoter-gpi-gen, predstavlja samo 0,6 % virusnega genoma in vsebuje samo 300 bp hibridizirajoče sekvence (t.j. P7.5 promotoija). Zato ni bilo pričakovati, da bi ta trak dal pod uporabljenimi pogoji zaznaven hibridizacijski signal. Pri daljši ekspoziciji prenosa, ko so večji trakovi močno preeksponirani, pa je postal trak z 1.1 kb viden.
Kar zadeva naravo fenotipa majhnih plakov, so dali majhni plaki El, E3 in E4 samo šibke hibridizacijske signale (sl. 1.8, proge 9-12), kar kaže na to, da se virus v teh plakih ni podvajal tako močno kot virusi v plakih normalne velikosti (proge 1-8), medtem ko izolat E2 ni dal zaznavne množine DNA (proga 10).
Vzorce, prikazane na sl. 1.8, smo tudi hibridizirali s sondo z gpf-genom (sl. 1.9). Pričakovani edini hibridizacijski signal smo dobili s plaki Al, A4, Cl, C2, CA, E3 in E4 (sl. 1.9, proge 1, 4, 5, 6, 8, 11 in 12). Plak A2 (proga 2) je imel gpt gen vključen v trak s 45 kb. (Šibki signal v traku s 145 kb je lahko posledica onečiščenja z drugo, manj pomembno species, ali sekundarnih rekombinantnih dogodkov). Plak A3 (proga 3) je imel sekvence gpt-gena vključene v trakova s 145 kb in 45 kb, medtem ko je imel plak C3 (proga 7) vključene te sekvence v trak s 145 kb in v mesto Noti. Plaki A2, A3 in C3 so verjetno rekombinanti, ki so nastali z napačno intracelularno rekombinacijo homolognih sekvenc, prisotnih v vstavku modelne genske kasete in v obrnjenih ponovitvah virusne DNA.
Kot s sondo DNA virusa vakcinije so dali majhni plaki E1-E4 samo šibke hibridizacijske signale (sl. 1.9, proge 9-12), kar kaže na to, da se virus v teh plakih ni podvajal tako močno kot virusi v plakih normalne velikosti. DNA divjetipskega virusa in DNA neokuženih celic CV-1 nista hibridizirali s sondo z gpf-genom (sl. 1.9, progi 13 in 15).
Orientacijo in število kopij vstavkov gpt-gena smo določili tako, da smo vzorce, ki jih kaže sl. 1.9, razgradili s Pstl, in z analizo Southemovega prenosa. Pričakovane velikosti novih Pstl fragmentov, ki so posledica vstavitve gpt-gena, so prikazane na sl. 1.11. Hibridizacija s sondo z gpi-genom je pokazala, da so vzorci plakov Al, A4, C1 in C2 (sl. 1.10, proge 1, 4, 5 in 6) obsegali en sam Pstl-fragment s 4.1 kb, kot je bilo pričakovati za edini vstavek v a orientaciji (sl. 1.11). Za plak El se je šibki hibridizacijski signal iz traku z 21 kb, ki smo ga opazili samo pri dolgih ekspozicijah prenosa, skladal z b orientacijo vstavka gpt-gena.
Strukture virusnih DNA iz plakov C4 in E3 (sl. 1.10, progi 8 in 11) so se skladale z dvojnimi tandemskimi vstavki v b orientaciji. V tem primeru pričakujemo hibridizirajoče fragmente z 21 in 1.1 kb (sl. 1.11). Struktura virusa v plaku E4, ki obsega dva fragmenta s po 4.1 in 1.1 kb, se sklada s tandensko vstavitvijo dveh gptgenov v a orientaciji. DNA iz plakov A2, A3 in C3 je kazala bolj zapletene vzorce, kar kaže na vstavke na mnogoternih mestih, kijih nismo dalje analizirali.
Na kratko povedano, v drugem poskusu kloniranja je imelo 5 od 8 normalno velikih plakov genomske strukture, ki smo jih pričakovali za vstavitev ene same kasete za gpt-gen v edino mesto Noti genoma virusa vakcinije. Počasneje rastoči plaki majhne velikosti so kazali nestabilne strukture, ki so se med kasnejšimi stopnjami čiščenja plakov izgubile.
PRIMER 2 Direktno molekulsko kloniranje selektivnega markerskega gena (E. coli gpt) v edino cepitveno riiesto (Noti) modificiranega genoma avipoksvirusa (virus kurjih koz, klon f-TK2a)
Ta primer ilustrira splošno uporabnost direktnega molekulskega kloniranja modificiranih genomov citoplazemskega DNA virusa s tem, da ilustrira uporabo modificiranih genomov avipoksvirusa, ki jih konstruiramo in vitro in zapakiramo in vivo. Avipoksvirusi imajo v družini poksvirusov največje genome. Genom virusa kurjih koz (FPV) je velik okoli 300 kb in doslej so konstruirali rekombinante FPV, ki izražajo tuje gene, samo s tehnikami reševanja markerja. [Glej npr. Boyle and Coupar, Virus Res. 120: 343-356 (1988); Taylor et al., Vaccine 5: 497-503 (1988)].
Pričujoči primer ilustrira izdelavo modificiranega virusa kurjih koz z direktnim molekulskim kloniranjem kasete za izražanje genov, ki sestoji iz poksvirusnega promotorja, ki vodi E. coli gpt-gcn v edino mesto Noti v genomu rekombinantnega virusa kurjih koz f-TK2a. To mesto Noti se nahaja v /acZ-genu, ki smo ga pred tem vstavili v ta rekombinant z intracelularno rekombinacijo. Konstruirano DNA zapakiramo v primarne fibroblaste piščančjih zarodkov, okužene s pomožnim virusom kuijih koz HP2, ki se podvaja bolj počasi kot rekombinant f-TK2a. Izbiranje gpZ-pozitivnih plakov vodi do izolacije konstruiranih virusov kurjih koz. Ker je /acZ markerski gen inaktiviran z vstavitvijo v mesto Noti, se namnoženi virusi razlikujejo od vektorskega virusa, ki mu manjka vstavek, po brezbarvnem fenotipu v modrem plaknem testu za izražanje lacZ, gena.
Čiščenje virusa kurjih koz in DNA: Virus kurjih koz (FPV), sev HP1 [Mayr & Malicki, Zentralbratt f. Veterinarmedizin, Reihe B, 13: 1-12 (1966)] in oslabljeni sev HP1.441 (pasaža št. 441 seva HP1) smo dobili od A. Mayra, Munchen. Sev HP2 virusa kurjih koz smo izvedli iz HP1.441 s plaknim čiščenjem. Primarne fibroblaste piščančjih zarodkov (CEF) smo pripravili tako, kot je opisano v evropski patentni prijavi, objava št. 0 338 807. Celice smo gojili v mediju za celično kulturo 199 (TCM 199; Gibco BRL), ki mu je bilo dodano 5 % fetalnega telečjega seruma, glutamin in antibiotiki. Virus kurjih koz smo očistili z dvema zaporednima gradientoma saharoze v skladu s Joklik, W. K., Virology 18: 9-18 (1962). Virusno DNA smo pripravili po postopku s proteinazo K in SDS v skladu z Gross-Bellard et al., Eur. J. Biochem 36: 32-38 (1973).
Konstruiranje vektorja virusa kurjih koz (f-TK2a), ki ima edino cepitveno mesto (NotT) v vstavljenem segmentu DNA: tk-gert virusa vakcinije smo skupaj z E. coli lacZ genom vstavili v intergensko področje med tk-genom in 3’-orf (orf = odprt bralni okvir) virusa kurjih koz. Plazmida pTKm-VVtka in pTKm-VVtkb smo konstruirali tako, da smo klonirali funkcionalni tk-gen virusa vakcinije v intermediami plazmid pTKm-sPll. Po intracelulami rekombinaciji plazmidov pTKmVVtka in pTKm-VVtkb z DNA divjetipskega virusa kurjih koz smo ustvarili dva nova vektoija FPV, imenovana f-TK2a oz. f-TK2b. Vsak vektor vsebuje dva funkcionalna Tk-gena, gen endogenega FPV in vstavljeni tk-gen virusa vakcinije, poleg vstavljenega /acZ-gena, od katerih lahko vsakega uporabimo kot nebistveno mesto za vstavitev tuje DNA. Posebno je mesto Noti v /acZ-genu edino cepitveno mesto v vektoijih f-TK2a in b in zato ugodno za direktno molekulsko kloniranje tuje DNA v ta vektorja. Popolne podrobnosti konstruiranja vektorjev f-TK2a in f-TK2b virusa kuijih koz so razkrite v U.S. prijavi z naslovom Recombinant Fowlpox Virus Scheiflingerja et al., ki zahteva prednostno pravico ekvivalentne evropske prijave, vložene istočasno s to prijavo, katere celotni opis je tukaj vključen kot referenca.
In vivo zapakiranje v ptičje celice: 8 χ 106 celic CEF okužimo z 0,2 pfu/celico pomožnega virusa (HP2) v teku 2 h. Za zapakiranje konstruiranih genomov FPV uporabimo 1 pg očiščenega reakcijskega produkta ligacije. Celice transfektiramo z DNA s tehniko obarjanja s kalcijevim fosfatom (Graham and van der Eb, 1973) in inkubiramo 15 minut pri sobni temperaturi. Celicam dodamo 9 ml medija (TCM 199, 10 % fetalnega telečjega seruma, glutamin in antibiotiki) na 1 ml oborine. Po 4 urah medij zamenjamo in inkubiramo še 2 dni. Surovi virusni material pripravimo po standardnih postopkih (Mackett et al. 1985). Plakne teste in gpf-selekcijo izvedemo tako, kot opisujejo Scheiflinger et al., 1991.
Direktno molekulsko kloniranje v edino cepitveno mesto Noti genoma virusa kurjih koz: Rekombinantni FPV, sev f-TK2a (Scheiflinger et al., 1991) je primeren kot vektor za direktno kloniranje genske kasete, npr. modelne ^ρί-genske kasete, kot je opisana tukaj, v edino cepitveno mesto Noti. To mesto Noti vektorja je področje za kodiranje lacZ gena, ki rabi kot marker za barvni screening, ki je po vstavitvi gena inaktivirano. Tako tvorijo /acZ-pozitivni virusi modre plake v prisotnosti kromogenega substrata Χ-Gal, medtem ko kažejo virusi z vstavki v to mesto Noti fenotip belih plakov. Genom vektoija f-TK2a ima vključen tudi gen timidin kinaze (tk) virusa vakcinije, ki tudi rabi kot možno področje za vstavljanje genov. Oba gena, ZacZ in tk, smo vstavili v genom virusa kurjih koz v intergenskem področju med genom timidin kinaze kurjih koz in 3’ odprtim bralnim okvirom z običajnimi metodami (Scheiflinger et al., 1991).
Vzorce cepitve DNA z Noti smo ugotovili za genomske DNA virusov FPV HP1.441 in vektorski sev f-TK2a (sl. 2.1). HP1.441 smo izvedli iz virulentnega seva FPV s slabljenjem s serijsko pasažo v fibroblastih piščančjih zarodkov. HP1.441 je 441. pasaža seva HP1 in uporabljajo jo kot sev za cepivo proti kurjim kozam (Mayr & Malicki, 1966) in je zelo primeren za hitro podvajanje v celični kulturi.
DNA iz HP1.441 smo analizirali kot referenco za sev f-TK2a vektorja FPV, ki je derivat seva HP1.441. Restrikcijska analiza DNA seva HP1.441 (sl. 2.1, progi 1 in 2) je pokazala, da ta sev nima mest Noti. Cepitev DNA vektorja f-TK2a z Noti je dala dva velika fragmenta z okoli 100 in 200 kb (sl. 2.1, proga 4).
Direktno molekulsko konstruiranje virusa kurjih koz, ki izraža gpt-gen: Modelno kaseto za izražanje genov, ki obsega E. coli gpt-gen, smo konstruirali v plazmidu pN2-gpia, ki vsebuje gpt-gen, ki ga kontrolira zgodnji/pozni poksvirusni promotor, ob katerem leže bočno mesta Noti (sl. 1.3).
Za kloniranje v vektor f-TK2a izrežemo gpt-gensko kaseto iz njenega plazmida in jo ligiramo z genomsko DNA vektorja f-TK2a, cepljeno z Noti, kot je prikazano na sl.2.2. Ligirano DNA transfektiramo v celice CEF, okužene s pomožnim virusom kurjih koz. gpf-pozitivne plake, ki ostanejo beli pod nanešenim slojem, ki vsebuje X-Gal, analiziramo po okuženju fibroblastov piščančjih zarodkov še s Southernovim prenosom. Totalno celično DNA izoliramo in z ločenimi Noti fragmenti izvedemo Southernov prenos z DNA pomožnega virusa kurjih koz, (HP2) oznamovanimi s 32P in sekvencami gpi-gena, kot je opisano v primeru 1. gpf-pozitivni virusi, ki vsebujejo gpt-gen na 1.1 kb Noti fragmentu, kažejo, daje prišlo v stopnji kloniranja do pravilne ligacije.
Priprava modificiranih virusov z obema orientacijama vstavkov v eni stopnji konstruiranja: Pričujoči primer tudi ilustrira, kako lahko pridobimo z eno samo stopnjo direktnega molekulskega kloniranja viruse, ki imajo eno samo kopijo vstavljene genske kasete v katerikoli od obeh orientacij, kot tudi viruse, ki vsebujejo mnogoterne kopije vstavljenega gena. Orientacijo vstavka DNA v izbranih konstruiranih genomih kuijih koz določimo tako, da opravimo Southernov prenos DNA, razgrajenih s primernimi restrikcijskimi encimi. Kot kaže sl. 2.2, je lahko DNA, ki je vstavljena v virusno DNA, bodisi v a orientaciji, bodisi v b orientaciji. Za predhodne analize števila in orientacije vstavkov s to modelno gensko kaseto razgradimo npr. totalno DNA celic, okuženih z izbranimi plaki, z restrikcijskima endonukleazama Clal in Noti in ločimo na 0,8 %-nem agaroznem gelu. Prenešeni material hibridiziramo s sondo zgpf-genom in sondo z virusom kuijih koz.
V vzorcih DNA rekombinantnih virusov, ki je razgrajena z Noti, izrežemo gpf-kaseto kot 1.1 kb fragment. Cepitev DNA, ki imajo insert v a ali b orientaciji, s Clal, ima tudi za posledico različne karakteristične fragmente, ki hibridizirajo s sondo z gpf-genom, kot smo določili iz struktur, prikazanih na sl. 2.2.
PRIMER 3. Heterologno zapakiranje konstruirane genomske DNA ortopoksvirusa (virusa vakcinije) s pomožnim avipoks virusom (virusom kurjih koz) in kasnejšim izbiranjem rekombinantov v gostiteliskih celicah take species, v kateri se pomožni virus ne more podvajati
O heterolognem zapakiranju poksvirusne DNA, npr. zapakiranju ortopoksvirusne DNA z avipoksvirusom, še niso poročali. Vendar pa pričujoči primer dokazuje, da lahko in vivo zapakiranje ekstracelularno konstruirane DNA virusa vakcinije dosežemo z virusom kurjih koz v fibroblastih piščančjih zarodkov. Uporaba vektorskega virusa, ki ima drug krog gostiteljev, kot ga ima pomožni virus, nudi enostaven in učinkovit postopek za čiščenje konstruiranega virusa v eni stopnji plaknega testa. Tako smo v pričujočem primeru rekombinantni ortopoksvirus dobili s plaknim testom na sesalskih (CV-1) celicah, ki ne podpirajo popolnega podvajanja pomožnega avipoksvirusa. Vstavitev dominantnega selektivnega markeija v DNA, vstavljeno v vektor, ugodno olajša uporabo selektivnih pogojev plaknega testa za odstranitev virusov, ki obsegajo vektorsko DNA, ki nima želenega vstavka.
Druga ugodnost pristopa heterolognega zapakiranja je zmanjšana možnost za rekombinacijo med vektorskim in pomožnim virusom. Ortopoksvirusi in avipoksvirusi spadajo npr. v različna rodova, imajo različno morfologijo in različno sposobnost podvajanja in skupna jim je le minimalna homolognost sekvenc, kot dokazuje odsotnost navzkrižne hibridizacije pod standardnimi pogoji hibridizacije. Zato je homologna rekombinacija genomov avipoksvirusa in ortopoksvirusa skrajno malo verjetna in uporaba teh dveh virusov lahko praktično eliminira dogodke neželene rekombinacije, do katerih pride pogosto med homolognimi sekvencami zelo sorodnih virusov [Fenner & Comben, P7ro/ogy 5: 530-548 (1958); Fenner, Virology 8: 499-507 (1959)]. Alternativen način za preprečitev rekombinacije med vektorjem in pomočnikom med zapakiranjem je uporaba rekombinacijsko pomanjkljivih sevov virusov ali gostiteljskih celic.
V tem primeru smo modelno kaseto za izražanje, ki obsega markerski gen (E. coli gpi-gen, ki ga kontrolira poksvirusni promotor), ekstracelulamo vstavili v edino mesto Stnal DNA virusa vakcinije. Uporaba tega restrikcijskega encima za cepitev virusne DNA daje tope konce, ki jih lahko s pridom ligiramo na vstavke DNA s topimi konci, pripravljene s katerokoli drugo nukleazo, ki daje tope konce, ali npr. z uporabo polimeraze ali eksonukleaze, da nastanejo iz vstavka, ki ima enoverižne konce, topi konci.
Za zapakiranje smo konstruirano genomsko DNA transfektirali v gostiteljske celice, okužene z virusom kurjih koz, v katerih se lahko podvajajo tako virusi vakcinije kot tudi virusi kurjih koz (fibroblasti piščančjih zarodkov). Ker je krog gostiteljev pomožnega virusa kurjih koz omejen na ptičje celice, smo klone virusa vakcinije izbirali s plaknim čiščenjem potomstva iz transfektiranih celic na sesalskih gostiteljskih celicah (celice CV-1 ledvic afriške zelene opice). Istočasno izbiranje izražanja gptgena smo uporabili, da smo izolirali samo modificirane viruse vakcinije. V nasprotju z običajno metodo za pripravo poksvirusnih rekombinantov, kjer lahko v enem intracelulamem genetskem križanju običajno vstavimo samo eno kopijo tujega gena v eni sami orientaciji, smo v pričujočem primeru identificirali kot produkte ene same reakcije ekstracelulamega genomskega modificiranja obe možni orientaciji enega samega vstavka kot tudi dvojne vstavke modelne genske kasete.
Esperimentalni rezultati v pričujočem primeru kažejo, da je bila učinkovitost pakiranja ligiranih DNA virusa vakcinije s pomožnim virusom kurjih koz majhna v primerjavi s pakiranjem intaktne DNA virusa vakcinije z virusom kurjih koz, ki daje dobitke v območju od 5 χ 103 do 1 χ 104 pfu na 6 χ 106 fibroblastov piščančjih zarodkov po treh dneh podvajanja. V enem poskusu pakiranja, (ki daje plake, označene kot serija ”F12, spodaj), je znašal dobitek zapakiranega modificiranega virusa 9 χ 102 pfu, in v drugem poskusu (ki daje serijo F13), 5 χ 102 pfu na 6 χ 106 piščančjih celic. En glavni vzrok te sorazmerno nizke pogostnosti zapakiranja pri teh poskusih je odsotnost defosforilacijske obdelave krakov vektorske DNA, ki so bili zato sposobni, da so se učinkovito religirali brez vsakega vstavka. Tako obdelavo smo opustili, ker je defosforiliranje fragmentov DNA s topimi konci običajno neučinkovito. Ta problem lahko premagamo s konstruiranjem sevov gostiteljskega virusa, ki imajo mnogotema cepitvena mesta z lepljivimi konci, ki omogočajo usmerjeno (prisilno) kloniranje, kar napravi vstavljanje fragmentov tuje DNA mnogo učinkovitejše.
Drug faktor, ki vpliva na učinkovitost pakiranja, so motnje med pomožnim virusom in zapakiranim virusom na ravni celice. Pri standardnih pogojih pakiranja se v treh dneh inkubiranja pomožni virus (kurjih koz) običajno podvoji do titrov okoli 1 χ 108 pfu na 6 χ 106 fibroblastov piščančjih zarodkov. Veliki prebitek virusa kurjih koz v primerjavi z zapakiranim virusom vakcinije ustvari pogoje, ki povzročijo negativne pojave motenj in preprečujejo podvajanje zapakiranega virusa.
Te motnje do skrajnosti zmanjšamo z uporabo sesalskih celic za pakiranje v kombinaciji s pomožnim virusom kurjih koz, kot je opisano v primeru 7. V tem primeru gostiteljske celice ne podpirajo popolnega podvajanja pomožnega virusa kurjih koz. Čeprav v sesalski gostiteljski celici nismo opravili nobenega testiranja ligirane DNA virusa vakcinije glede učinkovitosti zapakiranja z virusom kurjih koz, smo dobili z nerazcepljeno DNA virusa vakcinije dobitek zapakiranja 2 χ 106 pfu na 8 χ 106 sesalskih (CV-1) celic.
V vsakem rekombinantnem virusu, dobljenem z intracelulamo rekombinacijo z danim insercijskim plazmidom, ima vstavek eno orientacijo, ki je odvisna od polarnosti homolognih bočnih področij v tem plazmidu. Zaradi pojavov motenj pri prepisovanju, glej npr. Ink & Pickup, 1989, so nivoji izražanja za gene, vstavljene v poksvirusni vektor, odvisni od orientacije tujega gena glede na virusni genom. Zato bi bilo zaželeno dobiti v eni reakcijski stopnji modificirane viruse, ki imajo katerokoli možno orientacijo. Ena od prednosti postopka v tem primeru je, da dobimo obe možni orientaciji vstavljene DNA v eni ligacijski reakciji, kar omogoča takojšen screening variant, ki imajo najvišje nivoje izražanja. Prednostna orientacija kasete iz tega primera v izbranem mestu za vstavljanje Smal virusa vakcinije je b orientacija, kot dokazuje dejstvo, daje imela večina modificiranih virusov to genomsko strukturo.
V tej kaseti je P7.5 promotor, ki kontrolira tuji gen, v orientaciji obrnjene ponovitve glede na endogeni gen 7.5 kDa polipeptida. Kot smo rekli v primeru 1, se nahajajo geni endogenega 7.5 kDa polipeptida v obrnjenih terminalnih ponovitvah genoma vakcinije. Razdalja med P7.5 promotoijem gpi-gena in P7.5 promotoijem v levi terminalni ponovitvi je okoli 20 kb. a orientacija naj bi bila zato manj stabilna in naj bi jo dobili manj pogosto, kar se sklada z opažanjem, da smo to orientacijo našli samo dvakrat. Vendar pa smo virusna izolata F13.4 (orientacija a) in vF12.5 (orientacija b) z ^pf-selekcijo namnožili do velikega merila in ugotovili smo, da imata stabilne napovedane strukture. Stabilnost različnih struktur, ki obsegajo mnogoteme vstavke brez selekcije, bo treba šele določiti.
Ligacijske zmesi so vsebovale večkraten prebitek vstavkov glede na vektor, kar je pomagalo vstavljanju mnogotemih kopij kasete, ki smo ga opazili. Vendar pa ni jasno, zakaj so bili v tem primeru dvojni vstavki pogostejši kot v primeru 1. Zaradi dogodkov notranje rekombinacije je pričakovati, da bodo stabilne samo nekatere konfiguracije mnogoternih vstavkov. Nadaljnje študije za oceno stabilosti virusov z mnogotemimi vstavki in optimalnega razmerja med vektorjem in vstavkom za stabilnost in nivo izražanja, ki je odvisno od števila kopij, lahko po potrebi izvedemo za vsak konstrukt v skladu z naukom te prijave.
Čiščenje virusa in DNA: Uporabili smo viruse in postopke iz primerov 1 in 2.
Konstruiranje virusne DNA: Virusno DNA, očiščeno virionov, smo cepili s Smal in očistili z eno ekstrakcijo s fenolom in tremi ekstrakcijami s kloroformom. V prvem poskusu niže smo 2 /ig cepljene virusne DNA ligirali s 400 ng (34-kratni molski prebitek) vstavka fragmenta (1.1 kb Hpal-Dral fragment, izrezan iz plazmida pTKgpt-Fls) v volumnu 30 μΐ 40 h s 15 enotami T4 ligaze (Boehringer, Inc.). Drugi poskus ligiranja smo izvedli pod enakimi pogoji, le da smo uporabili sedemnajstkraten molski prebitek 1.1 kb vstavka Smal in 5 enot ligaze.
In vivo heterologno zapakiranje v ptičje celice: Fibroblasti piščančjih zarodkov (6xl06), okuženi s pomožnim virusom (0,5 pfu/celico HP1.441) in inkubirani 2 h. 2 ^g ligirane DNA smo transfektirali v okužene celice in obdelali dalje, kot je opisano za postopek homolognega pakiranja v primeru 1. Začetni plakni test smo izvedli v celicah CV-1, kot je opisano v primeru 1.
Dokaz zapakirania DNA modificiranega virusa vakcinije s pomožnim virusom kurjih koz: Načrt tega poskusa kaže slika 3.1. Genomsko DNA virusa vakcinije smo pripravili iz virionov, očiščenih z gradientom saharoze, razrezali z restrikcijsko endonukleazo Smal in ligirali s kaseto tujega gena s topimi konci. Za pakiranje smo ligirano DNA transfektirali v fibroblaste piščančjih zarodkov, okužene z virusom kurjih koz. Razmnoženi virus smo identificirali s plaknim testom na sesalskih celicah (CV-1), ki ne podpirajo popolnega podvajanja virusa kurjih koz, da bi nastali kužni virioni.
Bolj podrobno, najprej smo Hpal-Dral fragihent, ki nosi modelno gensko kaseto (ki vsebuje gpi-gen, ki ga kontrolira p7.5 promotor virusa vakcinije) izrezali iz plazmida pTKgpt-Fls (Falkner & Moss, 1988) in ligirali direktno v edino mesto Smal divjetipskega virusa vakcinije (sev WR),gpi-gen smo izbrali, da smo omogočili pozitivno izbiranje modificiranih virusov (Boyle & Coupar, 1988; Falkner & Moss, 1988). Edino mesto Smal v DNA virusa vakcinije se nahaja v odprtem bralnem okviru A51R v Hindlll A fragmentu genoma. Gen za A51R je nebistven za virusno podvajanje v celični kulturi (Goebel et al., 1990).
Ligirani material smo transfektirali v fibroblaste piščančjih zarodkov, okužene s pomožnim virusom kuijih koz. Po treh dneh smo celice zbrali in pripravili surovi virusni material. Zapakirani virus vakcinije smo identificirali s plaknim testom na celični liniji (CV-1) ledvic afriške zelene opice v mediju, ki izbira celice, okužene z virusom, ki nosi gpf-gen. Ta shema izbiranja prepreči virusom, ki vsebujejo avtoligirano DNA divjetipskega virusa vakcinije, da bi tvorili plake, modificiranim virusom, ki vsebujejo vstavljeno modelno gpi-gensko kaseto, pa to dovoljuje.
V začetnih poskusih je bila pogostnost zapakiranja majhna. Titer gpi-pozitivnega virusa vakcinije v surovem materialu, pripravljenem iz 6xl06 fibroblastov piščančjih zarodkov, je bil v območju od 1 χ 102 do 1 χ 103 pfu.
gpi-pozitivnih plakov smo pomnožili pod izbiranjem zgpt v celicah CV-1. Totalno DNA okuženih celic smo izolirali, razgradili s Hindlll, ločili na 0,7%-nem agaroznem gelu in dalje predelali za analizo s Southernovimi prenosi s sondo gpZ-gena. Kot kaže slika 3.2, smo dobili več virusov, ki smo imeli vzorce prenosov, napovedane za različne modificirane genomske strukture.
V progah 2, 4, 11 in 13 (ki ustrezajo plakom #F12.3, F12.5, F13.3 in F13.5), je viden en sam hibridizirajoči fragment z okoli 45 kb, ki ga pričakujemo, če je ena kopija genske kasete vstavljena v virusni genom v b orientaciji (glej sliko 3.3). V vseh primerih je prisoten tudi pričakovan nov fragment s 5.2 kb, in pojavlja se tudi, če testiramo iste DNA kot v sliki 3.2 ob uporabi sonde z virusom vakcinije.
V progah 7 in 12 (ki ustrezata plakoma #F12.8 in F13.4), kjer pričakujemo en sam, z gpt hibridizirajoči fragment z okoli 5.7 kb, smo dobili dva virusa, ki sta imela vzorca, ki se ujemata z a orientacijo. 5.7 kb fragment v progi 7 je bolj viden pri daljših ekspozicijah avtoradiografa. Vzorec, ki ga vidimo v progi 5 (plak F12.6) lahko predstavlja enojni vstavek v a orientaciji, vendar pa je iz neznanih razlogov pričakovani trak s 5.7 kb nekoliko širši.
Vzorec treh virusnih izolatov se ujema s tandemskim vstavkom v a orientaciji (proge 1, 6 in 10, ki ustrezajo plakom #F12.2, F12.7 in F13.2). V teh primerih pričakujemo dva gpt-pozitivna hibridizirajoča fragmenta s 5.7 in 1.1 kb (glej tudi sliko 3.3). Fragmente s 5.7 in 1.1 kb smo opazili tudi v ekvimolskih množinah z virusno DNA v prenosu, hibridiziranem s sondo virusa vakcinije.
Genom izolata v progi 3 (plak F12.4) vsebuje verjetno tandemski dvojni vstavek v b orientaciji. V tem primeru pričakujemo, da bosta dva fragmenta s 45 kb in 1.1 kb hibridizirala zgpt-genom.
Virusna DNA v progi 9 (plak F13.1) lahko obsega dvojni-vstavek s sprednjima koncema skupaj. V tem primeru pričakujemo fragment s 45 kb in fragment s 5.7 kb, ki hibridizirata s sondo gpt-gena. Vendar pa naj bi taka DNA vsebovala tudi nov 0,6 kb fragment, ki hibridizira s sondo DNA vakcinije, in ta fragment smo dejansko našli na prenosu, hibridiziranem s sondo vakcinije. Navzlic temu je bil pričakovani 5.7 kb fragment nekoliko manjši kot napovedani in je dal hibridizacijski signal, ki je bil šibkejši, kot smo pričakovali. Zato zahteva potrditev strukture tega rekombinanta podrobnejšo analizo.
Nadaljnja analiza je pokazala, da imata virusa F12.7 in F12.3, za katera smo zgoraj rekli, da imata dvojne vstavke s tandemskimi a strukturami, in virus F12.4, za katerega smo zgoraj rekli, da ima dvojne vstavke s tandemskimi b strukturami, dejansko mnogoteme tandemske vstavke z a oz. b orientacijama. Analiza Southemovega prenosa na sliki 3.2 ne razlikuje med dvojnimi tandemskimi in mnogoternimi tandemskimi vstavki.
PRIMER 4 Konstruiranje vektorja (vdTK) ortopoksvirusa (vakcinije) z usmerjevalnim glavnim mestom za kloniranje in plazmidov s kompatibilnimi kasetami za izražanje
Ta primer dokazuje uporabo postopkov v smislu pričujočega izuma za ustvarjanje novih poksvirusnih vektorjev za kloniranje z direktno molekulsko modifikacijo in kloniranjem obstoječih poksvirusnih genomov. Podrobno opisuje ta primer vektor (vdTK) virusa vakcinije, ki omogoča usmerjeno vstavljanje (t.j. prisilno kloniranje) tujih genov v kratek segment mnogoternega mesta za kloniranje, ki sestoji iz več različnih cepitvenih mest za endonukleazo, od katerih je vsako edino v genomu vektorja. Prisilno kloniranje odpravi potrebo po postopkih za izbiranje ali screening za razlikovanje med želenimi rekombinanti in vektorskim virusom, ki mu manjka vstavek, ker inkompatibilnost koncev DNA, cepljene z različnimi nukleazami, preprečuje ponovno ligiranje vektorskih krakov brez tujega vstavka. Zato je način dela s prisilnim kloniranjem najučinkovitejši način za vstavitev tujega gena v virusni vektor.
Usmerjevalni vektor vdTK ustvarimo tako, da vstavimo mnogoterno mesto za kloniranje (ki obsega edina mesta Noti, Smal, Apal in RsrlT) namesto gena timidin kinaze (tk) virusa vakcinije (glej sliko 4.1A). Ta nebistveni lokus je mesto, ki se najpogosteje uporablja za vstavljanje tujih genov v virus vakcinije, v glavnem zaradi tega, ker je na razpolago pozitivno izbiranje tk-negativnih virusov. Zato lahko, če DNA ligiranega vektorja vdTK zapakira tk-pozitiven pomožni virus, vektorski virus pozitivno odberemo od prebitka pomožnega virusa. Dalje ima vstavitev tuje DNA v tk-lokus virusa vakcinije z običajnimi metodami na splošno za posledico stabilne rekombinante.
Mnogoterno mesto za kloniranje novega vektorja vdTK obsega cepitveni mesti Noti in Smal, ki sta edini v vektorju. Pred vstavljanjem mnogoternega mesta za kloniranje odstranimo cepitveni mesti Noti in Smal, ki sta obstajali že prej v divjetipskem virusu vakcinije (sev WR), z direktnimi molekulskimi modifikacijami v skladu s pričujočim izumom. Prisotnost virusov, ki imajo želene modifikacije, ugotovimo s tehnikami screeninga, ki temelje na metodi verižne polimerazne reakcije (PCR) za pomnoževanje specifičnih sekvenc nukleinske kisline.
Ta primer opisuje tudi niz plazmidov, ki olajšajo izražanje tistih DNA, ki kodirajo popolne ali delne odprte bralne okvire v vektorju vdTK vakcinije. Pričujoči izum ob61 sega vstavljanje odprtih bralnih okvirov direktno v poksvirusni vektor za izražanje, ki ima vse ustrezne regulatorne elemente^ primerno nameščene za izražanje vstavljenega odprtega bralnega okvira. Vendar pa tale vektor vdTK ni opremljen s takimi regulatomimi sekvencami za izražanje vstavljenega odprtega bralnega okvira, ki nima svojih lastnih signalov za prepisovanje in prevajanje. Zato nudijo plazmidi iz tega primera prikladne kasete za izražanje genov za rutinsko povezovanje odprtih bralnih okvirov s poksvirusnimi promotorji in v danem primeru s startnim kodonom za prevajanje. Odprt bralni okvir in z njim povezane regulatorne sekvence nato s prisilnim kloniranjem učinkovito prenesemo v glavno mesto za kloniranje vektorja vdTK Modificirane viruse, ki imajo vstavek v katerikoli orientaciji, lahko dobimo tako, da uporabimo enega od obeh plazmidov, ki ima kaseto za izražanje v želeni orientaciji znotraj svojega glavnega mesta za kloniranje. Kasete za izražanje genov tukaj s primeri ponazorjenih plazmidov imajo dva vsajena niza cepitvenih mest za restrikcijske encime, da bi olajšali kloniranje odprtih bralnih okvirov v vektor vdTK. Kasete imajo glavno mesto za kloniranje, ki obsega ista edina mesta kot glavno mesto za kloniranje vektorja vdTK. Poleg tega vsebujejo v sredi tega glavnega mesta za kloniranje kasete različna mesta za encime, ki pogosto strižejo, ki so uporabna za vstavljanje odprtih bralnih okvirov v kasete. Zato ležijo ob DNA, ki so vstavljene v kaseto s pomočjo mest za encime, ki pogosto strižejo, bočno na obeh straneh različna edina mesta, ki so primerna za prisilno kloniranje kasete v glavno mesto za kloniranje vektorja vdTK.
Ta primer opisuje tudi kasete za izražanje genov, primerne za vstavljanje v eno samo edino mesto v vektorju vdTK virusa vakcinije. Da bi premagali zmanjšano učinkovitost kloniranja pri uporabi enega samega encima za cepitev vektorske DNA, vključujejo kasete za izražanje teh plazmidov kot selektiven marker E. coli gpt-gen.
Sistem vektorja vdTK vakcinije uporabljamo prednostno v povezavi s postopkom za heterologno zapakiranje, opisanim v primerih 3 in 7. Plazmide, ki vsebujejo gptmarker, lahko uporabimo tudi s homolognim pomožnim virusom, ki nima gptmarkerja. Primeri konstruktov za izražanje polipeptidov ob uporabi vektorja vdTK in sorodnega plazmidnega sistema so prikazani niže v primeru 5.
Poleg gornjih prednosti nudijo plazmidi kaset za izražanje v smislu izuma tudi sredstvo za premagovanje splošnega problema inkompatibilnosti med konci cepljenih DNA poksvirusnega vektorja in mnogimi vstavljenimi DNA kot prikladno alternativo običajni uporabi segmentov DNA sintetičnega adaptorja. Zato je izolacija fragmentov DNA, ki kodirajo odprte bralne okvire, običajno olajšana z uporabo restrikcijskih endonukleaz s sekvencami za prepoznavanje, ki so kratke in se zato naključno pojavljajo z veliko pogostnostjo v vseh naravnih sekvencah DNA. Po drugi plati pa taki encimi, ki pogosto strižejo, na splošno niso primerni za učinkovito direktno kloniranje v genome, ki so tako veliki, kot so npr. genomi poksvirusov, ker cepijo taki encimi velike DNA v mnogo fragmentov. Do ponovnega ligiranja teh fragmentov bi prišlo v naključnem zaporedju, pri čemer bi nastalo malo intaktnih virusnih genomov. Zato so mesta za vstavljanje v vektorju vakcinije prednostno cepitvena mesta restrikcijskih endonukleaz, ki ne strižejo pogosto, za katere ni veijetno, da bi jih uporabili za izolacijo fragmentov odprtih bralnih okvirov ali vstavljenih DNA na splošno. Pričujoči plazmidi premagajo to splošno inkompatibilnost tako, da omogočijo učinkovito vstavljanje fragmentov iz encimov, ki pogosto strižejo, v plazmid, čemur sledi učinkovit prenos v vektor vakcinije ob uporabi encimov, ki ne strižejo pogosto.
Delecija edinega cepitvenega mesta Noti iz divjetipskega virusa vakcinije (WR):
Edino mesto Noti virusa vakcinije lahko odstranimo tako, da vstavimo v to mesto segment adaptorja za delecijo Noti, ki ima kohezivna konca, ki sta kompatibilna za ligacijo z DNA, razcepljeno z Noti, ki pa nima sekvenc, ki so potrebne zato, da jih prepozna endonukleaza Noti. Zato sekvenc, ki jih tvorijo ligirani kohezivni konci virusne DNA, razcepljene z Noti, in virusna DNA in adaptor, Noti ne more cepiti. Ta adaptor vsebuje tudi več izbranih cepitvenih mest za restrikcijske endonukleaze za direktno vstavljanje fragmentov DNA.
Podrobneje, 1 μ% divjetipske DNA virusa vakcinije WR razrežemo z Noti in ligiramo z 1 μ-g dvoverižnega adaptorja za delecijo Noti. Adaptor sestoji iz dveh delno komplementarnih verig: odNl (SEQ. ID. NO. 16) IN odN2 (SEQ. ID. NO. 23). Osrednji del adaptoija vsebuje cepitvena mesta za restrikcijske endonukleaze Stul, Dral, Sspl in £coRV. Za reakcijo ligacije uporabimo spojene adaptorske oligonukleotide. Ligirani material transfektiramo v fibroblaste piščančjih zarodkov, okužene z virusom kurjih koz, in zapakiramo, kot je opisano v primeru 3.
Alternativen postopek za delecijo edinega mesta Noti virusa vakcinije (sev WR) je prikazan na sliki 4.1, list B. V prvi stopnji razrežemo DNA virusa vakcinije s SacI, Sad I fragment izoliramo iz agaroze z nizkim tališčem in kloniramo v mesto Sad primernega plazmida, kot je pTZ19R (ki se ga dobiti od firme Pharmacia, Inc.). Nastali plazmid, pTZ-SacI, razrežemo z Noti, obdelamo s Klenowo polimerazo, da zapolnimo lepljive konce, in ponovno ligiramo. Ligirani material transfektiramo v celice E. coli (HB101). Kolonije izoliraino v skladu s standardnimi postopki kloniranja. Nastali plazmid, pTZ-SacIdN, ima mesto Noti odstranjeno z delecijo, in uporabimo ga v poskusu reverznega izbiranja z gpt, kot opisujejo Isaacs, S.N.. Kotwal, G. & Moss B. Virology 178: 626-630 (1990), modificiranem takole:
Celice CV-1 (8x 106) okužimo z 0,2 pfu virusnega izolata vp7, virusa vakcinije, ki je vključil v edino mesto Noti gpi-gensko kaseto (glej primer 1). Nato transfektiramo v celice oborino kalcijevega fosfata, ki vsebuje 20 gg DNA iz modificiranega Sad fragmenta, pripravljenega iz plazmida pTZ-SacIdn. Celice dalje obdelamo, kot je opisano v postopku za pakiranje v primeru 1. Surovi virusni material uporabimo za okuženje mišjih celic STO (dobljenih od American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC# CRL 1503) v prisotnosti 6-tiogvanina (6-TG). To je postopek negativnega izbiranja, ki zahteva, da virus izgubi gpt-gcn, če naj bi se podvajal (Isaacs et al., 1990) in zato vodi v tem primeru do vključitve modificiranega Sad I fragmenta in s tem do delecije gpf-gena. Vsi plaki, ki rastejo v prisotnosti 6-TG, naj ne bi imeli gpf-gena in naj bi vsebovali modificiran Sad I fragment. Ocenjeni dobitek je v območju od 0,1 do 0,2% vseh plakov (t.j. normalna pogostnost rekombinantov pri tovrstnih poskusih reševanja markerja). Ker je postopek izbiranja nadvse učinkovit (Isaacs et al., 1990), ne pričakujemo, da bi identifikacija pravilnih struktur zahtevala preiskavo velikega števila klonov. Vendar lahko, če uporabimo prvi postopek zgoraj ali ta alternativni postopek za delecijo edinega mesta Noti virusa vakcinije, uporabimo za identifikacijo želenega konstrukta naslednji postopek screeninga.
Identifikacija virusa (vdN), ki ima mesto Noti odstranjeno z delecijo, s screeningom s
PCR: Klone virusa vakcinije, ki imajo mesto Noti odstranjeno z delecijo, lahko identificiramo z analizo plakov, ki rastejo v celični liniji (CV-1), ki ne podpira rasti pomožnega virusa kuijih koz. DNA virusov v posameznih plakih analiziramo z metodo screeninga, ki temelji na PCR, takole.
Prvi primer za PCR reakcijo je oligonukleotid odNl, (SEQ. ID. NO. 16), in drugi primer je bil odN3 (SEQ. ID. NO. 24). Sekvenca drugega primerja se nahaja v genomu virusa vakcinije okoli 770 bp navzdolno od sekvence prvega primerja. Osnova je totalna DNA iz 1 χ 106 celic CV-1, okuženih s polovico virusa iz enega samega plaka. DNA pripravimo s standardnimi tehnikami in za PCR-reakcijo uporabimo okoli 50 ng. PCR-reakcije izvedemo v skladu s standardnimi tehnikami ob uporabi komercialno dostopnih kompletov za PCR. Pozitivne PCR-reakcije dajo fragment DNA z okoli 770 bp. Tak virus, iz katerega je odstranjeno mesto Noti, označujemo kot vdN.
Delecija edinega restrikciiskega mesta Smal iz virusa vakcinije vdN: Sev WR virusa vakcinije vsebuje eno samo mesto Smal v odprtem bralnem okviru (A51R), ki ni bistveno za podvajanje virusa v celičnih kulturah (Goebel et al., 1990). Čeprav lahko to mesto uporabimo za vstavljanje tujih genov, pa je v tukajšnjem primeru to mesto odstranjeno v korist tvorbe bolj vsestranskega vektorja virusa vakcinije z uvedbo novega edinega mesta Smal kot dela kasete z mnogotemim mestom za kloniranje.
Zato razrežemo DNA (1 pg) virusa vdN s Smal in ligiramo s prebitkom heksamernega linkeija, ki ima sekvenco, ki prepozna restrikcijsko nukleazo Hindlll (odSl, 5’AAGCTT-3’). Vstavitev tega linkeija v cepitveno mesto Smal virusa vakcinije ima za posledico uničenje sekvence za prepoznavanje Smal in uvedbo nove sekvence za prepoznavanje Hindlll. Ligirani material zapakiramo s transfekcijo v celice cva, ki so bile okužene z virusom kurjih koz, kot je opisano v primeru 7.
Alternativno odstranimo edino mesto Smal virusa vakcinije (sev WL) v skladu s postopkom, prikazanim v sliki 4.1, list C, tako, da modificiramo klonirani fragment DNA virusa vakcinije, namesto da bi direktno modificirali popolno DNA virusa vakcinije. V prvi stopnji razrežemo DNA virusa vakcinije s Sall, Sall F-fragment izoliramo iz agaroze z nizkim tališčem in kloniramo v mesto Sall primernega plazmida, kot je pTZ9R (ki se ga da dobiti od firme Pharmacia, Inc.). Nastali plazmid, pTZ-SalF, ima dve mesti Smal, eno v mnogoternem mestu za kloniranje in drugo v sekvencah vakcinije (slika 4.1, list C). pTZ-SalF delno razgradimo s Smal in dodamo I-Scel linkerje na tale način: prva veriga, I-Scel linker 1 (SEQ. ID. NO. 25) in njegova komplementarna veriga, I-Scel linker 2 (SEQ. ID. NO. 26). Pravilni plazmid, ki ima mesto Smal izbrisano iz sekvenc vakcinije, identificiramo s cepitvijo s Smal in 1-Scel. Končni plazmid, pTZ-SalFdS, uporabimo, da uvedemo delecijo Smal v genom virusa vakcinije ob uporabi poskusa reverzne selekcije gpt-gena, kot je opisano za delecijo mesta Noti, le da je prednostni virus, ki naj bi ga modificirali, izolat F12.5, virus, ki je vključil v edino mesto Smal gpt-gensko kaseto (glej primer 3).
Nastala vstavitev mesta za endonukleazo I-Scel je ugodna za direktno molekulsko kloniranje, ker ta encim, izoliran iz kvasovk, prepozna 18-merno mesto in zato nadvse redko reže naključne sekvence DNA. Npr., 1-Scel reže genom kvasovk samo enkrat. Thierry, A., Perrin, A., Boyer, J., Fairhead, C., Dujon, B., Frey, B. & Schmitz,
G. Nucleic Acids Res. 19: 189-190 (1991). I-Scel je komercialno dosegljiv pri firmi Boehringer, Inc. S pridom uvedemo mesto I-Scel v vektor, ki nima nobenega že prej obstoječega mesta za ta encim, s čimer ustvarimo nov vektor z enim samim mestom, ki ga lahko uporabimo za vstavljanje genov. Ali vsebuje DNA virusa vakcinije ali druga vektorska DNA mesto za cepitev z I-Scel, lahko določimo z rutinskimi restrikcijskimi analizami vektorske DNA.
Kjer uporabimo ta alternativni postopek za delecijo mesta Smal, iz DNA virusa vakcinije je zaporedje stopenj za konstruiranje vektorja vdTK takole: delecija mesta Smal, ki da virus vdS (glej zgoraj); delecija mesta Noti z vstavitvijo Noti gpt-genske kasete (glej primer 1) v edino mesto Noti virusa vdS s kloniranjem in zapakiranjem, ki da virus vdSNgpt, in reverzna ,gpi-selekcija, kot je opisano zgoraj, ob uporabi vdSNgpt in pTZ-SacIdN kot substratov za poskus reševanja markerja, in delecija tkgena, kot je opisano niže v tem primeru.
Alternativen postopek, s katerim smo dejansko konstruirali vektor vdTK, je bil takle. Mesto Smal divjetipskega virusa vakcinije smo izbrisali, s čimer smo ustvarili intermediami virus vdS. V drugem poskusu smo mesto Noti izbrisali iz divjetipskega virusa vakcinije, s čemer smo ustvarili intermediarni virus vdN. Virus vdSN smo dobili s sookuženjem ob uporabi obeh virusov celic CV-1 in PCR-screeningom rekombinantnega virusa (ki smo ga ustvarili z enostavnim dogodkom genetskega križanja). Sposobnost različnih intermediatov za življenje smo določili s titracijami.
Tabela 4.1 A kaže rezultate, potem ko smo posamezne izolate iz poskusov kloniranja vdN petkrat plakno očistili (da smo zagotovili, da smo dobili klone, ki niso vsebovali divjetipskega virusa) in nato pomnožili. Po titraciji smo uporabili surovi virusni material iz prvega pomnoževanja skupaj z divjetipsko kontrolo (WR-WT), da smo okužili celice CV-1 z 0,1 pfu/celico. Te celice smo zbrali po 48 h in jih uporabili za pripravo surovega materiala, ki smo ga ponovno titrirali. Ti rezultati so prikazani v tabeli 4.1 B. Izolata vdN/Al #6.1111 in vdN/Al #10.1111 smo označili kot klona vdN#6 oz. vdN#10, in uporabili za pripravo virusov v velikem merilu.
Tabela 4.2 A kaže rezultate potem, ko smo posamezne izolate poskusa kloniranja vdS petkrat plakno očistili in nato pomnožili in titrirali. Surovi material iz prvega pomnoževanja smo skupaj z divjetipsko kontrolo (WR-WT) uporabili, da smo okužili celice CV-1 z 0,1 pfu/celico. Celice smo zbrali po 48 h in dobljeni surovi material ponovno titrirali. Ti rezultati so prikazani na sliki 4.2 B. Izolata vdS# 7.11 smo označili kot klona vdS#2 oz. vdS#7 in uporabili za pripravo virusov v velikem merilu. V vsakem primeru smo izolat virusa, ki je 'pokazal najboljše rastne karakteristike, izbrali za to, da smo ga pomnožili in gojili do velikega merila.
TABELA 4.1
Preiskava sposobnosti virusnega intermediata vdN za življenje
A) Titer po prvem pomnoževanju šestih virusnih izolatov vdN (pfu/ml surovega materiala):
vdN/Al# 2.1111 1.0 x 107 pfu/ml
vdN/Al# 4.1111 1.3 x 108 pfu/ml
vdN/Al# 6.1111 9.0 xl07 pfu/ml
vdN/Al# 8.1111 8.0 x 107 pfu/ml
vdN/Al# 10.1111 4.0 x 107 pfu/ml
vdN/Al# 12.1111 1.1 x 108 pfu/ml
B) Titer po drugem pomnoževanju
vdN/Al# 2.1111 3.6 x 108 pfu/ml
vdN/Al# 4.1111 2.5 x 108 pfu/ml
vdN/Al# 6.1111 5.9x10® pfu/ml
vdN/Al# 8.1111 4.2 x 108 pfu/ml
vdN/Al# 10.1111 4.3 x 108 pfu/ml
vdN/Al# 12.1111 2.2 x 108 pfu/ml
WR-WT 5.4 x 108 pfu/ml
TABELA 4.2
Preiskava sposobnosti virusnih intermediatov vdS za življenje
A) Titer po prvem pomnoževanju petih virusnih izolatov vdS (pfu/ml surovega materiala):
vdS# 2.11 4.1 x 107 pfu/ml
vdS# 3.11 6.5 x 107 pfu/ml
vdS# 4.11 8.0 x 107 pfu/ml
vdS# 5.11 2.7 x 107 pfu/ml
vdS# 7.11 4.7 x 107 pfu/ml
B) Titer po drugem pomnoževanju
vdS# 2.11 1.6 x 108 pfu/ml
vdS# 3.11 1.4 x 108 pfu/ml
vdS# 4.11 8.0 x 107 pfu/ml
vdS# 5.11 1.3 x 108 pfu/ml
vdS# 7.11 1.7 x 108 pfu/ml
WR-WT 2.8 x 108 pfu/ml
Identifikacija virusa fvdSN), ki ima mesto Smal izbrisano, s screeningom s PCR:
Klon virusa vakcinije, v katerih je mesto Smal izbrisano, identificiramo s screeningom s PCR takole.
Prvi primer za PCR-reakcijo je oligonukleotid odS2 (SEQ. ID. NO. 27) in drugi primer oligonukleotid odS3 (SEQ. ID. NO. 28). Sekvenca oligonukleotida odS2 se nahaja v genomu vakcinije okoli 340 bp navzgorno od mesta Smal, medtem ko se sekvenca oligonukleotida odS3 nahaja okoli 340 bp navzdolno od tega mesta. Osnova je totalna DNA celic CV-1, okuženih s plakom virusa, kot je opisano zgoraj za identifikacijo vdN. S PCR-pomnoženi trak z okoli 680 bp testiramo na občutljivost na Smal, pri čemer kaže odpor proti cepitvi s Smal na vstavek Hmdlll ali I-Scel linkerja, medtem ko razreže DNA divjetipske kontrole v dva kosa s po okoli 340 bp. Virus vakcinije, ki ima želeni vstavek linkerja v mestu Smal, označujemo kot vdSN.
Delecija področja za kodiranje gena timidin kinaze iz virusa vakcinije vdSN: Iz virusa vakcinije vdSN razvijemo nov vektorski sev (označen kot vdTK) tako, da nadomestimo gen timidin kinaze (tk), ki se nahaja v genetsko stabilnem področju genoma vakcinije, s segmentom, ki obsega več edinih cepitvenih mest za restrikcijsko endonukleazo (slika 4.1A).
Iz plazmida (pHindJ-1), ki obsega segment genoma vakcinije (HindlU J segment), v katerem se nahaja tk-gen, najprej izbrišemo sekvenco, ki kodira timidin kinazo (tk) (glej sliko 4.2). Namesto tk-gena nato vstavimo mnogoterno mesto za kloniranje z edinimi mesti Noti, Smal, Apal in Rsrll, ob katerem leže bočno mesta Sfil. Končno prenesemo segment modificiranega virusa v genom virusa-vakcinije vdSN, ki smo ga nato označili kot vdTK (slika 4.1A). Da bi še bolj olajšali prisilno kloniranje, lahko vsako od dveh mest Sfil tudi napravimo edino v vektorju s tem, da izrabimo spremenljivi značaj sekvence za prepoznavanje Sfil (GGCCNNNN’NGGCC). Sekvenci obeh mest Sfil sta taki-le: 5/žI(l), GGCCGGCT’AGGCC (SEQ. ID. NO. 29) in 5/71(2), GGCCATAT’AGGCC (SEQ. ID. NO. 30). Ta plazmid, ki vsebuje končno modifikacijo tk-gena (pHindJ-3), konstruiramo iz prekurzorskega plazmida pHindJ1Z izločitveno (loop-out) mutagenezo in delecijo tk-gena potrdimo z analizo sekvenc.
Konstruiranje prekurzorskega plazmida pHindJ-1: DNA divjetipskega virusa vakcinije smo razrezali s HindlU in nastale fragmente ločili na 0,8%-nem agaroznem gelu z nizkim tališčem. HindlU J fragment smo izrezali pod UV-svetlobo in pripravili v skladu s standardnimi tehnikami. Fragment smo vstavili v edino mesto HindlU plazmida pTZ19R (Pharmacia, Inc.) in dobili pHindJ-1.
Konstruiranje plazmida pHindJ-2: Plazmid pHindJ-1 transfektiramo v E. coli, sev NM522, in enoverižno DNA pripravimo s superinfekcijo s pomožnim fagom M13K07 v skladu s protokolom, ki ga je dobavila firma Pharmacia. Enoverižna DNA rabi kot osnova za mestno usmerjeno mutagenezo s primerjem odTKl (SEQ. ID. NO. 31). Ta primer je komplementaren s področjem promotorja in področjem okoli prevajalnega stop kodona tk-gena. V svojem osrednjem delu vsebuje edina restrikcijska mesta BamHl, Hpal, Nrul in FcoRI. Postopek mutageneze izvedemo s kompletom za mutagenezo, ki ga dobavlja firma Amersham, Inc., v skladu s priročnikom, ki ga dobavlja dobavitelj.
Za konstrukcijo plazmida pHindJ-2 je bila sekvenca tk-gena opisana v Weir J.P. & Moss B. J. Virol. 46: 530-537 (1983). Sekvenca tk-gena je dostopna v EMBL Data Library pod oznako (ID) PVHINLJ. Sekvenco vektorskega dela (pTZ19R) plazmida se da dobiti pri firmi Pharmacia, Inc. Sekvenca okoli izbrisanega gena timidin kinaze (tk) virusa vakcinije v plazmidu pHindJ-2 je prikazana v (SEQ. ID. NO. 4). 5’področju tk-gena (baze #1-19 v tukajšnjem seznamu, baze #4543-#4561 v ID PVHINLJ) slede edina restrikcijska mesta JEtamHI, Hpal, Nrul in EcoRI in 3’področje tk-gena (baze # 44-#67 v tukajšnjem seznamu; baze #5119-#5142 v ID PVHINLJ). Baze # 4562 do 5118 v ID PVHINLJ, ki vsebujejo del tk-promotorja in področje za kodiranje tk-gena, so v pHindJ-2 izbrisane.
Konstruiranje plazmida pHindJ-3: Plazmid pHindJ-2 razgradimo z BamHI in EcoRI in vstavimo dvoverižni linker, ki vsebuje edina restrikcijska mesta Noti, Smal, Rsrll in ob katerih leže bočno mesta Sfil. Linker sestoji iz oligonukleotidov P-J(l) (SEQ. ID. NO. 32) in P-J(2) (SEQ. ID. NO. 33).
Modificirana sekvenca plazmida pHindJ-3 je prikazana v SEQ. ID. NO.5. Vstavljeno mnogotemo mesto za kloniranje ustreza oligonukleotidu P-J(l). Vstavljena sekvenca se začne na položaju 21 in konča na položaju 99. Bočne sekvence so iste, kot je opisano zgoraj v pHindJ-2.
Da vstavimo v virus vakcinije delecijo tk, razgradimo plazmid pHindJ-3 s Hindlll in skrajšan Hindlll J fragment, ki ima izbrisan tk-gen, uporabimo za eksperiment reševanja markerja, kot opisujeta Sam in Dumbell, 1981. Viruse, ki imajo tk-gen izbrisan, izoliramo s tk-negativno selekcijo (Mackett et al., 1982) in identificiramo s kasnejšim screeningom s PCR.
Natančneje, modificirani Hindlll fragment, prisoten v pHindJ-3, izrežemo s Hindlll in izoliramo z agaroznim gelom z nizkim tališčem. Reševanje markerja izvedemo v bistvu tako, kot opisujeta Sam in Dumbell (1981) s temi-le spremembami. 5 χ 106 celic CV-1 okužimo z 0,2 pfu na celico virusa vakcinije vdSN. Po enourni inkubaciji transfektiramo v okužene celice 1 ml oborine kalcijevega fosfata, ki vsebuje 1 pg modificiranega Hindlll J fragmenta. Po dvodnevnem gojenju pripravimo surovi virusni material tako, kot je opisano v primeru 1, in titriramo na humanih 143B tk70 negativnih celicah v prisotnosti bromodeoksi-uridina (BrdU), kot so opisali Mackett al al., 1982. Tk-negativne plake lahko dalje analiziramo s screeningom s PCR.
Identifikacija virusa (vdTK) z izbrisano timidin kinazo s screeningom s PCR: Prvi primer za PCR-reakcijo je oligonukleotid odTK2 (SEQ. ID. NO.34), katerega sekvenca se nahaja okoli 300 bp navzgomo od tk-gena. Drugi primer, odTK3 (SEQ. ID. NO. 35), se nahaja okoli 220 bp navzdolno od stop kodona tk-gena. Osnova je totalna DNA celic CV-1, okuženih z plakom virusa, kot je opisano za screening vdN. Produkt pomnoževanja, ki izhaja iz virusa, ki ima izbrisan tk-gen, ima okoli 520 bp, medtem ko daje divjetipska kontrola fragment z okoli 1.1 kb.
Konstruiranje plazmidov, ki obsegajo kasete za izražanje genov za prenos v vektor vdTK: Plazmid pAO je osnovni plazmid, ki vsebuje glavno mesto za kloniranje, ki obsega edina mesta glavnega mesta za kloniranje vektorja vdTK virusa vakcinije. Plazmid pAO smo konstruirali tako, da smo nadomestili mnogotemo mesto za kloniranje komercialno dostopnega plazmida s segmentom, ki obsega edina mesta vektorja vdTK in mesto Xhol, kot je prikazano na sliki 4.3.
Natančneje, da bi izbrisali mnogotemo mesto za kloniranje pBluescript II SKfagemida (Stratagene), smo plazmid razgradili s Sad in Asp718. Veliki vektorski fragment smo ligirali z adaptorjem, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov P-A (0.1 (SEQ. ID. NO. 36) in P-A(0.2) (SEQ. ID. NO. 37).
Mnogotemo mesto za kloniranje plazmida pAO (ki ustreza oligonukleotidu P-A (0.1)) in 20 baz bočnih področij 5’- in 3’-plazmida pBluescriptll SK- kaže SEQ. ID. NO. 6. Vstavek se začne na položaju 21 in konča na položaju 95. (Prvi A ostanek na 5’-koncu ustreza položaju številka 2187, zadnji G ostanek na 3’-koncu ustreza položaju številka 2301 plazmida pAO).
Konstruiranje plazmidov pAl in pA2: Plazmida pAl in pA2 smo zasnovali za vstavljanje segmentov DNA, npr. fragmentov sintetičnih ali naravnih promotoijev. Konstruirali smo ju tako, da smo vstavili v mesto Xhol plazmida pAO linker, ki obsega drugo mnogotemo mesto za kloniranje encimov, ki pogosto režejo, ki pa ne cepijo pAO. Oba plazmida imata enako strukturo, razen orientacije drugega mnogotemega mesta za kloniranje (slika 4.3).
Plazmid pAO smo razgradili z Xhol in ligirali z adaptorjem, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov P-A (1.1) in P-A (1.2). Plažmida z obema možnima orientacijama adaptorja smo izolirali in označili kot pAl in pA2.
Mnogoterno mesto za kloniranje plazmida p Al (ki ustreza oligonukleotidu P-A (1.1) ) in dvajset baz bočnih področij 5’ in 3’ plazmida pAO kaže SEQ. ID. NO. 7. Vstavek se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 83. (Prvi C ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 2222, zadnji C ostanek na 3’ koncu ustreza položaju številka 2324 plazmida pAl).
Mnogoterno mesto za kloniranje plazmida pA2 (ki ustreza oligonukleotidu P-A (1.2) ) in dvajset baz 5’ in 3’ koncev plazmida pA2 kaže SEQ. ID. NO. 10. Vstavek se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 195. (Prvi C ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 2252, zadnji G ostanek na 3’ koncu ustreza položaju številka 2466 plazmida pA2-Sl).
Konstruiranje plazmidov pAl-Sl in pA2-Sl: Plazmida pAl-Sl in pA2-Sl zagotavljata močni sintetični poksvirusni promotor Sl, vključno s startnim kodonom za prevajanje, ki mu sledi eno samo mesto EcoRl, primemo za vstavljanje odprtih bralnih okvirov, ki nimajo vključenega startnega kodona. Promotor Sl je modificirana verzija močnega poksvirusnega poznega promotoija, označenega kot P2.
Plazmida pAl-Sl in pA2-Sl dobimo tako, da vstavimo fragment prvega dvoverižnega promotoija s prisilnim kloniranjem v mesto Ndel in BamHl plazmida p Al oz. pA2 (slika 4.4, list A). Natančneje, vektor pAl razgradimo z Ndel in BamHl in ligiramo z adaptorjem, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov P-P2ml.l. in P-P2ml.2. Nastali plazmid označimo kot pAl-Sl.
Sekvenco sintetičnega promotorja plazmida pAl-Sl (ki ustreza oligonukleotidu P-P2ml.l) in dvajset baz bočnih področij 5’ in 3’ plazmida pAl kaže SEQ. ID. NO. 9.
Vstavek se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 193. (Prvi C ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 2228, zadnji G ostanek na 3’ koncu ustreza položaju številka 2440 plazmida pAl-Sl).
Vektor pA2 smo razgradili z Ndel in BamHl in ligirali z adaptorjem, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov P-P2m.l.l in P-P2ml.2, kot za pAl-Sl zgoraj. Nastali plazmid označujemo kot pA2-Sl.
Sekvenco sintetičnega promotorja plazmida pA2-Sl (ki ustreza oligonukleotidu P-P2ml.2) in dvajset baz bočnih področij 5’ in 3’ plazmida pA2 kaže SEQ. ID. NO. 10.
Vstavek se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 195. (Prvi C' ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 2252, zadnji G ostanek na 3’ koncu ustreza položaju številka 2466 plazmida pA2-Sl.
Konstruiranje plazmidov pAl-S2 in pA2-S2: Plazmida pAl-S2 in pA2-S2 vsebujeta močni sintetični promotor S2, modificirano verzijo močnega poznega sintetičnega poksvirusnega promotoija, ki sta ga opisala Davison & Moss, J. Mol. Biol. 210: 771784 (1989). Ta plazmida ne zagotavljata startnega kodona.za prevajanje s promotorjem in sta zato primerna za vstavljanje popolnih odprtih bralnih okvirov, ki vključujejo startni kodon. Promotorja imata različni orientaciji glede na glavno mesto za kloniranje vdTK v teh dveh plazmidih.
Plazmida pAl-S2 in pA2-S2 dobimo s prisilnim kloniranjem fragmenta drugega dvoverižnega promotorja v mesti Hpal in EcoRI plazmidov pAl oz. pA2, (slika 4.5, list A). Natančneje, plazmid pAl razgradimo z encimoma Hpal in EcoRI in ligiramo s sekvenco sintetičnega linkerja, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov P-artP(5) in P-artP(6). Nastali plazmid označujemo kot pAl-S2.
Sekvenco sintetičnega promotorja plazmida pAl-S2 (ki ustreza oligonukleotidu P-artP(5) in dvajset baz bočnih področij 5’ in 3’ plazmida pAl kaže SEQ. ID. NO. 11. Sekvenca vstavka se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 68. (Prvi T ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 2240, zadnji A ostanek na 3’ koncu ustreza položaju Številka 2327 plazmida pAl-S2).
Podobno razgradimo plazmid pA2 z encimoma Hpal in EcoRI in ligiramo s spojenima oligonukleotidoma P-artP(5) in P-artP(6) kot za pAl-S2. Nastali plazmid označujemo kot pA2-S2. Sekvenco sintetičnega promotorja plazmida pA2-S2 (ki ustreza oligonukleotidu P-artP(6) in dvajset baz bočnih področij 5’ in 3’ plazmida pA2 kaže SEQ. ID. NO. 12. Vstavek se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 72. (Prvi 'T' ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 2263, zadnji A ostanek na 3’ koncu ustreza položaju številka 2354 plazmida pA2-S2).
Po vstavitvi odprtega bralnega okvira v kateregakoli od plazmidov pAl-Sl, pA2-Sl, pAl-S2 ali pA2-S2, lahko celotno kaseto za'izražanje izrežemo in vstavimo s prisilnim kloniranjem v ustrezna mesta v virusnem vektorju vdTK. Kaseto lahko vstavimo v genom virusa v odvisnosti od uporabljenega plazmida za kloniranje v katerikoli orientaciji.
Konstruiranje plazmidov, ki obsegajo kasete za izražanje s selektivnim markerjem fpN2gztf-S3A in pN2gPf-S4): Poleg zgoraj opisanih plazmidov, zasnovanih za prisilno kloniranje, smo konstruirali dva dodatna plazmida za prenos genov v eno edino mesto (Noti) v vektor poksvirusa s pomočjo markerskega gena, ki se ga da izbrati z E. coli gpt. Zagotavljata tudi dva dodatna poksvirusna promotorja poleg promotorjev Sl in S2, ki sta opisana zgoraj.
Plazmid pN^gpi-S3A (slika 4.7) lahko uporabimo za to, da vstavimo odprte bralne okvire, ki nimajo svojega lastnega iniciacijskega kodona. Gene, ki jih je treba prenesti v virus vakcinije (gpt marker in odprti bralni okvir), lahko izrežemo bodisi samo z Noti ali z dvema encimoma, npr. Noti in Smal (ali Rsrll ali^lpal). Izrezani fragment nato vstavimo v ustrezno mesto (ustrezna mesta) vektorja virusa vdTK.
Plazmid pN%;pi-S4 (slika 4.7) lahko uporabimo za to, da vstavimo popolne odprte bralne okvire, vključno s startnim kodonom za prevajanje AUG. Kasete, ki sestoje iz gpi-markerskega gena in odprtega bralnega okvira, lahko izrežemo, kot je opisano za pN2gp/-S3A. Promotorja S3A in S4 sta modificirani verziji močnih poksvirusnih poznih promotorjev.
Ta plazmida smo konstruirali tako, da smo najprej izdelali plazmida pN2-gpta in pN2-gptb (slika 4.6), ki vsebujeta E. coli gpt gen, ki ga kontrolira P7.5 promotor virusa vakcinije, ob katerem leži bočno več edinih restrikcijskih mest, vključno Noti (slika 1.3). Vstavljanje fragmenta promotorja S3A ali S4 v edini mesti Pstl in Clal v pN2-gpib je dalo plazmida pN2gpi-S3A in pN2gpi-S4.
Konstruiranje plazmidov pN2-gpfa in pN2-gp/b: glej primer 1 in sl. 4.6.
Konstruiranje plazmida pN2gp/-S3A: Starševski plazmid pN2-gp/b smo razgradili s Pstl in Cial in ligirali s sekvenco sintetičnega linkerja, ki sestoji iz oligonukleotidov
P-artP(7) in P-artP(8) (SEQ. ID. NO. 40). Nastali plazmid smo označili kot ρΝ%ρίS3A.
Sekvenca sintetičnega promotoija plazmida pN2gpf-S3A (ki ustreza oligonukleotidu P-artP(7)) in dvajset baz bočnih področij 5’ in 3’ plazmida pN2-gpzb so prikazane za pN2gpt-S3A v SEQ. ID. NO. 13. Vstavljena sekvenca DNA se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 107. (Prvi T-ostanek na 5’ koncu ustreza položaju številka 3328, zadnji A-ostanek na 3’ koncu položaju številka 3454 plazmida pN2gpt-S3A).
Konstruiranje plazmida pN2gpf-S4: Plazmid pN2-gp/b smo razgradili s Pstl in Clal in ligirali z adaptorsko sekvenco, ki sestoji iz oligonukleotidov P-artP(9) in P-artP(lO) (SEQ. ID. NO. 41). Nastali plazmid smo označili kot pN2gpf-S4.
Sekvenca sintetičnega promotoija plazmida pN2gpt-S4 (ki ustreza oligonukleotidu P-artP(9) in dvajset baz bočnih področij 5’ in 3’ plazmida pN2-gpt so prikazane za pN2 gpt-S4 v SEQ. ID. NO. 14. Vstavljena sekvenca DNA se začne pri položaju 21 in konča pri položaju 114. (Prvi T ostanek na 5’ koncu ustreza bazi #3328, zadnji A ostanek 3’ konca položaju baze #3461 plazmida pN2gpt-S4.
PRIMER 5 Izražanje polipeptidov v vektorju virusa vakcinije (vdTK) z direktnim molekulskim vstavljanjem kastet za izražanje genov
Ta primer dokazuje lahkoto, s katero lahko klonirane gene vstavimo v vektor virusa vakcinije (vdTK) v smislu pričujočega izuma za hitro ustvarjanje konstruktov izražanja poksvirusov ob uporabi direktnega molekulskega vstavljanja kaset za izražanje genov, opisanih v primeru 4. Tu je opisana uporaba sistema vdTK vektorske kasete za izdelavo konstruktov za izražanje več posebnih modelnih polipeptidov, vključno proteinov človeške krvi (protrombin in variante plazminogena) in antigena humanega virusa (HIV gpl60).
Konstruiranje modificiranega virusa vakcinije (vPTl), ki izraža humani protrombin:
Humani protrombin (PT) rabi kot model za izražanje tujega proteina v vektorju virusa vakcinije v smislu pričujočega izuma. Že prej so pokazali, da se da protrombin, ki kodira cDNA, izraziti s konvencionalno konstruiranim rekombinantnim virusom vakcinije, kot razkriva patentna prijava PCT/EP91/00139 Falknerja et al. (Falknerjeva prijava), katere celotni opis je tukaj vključen kot referenca.
Modificirano protrombinsko cDNA izrežemo kot 2,0 kb EcoRI fragment iz plazmida pTKgpi-PTHBb in vstavimo v edino mesto £coRI plazmida pAl-Sl (primer 4, sl. 4.4), da nastane plazmid pAlSl-PT (sl. 5.1). V kaseti za izražanje tega plazmida kontrolira protrombinsko cDNA sintetični poksvirusni promotor Sl, ki tudi zagotavlja kodon za začetek prevajanja.
Sekvenca humanega protrombina je bila objavljena: Degen S. J. F., MacGillivray R. T. A. & Davie, E. Biochemistry 22: 2087-2097 (1983). Ta sekvenca je dostopna v EMBO Data Library pod oznako (ID) HSTHR1. Sekvenca v ID HSTHR1 ni popolna; manjka ji prvih 19 bp področja, ki kodira protrombin. Podpisani izumitelji smo določili sekvence manjkajočega dela cDNA v ID HSTHR1 in to prikazujemo niže.
Zaradi mnogih modifikacij in sprememb baz je popolna sekvenca tega klona cDNA humanega protrombina, vključno s promotorjem Sl in 20 bazami sekvenc, ki leže bočno ob plazmidu, prikazana v SEQ. ID. NO. 15.
S stopnjami konstruiranja, opisanimi v Falknerjevi prijavi (PCT/EP-91/00139), smo cDNA modificirali tako-le: Uvedli smo dva dodatna kodona (baze #22-27), kar je imelo za posledico vključitev dveh novih amino kislin; 3’-neprevedeno sekvenco smo odstranili z uvedbo mesta EcoRI: baze #1963-1965 (#1920-1922 ID HSTHR1) smo spremenili iz TGG v GAA z mestno usmerjeno mutagenezo.
Eno spremembo baznega para smo ugotovili v tukajšnji PT-cDNA, kar ima za posledico novo mesto Ncol: baza #525 (#482 v ID HSTHR1) je spremenjena iz C v A. To je tiha mutacija, ker je CCC kodon (Pro) spremenjen v CCA (Pro), kar ima za posledico novo mesto Ncol. (Prva baza v SEQ. ID. NO. 15 iz pAlSl-PT ustreza bazi #2394 in zadnja baza bazi #4381 popolne sekvence plazmida pAlSl-PT.
Za prenos v vektor virusa vakcinije vdTK izrežemo kaseto iz plazmida pAlSl-PT z endonukleazama Noti in Rsrll in izoliramo po ločenju na agaroznem gelu z nizkim tališčem. DNA vektorja virusa vdTK cepimo z Noti in Rsrll, ekstrahiramo s fenolom in oborimo z etanolom. Mali vezni fragment Notl-Rsrll mnogotemega mesta za kloniranje vektorske DNA se med stopnjo obarjanja z etanolom izgubi. Kraka vektorja vakcinije ligiramo z dvajsetkratnim molskim prebitkom kasete. Zapakiranje ligirane DNA virusa vakcinije s pomožnim virusom kuijih koz v piščančjih celicah je opisano v primeru 3. Zapakirane viruse iz plakov, nastalih z okužbo v celicah CV-1, ponovno plakno očistimo in pripravimo majhne množine surovega materiala. Virusne izolate lahko dalje analiziramo s Southernovim prenosom in ekspresijsko analizo, kot je opisano v Falkneijevi prijavi. Virusni izolat, ki ima pravilno genomsko strukturo za vstavitev protrombinske cDNA, označujemo kot vPTl. Podoben rekombinantni virus vakcinije, dobljen z reševanjem markerja, je sprožil izražanje protrombina v celicah Vero z nivoji aktivnosti okoli 50-60 mU/ml supernatanta celične kulture. Glej Falknerjevo prijavo.
Konstruiranje virusa vakcinije (vGPgl), ki izraža humani glu-plazminogen: Nativna oblika plazminogena (Pg) ima amino terminus, ki se začenja z amino kislino glutaminsko kislino (glu) in ga zato imenujemo glu-plazminogen (glu-Pg). Delno predelano obliko plazminogena, ki nima prvih 77 aminoterminalnih amino kislin (aktivacijski peptid), imenujemo lys-plazminogen (lys-Pg). Afiniteta lys-Pg za njegov substrat fibrin je mnogo večja kot afiniteta glu-Pg. Poleg tega je rekombinantni lys-Pg znatno bolj stabilen kot glu-Pg v supernatantih celičnih kultur, okuženih z (konvencionalnim) rekombinantom vakcinije, ki nosi glu-Pg gen.
Popolno cDNA humanega plazminogena (vključno njen startni in stop kodon za prevajanje) smo izrezali iz plazmida (phPlaš-6) kot Ball-Smal fragment. Sekvenco humanega plazminogena so objavili Forsgren M, Raden B, Israelsson M, Larsson K & Heden L-O. FEBS Letters 213: 254-260 (1987) in je dostopna v EMBO Data Library(GenBank) pod oznako (ID) HSPMGR. Zato sekvenc tega plazmida nismo vključili v tukajšnji seznam sekvenc, ker ta plazmid ni edini vir sekvence DNA plazminogena. Vendar pa se področje za kodiranje tukajšnje sekvence plazminogena razlikuje od objavljene sekvence vsaj v enem nukleotidu: A ostanek v položaju #112 (ID HSPMGR) je G ostanek v tukajšnji DNA, kar ima za posledico nadomestitev ene amino kisline (Lys -» Glu).
cDNA plazminogena smo vstavili v mesto Hpal plazmida pN2gpZ-S4 (primer 4, sl. 4,7), ki smo ga izbrali za konstruiranje kasete za izražanje genov z markerjem, ki se ga da izbrati, ker vsebuje cDNA plazminogena dve mesti Apal in eno mesto Rsrll in zato ne dopušča uporabe kaset za izražanje, zasnovanih za prisilno kloniranje. Nastali plazmid smo označili kot pN2gp/-GPg (sl. 5.2).
Spajalno področje promotorja S4, vključno iniciacijski kodon plazminogena (baza #32 tega seznama; baza #55 v ID HSPMGR) je prikazano za pN2gp/-GPg v SEQ ID. NO. 17. Področje za kodiranje glu-plazminogena smo v seznamu sekvenc izpustili. Sekvenca se nadaljuje s stop kodonom (baza #35 tega seznama; baza #2485 v ID HSPMGR) in 25 bazami 3’-neprevedene sekvence plazminogena. Tej sekvenci sledi 29 baz mnogoternega mesta za kloniranje plazmida phPlas6 in 20 baz mnogoternega mesta za kloniranje plazmida pN2gpr-S4.
Da bi prenesli kaseto z genom glu-plazminogena v genom virusa vakcinije, izoliramo Noti fragment plazmida pN2gpi-GPg, ki obsega oba gena in njuna promotorja (P7.5 promotor, ki kontrolira gpf-selekcijski marker, in promotor S4, ki kontrolira gen gluplazminogena), iz agaroznega gela z nizkim tališčem in ga očistimo. To kaseto ligiramo s krakoma DNA virusa vakcinije vdTK, razrezane z Noti. Pakiranje in plakno čiščenje sta opisana v primeru 3. Virus, ki ima pravilno strukturo za vstavljeno kaseto z genom plazminogena, označujemo kot vN2gp/-GPg. Ta virus uporabimo za izražanje plazminogena v celicah CV-1, kot je opisano za analogen virus vakcinije, konstruiran s tehnikami reševanja markerja. Izločeni glu-Pg v supematantih celičnih kultur smo ugotovili v nivoju okoli 1,5 Mg/106 celic po 24-umi okužbi s konvencionalno konstruiranim virusom vakcinije pod standardnimi pogoji za gojenje vektorjev virusa vakcinije za izražanje tujih proteinov v celičnih kulturah. Prisotnost glu78 plazminogena v supematantu celične kulture smo lahko ugotovili samo v prisotnosti inhibitorja proteaze (50 Ag/ml aprotinina). '
Konstruiranje virusa vakcinije (vLPgl), ki izraža humani lvs-plazminogen: Sekvenco, ki kodira lys-plazminogen, smo pripravili z delecijo 231 bp področja za kodiranje za prvih 77 amino kislin (Glul do Lys77) plazminogena iz popolne cDNA plazminogena, kot je prikazano v sl. 5.3. To sekvenco smo vstavili v kaseto za izražanje genov plazmida (pN2gpt-S4), ki ima izbirljiv markerski gen (E. coli gpt, daje nastal plazmid, označen kot pN^gpi-LPg (sl. 5.3).
V tem plazmidu je pre-sekvenca, (ki kodira za signalni peptid, ki posreduje izločanje) direktno zlita s prvim nukleotidom ostanka 78 lizina v plazminogenu. Novo cepitveno mesto za signalni peptid, ustvarjeno z zlitjem, je podobno mnogim znanim signalnim cepitvenim mestom. Glej npr. von Heinje, Eur. J. Biochetn. 133:17-21 (1983).
Poleg tega smo uvedli na mestu iniciacijskega kodona cDNA plazminogena mesto Ncol, da bi olajšali kloniranje v eno samo mesto Ncol plazmida pN^gpt-S4 in dosegli optimalni kontekst promotorja in področja, ki kodira Pg. Da bi olajšali izrezanje Pg cDNA z Ncol, smo iz Pg cDNA izbrisali eno do dveh notranjih mest Ncol (Ncol (2); sl. 5.3), tako-le:
Plazmid phPlas6 smo prenesli v E. coli, sev NM522, in pripravili enoverižno DNA s superinfekcijo s pomožnim fagom M13K07. Prvi krog mutageneze smo izvedli z dvema oligonukleotidoma oNcol in oNco2 ob uporabi enoverižne DNA plazmida phPlas6 kot osnove s komercialno dostopnim kompletom za mutagenezo (Amersham, Inc.). Oligonukleotid Ncol pretvori dva A ostanka navzgomo od startnega kodona plazminogena v dva C ostanka, da nastane mesto Ncol okoli startnega kodona, ne da bi se spremenilo področje za kodiranje pre-sekvence plazminogena. Oligonukleotid oNco2 pretvori T v C ostanek znotraj internega mesta Ncol (Ncol (2)) v Pg cDNA, s čimer pride do tihe mutacije, ki inaktivira to mesto Ncol.
Področje plazminogena za kodiranje za aminokisline 1-77 smo izbrisali z drugo stopnjo loop-out mutageneze ob uporabi 42-baznega oligonukleotida oNco3. Vse mutacije smo potrdili z analizami sekvenc in restrikcijsko analizo.
Plazmid, kije imel tri mutacije, phLplas, smo linearizirali z Smal in delno razgradili z Ncol. 2.2 kb Ncol-Smal fragment smo izolirali in vstavili v plazmid pN2gpZ-S4, ki smo ga razrezali z Ncol in Smal. Nastali plazmid smo označili kot pN^gpi-LPg.
Zaradi mnogih modifikacij plazminogenske cDNA v pN2g/?t-LPg je popolna sekvenca Ncol-Smal fragmenta plazmida pLplas, vključno z 20 bazami promotorja S4 in 20 bazami navzdolnega plazmidnega področja plazmida pN2gpt-S4, prikazana v SEQ. ID. NO. 18. Sekvenco plazminogenske cDNA smo modificirali takole: Prvotna dva ostanka A na položajih #19 in #20 (bazi #53 in 54 v ID HSPMGR) smo spremenili v dva C-ostanka, da je nastalo mesto Ncol; baza #21 tega seznama (#55 v ID HSPMGR) je A-ostanek plazminogenskega startnega kodona; baza #2220 (baza #2485 v ID HSPMGR) je T-ostanek stop kodona; bazo #111 v ID HSPMGR (baza #77 tega seznama) smo združili z bazo #343 v ID HSPMGR (baza #78 tega seznama), kar je imelo za posledico delecijo sekvence, ki kodira za aktivacijski peptid; T-ostanek #926 (baza #1191 v ID HSPMGR) smo spremenili v C-ostanek (konservativna zamenjava), kar ima za posledico, da izgine interno mesto Ncol.
Da prenesemo gensko kaseto za lys-plazminogen v genom virusa vakcinije, ligiramo Noti fragment plazmida pN2gpt-LPg, ki vsebuje kaseto za izražanje genov, ki obsega kombinacijo dveh promotorskih genov (P7.5 promotor-gpf-gen in S4 promotor-lysplazminogen gen) z DNA vektorja virusa vakcinije vdTK, razrezano z Noti, in zapakiramo, kot je opisano v primeru 7. Izolat, ki ima pravilno strukturo za vstavljeno gensko kaseto, označen kot vN2gpt-LPg, uporabimo za izražanje lysplazminogena v celicah CV-1 pod pogoji, uporabljenimi že prej za konvencionalno konstruirani rekombinant pod standardnimi pogoji za kultiviranje vektoijev za izražanje virusa vakcinije za pripravo proteinov v celični kulturi. Izločeni lys-Pg v supematantih celične kulture smo ugotovili v nivoju okoli 1,0 do 2,0 gg/106 celic po 24umem okuženju s konvencionalnim rekombinantom. Lys-plazminogen v supernatantu celične kulture je bil stabilen brez dodatka inhibitorja proteaze.
Konstruiranje virusa vakcinije (vgpl60-l) za izražanje glikoproteina 160 virusa humane imunske pomanjkljivosti (HIV gp!60): Popoln odprt bralni okvir glikoproteina gpl60 virusa HIV dobimo na 2.5 kb EcoRV fragmentu, ki vsebuje, izrezan iz replikativne oblike (RF), DNA faga M13 [mpPEenv; Fuerst et al., Mol. Celi. Biol. 7: 2538-2544 (1987)]. Ta fragment vstavimo v plazmid pN2gpi-S4, kot je prikazano na sl. 5.4. V nastalem plazmidu, pN2gpf-gpl60, kontrolira sintetični promotor S4 virusa vakcinije gpl60 gen.
Sekvenco HIV gpl60 so objavili Ratner, L. čt al. Nature 313: 277-284 (1985). Sekvenca klona BH8 je dosegljiva v EMBO Data Library (GenBank) pod oznako (ID)HIVH3BH8. Zato sekvenca gpl60 ni vključena v SEQ. ID. NO. 19, prikazano pa je spajalno področje promotorja S4 in fragmenta EcoRV HIV-gpl60 vključno z začetnim kodonom gena gpl60 (baza #28 tega seznama; baza 226 v ID HIVH3BH8). EcoRV HIV-gpl60 fragment izvira iz faga M13 (replikativna oblika) mpPEenv, opisanega v Fuerst, T.R., Earl, P. & Moss, B. Mol. Celi. Biol. T. 2538-2544 (1987). Sekvenca se nadaljuje s stop kodonom (baza #31 tega seznama; baza #2779 v ID HIVH3BH8) in eno polovico navzdoljnjega mesta EcoRV. Tej sekvenci sledi 20 baz mnogotemega mesta za kloniranje plazmida pN2gpi-S4. Prva baza (T) tega seznama ustreza bazi #3368, zadnja baza (G) bazi #5973 v sekvenci plazmida pN^gpfgpl60.
Za prenos kasete za izražanje gena za HIV gpl60 v genom virusa vakcinije ligiramo Noti fragment, ki vsebuje obe kombinaciji gen-promotor (P7.5 promotor-gpi selekcijski marker in S4 promotor-gpl60 gen) z DNA vektorja vdTK virusa vakcinije, cepljeno z Noti, in zapakiramo, kot je opisano v primeru 7. Izolat, ki ima pravilno strukturo vstavka kasete, ki ga označujemo kot vN2^p/-gpl60, uporabimo za izražanje gpl60 v celicah (Vero) afriške zelene opice pod pogoji, ki so jih že prej uporabljali za konvencionalno konstruirani rekombinant. Barrett et al., AIDS Research and Human Retroviruses 6:159-171 (1989).
Konstruiranje vektorja virusa vakcinije, ki skrbi za screening modificiranih virusov, ki nosijo vstavke, s sovstavljanjem lacZ gena: Za prikaz screeeninga vstavitve s sovstavljanjem E. coli lacZ gena v kombinaciji s pristopom direktnega kloniranja nudi plazmid pTZgpt-S3AlacZ koristen modelni konstrukt (sl. 5.5). Plazmid pTZ19R (Pharmacia, Inc.) smo razrezali s Evull in veliki 2.5 kb vektorski fragment pripravili in ligirali z Noti linkerji (Boehringer, Inc.). Nastali plazmid, pTZ-N, ima delecijo mnogotemega mesta za kloniranje, ki se nahaja znotraj sekvenc α-komplementacijskega peptida v plazmidu pT219R. Zato so izključeni možni dogodki rekombinacije med lacZ genom, ki ga je treba vstaviti v pTZ-N, in sekvencami α-komplementacijskega peptida.
Za konstruiranje kasete za izražanje genov za direktno molekulsko kloniranje izrežemo 1.2 kb Noti fragment, ki vsebuje gpi-gensko kaseto in S3A promotor, iz plazmida pN2gpt-S3A (primer 4) in ga vstavimo v pTZ-N, da nastane plazmid pTZgpt-S3A. 3.0 kb £h?Ri lacZ, fragment (izrezan iz plazmida pTKgpt-Fls/3;
Falkner & Moss, 1988) vstavimo v edino mčsto FcoRI plazmida pTZgpt-S3A Nastali plazmid označimo kot pTZgpt-S3AlacZ.
4.4 kb Noti fragment tega plazmida, ki sestoji iz dveh markerskih genov (E. coligpt in ZflcZ), ligiramo z DNA virusa vdTK, cepljeno z Noti (primer 4). Ligacija in pogoji pakiranja so opisani v primeru 3. Ocenjeni dobitek modificiranih virusov v primeru gpf-selekcije je opisan v primeru 3.
Dodatni vektor virusa vakcinije smo konstruirali takole. Plazmida pTZS4-lacZa in pTZS4-lacZb sta nudila koristne modelne konstrukte (sl. 5.6). Plazmid pTZ-N smo konstruirali kot zgoraj. Kaseto za izražanje genov, 1.2 kb Noti fragment, ki vsebuje gpf-gensko kaseto in S4 promotor, smo izrezali iz pN2gpt-S4 (primer 4) in vstavili v pTZ-N, da je nastal plazmid pTZgpt-S4. 3.3 kb Smal-Stul lacZ fragment smo izrezali iz plazmida p/acZN*, ki smo ga konstruirali tako, da smo plazmid pFP-Zsart (evropska patentna prijava št. 91 114 300.-6, Recombinant Fowlpox Virus) razgradili z Noti in pFP-Zsart ligirali z oligonukleotidom T-Notl (5’-GGCCAT-3’). Ta 3.3 kb Smal-Stul lacT, fragment smo vstavili v edino mesto Smal plazmida pTZgpt-S4. Nastala plazmida smo označili kot pTZS4-/acZa in pTZS4-/acZb.
4.5 kb Noti fragment tega plazmida smo ligirali z DNA virusa vdTK, cepljeno z Noti, in zapakirali, kot je opisano zgoraj.
Kombinacija /acZ in gpf-selekcije v eni sami stopnji kloniranja nudi prednost, ker bodo vsi gpi-pozitivni plaki vsebovali /acZ gen. Vendar pa je za konstruiranje virusov, ki imajo vstavke v različnih mestih, zaželen postopek drugega screeninga. Marker, ki ga izberemo prednostno, je gpi-marker, vendar nudi screening na lacZ, alternativno metodo za ugotavljanje prisotnosti vstavkov, npr., če tarčni virusni genom že vsebuje kopijo izbirljivega markerja, kot npr. E. coli gpt gen.
Za ta screening zasadimo 2 ml 1/10, 1/100 in 1/1000 razredčin surovega virusnega materiala, pripravljenega po zapakiranju (glej primer 3), na 30 velikih (premer 8,5 cm) petrijevk (10 petrijevk na razredčino). Modri plakni test izvedemo v skladu s standardnimi postopki. Chakrabarti, S., Brechling, K. & Moss, B. Mol. Celi Biol 5: 3403-3409 (1985).
PRIMER 6 Konstruiranje vektorja (vS4) virusa vakcinije z usmerjevalnim glavnim mestom za kloniranje pod prepisovalno kontrolo močnega poznega promotorja virusa vakcinije
Pričujoči primer opisuje vektor za kloniranje virusa vakcinije (vS4), ki je zasnovan za direktno molekulsko vstavljanje popolnega odprtega bralnega okvira v glavno mesto za kloniranje, kije funkcionalno vezano na promotor virusa vakcinije. Zato omogoča uporaba tega vektorja v skladu s postopki v smislu pričujočega izuma vstavljanje genov direktno v vektor poksvirusa brez ločenega konstruiranja insercijskega plazmida, kot ga zahteva konvencionalno konstruiranje rekombinantnih poksvirusov z intracelularno rekombinacijo. Ta vektor tudi obide potrebo po ločenem konstruiranju kasete za izražanje genov za prenos v vektor virusa vakcinije z direktnim molekulskim vstavljanjem, kot je opisano zgoraj.
Glavno mesto za kloniranje vektorja S4 se nahaja v genetsko stabilnem osrednjem področju genoma virusa vakcinije in obsega več cepitvenih mest, ki so edina v vektorju, kar omogoča usmerjeno vstavljanje. Promotor S4 neposredno navzgomo od glavnega mesta za kloniranje je močna sintetična varianta poznega promotorja virusa vakcinije. Ta vektor za izražanje je primeren za direktno kloniranje in izražanje velikih odprtih bralnih okvirov, ki obsegajo startni kodon za prevajanje, kot je tukaj ponazorjeno s cDNA, ki kodira humani krvni protein, von Willebrandov faktor (vWF).
Konstruiranje vektorja vS4 virusa vakcinije: V vektor vdTK virusa vakcinije (primer 4, sl. 4.1) vstavimo na edinem mestu Noti (sl. 6.1) adaptor, ki vsebuje sintetični promotor S4 virusa vakcinije. Vstavitev izbranih adapterskih oligonukleotidov inaktivira navzgomje mesto Noti, medtem ko ostane navzdolnje mesto Noti funkcionalno kot edino mesto za kloniranje.
Natančneje, DNA (1 μ-g) vektorja vdTK (primer 4, sl. 4.1) cepimo z Noti in ligiramo z 0,5 μ-g) spojenih oligonukleotidov P-artP (11) (SEQ. ID. NO. 38) in P-artP(12) (SEQ. ID. NO. 39). Ligacijsko zmes zapakiramo in plake identificiramo, kot je opisano v primeru 3. Na plakih opravimo screening s PCR, kot je opisano (primer 4, identifikacija virusa vdTK s screeningom s PCR). Izolat, ki ima vstavek v pravilni orientaciji, označimo kot vS4.
Vstavljanje cDNA von Willebrandovega faktorja v vS4: Plazmid pvWF vsebuje popolno cDNA von Willebrandovega faktorja, ob kateri leže bočno mesta Noti. Sekvenca humanega vWF je bila objavljena: Bonthron, D. et al., NucL Acids Res. 14: 7125-7128 (1986). Sekvenca je dostopna v EMBO Data Library pod oznako (ID) HSVWFR1. SEQ. ID. NO. 20 kaže spoj v virusnem genomu klona virusa wWF virusnega promotorja S4 in 5’ neprevedenega področja tukajšnje cDNA von Willebrandovega faktorja (vWF) v plazmidu pvWF do startnega kodona za prevajanje (baza #249 v tem seznamu; baza #100 v ID HSVWFR1). V tukajšnjem seznamu sekvenc je področje za kodiranje von Willebrandovega faktorja izpuščeno. Sekvenca se nadaljuje s stop kodonom (baza #252; baza #8539 v ID HSVWFR1) in 3’neprevedeno sekvenco do mesta Noti (baza #304) in 20 baz prekrivanja s 3’področjem virusnega genoma virusa wWF.
cDNA fragment proteina vWF sprostimo z Noti, izoliramo in ligiramo z DNA vektorja vS4, ki smo jo cepili z Noti in obdelali s fosfatazo, kot je prikazano na sl. 6.2.
/xg ligirane DNA zapakiramo, kot je opisano v primeru 7. Plake poberemo in analiziramo s screeningom s PCR. Prvi primer za PCR-reakcijo je oligonukleotid odTK2, ki se nahaja okoli 300 bp navzgorno od tk-gena; reverzni primer ovWFl se nahaja v vWF genu okoli 50 bp navzdolno od iniciacijskega kodona. Do pomnoževanja s PCR pride samo, če je vstavek vWF v pravilni orientaciji glede na promotor S4 v vektorju. PCR-pozitivne plake identificiramo in analiziramo dalje. Če je dobitek želenega modificiranega virusa majhen, reda od 0,1 do 0,01 %, jih lahko alternativno identificiramo z metodami plakne hibridizacije in situ, prilagojenimi iz tistih, ki so v stroki znane. Glej npr. Villareal, L. P. & Berg, P. Science 796:183-185 (1977).
Virusni klon, ki ima vstavek cDNA, dobljen s PCR ali hibridizacijo, in ki poleg tega kaže pričakovani restrikcijski vzorec s TVnII, označujemo kot wWF. Take vektorje lahko testiramo glede izražanja von Willebrandovega faktorja, kot je opisano za druge humane proteine v primeru 5, modificirano, kot je primemo v skladu z načeli genetskega inženiringa, ki so strokovnjaku na tem področju znana.
PRIMER 7. Heterologno pakiranje genomske DNA ortopoksvirusa (vakcinija) s pomožnim avipoks virusom (kurjih koz) in istočastno izbiranje modificiranega virusa v gostiteljskih celicah take species, v kateri se pomožni virus ne more podvajati
Primer 3 opisuje pakiranje DNA modificiranega virusa vakcinije s pomožnim virusom kurjih koz v ptičjih celicah in temu sledečo izolacijo plakov razmnoženega virusa v sesalskih (CV-1) celicah, v katerih se pomožni avipoksvirus ne more podvajati. Pričujoči primer ilustrira zapakiranje DNA virusa vakcinije z virusom kurjih koz direktno v celice CV-1, s čimer sta omogočena istočasno zapakiranje in izbiranje kroga gostiteljev za zapakirani virus. Poleg odstranitve pomožnega virusa iz začetnega razmnoženega materiala zaobide ta postopek nadležno zahtevo po pripravi primarnih kultur fibroblastov piščančjih zarodkov za vsak eksperiment zapakiranja. Namesto tega lahko uporabimo kontinuirne sesalske celične linije, ki se na splošno uporabljajo za podvajanje virusa vakcinije, tudi za zapakiranje virusa vakcinije s pomožnim virusom kurjih koz.
Znano je, da se virus kurjih koz (FPV) podvaja popolno samo v ptičjih celicah; iz okuženih sesalskih celic ne dobimo virusnega potomstva, sposobnega za življenje. Natančni trenutek v življenjskem ciklu virusa FPV, v katerem pride do okmjenja podvajanja v sesalskih celicah, ni znan. Vendar pa je znano, da tvori FPV virusne proteine v sesalskih celicah in da celo sproži zaščitno imunost pri sesalcih, če ga uporabimo kot živo cepivo. Taylor et al., Vaccine 6: 497-503 (1988). Vendar se doslej ni pokazalo, da bi imel FPV sposobnost za pakiranje heterologne poksvirusne genomske DNA, zlasti direktno konstruirane DNA virusa vakcinije.
V začetnem eksperimentu smo celice CV-1 (5 χ 106) okužili z 1 pfu/celico virusa kurjih koz (sev HP1.441) in inkubirali 1 uro. Nato smo transfektirali v okužene celice oborino kalcijevega fosfata (1 ml vsebuje 1 Mg divjetipske DNA virusa vakcinije). Po 15 min pri sobni temperaturi smo dodali 10 ml medija (DMEM, 10 % fetalnega telečjega seruma). Celice smo inkubirali 4 ure in nato medij zamenjali. Celice smo nato inkubirali 6 dni in pripravili material s surovim virusom. Virusno potomstvo smo titrirali na celicah CV-1. Tipični plaki vakcinije so bili vidni po dveh dneh.
Odvisnost učinkovitosti pakiranja od množine genomske virusne DNA smo določili v območju množin DNA od 0,1 do 10 Mg na 5 xl06 celic CV-1. Glej sl. 7.1. Množine DNA, ki so presegale 1 Mg (npr. 10 Mg), so dale grobo oborino kalcijevega fosfata, ki je zmanjšala učinkovitost transfekcije, izraženo kot pfu/jxg vhodne DNA. Sl. 7.1.
Odvisnost dobitka zapakiranega virusa vakcinije od časa inkubacije za pakiranje smo analizirali ob uporabi konstantne množine divjetipske DNA virusa vakcinije (1 /xg) in konstantne množine pomožnega virusa FPV (1 pfu/celico) pod pogoji, opisanimi zgoraj za začetni eksperiment v tem primeru, le da smo medij, dodan 15 min po transfekciji, zamenjali po 4 urah, in celice nato inkubirali še dodatnih 1 do 5 dni, preden smo pripravili surovi virusni material (skupini volumen 2 ml). Virusni material iz kontrolnih celic, okuženih samo s fpv in inkubiranih 5 dni, ni pokazal nobenih vidnih plakov. Ta eksperiment smo ponovili trikrat in tipičen izid je prikazan nižje v tabeli 7.1.
Tabela 7.1. Vpliv časa inkubacije na dobitek virusa vakcinije iz zapakiranja DNA s pomožnim virusom kuijih koz v sesalskih (CV-1) celicah.
Čas inkubacije Titer
(ure) (pfu/ml)
24 1,0 xl02
48 4,6 xl04
72 5,0 xl05
96 5,6 xl06
120 2,1 χ 107
Titer zapakiranega virusa vakcinije, ugotovljen s plaknim testom na sesalskih (CV-1) celicah, je naraščal kontinuirno od okoli 102 pfu/ml pri 24 urah do okoli 2 χ 107 po 120 urah. Časi inkubacije v območju od 48 do 72 ur so dali primerne množine zapakiranega virusa vakcinije (med 104 in 106 pfu/ml) in so zato primerni za rutinsko pakiranje DNA virusa vakcinije z virusom kurjih koz v sesalskih celicah.
DNA vakcinije lahko zapakiramo v sesalske celice, okrnjeno okužene z virusom kurjih koz. Že prej se je pokazalo, da lahko virus kurjih koz okuži tudi sesalske celice, vendar virusni življenjski ciklus v teh netipičnih gostiteljskih celicah ni popoln. V odvisnosti od vrste celic se virusna rast ustavi bodisi v zgodnji, bodisi v pozni stopnji in ne nastane za življenje sposoben virus kurjih koz (Taylor et al., 1988). Te ugotovitve so spodbodle raziskovanje pakiranja DNA Vakcinije v kontinuimo sesalsko celično linijo.
Konfluentne enoplastne sloje celic CV-1 smo okužili z 0,05 pfu/celico seva HP1.441 virusa FPV in nato transfektirali z ligacijsko zmesjo, ki je sestojala iz DNA virusa vakcinije, cepljene z Noti, in gpi-genske kasete, ki ima mesta, ki leže bočno ob Noti. Podrobneje, DNA vakcinije (1 pg) smo razgradili z Noti in ligirali z navedenimi množinami insertne DNA (P7.5 gpi-genska kaseta). Edino mesto Noti v virusu vakcinije se nahaja v intergenskem področju v Hindlll F fragmentu. Goebel, et al., Virology, 179:247 (1990). Po 3-dnevni inkubaciji smo celice pobrali in surovi virusni material titrirali na celicah CV-1 v prisotnosti (+MPA) in odsotnosti (-MPA) gptselektivnega medija. Izid je povzet v tabeli 7.2.
Tabela 7.2
Titri po okrnjenem pakiranju
Poskus št. vstavek (ne) titri himere
(pfu χ 10'2 / 6 χ 106 celic) %
-MPA* + MPA
1. 200 17,2 1,6 9,3
2. 200 42,5 5,1 12,3
3. 400 64,0 3,8 5,9
4. 400 26,8 3,8 14,2
5. 210,0
*MPA, mikofenolna kislina.
Najvažnejši rezultat je bil, da je virus kurjih koz lahko zapakiral modificirano DNA vakcinije v celico take vrste, ki preprečuje njegovo lastno rast. Še več, dobitek himernih plakov je bil v območju od 5 do 10 %. To je v primerjavi s klasično tehniko in vivo rekombinacije, pri kateri je običajno 0,1 % vseh plakov rekombinantov, ugodno. Ligacija vektorskih krakov samih (tabela 7.2, poskus št. 5) je imela za posledico višji titer v primerjavi s poskusi ligiranja 1 do 4 z vstavkom, verjetno zaradi odsotnosti kontaminantov, prisotnih v molekulah vstavkh, očiščenih z agarozo.
Nekatere od izoliranih virusov smo plakno očistili in dalje karakterizirali. Kazali so tipične vzorce virusa vakcinije, dobljene pri restrikciji s Hindlll, in poleg tega trakove tujih genov, značilne za obe možni orientaciji edinega vstavka. Pri vstavljanju v mesto Noti nismo opazili virusov z mnogotemimi vstavki.
Heterologno zapakirani himemi virusi vakcinije ne hibridizirajo navzkrižno z virusom kurjih koz. Da bi preučili učinke heterolognega pakiranja z FPV na strukturo himernih virusov vakcinije, smo DNA izolatov F13.4, F12.5, F13.2, F13.2 in F12.4 skupaj z DNA štirih očiščenih izolatov iz poskusa kloniranja z Noti in kontrol virusa kurjih koz razgradili s Hindlll in dobljene fragmente ločili z elektroforezo in analizirali s Southemovo hibridizacijo s sondo z virusom kurjih koz, pripravljeno iz virionov, očiščenih z gradientom saharoze. Opazili nismo nobene navzkrižne hibridizacije virusov vakcinije z DNA virusa FPV.
PRIMER 8. Homologno pakiranje konstruirane genomske DNA virusa vakcinije z mutantom kroga gostiteljev virusa vakcinije (vdhr), ki ni sposoben, da bi se podvajal v humani celični liniji
Pričujoči primer ponazarja konstruiranje in uporabo pomožnega poksvirusa, ki vključuje delecije, ki omejujejo njegov krog gostiteljev, zlasti sposobnost, da se podvaja v določenih humanih celičnih linijah. Zato lahko pripravimo modificiran virus vakcinije, ki je brez pomožnega virusa tako, da zapakiramo vektorsko DNA s tem mutantnim pomožnim virusom in klone konstruiranega virusa izoliramo z okuženjem primernih humanih celic.
Ta mutantni pomožni virus je izveden iz mutantov kroga gostiteljev virusa vakcinije, ki niso sposobni, da bi se podvajali v različnih humanih celicah in ki kažejo spremenjene citopatične učinke na mnogo drugih celic, ki so dostopne za okuženje z divjetipskim virusom vakcinije. Glej npr. Drillien et al., Virology 111: 488-499 (1981). Zlasti vključuje genom tega pomožnega virusa mutacije dveh genov kroga gostiteljev, ki mu skupaj preprečujeta, da bi se podvajal v humanih celicah (MRC 5), v katerih se lahko podvajajo samo genomi virusa vakcinije, ki imajo vsaj en intakten gen kroga gostiteljev.
Konstruiranje mutanta vdhr kroga gostiteljev virusa vakcinije: Genomsko mesto in sekvenco DNA enega gena virusa vakcinije, potrebnega za podvajanje v humanih celicah, so opisali Gillard et al., Proč. Natl. Acad. ScL USA 83: 5573-5577 (1986). Nedavno so ta gen označili kot KIL (Goebel et al., 1990). Mapirali so tudi drugi gen kroga gostiteljev virusa vakcinije [Perkus et al., 7. Virology 63: 3829-2836 (1990)]. Ta drugi gen (ki ga označujemo po Goebelu et al., 1990, kot C7L), leži v področju, ki obsega dele Hindlll C in Hindlll N fragmentov. To področje je izbrisano v sevu virusa vakcinije WR-6/2 [Moss et al., J. Virol. 40: 387-395 (1981)]. Sev WR-6/2 zato nima gena C7L kroga gostiteljev.
Pomožni virus vdhr, ki mu manjkata oba gena kroga gostiteljev KIL in C7L, konstruiramo iz C7L-negativnega seva WR-6/2 z reševanjem markerja z modificiranim £coRI K fragmentom, iz katerega je bil gen kroga gostiteljev KIL izbrisan. Glej sl. 8.1. Ta modificirani EcoRI K fragment obsega selektiven markerski gen (E. coli gpt-gen), da olajšamo selekcioniranje modificiranih genomov WR-6/2, ki obsegajo modificirani EcoRI K fragment, ob uporabi intracelulamega reševanja markerja, kot opisujeta Sam & Dumbell, 1981. Pogojno letalen mutant, ki mu manjka sposobnost, da bi rasel v humanih celičnih linijah, so tudi opisali Perkus et al., 1989.
Podrobneje, 5.2kb £coRI K fragment divjetipske DNA virusa vakcinije subkloniramo v plazmid pFP-tkl8i. Nastali plazmid označujemo kot pFP-EcoKl. Gen kroga gostiteljev KIL virusa vakcinije (Gillard et al., 1986) izbrišemo in istočasno uvedemo edino mesto Noti z loop-out mutagenezo ob uporabi oligonukleotida P-hr(3) (SEQ. ID. NO. 42). Nastali plazmid označujemo kot pEcoK-dhr.
Plazmid pFP-tkl8i smo konstruirali z modifikacijo plazmida pFP-tk-10.4 (glej Falkner et al., evropska patentna prijava štev. 89303887.7, objava EPA 0 338,807, primer 3 pri 8, katere celotni opis je tukaj vključen kot referenca). Plazmid pFPtkl0.4 smo razgradili z Ncol in ligirali z adaptorjem, ki sestoji iz spojenih nukleotidov P-Ncol(l) in P-Ncol(2), kar ima za posledico uvedbo mnogoternega mesta za kloniranje v edino mesto Ncol tk-gena virusa FPV s cepitvenimi mesti za restrikcijske endonukleaze EcoRI, Noti in Hindlll.
Sekvenco virusa vakcinije so objavili Goebel, S. J. et al., Virology 179: 247-266 (1990). Dostopna je v EMBO Data Library (GenBank) pod dostopno štev. M35027.
Sekvenco gena kroga gostiteljev KIL virusa vakcinije so objavili Gillard. S. et aL, Proč. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5573-5577 (1986) in je dostopna v EMBO Data Library (GenBank) pod označbo (ID) PXVACMHC. Zato sekvenca za kodiranje gena KIL ni vključena v SEQ. ID. NO. 21. V pEcoK-dhr je gen KIL izbrisan in nadomeščen z mestom Noti. Področje spajanja med sekvenco PXVACMHC in vstavkom na mestu TVoilje prikazano (baze #1-20 tega seznama ustrezajo bazam #72 - 91 v ID PXVACMHC). Področje za kodiranje gena KIL smo izbrisali in nadomestili z mestom Noti, ki mu sledita dva G ostanka (baze #21-30 v seznamu sekvenc). Sekvenca se nadaljuje z bočnim področjem z 20 bp (baze #31-50 tega seznama; baze #944-963 v ID PXVACMHC).
V nadaljnji stopnji lineariziramo pEcoK-dhr z Noti in ligiramo z 1.1 kb HEl.S-gptgensko kaseto, izvedeno iz plazmida pN2-gpia (primer 4) z razgradnjo z Noti. Nastali plazmid pdhr-gpi uporabimo za tvorbo pomožnega virusa vdhr.
Kaseta Noti (ki obsega kaseto P7.5 promotor-gpi-gen), vstavljena v pEcoK-dhr, in 20 baz 5’ in 3’ bočnih področij so prikazane za pdhr-^pi v SEQ. ID. NO. 22. Bočno področje (baze #1-20 tega seznama) ustreza bazam #72-91 v ID PXVACMHC (glej SEQ. ID. NO. 21 za pEcoK-dhr). Vstavljena sekvenca DNA se začne pri položaju 21 (prvi G mesta Noti) in konča pri položaju 1189 (zadnji C ostanek mesta Noti ). A-ostanek začetnega kodona za prevajanje gpi-gena ustreza položaju #548. T-ostanek stop kodona za prevajanje gpi-gena ustreza položaju št. #1004. Sekvenca se nadaljuje z 20 bazami bočnega področja (baze #1192-1209 tega seznama; baze #944-961 v ID PXVACMHC). Dva G ostanka #1190 in 1191 v tem seznamu ustrezata položajema 29 in 30 v pEcoK-dhr.
Za prenos Eco K fragmenta v virus vakcinije transfektiramo plazmid v primarne celice fibroblastov piščančjih zarodkov, okužene z delecijskim mutantom virusa vakcinije WR-6/2. Modificirane viruse selekcioniramo kot gpi-pozitivne (ob uporabi mikofenolne kisline), gpi-pozitivni virus plakno očistimo trikrat v celicah CEF in označimo kot vdhr.
Karakterizacija pomožnega virusa vdhr: Strukturo gpi-pozitivnega virusa vakcinije vdhr analiziramo s Southernovimi prenosi in testi kroga gostiteljev. Virus vdhr je sposoben, da tvori plake na fibroblastih piščančjih zarodkov in dveh opičjih celičnih linijah (BSC40 in Vero), vendar je pomanjkljiv za podvajanje v humani celični liniji MRC-5.
Pakiranje konstruirane DNA virusa vakcinije ob uporabi mutanta kroga gostiteljev vdhr kot pomožnega virusa: Konstrukt za' izražanje cDNA, ki kodira humani protrombin, dokazuje uporabnost tega načina dela. Produkt iz ligacijske zmesi, opisan v primeru 5, sl. 5.1, transfektiramo v fibroblaste piščančjih zarodkov, okužene z vdhr kot pomožnim virusom. Po 2 dneh celice zberemo in pripravimo surovi virusni material. Zapakirani virus testiramo glede tvorbe plakov na humanih (MRC-5) celicah, v katerih se želeni virus vakcinije podvaja, mutantni pomožni virus vdhr pa ne.
Po treh dneh celice obarvamo z nevtralno rdečim in plake selekcioniramo za nadaljnjo analizo s Southemovim prenosom. Identificiramo modificirane klone virusa vakcinije z želeno strukturo. Pričakujemo tudi viruse, pri katerih je prišlo do rekombinacije z visokohomolognim pomožnim virusom.
PRIMER 9. Konstruiranje novih himemih virusov vakcinije, ki kodirajo HIV gp!60 (vP2-gpl60MEA, vP2-gpl6QMUB in vselP-gplčO^), in izražanje rekombinanta gp!60MN v celicah Vero
Pričujoči primer ponazarja konstruiranje rekombinanta virusa vakcinije za pripravo gpl60 izolata HIV-1MN v velikem obsegu z direktnim molekulskim kloniranjem. Pripravo gpl60 izolata HIVinB, ki so jo opisali Ratner et al., Nature 313: 277-284 (1985), ob uporabi konvencionalno konstruiranega vektorja za izražanje virusa vakcinije, so opisali Barrett et al., AIDS Research and Human Retroviruses 5: 159-171 (1989). Vendar je izolat HIVniB redka varianta HIV. Prizadevanja pri razvoju cepiv, temelječih na proteinih ovojnice HIV, naj bi vključevala bolj reprezentativne izolate HIV-1, kot MN-izolat. Gurgo et al., Virology 164: 531-536 (1988); Carrow et al.,?lidy Research and Human Retroviruses 7: 831-839 (1991). Zato smo tukajšnje vektorje virusa vakcinije konstruirali preko direktnega molekulskega kloniranja, da bi izrazili protein gpl60 izolata HIVMN.
Konstruiranje plazmida pP2-gpl60MN in himemih virusov vP2-gpt!60MNA in vP2gp!60MHB: Strategija vstavljanja gpl60 gena v virus vakcinije je obsegala (i) modificiranje gpl60-gena z odstranitvijo velikega 5’-neprevedenega področja (5’UTR) in uvedbo primernega mesta za kloniranje navzgorno od startnega kodona, (ii) kloniranje modificiranega gpl60-gena navzdolno od močnega poznega P2promotoija virusa kurjih koz (evropska patentna prijava št. 91 114 300.-6, 26.avgust
1991) in (iii) vstavljanje fragmenta s topimi konci, ki sestoji iz genskih kaset P2-gpl60 in P7.5-gpf v edina cepitvena mesta za restrikcijsko endonukleazo primernih sevov virusnih gostiteljev, npr. v mesto Smal gostiteljskega seva vakcinije vdTK (primer 4), v mesti Smal ali Noti seva vakcinije WR 6/2 (Moss et al., J. ViroL, 40: 387 (1981)) ali divjetipskega seva WR vakcinije.
Za te namene smo uvedli v plazmid pN2gpf-S4 (primer 4) novo mesto Smal, da je nastal plazmid pS2gp/-S4 (sl. 9.1, SEQ ID NO: 62). Nato smo S4-promotor zamenjali s P2-promotorjem, da je nastal plazmid pS^p/-P2 (SEQ ID NO:63). Ta plazmid omogoča kloniranje popolnih odprtih bralnih okvirov (orf), vendar ga lahko uporabimo tudi za kloniranje nepopolnih orf, ki nimajo svojega lastnega startnega kodona; startni kodon je zagotovljen, npr. če kloniramo v edino mesto Ncol (CCATGG) tega plazmida. Konstruiranje plazmidov in virusov je podrobneje opisano niže. Za modifikacijo gpl60-gena smo zamenjali bližnji fragment, ustvarjen s PCR, kar je privedlo do gpl60-genske kasete z minimalnim 5’-UTR. Ta kaseta je prisotna v končnem konstruktu, plazmidu pP2-gpl60MN (sl. 9.1, SEQ ID NO:69). Dodatne karakteristike plazmida so prikazane v naslednji tabeli.
pP2gpl60mn (6926bp) (SEQ ID NO:69j
Mesto
1-3529
2396 - 2851 2851
2395
3081 - 3323 3358 - 3526
3534 - 6001
3534
6102
6173 - 6926
Opis sekvence pS2gpt-P2 rcCDS gpt-gena E. coli
T rc začetnega kodona TAC gpt-gena
A rc stop kodona od TTA rc P7.5 promotoija vakcinije sekvenca P2 promotorja v skladu s prijavo EP Avipox intergenic region
CDS sekvence gpl60 seva MN HIV-1 (EMBL ID REHIVMNC)
A začetnega kodona ATG rekombinanta gpl60MN T stop kodona TAA rekombinanta gpl60MN sekvence pS2gpt-P2.
Plazmide smo konstruirali takole.
pS2gpi-S4: Plazmid pN2gp/-S4 (primer 4) smo razgradili z Xbal in ligirali s Sraaladaptorjem (SEQ ID NO:43 5’-CTAGCCCGGG-3’), s čimer smo inaktivirali mesto Xbal in ustvarili mesto Smal. Nastali plazmid smo označili kot pS2&pi-S4 (SEQ ID NO:62). Dodatne karakteristike tega plazmida so prikazane v naslednji tabeli.
pS2gpt-S4 (4145bp) (SEQ ID NO:62)
Mesto Opis
1 - 2226 sekvence pN2gpt-S4 iz SEQ ID NO: 14. Položaj 1 ustreza prvemu nukleotidu G ’5-TGGCACTTT TCGGGGAAAT-3’
2227 - 2236 Smal-adaptor 5’-CTAGCCCGGG-3’
2396 - 2851 rcCDSS gpt-gena E.coli
2851 T rc začetnega kodona TAC gpt-gena
2395 A rc stop kodon od TTA
3081-3323 rc P7.5 promotorja vakcinije
3358 - 3451 S4-promotor v SEQ. ID#14 (oligonukleotid P-artP (9) glej str. 120)
2237 - 4145 sekvence pN2gpt-S4 v SEQ. ID No. 14.
pS2gpr-P2: S4-promotorski segment plazmida pS2gpi-S4 smo odstranili s cepitvijo s Pstl in Hpal in nadomestili s 172 bp Pstl-Hpal P2-promotorskim segmentom. Ta promotorski segment smo napravili s PCR s plazmidom pTZgpi-P2a (Falkner et al., evropska patentna prijava št. 91 114 300.-6, 26. avgust 1991) kot osnovo in oligonukleotidoma P-P2 5’ (1) in P-P2 3’ (1) kot primerjema. PCR-produkt smo razrezali s Pstl in Hpal in ligirali veliki fragment plazmida pS2gpi-S4, razrezanega s Pstl in Hpal. Sekvenca oligonukleotida P-P2 5’ (1) (SEQ ID NO:44) je: 5’-GTACGTACGG CTGCAGTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAG-3’; sekvenca oligonukleotida P-P2 3’ (1) (SEQ ID NO:45) je: 5’-TCTGACTGAC GTTAACGATT TATAGGCTAT AAAAAATAGT ATTTTCTACT-3’. Pravilno sekvenco PCR-fragmenta smo potrdili z določitvijo sekvenc končnega plazmida, označenega kot pS^pi-P2 (SEQ ID NO:63). Sekvenčna primerja, ki smo ju uporabili, sta bila P-SM(2) (SEQ ID NO:46), 5’-GTC TTG AGT ATT GGT ATT AC-3’ in P-SM(3) (SEQ ID NO:47), 5’-CGA AAC TAT CAA AAC GCT TTA TG-3’. Dodatne karakteristike plazmida pS2gpt-P2 so prikazane v naslednji tabeli.
pS2gpt-P2 (4277bp) (SEQ ID NO:63)
Mesto Opis
1 - 3357 sekvence pS2gpt-S4
1396 - 2851 rcCDS gpi-gena E. coli
2851 T rc začetnega kodona TAC gpt-gena
2395 A rc stop kodona TTA
3081 - 3323 rc P7.5 promotorja vakcinije
3358 - 3526 sekvenca P2 promotorja v skladu s prijavo EP Ανΐρόχ intergenic region
3527 - 4277 pS2gpt-S4 sekvence.
pMNevn2: Plazmid pMNenvl je priskrbel R. Gallo (National Cancer Institute, Bethesda, Maryland). Vsebuje gpl60-gen seva HIV MN, kloniran kot 3.1 kb EcoRIPvull fragment v vektor pSP72 (Promega, Inc.). 0.6kb £c<?RI-Asp718 fragment plazmida pMNenvl smo nadomestili z 0.13kb £coRI-Asp718 fragmentom, pri čemer smo odstranili velike dele 5’ neprevedenega področja gpl60-gena. Ta 0.13kb fragment smo pripravili s PCR ob uporabi plazmida pMNenvl kot osnove in oligonukleotidov P-MN(l) in P-MN(2) kot primerjev. Naprej usmerjeni primer P-MN(l) je uvedel poleg tega mesto Stul 1 bp navzgomo od startnega kodona. Sekvenca P-MN(l) (SEQ ID NO:48) je 5’-AGCTAGCTGA ATTCAGGCCT CATGAGAGTG AAGGGGATCA GGAGGAATTA TCA-3’; sekvenca P-MN(2) (SEQ ID NO:49) je 5’-CATCTGATGC ACAAAATAGA GTGGTGGTTG-3’. Nastali plazmid smo označili kot pMNenv2. Da bi izključili mutacije, smo v fragmentu, dobljenem s PCR v tem plazmidu, določili sekvence s primerjema P-Seq (2) (SEQ ID NO:50) 5’-CTG TGG GTA CAC AGG CTT GTG TGG CCC-3’ in P-Seq (3) (SEQ ID NO:51) 5’-CAA TTT TTC TGT AGC ACT ACA GAT C-3’.
pP2-gpl60MN: 2.7 kb Stul-Pvull fragment, ki vsebuje MN gpl60-gen, izoliran iz plazmida pMNenv2, smo vstavili v mesto Hpal plazmida pS2gpf-P2, da je nastal plazmid pP2-gpl60MN (SEQ ID NO:69).
Himema virusa vP2-gpl60MNA in vP2-gpl60MNB smo konstruirali tako-le: Smalfragment, ki sestoji iz P2-gpl60 in P7.5-^pi-genskih kaset, smo vstavili z direktnim molekulskim kloniranjem v edino mesto Smal gostiteljskega seva vdTK vakcinije (primer 4), da sta nastala himema virusa vP2-gpl60MNA in vP2-gpl60MNB (sl. 9.2). Podrobno, virus vakcinije vdTK iz primera 4 smo razrezali na njegovem edinem mestu Smal in ligirali s 4.0kb Smal fragmentom, ki vsebuje P7.5-^pi-gensko in P2gpl60-gensko kaseto. Ustrezno smo sev vAkcinije WR6/2 razrezali na njegovem edinem mestu Smal (Not!) in ligirali s 4.0kb Smal (NotT) fragmentom, ki vsebuje P7.5-gpt-gensko in P2-gpl60-gensko kaseto. Postopek kloniranja smo izvedli tako, kot je opisano v primeru 1. V virusu vP2-gpl60MNA prepišemo gpl60-gen v isti smeri kot gene, nakopičene okoli gena virusne timidin kinaze; v virusu vP2-gpl60MNB je gpl60-gen prepisan v obratni smeri. Ker lahko učinki položaja gena vplivajo na nivoje izražanja v konstruktih vakcinije, smo v mesto Smal (NotT) seva WR6/2 vstavili tudi Smal (VoZl)-fragment, ki sestoji iz P2-gpl60 in P7.5-gpt-genskih kaset. In vivo pakiranje smo opravili tako, kot je opisano v primeru 3.
Struktura himemih virusov. Da bi potrdili teoretske strukture himemih virusov (sl. 9.3), smo izvedli analize Southernovih prenosov. DNA očiščenih virusov cepimo s Pstl in nastale fragmente ločimo na agaroznem gelu, prenesemo na nitrocelulozno membrano in hibridiziramo s sondo z genom timidin kinaze (tk) vakcinije in sondo z gpl60-genom. S sondo s tk-genom sta v primeru virusa vP2-gpl60MNA vidna napovedana 6.9 in 14.3 kb fragmenta in za vP2-gpl60MNB napovedana 8.7 in 12.5 kb fragmenta. Z gpl60-sondo (pMNenvl) sta vidna napovedana 14.3 kb fragment virusa vP2-gpl60MNA in 8.7 kb fragment virusa vP2-gpl60MNB, kar potrjuje vključitev tujih genskih kaset v dveh različnih orientacijah.
Preiskave izražanja s himernima virusoma vP2-gpl60MNA in vP2-gpl60MNB. Za preiskave izražanja izberemo celice Vero. Gojenje celic, okužbo s himemimi virusi in čiščenje rekombinantnega gpl60 proteina izvedemo tako, kot opisujejo Barrett et al., zgoraj.
Westemovi prenosi gpl60:
Westemove prenose izvedemo v bistvu tako, kot opisujejo Towbin et al., Proč. Natl. Acad. Sci USA 83: 6672-6676 (1979). Pivo protitelo je mišje monoklonsko anti-HIVgpl20 protitelo (Du Pont, Inc. #NEA9305), uporabljeno v razredčenju 1:500. Drugo protitelo je kozji-anti-mišji IgG (H+L), pripojen na alkalno fosfatazo (BioRad, Inc., #170-6520), uporabljen v razredčenju 1:1000. Reagente (BCIP in NBT) in protokole za obarvanje je dobavila Promega, Inc.
Konstruiranje plazmida pselP-gpl60MN in himernega virusa vselP-gpl60MH·
Sintetični zgodnji/pozni promotor selP (SEQ ID NO:70) S. Chakrabarti & B. Moss; glej evropsko patentno prijavo št. 91 114 300.-6, Recombinant Fowlpox Virus), kije eden od najmočnejših znanih promotorjev virusa vakcinije, smo uporabili v tem primeru, da smo izrazili gpl60-gen seva HIV-1 MN. Najprej smo konstruirali plazmid pselP-gpi-L2 (sl. 9.4). Ta plazmid vključuje selP-promotor, ki mu sledi mnogotemo mesto za kloniranje za vstavljanje tujih genov, bodisi kot popoln ali nepopoln odprt bralni okvir, in translacijski stop kodoni v vseh bralnih okvirih, ki jim sledi zgodnji transkripcijski stop signal virusa vakcinije ΊΤΤΤΤΝΤ. Rohrmann et al., Celi 46:1029-1035 (1986). P7.5 gpi-genska kaseta se nahaja tik ob promotorju in služi kot dominanten selekcijski marker. Falkner et al., J. Virol. 62: 1849-1854 (1988). Ob selP-promotor/marker genskih kasetah leže bočno cepitvena mesta za restrikcijske endonukleaze, ki so edina v genomu virusa vakcinije (Sfil, Noti, Rsrll) in ki jih lahko tudi izrežemo kot fragmente s topimi konci (npr. s cepitvijo s Hpal in S/ίαΒΙ). Da bi bili sposobni vstaviti gpl60-gen v pselP-^pi-L2, smo okoli translacijskega startnega kodona uvedli mesto Ncol. Ta mutacija ima za posledico substitucijo amino kisline arginina (AGA) z alaninom (GCC). Ni verjetno, da bi ta mutacija v drugi amino kislini signalnega peptida motila učinkovito izražanje gpl60-gena. Postopek kloniranja in sekvenca okoli divjetipskega in modificiranega gpl60-gena sta prikazana na sl. 9.5. Da bi uvedli to mutacijo v gpl60-gen, smo zamenjali s PCR dobljen bližen fragment. Konstrukcija plazmida je podrobneje opisana niže.
pL2: Za konstruiranje pL2 smo 0,6 kb Xbal-Clal fragment plazmida pTM3 (Moss et al., Nature, 348: 91 (1990) substituirali z Xbal-Clal adaptorskim fragmentom, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov o-542 (SEQ ID NO: 52) 5’-CGA TTA CGT AGT TAA CGC GGC CGC GGC CTA GCC GGC CAT AAA AAT-3’ in o-544 (SEQ ID NO: 53) 5’-CTA GAT ITT TAT GGC CGG CTA GGC CGC GGC CGC GTT AAC TAC GTA AT-3’. Intermediami plazmid, kije nastal pri tej stopnji kloniranja, smo imenovali pLl. 0.84kb Aatll-Sphl fragment (deli gpi-sekvenc, ki ne kodirajo) smo substituirali z Aatll-Sphl adaptorskim fragmentom, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov o-541 (SEQ ID NO: 54: 5’-CTT TTT CTG CGG CCG CGG ATA TGG CCC GGT CCG GTT AAC TAC GTA GAC GT-3’) in 0-543 (SEQ ID NO: 55: 5’-CTA CGT AGT TAA CCG GAC CGG GCC ATA TAG GCC GCG GCC GCA GAA AAA GCA TG-3’). Nastali plazmid smo imenovali pL2.
pTZ-L2: Xbal-Sphl fragment (ki sestoji iz segmenta T7-promotor-EMC-T7terminator, mnogotemega mesta za kloniranje in Pl.S-gpt genske kasete) smo obdelali s Klenowo polimerazo in vstavili med mesti Pvull plazmida pTZ19R (Pharmacia, Inc.). Nastali plazmid smo imenovali pTZ-L2 (SEQ ID NO: 64). Dodatne značilnosti tega pazmida so prikazane niže v tabeli.
Mesto
1-55 56 -108
110-860
861 -1338 1339-1344
1345 -1488
1489 -1558
1559 - 2131
2132 - 2187 2190 - 2242 2243 - 4701 pTz-L2 (4701 bp) (SEQ ID NO: 64) λ
Opis sekvence pTZ19R (Pharmacia)
Linker I v rc-orientaciji (5TNT, Noti, Sfil, RsrII,
Hpal, SnaBI, Aatll sekvence E. coli gpt v rc-orientaciji. gpt odprti bralni okvir se začne z rc TAC startnim kodonom pri položaju 860 in konča z rc ATT stop kodonom pri položaju 403 sekvence p7.5 promotorja virusa vakcinije v rc orientaciji mesto Hpal med bakteriofagnim T7 terminatoijem in p7.5 promotoijem virusa vakcinije sekvence bakteriofagnega T7 terminatorja v rc orientaciji (Studier et al.) mnogoterno mesto za kloniranje v rc'orientaciji (Šali, translacijski stop kodoni za vse tri odprte bralne okvire, Stul, Xhol, Pstl, BamHI, Spel, SacI, Smal, EcoRI, Ncol) sekvence iz 5’ neprevedenega področja () virusa encefalomiokarditisa (EMC-virus) v rc orientaciji sekvence bakteriofag-T7 promotorja v rc orientaciji () Linker II v rc-orientaciji (SnaBI, Hpal, Noti, Sfil, 5TNT) sekvence pTZ19R (Pharmacia)
PTZselP-L2 in pselP-gpf-L2: 0.6 kb Clal-Ncol fragment (T7-promotor-EMCsekvenca) smo nadomestili s fragmentom sintetičnega promotoija, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov o-selPI (SEQ ID NO: 56: 5’-CGA TAA AAA TTG AAA TTT TAT TTT ITT TTT TTG GAA TAT AAA TAA GGC CTC-3’; 51 mer) in o-selPII (SEQ ID NO: 57: 5’-CAT GGA GGC CTT ATT TAT ATT CCA AAA AAA AAA AAT AAA ATT TCA ATT ΤΊΤ AT-3’). Nastali intermediami plazmid pTZselP-L2 še vedno vsebuje T7-terminator in mesto Hpal, ki smo ju odstranili v naslednji stopnji kloniranja, s čimer smo vstavili stop signal za zgodnje prepisovanje vakcinije in zmanjšali velikost P7.5 promotorskega fragmenta od 0.28 na 0.18 kb. (239 bp) SaH-Ndel fragment smo nadomestili s SaH-Ndel adaptorjem, ki sestoji iz spojenih oligonukleotidov o-830 (SEQ ID NO: 58: 5’-TCG ACT ITT' TAT CA-3’) in
0-857 (SEQ ID NO: 59: 5’-TAT GAT AAA AAC-3’). Nastali plazmid smo imenovali pselP-,gpi-L2 (SEQ ID NO: 65). Dodatne značilnosti tega konstrukta so prikazane nižje v tabeli.
DselP-gpt-L2 (3878 bol (SEO ID NO: 651
Mesto 1-55 56 -108 Opis sekvence pTZ19R (Pharmacia) Linker I v rc-orientaciji (5TNT, Noti, Sfil, RsrII,
110 - 860 Hpal, SnaBI, Aatll) sekvence E.coli gpt v rc-orientacijski. gpt odprt bralni okvir se začne z rc TAC startnim kodom na položaju 860 in
861 -1245 konča z rc ATT stop kodonom pri položaju 403 sekvence p7.5 promotorja virusa vakcinije v rc orientaciji, ki se začno s p7.5 notranjim mestom Ndel pri položaju 1241
1246 -1258 stop signal za zgodnje prepisovanje virusa vakcinije v rc orientaciji, ob katerem ležita bočno mesto Ndel (položaj 1245) in mesto Sall (položaj 1253)
1259 -1322 mnogotemo mesto za kloniranje v rc orientaciji (Sall, transtlacijski stop kodoni za vse tri bralne okvire Stul, Xhol, Pstl, BamHl, Spel, SacI, Smal, EcoRI, Ncol)
1323 -1374 sintetični zgodnji pozni promotor virusa vakcinije v rc orientaciji, ob katerem leži bočno mesto Ncol pri položaju 1317 in mesto Clal pri položaju 1370
1375 -1414 1415 - 3878 Linker II v rc orientaciji (SnaBI, Hpal, Noti, Sfil, 5TNT) sekvence pTZ19R (Pharmacia)
pselP-gpl60MN: 3.1 kb env gen, ki vsebuje £coRI in PvuII fragment plazmida pMNenvI, smo vstavili v plazmid pselP-gp/-L2, razrezan z EcoRI in Stul, da je nastal intermediarni plazmid pselP-gpl60.1. 0.8 kb Ncol-Nsil fragment plazmida pselPgpl60 smo nadomestili z 0.31 kb Ncol-Nsil fragmentom, dobljenim s PCR, da smo dobili končni plazmid pselP-gpl60MN (SEQ ID NO: 66). Dodatne značilnosti tega plazmida so prikazane niže v tabeli.
pselP-gpl60MN (6474 bp) (SEQ ID NQ:66)
K
Mesto Opis
- 55 sekvence pTZ19R (Pharmacia)
-108 Linker I v rc orientaciji (5TNT, Sfil, RsrII, Hpal, SnaBI,
Aatll)
110 - 860 sekvence E. coli gpt v rc orientaciji, gpt odprt bralni okvir se začne pri položaju 860 z rc TAC startnim kodonom in konča pri položaju 403 z rc ATT stop kodonom
861 -1245 sekvence p7.5 promotorja virusa vakcinije v rc orientaciji, ki se začenjajo s p7.5 internim mestom Ndel pri položaju 1241
1246 -1258 stop signal za zgodnje prepisovanje virusa vakcinije v rc orientaciji (položaj 1245-1252), ob katerem leži bočno mesto Ndel pri položaju 1241 in mesto Sall pri položaju 1253
1259 - 3916 HIV-MN env-gen v rc orientaciji. ORF se začne pri položaju
3916 z rc TAC startnim kodonom in konča pri položaju 1348 z rc ATT stop kodonom
3917 - 3970 sintetični zgodnji pozni promotor virusa vakcinije v rc orientaciji, ob katerem ležita bočno mesto Ncol (položaj 3913) in mesto Clal (položaj 3966)
3971 - 4015 Linker II v rc-orientaciji (SnaBI, Hpal, Noti, Sfil, 5TNT)
4016 - 6474 sekvence pTZ19R (Pharmacia).
Primerja, ki smo ju uporabili za PCR-reakcijo, sta bila o-Ncol (40mer) SEQ ID NO:60: 5’-GAG CAG AAG ACA GTG GCC ATG GCC GTG AAG GGG ATC AGG A-3’, in o-Nsil (30mer) SEQ ID NO:61: 5’-CAT AAA CTG ATT ATA TCC TCA TGC ATC TGT-3’. Za nadaljnje kloniranje smo PCR-produkt cepili z Ncol in Nsil.
Himema virusa vselP-gpl60MHA in vselP-gp!60MHB konstruiramo tako-le: Hpalfragment, ki sestoji iz selP-gpl60 in P7.5-gpi-genskih kaset, vstavimo z direktnim molekulskim kloniranjem (sl. 9.6) v edino mesto Smal seva WR6/2 vakcinije [Moss et al., J. Virol. 40: 387-395 (1981)], ki je močno oslabljen sev virusa vakcinije. Glej Buller et al., Nature 3Yk 803-815 (1985). Sev WR6/2 virusa vakcinije (Moss et al., zgoraj) razrežemo na njegovem edinem mestu Smal in ligiramo s 4.0kb Hpalfragmentom, ki vsebuje P7.5-gpi-gensko in selP-gpl60-gensko kaseto. Postopek kloniranja izvedemo tako, kot je opisano v primeru 1.
Nastala himema virusa, vselP-gpl60MNA in VselP-gpl60MNB, očistimo in dalje karakteriziramo. V virusu vselP-gpl60MNA se gp 160-gen prepisuje v isti smeri (od leve proti desni) kot geni, nakopičeni okoli mesta za vstavljanje [A51R odprt bralni okvir; Goebel et al., Virology 179: 247-266 (1990)]. V virusu vselP-gp!60MNB se gpl60-gen prepisuje v obratni smeri. In vivo pakiranje izvedemo tako, kot je opisano v primeru 3.
Struktura himemih virusov: Da bi potrdili teoretsko strukturo himemih virusov (sl. 9.7), smo izvedli analize Southemovih prenosov. DNA očiščenih virusov smo cepili s Sall in fragmente ločili na agaroznem gelu, prenesli na nitrocelulozno membrano in hibridizirali s sondo s SflZF-fragmentom vakcinije (pTZ-SalF) in gpl60-gensko sondo (pMNenvl). S sondo SalF-fragmenta sta za vselP-gpl60MNA vidna napovedana 6.8 in 10.7 kb fragmenta, in za vselP-gpl60MnB sta vidna napovedana 3.5 in 13.7 kb fragmenta. S sondo z gpl60 so vidni isti fragmenti, le da dajeta 10.7 kb fragment v vselPgpl60MNA in 3.5 kb fragment v vselP-gpl60MNB manj intenzivne signale, ker je samo okoli 400 bp vsakega celotnega fragmenta homolognega s sondo.
Ker ima direktno kloniranje za posledico tudi vključitev tandemskih multimernih struktur, razgradimo DNA virusov tudi z Xbal, ki ne razreže vstavljene DNA. Divjetipski Xbal fragment ima velikost 447bp. Vključitev ene kopije vstavka z velikostjo 3.8 kb ima za posledico nastanek fragmenta s 4.3kb. V multimernih strukturah narašča velikost tega 4.3kb fragmenta s porasti po 3.8kb.
Raziskave izražanja s himernima virusoma vselP-gpl60MNA in vselP-gp!60MNB: Za raziskave izražanja smo uporabili celice Vero. Rast celic, okuženje s himemimi virusi in čiščenje rekombinantnega gpl60 proteina izvedemo, kot so opisali Barrett et al., zgoraj.
100
PRIMER 10 Konstruiranje novih himemih virusov vakcinije, ki kodirajo humani protein S (vProtS), in izražanjeJekombinantnega proteina S
Ta primer ponazarja konstruiranje rekombinantnega proteina S, ki ga izraža himemi virus vakcinije. Humani protein S je glikoprotein s 70 kDa, ki je udeležen pri uravnavanju koagulacije krvi. DiScipio et al., Biochemistry 18: 89-904 (1979). cDNA in genomsko DNA proteina S so klonirali in karakterizirali. Londvvall et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6716 (1986); Hoskins et al., Proč. Natl. Acad. ScL USA, 84: 349 (1987); Edenbrandt et al., Biochemistry, 29: 7861 (1990); Schmidel et al., Biochemistry, 29: 7845 (1990).
Humani protein S, ki se normalno tvori kot protein s 70 kDa v jetrih in endotelijskih celicah (DiScipio et al., zgoraj), so izrazili v stalnih celičnih linijah, izvedenih iz humanih celic 293 in hrčkovih celic AV12-664 (z adenovirusom transformirane celične linije) z nivoji do 7 /ig/106 celic/dan (Grinnell et ai.,Blood, 76: 2546 (1990)) v sistemu mišjih celic C127/papilloma virus ob podobnih nivojih izražanja. Malm et al., Eur. J. Biochem., 187: 737 (1990). Protein, izvirajoč iz drugo navedenih celic, je bil večji kot iz plazme izvirajoči protein S, verjetno zaradi anomalne glikozilacije.
Tukajšnje izražanje proteina S uporablja dvojno gensko kaseto, ki sestoji iz komplementarne DNA za protein S humanega krvnega faktorja in gpf-gena, ki ju vsakega kontrolira promotor vakcinije. To smo klonirali v edino mesto Noti in zapakirali v sesalske celice, okužene s pomožnim virusom kurjih koz. Humani protein S se je izrazil v okuženih celicah Vero v nivojih 4-6 μβ na 106 celic.
Za screening celic za optimalno izražanje proteina S s himemim virusom vakcinije smo uporabili 5 različnih linij gostiteljskih celic, WI 38 (humani embrionalni pljučni fibroblast), CV-1 in Vero (opičje ledvične celice), Changove jetrne in SK Hepl. Proteina S po več kriterijih ni bilo mogoče razlikovati od proteina S, ki izvira iz plazme: rekombinantni material, ki izvira iz okuženih celic te celične linije, je kazal enake vzorce elektroforezne migracije in enake profile kromatografske elucije, kot protein S, ki izvira iz plazme. To kaže na to, daje prišlo do pravilne post-translacijske modifikacije tega kompleksnega glikoproteina. Metode so podrobno opisane nižje.
101
Konstruiranje plazmida pN2-gptaProtS. Enoverižno DNA, pripravljeno iz plazmida pBluescript-ProtS, ki obsega cDNA, ki kodita za humani protein S (priskrbel R. T. A. McGillivray), smo uporabili, da smo mutagenizirali področje okoli prevajalnega startnega kodona področja za kodiranje proteina S v mesto Ncol (CCATGG). Mutagenski primer, oProtSl (SEQ ID NO: 68),ima sekvenco 5’-ACC CAG GAC CGC CAT GGC GAA GCG CGC-3’; mutagenezo smo izvedli tako, kot je opisano v protokolu za mutagenezo (Amersham, Inc.). Signalni peptid mutira, pri čemer se druga amino kislina spremeni iz Arg v Ala (sl. 10.1 B in SEQ ID NO 77 in 79). To uvede mesto Ncol, ki je potrebno za nadaljnje kloniranje, in privede ATG startni kodon v optimalen kontekst za prevajanje. To lahko izboljša izločanje proteina S.
cDNA proteina S smo nato izrezali kot NcoI-Noil-fragment in vstavili v insercijski plazmid pTKgpt-selP vakcinije (Falkner et al., zgoraj), plazmid, ki daje močan sintetičen promotor vakcinije. Gensko kaseto promotor-protein S smo nato izrezali kot Bg/II-Abil-fragment in vstavili v plazmid pN2-gpta (primer 1), da je nastal pN2gptaProtS (SEQ ID NO: 67). Dodatne značilnosti tega konstrukta so prikazane na spodnji tabeli.
pN2-gptaProtS (6811 bp) (SEQ ID NO: 67)
Mesto
Opis
- 2217 2218 - 2225 2226 - 4938
4939 - 4992
4993 - 5493 5494 - 6127
6228 - 6235 6236 - 6811
Bluescript II SK-sekvence (Stratagene) mesto 1 Noti sekvence ProtS v rc-orientaciji. Odprt bralni okvir se začne pri položaju 4938 z rc TAC startnim kodonom in konča pri položaju 2910 z rc ATT stop kodonom sintetični zgodnji pozni promotor virusa vakcinije v rc orientaciji, ob katerem ležita bočno mesto Ncol (položaj 4935) in združeno mesto Bglll/BamHI (položaj 4987-4992). Mesto vključuje Ncol Prot S rc startni kodon TAC sekvence p7.5 promotorja virusa vakcinije gpt-sekvence E. coli. ORF se začne pri položaju 5494 z ATG startnim kodonom in konča pri položaju 5950 s TAA stop kodonom mesto 2 Noti
Bluescript II SK-sekvence (Stratagene)
102
V tem plazmidu se gpt-gen, ki ga kontrolirata P7.5 promotor virusa vakcinije in cDNA proteina S, prepisuje divergentno in bočno ob njem leže mesta Noti.
Vstavljanje cDNA za humani protein S v edino mesto Noti virusa vakcinije, da nastane vProtS. JVbri-fragment, ki sestoji iz kaset gpt-gena in gena proteina S, smo ligirali s kraki vektorja vakcinije in transfektirali v sesalske celice CV-1, okužene z FPV. Pod temi pogoji se je razmnoževal samo zapakirani virus vakcinije. Natančneje, DNA divjetipske vakcinije seva WR (1 μξ) smo razrezali z Noti in encim inaktivirali s toploto 30 min pri 65°C. Vektor smo preko noči ligirali z 1 μ% genske kasete 3.8kb gpt/protein S (izrezane kot Voil-fragment iz plazmida pN2gpta-ProtS) v 30 μΐ ob uporabi 15 enot T4 DNA ligaze.
Surovi virusni material, ki smo ga pripravili po 5 dneh inkubacije, smo titrirali v prisotnosti in v odsotnosti mikofenolne kisline (MPA). S’tem postopkom seje dalo razlikovati med himemim in nazaj zligiranim divjetipskim virusom. Z MPA smo dobili 4 χ 104, brez nje pa 6 χ 105 pfu/106 gostiteljskih celic. Okoli 6-7 % virusnih plakov je bilo himernih virusov. 10 gpt-pozitivnih izolatov smo dvakrat plakno očistili, vzgojili do majhnih množin surovega materiala in uporabili za okuženje celic CV-1. Pripravili smo totalno DNA, jo razrezali z restrikcijskima encimoma Sad in Noti in podvrgli analizi Southemovih prenosov (sl. 10.2). S Sad razgrajeni material, hibridiziran s kloniranim SacI-I-fragmentom (plazmid pTZ-SacI; primer 4), je omogočil določitev orientacije vstavljene DNA, ker reže Sad vstavke asimetrično. V vseh desetih izolatih so bili vstavki v a-orientaciji (fragmenta s 6.3 in 4.6 kb; glej sl. 10.2 A in C), kar kaže na to, da je ta konfiguracija močno prednostna. Noti fragmente smo hibridizirali s sondo s proteinom S. V tem primeru se je sprostila 3.8 kb Noti genska kaseta (sl. 10.2 B).
Izražanje humanega proteina S s himemim virusom vakcinije. Iz gpt-pozitivnih himernih virusov smo vzgojili surovi material in ga uporabili za okuženje različnih sesalskih celičnih linij. Enocelične sloje s po 5 χ 106 celic smo okužili z 0,1 pfu/celico v prisotnosti medija brez seruma (DMEM), ki mu je bilo dodanega 50 /xg/ml vitamina K, in inkubirali 72 ur. Supematante smo zbrali in določili antigen proteina S ob uporabi testnega kompleta za ELISA firme Boehringer Mannheim, ZRN (Kit Nr. 1360264). Množine sintetiziranega proteina S so podane v tabeli 1 v milienotah (1 U ustreza 25 ^g proteina S).
103
Alternativno smo 10 μΐ supernatanta iz celic Vero analizirali z Westernovim prenosom ob uporabi 50 ng humanega, iz plazme izvirajočega proteina S kot standarda in mišjega poliklonskega seruma, specifičnega za hu Prot S (Axell) (sl. 10.3). Prenose smo obarvali ob uporabi z alkalno fosfatazo konjugiranega kozjega protimišjega poliklonskega seruma (Dakopatts) in NBT/BCIP kot substrata.
Čiščenje rekombinantnega proteina S iz supematantov celične kulture smo izvedli tako, kot opisujejo Grinnell et al., 1990.
Tabela 10.1
Celična linija ATCC# mU huProtS na 106 celic
SKHepl (HTB52) 750
Vero (CCL 81) 127
Chang, jetra (CCL13) 135
CV-1 (CCL 70) 450
WI38 (CCL 75) 440
PRIMER 11. Konstruiranje novih himemih virusov vakcinije, ki kodirajo humani faktor IX, in izražanje rekombinantnega faktorja IX
Dvojno gensko kaseto, ki sestoji iz komplementarne DNA za humani krvni faktor IX in gpt-gena, kiju vsakega kontrolira promotor vakcinije, smo klonirali v edino mesto Noti genoma virusa vakcinije WR in zapakirali v sesalske celice, okužene s pomožnim virusom kurjih koz. Humani faktor IX smo izrazili v različnih vrstah celic.
Humani koagulacijski faktor IX je glikoprotein s 56 kDa, ki je udeležen pri uravnavanju strjevanja krvi. Ta koagulacijski faktor pretrpi kompleksne posttranslacijske modifikacije: od vitamina K odvisno karboksiliranje prvih 12 glutaminskih ostankov, glikoziliranje, 3-hidroksiliranje asparaginske kisline in pretvorbo aminoterminalnega proteina. Davie, E. W., The Blood Coagulation Factors: Their cDNAs, Genes and Expression, Hemostasis and Thrombosis, Colman, R. W., Hirsh, J. Marder, V.J. in
104
Salzman, E. W., eds., J. B. Lippincott Co. (1987). Hemofilijo B, nepravilnost pri krvavenju, vezano na kromosom X, povžroča mutacija faktorja IX. Bolnike s hemofilijo zdravijo običajno z nadomeščanjem s faktorjem IX, izvirajočim iz plazme.
cDNA in genomsko DNA faktorja IX (FIX) so klonirali in karakterizirali in FIX izrazili v permanentnih celičnih linijah. Busby et al., Nature, 316: 271 (1985); Kaufman, et al., J. Biol. Chem., 261: 9622 (1986); Balland, et al., Eur. J. Biochem., 172: 565 (1922), in Lin et al., J. Biol. Chem., 265:144 (1990). Opisali so tudi izražanje faktoija IX v rekombinantih vakcinije. de la Salle, et al., Nature, 316: 268 (1985).
Konstruiranje plazmidov.
pN2gpta-FIX: cDNA iz FIX (ki jo je ljubeznivo priskrbel R. T. A. MacGillivray) smo iz plazmida pBluescript-FIX izrezali z £coRI in ligirali s plazmidom pTM3, lineariziranim zEcoRI. Moss, et al., Nature, 348: 91 (1990). Iz rekombinantnega plazmida, ki je vseboval vstavek FIX v pravilni orientaciji, smo izolirali enoverižno DNA in okoli FIX ATG startnega kodona uvedli mesto Ncol (CCATGG) z mestno usmerjeno in oligonukleotidno posredovano mutagenezo ob uporabi oligonukleotida oFIX.l (SEQ ID NO: 71 5’-TCA TGT TCA CGS GCT CCA TGG CCG CGG CCG CAC C-3’) in komercialnega kompleta za mutagenezo (Amersham, Inc.; kit No. PPN 1523). Vektor in mesto Ncol faktorja FIX smo združili, DNA vstavka izolirali z razgradnjo z Ncol in Noti in ligirali z vektorjem pTKgpt-selP, razrezanim z Ncol/Notl. Falkner et al., zgoraj. Kaseto promotor/FIX smo izrezali iz tega plazmida z Bglll in Noti in ligirali z vektorjem pN2-gpta, lineariziranim z BamHl/Notl (primer 1). Iz tega konstrukta smo izolirali kaseto Noti, ki je vsebovala cDNA faktoija FIX (po kontrolo selP-promotoija) in gpt-gen (pod kontrolo P7.5 promotoija vakcinije) in jo uporabili za in vitro molekulsko kloniranje in pakiranje, kot je opisano v primeru 10.
Dodatne karakteristike tega plazmida so prikazane niže v tabeli.
pN2gpta-FIX (5532bp) (SEQ ID NO:72)
Mesto
- 2217 2218 - 2225 2226 - 3659
Opis
Bluescript II SK-sekvence (Stratagene) mesto 1 Noti sekvenca faktoija FIX v rc-orientaciji. Odprti bralni okvir
105 se začne pri položaju 3659 z rc TAC startnim kodonom in konča pri položaju 2276 z rc ATT stop kodonom
3660 - 3713 sintetični zgodnji pozni promotor virusa vakcinije v rc orientaciji, ob katerem leži bočno mesto Ncol (položaj 3656) in združeno mesto Bglll/BaniHl (položaj 3708-3713). Mesto Ncol vključuje rc startni kodon TAC faktorja FIX
3714 - 4214 sekvence P7.5 promotoija virusa vakcinije
4215 - 4848 E. coli gpi-sekvence. ORF se začne pri položaju 4215 z ATG startnim kodonom in konča pri položaju 4671 s TAA stop kodonom
4849 - 4856 mesto 2 Noti
4857 - 5532 Bluescript II SK-sekvence (Stratagene).
Vstavljanje cDNA za humani faktor IX v edino mesto Noti virusa vakcinije. Pred vstavljanjem cDNA faktorja IX v virus vakcinije smo to cDNA vstavili v plazmid pN2-gpta, da je nastal plazmid pN2gpta-FIX (sl. 11.1A, SEQ ID NO: 72). Da bi dobili optimalen sekvenčni kontekst med sintetičnim promotoijem vakcinije in področjem za kodiranje faktorja IX, smo 5’ neprevedeno področje faktorja IX odstranili tako, da smo uvedli novo mesto Ncol pri startnem kodonu faktorja IX in združili to mesto Ncol z mestom Ncol, ki ga daje na razpolago promotor. Posledica te mutacije je bil mutiran signalni peptid (sl. 11.IB). V divjetipskem faktorju IX je druga amino kislina signalnega peptida ostanek glutamina, medtem ko je v pN2gptaFIX druga amino kislina ostanek glutaminske kisline.
Noti fragment, ki sestoji iz gpt-genske kasete in genske kasete faktorja IX, smo ligirali s kraki vektorja vakcinije in transfektirali v sesalske celice CV-1, okužene z FPV. Pod temi pogoji se je razmnoževal samo zapakirani virus vakcinije. Surovi virusni material, pripravljen po 5 dneh inkubacije, smo titrirali v prisotnosti in odsotnosti mikofenolne kisline (MPA). Ta postopek razlikuje med himemim in nazaj zligiranim divjetipskim virusom. Z MPA smo dobili 5 χ 104 in brez njega 5 χ 106 pfu/106 gostiteljskih celic. Okoli 1 % virusnih plakov je bilo v tem primeru himemih virusov. 10 gpt-pozitivnih izolatov smo dvakrat plakno očistili, vzgojili do majhnih množin surovega materiala in uporabili za okuženje celic CV-1. Totalno DNA smo pripravili iz osmih celičnih kultur, okuženih s posameznimi virusnimi izolati, razgradili z restrikcijskimi encimi Sful, Ndel in Noti in analizirali s Southernovim prenosom.
106
S Sful razgrajeni material, hibridiziran s sondo faktorja IX, je omogočil določitev orientacije vstavljene DNA, ker reže Sful vstavke asimetrično. V vseh osmih izolatih so bili vstavki v a-orientaciji (fragmenta s 6.3 in 4.6 kb; glej sl. 11.2), kar kaže na to, da je ta konfiguracija močno prednostna. Ndel (Noti) fragmente smo hibridizirali tudi s sondo s faktorjem IX. V tem primeru se je sprostil fragment s 656kb (3.8kb Noti genska kaseta), s čimer je bila dokazana napovedana struktura.
Izražanje humanega faktorja IX. Surove materiale smo vzgojili iz osmih izolatov posameznih plakov in jih uporabili za okuženje različnih sesalskih celičnih linij. 5 x 106 celic v 10 cm petrijevki smo okužili z moi (razmerje med virioni in dovzetnimi celicami) 0,1 pfu/celico v prisotnosti medija brez seruma (DMEM) in 50 /zg/ml vitamina K. Okužene celice smo inkubirali 72 ur, dokler celice niso začele odstopati od dna petrijevke. Supernatante smo zbrali, celične fragmente odstranili s centrifugiranjem in ob uporabi kompleta za test ELISA firme Boehringer Mannheim, ZRN (Kit Nr. 1360299) določili množine faktorja FlX. Množine antigena faktorjev FIX in aktivnosti faktorja IX so navedene v tabeli 11.1.
Alternativno smo 10 μΐ supematanta celic Vero analizirali z Westemovim prenosom ob uporabi 50 ng huFIX, izvirajočega iz humane plazme, kot standarda, in mišjega poliklonskega seruma, specifičnega za huFIX (Axell). Prenose smo obarvali ob uporabi z alkalno fosfatazo konjugiranega kozjega-protimišjega poliklonskega seruma (Dakopatts) in NBT/BCIP kot substrata. Kot kaže sl. 11.3, se je rekombinantni material selil kot širok trak, podobno kot standard faktorja IX, izvirajočega iz plazme. Koagulacijski poskusi s faktorjem IX, izvirajočim iz delno očiščenih celic Vero, so pokazali, daje bilo okoli 50 % materiala aktivni faktor IX. Virusni izolat #5, označen kot vFIX#5, smo vzgojili do velikega obsega in uporabili za nadaljnje poskuse.
Kot v primeru himernih virusov proteina S (primer 10) so imele himere, ki izražajo faktor IX, vstavke v eni prednostni orientaciji.
Protein prepisovanja gena, kije zanimiv (faktor IX in protein S), je bil od desne proti levi, (.j. ista smer, kot za gene, ki so nakopičeni okoli mesta Noti. Zato se zdi, da je treba močno prepisane enote poravnati v prednostni prepisovalni smeri, če jih kloniramo v kopico Noti. Virusi s to konfiguracijo vstavka so močno prednostni in kažejo najboljše rastne karakteristike. Smer prepisovanje druge genske kasete, P7.5 gpt gena, je bila od leve proti desni. P7.5 promotorski segment je zato v konfiguraciji
107 obrnjene ponovitve glede na bližnji endogeni gen, ki kodira za 7.5 kDa protein, t.j. prednostna je pričakovana stabilna konfiguracija. Ker nismo našli nobenih himer z obratno orientacijo, je b orientacija verjetno nestabilna. Vstavljanje zgoraj omenjene genske kasete v b-orientaciji z rekombinacijo in vivo bi se ponesrečila, kar bi privedlo do napačnega tolmačenja, da je intergensko področje Noti bistveno za virusno rast. Ta situacija ilustrira eno od prednosti načina dela z direktnim kloniranjem: tvorijo se samo strukture, ki so dopustne.
Z vstavljanjem enostavnih majhnih genskih kaset smo dobili obe orientaciji in multimere (primer 1), medtem ko so nastale z vstavljanjem kompleksnih genskih kaset (divergentno prepisanih dvojnih genskih kaset s homolognostmi z notranjimi geni, kot je P7.5 promotorski segment) prednostne strukture.
Screening celic z optimalnim izražanjem faktorja IX je pokazal, daje imelo okuženje celic CV-1 in SK Hepl za posledico najvišje nivoje antigena. Material iz celic CV-1 je imel najmočnejšo koagulacijsko aktivnost (tabela 11.1), kar kaže na to, da ima ta celična linija učinkovite sisteme za post-translacijske modifikacije. Faktor IX so pred tem izrazili v konvencionalnem sistemu za izražanje vakcinije ob uporabi P7.5 promotorja in celic HepG2 in BHK (de la Salle et al., 1985). Pokazalo se je, da proizvedejo celične linije z boljšimi rastnimi karakteristikami, kot so celice Vero in CV-1, zaradi izboljšanih promotorjev in metod višje nivoje izražanja s temi virusi. Poleg tega se zdi, da imata delecija 5’-neprevedenega področja cDNA faktorja IX in modifikacija signalnega peptida pozitivne učinke na nivoje izločanja in izražanja.
Tabela 11.1
Izražanje faktorja IX v različnih celičnih linijah
celična liniia ATCC# antigen aktivnost (mU/106 celic)* razmerje %
SKHepl (HTB52) 810 183 22,5
Vero (CCL81) 500 282 56,4
Changove jetrne (CCL13) 190 100 52,6
CV-1 (CCL70) 850 1290 151,8
RK13 (CCL37) 300 460 153,3
* 1 enota ustreza 5 pg FIX na ml humane plazme
108
PRIMER 12 Konstruiranje himernega virusa kurjih koz f-envIIIB in izražanje proteinov ovojnice rekombinantnega HIVIIIB v fibroblastih piščančjih zarodkov
Pred kratkim so opisali produkcijo gpl60 v velikem obsegu v sistemu za izražanje virus vakcinije-celica Vero (Barrett et al., 1989). Ker je virus vakcinije za mnoge vretenčarje, vključno sesalce, še vedno patogen, in ker je virus kuijih koz omejen na ptičje species kot gostitelje, smo razvili sistem za izražanje, ki temelji na avipoks virusu (prijava U.S. serijska številka 07/734,741 in njena CIP). Sedaj smo konstruirali himeme viruse kuijih koz z direktnim molekulskim kloniranjem, da bi izrazili gen ovojnice HIV-1 HIB izolata (Rainer et al., 1985). V tem rekombinantnem virusu je env-gen pod kontrolo močnega sintetičnega poznega promotorja. Za proizvodnjo glikoproteinov ovojnice uporabimo himemi virus kurjih koz za to, da okužimo kulture celičnih agregatov piščančjih zarodkov. Mundt et al., PCT/WO 91 709 937.
Konstruiranje in struktura himernega virusa kurjih koz f-envIIIB. Za konstruiranje virusa f-envIIIB (sl. 12.1) smo iz plazmida pN2gpt-gpl60 izrezali kot Noti fragment dvojno gensko kaseto, ki sestoji iz P7.5-promotor/gpt-gena S4-promotor/gpl60-gena (primer 5). To kaseto smo ligirali z genomsko DNA virusa f-TK2a kurjih koz, cepljeno z Noti (primer 2) in himerni virus izolirali tako, kot je opisano v poglavju materiali in metode. Totalno DNA iz fibroblastov piščančjih zarodkov, okuženih z 12 različnimi plaki, smo razgradili s Sspl in dalje analizirali s Southernovimi prenosi in hibridizacijo z izoliranim gpl60-fragmentom kot sondo (sl. 12.2A). Napovedane fragmente s 3.7, 1.0 in 0.8 kb smo našli v 11 primerih, kar kaže na to, da se je gpl60-gen vključil v b-orientaciji (sl. 12.2B). En virusni izolat, f-LF2e, ni hibridiziral z gpl60sondo.
Dejstvo, da obstaja prednostna orientacija vstavka, kaže na možnost, da ima virus z b-orientacijo rastne prednostni pred a-orientacijo, in je a-orientacija lahko celo nestabilna. To, da pustimo virusnemu vektorju, da izbere najboljšo orientacijo, lahko smatramo kot prednost pristopa direktnega kloniranja.
Preiskave izražanja s himemim virusom f-envIIIB. Preiskave izražanja smo izvedli v fibroblastih piščančjih zarodkov (CEF). Konfluentne enocelične sloje fibroblastov CEF smo okužili z 0,1 pfu na celico različnih surovih virusnih materialov, ki smo jih gojili 5 dni. Totalne celične proteine smo ločili na 10 %-nem poliakrilamidnem gelu,
109 prenesli na nitrocelulozne membrane in dalje obdelali, kot je opisano v poglavju materiali in metode. Westemov prenos, ki'kaže izražanje gpl60, gpl20 in gp41, je prikazan na sl. 12.3 in 12.4. Vsi virusni izolati razen f-LF2e so sprožili izražanje envglikoproteinov. Virus f-LF2e je bil negativen tudi v Southemovem prenosu in zato ne nosi sekvenc gpl60 gena.
Konstruiranje f-envIIIB. 2 pg DNA vektorja pomožnega virusa f-Tk2a (primer 2) smo razrezali z Noti in ligirali s 500 ng genske kasete, ki sestoji iz P7.5-promotor/gptgena in S4-promotor/gpl60-gena. Ligiranje smo izvedli v volumnu 20 pl in 5U ligaze v času 4 dni pri 12°C. Ligacijsko zmes smo transfektirali v 6 χ 106 fibroblastov CEF, okuženih z 0,5 pfu HP2 na celico, izolata kuijih koz, dobljenega s plaknim čiščenjem HP1.441. Po inkubacijski dobi 5 dni smo pripravili surovi material (končni volumen 1 ml), ki smo ga podvajali. Surovi material smo titrirali na CEF na ploščicah s šestimi vdolbinicami in gojili 5 dni pod gpt-selekcijo (25 μ-g/ml mikofenolne kisline, 125 pg ksantina). Celice, na katerih je dalo minimalno razredčenje viden citopatičen učinek, smo pobrali in pomnožili dvakrat v skladu z istim protokolom. Surovi material, dobljen po drugem pomnoževanju iz drugega pomnoževanja, smo titrirali na fibroblastih CEF v prisotnosti gpt-selekcije in pobrali 12 posameznih plakov (fLF2a-l).
Westemovi prenosi gpl60. Westernove prenose smo izvedli v bistvu tako, kot opisujejo Towbin et al., zgoraj. Za ugotovitev prisotnosti gpl60/gpl20 je bilo prvo protitelo mišje monoklonsko anti-HIV-gpl20 protitelo (Du Pont, Inc. # NEA9305), ki smo ga uporabili v razredčenju 1:500. Za ugotovitev prisotnosti gp41 smo uporabili humani anti-HIV-gp41 3D6 Mab (priskrbel H. Katinger, Universitat fur Bodenkultur, Inst. fur Angewandte Mikrobiologie) v razredčenju 1:500. Drugo protitelo je kozji-anti-mišji IgG (H+L), pripojen na alkalni fosfat (BioRad, Inc. #170-6520), ki smo ga uporabili v razredčenju 1:1000. Reagente (BCIP in NBT) in protokole za obarvanje je dobavila firma Promega, Inc.
110
SEZNAM SEKVENC (1) SPLOŠNA INFORMACIJA:
(i) PRIJAVITELJ: DORNER, F
SCHEIFLINGER, F.
FALKNER, F. G.
PFLEIDERER, M.
(ii) NASLOV IZUMA: Direktno molekulsko kloniranje modificiranega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa (iii) ŠTEVILO SEKVENC: 84 (iv) NASLOV ZA KORESPONDENCO (A) NASLOVNIK: Foley & Lardner (B) CESTA: 1800 Diagonal Road, Suite 500 (C) MESTO: Alexandria (D) ZVEZNA DRŽAVA: VA (E) DRŽAVA: USA (F) POŠTNA ŠTEVILKA: 22313-0299 (v) RAČUNALNIŠKO BERLJIVA OBLIKA:
(A) VRSTA MEDIJA: mehki disk (B) RAČUNALNIK: IBM, kompatibilen s PC (C) OPERACIJSKI SISTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMSKA OPREMA: Patentln Release #1.0, verzija #1.25 (vi) PODATKI O TEKOČI PRIJAVI:
(A) ŠTEVILKA PRIJAVE: 07/750,080 (B) DATUM VLOŽITVE: 26. avgust, 1991 (C) KLASIFIKACIJA: neznana (viii) INFORMACIJA O ZASTOPNIKU / AGENTU:
(A) IME: BENT, Stephen A.
(B) ŠTEVILKA REGISTRACIJE: 29,768 (C) REFERENCA / KARTOTEČNA ŠTEVILKA: 30472/106 IMMU
111 (ix) INFORMACIJA O TELEKOMUNIKACIJAH:
(A) TELEFON: (703) 836-9300 (B) TELEFAX: (703) 683-4109 (C) TELEX: 899149 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 1:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 48 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
TCAAGCTTAT CGATACCGTC GCGGCCGCGA CCTCGAGGGG GGGCCCGG (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 2:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 1133 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2-gpta
112 (xi): OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AACTTAAGGG TACCGCCTCG ACATCTATAT ACTATATAGT 60
AATACCAATA CTCAAGACTA CGAAACTGAT ACAATCTCTT ATCATGTGGG TAATGTTCTC 120
GATGTCGAAT AGCCATATGC CGGTAGTTGC GATATACATA AACTGATCAC TAATTCCAAA 180
CCCACCCGCT TTTTATAGTA AGTTTTTCAC CCATAAATAA TAAATACAAT AATTAATTTC 240
TCGTAAAAGT AGAAAATATA TTCTAATTTA TTGCACGGTA AGGAAGTAGA ATCATAAAGA 300
ACAGTGACGG ATGATCCCCA AGCTTGGACA CAAGACAGGC TTGCGAGATA TGTTTGAGAA 360
TACCACTTTA TCCCGCGTCA GGGAGAGGCA GTGCGTAAAA AGACGCGGAC TCATGTGAAA 420
TACTGGTTTT TAGTGCGCCA GATCTCTATA ATCTCGCGCA ACCTATTTTC CCCTCGAACA 480
CTTTTTAAGC CGTAGATAAA CAGGCTGGGA CACTTCACAT GAGCGAAAAA TACATCGTCA 540
CCTGGGACAT GTTGCAGATC CATGCACGTA AACTCGCAAG CCGACTGATG CCTTCTGAAC 600
AATGGAAAGG CATTATTGCC GTAAGCCGTG GCGGTCTGGT ACCGGGTGCG TTACTGGCGC 660
GTGAACTGGG TATTCGTCAT GTCGATACCG TTTGTATTTC CAGCTACGAT CACGACAACC 720
AGCGCGAGCT TAAAGTGCTG AAACGCGCAG AAGGCGATGG CGAAGGCTTC ATCGTTATTG 780
ATGACCTGGT GGATACCGGT GGTACTGCGG TTGCGATTCG TGAAATGTAT CCAAAAGCGC 840
ACTTTGTCAC CATCTTCGCA AAACCGGCTG GTCGTCCGCT GGTTGATGAC TATGTTGTTG 900
ATATCCCGCA AGATACCTGG ATTGAACAGC CGTGGGATAT GGGCGTCGTA TTCGTCCCGC 960
CAATCTCCGG TCGCTAATCT TTTCAACGCC TGGCACTGCC GGGCGTTGTT CTTTTTAACT 1020
TCAGGCGGGT TACAATAGTT TCCAGTAAGT ATTCTGGAGG CTGCATCCAT GACACAGGCA 1080
AACCTGAGCG AAACCCTGTT CAAACCCCGC TTTGGGCTGC AGGAATTCGA TAT 1133
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 3:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 1133 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2-gptb (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
113
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AAAGCGGGGT TTGAACAGGG TTTCGCTCAG GTTTGCCTGT 60
GTCATGGATG CAGCCTCCAG AATACTTACT GGAAACTATT GTAACCCGCC TGAAGTTAAA 120
AAGAACAACG CCCGGCAGTG CCAGGCGTTG AAAAGATTAG CGACCGGAGA TTGGCGGGAC 180
GAATACGACG CCCATATCCC ACGGCTGTTC AATCCAGGTA TCTTGCGGGA TATCAACAAC 240
ATAGTCATCA ACCAGCGGAC GACCAGCCGG TTTTGCGAAG ATGGTGACAA AGTGCGCTTT 300
TGGATACATT TCACGAATCG CAACCGCAGT ACCACCGGTA TCCACCAGGT CATCAATAAC 360
GATGAAGCCT TCGCCATCGC CTTCTGCGCG TTTCAGCACT TTAAGCTCGC GCTGGTTGTC 420
GTGATCGTAG CTGGAAATAC AAACGGTATC GACATGACGA ATACCCAGTT CACGCGCCAG 480
TAACGCACCC GGTACCAGAC CGCCACGGCT TACGGCAATA ATGCCTTTCC ATTGTTCAGA 540
AGGCATCAGT CGGCTTGCGA GTTTACGTGC ATGGATCTGC AACATGTCCC AGGTGACGAT 600
GTATTTTTCG CTCATGTGAA GTGTCCCAGC CTGTTTATCT ACGGCTTAAA AAGTGTTCGA 660
GGGGAAAATA GGTTGCGCGA GATTATAGAG ATCTGGCGCA CTAAAAACCA gtatttcaca 720
TGAGTCCGCG TCTTTTTACG CACTGCCTCT CCCTGACGCG GGATAAAGTG gtattctcaa 780
ACATATCTCG CAAGCCTGTC TTGTGTCCAA GCTTGGGGAT CATCCGTCAC TGTTCTTTAT 840
GATTCTACTT CCTTACCGTG CAATAAATTA GAATATATTT TCTACTTTTA CGAGAAATTA 900
ATTATTGTAT TTATTATTTA TGGGTGAAAA ACTTACTATA AAAAGCGGGT GGGTTTGGAA 960
TTAGTGATCA GTTTATGTAT ATCGCAACTA CCGGCATATG GCTATTCGAC ATCGAGAACA 1020
TTACCCACAT GATAAGAGAT TGTATCAGTT TCGTAGTCTT GAGTATTGGT ATTACTATAT 1080
AGTATATAGA TGTCGAGGCG GTACCCTTAA GTTGGGCTGC AGGAATTCGA TAT 1133
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 4:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 66 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pHindJ-2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
114
CGCATTTTCT AACGTGATGG GATCCGTTAA CTCGCGAGAA TTCTGTAGAA AGTGTTACAT
CGACTC (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 5:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 127 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pHindJ-3 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
CGCATTTTCT AACGTGATGG GATCCGGCCG GCTAGGCCGC GGCCGCCCGG GTTTTTATCT CGAGACAAAA AGACGGACCG GGCCCGGCCA TATAGGCCCA ATTCTGTAGA AAGTGTTACA TCGACTC (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 6:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 115 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pAO
120
127 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
115 agggaacaaa agctggagct aggccggcta ggccgcggcc gcccgggttt ttatctcgag ACAAAAAGAC GGACCGGGCC CGGCCATATA GGCCAGTACC CAATTCGCCC TATAG (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 7:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 103 bazni pari (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pAl (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
CGGCCGCCCG GGTTTTTATC TCGACATATG CTGCAGTTAA CGAATTCCAT GGGGATCCGA
TATCAAGCTT AGGCCTGTCG ACGTCGAGAC AAAAAGACGG ACC (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 8:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 103 bazni pari (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pA2
115
103 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
116
CGGCCGCCCG GGTTTTTATC TCGACGTCGA CAGGCCTAAG CTTGATATCG GATCCCCATG 60
GAATTCGTTA ACTGCAGCAT ATGTCGAGAC AAAAAGACGG ACC 103 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 9:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 213 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pAl-Sl (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:
CCCGGGTTTT TATCTCGACA TACGGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAGTAA TTGTAAAGAA 60
GAAAACGAAA CTATCAAAAC CGTTTATGAA ATGATAGAAA AAAGAATATA AATAATCCTG 120
TATTTTAGTT TAAGTAACAG TAAAATAATG AGTAGAAAAT ACTATTTTTT ATAGCCTATA 180
AATCATGAAT TCGGATCCGA TATCAAGCTT AGG 213 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 10:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 215 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pA2-Sl
117 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:
CAGGCCTAAG CTTGATATCG GATCCGAATT CATGATTTAT AGGCTATAAA AAATAGTATT 60
TTCTACTCAT TATTTTACTG TTACTTAAAC TAAAATACAG GATTATTTAT ATTCTTTTTT 120
CTATCATTTC ATAAACGGTT TTGATAGTTT CGTTTTCTTC TTTACAATTA CTTAGTTGTC 180
CGCTATACCA AGCCGTATGT CGAGACAAAA AGACG 215 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 11:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 88 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pAl-S2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:
TCTCGACATA TGCTGCAGTT GGGAAGCTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGGC ATATAAATAG 60
GCTGCAGGAA TTCCATGGGG ATCCGATA 88 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 12:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 92 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
118 (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pA2-S2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:
TTGATATCGG ATCCCCATGG AATTCCTGCA GCCTATTTAT ATGCCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGCTTC CCAACTGCAG CATATGTCGA GA (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 13:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 127 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2gpt-S3A (sl. 4.7) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:
TACCCTTAAG TTGGGCTGCA GAAGCTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGQAT ATAAATGAAT TCCATGGCCC GGGAAGGCCT CGGACCGGGC CCGGCCATAT AGGCCAGCGA TACCGTCGCG
GCCGCGA (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 14:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 134 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna
120
127
119 (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2gpt-S4 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:
TACCCTTAAG TTGGGCTGCA GAAGCTTTTT ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΓ TTTTTGGCAT ATAAATCGTT AACGAATTCC ATGGCCCGGG AAGGCCTCGG ACCGGGCCCG GCCATATAGG CCAGCGATAC CGTCGCGGCC GCGA (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 15:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 1988 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pAlSl-PT (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:
TTTTATAGCC TATAAATCAT GAATTCCGCG CACGTCCGAG GCTTGCAGCT GCCTGGCTGC 60
CTGGCCCTGG CTGCCCTGTG TAGCCTTGTG CACAGCCAGC ATGTGTTCCT GGCTCCTCAG 120
CAAGCACGGT CGCTGCTCCA GCGGGTCCGG CGAGCCAACA CCTTCTTGGA GGAGGTGCGC 180
AAGGGCAACC TAGAGCGAGA GTGCGTGGAG GAGACGTGCA GCTACGAGGA GGCCTTCGAG 240
GCTCTGGAGT CCTCCACGGC TACGGATGTG TTCTGGGCCA AGTACACAGC TTGTGAGACA 300
GCGAGGACGC CTCGAGATAA GCTTGCTGCA TGTCTGGAAG GTAACTGTGC TGAGGGTCTG 360
GGTACGAACT ACCGAGGGCA TGTGAACATC ACCCGGTCAG GCATTGAGTG CCAGCTATGG 420
120
AGGAGTCGCT ACCCACATAA GCCTGAAATC AACTCCACTA CCCATCCTGG GGCCGACCTA 480
CAGGAGAATT TCTGCCGCAA CCCCGACAGC AGCAACACGG GACCATGGTG CTACACTACA 540
GACCCCACCG TGAGGAGGCA GGAATGCAGC ATCCCTGTCT GTGGCCAGGA TCAAGTCACT 600
GTAGCGATGA CTCCACGCTC CGAAGGCTCC AGTGTGAATC TGTCACCTCC ATTGGAGCAG 660
TGTGTCCCTG ATCGGGGGCA GCAGTACCAG GGGCGCCTGG CGGTGACCAC ACATGGGCTC 720
CCCTGCCTGG CCTGGGCCAG CGCACAGGCC AAGGCCCTGA GCAAGCACCA GGACTTCAAC 780
TCAGCTGTGC AGCTGGTGGA GAACTTCTGC CGCAACCCAG ACGGGGATGA GGAGGGCGTG 840
TGGTGCTATG TGGCCGGGAA GCCTGGCGAC TTTGGGTACT GCGACCTCAA CTATTGTGAG 900
GAGGCCGTGG AGGAGGAGAC AGGAGATGGG CTGGATGAGG ACTCAGACAG GGCCATCGAA 960
GGGCGTACCG CCACAAGTGA GTACCAGACT TTCTTCAATC CGAGGACCTT TGGCTCGGGA 1020
GAGGCAGACT GTGGGCTGCG ACCTCTGTTC GAGAAGAAGT CGCTGGAGGA CAAAACCGAA 1080
AGAGAGCTCC TGGAATCCTA CATCGACGGG CGCATTGTGG AGGGCTCGGA TGCAGAGATC 1140
GGCATGTCAC CTTGGCAGGT GATGCTTTTC CGGAAGAGTC CCCAGGAGCT GCTGTGTGGG 1200
GCCAGCCTCA TCAGTGACCG CTGGGTCCTC ACCGCCGCCC ACTGCCTCCT GTACCCGCCC 1260
TGGGACAAGA ACTTCACCGA GAATGACCTT CTGGTGCGCA TTGGCAAGCA CTCCCGCACC 1320
AGGTACGAGC GAAACATTGA AAAGATATCC ATGTTGGAAA AGATCTACAT CCACCCCAGG 1380
TACAACTGGC GGGAGAACCT GGACCGGGAC ATTGCCCTGA TGAAGCTGAA GAAGCCTGTT 1440
GCCTTCAGTG ACTACATTCA CCCTGTGTGT CTGCCCGACA GGGAGACGGC AGCCAGCTTG 1500
CTCCAGGCTG GATACAAGGG GCGGGTGACA GGCTGGGGCA ACCTGAAGGA GACGTGGACA 1560
GCCAACGTTG GTAAGGGGCA GCCCAGTGTC CTGCAGGTGG TGAACCTGCC CATTGTGGAG 1620
CGGCCGGTCT GCAAGGACTC CACCCGGATC CGCATCACTG ACAACATGTT CTGTGCTGGT 1680
TACAAGCCTG ATGAAGGGAA ACGAGGGGAT GCCTGTGAAG GTGACAGTGG GGGACCCTTT 1740
GTCATGAAGA GCCCCTTTAA CAACCGCTGG TATCAAATGG GCATCGTCTC ATGGGGTGAA 1800
GGCTGTGACC GGGATGGGAA ATATGGCTTC TACACACATG TGTTCCGCCT GAAGAAGTGG 1860
ATACAGAAGG TCATTGATCA GTTTGGAGAG TAGGGGGCCA CTCATATTCT GGGCTCCTGG 1920
AACCAATCCC GTGAAAGAAT TATTTTTGTG TTTCTAAAAC TAGAATTCGG ATTCGATATC 1980
AAGCTTAG 1988
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 16:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 26 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna
121 (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: odNl (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:
GGCCAGGCCT TTTAAATTAA GATATC 26 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 17:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 111 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: Druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: Sintetični oligonukleotid DNA (νϋ) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2gpt-GPg (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:
TTTTTGGCAT ATAAATCGTT CCAGTCCCAA AATGTAATTG GACGGGAGAC AGAGTGACGC
ACGCGGCCGC TCTAGAACTA GTGGATCCCC CAACGAATTC CATGGCCCGG G (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 18:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 2296 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna
111
122 (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2gpt-LPg (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:
ATAAATCGTT AACGAATTCC ATGGAACATA AGGAAGTGGT TCTTCTACTT CTTTTATTTC 60
TGAAATCAGG TCAAGGAAAA GTGTATCTCT CAGAGTGCAA GACTGGGAAT GGAAAGAACT 120
ACAGAGGGAC GATGTCCAAA ACAAAAAATG GCATCACCTG TCAAAAATGG AGTTCCACTT 180
CTCCCCACAG ACCTAGATTC TCACCTGCTA CACACCCCTC AGAGGGACTG GAGGAGAACT 240
ACTGCAGGAA TCCAGACAAC GATCCGCAGG GGCCCTGGTG CTATACTACT GATCCAGAAA 300
AGAGATATGA CTACTGCGAC ATTCTTGAGT GTGAAGAGGA ATGTATGCAT TGCAGTGGAG 360
AAAACTATGA CGGCAAAATT TCCAAGACCA TGTCTGGACT GGAATGCCAG GCCTGGGACT 420
CTCAGAGCCC ACACGCTCAT GGATACATTC CTTCCAAATT TCCAAACAAG AACCTGAAGA 480
AGAATTACTG TCGTAACCCC GATAGGGAGC TGCGGCCTTG GTGTTTCACC ACCGACCCCA 540
ACAAGCGCTG GGAACTTTGC GACATCCCCC GCTGCACAAC ACCTCCACCA TCTTCTGGTC 600
CCACCTACCA GTGTCTGAAG GGAACAGGTG AAAACTATCG CGGGAATGTG GCTGTTACCG 660
TTTCCGGGCA CACCTGTCAG CACTGGAGTG CACAGACCCC TCACACACAT AACAGGACAC 720
CAGAAAACTT CCCCTGCAAA AATTTGGATG AAAACTACTG CCGCAATCCT GACGGAAAAA 780
GGGCCCCATG GTGCCATACA ACCAACAGCC AAGTGCGGTG GGAGTACTGT AAGATACCGT 840
CCTGTGACTC CTCCCCAGTA TCCACGGAAC AATTGGCTCC CACAGCACCA CCTGAGCTAA 900
CCCCTGTGGT CCAGGACTGC TACCACGGTG ATGGACAGAG CTACCGAGGC ACATCCTCCA 960
CCACCACCAC AGGAAAGAAG TGTCAGTCTT ggtcatctat GACACCACAC CGGCACCAGA 1020
AGACCCCAGA AAACTACCCA AATGCTGGCC TGACAATGAA CTACTGCAGG AATCCAGATG 1080
CCGATAAAGG CCCCTGGTGT TTTACCACAG ACCCCAGCGT CAGGTGGGAG TACTGCAACC 1140
TGAAAAAATG CTCAGGAACA GAAGCGAGTG TTGTAGCACC TCCGCCTGTT gtcctgcttc 1200
CAGATGTAGA GACTCCTTCC GAAGAAGACT GTATGTTTGG GAATGGGAAA GGATACCGAG 1260
123
GCAAGAGGGC GACCACTGTT ACTGGGACGC CATGCCAGGA CTGGGCTGCC CAGGAGCCCC 1320
ATAGACACAG CATTTTCACT CCAGAGACAA ATCCACGGGC GGGTCTGGAA AAAAATTACT 1380
GCCGTAACCC TGATGGTGAT GTAGGTGGTC CCTGGTGCTA CACGACAAAT CCAAGAAAAC 1440
TTTACGACTA CTGTGATGTC CCTCAGTGTG CGGCCCCTTC ATTTGATTGT GGGAAGCCTC 1500
AAGTGGAGCC GAAGAAATGT CCTGGAAGGG TTGTGGGGGG GTGTGTGGCC CACCCACATT 1560
CCTGGCCCTG GCAAGTCAGT CTTAGAACAA GGTTTGGAAT GCACTTCTGT GGAGGCACCT 1620
TGATATCCCC AGAGTGGGTG TTGACTGCTG CCCACTGCTT GGAGAAGTCC CCAAGGCCTT 1680
CATCCTACAA GGTCATCCTG GGTGCACACC AAGAAGTGAA TCTCGAACCG CATGTTCAGG 1740
AAATAGAAGT GTCTAGGCTG TTCTTGGAGC CCACACGAAA AGATATTGCC TTGCTAAAGC 1800
TAAGCAGTCC TGCCGTCATC ACTGACAAAG TAATCCCAGC TTGTCTGCCA TCCCCAAATT 1860
ATGTGGTCGC TGACCGGACC gaatgtttca TCACTGGCTG GGGAGAAACC CAAGGTACTT 1920
TTGGAGCTGG CCTTCTCAAG GAAGCCCAGC TCCCTGTGAT TGAGAATAAA GTGTGCAATC 1980
GCTATGAGTT TCTGAATGGA AGAGTCCAAT CCACCGAACT CTGTGCTGGG CATTTGGCCG 2040
GAGGCACTGA CAGTTGCCAG GGTGACAGTG GAGGTCCTCT GGTTTGCTTC GAGAAGGACA 2100
AATACATTTT ACAAGGAGTC ACTTCTTGGG GTCTTGGCTG TGCACGCCCC AATAAGCCTG 2160
GTGTCTATGT TCGTGTTTCA AGGTTTGTTA CTTGGATTGA GGGAGTGATG AGAAATAATT 2220
AATTGGACGG GAGACAGAGT GACGCACGCG GCCGCTCTAG AACTAGTGGA TCCCCCGGGA 2280
AGGCCTCGGA CCGGGC 2296
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 19:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 56 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2gpt-gpl60 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:
124
TTTTTGGCAT ATAAATCGTT ATCCACCATG TAAGATAACG AATTCCATGG CCCGGG ' 56 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 20:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 331 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pvWF (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:
TTTTTTTTGG CATATAAATC GCGGCCGCGG GTGGTTGGTG GATGTCACAG CTTGGGCTTT 60
ATCTCCCCCA GCAGTGGGAT TCCACAGCCC CTGGGCTACA TAACAGCAAG ACAGTCCGGA 120
GCTGTAGCAG ACCTGATTGA GCCTTTGCAG CAGCTGAGAG CATGGCCTAG GGTGGGCGGC 180
ACCATTGTCC AGCAGCTGAG TTTCCCAGGG ACCTTGGAGA TAGCCGCAGC CCTCATTTGC 240
AGGGGAAGAT GTGAGGCTGC TGCAGCTGCA TGGGTGCCTG CTGCTGCCTG CCTTGGCCTG 300
ATGGCGGCCG CCCGGGTTTT TATCTCGAGA C 331
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 21:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 50 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
125 (B) KLON: pEcoK-dhr *
(xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:
ATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCGG TAATTAGATT CTCCCACATTT 50 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 22:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 1209 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vil) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pdhr-gpt (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:
ATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCTC TAGAACTAGT GGATCCCCCA ACTTAAGGGT 60
ACCGCCTCGA CATCTATATA CTATATAGTA ATACCAATAC TCAAGACTAC GAAACTGATA 120
CAATCTCTTA TCATGTGGGT AATGTTCTCG ATGTCGAATA GCCATATGCC GGTAGTTGCG 180
ATATACATAA ACTGATCACT AATTCCAAAC CCACCCGCTT TTTATAGTAA GTTTTTCACC 240
CATAAATAAT AAATACAATA ATTAATTTCT CGTAAAAGTA GAAAATATAT TCTAATTTAT 300
TGCACGGTAA GGAAGTAGAA TCATAAAGAA CAGTGACGGA TGATCCCCAA GCTTGGACAC 360
AAGACAGGCT TGCGAGATAT GTTTGAGAAT ACCACTTTAT CCCGCGTCAG GGAGAGGCAG 420
TGCGTAAAAA GACGCGGACT CATGTGAAAT ACTGGTTTTT AGTGCGCCAG ATCTCTATAA 480
TCTCGCGCAA CCTATTTTCC CCTCGAACAC TTTTTAAGCC GTAGATAAAC AGGCTGGGAC 540
ACTTCACATG AGCGAAAAAT ACATCGTCAC CTGGGACATG TTGCAGATCC ATGCACGTAA 600
ACTCGCAAGC CGACTGATGC CTTCTGAACA ATGGAAAGGC ATTATTGCCG TAAGCCGTGG 660
CGGTCTGGTA CCGGGTGCGT TACTGGCGCG TGAACTGGGT ATTCGTCATG TCGATACCGT 720
126
TTGTATTTCC AGCTACGATC ACGACAACCA GCGCGAGCTT AAAGTGCTGA AACGCGCAGA 780
AGGCGATGGC GAAGGCTTCA TCGTTATTGA TGACCTGGTG GATACCGGTG GTACTGCGGT 840
TGCGATTCGT GAAATGTATC CAAAAGCGCA CTTTGTCACC ATCTTCGCAA AACCGGCTGG 900
TCGTCCGCTG GTTGATGACT ATGTTGTTGA TATCCCGCAA GATACCTGGA TTGAACAGCC 960
GTGGGATATG GGCGTCGTAT TCGTCCCGCC AATCTCCGGT CGCTAATCTT TTCAACGCCT 1020
GGCACTGCCG GGCGTTGTTC TTTTTAACTT CAGGCGGGTT ACAATAGTTT CCAGTAAGTA 1080
TTCTGGAGGC TGCATCCATG ACACAGGCAA ACCTGAGCGA AACCCTGTTC AAACCCCGCT 114 0
TTGGGCTGCA GGAATTCGAT ATCAAGCTTA TCGATACCGT CGCGGCCGCG GTAATTAGAT 1200
TCTCCCACA 1209 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 23:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 26 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: odN2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:
GGCCGATATC TTAATTTAAA AGGCCT 26 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 24:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 24 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
127 (B) KLON: odN3 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:
CCAATGTTAC GTGGGTTACA TCAG 24 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 25:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: I-Scel linker 1 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:
TAGGGATAAC AGGGTAAT 18 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 26:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: I-Scel linker 2 (») OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:
128
ATTACCCTGT TATCCCTA ' 18 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 27:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 23 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: odS2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 27:
GTATAAAGTC CGACTATTGT TCT 23 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 28:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 26 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: odS3 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 28:
TCTGAGGCCT AATAGACCTC TGTACA
129 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 29:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE (A) DOLŽINA: 13 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: Sfil (1) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 29:
GGCCGGCTAG GCC 13 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 30:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 13 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: Sfil (2) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 30:
GGCCATATAG GCC 13 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 31:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 66 baznih parov
130 (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: odTKl (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 31:
GAGTCGATGT AACACTTTCT ACAGGATCCG TTAACTCGCG AGAATTCCAT CACGTTAGAA
AATGCG (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 32:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 79 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-J (1) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 32:
GATCCGGCCG GCTAGGCCGC GGCCGCCCGG GTTTTTATCT CGAGACAAAA AGACGGACCG GGCCCGGCCA TATAGGCCC (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 33:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 79 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina
131 (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna ' (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-J (2) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 33:
AATTGGGCCT ATATGGCCGG GCCCGGTCCG TCTTTITGTC TCGAGATAAA AACCCGGGCG 60
GCCGCGGCCT AGCCGGCCG 79 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 34:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: odTK2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 34:
AGAAGCCGTG GGTCATTG 18 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 35:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 21 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna
132 (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: odTK3 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 35:
TACCGTGTCG CTGTAACTTA C 21 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 36:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 75 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-A (0.1) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 36:
AGGCCGGCTA GGCCGCGGCC GCCCGGGTTT TTATCTCGAG ACAAAAAGAC GGACCGGGCC
CGGCCATATA GGCCA (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 37:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 83 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
133 (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA t
(vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-A (0.2) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 37:
GTACTGGCCT ATATGGCCGG GCCCGGTCCG TCTTTTTGTC TCGAGATAAA AACCCGGGCG GCCGCGGCCT AGCCGGCCTA GCT (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 38:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 55 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-artP (11) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 38:
GGCCACGTTT TTATGGGAAG (HTTTTTTTT TTTTTTTTTT TGGCATATAA ATCGC 55 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 39:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 55 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
134 (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA k
(vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-artP (12) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 39:
GGCCGCGATT TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TTCCCATAAA AACGT 55 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 40:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 93 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-artP (8) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 40:
CGCTGGCCTA TATGGCCGGG CCCGGTCCGA GGCCTTCCCG GGCCATGGAA TTCATTTATA
TGCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCTTCT GCA (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 41:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 97 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA
135 (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-artP (10) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 41:
CGCTGGCCTA TATGGCCGGG CGTCCGAGGC CTTCCCGGGC CATGGAATTC GTTAACGATT
TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC TTCTGCA (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 42:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 50 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: oligonukleotid P-hr (3) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 42:
ATTAGCGTCT CGTTTCAGAC GCGGCCGCGG TAATTAGATT CTCCCACATT 50 (2) INFORMAC2IJA ZA SEQ ID NO: 43:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 10 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA
136 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 43:
k
CTAGCCCGGG 10 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 44:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 47 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-P25’(l) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 44:
GTACGTACGG CTGCAGTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAG 47 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 45:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 50 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-P2 3’ (1) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 45:
137
TCTGACTGAC GTTAACGATT TATAGGCTAT AAAAAATAGT ATTTTCTACT ‘ 50 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 46:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 20 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-SM (2) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 46:
GTCTTGAGTA TTGGTATTAC 20 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 47:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 23 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-SM (3) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 47:
CGAAACTATC AAAACGCTTT ATG
138 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 48:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:' (A) DOLŽINA: 53 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina; (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-MN (1) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 48:
AGCTAGCTGA ATTCAGGCCT CATGAGAGTG AAGGGGATCA GGAGGAATTA TCA 53 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 49:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 30 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-MN (2) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 49:
CATCTGATGC ACAAAATAGA GTGGTGGTTG 30 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 50:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
139 (A) DOLŽINA: 27 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-Seq (2) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 50:
CTGTGGGTAC ACAGGCTTGT GTGGCCC 27 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 51:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 25 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: P-Seq (3) (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 51:
CAATTTTTCT GTAGCACTAC AGATC 25 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 52:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 45 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna
140 (D): TOPOLOGIJA: linearna
K (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-542 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 52:
CGATTACGTA GTTAACGCGG CCGCGGCCTA GCCGGCCATA AAAAT 45 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 53:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 47 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: 0-544 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 53:
CTAGATTTTT ATGGCCGGCT AGGCCGCGGC CGCGTTAACT ACGTAAT 47 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 54:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 50 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna
141 (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-541 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 54:
CTTTTTCTGC GGCCGCGGAT ATGGCCCGGT CCGGTTAACT ACGTAGACGT 50 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 55:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 53 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-543 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 55:
CTACGTAGTT AACCGGACCG GGCCATATAG GCCGCGGCCG CAGAAAAAGC ATG 53 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 56:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 51 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna
142 (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-selPI (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 56:
CGATAAAAAT TGAAATTTTA TTTTTTTTTT TTGGAATATA AATAAGGCCT C 51 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 57:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 53 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-selPII (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 57:
CATGGAGGCC TTATTTATAT TCCAAAAAAA AAAAATAAAA TTTCAATTTT TAT 53 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 58:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 14 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
143 (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-830 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 58:
TCGACTTTTT ATCA 14 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 59:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 12 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-857 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 59:
TATGATAAAA AC 12 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 60:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 40 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
144 (B) KLON: o-Ncol (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 60:
GAGCAGAAGA CAGTGGCCAT GGCCGTGAAG GGGATCAGGA 40 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 61:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 30 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: o-Nsil (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 61:
CATAAACTGA TTATATCCTC ATGCATCTGT 30 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 62:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 4145 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pS2gpt-S4 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 62:
145
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
146
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACČCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280
GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC agccggtttt GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120
CTTTTACGAG ΑΑΑΤΤΑΑΤΓΑ TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGAA 3360
GCTTTTTTTT ΤΤΤΤΓΓΤΤΤΤ TTGGCATATA AATCGTTAAC GAATTCCATG GCCCGGGAAG 3420
GCCTCGGACC GGGCCCGGCC ATATAGGCCA GCGATACCGT CGCGGCCGCG ACCTCGAGGG 3480
GGGGCCCGGT ACCCAATTCG CCCTATAGTG AGTCGTATTA CGCGCGCTCA CTGGCCGTCG 3540
147
TTTTACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG GCGTTAČCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC 3600
ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC 3660
AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGAAAT TGTAAGCGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC 3720
GITAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC 3780
TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG 3840
TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA 3900
TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC 3960
ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA 4020
CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT 4080
AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC 4140
GTCAG 4145
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 63:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 4277 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pS2gpt-P2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 63:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
148
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT AITAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT 1TATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280
GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
149
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGf CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120
CTTTTACGAG ΑΑΑΤΓΑΑΤΤΑ TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGTT 3360
GTTAGAGCTT GGTATAGCGG ACAACTAAGT AATTGTAAAG AAGAAAACGA AACTATCAAA 3420
ACCGTTTATG AAATGATAGA AAAAAGAATA TAAATAATCC TGTATTTTAG TTTAAGTAAC 3480
AGTAAAATAA TGAGTAGAAA ATACTATTTT TTATAGCCTA TAAATCGTTA ACGAATTCCA 3540
TGGCCCGGGA AGGCCTCGGA CCGGGCCCGG CCATATAGGC CAGCGATAGC GTCGCGGCCG 3600
CGACCTCGAG GGGGGGCCCG GTACCCAATT CGCCCTATAG TGAGTCGTAT TACGCGCGCT 3660
CACTGGCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC 3720
GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC 3780
GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGAA ATTGTAAGCG ΤΤΑΑΤΑΤΊΤΓ 3840
GTTAAAATTC GCGTTAAATT TTTGTTAAAT CAGCTCATTT TTTAACCAAT AGGCCGAAAT 3900
CGGCAAAATC CCTTATAAAT CAAAAGAATA GACCGAGATA GGGTTGAGTG TTGTTCCAGT 3960
TTGGAACAAG AGTCCACTAT TAAAGAACGT GGACTCCAAC GTCAAAGGGC GAAAAACCGT 4020
CTATCAGGGC GATGGCCCAC TACGTGAACC ATCACCCTAA TCAAGTTTTT TGGGGTCGAG 4080
GTGCCGTAAA GCACTAAATC GGAACCCTAA AGGGAGCCCC CGATTTAGAG CTTGACGGGG 4140
AAAGCCGGCG AACGTGGCGA GAAAGGAAGG GAAGAAAGCG AAAGGAGCGG GCGCTAGGGC 4200
GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA CGCTGCGCGT AACCACCACA CCCGCCGCGC TTAATGCGCC 4260
GCTACAGGGC GCGTCAG 4277
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 64:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 4701 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA
150 (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pTZ-L2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 64:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGACGGA 180
tggttttacc ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGGCTAT TCGACATCGA 1260
GAACATTACC CACATGATAA GAGATTGTAT CAGTTTCGTA GTCTTGAGTA TTGGTATTAC 1320
TATATAGTAT ATNNNNNNGG TAACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1380
NNNNNNNAGA TCTCGATCCG GATATAGTTC CTCCTTTCAG CAAAAAACCC CTCAAGACCC 1440
GTTTAGAGGC CCCAAGGGGT TATGCTAGTT ATTGCTCANN NNNNNNNNGT CGACTTAATT 1500
AATTAGGCCT CTCGAGCTGC AGGGATCCAC TAGTGAGCTC CCCGGGGAAT TCCCATGGTA 1560
TTATCGTGTT ITTCAAAGGA AAAAAACGTC CCGTGGTTCG GGGGGCTCTN NNNNNNNNNN 1620
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1680
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1740
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1800
151
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ 1860
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ NNNNNIJNNNN ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ 1920
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ 1980
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ 2040
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ 2100
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ NCCGCTAGAG GGAAACCGTT GTGGTCTCCC 2160
TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GATCGATTAC GTAGTTAACG CGGCCGCGGC 2220
CTAGCCGGCC ATAAAAATCT AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT 2280
CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGGAAATTGT AAACGTTAAT ATTTTGTTAA 2340
AATTCGCGTT AAATTTTTGT TAAATCAGCT CATTTTTTAA CCAATAGGCC GAAATCGGCA 2400
AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA 2460
ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 2520
AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 2580
GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGČTTGA CGGGGAAAGC 2640
CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 2700
CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 2760
AGGGCGCGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 2820
TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT 2880
AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT 2940
TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 3000
CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA 3060
TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC 3120
TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTGTTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 3180
ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 3240
GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA 3300
ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG 3360
GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG 3420
ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGCAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 3480
GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG 3540
TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG 3600
GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT 3660
CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC 3720
AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 3780
CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ΑΤΤΓ1ΤΑΑΤΓ TAAAAGGATC TAGGTGAAGA 3840
152
TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT 3900
CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC tttttttctg CGCGTAATCT 3960
GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC 4020
TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC 4080
TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC 4140
TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG 4200
GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT 4260
CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG 4320
AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG 4380
GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT 4440
ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG 4500
GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT 4560
GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA 4620
TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT 4680
CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA G 4701
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 65:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 3878 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pselP-gpt-L2 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 65:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
153
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTJTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGČTG 840
ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCČTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGGTT 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGATAAA AAGTCGACTT 1260
AATTAATTAG GCCTCTCGAG CTGCAGGGAT CCACTAGTGA GCTCCCCGGG GAATTCCCAT 1320
GGAGGCCTTA TTTATATTCC AAAAAAAAAA ΑΑΤΑΑΑΑΤΓΤ CAATTTTTAT CGATTACGTA 1380
GTTAACGCGG CCGCGGCCTA GCCGGCCATA AAAATCTAGC TGGCGTAATA GCGAAGAGGC 1440
CCGCACCGAT CGCCCTTCCC AACAGTTGCG CAGCCTGAAT GGCGAATGGG AAATTGTAAA 1500
CGTTAATATT TTGTTAAAAT TCGCGTTAAA TTTTTGTTAA ATCAGCTCAT TTTTTAACCA 1560
ATAGGCCGAA ATCGGCAAAA TCCCTTATAA ATCAAAAGAA TAGACCGAGA TAGGGTTGAG 1620
TGTTGTTCCA GTTTGGAACA AGAGTCCACT ATTAAAGAAC GTGGACTCCA ACGTCAAAGG 1680
GCGAAAAACC GTCTATCAGG GCGATGGCCC ACTACGTGAA CCATCACCCT AATCAAGTTT 1740
TTTGGGGTCG AGGTGCCGTA AAGCACTAAA TCGGAACCCT AAAGGGAGCC CCCGATTTAG 1800
AGCTTGACGG GGAAAGCCGG CGAACGTGGC GAGAAAGGAA GGGAAGAAAG CGAAAGGAGC 1860
GGGCGCTAGG GCGCTGGCAA GTGTAGCGGT CACGCTGCGC GTAACCACCA CACCCGCCGC 1920
GCTTAATGCG CCGCTACAGG GCGCGTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC 1980
CCCTATTTGT ttatttttct AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC 2040
CTGATAAATG CTTCAATAAT ATTGAAAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC ATTTCCGTGT 2100
CGCCCTTATT CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGTT TTTGCTCACC CAGAAACGCT 2160
GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA GTGGGTTACA TCGAACTGGA 2220
TCTCAACAGC GGTAAGATCC TTGAGAGTTT TCGCCCCGAA GAACGTTTTC CAATGATGAG 2280
CACTTTTAAA GTTCTGCTAT GTGGCGCGGT ATTATCCCGT GTTGACGCCG GGCAAGAGCA 2340
ACTCGGTCGC CGCATACACT ATTCTCAGAA TGACTTGGTT GAGTACTCAC CAGTCACAGA 2400
AAA.GCATCTT ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC AGTGCTGCCA TAACCATGAG 2460
TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA GGACCGAAGG AGCTAACCGC 2520
TTTTTTGCAC AACATGGGGG ATCATGTAAC TCGCCTTGAT CGTTGGGAAC CGGAGCTGAA 2580
TGAAGCCATA CCAAACGACG AGCGTGACAC CACGATGCCT GCAGCAATGG CAACAACGTT 2640
154
GCGCAAACTA TTAACTGGCG AACTACTTAC TCTAGCTTCC CGGCAACAAT TAATAGACTG 2700
GATGGAGGCG GATAAAGTTG CAGGACCACT TCTGCGCTCG GCCCTTCCGG CTGGCTGGTT 2760
TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC GGTATCATTG CAGCACTGGG 2820
GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT TATCTACACG ACGGGGAGTC AGGCAACTAT 2880
GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT AGGTGCCTCA CTGATTAAGC ATTGGTAACT 2940
GTCAGACCAA GTTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCATT ΤΤΓΑΑΊΤΤΑΑ 3000
AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT AACGTGAGTT 3060
TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT GAGATCCTTT 3120
TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG 3180
TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA 3240
GATACCAAAT actgtccttc TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT 3300
AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA 3360
TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG CGCAGCGGTC 3420
GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT 3480
GAGATACCTA CAGCGTGAGC ATTGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA 3540
CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG 3600
AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG AGCGTCGATT 3660
TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG CGGCCTTTTT 3720
ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC TTTCCTGCGT TATCCCCTGA 3780
TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC 3840
GACCGAGCGC AGCGAGTCAG TGAGCGAGGA AGCGGAAG 3878
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 66:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 6474 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
155 (B) KLON: pselP-gpl60MN (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 66:
AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTTTT 60
TCTGCGGCCG CGGCCTATAT GGCCCGGTCC GGTTAACTAC GTAGACGTCG AGGATTTCGC 120
GTGGGTCAAT GCCGCGCCAG ATCCACATCA GACGGTTAAT CATGCGATAC CAGTGAGGGA 180
TGGTTTTACC ATCAAGGGCC GACTGCACAG GCGGTTGTGC GCCGTGATTA AAGCGGCGGA 240
CTAGCGTCGA GGTTTCAGGA TGTTTAAAGC GGGGTTTGAA CAGGGTTTCG CTCAGGTTTG 300
CCTGTGTCAT GGATGCAGCC TCCAGAATAC TTACTGGAAA CTATTGTAAC CCGCCTGAAG 360
TTAAAAAGAA CAACGCCCGG CAGTGCCAGG CGTTGAAAAG ATTAGCGACC GGAGATTGGC 420
GGGACGAATA CGACGCCCAT ATCCCACGGC TGTTCAATCC AGGTATCTTG CGGGATATCA 480
ACAACATAGT CATCAACCAG CGGACGACCA GCCGGTTTTG CGAAGATGGT GACAAAGTGC 540
GCTTTTGGAT ACATTTCACG AATCGCAACC GCAGTACCAC CGGTATCCAC CAGGTCATCA 600
ATAACGATGA AGCCTTCGCC ATCGCCTTCT GCGCGTTTCA GCACTTTAAG CTCGCGCTGG 660
TTGTCGTGAT CGTAGCTGGA AATACAAACG GTATCGACAT GACGAATACC CAGTTCACGC 720
GCCAGTAACG CACCCGGTAC CAGACCGCCA CGGCTTACGG CAATAATGCC TTTCCATTGT 780
TCAGAAGGCA TCAGTCGGCT TGCGAGTTTA CGTGCATGGA TCTGCAACAT GTCCCAGGTG 840
ACGATGTATT TTTCGCTCAT GTGAAGTGTC CCAGCCTGTT TATCTACGGC TTAAAAAGTG 900
TTCGAGGGGA AAATAGGTTG CGCGAGATTA TAGAGATCTG GCGCACTAAA AACCAGTATT 960
TCACATGAGT CCGCGTCTTT TTACGCACTG CCTCTCCCTG ACGCGGGATA AAGTGGTATT 1020
CTCAAACATA TCTCGCAAGC CTGTCTTGTG TCCAAGCTTG GGGATCATCC GTCACTGTTC 1080
TTTATGATTC TACTTCCTTA CCGTGCAATA AATTAGAATA TATTTTCTAC TTTTACGAGA 1140
AATTAATTAT TGTATTTATT ATTTATGGGT GAAAAACTTA CTATAAAAAG CGGGTGGG1T 1200
TGGAATTAGT GATCAGTTTA TGTATATCGC AACTACCGGC ATATGATAAA AAGTCGACTT 1260
AATTAATTAG GCTGGTTCAG CTCGTCTCAT TCTTTCCCTT ACAGTAGGCC ATCCAGTCAC 1320
ACGTTTTGAC CATTTGCCAC CCATCTTATA GCAAAGCCCT TTCCAAGCCC TGTCTTATTC 1380
TTGTAGGTAT GTGGAGAATA GCTCTACCAG CTCTTTGCAG TACTTCTATA ACCCTATCTG 1440
TCCCCTCAGC TACTGCTATA GCTGTGGCAT TAAGCAAGCT AACAGCACTA CTCTTTAGTT 1500
CCTGACTCCA ATACTGTAGG AGATTCCACC AATATTTGAG GACTTCCCAC CCCCTGCGTC 1560
CCAGAAGTTC CACAATCCTC GCTGCAATCA AGAGTAAGTC TCTGTGGTGG TAGCTGAAGA 1620
GGAACAGGCT CCGCAGGTCG ACCCAGATAA TTGCTAAGAA TCCATGCACT AATCGACCGG 1680
ATGTGTCTCT GTCTCTCTCT CCACCTTCTT CTTCGATTCC TTCGGGCCTG TCGGGTCCCC 1740
TCGGAACTGG GGGGCGGGTC TGCAACGACA ATGGTGAGTA TCCCTGCCTA actctattca 1800
156
CTATAGAAAG TACAGCAAAA ACTATTCTTA AACCTACCAA GCCTCCTACT ATCATTATGA 1860
ATATTTTTAT ATACCACAGC CAATTTGTTA TGTCAAACCA ATTCCACAAA CTTGCCCATT 1920
TATCCAATTC CAATAATTCT TGTTCATTCT TTTCTTGTTG GGTTTGCGAT TTTTCTAGTA 1980
ATGAGTATAT TAAGCTTGTG TAATTGTCAA TTTCTCTTTC CCACTGCATC CAGGTCATGT 2040
TATTCCAAAT ATCATCCAGA GATTTAITAC TCCAACTAGC ATTCCAAGGC ACAGTAGTGG 2100
TGCAAATGAG TTTTCCAGAG CAACCCCAAA ACCCCAGGAG CTGTTGATCC TTTAGGTATC 2160
TTTCCACAGC CAGGACTCTT GCCTGGAGCT GCTTGATGCC CCAGACTGTG AGTTGCAACA 2220
TATGCTGTTG CGCCTCAATG GCCCTCAGCA aattgttctg CTGTTGCACT ATACCAGACA 2280
ATAATAGTCT GGCCTGTACC GTCAGCGTCA CTGACGCTGC GCCCATAGTG CTTCCTGCTG 2340
CTCCTAAGAA CCCAAGGAAC AGAGCTCCTA TCGCTGCTCT TTTTTCTCTC TGCACCACTC 2400
TTCTCTTTGC CTTGGTGGGT GCTACTCCTA ATGGTTCAAT TGTTACTACT TTATATTTAT 2460
ATAATTCACT TCTCCAATTG TCCCTCATAT CTCCTCCTCC AGGTCTGAAG ATCTCGGTGT 2520
CGTTCGTGTC CGTGTCCTTA CCACCATCTC TTGTTAATAG TAGCCCTGTA ATATTTGATG 2580
AACATCTAAT TTGTCCTTCA ATGGGAGGGG CATACATTGC TTTTCCTACT TCCTGCCACA 2640
TGTTTATAAT TTGTTTTATT TTGCATTGAA GTGTGATATT GTTATTTGAC CCTGTAGTAT 2700
TATTCCAAGT ATTATTACCA TTCCAAGTAC TATTAAACAG TGGTGATGTA TTACAGTAGA 2760
AAAATTCCCC TCCACAATTA AAACTGTGCA TTACAATTTC TGGGTCCCCT CCTGAGGATT 2820
GATTAAAGAC TATTGTTTTA TTCTTAAATT GTTCTTTTAA TTTGCTAACT ATCTGTCTTA 2880
AAGTGTCATT CCATTTTGCT CTACTAATGT TACAATGTGC ttgtcttata GTTCCTATTA 2940
TATTTTTTGT TGTATAAAAT GCTCTCCCTG GTCCTATATG TATCCTTTTT CTTTTATTGT 3000
AGTTGGGTCT TGTACAATTA ATTTGTACAG ATTCATTCAG ATGTACTATG ATGGTTTTAG 3060
CATTATCAGT gaaattctca GATCTAATTA CTACCTCTTC TTCTGCTAGA CTGCCATTTA 3120
ACAGCAGTTG AGTTGATACT ACTGGCCTAA TTCCATGTGT ACATTGTACT GTGCTGACAT 3180
TTTTACATGA TCCTTTTCCA CTGAACTTTT TATCGTTACA TTTTAGAATC GCAAAACCAG 3240
CCGGGGCACA ATAGTGTATG GGAATTGGCT CAAAGGATAT CTTTGGACAA GCTTGTGTAA 3300
TGACTGAGGT ATTACAACTT ATCAACCTAT AGCTGGTACT ATCATTATCT ATTGATACTA 3360
TATCAAGTTT ATAAAGAAGT GCATATTCTT TCTGCATCTT ATCTCTTATG CTTGTGGTGA 3420
TATTGAAAGA GCAGTTTTTC ATTTCTCCTC CCTTTATTGT TCCCTCGCTA TTACTATTGT 3480
TATTAGCAGT ACTATTATTG GTATTAGTAG TATTCCTCAA ATCAGTGCAA TTTAAAGTAA 3540
CACAGAGTGG GGTTAATTTT ACACATGGCT TTAGGCTTTG ATCCCATAAA CTGATTATAT 3600
CCTCATGCAT CTGTTCTACC ATGTTATTTT TCCACATGTT AAAATTTTCT GTCACATTTA 3660
CCAATTCTAC TTCTTGTGGG TTGGGGTCTG TGGGTACACA GGCTTGTGTG GCCCAAACAT 3720
TATGTACCTC TGTATCATAT GCTTTAGCAT CTGATGCACA AAATAGAGTG GTGGTTGCTT 3780
CTTTCCACAC AGGTACCCCA TAATAGACTG TGACCCACAA TTTITCTGTA GCACTACAGA 3840
157
TCATTAATAA CCCAAGGAGC ATCGTGCCCC ATCCCCACCA GTGCTGATAA TTCCTCCTGA 3900
TCCCCTTCAC GGCCATGGAG GCCTTATTTA TATTCCAAAA ΑΑΆΑΑΑΑΑΤΑ AAATTTCAAT 3960
TTTTATCGAT TACGTAGTTA ACGCGGCCGC GGCCTAGCCG GCCATAAAAA TCTAGCTGGC 4020
GTAATAGCGA AGAGGCCCGC ACCGATCGCC CTTCCCAACA GTTGCGCAGC CTGAATGGCG 4080
AATGGGAAAT TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA 4140
GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA 4200
CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG 4260
ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT 4320
CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG 4380
GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA 4440
AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA 4500
CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG 4560
GAAATGTGCG CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC 4620
TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA 4680
TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG 4740
CTCACCCAGA AACGCTGGTG AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG 4800
GTTACATCGA ACTGGATCTC AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC 4860
GTTTTCCAAT GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGTTG 4920
ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT 4980
ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG 5040
CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC 5100
CGAAGGAGCT AACCGCTTTT TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT 5160
GGGAACCGGA GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGCAG 5220
CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC 5280
AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC 5340
TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA 5400
TCATTGCAGC ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG 5460
GGAGTCAGGC AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA 5520
TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC 5580
TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA 5640
TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT 5700
158
CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC 5760
TACCAGCGGT GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 5820
GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC 5880
ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG 5940
CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG 6000
ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA 6060
CGACCTACAC CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCATTG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG 6120
AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA 6180
GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT 6240
GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA 6300
GCAACGCGGC CTTTTTACGG TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC 6360
CTGCGTTATC CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG 6420
CTCGCCGCAG CCGAACGACC GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAG 6474
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 67:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 6811 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2-gpta ProtS (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 67:
159
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CAACATGGGG GATCATGTAA bUO
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT ΤΊΤΤΑΑΤΤΤΑ AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG gtatctttat AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
160
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG aacaaAagct GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCGTCGA CAGAAAAATT AATTAATTAT GGCCTCTCGA GCTGCAGCTG CCAAGAAGAA 2280
GATTCCTGTG CTGCTCTCAG GAAAATATGT CCCACTTGTT TTCTAATTCA ATAAAGATAC 2340
TGGTTTAAAT GTGAAGCCAC ACAAGAGAAA GATGAAGCCA AAGCTGGTCC CCCTGAGGAA 2400
TTGTTTTGAA ATAAGGCATT AGGACCCTCC ATTCAATTCA TATTTAATAG ACCACCATCT 2460
CTTCTGCCTT CATCAGGAAA AAAACAAAAA CATAAACAAA ATAGTATCTG CCTATGATTA 2520
ATAGTATTTA ATTACACGCA CTTTTGTTTG AGTTTACTTC CTTGCTTTCT GAAAAAAACA 2580
TAGGTATTTA GACACTAGTT CATGATGATA AAATTAAAAA TTTAGTTTTA CAAACAAAAA 2640
TTGAAACTGT CATTTGTAGG AAAAAAATTC AAATTTAAAA TTGTTATTTT TCACTATTCT 2700
TAGATAGCAA GAGAAGTAAG AATTTCTTTA CTGTGATTTA TATCACAACA GAATTTTTTT 2760
CCTTGACAAA GGACCTTTTA AAAATCCCAG GAAAGGACCA CAAAATAATC AAAGACTGCA 2820
CATTGTAAAT AAAACCCTTC AGCTGTTATT GAAACATAAG TATAATTACA CACAAGGAAA 2880
AGGTATTATA AGCAGAGAAA AGATGCCTTA AGAATTCTTT GTCTTTTTCC AAACTGATGG 2940
ACATGAGTGA GCTCTAATAT CATTATGTTT AGAAATGGCT TCATCCAGAT CCAACTGTAC 3000
ACCATTAATA TTCACTTCCA TGCAGCCATT ATAAAAGGCA TTCACTGGTG TGGCACTGAA 3060
TGGAACATCT GGAAGGCCAC CCAGGTATGT GGCCACTTTT GCTTTCATTG CTTTGTCCAA 3120
GACGGCAAGT TGTCTTTGAA GGTCTTCATG GGAGATGGTT TCTATTTTAA GTGGTGTCGA 3180
CAACTCCAGA TTGTTTCTGT TGACTCTAAA TTCCAGATGA GATTGTTGAT CGGAACATAG 3240
ACTTAGGGCC TGTATCCGAT ATATTACAGT ATTTTCAACA GATAACAGAA TATCCTGTGA 3300
TTTITCAGAG GTGGAGTCCA CCAAGGACAC AGCAAAGGGC ACTGTGTTGT TACCAGAAAC 3360
CAAGGCAAGC ATAACACCAG TGCCCGTGGA TGGACGAATA TTCAAGGTCA CATTTACATG 3420
CCAACCCTCA GCACTGGATA CATTATTATA ATCTATGTGA AATTGAGCAA TTCCAGAft.CC 3480
AGGATAGTAG GAGCCCTTCT CCACAGTAAC CAGGCAATGC TTATTTTGTT TTTCTTGAAT 3540
AATTTCCTTT ATTCCAGAAG CTCCTTGCTT CATCAAATTC CAGCTTCGTA TACATCCATC 3600
TAGACGAGGG TTAATCGGTT TAATGAGTTC ACTTTCCACT TTCCGAGGGA ATCCTGCAAA 3660
GTATACTTTG GTTTCCAGCA ATCCATTTTC CGGCTTAAAA AGGGGTCCAG GTTTATTTAT 3720
ATCCATCACA GCTTCTTTAG CTATTTTAAT GCTAATACTA TGTTCTAATT CTTCCACAGA 3780
CACCATATTC CATAGACCAT TATTAATAAC ATCACCTCCA GTTGTGATTT TGGATGTATG 3840
TTCATTCTTA AGCTGAACTT CAATCTTTCC ACCACGAAGT GCAATCAGGA GCCACGCTGA 3900
GTGATCGATA GATTCTGCGT ACAGTATCAC GCCTTCTGAA TCATATGTCC GGAAATCAAA 3960
TTCTGCTGAA AATCTGCTGA TTTCTGGCAA ACGAAATTTT AAATATAAAA CAACCCCTGC 4020
AAACTGCTCC GCCAAGTAAA GTAATTCATA CTTTGTGTCA AGGTTCAAGG GAAGGCACAC 4080
161
TGAAACAACC TCACAACTCT TCTGATCTTG GGCAAGTTTG t AATCCTTTCT TCCCATCACA 4140
ATAGCAAGTG TAACCTCCAG GGTAATTGAC ACAAAGCTGA GCACACATGT TCTCAGAGCA 4200
TTCATCTATA TCTTCACAAG ACTTTGATTT GAGATTATAT CTGTAGCCTT CGGGGCATTC 4260
ACATTCAAAA TCTCCTGGGA TGTTCTTGCA CACAGCTGTG CCACAAATGC TTGGCTTCAA 4320
AGAGCATTCA TCCACATCTT TACAATCTTT CTTATTTGAA AGCATAACAA AACCATTTTT 4380
ACAGGAACAG TGGTAACTTC CAGGTGTATT ATCACAAATT TGACTGCAAC CTCCATTTAT 4440
ATTTGAGGGA TCTTTGCATT CATTTATGTC AAATTCACAC TTTTCTCCTT GCCAACCTGG 4500
TTTACAAGTG CAAGTAAAAG AAGCTTTTCC ATCTTTGCAG CTCATATATC CATCTTCATT 4560
GCATGGCAGA GGACTACACT GGTCTGGAAT GGCATTGACA CAGCTTCTTA GGTCAGGATA 4620
AGCATTAGTT GACTGACGTG CAGCAGTGAA TAACCCAGTT TGAAAAGAGC GAAGACAAAC 4680
TAAGTATTTT GGATAAAAAT AATCCGTTTC CGGGTCATTT TCAAAGACCT CCCTGGCTTC 4740
TTCTTTATTG CACAGTTCTT CGATGCATTC TCTTTCAAGA TTACCCTGTT TGGTTTCTTC 4800
AAGTAAAGAA TTTGCACGAC GCTTCCTAAC CAGGACTTGT GAAGCCTGTT GCTTTGACAA 4860
AAAGTTTGCC TCTGAGACGG GAAGCACTAG GAGGAGACAC GCCAGCAACG CCCCGCAGCG 4920
CCCACCCAGG ACCCCCATGG AGGCCTTATT TATATTCCAA AAAAAAAAAA TAAAATTTCA 4980
ATTTTTAGAT CCCCCAACTT AAGGGTACCG CCTCGACATC TATATACTAT ATAGTAATAC 5040
CAATACTCAA GACTACGAAA CTGATACAAT CTCTTATCAT GTGGGTAATG TTCTCGATGT 5100
CGAATAGCCA TATGCCGGTA GTTGCGATAT ACATAAACTG ATCACTAATT CCAAACCCAC 5160
CCGCTTTTTA TAGTAAGTTT TTCACCCATA AATAATAAAT ACAATAATTA ATTTCTCGTA 5220
AAAGTAGAAA ATATATTCTA ATTTATTGCA CGGTAAGGAA GTAGAATCAT AAAGAACAGT 5280
GACGGATGAT CCCCAAGCTT GGACACAAGA CAGGCTTGCG AGATATGTTT GAGAATACCA 5340
CTTTATCCCG CGTCAGGGAG AGGCAGTGCG TAAAAAGACG CGGACTCATG TGAAATACTG 5400
GTTTTTAGTG CGCCAGATCT CTATAATCTC GCGCAACCTA TTTTCCCCTC GAACACTTTT 5460
TAAGCCGTAG ATAAACAGGC TGGGACACTT CACATGAGCG AAAAATACAT CGTCACCTGG 5520
GACATGTTGC AGATCCATGC ACGTAAACTC GCAAGCCGAC TGATGCCTTC TGAACAATGG 5580
AAAGGCATTA TTGCCGTAAG CCGTGGCGGT CTGGTACCGG GTGCGTTACT GGCGCGTGAA 5640
CTGGGTATTC GTCATGTCGA TACCGTTTGT ATTTCCAGCT ACGATCACGA CAACCAGCGC 5700
GAGCTTAAAG TGCTGAAACG CGCAGAAGGC GATGGCGAAG GCTTCATCGT TATTGATGAC 5760
CTGGTGGATA CCGGTGGTAC TGCGGTTGCG ATTCGTGAAA TGTATCCAAA AGCGCACTTT 5820
GTCACCATCT TCGCAAAACC GGCTGGTCGT CCGCTGGTTG ATGACTATGT TGTTGATATC 5880
CCGCAAGATA CCTGGATTGA ACAGCCGTGG GATATGGGCG TCGTATTCGT CCCGCCAATC 5940
TCCGGTCGCT AATCTTTTCA ACGCCTGGCA CTGCCGGGCG TTGTTCTTTT TAACTTCAGG 6000
CGGGTTACAA TAGTTTCCAG TAAGTATTCT GGAGGCTGCA TCCATGACAC AGGCAAACCT 6060
162
GAGCGAAACC CTGTTCAAAC CCCGCTTTGG GCTGCAGGAA TTCGATATCA AGCTTATCGA 6120
TACCGTCGCG GCCGCGACCT CGAGGGGGGG CCCGGTACCC AATTCGCCCT ATAGTGAGTC 6180
GTATTACGCG CGCTCACTGG CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT 6240
TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA 6300
GGCCCGCACC GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGAAATTGTA 6360
AGCGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC ATTTTTTAAC 6420
CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA GATAGGGTTG 6480
AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC CAACGTCAAA 6540
GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC CTAATCAAGT 6600
TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG CCCCCGATTT 6660
AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA AGCGAAAGGA 6720
GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC CACACCCGCC 6780
GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCA G 6811
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 68:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 27 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: oProtSl (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 68:
ACCCAGGACC GCCATGGCGA AGCGCGC 27 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 69:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 6926 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina
163 (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna ' (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pP2-gpl60MN (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 69:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 480
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
164
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG gtatctttat AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTCTAG CCCGGGCTAG AACTAGTGGA TCCCCCAAAG CGGGGTTTGA ACAGGGTTTC 2280
GCTCAGGTTT GCCTGTGTCA TGGATGCAGC CTCCAGAATA CTTACTGGAA ACTATTGTAA 2340
CCCGCCTGAA GTTAAAAAGA ACAACGCCCG GCAGTGCCAG GCGTTGAAAA GATTAGCGAC 2400
CGGAGATTGG CGGGACGAAT ACGACGCCCA TATCCCACGG CTGTTCAATC CAGGTATCTT 2460
GCGGGATATC AACAACATAG TCATCAACCA GCGGACGACC AGCCGGTTTT GCGAAGATGG 2520
TGACAAAGTG CGCTTTTGGA TACATTTCAC GAATCGCAAC CGCAGTACCA CCGGTATCCA 2580
CCAGGTCATC AATAACGATG AAGCCTTCGC CATCGCCTTC TGCGCGTTTC AGCACTTTAA 2640
GCTCGCGCTG GTTGTCGTGA TCGTAGCTGG AAATACAAAC GGTATCGACA TGACGAATAC 2700
CCAGTTCACG CGCCAGTAAC GCACCCGGTA CCAGACCGCC ACGGCTTACG GCAATAATGC 2760
CTTTCCATTG TTCAGAAGGC ATCAGTCGGC TTGCGAGTTT ACGTGCATGG ATCTGCAACA 2820
TGTCCCAGGT GACGATGTAT TTTTCGCTCA TGTGAAGTGT CCCAGCCTGT TTATCTACGG 2880
CTTAAAAAGT GTTCGAGGGG AAAATAGGTT GCGCGAGATT ATAGAGATCT GGCGCACTAA 2940
AAACCAGTAT TTCACATGAG TCCGCGTCTT TTTACGCACT GCCTCTCCCT GACGCGGGAT 3000
AAAGTGGTAT TCTCAAACAT ATCTCGCAAG CCTGTCTTGT GTCCAAGCTT GGGGATCATC 3060
CGTCACTGTT CTTTATGATT CTACTTCCTT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT ATATTTTCTA 3120
CTTTTACGAG AAATTAATTA TTGTATTTAT TATTTATGGG TGAAAAACTT ACTATAAAAA 3180
GCGGGTGGGT TTGGAATTAG TGATCAGTTT ATGTATATCG CAACTACCGG CATATGGCTA 3240
TTCGACATCG AGAACATTAC CCACATGATA AGAGATTGTA TCAGTTTCGT AGTCTTGAGT 3300
ATTGGTATTA CTATATAGTA TATAGATGTC GAGGCGGTAC CCTTAAGTTG GGCTGCAGTT 3360
165
GTTAGAGCTT GGTATAGCGG ACAACTAAGT AATTGTAAAG AAGAAAACGA AACTATCAAA 3420
ACCGTTTATG AAATGATAGA AAAAAGAATA TAAATAATCC TGTATTTTAG TTTAAGTAAC 3480
AGTAAAATAA TGAGTAGAAA ATACTATTTT TTATAGCCTA TAAATCGTTC CTCATGAGAG 3540
TGAAGGGGAT CAGGAGGAAT TATCAGCACT GGTGGGGATG GGGCACGATG CTCCTTGGGT 3600
TATTAATGAT CTGTAGTGCT ACAGAAAAAT TGTGGGTCAC AGTCTATTAT GGGGTACCTG 3660
TGTGGAAAGA AGCAACCACC ACTCTATTTT GTGCATCAGA TGCTAAAGCA TATGATACAG 3720
AGGTACATAA TGTTTGGGCC ACACAAGCCT GTGTACCCAC AGACCCCAAC CCACAAGAAG 3780
TAGAATTGGT AAATGTGACA GAAAATTTTA ACATGTGGAA AAATAACATG GTAGAACAGA 3840
TGCATGAGGA TATAATCAGT TTATGGGATC AAAGCCTAAA GCCATGTGTA AAATTAACCC 3900
CACTCTGTGT TACTTTAAAT TGCACTGATT TGAGGAATAC TACTAATACC AATAATAGTA 3960
CTGCTAATAA CAATAGTAAT AGCGAGGGAA CAATAAAGGG AGGAGAAATG AAAAACTGCT 4020
CTTTCAATAT CACCACAAGC ATAAGAGATA AGATGCAGAA AGAATATGCA CTTCTTTATA 4080
AACTTGATAT AGTATCAATA GATAATGATA GTACCAGCTA TAGGTTGATA AGTTGTAATA 4140
CCTCAGTCAT TACACAAGCT TGTCCAAAGA TATCCTTTGA GCCAATTCCC ATACACTATT 4200
GTGCCCCGGC TGGTTTTGCG ATTCTAAAAT GTAACGATAA AAAGTTCAGT GGAAAAGGAT 4260
CATGTAAAAA TGTCAGCACA GTACAATGTA CACATGGAAT TAGGCCAGTA GTATCAACTC 4320
AACTGCTGTT AAATGGCAGT CTAGCAGAAG AAGAGGTAGT AATTAGATCT GAGAATTTCA 4380
CTGATAATGC TAAAACCATC ATAGTACATC TGAATGAATC TGTACAAATT AATTGTACAA 4440
GACCCAACTA CAATAAAAGA AAAAGGATAC ATATAGGACC AGGGAGAGCA TTTTATACAA 4500
CAAAAAATAT AATAGGAACT ATAAGACAAG CACATTGTAA CATTAGTAGA GCAAAATGGA 4560
ATGACACTTT AAGACAGATA GTTAGCAAAT TAAAAGAACA ATTTAAGAAT AAAACAATAG 4620
TCTTTAATCA ATCCTCAGGA GGGGACCCAG AAATTGTAAT GCACAGTTTT AATTGTGGAG 4680
GGGAATTTTT CTACTGTAAT ACATCACCAC TGTTTAATAG TACTTGGAAT GGTAATAATA 4740
CTTGGAATAA TACTACAGGG TCAAATAACA ATATCACACT TCAATGCAAA ATAAAACAAA 4800
TTATAAACAT GTGGCAGGAA GTAGGAAAAG CAATGTATGC CCCTCCCATT GAAGGACAAA 4860
TTAGATGTTC ATCAAATATT ACAGGGCTAC TATTAACAAG AGATGGTGGT AAGGACACGG 4920
ACACGAACGA CACCGAGATC TTCAGACCTG GAGGAGGAGA TATGAGGGAC AATTGGAGAA 4980
GTGAATTATA TAAATATAAA GTAGTAACAA TTGAACCATT AGGAGTAGCA CCCACCAAGG 5040
CAAAGAGAAG AGTGGTGCAG AGAGAAAAAA GAGCAGCGAT AGGAGCTCTG TTCCTTGGGT 5100
TCTTAGGAGC AGCAGGAAGC ACTATGGGCG CAGCGTCAGT GACGCTGACG GTACAGGCCA 5160
GACTATTATT GTCTGGTATA GTGCAACAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCC ATTGAGGCGC 5220
AACAGCATAT GTTGCAACTC ACAGTCTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAGTCCTGG 5280
CTGTGGAAAG ATACCTAAAG GATCAACAGC TCCTGGGGTT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC 5340
TCATTTGCAC CACTACTGTG CCTTGGAATG CTAGTTGGAG TAATAAATCT CTGGATGATA 5400
166
TTTGGAATAA CATGACCTGG ATGCAGTGGG AAAGAGAAAT TGACAATTAC ACAAGCTTAA 5460
TATACTCATT ACTAGAAAAA TCGCAAACCC aacaagAaaa GAATGAACAA GAATTATTGG 5520
AATTGGATAA ATGGGCAAGT TTGTGGAATT GGTTTGACAT AACAAATTGG CTGTGGTATA 5580
TAAAAATATT CATAATGATA GTAGGAGGCT TGGTAGGTTT AAGAATAGTT TTTGCTGTAC 5640
TTTCTATAGT GAATAGAGTT AGGCAGGGAT ACTCACCATT GTCGTTGCAG ACCCGCCCCC 5700
CAGTTCCGAG GGGACCCGAC AGGCCCGAAG GAATCGAAGA AGAAGGTGGA GAGAGAGACA 5760
GAGACACATC CGGTCGATTA GTGCATGGAT TCTTAGCAAT TATCTGGGTC GACCTGCGGA 5820
GCCTGTTCCT CTTCAGCTAC CACCACAGAG AC1TACTCTT GATTGCAGCG AGGATTGTGG 5880
AACTTCTGGG ACGCAGGGGG TGGGAAGTCC TCAAATATTG GTGGAATCTC CTACAGTATT 5940
GGAGTCAGGA ACTAAAGAGT AGTGCTGTTA GCTTGCTTAA TGCCACAGCT ATAGCAGTAG 6000
CTGAGGGGAC AGATAGGGTT ATAGAAGTAC TGCAAAGAGC TGGTAGAGCT ATTCTCCACA 6060
TACCTACAAG AATAAGACAG GGCTTGGAAA GGGCTTTGCT ATAAGATGGG TGGCAAATGG 6120
TCAAAACGTG TGACTGGATG GCCTACTGTA AGGGAAAGAA TGAGAČGAGC TGAACCAGAA 6180
CGAATTCCAT GGCCCGGGAA GGCCTCGGAC CGGGCCCGGC CATATAGGCC AGCGATACCG 6240
TCGCGGCCGC GACCTCGAGG GGGGGCCCGG TACCCAATTC GCCCTATAGT GAGTCGTATT 6300
ACGCGCGCTC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCCT GGCGTTACCC 6360
AACTTAATCG CCTTGCAGCA CATCCCCCTT TCGCCAGCTG GCGTAATAGC GAAGAGGCCC 6420
GCACCGATCG CCCTTCCCAA CAGTTGCGCA GCCTGAATGG CGAATGGAAA TTGTAAGCGT 6480
TAATATTTTG TTAAAATTCG CGTTAAATTT TTGTTAAATC AGCTCATTTT TTAACCAATA 6540
GGCCGAAATC GGCAAAATCC CTTATAAATC AAAAGAATAG ACCGAGATAG GGTTGAGTGT 6600
TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT AAAGAACGTG GACTCCAACG TCAAAGGGCG 6660
AAAAACCGTC TATCAGGGCG ATGGCCCACT ACGTGAACCA TCACCCTAAT CAAGTTTTTT 6720
GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG GAACCCTAAA GGGAGCCCCC GATTTAGAGC 6780
TTGACGGGGA AAGCCGGCGA ACGTGGCGAG AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA AAGGAGCGGG 6840
CGCTAGGGCG CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC GCTGCGCGTA ACCACCACAC CCGCCGCGCT 6900
TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTCAG
6926
167 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 70: ' (i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 49 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: selP promotor (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 70:
TATGAGATCT AAAAATTGAA ATTTTATTTT TTTTTTTTGG AATATAAAT 49 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 71:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 34 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: oFIX.l (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 71:
TCATGTTCAC GCGCTCCATG GCCGCGGCCG CACC 34 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 72:
168 (i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 5532 baznih phrov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: enojna (D) ; TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: pN2gpta-FIX (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 72:
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT 60
CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA 120
GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT 180
GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 240
TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT 300
TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG 360
TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA 420
ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA 4 80
GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 540
CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA 600
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA 660
CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA 720
CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 780
TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 840
GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG 900
169
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA 960
TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT 1020
AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 1080
ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1140
AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTITCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA 1200
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT 1260
TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC 1320
CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA 1380
TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 1440
GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC 1500
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA 1560
GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA 1620
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 1680
GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 1740
TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG 1800
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG 1860
AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG 1920
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT 1980
GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG 2040
TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT 2100
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG 2160
CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT GGAGCTCCAC CGCGGTGGCG 2220
GCCGCTTGTT AATTTTCAAT TCCAATGAAT TAACCTTGGA AATCCATCTT TCATTAAGTG 2280
AGCTTTGTTT TTTCCTTAAT CCAGTTGACA TACCGGGATA CCTTGGTATA TATTCCATAT 2340
TTGCCTTTCA TTGCACACTC TTCACCCCAG CTAATAATTC CAGTTAAGAA ACTGGTCCCT 2400
TCCACTTCAG TAACATGGGG TCCCCCACTA TCTCCTTGAC ATGAATCTCT ACCTCCTTCA 2460
TGGAAGCCAG CACAGAACAT GTTGTTATAG ATGGTGAACT TTGTAGATCG AAGACATGTG 2520
GCTCGGTCAA CAAGTGGAAC TCTAAGGTAC TGAAGAACTA AAGCTGATCT CCCTTTGTGG 2580
AAGACTCTTC CCCAGCCACT TACATAGCCA GATCCAAATT TGAGGAAGAT GTTCGTGTAT 2640
TCCTTGTCAG CAATGCAAAT AGGTGTAACG TAGCTGTTTA GCACTAAGGG TTCGTCCAGT 2700
TCCAGAAGGG CAATGTCATG GTTGTACTTA TTAATAGCTG CATTGTAGTT GTGGTGAGGA 2760
ATAATTCGAA TCACATTTCG CTTTTGCTCT GTATGTTCTG TCTCCTCAAT ATTATGTTCA 2820
CCTGCGACAA CTGTAATTTT AACACCAGTT TCAACACAGT GGGCAGCAGT TACAATCCAT 2880
TTTTCATTAA CGATAGAGCC TCCACAGAAT GCATCAACTT TACCATTCAA AACAACCTGC 2940
170
CAAGGGAATT GACCTGGTTT GGCATCTTCT CCACCAACAA CCCGAGTGAA gtcattaaat 3000
GATTGGGTGC TTTGAGTGAT GTTATCCAAA ATGGTTTCAG CTTCAGTAGA ATTTACATAG 3060
TCCACATCAG GAAAAACAGT CTCAGCACGG GTGAGCTTAG AAGTTTGTGA AACAGAAACT 3120
CTTCCACATG GAAATGGCAC TGCTGGTTCA CAGGACTTCT GG1TTTCTGC AAGTCGATAT 3180
CCCTCAGTAC AGGAGCAAAC CACCTTGTTA TCAGCACTAT TTTTACAAAA CTGCTCGCAT 3240
CTGCCATTCT TAATGTTACA TGTTACATCT AATTCACAGT TCTTTCCTTC AAATCCAAAG 3300
GGACACCAAC ATTCATAGGA ATTAATGTCA TCCITGCAAC TGCCGCCATT TAAACATGGA 3360
TTGGACTCAC ACTGATCTCC ATCAACATAC TGCTTCCAAA ATTCAGTTGT TCTTTCAGTG 3420
TTTTCAAAAA CTTCTCGTGC TTCTTCAAAA CTACACTTTT CTTCCATACA TTCTCTCTCA 3480
AGGTTCCCTT GAACAAACTC TTCCAATTTA CCTGAATTAT ACCTCTTTGG CCGATTCAGA 3540
ATTTTGTTGG CGTTTTCATG ATCAAGAAAA ACTGTACATT CAGCACTGAG TAGATATCCT 3600
AAAAGGCAGA TGGTGATGAG GCCTGGTGAT TCTGCCATGA TCATGTTCAC GCGCTCCATG 3660
GAGGCCTTAT TTATATTCCA AAAAAAAAAA ATAAAATTTC AATTTTTAGA TCCCCCAACT 3720
TAAGGGTACC GCCTCGACAT CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA 3780
ACTGATACAA TCTCTTATCA TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGAATAGCC ATATGCCGGT 3840
AGTTGCGATA TACATAAACT GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCGCTTTTT ATAGTAAGTT 3900
TTTCACCCAT AAATAATAAA TACAATAATT AATTTCTCGT AAAAGTAGAA AATATATTCT 3960
AATTTATTGC ACGGTAAGGA AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACGGATGA TCCCCAAGCT 4020
TGGACACAAG ACAGGCTTGC GAGATATGTT TGAGAATACC ACTTTATCCC GCGTCAGGGA 4080
GAGGCAGTGC GTAAAAAGAC GCGGACTCAT GTGAAATACT GGTTTTTAGT GCGCCAGATC 4140
TCTATAATCT CGCGCAACCT ATTTTCCCCT CGAACACTTT TTAAGCCGTA GATAAACAGG 4200
CTGGGACACT TCACATGAGC GAAAAATACA TCGTCACCTG GGACATGTTG CAGATCCATG 4260
CACGTAAACT CGCAAGCCGA CTGATGCCTT CTGAACAATG GAAAGGCATT ATTGCCGTAA 4320
GCCGTGGCGG TCTGGTACCG GGTGCGTTAC TGGCGCGTGA ACTGGGTATT CGTCATGTCG 4380
ATACCGTTTG TATTTCCAGC TACGATCACG ACAACCAGCG CGAGCTTAAA GTGCTGAAAC 4440
GCGCAGAAGG CGATGGCGAA GGCTTCATCG TTATTGATGA CCTGGTGGAT ACCGGTGGTA 4500
CTGCGGTTGC GATTCGTGAA ATGTATCCAA AAGCGCACTT TGTCACCATC TTCGCAAAAC 4560
CGGCTGGTCG TCCGCTGGTT GATGACTATG TTGTTGATAT CCCGCAAGAT ACCTGGATTG 4620
AACAGCCGTG GGATATGGGC GTCGTATTCG TCCCGCCAAT CTCCGGTCGC TAATCTTTTC 4680
AACGCCTGGC ACTGCCGGGC GTTGTTCTTT TTAACTTCAG GCGGGTTACA ATAGTTTCCA 4740
GTAAGTATTC TGGAGGCTGC ATCCATGACA CAGGCAAACC TGAGCGAAAC CCTGTTCAAA 4800
CCCCGCTTTG GGCTGCAGGA ATTCGATATC AAGCTTATCG ATACCGTCGC GGCCGCGACC 4860
TCGAGGGGGG GCCCGGTACC CAATTCGCCC TATAGTGAGT CGTATTACGC GCGCTCACTG 4920
GCCGTCGTTT TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT TAATCGCCTT 4980
171
GCAGCACATC CCCCTTTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGATCGCCCT 5040
TCCCAACAGT TGCGCAGCCT GAATGGCGAA TGGAAATTGT AAGCGTTAAT ATTTTGTTAA 5100
AATTCGCGTT AAATTTTTGT TAAATCAGCT CATTTTTTAA CCAATAGGCC GAAATCGGCA 5160
AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGACCG AGATAGGGTT GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA 5220
ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA AGGGCGAAAA ACCGTCTATC 5280
AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCTAATCAAG TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC 5340
GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC 5400 t
CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG AGCGGGCGCT AGGGCGCTGG 5460
CAAGTGTAGC GGTCACGCTG CGCGTAACCA CCACACCCGC CGCGCTTAAT GCGCCGCTAC 5520
AGGGCGCGTC AG 5532 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 73:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 14 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: dvojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: divjetipski gpl60MN (ix) ZNAČILNOST:
(A) IME/KLJUČ: CDS (B) MESTO: 3..14 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 73:
172
CA ATG AGA GTG AAG 14
Met Arg Val Lys (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 74:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 4 amino kisline (B) TIP: amino kislina (D): TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: protein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 74:
Met Arg Val Lys 1 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 75:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 14 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: dvojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina;
(A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: gpl60 v virusu vselP-gpl60 (ix) ZNAČILNOST:
(A) IME/KLJUČ: CDS (B) MESTO: 3..14 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 75:
173
CC ATG GCC GTG AAG 14
Met Al a Val Lys (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 76:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 4 amino kisline (B) TIP: amino kislina (D): TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: protein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 76:
Met Al a Val Lys 1 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 77:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: dvojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: divjetipski Protein S (ix) ZNAČILNOST:
(A) IME/KLJUČ: CDS (B) MESTO: 4..18 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 77:
174
GAA ATG AGG GTC CTG GGT ' 18
Met Arg Val Leu Gly
5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 78:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 5 amino2 kislin (B) TIP: amino kislina (D): TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: protein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 78:
Met Arg Val Leu Gly 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 79:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 18 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: dvojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: Protein S v himerah (ix) ZNAČILNOST:
(A) IME/KLJUČ: CDS (B) MESTO: 4..18 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 79:
175
GCC ATG GCG GTC CTG GGT 18
Met Al a Val Leu Gly
5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 80:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 5 amino kislin (B) TIP: amino kislina (D): TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: protein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 80:
Met Al a Val Leu Gly 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 81:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 17 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: dvojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: divjetipski faktor IX (ix) ZNAČILNOST:
(A) IME/KLJUČ: CDS (B) MESTO: 3..17 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 81:
Υ16
TT ATG CAG CGC GTG AAC 17
Met Gin Arg Val Asn
5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 82:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 5 amino kislin (B) TIP: amino kislina (D): TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: protein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 82:
Met Gin Arg Val Asn 1 5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 83:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 17 baznih parov (B) TIP: nukleinska kislina (C) VERIŽNOST: dvojna (D) : TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: sintetičen oligonukleotid DNA (vii) NEPOSREDNI VIR:
(B) KLON: faktor IX v FIX #5 (ix) ZNAČILNOST:
(A) IME/KLJUČ: CDS (B) MESTO: 3..17 (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 83:
177
CC ATG GAG CGC GTG AAC 17
Met Glu Arg Val Asn
5 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 84:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 5 amino kislin (B) TIP: amino kislina (D): TOPOLOGIJA: linearna (ii) TIP MOLEKULE: protein (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 84:
Met Glu Arg Val Asn

Claims (101)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Postopek za pripravo modificiranega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa z direktnim molekulskim kloniranjem modificiranega virusnega genoma, označen s tem, da obsega stopnje, v katerih (I) modificiramo pod ekstracelularnimi pogoji očiščeno molekulo DNA, ki obsega prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, da nastane modificirana molekula DNA, ki obsega ta modificirani virusni genom, (II) uvedemo to modificirano molekulo DNA v prvo gostiteljsko celico, ki zapakira ta modificirani virusni genom v kužne virione, in (III) pridobimo iz te prve gostiteljske celice kužne virione, ki obsegajo ta modificirani virusni genom.
  2. 2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da obsega stopnja modificiranja te molekule DNA pod ekstracelularnimi pogoji stopnjo cepitve te molekule DNA s sekvenčno specifično endonukleazo.
  3. 3. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da obsega stopnja modificiranja te molekule DNA stopnjo vstavljanja prve sekvence DNA v ta prvi genom.
  4. 4. Postopek po zahtevku 3, označen s tem, da vstavimo to prvo sekvenco DNA v ta prvi genom na cepitvenem mestu za sekvenčno specifično endonukleazo.
  5. 5. Postopek po zahtevku 4, označen s tem, da je to cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo edino mesto v tem prvem genomu.
  6. 6. Postopek po zahtevku 5, označen s tem, da obsega stopnja modificiranja te molekule DNA stopnjo uporabe fosfataze za odstranitev fosfatnega dela z enega konca segmenta DNA, ki nastane s cepitvijo te molekule DNA s sekvenčno specifično endonukleazo na tem edinem mestu.
  7. 7. Postopek po zahtevku 6, označen s tem, da je ta prvi genom genom virusa vakcinije in to edino mesto cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti ali za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Smal.
    179
  8. 8. Postopek po zahtevku 7, označen s tetn, da ta prvi genom obsega drugo sekvenco DNA, ki ne nastopa naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa in obsega ta druga sekvenca DNA to edino mesto.
  9. 9. Postopek po zahtevku 8, označen s tem, da je ta prvi genom genom virusa kuijih koz, ki obsega sekvenco gena /3-galaktozidaze Escherichije coli, in je to edino mesto cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti.
  10. 10. Postopek po zahtevku 3, označen s tem, da vstavimo to prvo sekvenco DNA v ta prvi genom med prvim cepitvenim mestom za prvo sekvenčno specifično endonukleazo in drugim cepitvenim mestom za drugo sekvenčno specifično endonukleazo.
  11. 11. Postopek po zahtevku 10, označen s tem, da je vsako od tega prvega in tega drugega cepitvenega mesta edino v tem prvem genomu.
  12. 12. Postopek po zahtevku 3, označen s tem, da je vsaj del te prve sekvence DNA, kije vstavljen v ta prvi genom, pod prepisovalno kontrolo promotorja.
  13. 13. Postopek po zahtevku 12, označen s tem, da se nahaja ta promotor v tej prvi sekvenci DNA, kije vstavljena v ta prvi genom.
  14. 14. Postopek po zahtevku 12, označen s tem, da se nahaja ta promotor v tem modificiranem virusnem genomu navzgorno od te prve sekvence DNA, ki je vstavljena v ta prvi genom.
  15. 15. Postopek po zahtevku 12, označen s tem, da ta promotor uporablja RNA polimeraza, ki jo kodira ta modificirani virusni genom.
  16. 16. Postopek po zahtevku 15, označen s tem, da je ta promotor primeren za začetek prepisovanja z RNA polimerazo tega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa.
  17. 17. Postopek po zahtevku 15, označen s tem, da ta promotor obsega modifikacijo naravnega promotorja tega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa.
    180
  18. 18. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da obsega stopnja modificiranja te molekule DNA stopnjo delecije sekvence DNA iz tega prvega genoma.
  19. 19. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da obsega stopnja modificiranja te molekule DNA stopnjo nadomeščenja sekvence DNA tega prvega genoma.
  20. 20. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da obsega nadalje stopnjo, v kateri okužimo to prvo gostiteljsko celico z drugim evkariotskim citoplazemskim DNA virusom, ki obsega drugi genom, ki se izraža zato, da zapakira ta modificirani virusni genom v kužne virione.
  21. 21. Postopek po zahtevku 20, označen s tem, da izvedemo stopnjo uvedbe te modificirane molekule DNA v to prvo gostiteljsko celico okoli 1 uro po stopnji okuženja te prve gostiteljske celice s tem drugim evkariotskim citoplazemskim DNA virusom.
  22. 22. Postopek po zahtevku 20, označen s tem, da izražanje tega drugega genoma v tej prvi gostiteljski celici ne povzroči nastanka kužnih virionov, ki obsegajo ta drugi genom.
  23. 23. Postopek po zahtevku 20, označen s tem, da je ta modificirani virusni genom modificiran genom virusa vakcinije, ta drugi genom genom virusa kurjih koz in ta prva gostiteljska celica sesalska celica.
  24. 24. Postopek po zahtevku 20, označen s tem, da obsega stopnja pridobivanja kužnih virionov, ki obsegajo ta modificirani virusni genom, stopnjo, v kateri okužimo drugo gostiteljsko celico s kužnimi virioni, ki jih je proizvedla ta prva gostiteljska celica pod takimi pogoji, da izražanje tega drugega genoma v tej drugi gostiteljski celici ne povzroči nastanka kužnih virionov, ki obsegajo ta drugi genom.
  25. 25. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, da je ta modificirani virusni genom modificiran genom virusa vakcinije, ta drugi genom genom virusa kuijih koz in ta druga gostiteljska celica sesalska celica.
    181
  26. 26. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, da obsega ta modificirani virusni genom gen funkcionalnega kroga gostiteljev, ki je potreben, da nastanejo kužni virioni v tej drugi gostiteljski celici, in ta drugi genom nima tega gena funkcionalnega kroga gostiteljev.
  27. 27. Postopek po zahtevku 26, označen s tem, da je ta modificirani virusni genom modificiran genom virusa vakcinije, ki obsega gen funkcionalnega gen kroga gostitelje, ki je potreben, da nastanejo kužni virioni v človeški celici, in je ta druga gostiteljska celica človeška celica.
  28. 28. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, da obsega ta modificirani virusni genom selektiven markerski gen, da ta drugi genom nima selektivnega markerskega gena in da izvedemo stopnjo okuženja te druge gostiteljske celice pod pogoji, ki izberejo genom, ki izraža ta selektiven markerski gen.
  29. 29. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, da podeli izražanje tega selektivnega markerskega gena v tej drugi gostiteljski celici tej drugi gostiteljski celici odpornost proti citotoksičnemu zdravilu, ki je prisotno med okuženjem te druge gostiteljske celice v nivoju, ki je zadosten, da izbere genom, ki izraža ta selektivni markerski gen.
  30. 30. Modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus, označen s tem, da je izdelan z direktnim molekulskim kloniranjem modificiranega virusnega genoma v skladu s postopkom po kateremkoli od zahtevkov 5,11 ali 14.
  31. 31. Modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus, ki obsega modificiran virusni genom, označen s tem, da obsega ta modificirani virusni genom (I) prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, v katerem obsega ta prvi genom cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo in je to cepitveno mesto edino mesto v tem prvem genomu, in (II) prvo sekvenco DNA, vstavljeno v to edino mesto v tem prvem genomu.
  32. 32. Modificirani virus po zahtevku 31, označen s tem, da se ta prva sekvenca DNA ne pojavlja naravno genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa.
    182
  33. 33. Modificirani virus po zahtevku 32, označen s tem, da je ta prvi genom genom virusa vakcinije in to edino mesto cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz Noti in Smal.
  34. 34. Modificirani virus po zahtevku 32, označen s tem, da obsega ta prvi genom drugo sekvenco DNA, ki se ne pojavlja v naravi v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa in da obsega ta druga sekvenca DNA to edino mesto.
  35. 35. Modificirani virus po zahtevku 34, označen s tem, da je ta prvi genom genom virusa kurjih koz, ki obsega drugo sekvenco DNA gena /3-galaktozidaze Escherichije coli in je to edino mesto cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti.
  36. 36. Modificirani virus po zahtevku 32, označen s tem,-da je vsaj del te prve sekvence DNA, kije vstavljena v to edino mesto, pod prepisovalno kontrolo promotorja.
  37. 37. Modificirani virus po zahtevku 36, označen s tem, da se nahaja ta promotor v tej prvi sekvenci DNA, kije vstavljena v ta prvi genom.
  38. 38. Modificirani virus po zahtevku 37, označen s tem, da je ta prvi genom genom poksvirusa in ta promotor obsega modifikacijo naravnega promotoija poksvirusa.
  39. 39. Modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus, ki obsega modificiran virusni genom, označen s tem, da obsega ta modificirani virusni genom (I) prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, kjer ta prvi genom obsega prvo cepitveno mesto za prvo sekvenčno specifično endonukleazo in drugo cepitveno mesto za drugo sekvenčno specifično endonukleazo in je vsako od teh cepitvenih mest edino mesto v tem prvem genomu, in (II) prvo sekvenco DNA, vstavljeno v ta prvi genom med tem prvim edinim mestom in tem drugim edinim mesto.
  40. 40. Modificirani virus po zahtevku 39, označen s tem, da se ta prva sekvenca DNA ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa.
    183
  41. 41. Modificirani virus po zahtevku 40, označen s tem, da ta prvi genom obsega drugo sekvenco DNA, ki se ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, in obsega ta druga sekvenca DNA to prvo sekvenco DNA, vstavljeno med tem prvim edinim mestom in tem drugim edinim mestom.
  42. 42. Modificirani virus po zahtevku 41, označen s tem, da je prvi genom genom virusa vakcinije in daje vsako od tega prvega edinega mesta in tega drugega edinega mesta cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo, izbrano iz skupine, ki sestoji iz Noti, Smal, Apal in RsrII.
  43. 43. Modificiran evkariotski citoplazemski DNA virus, ki obsega modificiran virusni genom, označen s tem, da obsega ta modificirani virusni genom (I) prvi genom prvega evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, kjer obsega ta prvi genom prvo sekvenco DNA in obsega ta prva sekvenca DNA cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino mesto v tem modificiranem virusnem genomu, in (II) promotor, ki se nahaja na takem mestu, da je sekvenca DNA, vstavljena v to edino mesto, pod prepisovalno kontrolo tega promotoija, kjer ta prva sekvenca DNA nima translacijskega startnega kodona med tem promotoijem in tem edinim mestom.
  44. 44. Modificirani virus po zahtevku 43, označen s tem, da se ta prva sekvenca DNA ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa.
  45. 45. Modificirani virus po zahtevku 44, označen s tem, da je ta prvi genom genom virusa vakcinije in da obsega ta prva sekvenca DNA mnogoterno mesto za kloniranje, ki obsega cepitvena mesta za bakterijske restrikcijske endonukleaze Noti, Smal, Apal in Rsrll.
  46. 46. Molekula DNA, označena s tem, da obsega modificiran virusni genom modificiranega virusa po zahtevku 30.
  47. 47. Molekula DNA, označena s tem, da obsega modificiran virusni genom modificiranega virusa po kateremkoli od zahtevkov 31, 39 ali 43.
  48. 48. Molekula DNA, označena s tem, da obsega en konec modificiranega virusnega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, kjer
    184 (I) obsega ta konec tega modificiranega virusnega genoma sekvenco DNA, ki se ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, in (II) obsega ta modificirani virusni genom cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino mesto v tem modificiranem virusnem genomu, in (III) ima ta molekula DNA terminus, ki je homologen terminusu, ki nastane s cepitvijo tega edinega mesta v tem modificiranem virusnem genomu s to sekvenčno specifično endonukleazo.
  49. 49. Molekula DNA po zahtevku 48, označena s tem, da obsega ta sekvenca DNA, ki se ne pojavlja naravno v genomu evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, to cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, ki je edino mesto v tem modificiranem virusnem genomu.
  50. 50. Komplet za direktno molekulsko kloniranje modificiranega virusnega genoma evkariotskega citoplazemskega DNA virusa, označen s tem, da obsega (I) očiščeno molekulo DNA po zahtevku 48 ali 49, (II) DNA ligazo in (III) raztopine puferja in reagentov, primernih za ligiranje segmentov DNA, da nastane modificirana molekula DNA, ki obsega ta modificirani virusni genom.
  51. 51. Komplet po zahtevku 50, označen s tem, da obsega nadalje plazmid, ki obsega kaseto za izražanje genov, ob kateri leže bočno mesta za cepitev s sekvenčno specifično endonukleazo, ki so kompatibilna za vstavitev te kasete v edino cepitveno mesto tega modificiranega virusnega genoma, ki ga kodira ta molekula DNA.
  52. 52. Komplet po zahtevku 50, označen s tem, da obsega nadalje prvo gostiteljsko celico in drugi virus, primeren za zapakiranje tega modificiranega virusnega genoma v kužne virione.
  53. 53. Plazmid, označen s tem, da obsega segment DNA, ki ima cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti na vsakem koncu, kjer obsega ta segment DNA cepitveno mesto za sekvenčno specifično endonukleazo, kije edino v tem plazmidu.
    185
  54. 54. Plazmid po zahtevku 53, kot je prikazan na sl. 1.3, označen s tem, da ga označujemo kot pN2 in da obsega sekvenco iž SEQ. ID. NO. 1.
  55. 55. Plazmid po zahtevku 53, označen s tem, da obsega ta segment DNA nadalje selektiven markerski gen pod prepisovalno kontrolo poksvirusnega promotorja.
  56. 56. Plazmid po zahtevku 55, kot je prikazan na sl. 1.3, označen s tem, da je izbran iz skupine plazmidov, označenih kot pN2-gpia, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 2, in pN2-gpib, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 3.
  57. 57. Plazmid po zahtevku 55, označen s tem, da ta segment DNA nadalje obsega drugi poksvirusni promotor, ki je operativno povezan s sekvenco DNA, ki obsega cepitveno mesto za restrikcij sko endonukleazo.
  58. 58. Plazmid po zahtevku 57, kot je prikazan na sl. 4.7, označen s tem, da ga označujemo kot pN2gpf-S4 in da obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 14.
  59. 59. Plazmid po zahtevku 57, označen s tem, da nadalje obsega translacijski startni kodon, operativno povezan s to sekvenco DNA, ki obsega cepitveno mesto za restrikcijsko endonukleazo.
  60. 60. Plazmid po zahtevku 59, kot je prikazan na sl. 4.7, označen s tem, da ga označujemo kot pN2gpr-S3A in da obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 13.
  61. 61. Plazmid, označen s tem, da obsega prvo glavno mesto za kloniranje, ki obsega edina mesta drugega glavnega mesta za kloniranje vektorja virusa vakcinije, označenega kot vdTK, izbranega iz te-le skupine plazmidov, prikazanih na sl. 4.3: pAO, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 6, pAl, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 7, in pA2, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 8.
  62. 62. Plazmid po zahtevku 61, označen s tem, da obsega nadalje poksvirusni promotor in translacijski startni kodon, operativno povezan s tem prvim glavnim mestom za kloniranje, kot je prikazano na sl. 4.4, izbran iz skupine plazmidov pAlSl, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 9, in pA2-Sl, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 10.
    186
  63. 63. Plazmid po zahtevku 61, označen s tem, da obsega nadalje poksvirusni promotor, kije operativno povezan s tem prvim glavnim mestom za kloniranje, kot je prikazano na sl. 4.5, izbran iz skupine plazmidov pAl-S2, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 11, in pA2-S2, ki obsega sekvenco iz SEQ. ED. NO. 12.
  64. 64. Plazmid po zahtevku 62, označen s tem, da obsega ta plazmid nadalje sekvenco DNA, ki kodira humani protrombin, kjer je nadalje ta sekvenca DNA operativno povezana s tem poksvirusnim promotoijem in tem startnim kodonom.
  65. 65. Plazmid po zahtevku 64, kot je prikazan na sl. 5.1, označen s tem, da ga označujemo kot plazmid pAlSl-PT in da obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 15.
  66. 66. Plazmid po zahtevku 58, označen s tem, da ta plazmid nadalje obsega sekvenco DNA, ki kodira humani plazminogen, kjer je nadalje ta sekvenca DNA operativno povezana s tem poksvirusnim promotoijem in tem startnim kodonom.
  67. 67. Plazmid po zahtevku 66, označen s tem, da je izbran iz skupine plazmidov: pN2gpt-GPg, kot je prikazan na sl. 5.2, ki kodira humani glu-plazminogen in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 17, in pN2gpt-LPg, kot je prikazan na sl. 5.3, ki kodira lysplazminogen in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 18.
  68. 68. Plazmid po zahtevku 58, označen s tem, da ta plazmid nadalje obsega sekvenco DNA, ki kodira virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV) gpl60, kjer je nadalje ta sekvenca DNA operativno povezana s tem poksvirusnim promotoijem in tem startnim kodonom.
  69. 69. Plazmid po zahtevku 68, kot je prikazan na sl. 5.4, označen s tem, da ga označujemo kot pN2gpt-gpl60 in da obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 19.
  70. 70. Plazmid, označen s tem, da obsega modificiran EcoRI K fragment DNA virusa vakcinije, iz katerega je izbrisan gen kroga gostiteljev KIL.
  71. 71. Plazmid po zahtevku 70, kot je prikazan na sl. 8.1, označen s tem, da je izbran iz skupine plazmidov pEcoK-dhr, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 21, in pdhrgpt, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 22.
    187
  72. 72. Plazmid, označen s tem, da obsega segment poksvirusnega genoma, ki obsega gen timidin kinaze tega poksvirusa, kjer smo'ta gen timidin kinaze modificirali, da bi preprečili izražanje aktivne timidin kinaze.
  73. 73. Plazmid po zahtevku 72, kot je prikazan na sl. 4.2, označen s tem, da je izbran iz skupine plazmidov pHindJ-2, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 4, in pHindJ-3, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 5.
  74. 74. Modificiran virus vakcinije, označen s tem, da obsega modifikacijo genoma divjetipskega virusa vakcinije, ki ima eno samo cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti, kjer ta modifikacija odstrani to eno samo cepitveno mesto.
  75. 75. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 74, označen s tem, da je opisan na sl. 4.1 A in označen kot vdN.
  76. 76. Modificiran virus vakcinije, označen s tem, da obsega modifikacijo genoma divjetipskega virusa vakcinije, ki ima eno samo cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Smal, kjer ta modifikacija odstrani to eno samo cepitveno mesto.
    ΊΊ. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 76, označen s tem, da je opisan na sl. 4.1 A in označen kot vdSN.
  77. 78. Modificiran virus vakcinije, označen s tem, da obsega modifikacije genoma divjetipskega virusa vakcinije, ki ima eno samo cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti, eno samo cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Smal in gen timidin kinaze, kjer obsegajo te modifikacije (I) modifikacijo, ki odstrani to mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti, (II) modifikacijo, ki odstrani to mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Smal, in (III) modifikacijo, ki obsega vstavek v ta gen timidin kinaze, ki obsega eno samo cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti in eno samo cepitveno mesto za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Smal.
    188
  78. 79. Modificiran virus vakcinije po zahtevku 78, označen s tem, daje opisan na sl. 4.1A in označen kot vdTK.
  79. 80. Modificiran virus vakcinije po zahtevku 79, ki ga označujemo kot vPTl, označen s tem, da obsega nadalje sekvenco DNA, ki kodira humani protrombin, kjer ta sekvenca obsega tisti del plazmida pAlSl-PT, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 15, ki leži med cepitvenima mestoma za endonukleazo Noti in Rsrll, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK med cepitvenima mestoma za endonukleazi Noti in Tfrrll.
  80. 81. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 79, ki je označen kot vGPgl, označen s tem, da obsega nadalje sekvenco DNA, ki obsega tisti del plazmida pN2gpt-GPg, ki kodira humani glu-plazminogen in ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 17, ki leži med dvema cepitvenima mestoma za endonukleazi Noti, .kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK v cepitveno mesto za endonukleazo Noti.
  81. 82. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 79, označen kot vLPgl, označen s tem, da nadalje obsega tisti del plazmida pN2gpt-LPg, ki kodira lys-plazminogen in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 18, ki leži med dvema cepitvenima mestoma za endonukleazi Noti, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK v cepitvenem mestu za endonukleazo Noti.
  82. 83. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 79, označen s tem, da obsega nadalje sekvenco DNA, ki kodira virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV) gpl60, kjer ta sekvenca obsega tisti del plazmida pN2gpt-gpl60, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 19, ki leži med cepitvenima mestoma za endonukleazo Noti, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK v cepitvenem mestu za endonukleazo Noti.
  83. 84. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 79, ki je označen kot vS4, označen s tem, da nadalje obsega sekvenco DNA, ki kodira sintetičen poksvirusni promotor S4, kjer ta sekvenca DNA obsega sekvenco oligonukleotida P-artP(ll) iz SEQ. ID. NO. 38, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK v cepitvenem mestu za endonukleazo Noti.
  84. 85. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 84, ki ga označujemo kot wWF, označen s tem, da obsega nadalje sekvenco DNA, ki kodira humani von Willebrandov faktor, kjer obsega ta sekvenca DNA tisti del plazmida pvWF, ki obsega sek189 venco iz SEQ. ID. NO. 20, ki leži med cepitvenima mestoma za endonukleazo Noti, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vS4 v cepitvenem mestu za endonukleazo Noti.
  85. 86. Modificiran virus vakcinije, ki ga označujemo kot vdhr, označen s tem, da obsega modificiran genom, ki mu manjkata tako gen funkcionalnega kroga gostiteljev KIL kot tudi gen funkcionalnega kroga gostiteljev C7L, kjer ta modificirani genom obsega genom C7L-negativnega seva virusa vakcinije (WR-6/2), ki ima sekvenco iz SEQ. ID. NO. 22, vstavljen na mestu KIL divjetipskega virusa vakcinije namesto KIL gena.
  86. 87. Modificiran virus, pripravljen po zahtevku 30, označen s tem, da je ta prva sekvenca izražena v gostiteljski celici, kar ima za posledico proizvodnjo proteina.
  87. 88. Modificiran virus proizveden v skladu z zahtevkom 31 ali 39, označen s tem, daje ta prva sekvenca izvažena v gostiteljski celici, kar ima za posledico proizvodnjo proteina.
  88. 89. Modificiran virus po zahtevku 30, označen s tem, da je ta modificirani virusni genom, modificiran postvirusni genom.
  89. 90. Modificiran virus po kateremkoli od zahtevkov 31,39 ali 43, označen s tem, da je ta modificirani virusni genom modificiran poksvirusni genom.
  90. 91. Molekula DNA po zahtevku 46, označena s tem, da je ta modificirani virusni genom modificiran poksvirusni genom.
  91. 92. Molekula DNA po zahtevku 47, označena s tem, da je ta modificirani virusni genom modificiran poksvirusni genom.
  92. 93. Plazmid po zahtevku 68, kot je prikazan na sl. 9.1, označen s tem, da ga označujemo kot pP2-gpl60MN in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 69.
    190
  93. 94. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 79, označen s tem, da obsega nadalje sekvenco DNA, ki kodira virus humane imdnske pomanjkljivosti (HIV) gpl60, kjer ta sekvenca obsega tisti del plazmida pN2gpt-gpl60, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 69, ki leži med cepitvenima mestoma za endonukleazo Smal, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK v cepitvenem mestu za endonukleazo Smal.
  94. 95. Plazmid po zahtevku 58, označen s tem, da ta plazmid nadalje obsega sekvenco DNA, ki kodira humani protein S, kjer je nadalje ta sekvenca DNA operativno povezana s tem poksvirusnim promotorjem in tem startnim kodonom.
  95. 96. Plazmid po zahtevku 95, označen s tem, da ga označujemo kot pN2gptaProtS, kot je prikazan na sl. 10.1, ki kodira humani protein S in obsega sekvenco izSEQ. ID. NO. 67.
  96. 97. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 79, ki ga označujemo kot vProtS, označen s tem, da obsega nadalje sekvenco DNA, ki obsega tisti del plazmida pN2gptaProtS, ki kodira humani protein S in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 67, ki leži med dvema cepitvenima mestoma za endonukleazo Noti, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK v cepitvenem mestu za endonukleazo Noti.
  97. 98. Plazmid po zahtevku 58, označen s tem, da ta plazmid nadalje obsega sekvenco DNA, ki kodira humani faktor IX, kjer je nadalje ta sekvenca DNA operativno povezana s tem poksvirusnim promotorjem in tem startnim kodonom.
  98. 99. Plazmid po zahtevku 98, označen s tem, da ga označujemo kot pN2-gpta-FIX, kot je prikazan na sl. 11.1, ki kodira humani faktor IX in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 72.
  99. 100. Modificirani virus vakcinije po zahtevku 79, označen s tem, da ga označujemo kot vFIX#5, ki obsega nadalje sekvenco DNA, ki obsega tisti del plazmida pN2gptaFIX, ki kodira humani faktor IX in obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 72, ki leži med dvema cepitvenima mestoma za endonukleazo Noti, kjer je nadalje ta sekvenca vstavljena v ta vdTK v cepitvenem mestu za endonukleazo Noti.
    191
  100. 101. Modificirani virus po zahtevku 35, označen s tem, da ta genom virusa kurjih koz nadalje obsega sekvenco DNA, ki kodifa gen HIV envIIIB, vstavljen v to sekvenco tega gena α-galaktozidaze Escherichije coli na tem edinem mestu za bakterijsko restrikcijsko endonukleazo Noti.
  101. 102. Modificirani virus kuijih koz po zahtevku 101, ki ga označujemo kot f-envIIIB, označen s tem, da obsega nadalje tisti del plazmida pN2gpt-gpl60, ki obsega sekvenco iz SEQ. ID. NO. 19, ki leži med cepitvenima mestoma za endonukleazo Noti.
SI19929200190A 1991-08-26 1992-08-26 Direct molecular cloning of a modified eucaryotic cytoplasmic dna virus genome SI9200190A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/750,080 US5445953A (en) 1991-08-26 1991-08-26 Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome
US91473892A 1992-07-20 1992-07-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9200190A true SI9200190A (en) 1993-03-31

Family

ID=27115227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI19929200190A SI9200190A (en) 1991-08-26 1992-08-26 Direct molecular cloning of a modified eucaryotic cytoplasmic dna virus genome

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6265183B1 (sl)
EP (1) EP0561034B1 (sl)
JP (1) JPH06261763A (sl)
AT (1) ATE181108T1 (sl)
AU (1) AU652467B2 (sl)
BR (1) BR9203322A (sl)
CA (1) CA2076839C (sl)
CZ (1) CZ264192A3 (sl)
DE (1) DE69229390T2 (sl)
FI (1) FI111384B (sl)
HU (1) HU219369B (sl)
MX (1) MX9204926A (sl)
NO (1) NO310306B1 (sl)
PL (1) PL295733A1 (sl)
SI (1) SI9200190A (sl)
SK (1) SK264192A3 (sl)
YU (1) YU79092A (sl)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
EP0753581A1 (en) 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
EP1180157B1 (en) * 1999-05-28 2012-11-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector
US20040063653A1 (en) * 2000-12-21 2004-04-01 Shiver John W. Polynucleotide vaccines expressing codon optimized hiv-1 pol and modified hiv-1 pol
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
WO2002072754A2 (en) 2001-03-08 2002-09-19 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mva expressing modified hiv envelope, gag, and pol genes
US20020106798A1 (en) 2000-03-02 2002-08-08 Robinson Harriet L. DNA expression vectors and methods of use
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
WO2002095038A2 (en) * 2001-05-23 2002-11-28 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of vegf for disease treatment
US7223740B2 (en) 2001-05-23 2007-05-29 Fornix Biosciences N.V. Vectors for enhanced expression of VEGF for atrial disease treatment
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
EP1450854A2 (en) * 2001-11-30 2004-09-01 Isis Innovation Limited Vaccine
GB2382578A (en) * 2001-11-30 2003-06-04 Isis Innovation Fowlpox-based vaccine
CA2425021A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-12 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Control of the ratio of lap to lip
WO2003097846A1 (en) * 2002-05-16 2003-11-27 Bavarian Nordic A/S Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome
GB0215621D0 (en) * 2002-07-05 2002-08-14 Imp College Innovations Ltd Improved poxvirus vaccines
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
EP2415783B1 (en) * 2006-10-16 2016-12-14 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
US8202967B2 (en) 2006-10-27 2012-06-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
AR083533A1 (es) 2010-10-22 2013-03-06 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe
JP6415977B2 (ja) 2011-04-15 2018-10-31 ジェネラックス・コーポレイションＧｅｎｅｌｕｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株およびその使用方法
AR088028A1 (es) 2011-08-15 2014-05-07 Boehringer Ingelheim Vetmed Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal
US20140140959A1 (en) 2012-10-05 2014-05-22 Aladar A. Szalay Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes
MX360137B (es) 2013-02-21 2018-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Proteínas h5 del virus de la influenza h5n1 para usarse como un medicamento.
US10238700B2 (en) 2014-01-02 2019-03-26 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
BR102015012334A2 (pt) 2015-05-27 2016-11-29 Fundação Hemoct De Ribeirão Preto Fundherp processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea
JP7150611B2 (ja) 2016-01-08 2022-10-11 ジオバックス・インコーポレイテッド 腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘起するための組成物及び方法
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
WO2024011250A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Viromissile, Inc. Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5155020A (en) 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5135855A (en) * 1986-09-03 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells
US5266313A (en) 1987-02-03 1993-11-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Raccoon poxvirus as a gene expression and vaccine vector for genes of rabies virus and other organisms
FR2619314B1 (fr) * 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
WO1990010693A1 (en) 1989-03-08 1990-09-20 Health Research, Inc. Recombinant poxvirus host selection system
WO1991011519A1 (en) * 1990-01-26 1991-08-08 Immuno Aktiengesellschaft Recombinantly produced blood factors and process for the expression of said blood factors, as well as vaccinia virus recombinants used in said process
US5204243A (en) 1990-02-14 1993-04-20 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus internal cores
AU658836B2 (en) 1990-09-25 1995-05-04 Xenova Research Limited Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line
JP3602530B2 (ja) 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5989561A (en) 1991-03-07 1999-11-23 Virogenetics Corporation Recombinant poxvirus-calicivirus rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) compositions and uses
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
US5863542A (en) 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
ATE288483T1 (de) 1992-07-30 2005-02-15 Akzo Nobel Nv Nicht-verbreitendes lebendes herpesvirusvakzin
JPH10512151A (ja) 1995-01-13 1998-11-24 ヴァイロジェネティクス コーポレイション Ｈｔｌｖ抗原を発現する組換え弱毒化ポックスウイルスを含有する免疫原性組成物

Also Published As

Publication number Publication date
FI923828A (fi) 1993-02-27
HU219369B (en) 2001-03-28
YU79092A (sh) 1995-12-04
DE69229390T2 (de) 1999-11-11
MX9204926A (es) 1994-02-28
AU652467B2 (en) 1994-08-25
NO923323L (no) 1993-03-01
FI923828A0 (fi) 1992-08-26
PL295733A1 (en) 1993-05-17
SK264192A3 (en) 1995-08-09
FI111384B (fi) 2003-07-15
ATE181108T1 (de) 1999-06-15
CA2076839C (en) 2007-06-12
EP0561034B1 (en) 1999-06-09
JPH06261763A (ja) 1994-09-20
CA2076839A1 (en) 1993-02-27
BR9203322A (pt) 1993-03-30
CZ264192A3 (en) 1993-08-11
AU2126992A (en) 1993-03-04
NO310306B1 (no) 2001-06-18
EP0561034A3 (sl) 1995-04-26
HUT69927A (en) 1995-09-28
US6103244A (en) 2000-08-15
EP0561034A2 (en) 1993-09-22
NO923323D0 (no) 1992-08-25
DE69229390D1 (de) 1999-07-15
US6265183B1 (en) 2001-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6265183B1 (en) Direct molecular cloning of foreign genes into poxviruses and methods for the preparation of recombinant proteins
AU2020286323B2 (en) Co-stimulatory domains for use in genetically-modified cells
KR102604096B1 (ko) 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료
KR102550926B1 (ko) 이중 항체 구축물을 발현하는 aav를 포함하는 조성물 및 이들의 용도
CN111344395A (zh) 产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法
KR20160138298A (ko) 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
AU2018235957B2 (en) Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins
CN111733174B (zh) 一种分离的核酸分子及其用途
CN112912112A (zh) 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途
CN111979240B (zh) 一种基于Type I-F CRISPR/Cas的基因表达调控方法和调控系统
CN116083398B (zh) 分离的Cas13蛋白及其应用
CN113164560A (zh) 改善基因疗法的新工具及其用途
CN114990157B (zh) 用于构建lmna基因突变的扩张型心肌病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
KR20220142502A (ko) 근육 특이적 핵산 조절 요소 및 이의 방법 및 용도
CA2558864C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
CA2515166C (en) Direct molecular cloning of a modified eukaryotic cytoplasmic dna virus genome
CN114958758B (zh) 一种乳腺癌模型猪的构建方法及应用
CN113260704B (zh) CYP4V2和RdCVF在制备药物中的用途
KR20240032025A (ko) 내이의 세포 유형-특이적 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
KR20220037964A (ko) 재조합 발생이 최소화된 유전자치료 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 및 상기 재조합 레트로바이러스를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
CN115245144A (zh) 用于制备富含ω-3脂肪酸的猪的试剂盒及其制备方法和应用
CN116323924A (zh) 具有最小化重组发生的基因疗法载体、包含载体的重组逆转录病毒和用于预防或治疗癌症的包含重组逆转录病毒的药物组合物
KR20210013036A (ko) 신규 벡터 및 그 이용
JPH01148183A (ja) 組み換えワクチニアウイルス