NO310306B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et modifisert chordopoxvirus ved hjelp av direkte molekyl¶r kloning av etmodifisert chordopoxvirusgenom, modifisert chordopoxvirus, DNA-molekyl og anvendelse av et modifisert virus for fremstilling avet rekomb - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for fremstilling av et

modifisert chordopoxvirus ved hjelp av direkte molekylær kloning av et modifisert chordopoxvirusgenom, modifisert chordopoxvirus, DNA-molekyl og anvendelse av et modifisert virus for fremstilling av et rekombinant protein fra en vertscelle.

Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen direkte molekylær kloning av et modifisert cytoplasmisk DNA-virusgenom som fremstilles ved å modifisere under ekstracellulære betingelser, et renset DNA-molekyl som omfatter et cytoplasmisk DNA-virusgenom. Det modifiserte DNA-molekyl pakkes så inn i infeksiøse virioner i

en celle infisert med et cytoplasmisk DNA-hjelpervirus. Ved en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse innføyes et fremmed-DNA-fragment som omfatter et ønsket gen direkte i poxvirusgenom-DNA i et restriksjonsendonukleasespaltningssete som er unikt i viralgenomet, og den modifiserte virus-DNA pakkes inn i virioner ved transfeksjon i celler infisert med et hjelperpoxvirus.

Cytoplasmiske DNA-virus hos eukaryoter omfatter diverse poxvirus og iridovirus som finnes i virveldyr og insekter. Poxvirus med rekombinante genomer er blitt brukt for ekspresjon av mange forskjellige innføyde gener. Slike poxvirus kan f.eks. brukes til å fremstille biologisk aktive polypeptider i cellekulturer og til å overlevere vaksineantigener direkte til et dyre- eller humanimmunsystem.

Konstruksjon av rekombinante iridovirusgenomer for ekspresjon av fremmedgener

synes ikke å være dokumentert i litteraturen vedrørende genteknikk.

Konvensjonelle teknikker for konstruksjon av rekombinante poxvirusgenomer bestående av fremmedgener er delvis basert på in

v/vo(intracellulær)-rekombinasjon. Bruken av intracellulær rekombinasjon ble først beskrevet som en prosess for "markørredning" med subgenomiske fragmenter av virus-DNA av Sam & Dumbell, Ann. Virol. (Institut Pasteur) 132E: 135 (1981). Disse forfatterne viste at en temperaturfølsom vacciniavirusmutant kunne "reddes" ved intracellulær rekombinasjon med et subgenom-DNA-fragment av et kaninpoxvirus. Metodene som de brukte for intracellulær rekombinasjon, brukes fortsatt i dag.

Konstruksjon av rekombinante vacciniavirus bestående av ikke-poxvirusgener ("fremmed"-gener) ble senere beskrevet av Panicali & Paoletti, Proe.

Nat'1 Acad. Sei. U.S.A. 79:4927-4931 (1982); Mackett, et al., Proe. Nat'1 Acad. Sei. U.S.A. 79: 7415-7419 (1982) og i US-patentskrift nr. 4.769.330. Nærmere bestemt omfatter den eksisterende teknologi for fremstilling av rekombinante poxvirus, to trinn. For det første fremstilles et DNA-fragment som har områder med homologi til poxvirusgenomet som omgir et fremmedgen. Alternativt konstrueres et "innføyelses"-plasmid ved in v/Yro(ekstracellulær)-rekombinasjon av et fremmedgen med et plasmid. Dette plasmidet omfatter korte virus-DNA-sekvenser som er homologe til området i poxvirusgenomet hvor geninnføyelsen til sist er ønsket. Fremmedgenet innføyes i plasmidet på en side flankert av virus-DNA-sekvensene og vanligvis nedstrøms fra en poxviruspromoter som vil regulere transkripsjon av det innføyde gen. I det andre trinn innføres innføyelsesplasmidet i vertsceller infisert med målpoxviruset. Genet innføyes så indirekte i poxvirusgenomet ved intracellulær rekombinasjon mellom homologe virussekvenser i poxvirusgenomet og den delen av plasmidet som omfatter fremmedgenet. Det resulterende rekombinante genom replikerer så og gir infeksiøst poxvirus.

Innføyelse av hvert bestemte gen i et poxvirusgenom har således hittil krevd et bestemt plasmid bestående av de genflankerte virussekvenser valgt for et ønsket innføyelsessted. En vanskelighet ved denne fremgangsmåten er at et nytt innføyelsesplasmid er påkrevd for hvert rekombinante poxvirus. Hvert plasmid må konstrueres ved hjelp av ekstracellulære metoder med rekombinant DNA, amplifiseres i en bakteriecelle og isoleres på en arbeidskrevende måte og renses nøye før tilsetning til en poxvirusinfisert vertscelle.

Et annet problem med eksisterende metodikk i dette henseende er et lavt utbytte av rekombinante genomer, noe som kan nødvendiggjøre screening av hundreder av individuelle virus for å finne en enkelt, ønsket rekombinant. Det dårlige utbyttet er en funksjon av den lave hyppigheten av individuelle, intracellulære rekombinasjonshendelser, kombinert med behovet for flere hendelser av denne sorten for å oppnå integrasjon av innføyelsesplasmidet i et virusgenom. Som et resultat av dette er de fleste virusgenomer fremstilt ved intracellulære rekombinasjonsmetoder, parentale genomer som mangler et fremmedgen. Det er derfor ofte nødvendig å innføre selektivt markørgen i et poxvirusgenom sammen med hvilken som helst annen ønsket sekvens for å muliggjøre hurtig påvisning av de påkrevde sjeldne rekombinanter uten behov for å karakterisere isolerte DNA-er fra et stort antall individuelle viruskloner.

Rensede DNA-er fra eukaryote cytoplasma-DNA-virus er ute av stand til å replikere når de innføres i mottakelige vertsceller under anvendelse av metoder som initierer infeksjoner med virus-DNA-er som replikerer i kjernen. Denne mangelen på infektivitet hos DNA-er fra cytoplasma-DNA-virus skriver seg fra det faktum at virustranskripsjon må initieres i infiserte celler ved hjelp av en virusspesifikk RNA-polymerase som normalt finnes inne i infiserte virioner.

"Reaktivering" av poxvirus-DNA hvor genom-DNA inne i en inaktivert, ikke-infeksiøs poxviruspartikkel ble pakket i infeksiøse virioner ved hjelp av saminfeksjon med et levedyktig hjelperpoxvirus, har vært kjent i årtider. Se f.eks. Fenner & Woodroofe, Virology 11: 185-201 (1960). I 1981 viste Sam og Dumbell at isolert, ikke-infeksiøs genom-DNA fra et første poxvirus kunne pakkes i infeksiøse poxvirusvirioner i celler infisert med et andre, genetisk forskjellig poxvirus. Sam &

Dumbell, Ann. Virol. (Institut Pasteur) 132E: 135 (1981). Denne innpakking av naken poxvirus-DNA ble først demonstrert ved transfeksjon av umodifisert DNA som omfatter et første villtypeortopoxvirusgenom isolert fra virioner eller infiserte celler, i celler infisert med et andre, naturlig forekommende ortopoxvirusgenom. Heterolog pakking, pakking av DNA fra én poxvirusslekt (f.eks. ortopox) ved hjelp av levedyktige virioner fra en annen slekt (f.eks. avipox), har imidlertid hittil ikke blitt vist.

Bruken av intracellulær rekombinasjon for konstruksjon av et rekombinant poxvirusgenom som uttrykker ikke-poxvirusgener, ble rapportert kort tid etter at Sam & Dumbell først rapporterte intracellulær pakking av naken poxvirus-DNA i poxvirusvirioner og markørredning med DNA-fragmenter ved hjelp av intracellulær rekombinasjon. Se Panicali & Paoletti, 1982; Mackett, et al., 1982. Den relevante litteratur fra det forutgående tiår synes imidlertid ikke å dokumentere den direkte molekylære kloning, dvs. konstruksjon alene ved ekstracellulær genteknikk, av et modifisert genom fra hvilket som helst eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, særlig et poxvirus. Litteraturen sannsynliggjør ikke en gang utstrakt anerkjennelse av en eventuell fordel realisert fra en slik direkte kloningsfremgangsmåte. Derimot har en autoritativ behandling fastslått at direkte molekylær kloning ikke er praktisk i sammenheng med genteknikk ned på poxvirus ettersom poxvirus-DNA ikke er infeksiøs. F. FENNER, R. WITTEK & K.R. DUMBELL, THE POXVIRUSES (Academic Press, 1989). Andre som arbeider på dette området har likeledes sett bort fra endonukleolytisk spaltning og religering av poxvirus-DNA-er, selv om de har anerkjent et potensiale for redning av isolert DNA som omfatter et rekombinant poxvirusgenom, ved hjelp av infeksiøst virus. Se f.eks. Mackett & Smith, J. Gen. Virol. 67: 2067-2082 (1986). Nyere oversikter fremlegger dessuten den tese at den eneste mulige måte å konstruere et rekombinant poxvirusgenom på er ved hjelp av metoder som krever intracellulær rekombinasjon. Se Miner & Hruby, TIBTECH 8: 20-25 (1990) og Moss & Flexner, Ann. Rev. Immunol. 5: 305-324 (1987).

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for konstruksjon av modifiserte genomer av eukaryote cytoplasmiske DNA-virus, særlig av poxvirus, som overvinner de tidligere nevnte begrensninger forbundet med konvensjonelle teknikker basert på intracellulær rekombinasjon.

Det er et annet formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe teknikker for cytoplasmisk DNA-virusgenomkonstruksjon som gir vesentlig høyere utbytter av rekombinanter enn eksisterende metodikk.

Det er et ytterligere formål ved denne oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for å modifisere et genom fra et cytoplasmisk DNA-virus ved direkte modifikasjon av genom-virus-DNA og intracellulær pakking av den modifiserte virus-DNA i virioner ved hjelp av hjelpervirusfunksjoner.

Det er et annet formål ved denne oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåter for konstruksjon av et genom til et cytoplastisk DNA-virus som i ett rekombinasjonsreaksjonstrinn gir modifiserte genomer med et fremmed-DNA-segment innføyd i hvert av de to mulige orienteringer og modifiserte genomer med multiple innføyelser av et fremmed-DNA-segment.

Det er ytterligere et annet formål å tilveiebringe modifiserte DNA-molekyler egnet for direkte molekylær kloning av fremmedgener i et modifisert cytoplasmisk DNA-virusgenom som omfatter to deler av et genomvirus-DNA fremstilt ved spaltning med en sekvensspesifikk endonuklease i et sete som er unikt for virusgenomet.

Det er nok et ytterligere formål å tilveiebringe et cytoplasmisk DNA-virus, særlig et poxvirus, med et modifisert genom bestående av et fremmed-DNA innføyd i et unikt spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease.

Det er et annet formål å tilveiebringe plasmider som letter konstruksjon og overføring av genkassetter til et cytoplasmisk DNA-virus, særlig et poxvirus, under anvendelse av direkte molekylær kloning.

For å gjennomføre disse og andre formål, er det i overensstemmelse med ett aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av et modifisert chordopoxvirus ved hjelp av direkte molekylær kloning av et modifisert chordopoxvirusgenom, kjennetegnet ved at den omfatter (i) modifisering av et renset DNA-molekyl som omfatter et genom fra en chordopoksvirus, under ekstracellulære betingelser for å danne et modifisert DNA-molekyl som omfatter det modifiserte virusgenom; (ii) introduksjon av nevnte modifiserte DNA-molekyl inn i en vertscelle hvorved nevnte modifiserte virusgenom pakkes inn i infeksiøse virioner; og (iii) infeksiøse virioner bestående av nevnte modifiserte virusgenom, utvinnes fra nevnte vertscelle.

Ifølge én utførelsesform av denne fremgangsmåten omfatter trinnet med å modifisere DNA-molekylet under ekstracellulære forhold, et trinn ved spaltning av DNA-molekylet med en sekvensspesifikk endonuklease. Ifølge en annen utførelses-form omfatter trinnet med å modifisere DNA-molekylet et trinn med innføyelse av en første DNA-sekvens i det første virusgenom. Fordelaktig innføyes denne første DNA-sekvens i det første genom i et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease. Det bør legges merke til at når en bestemt sekvensspesifikk endonuklease, slik som et bakterielt restriksjonsenzym, her beskrives ved navn, betegner det navnet også enhver isoschizomer av den navngitte nuklease.

Eventuelt omfatter trinnet med å modifisere DNA-molekylet i henhold til denne fremgangsmåten, også et trinn med å bruke en fosfatase for å fjerne en fosfatrest fra en ende av et DNA-segment som frembringes ved spaltning av DNA-molekylet med en sekvensspesifikk endonuklease.

Ved noen utførelsesformer av denne fremgangsmåten er det første virusgenom et vacciniavirusgenom og det unike sete er et spaltningssete for den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti eller for den bakterielle restriksjonsendonukleasen Smal. Det første genomet kan også omfatte en andre DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et eukaryot cytoplasmisk DNA-virusgenom hvor den andre DNA-sekvens består av det unike spaltningssetet. F.eks. kan det første genomet være et fjærfekoppervirusgenom som omfatter en sekvens av et B-galaktosidasegen fra Escherichia coli, og det unike setet er et spaltningssete for den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti som befinner seg i det genet.

Ved andre former av denne fremgangsmåten innføyes den første DNA-sekvens i det første virusgenom mellom et første spaltningssete for en første sekvensspesifikk nuklease og et andre spaltningssete for en andre sekvensspesifikk endonuklease. Eventuelt er hvert av det første og det andre spaltningssetet unikt i det første virusgenom.

Ifølge andre utførelsesformer av fremgangsmåten er minst en del av den første DNA-sekvens som innføyes i det første genom, under transkripsjonen kontroll av en promoter. Denne promoter kan være lokalisert i den første DNA-sekvens som innføyes i det første virusgenom. Alternativt befinner promoteren seg i det modifiserte virusgenom oppstrøms fra den første DNA-sekvens som er innføyd i det første genom. I noen tilfeller benyttes promoteren av en RNA-polymerase som kodes for av det modifiserte virusgenom. Denne promoter kan også være egnet for initiering av transkripsjon ved hjelp av en RNA-polymerase hos det eukaryote cytoplasmiske DNA-virus som skal modifiseres. Ved visse fremgangsmåter omfatter promoteren en modifikasjon av en naturlig forekommende promoter hos det eukaryote cytoplasmiske DNA-virus.

Trinnet med å modifisere DNA-molekylet i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan omfatte et trinn med å deletere en DNA-sekvens fra det første genomet. Alternativt omfatter dette trinnet et trinn med å bytte ut en DNA-sekvens i det første genomet.

Fremgangsmåten for modifikasjon av et første virusgenom kan også omfatte et trinn med infeksjon av den første vertscelle med en andre eukaryot cytoplasmisk DNA-virus omfattende et andre genom som uttrykkes for innpakking av det modifiserte virusgenom i infeksiøse virioner. Trinnet med å innføre det modifiserte DNA-molekyl i den første vertscellen utføres fordelaktig ca. én time etter trinnet med å infisere den første vertscellen med det andre eukaryote cytoplasmiske DNA-virus.

Ved én variasjon av denne fremgangsmåten velges den første vertscellen, slik at ekspresjon av det andre genom i den første vertscellen ikke gir infeksiøse virioner bestående av det andre virusgenom. Når det modifiserte virusgenom er et modifisert vacciniavirusgenom og det andre genom er et fjærfekoppervirusgenom, er f.eks. den utvalgte første vertscelle en pattedyrcelle.

Ved noen former av fremgangsmåten for modifikasjon av et virusgenom, omfatter trinnet med utvinning av infeksiøse virioner bestående av det modifiserte virusgenom, et trinn med infeksjon av en andre vertscelle med infeksiøse virioner fremstilt ved hjelp av den første vertscellen. Dette gjøres under slike betingelser at ekspresjon av det andre genom i den andre vertscellen ikke gir infeksiøse virioner bestående av det andre genom. Når det modifiserte virusgenom er et modifisert vacciniavirusgenom, kan det andre genom f.eks. være et fjærfekoppervirusgenom og den andre vertscellen er en pattedyrcelle. Alternativt omfatter det modifiserte virusgenom et funksjonelt vertsområdegen påkrevd for å gi infeksiøse virioner i den andre vertscellen og det andre genomet mangler det funksjonelle vertsområdegen. Dette illustreres ved hjelp av det tilfellet hvor det modifiserte virusgenom er et modifisert vacciniavirusgenom som omfatter et funksjonelt vertsområdegen påkrevd for å gi infeksiøse virioner i en humancelle, og den andre vertscellen er en humancelle.

Ved andre former av denne fremgangsmåten omfatter det modifiserte virusgenom et gen for en selektiv markør, i det det andre genom mangler det genet for den selektive markør, og trinnet med infeksjon av den andre vertscellen utføres under betingelser som selekterer for et genom som uttrykker det genet for en selektiv markør. Ekspresjon av genet for den selektive markør i den andre vertscellen gir fordelaktig den andre vertscellen resistens mot et cytotoksisk legemiddel som er til stede under infeksjon ved et tilstrekkelig nivå til å selektere for et genom som uttrykker genet for den selektive markør.

Ifølge et annet-aspekt tilveiebringes et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus fremstilt ved hjelp av direkte molekylær kloning av et modifisert virusgenom i henhold til fremgangsmåter oppsummert ovenfor.

Nok et annet aspekt vedrører et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus som består av et modifisert virusgenom, hvor det modifiserte virusgenom omfatter: (I) et første genom fra et første eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Dette første genomet består av et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease, og dette spaltningssetet er et unikt sete i det første genom. Det modifiserte genom omfatter videre (II) en første DNA-sekvens innføyd i det unike setet i det første

genom.

I henhold til en hovedutførelsesform av dette aspektet er den første DNA-sekvens ikke naturlig forekommende i et genom hos et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. I noen foretrukne tilfeller er det første genom et vacciniavirusgenom og det unike sete er et spaltningssete for en bakteriell restriksjonsendonuklease valgt fra gruppen bestående av Noti og Smal.

Det første genom kan omfatte en andre DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et genom hos et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, og den andre DNA-sekvens består av et unikt spaltningssete. I ett eksempel er det første genom et fjærfekoppervirusgenom som omfatter en andre DNA-sekvens fra et 6-galaktosidasegen fra Escherichia coli, og det unike setet i det genet er et spaltningssete for den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti.

Hos noen modifiserte virus er i det minste en del av den første DNA-sekvens som er innføyd i det unike sete, under transkripsjonskontroll av en promoter. Denne promoter befinner seg i den første DNA-sekvens som er innføyd i det første genom. I noen tilfeller er det første genomet et poxvirusgenom og promoteren omfatter en poxviruspromoter, enten en naturlig forekommende poxviruspromoter eller en modifikasjon derav.

Nok et annet aspekt vedrører et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus bestående av et modifisert virusgenom hvor det modifiserte virusgenom omfatter (I) et første genom fra et første eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Dette første genomet består av et første spaltningssete for en første sekvensspesifikk endonuklease og et andre spaltningssete for en andre sekvensspesifikk endonuklease. Hvert av disse spaltningssetene er et unikt sete i det første genom.

Det modifiserte genom i dette modifiserte virus omfatter videre (II) en første DNA-sekvens innføyd i det første genom mellom det første unike sete og det andre unike sete. Hos noen former av dette modifiserte virus er den første DNA-sekvens ikke naturlig forekommende i et genom fra et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. I noen tilfeller omfatter det første genom en andre DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et genom hos et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, og den andre DNA-sekvensen består av en første DNA-sekvens innføyd mellom det første unike sete og det andre unike sete. Dette modifiserte virus kan f.eks. omfatte et første genom som er et vacciniavirusgenom, og hvert av det første unike sete og det andre unike sete er et spaltningssete for en bakteriell restriksjonsendonuklease valgt fra gruppen bestående av Noti, Smal, Apal og Rsrll.

Nok et annet modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus består av et modifisert virusgenom som omfatter (I) et første genom fra et første eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Dette første genomet består av en første DNA-sekvens og denne første DNA-sekvensen består av et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease som er et unikt sete i dette modifiserte virusgenom. Dette genomet i dette modifiserte virus omfatter videre (II) en promoter som er lokalisert slik at en DNA-sekvens innføyd i det unike sete i virusgenomet er under transkripsjonskontroll av promoteren. Hos visse former mangler denne første DNA-sekvensen et translasjonsstartkodon mellom promoteren og det unike innføyelsessete. Denne første DNA-sekvensen kan være et som ikke er naturlig forekommende i et genom hos et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Dette modifiserte virus eksemplifiseres av ett hvor det første genom er et vacciniavirusgenom og den første DNA-sekvens består av et multippelkloningssete som omfatter spaltningsseter for de bakterielle restriksjonsendonukleasene Noti, Smal, Apal og Rsrll.

Nok et annet aspekt vedrører et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus ifølge oppfinnelsen, hvor en første sekvens i det modifiserte virusgenom (en innføyd sekvens av interesse) uttrykkes i en vertscelle, noe som resulterer i fremstilling av et protein.

I henhold til et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse også et DNA-molekyl som omfatter et DNA-molekyl kjennetegnet ved at det omfatter et modifisert chordopoxvirusgenom som kan dannes ved direkte molekylær kloning ved modifisering under ekstracellulære betingelser av et renset DNA-molekyl fra et chordopoxvirusgenom ved

a) spalting av nevnte DNA-molekyl i et unikt sekvensspesifikt endonukleasespaltingssete og innsetting av en DNA-sekvens som ikke er

naturlig forekommende i virusgenomet i nevnte sete, eller

b) spalting av nevnte DNA-molekyl i et første unikt og et andre unikt sekvensspesifikt endonukleasespaltingssete, og innsetting av en DNA-sekvens

som ikke er naturlig forekommende i virusgenomet, mellom nevnte seter

for å danne et modifisert DNA-molekyl omfattende nevnte modifiserte virusgenom.

I noen former av dette DNA-molekylet består DNA-sekvensen som ikke er naturlig forekommende i et genom fra et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, av spaltningssetet for en sekvensspesifikk endonuklease som er et unikt sete i det modifiserte virusgenom.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et modifisert virus ifølge ethvert av kravene 28 til 37 for fremstilling av et rekombinant protein fra en vertscelle

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1.1 viser ekspresjon av markørgener ved hjelp av modifiserte genomer fra poxvirus fremstilt ved reaktivering av naken poxvirus-DNA. En sølvfarget polyakrylamidgel av proteiner fremstilt i kultursupernatanter til celler infisert med innpakkede virus (vpPg#l-vpPg#8) og med villtypeviruskontroller (WT), er vist. Den øverste pilen peker mot plasminogenmarkørbåndet, den nederste pilen mot båndet til det viktigste utskilte 35 K-vacciniamarkørprotein. Feltene 1 og 9, markørproteiner; feltene 2 og 10, humanplasminogenstandard (10 ng); felt 3, vacciniarekombinant vPgD (kilde for innpakket DNA); feltene 4-7 og 11-14, vpPg#l-8; feltene 8 og 15, villtypevaccinia (WR WT).

Figur 1.2 er et skjematisk diagram som viser direkte molekylær kloning av poxvirusgenomer bestående av en genkassett for ekspresjon av et markørgen ( E. cø/z-gpt-genet) under kontroll av en vacciniaviruspromoter. Figur 1.3 er en skjematisk illustrasjon av konstruksjon av plasmider (pN2-gpta og pN2-gptb) som er forløpere for konstruksjon av genekspresjonskassetter ved innføyelse av en promoter og en åpen leseramme. Slike kassetter er utformet for direkte molekylær overføring i vacciniavirusvektorer under anvendelse av et unikt innføyelsessete og et gen for en selekterbar markør (gpt) drevet av en vacciniaviruspromoter. MCS = multippelkloningssete. P7.5 = promoter for vaccinia-7.5K-polypeptidgen; Pl 1 = promoter for vaccinia-1 lK-polypeptidgen. Piler viser retningene for transkripsjon fra promoterne. Figur 1.4 viser at poxvirusgenomer fremstilt ved direkte molekylær kloning inneholder gpt-markørgenkassetten innføyd i et unikt (Noti) spaltningssete, som vist ved hjelp av "Southern blot"-analyser av plakkrensede virus-DNA-er fordøyd med Hindlll-endonukleasen under anvendelse av en gpt-genprobe. Felt 1, markør-DNA-er (Hindlll-fordøyd fag Å--DNA); feltene 2 og 3, villtypevacciniavirus(WR)-DNA kuttet med Hindlll (hhv. 500 og 100 ng); feltene 4-9, DNA-er fra celler infisert med plakker betegnet 2.1.1-7.1.1; feltene 10-12, DNA-er fra celler infisert med plakker 10.1.1-12.1.1. Piler viser størrelser på restriksjonsfragmentene av markøren i kilobasepar. Figur 1.5 illustrerer videre strukturer av modifiserte poxvirus-DNA-er under anvendelse av "Southern blot" av Notl-fordøyd DNA-er fra celler infisert med forskjellige isolater og hybridisert med en gpt-genprobe. Felt 1, markør-DNA-er (Hindlll-fordøyd fag <>>i-DNA); felt 2, vacciniavilltype(WT)-DNA kuttet med Noti (50 ng); feltene 3-8, DNA-er fra celler infisert med rekombinante plakker betegnet 2.1.1-7.1.1; feltene 9-11, DNA-er fra celler infisert med plakker 10.1.1-12.1.1. Figur 1.6 viser en sammenligning av DNA-er fra villtype(WT)-vaccinia og en modifisert klon (vp7) under anvendelse av etidiumbromidfarging av DNA-fragmenter spaltet med angitte restriksjonsendonukleaser og separert på en agarosegel. Feltene 1 og 2, Notl-fordøyelsesprodukter av WT og vp7; feltene 3 og 4, Hindlll-fordøyelsesprodukter av WT og vp7; feltene 5 og 6, Hindlll og Noti kombinerte fordøyelsesprodukter av WT og vp7; feltene 7 og 8, Pstl-fordøyelsesprodukter av WT og vp7; feltene 9 og 10, Pstl og Noti kombinerte fordøyelsesprodukter av WT og vp7; feltene 11 og 12, Sali-fordøyelsesprodukter av WT og vp7; felt 13, markør-DNA-er (ligert og Hindlll-fordøyd fag A,-DNA; og fag <|)X kuttet med Haelll). Piler til venstre viser størrelser på fragmenter (i kilobasepar) av Notl-fordøyelse av vaccinia-WT; piler til høyre, markører. Legg merke til at feltene 1 og 2 inneholder ca. ti ganger mindre DNA enn de øvrige feltene. Figur 1.7 viser en "Southern blot" av gelen vist i figur 1.6 under anvendelse av en gpt-genprobe. Piler viser markørstørrelser. Figur 1.8 viser "Southern blot"-analyser av vacciniavirus-DNA-er fra infiserte celler fordøyd med Noti og hybridisert til en vacciniavirusprobe. Feltene 1-4, DNA-er fra celler infisert med plakker betegnet A1-A4; feltene 5-8, plakker C1-C4; feltene 9-12, plakker E1-E4; felt 13, vaccinia-WT-DNA; felt 14, DNA fra uinfiserte CV-1-vertsceller; felt 15, markør-DNA-er (Hindlll-fordøyd fag ?i-DNA; og fag §X kuttet med Haelll). Figur 1.9 viser en "Southern blot" av de samme prøvene som i gelen vist i figur 1.8 under anvendelse av en gpt-genprobe. Feltene 1-12 som i figur 1.8; felt 13, DNA fra uinfiserte CV-1-vertsceller; felt 14, vaccinia-WT-DNA; felt 15, markør-DNA-er (Hindlll-fordøyd fag X-DNA; og fag <j)X kuttet med Haelll). Figur 1.10 viser en "Southern blot" av de samme virus-DNA-er som i gelen i figur 1.8, begrenset med Pstl, under anvendelse av en gpt-genprobe. Feltene 1-12 som i figur 1.8; felt 13, DNA fra uinfiserte CV-1-vertsceller; felt 14, vaccinia-WT-DNA; felt 15, markør-DNA-er (Hindlll-fordøyd fag >,-DNA; og fag <j)X kuttet med Haelll). Figur 1.11 skisserer skjematisk den forutsakte struktur til de modifiserte PstI-"C"-fragmentene av vacciniavirus-DNA-er med enkelt- eller dobbeltinnføyelser av gpt-genkassetten. P = Pstl- og N = Notl-spaltningsseter. Tallene angir størrelser på respektive Pstl-fragmenter; uthevede tall angir fragmenter forventet å hybridisere med en gpt-genprobe. Piler viser transkripsjonsretning for gpt-genet (800 bp) ved hjelp av vacciniaviruspromoteren (300 bp). Figur 2.1 viser analyser av rekombinante avipoxgenomer (fjærfekopper, FP) ved fordøyelse med restriksjonsendonukleasen Noti og separasjon ved hjelp av FIGE på en 1 % agarosegel. Felt 5, markør (fag X Hindlll-fragmenter, ukuttet fag X og vaccinia-WR); feltene 1 og 2, fjærfekoppervirus HP 1.441-DNA, ukuttet og kuttet med Noti; feltene 3 og 4, rekombinant fjærfekoppervirus f-TK2a-DNA, ukuttet og kuttet med Noti. Figur 2.2 viser konstruksjon av fjærfekoppervirus som uttrykker fremmedgener ved direkte molekylær kloning. En genekspresjonskassett bestående av gpt-genet fra E. coli kontrollert ved hjelp av en poxviruspromoter (P), ligeres med den høyre og den venstre DNA-arm (hhv. ra og la) til fjærfekoppervirus (f-TK2a) erholdt ved spaltning med Noti. Pakking utføres ved hjelp av fjærfekopperhjelpervirus (stamme HP2) i kyllingembryofibroblastere. Figur 3.1 viser en fremgangsmåte for konstruksjon av modifiserte poxvirus ved hjelp av ekstracellulær genomteknikk og intracellulær pakking. En genkassett bestående av gpt-genet regulert av en vacciniaviruspromoter, ligeres med den "høyre arm" (ra) og den "venstre arm" (la) av vacciniavirus-DNA spaltet i et unikt sete med endonukleasen Smal. Innpakking gjøres ved hjelp av fjærfekopperhjelperviruset (stamme HP 1.441) i kyllingembryofibroblaster. Pl = promoter til vacciniavirusgenet som koder for 7,5 kDA polypeptidet. Figur 3.2 viser at fremstilte vacciniavirusgenomer pakket ved hjelp av fjærfekopperhjelpervirus, inneholder den forventede innføy else av et unikt Smal-spaltningssete, som bestemt ved hjelp av "Southern blot"-analyser. Total DNA isolert fra infiserte celler ble fordøyd med Hindlll og blotten ble hybridisert med en gpt-genprobe. Feltene 1-8, DNA-er fra celler infisert med plakker betegnet F12.2-F12.9; feltene 9-13, plakkene F13.1-F13.5; feltene 14 og 15, Hindlll-fordøyd DNA isolert fra hhv. uinfiserte celler og celler infisert med vacciniavirus (WR villtype); felt 16, markører (Hindlll-fordøyd fag A.-DNA). DNA-en i felt 8 hybridiserer ikke ettersom virusisolatet #F12.9 ikke replikerer. Figur 3.3 viser en skjematisk skisse av de forventede strukturer til modifiserte vacciniavirusgenomer som har en genkassett innføyd i et unikt Smal-sete, særlig de modifiserte HindIII-"A"-fragmenter i virus med enkelt- og dobbelt-innføyelser. H = Hindlll- og S = Smal-restriksjonsendonukleasespaltningsseter. Tall angir størrelser på Hindlll-fragmentene, i det de i uthevet skrifttype angir fragmenter forventet å hybridisere med en gpt-genprobe. gpt-genkassetten består av en vacciniaviruspromoter (ca. 300 bp i størrelse) atskilt ved hjelp av et internt Hindlll-sete fra gpt-sekvensene (ca. 800 bp). Piler viser transkripsjonsretningen til gpt-genet. Figur 4.1 viser en skjematisk plan for konstruksjonen av vacciniavirus vektor vdTK som har et modifisert tymidinkinasegen (tk). WR-WT = villtype (WT) Western Reserve (WR)-stamme av vacciniavirus (VV). Panel A viser en fremgangsmåte hvor det anvendes bare direkte molekylær modifikasjon av vacciniavirusgenomet, inkludert delesjon av uønskede Noti- og Smal-seter. Panel B skisserer en alternativ fremgangsmåte for delesjon av et Notl-sete under anvendelse av markørredningsteknikker med vacciniavirus og et modifisert plasmid. Panel C viser en alternativ fremgangsmåte for å deletere Smal-setet ved hjelp av markørredning. Figur 4.2 illustrerer konstruksjon av vacciniavirusvektoren (vdTK) som har tymidinkinasegenet (tk) erstattet med et multippelkloningssete. Pilen angir initieringen og transkripsjonsretningen til vacciniavirus-tk-genet (VV-tk) i Hindlll-J-fragmentet klonet i plasmid pHindJ-1. tk-genet ble erstattet, som vist, og sluttplasmidet pHindJ-3 ble brukt til å innføye det modifiserte Hindlll-J-fragment i vacciniavirus. Figur 4.3 skisserer konstruksjon av plasmider (pAl og pA2) som er forløpere for konstruksjon av genekspresjonskassetter ved innføyelse av en promoter og en åpen leseramme. Slike kassetter er egnet for direkte molekylær overføring i vacciniavirus vektor vdTK under anvendelse av styrt (fremtvunget) kloning. Figur 4.4 illustrerer konstruksjon av plasmider (pAl-Sl og pA2-Sl) bestående av genekspresjonskassetter egnet for binding mellom åpne leserammer med en syntetisk poxviruspromoter (Sl) og et translasjonsstartkodon. Kassettene er utformet for direkte molekylær overføring i vacciniavirus vektor vdTK ved hjelp av fremtvunget kloning. Sl-promoteren er til stede i forskjellige orienteringer i de to plasmidene, som angitt ved hjelp av pilene som viser transkripsjonsretningene. Figur 4.5 skisserer konstruksjonen av plasmider (pAl-S2 og pA2-S2) bestående av genekspresjonskassetter egnet for binding av åpne leserammer som allerede har et translasjonsstartkodon med en syntetisk poxviruspromoter (S2), før direkte molekylær overføring i vacciniavirus vektor vdTK ved hjelp av fremtvunget kloning. S2-promoteren er til stede i forskjellige orienteringer i de to plasmidene, som angitt ved hjelp av pilene som viser transkripsjonsretningene. Figur 4.6 viser konstruksjonen av plasmidene pN2-gpta og pN2-gptb. Figur 4.7 viser konstruksjon av plasmider (pN2gpt-S3 A og pN2gpt-S4) bestående av genekspresjonskassetter egnet for binding av en åpen leseramme som enten mangler (S3A) eller har (S4) et translasjonsstartkodon, med en syntetisk promoter (hhv. S3A eller S4), før direkte molekylær overføring i et unikt sete i vacciniavirusvektor vdTK. Forkortelser som i figur 1.3. Figur 5.1 illustrerer konstruksjon av et genekspresjonskassettplasmid (pAlSl-PT) for ekspresjon av humanprotrombin i vacciniavirusvektor vdTK. Forkortelser som i figur 1.3. Piler angir transkripsjonsretningen. Figur 5.2 viser konstruksjon av et genekspresjonskassettplasmid (pN2gpt-GPg) for ekspresjon av humant glu-plasminogen i vacciniavirusvektor vdTK. S4 = syntetisk poxviruspromoter; andre forkortelser som i figur 1.3. Figur 5.3 viser konstruksjon av et genekspresjonskassettplasmid (pN2gpt-LPg) for ekspresjon av humant lys-plasminogen i vacciniavirusvektor vdTK. Forkortelser som i figur 1.3. Figur 5.4 skisserer konstruksjon av et genekspresjonskassettplasmid (pN2gpt-gpl60) for ekspresjon av et humant virusantigen (HIV-gpl60) i vacciniavirusvektor vdTK. Forkortelser som i figur 1.3. Figur 5.5 illustrerer en fremgangsmåte for screening av modifiserte vacciniavirus laget ved hjelp av direkte molekylær kloning basert på samtidig innføyelse av et markørgen ( E. cø/MacZ-genet) som gir en visuelt forskjellig fenotype ("blå" plakk sammenlignet med normale "hvite" plakker av virus som mangler et lacZ-gen). Figur 5.6 illustrerer konstruksjonen av plasmidene pTZS4-lacZa og pTZS4-lacZb. Figur 6.1 illustrerer konstruksjon av en vacciniavirusvektor (vS4) med et styrt masterkloningssete under kontroll av en sterk "sen"-vacciniaviruspromoter (S4). Figur 6.2 viser konstruksjon av et modifisert vacciniavirus (vvWF) for ekspresjon av von Willebrand-faktor ved direkte molekylær innføyelse av en åpen leseramme i vacciniavirusvektor vS4. vWF = von Willebrand-faktor-cDNA. Pilen angir transkripsjonsretningen fra S4-promoteren. Figur 7.1 illustrerer effekten av mengde tilsatt DNA på innpakking av vacciniavirus-DNA ved hjelp av fjærfekopperhjelpervirus i pattedyrceller (CV-1) hvor fjærfekoppervirus ikke replikerer fullstendig. Fem kulturer ble infisert med fjærfekoppervirus og deretter transfisert med de angitte mengder vacciniavirus-DNA. Den første spalten viser en kultur uten noe tilsatt DNA og uten fjærfekoppervirus, og den femte spalten, ikke noe tilsatt DNA, men infisert med fjærfekoppervirus. Figur 8.1 skisserer konstruksjon av et vacciniavirus (vdhr) egnet for anvendelse som et hjelpervirus med vertsområdemutasjoner som forhindrer replikasjon i noen humancellelinjer. hr-gen = vertsområdegen lokalisert i EcoRI K-fragmentet til vacciniavirus; andre forkortelser som i figur 1.3. Figur 9.1 viser konstruksjonen av plasmidene pS2gpt-P2 og pP2gpl60MN. Piler innenfor plasmider viser transkripsjonsretningen til de respektive gener. Figur 9.2 viser den skjematiske skissering av konstruksjonen av virusene vP2-gpl60MN-A og vP2-gpl60MN-B. Figur 9.3 viser kart over Pstl-E-fragmentet til villtypevacciniaviruset og over Pstl-fragmentene til kimærvirusene som omfatter gpl60-gener. Piler angir transkripsjonsretningen til gpl60-genet. Tall angir størrelser på fragmenter i kilobasepar. Figur 9.4 viser konstruksjon av plasmidet pselP-gpt-L2. Piler angir transkripsjonsretningen til de respektive gener. Figur 9.5 A) viser konstruksjon av plasmidet pselP-gpl60MN og figur 9.5 B) viser sekvenser rundt translasjonsstartkodoner fra villtype (sekvens med identifikasjonsnr. 73) og modifiserte gpl60-gener (sekvens med identifikasjonsnr. 75). Figur 9.6 er en skjematisk skissering av konstruksjon av kimærvacciniavirusene vselP-gpl60MNA og vP2-gpl60MNB. Piler angir transkripsjonsretningen til gpl60-genet. Figur 9.7 er et kart over Sall-F-fragmentet fra villtypevacciniaviruset og over Sall-fragmentene fra kimærvacciniavirusene vselP-gpl60MNA og vP2-gpl60MNB. Piler angir transkripsjonsretningen til gpl60-genet. Tall angir størrelser på fragmentene i kilobasepar. Figur 10.1 A) viser strukturen til plasmid pN2-gptaProtS. Den doble genkassetten bestående av gpt-genet kontrollert av vaccinia-P7.5-promoteren (P7.5) og det humane protein S-gen (huProtS) kontrollert av en syntetisk poxviruspromoter (selP), er flankert av Notl-restriksjonssetene. Figur 10.1 B) viser sekvenser rundt translasjonsstartkodoner hos villtypeprotein S-gen (sekvens med identifikasjonsnr. 77) og protein S-genet i kimærne (sekvens med identifikasjonsnr. 79). Figur 10.2 viser "Southern blot"-analyse av kimærvacciniavirus som bærer protein S-genet. A) Totale cellulære DNA-er fordøyd med SacI og hybridisert med vacciniavilltype Sacl-fragment. B) Det samme materialet fordøyd med Noti og probet med sekvenser fra humant protein S. C) Skjematisk skissering av villtype Sacl-I-fragmentet og kimær-SacI-fragmentet etter ligering av innføyelsen. Figur 10.3 viser "western blot"-analyse av plasmaavledet protein S (pdProtS; feltene 1 og 2) og et rekombinant protein S (rProtS).

Cellekultursupernatanter (10 ul) fra SK-Hepl-celler ble analysert etter inkubasjonsperioder på 24-72 timer. Figur 11.1 viser strukturen til plasmid pN2gpta-FIX. Den doble genkassetten bestående av gpt-genet kontrollert av vaccinia-P7.5-promoteren (P7.5) og humanfaktor-IX-genet kontrollert av en syntetisk poxviruspromoter (selP), er flankert av Notl-restriksjonssetene. Figur 11.2 viser "Southern blot"-analyse av kimærvirusene som bærer et gen for humanfaktor IX. Panel A) totale cellulære DNA-er fordøyd med SM og hybridisert med humanfaktor IX-genproben (plasmid pBluescirpt-FIX). I alle åtte isolatene (#1-6, 9 og 10) hadde innføyelsen "a"-orienteringen; m = markør; VV-WT/WR = vacciniavilltype, WR-stamme. Panel B) forutsakte genomstrukturer til kimærvirusene. Figur 11.3 viser "Western blot"-analyse av plasmaavledet faktor IX (pdFIX; feltene 1 og 2) og av rekombinant faktor IX uttrykt ved hjelp av kimærvacciniavirus i Vero-celler. Cellekultursupernatanter (10 ul) ble analysert etter inkubasjon i 72 timer. #1-6, 9 og 10 = numrene til plakkisolater; pd FIX = plasmaavledet faktor IX. Figur 12.1 illustrerer konstruksjon av det kimære fjærfekoppervirus f-envIIIB ved direkte molekylær kloning av HIVIIIB-env-genet. Figur 12.2 A) viser "Southern blots" av Sspl-fragmenter av kimære fjærfekoppervirusisolater hvor orienteringene til env-geninnskudd er vist. Feltene 1-12, virusisolatene f-LFa-1; felt 13 og 14, HP 1,441 og f-TK2a (negative kontroller); felt 15, Sspl-fordøyelsesprodukt (10 ng) av pN2gpt-gpl60 (positiv kontroll). Panel B) viser restriksjonskart for Sspl-fragmenter av innskudd i de to mulige orienteringene i det kimære fjærfekoppervirus. Tallene angir størrelser på Sspl-fragmenter i kilobasepar. Piler angir orienteringer til innskuddet som faller sammen med transkripsjonsretning for gpl60-transkripsjonsenheten. Figur 12.3 viser ekspresjon av HIV-kappeglykoproteiner i kyllingembryofibroblastere ("Western blots"). Feltene 1-8, virusisolatene f-LF2a-h; feltene 9 og 15, gpl60-standard (levert av A. Mitterer, Immuno Ag, Orth/Donau, Østerrike); feltene 10-13, virusisolatene f-lF2i-l; felt 14, markørproteiner; feltene 16 og 17, fjærfekoppervirusene HP 1.441 og f-TK2a (negative kontroller). Figur 12.4 viser påvisning av HIV-gp41 fremstilt ved hjelp av kimærvacciniavirus i infiserte kyllingembryofibroblastere ("Western blots"). Feltene 1-8, virusisolatene f-LF2a-h; feltene 9 og 15, gpl60-standard; feltene 10-13, virusisolatene f-LF2i-l; felt 14, markørproteiner; feltene 16 og 17, fjærfekoppervirusene HP 1.441 og f-TK2a (negative kontroller).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse utgjør den første konstruksjon av et modifisert genom til et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, som eksemplifisert ved hjelp av et poxvirus, fullstendig utenfor rammene til en levende celle. Denne konstruksjonen ble utført ved å bruke en isolert virusgenom-DNA som ble spaltet ved hjelp av en sekvensspesifikk endonuklease og så religert med fremmed-DNA. Den resulterende modifiserte DNA ble så pakket i infeksiøse poxvirusvirioner ved transfeksjon i en vertscelle infisert med et annet poxvirus som tjente som et hjelpervirus.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør diverse strategier for vektorutvikling fra eukaryote cytoplasmiske DNA-virus som er blitt applisert tidligere til andre DNA-virus for å løse forskjellige gentekniske problemer. F.eks. byr denne direkte kloningsfremgangsmåte på muligheten for å klone gener direkte i cytoplasmiske DNA-virus, slik som poxvirus, som ikke kan klones i bakterielle systemer, enten fordi de er for store for bakterielle vektorer eller er toksiske overfor bakterier eller er ustabile i bakterier. Direkte molekylær kloning muliggjør større presisjon over konstruksjon av kunstig fremstilte virusgenomer og kan under optimale betingelser øke kloningshastigheten samt gi mange forskjellige konstruksjoner i en enkelt ligeringsreaksjon som har multiple innføyelser i forskjellige orienteringer, noe som muliggjør hurtig screening med hensyn på arrangementer som gir optimal ekspresjon

av et fremmedgen.

Slik det er brukt i den foreliggende sammenheng omfatter "eukaryot cytoplasmisk DNA-virus" iridovirus og poxvirus. "Iridovirus" omfatter ethvert virus som er klassifisert som et medlem av familien Iridoviridae, eksemplifisert ved det afrikanske svinefebervirus samt visse amfibie- og insektvirus. "Poxvirus" omfatter ethvert medlem av familien Poxviridae, inkludert underfamiliene Chordopoxviridae (virveldyrpoxvirus) og Entomopoxviridae (insektpoxvirus). Se f.eks. B. Moss i B. N. FIELDS, D. M. KNIPE ET AL., VIROLOGY 2080 (Raven Press, 1990). Chordopoxvirusene omfatter blant annet de følgende slekter hvorfra bestemte eksempler er omtalt her, som angitt i parenteser: Orthopoxvirus (vaccinia); Avipoxvirus (fjærfekopper); Capripoxvirus (sauekopper); Leporipoxvirus (kanin-fibrom (Shope), myxom) og Suipoxvirus (svinekopper). Entomopoxvirusene omfatter tre slekter: A, B og C.

Ifølge ett aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus ved direkte molekylær kloning av et modifisert cytoplasmisk DNA-virusgenom. Denne fremgangsmåten omfatter et trinn hvor det under ekstracellulære forhold modifiseres et renset DNA-molekyl som omfatter et første cytoplasmisk DNA-virusgenom, for å fremstille et modifisert DNA-molekyl som omfatter et modifisert cytoplasmisk DNA-virusgenom.

Et renset DNA-molekyl egnet for modifikasjon ifølge foreliggende fremgangsmåte fremstilles f.eks. ved å isolere en genom-DNA fra viruspartikler i henhold til standardmetoder for isolering av genom-DNA fra eukaryote cytoplasmiske DNA-virus. Se f.eks. eksempel 1 nedenunder. Alternativt kan noe eller alt av det rensede DNA-molekyl fremstilles ved hjelp av molekylær kloning eller kjemisk syntese.

Modifikasjon av et renset DNA-molekyl som omfatter et virusgenom innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, omfatter fremstilling av enhver arvelig endring i DNA-sekvensen i det genomet. Slike endringer omfatter f.eks. innføyelse av en DNA-sekvens i det genomet, deletering av en DNA-sekvens fra det genomet eller utbytting av en DNA-sekvens i det genomet med en annen DNA-sekvens. DNA-sekvensen som innføyes, deleteres eller byttes ut, består av et enkelt DNA-basepar eller mer enn ett DNA-basepar.

I henhold til dette aspekt av oppfinnelsen utføres trinnet med å modifisere et DNA-molekyl som omfatter et første DNA-virusgenom, ved hvilken som helst teknikk som er egnet for ekstracellulær modifikasjon av sekvensen til et DNA-molekyl. F.eks. omfatter modifikasjon av et DNA-molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse å modifisere det rensede DNA-molekyl med et fysisk mutagen, slik som ultrafiolett lys, eller med et kjemisk mutagen. Et stort antall fremgangsmåter for ekstracellulær mutagenese av rensede DNA-molekyler er godt kjent innen genteknikkområdet.

Ved en annen utførelsesform omfatter trinnet med modifikasjon av DNA-molekylet sammenknytting av DNA-segmenter til det modifiserte DNA-molekyl som omfatter det modifiserte virusgenom. Ifølge ett aspekt av denne utførelsesformen fremstilles noen av eller alle DNA-segmentene knyttet sammen til det modifiserte DNA-molekyl ved spaltning av DNA-molekylet som omfatter det første virusgenom, med en nuklease, fortrinnsvis en sekvensspesifikk endonuklease. Alternativt kan noen av eller alle DNA-segmentene knyttet sammen til det modifiserte DNA-molekyl, fremstilles ved hjelp av kjemisk syntese under anvendelse av velkjente fremgangsmåter.

Ved noen utførelsesformer omfatter trinnet med å knytte sammen DNA-segmenter for å fremstille det modifiserte DNA-molekyl, et ekstracellulært trinn med å ligere disse DNA-segmentene sammen under anvendelse av en ligase, slik som en bakteriell eller bakteriofagligase, i henhold til godt kjente fremgangsmåter med rekombinant DNA. Eventuelt omfatter dette DNA-modifikasjonstrinnet også behandling av ender av DNA-segmenter avspaltet fra DNA-molekylet som omfatter det første virusgenom med en fosfatase, f.eks. kalvetynntarmfosfatase. Dette enzymet fjerner fosfatrester og forhindrer derved religering av ett DNA-segment fremstilt ved spaltning av DNA-molekylet med et annet slikt segment.

Ved en alternativ fremgangsmåte for sammenknytting av DNA-segmentene, knyttes noen av eller alle DNA-segmentene sammen ved hjelp av ekstracellulær annealering av kohesive ender som er tilstrekkelig lange til å muliggjøre transfeksjon av det modifiserte DNA-molekyl i en vertscelle hvor ligering av de annealerte DNA-segmenter inntrer.

Ved en annen utførelsesform av denne fremgangsmåten omfatter trinnet med å modifisere DNA-molekylet som omfatter det første virusgenom, et trinn med sammenknytting av minst noen DNA-segmenter som skriver seg fra spaltning av et genom-DNA-molekyl for det første virus, med et ytterligere DNA-segment, hvorved man får det modifiserte DNA-molekyl. Ved en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter dette trinnet spaltning av et genomvirus-DNA-molekyl med en sekvensspesifikk endonuklease i et unikt spaltningssete i det første virusgenom, hvorved det fremstilles to DNA-"armer" av genomvirus-DNA-en. De to armene ligeres så sammen med en fremmed-DNA som omfatter en sekvens av interesse.

En DNA-sekvens av interesse som her er brukt for å beskrive sekvensen til et fremmed-DNA-segment som ligeres med virus-DNA-armer, omfatter i første eksempel en DNA-sekvens som ikke naturlig forekommende i et genom til et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Alternativt omfatter en DNA-sekvens av interesse en sekvens bestående av en sekvens som er naturlig forekommende i et genom til et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, samt en sekvens som ikke er naturlig forekommende i et slikt genom. Dessuten kan en sekvens av interesse omfatte bare sekvenser som er naturlig forekommende i et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, hvor en slik sekvens er innføyd i et sted i genomet til det cytoplasmiske DNA-virus som er forskjellig fra stedet hvor den sekvensen naturlig forekommer. Innføyelse av en naturlig forekommende virussekvens av interesse fra ett DNA-virus i et annet, eller fra én del av et enkelt virusgenom i en annen del av det genomet, vil dessuten nødvendigvis skape en sekvens som er "ikke naturlig forekommende i genomet til et cytoplasmisk DNA-virus" i henhold til foreliggende oppfinnelse, i sammenknyttingspunktet til virusgenomet og den innføyde virussekvens av interesse.

Fremmed-DNA-segmentet som ligeres til de to armene av genomvirus-DNA, omfatter ender som er forenlige for ligering med endene til virus-DNA-armene. De forenlige endene kan være komplementært kohesive ender eller butte ender. Ligeringstrinnet i denne bestemte fremgangsmåte gir et modifisert DNA-molekyl som omfatter det første virusgenom med DNA-sekvensen til fremmed-DNA-en innføyd i det første virusgenom i det unike spaltningssetet.

Denne utførelsesformen av en fremgangsmåte hvor en DNA-sekvens innføyes i genomet til det første virus, er her eksemplifisert blant annet ved en fremgangsmåte for innføyelse av en genekspresjonskassett i et vacciniavirusgenom i et unikt spaltningssete for den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti eller Smal, som beskrevet i hhv. eksemplene 1 og 3. Denne utførelsesformen er også eksemplifisert ved innføyelse av en genkassett i genomet til en rekombinant fjærfekoppervirus vektor, i et unikt Notl-sete i sekvensen til et bakteriegen i det rekombinante fjærfekoppervirusgenom, som beskrevet i eksempel 2.

Innføyelse av en fremmed-DNA i et unikt sete i et eukaryot cytoplasmisk DNA-virusgenom ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for det formål å uttrykke et ønsket protein, særlig et humanprotein. F.eks. beskriver eksempel 5 innføyelse av gener for plasminogen, protrombin og humant immunsviktvirusglykoprotein 160 (HIV gpl60) i et unikt spaltningssete hos en vacciniavirusvektor og bruken av de resulterende modifiserte vacciniavirus for fremstilling av disse proteinene. Fremmedproteinene kan fremstilles i cellekulturer for fremstilling av rensede proteiner eller direkte i human- eller dyreverter, for immunisering av verten med en vaksine som omfatter et modifisert virus ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ved visse utførelsesformer omfatter trinnet med å modifisere et virusgenom ved innføyelse av en DNA-sekvens, innføring eller eliminering av en marlcørgenfunksjon for å skjelne mellom de modifiserte virusgenom og det første virusgenom. Ved én slik utførelsesform omfatter en DNA-sekvens innføyd i det første virusgenom et selektivt markørgen og trinnnet med å utvinne de infeksiøse,

modifiserte poxvirus virioner fremstilt ved hjelp av den første vertscelle omfatter et trinn med smitting av en andre vertscelle med de infeksiøse virioner under betingelser som selekterer med hensyn på et poxvirusgenom som uttrykker et selektivt markørgen. Ved en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen gir ekspresjon av det selektive markørgen i den andre vertscellen resistens hos den andre vertscellen mot et cytotoksisk legemiddel. Dette legemidlet er til stede under infeksjon av den andre vertscelle i en mengde som er tilstrekkelig til å selektere med hensyn på

et poxvirusgenom som uttrykker det selektive markørgen. I dette tilfellet selekterer legemidlet med hensyn på et modifisert virusgenom med det innføyde selektive markørgen, og selekterer mot ethvert genom som mangler det markørgenet.

Innføyelse av en DNA-sekvens som omfatter et selektivt markørgen for å skjelne det modifiserte virusgenom fra det første virusgenom, er særlig nyttig når et genom-DNA-molekyl i det første virus er blitt spaltet i et unikt spaltningssete og de resulterende virus-DNA-armer vil derfor sannsynligvis religere uten innføyelse av den ønskede DNA-sekvens. Denne fremgangsmåten er eksemplifisert ved en metode for innføyelse av et gen for enzymet xantin-guanin-fosforibosyl-transferase fra Escherichia coli (heretter "gpt"-genet) i blant annet et vacciniavirusgenom eller et fjærfekoppervirusgenom i et unikt Notl-sete, som beskrevet i hhv. eksemplene 1 og 2.

En fremgangsmåte for fjerning av en markørgenfunksjon fra det første virusgenom for å skjelne det modifiserte virusgenom fra det første genom, er eksemplifisert i eksempel 2. Denne fremgangsmåten vedrører innføyelse av en fremmed-DNA-sekvens i et fjærfekoppervirusgenom i et Notl-sete som befinner seg i et E. cø/7-lacZ-gen som koder for 6-galaktosidase. Som beskrevet i eksempel 2 (avipox), avbryter innføyelse av en DNA-sekvens i dette setet den lacZ-kodende sekvens og forhindrer derved fremstilling av fi-galaktosidase. Ekspresjon av dette enzymet gir en "blåplakk"-fenotype for et virus som bærer lacZ-genet. Et modifisert virusgenom som bærer en innføyelse av en DNA-sekvens i dette setet, oppviser følgelig en hvitplakk-fenotype som skiller det modifiserte virus fra det første virus.

Ved andre utførelsesformer av fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen overføres et E. cø//-lacZ-gen som virker, i vektoren med et annet gen av interesse for å tjene som en markør for modifiserte virus som inneholder den ønskede innføyelse.

Ved ytterligere andre utførelsesformer av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter trinnet med å modifisere et DNA-molekyl innføring av et nytt spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease i det første virusgenom. Ett eksempel på denne utførelsesformen omfatter å innføye i et eksisterende unikt sete i et første poxvirusgenom, en fremmed-DNA bestående av en syntetisk DNA-"linker", som beskrevet i eksempel 6. Denne linkeren omfatter et "multippelkloningssete" bestående av flere nært tilgrensende spaltningsseter som kan anvendes for innføyelse av fremmed-DNA i det modifiserte poxvirusgenom. Spaltningssetene i multippelkloningssetet er med fordel ikke til stede i det første virusgenom og er derfor unike i det modifiserte virusgenom.

Nærmere bestemt inkluderer trinnet med å modifisere et DNA-molekyl som omfatter et første virusgenom, også innføyelse av en DNA-sekvens mellom et første og et andre spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease. Ved én slik utførelsesform omfatter det første virusgenom et multippelkloningssete bestående av spaltningsseter som er unike i det første virusgenom. Ifølge denne fremgangsmåten gir spaltning av et DNA-molekyl som omfatter et første virusgenom i to slike unike seter i multippelkloningssetet, to virus-DNA-armer med kohesive ender som ikke er forenlige for ligering med hverandre. Det mellomliggende DNA-segment mellom de to unike spaltningssetene i multippelkloningssetet, fjernes fra de spaltede virus-DNA-armer, f.eks. ved hjelp av etanolutfelling av disse armene, som beskrevet for innføyelse av et humanprotrombingen i en modifisert poxvirusvektor i eksempel 5.

Innføyelse av et DNA-segment i et virusgenom mellom to unike spaltningsseter kan anvendes for "fremtvunget" kloning av DNA-innføyeiser med kohesive ender som er forenlige for ligering med hver av vektorarmene. Med andre ord kan denne fremgangsmåten som omfatter spaltning av virus-DNA i to seter, anvendes for å øke utbyttet av virusgenomer som skriver seg fra ligering av virus-DNA-armer, sammenlignet med armer fremstilt ved spaltning av virus-DNA i et enkelt sete ettersom armene ved denne fremgangsmåte ikke har ender som er forenlige for ligering. Denne fremgangsmåte med fremtvunget kloning styrer også orientering av den innføyde DNA i det modifiserte virusgenom ettersom bare én virus-DNA-arm er forenlig for ligering til hver ende av det innføyde DNA.

Fremgangsmåten med fremtvunget kloning demonstreres f.eks. ved innføyelse av en genekspresjonskassett bestående av et humanprotrombingen i et multippelkloningssete i en vacciniavirusvektor, som beskrevet i eksempel 5.

Ved en foretrukket utførelsesform er det mellomliggende DNA-segment mellom to unike spaltningsseter i det første virusgenom ikke vesentlig for replikasjon av det første virusgenom, og hverken deletering av denne sekvensen eller erstatning av den med et annet DNA-segment forhindrer derfor replikasjon av det resulterende modifiserte genom. Alternativt erstattes det mellomliggende DNA-segment med et DNA-segment som omfatter den delen av den mellomliggende sekvens som er vesentlig for virusreplikasjon, bundet til en ytterligere DNA-sekvens som skal

innføyes i det første virusgenom.

Ved et annet aspekt av foreliggende fremgangsmåte omfatter trinnet med å modifisere det første virusgenom fjerning av et uønsket spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease. Modifikasjoner av denne type kan om nødvendig gjøres gjentatte ganger, f.eks. for å deletere overflødige spaltningsseter for den samme nuklease for derved til sist å fremstille et modifisert virusgenom med et unikt spaltningssete for en bestemt nuklease.

Fremgangsmåter som er særlig egnede for fjerning av et spaltningssete fra et virusgenom, er kjent innen teknikken. Disse omfatter forskjellige generelle

setespesifikke mutagenesefremgangsmåter. Én bestemt fremgangsmåte for fjerning av et endonuWeasespaltoingssete fira et virusgenom omfatter ekstracellulær behandling av genomvirus-DNA for å selektere med hensyn på mutante genom-DNA-molekyler som er resistente overfor spaltning ved hjelp av den aktuelle endonuklease.

En annen fremgangsmåte for fjerning av et spaltningssete fra et virusgenom er ved ligering av et spaltet virus-DNA-molekyl med et DNA-segment, f.eks. et syntetisk DNA-segment, som omfatter en ende som er forenlig for ligering med den spaltede virus-DNA, men som mangler en del av gjenkjennelsessekvensen for nukleasen som spaltet virus-DNA-en. Ved denne fremgangsmåten omfatter spaltningssetet for den sekvensspesifikke endonuklease som spalter virus-DNA-en, en nukleasegjenkjennelsessekvens som strekker seg ut over sekvensene som er omfattet i de kohesive endene, inn i sekvensene umiddelbart ved siden av de kohesive ender. Den syntetiske innføyelse omfatter kohesive ender som er forenlige for ligering med virus-DNA-armene spaltet i et enkelt sete. Sekvensen umiddelbart ved siden av én kohesiv ende i den syntetiske innføyelse atskiller seg imidlertid fra gjenkjennelsessekvensen som er påkrevd for spaltning, ved enzymet som spaltet virus-DNA-en. Ligering i denne enden av det syntetiske DNA-segment med en virusarm rekonstruerer derfor ikke et funksjonelt spaltningssete for nukleasen som spaltet virus-DNA-en. Denne fremgangsmåten for fjerning av et spaltningssete fra et virusgenom er eksemplifisert i eksempel 4 ved innføyelse av et syntetisk DNA-segment som omfatter et multippelkloningssete, i et unikt spaltningssete fra et virusgenom.

For å forhindre inaktivering av et virusgenom som et resultat av modifikasjon, er det åpenbart at modifikasjonen av et virusgenom ifølge foreliggende fremgangsmåte må gjøres i et område i virusgenomet som ikke er vesentlig for virusformering i cellekultur under de anvendte betingelser for propagering av det resulterende, modifiserte virus. DNA-virusgenomområder som omfatter sekvenser som er ikke-essensielle for formering i cellekultur og ellers egnet for modifikasjon ifølge de foreliggende fremgangsmåter, omfatter sekvenser mellom gener (dvs. intergenområder) og sekvenser i gener som ikke er påkrevd for formering av det

modifiserte virusgenom.

Et ikke-essensielt sete egnet for å modifisere et utvalgt genom fra et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus ifølge foreliggende oppfinnelse, kan identifiseres ved å lage en ønsket modifikasjon og bestemme hvorvidt denne modifikasjonen virker inn på replikasjon av genomet under de ønskede infeksjonsbetingelser. Nærmere bestemt er det blitt identifisert restriksjonsenzymspaltningsseter i et virusgenom, inkludert unike seter i genomet, f.eks. ved fordøyelse av genom-DNA og analyse av de resulterende fragmenter under anvendelse av fremgangsmåter som er godt kjent innen teknikken. Genomet kan avbrytes ved hjelp av forsøksinnføyelse av et kort syntetisk DNA-segment i et utvalgt målspaltningssete ved hjelp av en direkte kloningsfremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Utvinning av et virus bestående av forsøksinnføyeisen i det utvalgte målsetet gir en direkte indikasjon om at målsetet er i et ikke-essensielt område i det genomet. Dersom det ikke foreligger noe anvendbart spaltningssete i et bestemt genommålsted, kan et slikt sete alternativt innføres ved å bruke enten direkte molekylær kloning eller konvensjonell genomkonstruksjon basert på markørredningsteknikker. I dette tilfellet indikerer vellykket utvinning av et virus bestående av det innføyde spaltningssete i målstedet, direkte at målstedet er i et ikke-essensielt område egnet for modifikasjon i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Visse ikke-essensielle genomområder egnet for praktisering av foreliggende oppfinnelse med poxvirus, er blitt beskrevet. Se f.eks. Goebel et al., Virology 179: 247-266 (1990), tabell 1.

Ved ytterligere utførelsesformer av fremgangsmåten er i det minste en del av DNA-sekvensen som er innføyd i det første virusgenom, under transkripsjonskontroll av en promoter. Ved visse utførelsesformer befinner denne promoteren seg i DNA-sekvensen som er innføyd i det første virusgenom, og regulerer derfor transkripsjon av den delen av den innføyde DNA-sekvens som befinner seg nedstrøms fra promoteren. Denne fremgangsmåten er eksemplifisert ved innføyelse i et poxvirusgenom av en genkassett som omfatter en promoter funksjonelt bundet til en åpen leseramme, som beskrevet i eksemplene 1-5.

Ved en annen foretrukket utførelsesform befinner promoteren som regulerer transkripsjon av DNA-sekvensen som er innføyd i det første virusgenom, seg i det modifiserte virusgenom oppstrøms fra den innføyde DNA-sekvens. Denne fremgangsmåten er illustrert ved innføyelse av en cDNA som koder for det humane von Willebrand-faktorprotein, i et multippelkloningssete som er funksjonelt bundet til en oppstrømspromoter i en vacciniavirusvektor, som beskrevet i eksempel 6.

Ved visse utførelsesformer gjenkjennes promoteren som regulerer den innføyde DNA-sekvens, ved hjelp av en RNA-polymerase som er kodet for av det modifiserte virusgenom. Denne promoteren vil alternativt kunne gjenkjennes bare av en RNA-polymerase som kodes for av et annet genom, f.eks. et annet viralt eller cellulært genom. Denne RNA-polymerase vil f.eks. kunne være en bakteriofag-T7-polymerase som kodes for av et annet cytoplasmisk DNA-virusgenom eller av genomet til en modifisert vertscelle. T7-polymerasen og promoteren er f.eks. blitt brukt i rekombinante poxvirus for å fremme ekspresjon av en innføyd DNA-sekvens. Se f.eks. Fuerst, T. R. et al., J. Mol. Biol. 205:333-348 (1989). Tilveiebringelse av T7-RNA-polymerasen på et separat genom brukes til å forhindre ekspresjon av en DNA-sekvens innføyd i det modifiserte poxvirusgenom, bortsett fra når det separate genom er til stede.

Ved ytterligere andre utførelsesformer er promoteren som regulerer innføyelsen, egnet for transkripsjonsinitiering med en cytoplasmisk DNA-virus-RNA-polymerase. Ved noen utførelsesformer omfatter promoteren en modifikasjon av en DNA-sekvens fra en naturlig forekommende viruspromoter. En slik utførelsesform er eksemplifisert ved bruken av en "syntetisk" vacciniaviruspromoter, slik som "S3A"-og "S4"-promoterne beskrevet blant annet i eksemplene 5 og 6.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for eukaryot cytoplasmisk DNA-virusgenomkonstruksjon omfatter videre et trinn med å innføre det modifiserte DNA-molekyl som omfatter det modifiserte virusgenom, i en første vertscelle som pakker inn det modifiserte DNA-molekyl i infeksiøse, modifiserte cytoplasmiske DNA-virusvirioner. Det modifiserte DNA-molekyl innføres i den første vertscelle ved hjelp av en fremgangsmåte egnet for transfeksjon av den første vertscellen med et DNA-molekyl, f.eks. ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent innen teknikken for transfeksjon av andre DNA-er i forenlige vertsceller. Ved en foretrukket utførelsesform innføres f.eks. den modifiserte DNA i den første vertscellen ved å bruke kalsiumfosfatutfellingsteknikken til Graham og van der Eb, Virology 52: 456-467 (1973).

Ved en foretrukket utførelsesform omfatter denne fremgangsmåten for fremstilling av et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, videre et trinn med infeksjon av den første vertscellen med et andre cytoplasmisk DNA-virus som omfatter et andre cytoplasmisk DNA-virusgenom som uttrykkes til innpakking av det modifiserte DNA-molekyl i infeksiøse modifiserte cytoplasmiske DNA-virusvirioner. Ved fremgangsmåten som omfatter infeksjon av den første vertscellen med et andre virus, utføres innføring av det rekombinante DNA-molekyl i den første vertscelle med fordel ca. én time etter infeksjon av den første vertscelle med det andre virus.

Ved en annen utførelsesform av denne fremgangsmåten tilføres de nødvendige irmpakldngsfunksjoner i den første vertscelle ved hjelp av et annet genetisk element enn et komplett genom i et andre virus, slik som et plasmid eller en annen ekspresjonsvektor egnet for å transformere den første vertscellen og uttrykke de påkrevde hjelpervimsfunksjoner. Bruk av et ikke-viralt genetisk element for å tilveiebringe hjelperfunksjoner, muliggjør fremstilling av genetisk stabile hjelperceller som ikke produserer infeksiøst hjelpervirus. Bruk av en slik hjelpercelle som en første vertscelle for innpakking av et modifisert DNA-molekyl, gir på fordelaktig måte bare virioner bestående av den modifiserte DNA.

Ved fremgangsmåten som omfatter infeksjon av den første vertscelle med et andre virus, velges det andre virus slik at ekspresjon av det andre virusgenom i den første vertscelle innpakker det modifiserte DNA-molekyl i infeksiøse virioner bestående av det modifiserte virusgenom. I henhold til foreliggende oppfinnelse er det gunstig å bevirke intracellulær innpakking av en modifisert DNA som omfatter et eukaryot cytoplasmisk DNA-virusgenom ved transfeksjon i celler infisert med et nært beslektet virus. DNA fra en første poxvirusslekt pakkes f.eks. ved hjelp av en vertscelle infisert med et andre poxvirus fra den samme poxvirusunderfamilie, enten fra den samme eller en annen slekt.

Ved visse utførelsesformer gir ekspresjon av det andre virusgenom i den første vertscelle infeksiøse virioner bestående av det andre virusgenom samt det modifiserte virusgenom. Denne situasjonen oppstår f.eks. i tilfellet med homolog innpakking av en første poxvirus-DNA fra én slekt ved hjelp av et andre poxvirus fra den samme slekt. Selv om den transfiserte DNA teoretisk kunne pakkes direkte, dvs. uten transkripsjon av det transfiserte genom, involverer her homolog innpakking av det transfiserte DNA-molekyl sannsynligvis transkripsjon og replikasjon av både den transfiserte DNA og DNA fra hjelperviruset. Denne situasjonen er blant annet illustrert med homolog innpakking av poxvirus-DNA i eksemplene 1 og 2.

Ved andre utførelsesformer gir imidlertid ekspresjon av det andre virusgenom i den første vertscellen ikke infeksiøse virioner bestående av det andre virusgenom. I tilfeller som omfatter heterolog innpakking, kan f.eks. passiv innpakking alene ikke gi levedyktige viruspartikler fra den transfiserte DNA. I et slikt tilfelle er det fordelaktig å velge et andre (hjelper-)virus som tilveiebringer en RNA-polymerase som gjenkjenner den transfiserte DNA som et templat, og derved tjener til å initiere transkripsjon og til sist replikasjon av den transfiserte DNA. Dette tilfellet er eksemplifisert ved reaktiveringen av et modifisert genom fra en ortopoxvirusvektor (vaccinia) ved hjelp av et avipoxhjelpervirus (fjærfekopper) i en første pattedyrvertscelle, hvor avipoxviruset ikke er i stand til å produsere infeksiøse virioner bestående av avipoxvirusgenomet, som beskrevet i eksempel 3.

Bruken av et heterologt virus til å pakke inn det modifiserte DNA-molekyl, slik som bruken av fjærfekopper- eller ectromelia(musekopper)-virus som en hjelper for vacciniaviruskonstruksjoner, minimaliserer på fordelaktig måte rekombinasjonshendelser mellom hjelpervirusgenomet og det transfiserte genom som finner sted når homologe sekvenser fra nært beslektede virus er til stede i én celle. Se Fenner & Comben (1958); Fenner (1959).

Ved visse utførelsesformer av fremgangsmåten for å anvende et hjelpervirus for DNA-innpakking, omfatter trinnet med utvinning av de infeksiøse virioner bestående av det modifiserte virusgenom, et trinn med infeksjon av en andre vertscelle med infeksiøse virioner fremstilt ved hjelp av den første vertscelle. Den andre vertscellen infiseres fortrinnsvis under slike betingelser at ekspresjon av det andre virusgenom i den andre vertscelle ikke gir infeksiøse virioner bestående av det andre virusgenom. Med andre ord infiseres den andre vertscelle under betingelser som selekterer med hensyn på replikasjon av det modifiserte virus og mot hjelperviruset. Denne fremgangsmåten er eksemplifisert ved hjelp av en metode hvor det modifiserte genom er et modifiserte vacciniavirusgenom, det andre genom er et fjærfekoppervirusgenom og den andre vertscellen er en pattedyrcelle. Ved denne fremgangsmåten plakkrenses det modifiserte virus i kulturer av pattedyrvertscellen hvor fjærfekoppervirus ikke gir infeksiøse virioner, som beskrevet i eksempel 3.

I en annen utførelsesform hvor den andre vertscellen infiseres under betingelser som selekterer med hensyn på det modifiserte virus, omfatter det modifiserte virusgenom et funksjonelt vertsområdegen påkrevd for å produsere infeksiøse virioner i den andre vertscellen. Det andre virusgenom mangler dette funksjonelle vertsområdegen. Denne utførelsesformen er illustrert ved hjelp av en fremgangsmåte hvor det modifiserte virusgenom er et modifisert vacciniavirusgenom bestående av et funksjonelt vertsområdegen påkrevd for å produsere infeksiøst vacciniavirus i en humancelle (MRC 5) som brukes som den andre vertscelle, slik som beskrevet i eksempel 8.

Ved nok en annen utførelsesform som omfatter seleksjon med hensyn på modifisert virus i en andre vertscelle, omfatter det modifiserte virusgenom et gen for en selektiv markør som det andre virusgenom mangler, og trinnet med å infisere den andre vertscellen utføres under betingelser som selekterer med hensyn på et virusgenom som uttrykker genet for den selektive markør. Ekspresjon av det selektive markørgen i den andre vertscellen, kan f.eks. gi cellen resistens overfor et cytotoksisk legemiddel. Legemidlet tilveiebringes under infeksjon av den andre vertscellen ved et nivå som er tilstrekkelig til å selektere med hensyn på et virusgenom som uttrykker genet for den selektive markør. Denne fremgangsmåten er eksemplifisert ved hjelp av en metode for innføyelse av et gen for E. cø/z-gpt-genet i et vacciniavirusgenom, som i eksempel 1, eller et fjærfekoppervirusgenom, som i eksempel 2, under anvendelse i hvert tilfelle av et homologt hjelpervirus som mangler genet for den selektive markør. Ved nok en annen utførelsesform som omfatter seleksjon med hensyn på et modifisert virus i en andre vertscelle, omfatter det modifiserte virusgenom en delesjon av et gen for en selektiv markør som er til stede i det andre virusgenom. Her utføres trinnet med å infisere den andre vertscellen under betingelser som selekterer mot et virusgenom som uttrykker genet for den selektive markør. Ekspresjon av et poxvirustymidinkinasegen (tk) i den andre vertscellen (dvs. en tymidin-kinasenegativ vertscelle) gjør det andre (hjelper-)viruset følsomt for den metabolske inhibitor, 5-bromdeoksyuridin. I eksempel 4 beskrives bruken av disse inhibitorene under infeksjon av en andre vertscelle for å selektere med hensyn på en vacciniavirusvektor (vdTK) hvor tk-genet er deletert og erstattet med et multippelkloningssete.

Et annet aspekt vedrører et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus bestående

av et modifisert virusgenom. Et modifisert genom av et cytoplasmisk DNA-virus innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelsen omfatter atskilte komponent-DNA-sekvenser som lar seg skjelne fra hverandre f.eks. ved hjelp av rutinemessig nukleinsyrehybridisering eller DNA-sekvenseirngsmetoder.

Ved visse utførelsesformer omfatter f.eks. det modifiserte virusgenom et første genom fra et første eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Dette første genomet består av et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease som er et unikt sete i det første genom. Ved denne utførelsesformen er sekvensene til det modifiserte genom som omfatter det første virusgenom, homologe med et genom til et naturlig forekommende, eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Sekvensene til dette første viruset er videre avbrutt av en DNA-sekvens av interesse, som definert ovenfor.

For å bestemme hvorvidt denne sekvensen innføyes i et unikt

spaltningssete i det første virusgenom, slik som påkrevd for denne utførelsesform av et modifisert virusgenom, sammenlignes sekvensene som umiddelbart flankerer innføyelsen, med sekvenser i spaltningsseter for sekvensspesifikke endonukleaser.

Ved én form av denne utførelsesform hvor en DNA-sekvens innføyes i et unikt spaltningssete i det første virusgenom, flankeres den innføyde sekvens i det første virusgenom ved hjelp av to identiske, intakte spaltningsseter for en sekvensspesifikk endonuklease, og disse to setene er de eneste setene for denne nukleasen i det fullstendig modifiserte genom. Hvert av disse to setene består av kombinerte deler av spaltede seter fra det første virusgenom og den innføyde DNA-sekvens.

Nærmere bestemt kan hver tråd av en dobbelttrådet DNA bestående av et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease betraktes som omfattende en komplett spaltningssetesekvens (SLSR) bestående av en venstre spaltningssetesekvens (SL) og en høyre spaltningssetesekvens (SR) atskilt med monofosfatbindingen som brytes ved spaltning med den passende nuklease. Ved visse former av denne utførelsesformen reproduserer innføyelse av en DNA-sekvens i et unikt

restriksjonssete, to komplette seter som flankerer innføyelsen.

Ved andre former av denne utførelsesformen gjenskaper imidlertid innføyelse av DNA-sekvensen i et unikt spaltningssete, ikke det opprinnelige spaltningssete i hver ende av den innføyde DNA-sekvens. Se f.eks. fremgangsmåten for fjerning av et spaltningssete beskrevet i eksempel 6. Den innføyde DNA kan således flankeres i én ende (f.eks. den venstre ende) av et komplett spaltningssete (SLSR), mens den høyre ende avsluttes i en sekvens som atskiller seg fra SL, direkte bundet til en SR-sekvens i det første virusgenom. Mer generelt sagt vil i ethvert modifisert virusgenom ifølge oppfinnelsen, DNA-sekvensen innføyd i et unikt sete i et første virusgenom, være flankert av to deler som passer til hverandre (SL og Sr) i et spaltet sete som ikke oppstår i det modifiserte virusgenom utenfor den innføyde DNA.

Ved andre utførelsesformer består det modifiserte virusgenom av en DNA-sekvens som er innføyd mellom to unike seter i det første virusgenom. I dette tilfellet vil, dersom det første virusgenom er et naturlig forekommende genom i et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, innføyelsen være omfattet av virussekvenser åtskilt fra fremmed-DNA-sekvensen i det minste ved gjenkjennbare SL- og SR-deler i de to forskjellige, opprinnelige spaltningsseter.

Ved ytterligere utførelsesformer omfatter det modifiserte virusgenom et unikt spaltningssete beliggende i en DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et genom i et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. I dette tilfellet er denne fremmed-DNA ikke atskilt fra de naturlige virus-DNA-sekvenser ved gjenkjennbare SL-og SR-deler i spaltningsseter. Ved visse former av denne utførelsesformen er den første fremmed-DNA-sekvens avbrutt av en andre fremmed-DNA-sekvens innføyd i et unikt spaltningssete i den første sekvens eller mellom to slike seter i den første sekvens. Ved disse utførelsesformene er den andre fremmed-DNA atskilt fra de første fremmed-DNA-sekvenser ved gjenkjennbare SL- og SR-deler i sekvensspesifikke endonukleasespaltningsseter. I dette tilfellet omfatter alle sekvenser som omgir denne andre fremmed-DNA-sekvens, genomet i det første virus.

Foretrukne utførelsesformer av modifiserte eukaryote cytoplasmiske DNA-virus omfatter en første hovedutførelsesform hvor det modifiserte virusgenom omfatter (I) et første genom fra et første eukaryot cytoplasmisk DNA-virus som består av et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease. Dette setet er et unikt sete i det første virusgenom. Det modifiserte virusgenom ifølge denne utførelsesformen omfatter også (II) en første DNA-sekvens av interesse. Denne DNA-sekvens er innføyd i det unike sete i det første cytoplasmiske DNA-virusgenom.

Ved én variasjon av denne første utførelsesform av et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, er det første virusgenom bestående av det unike setet, et naturlig forekommende virusgenom. Denne variasjonen er eksemplifisert her ved hjelp av et modifisert poxvirusgenom bestående av et naturlig forekommende vacciniavirusgenom som har unike spaltningsseter for de bakterielle restriksjonsendonukleasene Noti og Smal, som beskrevet i eksemplene 1 og 3. Ved denne utførelsesformen er den første DNA-sekvens av interesse som innføyes i det unike sete, eksemplifisert ved et E. cø//-gpt-gen drevet av en naturlig forekommende vacciniaviruspromoter innføyd i Notl-setet (eksempel 1) eller i Smal-setet (eksempel 3) i et vacciniavirusgenom.

Ved en andre form av denne første utførelsesform av et modifisert virus omfatter det første virusgenom bestående av det unike sete, også en andre DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et virusgenom. Dessuten omfatter denne andre DNA-sekvens det unike sete for innføyelse av den første DNA-sekvens. Denne variasjonen er her eksemplifisert ved hjelp av et modifisert fjærfekoppervirusgenom som omfatter en DNA-sekvens som koder for et Escherichia coli 8-galaktosidasegen, som beskrevet i eksempel 2. Dette bakteriegen omfatter et spaltningssete for den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti som er unikt i det modifiserte fjærfekoppervirusgenom og som derfor er særlig bekvemt for innføyelse av fremmed-DNA-sekvenser.

Ved en annen variasjon av denne første utførelsesformen av et modifisert virus, er i det minste en del av den første DNA-sekvens som er innføyd i det unike sete, under transkripsjonskontroll av en promoter. I noen tilfeller befinner promoteren seg i den første DNA-sekvens som innføyes i det første virusgenom. Dette gjelder f.eks. når den innføyde DNA omfatter en genkassett som omfatter en promoter og et funksjonelt bundet gen, som beskrevet blant annet i eksemplene 1 og 2.

Ved en andre utførelsesform av et modifisert cytoplasmisk DNA-virus, omfatter det modifiserte virusgenom (I) et første virusgenom bestående av et første og et andre spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease hvor hver av disse setene er unike i det første virusgenom. Ved én foretrukket variasjon av denne utførelses-formen omfatter det første virusgenom et multippelkloningssete bestående av flere unike spaltningsseter.

Ved denne andre utførelsesformen omfatter det modifiserte virusgenom også (II) en første DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et genom i et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, og denne første DNA-sekvens er innføyd i det første virusgenom mellom det første og det andre unike spaltningssete.

Ved en tredje utførelsesform av et modifisert cytoplasmisk DNA-virus omfatter det modifiserte virusgenom (I) et første virusgenom bestående av en første DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et genom i et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Denne første DNA-sekvensen består av et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease som er et unikt sete i det modifiserte virusgenom. Det modifiserte virusgenom ifølge denne utførelsesformen omfatter videre (II) en promoter lokalisert slik at en DNA-sekvens innføyd i det unike sete er under transkripsjonskontroll av promoteren. Denne første DNA-sekvens har ikke et translasjonsstartkodon mellom promoteren og det unike sete som brukes for innføyelse av en DNA-sekvens. Denne utførelsesformen er eksemplifisert ved vacciniavirusvektoren (vS4) beskrevet i eksempel 6, som har en "syntetisk" poxviruspromoter lokalisert slik at denne promoteren regulerer transkripsjon av en DNA-sekvens innføyd i et multippelkloningssete utformet for innføyelse av en åpen leseramme.

Et annet aspekt vedrører et DNA-molekyl som omfatter et modifisert virusgenom fra et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Ved en foretrukket utførelsesform fremstilles dette DNA-molekylet ved ekstraksjon av genom-DNA-molekyler fra virioner av et modifisert eukaryot cytoplasmisk DNA-virus eller fra celler infisert med et modifisert virus. Metoder egnet for å ekstrahere modifiserte virusgenom-DNA-er fra virioner er kjent innen teknikken. I tillegg er egnede metoder for fremstilling av DNA til eukaryote cytoplasmiske DNA-virus beskrevet her i eksempel 1.

Nok et annet aspekt vedrører genom-DNA-armer til et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Disse genom-DNA-armene kan anvendes for direkte molekylær kloning av virusgenomer omfattende fremmed-DNA-er. Nærmere bestemt vedrører dette aspektet av oppfinnelsen to DNA-molekyler, de venstre og de høyre genomarmene til et modifisert virusgenom fra et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Ved utøvelsen av den direkte kloningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen beskrevet ovenfor, kan enten én av eller begge disse armene bestå fullstendig av en DNA-sekvens som er naturlig forekommende i et cytoplasmisk DNA-virus. Men det nye DNA-molekylet ifølge det foreliggende aspekt av oppfinnelsen er en modifisert arm fra et virusgenom, med andre ord et DNA-molekyl som omfatter én ende av et modifisert virusgenom fra et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Denne enden av det modifiserte virusgenom omfatter en DNA-sekvens av interesse som atskiller dette DNA-molekylet fra genomarmer bestående av bare en sekvens som er naturlig forekommende i et cytoplasmisk DNA-virus. I tillegg består det modifiserte virusgenom hvorfra den nye armen skriver seg, av et unikt spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease. Dette DNA-molekylet har dessuten en ende som er homolog til et produkt fra spaltning av det unike sete i det modifiserte virusgenom med den sekvensspesifikke endonuklease.

Ved en foretrukket utførelsesform fremstilles dette DNA-molekylet som omfatter en genomarm, ved spaltning av genom-DNA fra et modifisert virus i et unikt sete for en sekvensspesifikk endonuklease. Dette DNA-molekylet kan alternativt fremstilles ved å modifisere et annet DNA-molekyl, hvorved det fremstilles en ende som er homolog til en ende fremstilt ved å spalte et unikt sete i et modifisert virusgenom. F.eks. kan et DNA-molekyl ifølge dette aspektet av oppfinnelsen fremstilles fra en arm av en naturlig forekommende virusgenom-DNA. Det påkrevde DNA-molekyl kan fremstilles fra en slik naturlig forekommende virusarm, f.eks. ved ligering til et syntetisk "adaptor"-DNA-segment bestående av en kohesiv ende avledet fra spaltningssete som ikke er til stede i det første virusgenom. I dette eksemplet omfatter enden av det første virusgenom og den ligerte adaptor sammen én ende av et modifisert virusgenom. Dette bestemte DNA-molekyl framstilles følgelig ikke ved spaltning av en modifisert virusgenom-DNA, men det omfatter en ende som er homolog til en ende som fremstilles ved å spalte et unikt sete i et modifisert virusgenom.

Ved en annen utførelsesform av en modifisert virus-DNA-arm består DNA-sekvensen som ikke er naturlig forekommende i et genom fra et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus, av spaltningssetet for en sekvensspesifikk endonuklease som er unik i det modifiserte virusgenom. Dette spaltningssetet omfatter videre en venstre spaltningssetesekvens (SL) for den venstre genomarm eller den høyre spaltningssetesekvens (SR) for den høyre genom-DNA-arm, i det fullstendig spaltningssetesekvens (SlSr) som opptrer, er unik i det modifiserte virusgenom. Denne utførelsesformen er eksemplifisert blant annet med DNA-armer fremstilt fra en fjærfevirusvektor ved hjelp av den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti, som beskrevet i eksempel 2, eller ved armer av en vacciniavirusvektor (vS4) spaltet i hvilken som helst av flere unike seter i et innføyd multippelkloningssete, som beskrevet i eksempel 6.

Nok et annet aspekt vedrører et sett for direkte molekylær kloning av et modifisert virusgenom fra et eukaryot cytoplasmisk DNA-virus. Dette settet omfatter (I) rensede DNA-molekyler ifølge oppfinnelsen. Disse DNA-molekylene omfatter enten virusgenom-DNA-armer ifølge oppfinnelsen eller et fullstendig, intakt modifisert virusgenom ifølge oppfinnelsen eller begge to. Virus-DNA-armene kan anvendes for direkte ligering til fremmed-DNA-segmenter som skal klones, mens de intakte virus-DNA-er kan anvendes for kloning etter spaltning, f.eks. med en sekvensspesifikk endonuklease i et sete som er unikt i det modifiserte virusgenom.

Settet omfatter videre (II) en DNA-ligase og (III) oppløsninger av en buffer og andre reagenser egnet for ligering av DNA-segmenter sammen for å fremstille et modifisert DNA-molekyl som omfatter det modifiserte virusgenom. En egnet buffer og egnede reagenser for ligering er beskrevet f.eks. i eksempel 1.

Ved én utførelsesform omfatter dette settet videre et plasmid bestående av en genekspresjonskassett flankert av seter for spaltning med en sekvensspesifikk endonuklease. Når det er spaltet ved hjelp av den passende sekvensspesifikke endonuklease, gir setene som flankerer kassetten ender som er forenlige for innføyelse av denne kassetten i et unikt spaltningssete i det modifiserte virusgenom som kodes for av DNA-molekylet.

Ved en annen utførelsesform omfatter kloningssettet videre en første vertscelle og et andre (hjelper-)virus egnet for innpakking av det modifiserte virusgenom i infeksiøse virioner.

Nok et annet aspekt vedrører plasmider som er særlig egnet til å tjene som mellomprodukter ved konstruksjonen av modifiserte cytoplasmiske DNA-virusvektorer. Ifølge én utførelsesform av dette aspektet er det tilveiebrakt et plasmid som omfatter et DNA-segment som i hver ende har det samme spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease. Dette setet er også et unikt sete i et første cytoplasmisk DNA-virusgenom. Dette DNA-segmentet omfatter et multippelkloningssete bestående av flere nært tilgrensende sekvensspesifikke endonukleasespaltningsseter som er unike i plasmidet, og som derfor kan anvendes for innføyelse av fremmede DNA-segmenter i plasmidet.

Dette plasmidet kan anvendes for innføyelse av gener i et unikt spaltningssete i DNA-segmentet for påfølgende overføring av segmentet til et unikt spaltningssete i et cytoplasmisk DNA-virus under anvendelse av den direkte fremgangsmåte for molekylær kloning ifølge oppfinnelsen. Dette plasmidet er eksemplifisert ved plasmidet pN2 (se eksempel 1, figur 1.3) som har et DNA-segment som omfatter et multippelkloningssete flankert av Notl-seter og som inneholder de følgende ytterligere bakterielle restriksjonsenzymspaltningsseter i den angitte rekkefølge: Xbal, Spel, BamHI, Smal, Pstl, EcoRI, EcoRV, Hindlll og Clal.

Et annet plasmid omfatter et DNA-segment som i hver ende har et spaltningssete som er et unikt sete i et cytoplasmisk DNA-virus. DNA-segmentet i dette plasmidet omfatter også flere restriksjonsenzymspaltningsseter som er unike i plasmidet. Dette DNA-segmentet omfatter videre et selektivt markørgen (f.eks. et E. cø/7-gpt-gen) under transkripsjonskontroll av en cytoplasmisk DNA-viruspromoter (f.eks. P7.5-promoteren fra vacciniavirus). Dette plasmidet er eksemplifisert ved to plasmider betegnet pN2-gpta og pN2-gptb som inneholder et DNA-segment flankert av Notl-seter og som omfatter et E, cø/z-gpt-gen under transkripsjonskontroll av en P7.5-promoter fra vacciniavirus. Dette plasmidet ble skapt ved innføyelse av promotergenkassetten i Smal-setet i plasmidet pN2, som beskrevet i figur 1.3.

Ved en ytterligere modifikasjon av det ovenfor nevnte plasmid omfatter DNA-segmentet videre en andre poxviruspromoter operativt bundet til en DNA-sekvens som omfatter et restriksjonsendonukleasespaltningssete. Dette plasmidet, som eksemplifisert ved plasmidet pN2gpt-S3 A (figur 4.7), kan anvendes til å innføye åpne leserammer som mangler sitt eget initieringskodon for overføring i en vacciniavirusvektor. Likeledes kan plasmidet pN2gpt-S4 (figur 4.7) brukes til å innføye komplette åpne leserammer inkludert et AUG-translasjonsstartkodon.

Ved en annen utførelsesform omfatter dette plasmidet videre en DNA-sekvens som koder for human plasminogen, hvor DNA-sekvensen er operativt bundet til poxviruspromoteren og startkodonet. Dette plasmidet er eksemplifisert ved plasmid pN2gpt-GPg som koder for humant glu-plasminogen, og ved plasmid pN2gpt-LPg som koder for lys-plasminogen, hvor det kodende området for aminosyrene 1-77 fra human plasminogen er deletert (figurene 5.2 og 5.3).

I en beslektet form omfatter dette plasmidet videre en DNA-sekvens som koder for human immunsviktvirus (HIV) gpl60, hvor DNA-sekvensen er operativt bundet til poxviruspromoteren og startkodonet. Dette er eksemplifisert ved plasmid pN2gpt-gpl60, som har gpl60-genet regulert ved hjelp av den syntetiske vacciniaviruspromoter S4 (figur 5.4).

Et annet plasmid omfatter et segment av et cytoplasmisk DNA-virusgenom hvor genet for virustymidinkinase (tk) er lokalisert. I dette plasmidet er det kodende området for tk-genet blitt modifisert (deletert) for å forhindre ekspresjon av aktivt tk-enzym. Dette plasmidet kan anvendes som et mellomprodukt ved konstruksjon av en cytoplasmisk DNA-virusvektor som har et defekt tk-gen, under anvendelse av konvensjonelle metoder for markørredning, slik som beskrevet for genet for vacciniavirus-tk, ved å bruke plasmid pHindJ-3. Ved en beslektet utførelses-form omfatter et plasmid som omfatter et modifisert tk-genområde fra cytoplasmisk DNA-virus, videre et multippelkloningssete bestående av flere nært tilgrensende sekvensspesifikke endonukleasespaltningsseter som er unike i plasmidet. Dessuten er hvert av disse setene fraværende i et cytoplasmisk DNA-virus hvori det modifiserte tk-genområdet skal innføyes. Etter innføyelse av det modifiserte tk-genområdet omfattende disse unike setene i det virusgenomet, er derfor disse setene anvendbare for innføyelse av fremmed-DNA-segmenter i det cytoplasmiske DNA-virusgenom som bærer det modifiserte tk-genområdet, i henhold til den direkte kloningsfremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse.

Dette plasmid som omfatter et modifisert tk-genområde inneholdende et multippelkloningssete, er eksemplifisert ved plasmid pHindJ-3 hvor det modifiserte genområdet for vacciniavirus-tk i plasmid pHindJ-2 har fått innføyd et multippelkloningssete med de unike setene Noti, Smal, Apal og Rsrll, flankert med Sfll-seter (figur 4.2). For ytterligere å lette fremtvunget kloning i en vacciniavirusvektor, er hvert av de to Sfil-setene også gjort unike i vektoren ved å undersøke den variable natur til Sfll-gjenkjennelsessekvensen, slik som nærmere forklart i eksempel 4.

Ved nok en annen utførelsesform omfatter et plasmid et sekvensspesifikt endonukleasespaltningssete som er unikt i genomet til det viruset. Slike plasmider er særlig egnet for konstruksjon av genekspresjonskassetter for overføring til en vektor ved det ovenfor nevnte, unike sete. Plasmidet pAO eksemplifiserer det grunnleggende plasmid som inneholder et masterkloningssete bestående av de unike setene til masterkloningssetet i vdTK-vacciniavirusvektoren (figur 4.3). De beslektede plasmider pAl og pA2 ble utformet for innføyelse av DNA-segmenter, f.eks. syntetiske eller naturlige promoterfragmenter, og ble konstruert ved å innføye i Xhol-setet i pAO en linker bestående av et andre multippelkloningssete for hyppig kutting av enzymer som ikke spalter pAO. Begge plasmidene har den samme struktur, bortsett fra orienteringen til det andre multippelkloningssete (figur 4.3).

Ved nok en annen utførelsesform omfatter et plasmid en poxviruspromoter operativt bundet til et translasjonsstartkodon hvor dette startkodonet er umiddelbart etterfulgt av et andre restriksjonsendonukleasespaltningssete passende ordnet til å muliggjøre translasjon av en åpen leseramme innføyd i det andre restriksjonsendonukleasespaltningssete. Dette plasmidet er eksemplifisert ved plasmidene pAl-Sl og pA2-Sl som gir den sterke syntetiske poxviruspromoteren Sl, inkludert et translasjonsstartkodon, etterfulgt av et enkelt EcoRI-sete egnet for innføyelse av åpne leserammer som ikke har et tilknyttet startkodon (figur 4.4). Plasmidene pAl-S2 og pA2-S2 er like med pAl-Sl og pA2-Sl, men har en annen poxviruspromoter, S2 (figur 4.5).

Ved en beslektet utførelsesform omfatter plasmidet ovenfor videre en DNA-sekvens som koder for humant protrombin, hvor DNA-sekvensen er operativt bundet til poxviruspromoteren og startkodonet. Dette plasmidet er eksemplifisert ved plasmidet pAlSl-PT (figur 5.1) hvor en modifisert protrombin-cDNA er innføyd i det eneste EcoRI-sete i plasmidet pAl-Sl.

Et annet plasmid omfatter et modifisert EcoRI-K-fragment fra vacciniavirus-DNA hvorfra KIL-vertsområdegenet er deletert. Hjelperviruset vdhr som mangler både KIL- og C7L-vertsområdegenene, konstrueres fra den C7L-negative stamme WR-6/2 ved hjelp av markørredning med et modifisert EcoRI-K-fragment hvorfra KIL-vertsområdegenet er deletert. Se figur 8.1. Dette modifiserte EcoRI-K-fragmentet omfatter et selektivt markørgen ( E. cø/z-gpt-genet) for å lette utvelgelse med hensyn på rekombinante WR-6/2-genomer omfattende det modifiserte EcoRI-K-fragment under anvendelse av intracellulær markørredning som beskrevet av Sam & Dumbell, 1981. Det eksemplifiserende plasmid er betegnet pEcoK-dhr (figur 8.1).

Ved et ytterligere trinn lineariseres pEcoK-dhr med Noti og ligeres med en 1,1 kb P7.5-gpt-genkassett avledet fra plasmid pN2-gpta (eksempel 4) ved hjelp av Notl-fordøyelse. Det resulterende plasmid pdhr-gpt (figur 8.1) anvendes i markørredningsforsøk for å frembringe hjelpervirus-vdhr i henhold til markørredningsmetoden til Sam & Dumbell, 1981.

Foreliggende oppfinnelse er ytterligere beskrevet nedenunder ved hjelp av de følgende illustrerende eksempler.

I eksemplene som følger er visse konstruksjoner illustrert med tabeller som angir deres kjennetegn. I disse tabellen er de følgende forkortelser brukt:

CDS = kodende sekvens

rc = reverskomplementær sekvens

rcCDS = reverskomplementær kodende sekvens, arabiske tall er

stillinger til nukleotider

ATG = translasjonsstartkodon

EMBL ID = identifikasjon i EMBL-DATABANK

Eksempel 1

Direkte molekylær kloning av fremmed- DNA omfattende et selektivt markørgen ( gpt-genet til E . coli ) i et unikt ( Noti) spaltningssete i genomet til et ortopoxvirus ( vaccinia)

Dette eksemplet demonstrerer direkte molekylær kloning av en genekspresjonskassett i et poxvirusgenom ifølge foreliggende oppfinnelse, ved hjelp av intracellulær innpakking av genteknisk fremstilte poxvirus-DNA. I tillegg illustrerer dette eksemplet anvendelse av en genetisk utvelgelsesfremgangsmåte for effektiv utvinning av modifiserte vacciniavirus inneholdende et innføyd, selektivt markørgen. Forsøksresultatene avslører også at rekombinasjon ofte inntrer mellom DNA som skal innpakkes og DNA til det infiserte hjelpervirus under innpakking når hjelpervirus-DNA-en er homolog med DNA-en som skal innpakkes.

Nærmere bestemt viser et første direkte forsøk med molekylkloning beskrevet nedenunder, at en markørgenkassett (gpt-genkassett) kan innføyes som et Notl-restriksjonsfragment i Notl-spaltet vacciniavirus-DNA og deretter pakket i vacciniavirusinfiserte pattedyrceller. En av ni undersøkte plakker omfattet virus med den forutsakte struktur for en enkelt innføyelse av gpt-genet i "a"-orienteringen (se figur 1.11). Strukturen til denne klonen (betegnet vp7) var stabil under storskalareplikasjon i fravær av utvelgelsesmidlet.

I en andre serie av kloningsforsøk hadde syv av tolv undersøkte kloner den forventede struktur. I denne serien var det imidlertid inkludert fire små plakker (E1-E4) med sakte replikerende virus, selv om disse fortrinnsvis vanligvis ikke velges ut ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Rekombinanter med flere innføyelser av det selektive markørgen, ble også erholdt under selektive betingelser. Stabiliteten til disse multiple innføyelser ble ikke undersøkt i fravær av det selektive middel som er kjent for å stabilisere visse ellers ustabile strukturer. Se Falkner & Moss, J. Virol. 64: 3108-3111 (1990).

Det forholdsvis lave utbyttet av forutsakte strukturer er ikke forventet på bakgrunn av den kjente presisjon ved genteknikkmetoder for setespesifikk spaltning og ligering av DNA-molekyler. Den bestemte sekvens valgt for innføyelse i dette modellsystemet, gpt-genkassetten, omfattet imidlertid vacciniavirus-DNA-sekvenser fra P7.5-promoteren som er homologe til to endogene promotere i vacciniavektoren som driver to 7,5 kD-store polypeptidgener fra vacciniavirus lokalisert innenfor de omsnudde terminale repetisjoner i vacciniagenomet. Se Venkatesan, B., Baroudy B. M. & Moss, B., Cell 25: 805-813 (1981). Denne P7.5-promoteren er blitt brukt til å konstruere vacciniavirusrekombinanter ved konvensjonell intracellulær rekombinasjon og kan integreres stabilt i vacciniatymidinkinasegenet. Mackett & Smith (1986). Av og til fremkommer imidlertid submolare mengder av DNA-fragmenter under analyser av konvensjonelle rekombinanter, noe som kan skrive seg fra sekundære rekombinasjonshendelser. Når en P7.5-promoter innføyes nær de endogene P7.5-promotere (dvs. innenfor flere kilobaser), er bare rekombinanter som har en invertert gjentakelsesstruktur, stabile og denne observasjonen er blitt utnyttet til å utvikle en delesjonsfremgangsmåte basert på innføyelse av et tandemrepetert P7.5-promotersegment. Spenner, D., Drillien, R. & Lecocq, J.-P. J. Virol. 64: 527-533

(1990).

I foreliggende tilfelle med innføyelse av gpt-genkassetten i Notl-setet til vacciniavirus, er avstanden mellom P7.5-promoterne i den venstre inverterte enderepetisjon og den i den innføyde kassett, ca 30 kb, sannsynligvis nært nok til å forårsake destabiliserende sekundære rekombinasjonshendelser. I virkeligheten hadde bare strukturene til noen få sakte replikerende, ustabile kloner, en innføyelse i "b"-orienteringen som ville gi en tandemgjentakelsesordning av de innføyde og endogene promotere. Den sjeldne opptreden av denne strukturen kan således forklares mest sannsynlig ved hjelp av nærheten mellom lokaliseringene av P7.5-promoterne i gpt-genkassetten og de endogene P7.5-promotere og den kjente ustabilitet til tandemrepeterte kopier av P7.5-promoteren.

I motsetning til dette hadde viruset vp7 og flere andre isolater (Al, A4, Cl og C2) innføyelser i "a"-orienteringen og var stabile. Strukturanalysen av ett isolat, C4, var i overensstemmelse med en hode-til-hale-dobbeltinnføyelse.

Titerne til innpakkede gpt-genpositive virus i den andre serien av kloningsforsøk (fem forskjellige prøver) var omtrent 1 x IO<5> pfu pr. 8 x IO<6> celler, mens det i det første forsøk ble oppnådd en titer på 1-2 x IO<2> pfu fra det samme antall celler. Titeren til modifiserte virus vil være påvirket av flere faktorer, inkludert ligerings- og innpakkingseffektiviteter, reaksjons- og dyrkingsbetingelser ved kloningsfremgangsmåten og av omfanget av forsiktighet som tas for å unngå oppdeling av den høymolekylære vektor-DNA under håndtering. Titerer på ca. IO<5> pfu pr. 8 x IO<6> celler er generelt forventet under standardbetingelsene beskrevet nedenunder.

Selv om det foreliggende eksempel viser at det unike intergen-Notl-sete i vacciniavirus kan brukes for innføyelse av fremmed-DNA, illustrerer det også behovet for å vurdere hvorvidt en foreslått innføyelse kan inneholde virussekvenser av en type og orientering som er kjent eller som det er sannsynlig vil forårsake ustabilitet hos modifiserte virus. Innføyelser som mangler homologi med virussekvenser nær inn-føyelsessetet (f.eks. innenfor 30 kb), skal foretrekkes av hensyn til stabilitet. Innføyelser som omfatter bare korte syntetiske promotersekvenser som gjenkjennes av transkripsjonssystemet til vektoren, er følgelig foretrukket fremfor de som inneholder store segmenter av virus-DNA som inkluderer naturlige promotere i virusvektoren. Se f.eks. Sl-promoteren i eksempel 4 nedenunder.

De følgende materialer og metoder ble brukt i dette og alle etterfølgende eksempler, bortsett fra når annet er angitt.

Rensing av ortopoxvirus og DNA:

Vacciniavirus (villtypestamme Western Reserve (WR), American Type Culture Collection nr. VR 119) ble renset ved hjelp av to på hverandre følgende sukrosegradienter i henhold til Mackett et al., i D. M. GLOVER, DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, 191-211 (IRL Press, 1985). Virus-DNA ble fremstilt ved hjelp av proteinase-K-SDS-fremgangsmåten ifølge Gross-Bellard et al., Eur. J. Biochem. 36: 32-38 (1973).

Fremstilling av isolerte poxvirus- DNA:

Virus-DNA (typisk 2-5 ug) ble spaltet med passende mengder av én eller flere sekvensspesifikke endonukleaser (f.eks. den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti), eventuelt behandlet med alkalisk fosfatase fra kalvetarm (Boehringer, Inc.) og renset ved fenolekstraksjon og etanolutfelling i henhold til rutinemessige metoder med rekombinant DNA. De resulterende virus-DNA-armer ble ligert med et fem- til femtigangers molart overskudd av DNA-fragmentet som skulle innføyes, som har ender som er forenlige for ligering med virusarmene. En aliquot av ligeringsreaksjonsblandingen ble analysert ved hjelp av feltinversjonsgelelektroforese.

Nærmere bestemt ble det i den andre serien av forsøk (A-E) beskrevet nedenunder ligert 2 ug Notl-fordøyd vaccinia-DNA som ikke var behandlet med fosfatase, med 200-600 ng gpt-genkassettinnføyelse i et volum på 30 ul med 5-15 enheter T4-ligase i 48 t ved 12°C, som oppsummert i tabell 1.

In v/ vo- innpakking i pattedyrceller:

8 x IO<6> celler fra afrikansk grønnape (CV-1) ble infisert med hjelpervirus (enten vaccinia WR-villtype- eller WR6/2-virus eller andre virus som angitt) ved 0,2 pfu/celle i 2 t. For den initiale demonstrasjon av innpakking med intakt DNA isolert fra virioner, ble det brukt 20 ug virus-DNA (vPgD-DNA). For innpakking av ekstracellulært fremstilte genomer ble det brukt 1 ug av DNA renset fra en ligeringsreaksjonsblanding. DNA-er ble transfisert inn i celler ved hjelp av kalsiumfosfatutfellingsteknikken (Graham, F. L. & van der Eb, 1973). Cellene ble inkubert i 15 min ved værelsestemperatur og så ble det tilsatt 9 ml medium (DMEM, 10 % kalvefosterserum, glutamin og antibiotika) pr. én ml utfelling til cellene. Etter 4 timer ble mediet byttet ut og det ble inkubert videre i to dager.

Urensede virusforråd ble fremstilt i henhold til standardfremgangsmåter. Mackett et al., 1985. Plakkanalyser og utvelgelsesbetingelser for E. co/z-gpt-genet er kjent innen teknikken. Se Falkner & Moss, J. Virol. 62: 1849-1854 (1988) og Boyle & Coupar, Gene 65: 123-128 (1988).

Feltinversj onsgelelektroforese ( FIGE)

Virus-DNA ble separert på en 1 % agarosegel i tris/acetat/EDTA-buffer (40 mM tris/20 mM iseddik/2 mM EDTA, pH 8,0) med en

mikrodatamaskinkontrollert krafttilførsel (Consort Model E790). For å separere hele området av fragmenter ble det kjørt fire programmer etter hverandre på følgende måte: program 1: 5 t ved 7 V/cm foroverpuls (F) 6 sek, reverspuls (R) 3 sek, pause 1 sek;

program 2: 5 t ved 7 V/cm, F 4 sek, R 2 sek, pause 1 sek; program 3: 5 t ved 7 V/cm,

F 2 sek, R 1 sek, pause 1 sek; og program 4: 5-101 ved 7 V/cm, F 8 sek, R 4 sek, pause 1 sek.

Konstruksjon av plasmid pN2:

Plasmidet Bluescript II SK (Stratagene, Inc.) ble fordøyd med Hindll og ligert til Notl-linkere (Pharmacia, Inc.). Det resulterende plasmid, pN2, har et multippelkloningssete flankert av Notl-seter.

Nærmere bestemt består multippelkloningssetet til pN2 av de følgende seter i den angitte rekkefølge: Noti, Xbal, Spel, BamHI, Smal, Pstl, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Clal og Noti. Den innføyde Notl-linkersekvens i pN2 og tyve baser av de 5'-og 3'-flankerende områder i pBluescript II SK (Stratagene, Inc., La Jolla, USA) er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 1. Innføyelsessekvensen starter i stilling 21 og slutter i stilling 28. (Den første "T"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2266, den siste "G"-rest i 3'-enden til stilling nr. 2313 i plasmidet pN2).

Konstruksjon av plasmidene pN2- gpta og pN2- gptb:

Det 1,1 kb-store Hpal-Dral-fragment (inneholdende P7.5-promoter-gpt-genkassetten) ble isolert fra plasmidet pTKgpt-Fls (Falkner & Moss, 1988) og innføyd i Smal-setet i plasmidet pN2 (figur 1.3). To resulterende plasmider er orienteringsmessige isomerer og ble betegnet pN2-gpta og pN2-gptb. Vacciniavirus-P7.5-promoter-£. co//-gpt-genkassetten og tyve baser fra de 5'- og 3'-flankerende områder i pN2 er vist for pN2-gpta i sekvens med identifikasjonsnr. 2. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 1113. A-resten i translasjonsinitieringskodonet i gpt-genet svarer til stilling 519. T-resten i translasjonsstoppkodonet i gpt-genet svarer til stilling nr. 975. (Den første "C"-rest i 5'-enden svarer til stillingsnummeret 2227, den siste "T"-resten i 3'-enden til stillingsnummeret 3359 i plasmidet pN2-gpta).

Den reverskomplementære form av vacciniavirus-P7.5-promoter-£'. coli-gpt-kassetten og 20 baser av de 5'- og 3'-flankerende områder i pN2 er vist for pN2-gptb i sekvens med identifikasjonsnr. 3. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 1113. T-resten i (reverskomplementet til) translasjonsinitieringskodonet CAT svarer til stilling 615. A-resten i (reverskomplementet til) translasjonsstoppkodonet i gpt-genet svarer til stillingsnummeret 159.

Andre standardteknikker ved analyse med rekombinant DNA (f.eks. "Southern blot", PAGE, "nick"-translasjon) ble utført som beskrevet. J. SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Innpakking av naken virus- DNA:

For å etablere betingelser som trengs for innpakking av den nakne poxvirus-DNA ved hjelp av et hjelpervirus, ble intakt DNA isolert fra virioner fra et eksempelvis rekombinant vacciniavirus (vPgD) transfisert i apeceller (CV-1) infisert med et hjelpervirus (vaccinia-WR-villtype). Det utvalgte, rekombinante virus har flere lett analyserbare fenotypemarkører. vPgD-genomet har således inkorporert i virustymidinkinasestedet (tk) et gen for en legemiddelresistent markør (et gen for enzymet xantinguaninfosforibosyltransferase fra Escherichia coli; dvs. "gpt"-genet) og et gen for et lettvint påvist markørprotein (humant plasminogen). Dette viruset ble opprinnelig konstruert fra en vacciniavirusstamme [WR 6/2; Moss et al., J. Virol. 40: 387-95 (1960), som har en delesjon i ca. 9 kb og følgelig ikke uttrykker virusgenet for 35K-proteinet som utskilles i størst mengde, beskrevet av Kotwal et al., Nature 335: 176-178 (1988)]. Den forventede fenotype til det innpakkede virus omfatter derfor: tk-negativ (dvs. replikasjon i nærvær av bromdeoksyuridin); gpt-positiv (dvs. replikasjon i nærvær av mykofenolsyre og xantin); uttrykking av det humane plasminogengen og ikke uttrykking av det utskilte 35K-protein.

Åtte gpt-positive plakker fra det ovenfor nevnte innpakkingsforsøk ble

analysert. Alle var tk-negative og, som vist i fig. 1.1, alle uttrykte plasminogen. Seks av disse isolatene (feltene 5, 6, 7, 11, 12 og 14) uttrykte ikke det utskilte 35K-vacciniaprotein og oppviste således alle kjennetegnene til det transfiserte genom-DNA. To av plakkene uttrykte også 35K-proteinmarkøren (feltene 4 og 13) og var derfor rekombinanter mellom hjelpervilltypeviruset (feltene 8 og 15) og de innføyde virusgenomer.

Dette forsøket fastslo at nakent poxvirus-DNA ekstrahert fra virioner innpakkes når de transfiseres i hjelpervirusinfiserte celler under de testede forhold. Disse forholdene ble derfor anvendt for transfeksjon av poxvirusgenom-DNA som var blitt modifisert ved direkte molekylær kloning, slik som skissert i figur 1.2.

Innpakking av ekstracellulært fremstilt poxvirus- DNA:

Genomet til vacciniavirus inneholder et enkelt spaltningssete for den Notl-sekvensspesifikke endonuklease i området som er kjent som HindIII-F-fragmentet. Inspeksjon av sekvensen rundt dette setet (Goebel et al., 1990) avslørte at det er lokalisert i et intergenområde som sannsynligvis ikke er essensielt for virusreplikasjon. En markørgenekspresjonskassett ble konstruert i to plasmider (pN2-gpta og pN2-gptb; figur 1.3) ved innføyelse av gpt-genet fra E. coli i hver av de to mulige orienteringer, gpt-genet ble kontrollert ved hjelp av promoteren til vacciniavirusgenet som koder for det 7,5 kDa-store protein beskrevet i Cochran et al., J. Virol. 54: 30-37 (1985) (merket Pl i figur 1.2 og P7.5 i figur 1.3). Hele markørgenkassetten befant seg på et enkelt 1.1 kb-stort Notl-fragment i disse plasmidene. Dette restriksjonsfragmentet fra pN2-gpta ble ligert med Noti-fordøyd WR-villtype-DNA og transfisert i celler som var blitt infisert med hjelpervirus (WR).

I et første kloningsforsøk ble det utført "Southern blot"-analyser av genomstrukturene til fenotypisk gpt-positive forløperplakker. Virusisolatene ble plakkrenset tre ganger og amplifisert under gpt-utvelgelse. De Hindlll-fordøyde DNA-fragmenter fra celler (CV-1) infisert med de forskjellige virusene, ble separert på en 1 % agarosegel ved en kombinasjon av normal elektroforese og feltinversjonsgelelektroforese. Gelen ble så blottet og hybridisert med <32>P-merket vaccinia-WR-DNA og en merket probe inneholdende gpt-sekvenser. Resultatene bekreftet at alle fenotypisk markørpositive kloner inneholdt den 1,1 kb-store gpt-innføyelse.

Figur 1.4 viser flekker av HindIII-DNA-fragmenter fra celler infisert med de ni virusisolatene (feltene 4-12); plakkene 2.1.1 til 7.1.1 og 10.1.1 til 12.1.1). Det forventede 0,8 kb-store Hindlll-fragment som inneholder gpt-sekvensene, kan observeres. I feltene 2 og 3, hvor Hindlll-fordøyd villtypevirus-DNA (hhv. 100 og 50 ng) ble påsatt, var det ikke synlig noen krysshybirdisering til virussekvenser.

I det neste forsøket ble totale DNA-er fra CV-1-cellekulturer infisert med de ni forskjellige plakker fordøyd med Noti. "Southern blot" av de separerte fragmenter er vist i figur 1.5. Uventet var to bånd synlige i de fleste virusisolater, den forutsakte 1,1 kb-store innføyelse og et annet, større fragment. Bare plakk nr. 7.1.1

(felt 8) oppviste det forventede eneste 1,1-kb-bånd. Selv om hybridiseringssignalet til det største fragment er like sterkt i alle undersøkte DNA-er, varierte styrken til 1,1-kb-båndet fra DNA til DNA, noe som indikerer at den 1,1 kb-store innføyelsen kan være til stede i forskjellige molare mengder i forskjellige genomer. Villtypeviruskontrollen (felt 2) hybridiserte ikke til gpt-genproben.

Den samme flekk ble også hybridisert med en vacciniavirus-DNA-probe. Tre fragmenter forventes på ca. 145 kb, 45 kb og 1,1 kb. De oppnådde flekkmønstre omfattet de forventede bånd, men oppviste også et ytterligere bånd på ca. 5 kb. Bare plakk 7.1.1 hadde ikke det uventede 5-kb-bånd.

Orienteringen til DNA-innføyelsen i utvalgte, fremstilte vacciniagenomer ble også undersøkt ved hjelp av "Southern blotting". Som vist i figur 1.2, kan innføyelsen i virus-DNA-er være i enten "a"- eller "b"-orienteringene som lar seg skjelne fra hverandre ved fordøyelse av DNA-ene med passende restriksjonsenzymer. Etter preliminære analyser ble isolat 7.1.1 betegnet klon vp7 og syntes å ha genomstrukturen til det forventede modifiserte virus og ble derfor oppformert og renset. DNA-en i denne klonen ble sammenlignet med DNA-en i villtypevirus ved fordøyelse med flere restriksjonsenzymer og separasjon på en agarosegel ved hjelp av feltinversjonsgelelektroforese (figur 1.6). I et Notl-fordøyelsesprodukt fra vp7 farget med etidiumbromid (felt 2), inneholdt bare 145-kb- og 45-kb-båndene tilstrekkelig DNA-masse til å være synlig, ettersom båndet for den 1,1 kb-store innføyelsen ble beregnet til å inneholde bare ca. 3 ng DNA. Hybridisering med en gpt-spesifikk probe avslørte imidlertid et svakt bånd ved 1,1 kb (figur 1.7, felt 2).

Ved fordøyelser med Hindlll ble de forventede bånd ved 1,4 og 0,8 kb observert. Som forutsakt hybridiserte 0,8 kb båndet med gpt-genproben (figurene 1.6 og 1.7, feltene 4). Ved dobbeltfordøyelse med Noti og Hindlll ble også det forventede 0,8 kb-fragment observert (figurene 1.6 og 1.7, feltene 6).

Ved fordøyelser av vp7-DNA med Pstl ble et forutsakt 4,1 kb-fragment inneholdende gpt-sekvenser observert (figurene 1.6 og 1.7, feltene 8; det 4,1 kb etidiumbromidfargede bånd i figur 1.6 er i virkeligheten en dublett av 4,1 kb-fragmenter, hvorav én inneholder gpt-innføyelsen). Etter spaltning med både Pstl og Noti ble gpt-genkassetten frigjort som et 1,1 kb-stort fragment (figurene 1.6 og 1.7, feltene 10).

Fordøyelsesmønstrene som ble oppnådd med disse og andre restriksjonsnukleaser, inkludert Sali (figurene 1.6 og 1.7, feltene 12), er i overensstemmelse med den fortolkning at vp7 er et stabilt modifisert virus sm har gpt-genet integrert i Notl-setet i vacciniavirusgenomet i "a"-orienteringen (se figur 1.11).

En andre serie med kloningsforsøk ble gjort under litt modifiserte betingelser (se tabell 1 og metoder ovenfor). Fem forskjellige ligeringsreaksjoner (A-E) ble satt opp inneholdende konstante mengder av Notl-spaltet vacciniavektor-DNA og med økende mengder innføyelses-DNA. Pakking ble gjort under standardbetingelser i vacciniavirusinfiserte CV-1-celler. Titrene av gpt-positive vacciniavirus var i alle tilfeller ca. 1 x IO<5> pfu pr. 8 x IO<6> celler. Plakkpopulasjonen i alle kloningsforsøkene var heterogene i størrelse: ca. halvparten hadde en normal størrelse, mens den andre halvparten var mindre enn normalt.

Det ble isolert tolv gpt-positive plakker, fire i hver av tre serier betegnet seriene A, C og E, omfattende 8 plakker (A 1-4 og Cl-4) med normal størrelse (store) og 4 små plakker (El-4). Hver av disse plakkene ble analysert ved å infisere CV-1-celler i gpt-selektivt medium, isolere totale celle-DNA-er og fordøye dem med restriksjonsnukleaser, separere fragmentene ved hjelp av FIGE og blotte dem på en nitrocellulosemembran.

I figur 1.8 er de Notl-fordøyde DNA-prøver hybridisert med vacciniavirus-DNA-proben, vist (Al-4, feltene 1-4; Cl-4, feltene 5-8; El-4, feltene 9-12). Pga. overbelastning av gelen fløt båndene noe sammen, men de vesentlige trekk er klart synlige. 145 kb- og 45 kb-båndene ga hovedsignalet. Et svakt bånd ved ca. 5 kb av ukjent opprinnelse kan ses i noen av prøvene. 1,1 kb-båndet som omfatter P7.5-promoter-gpt-genkassetten, utgjør bare 0,6 % av virusgenomet og inneholder bare 300 bp hybridiserende sekvens (dvs. P7.5-promoteren). Dette båndet var derfor ikke forventet å gi et påvisbart hybridiseringssignal under de anvendte betingelser. Ved en mer langvarig eksponering av flekken, når de større båndene er svært overeksponerte,

ble 1,1 kb-båndet synlig.

Med hensyn til egenskapene til småplakkfenotypen, ga små plakker El,

E3 og E4 bare svake hybridiseringssignaler (figur 1.8, feltene 9-12), noe som indikerer

at viruset i disse plakkene ikke hadde replikert så omfattende som de i plakkene med normal størrelse (feltene 1-8), mens isolat E2 ikke ga en påvisbar mengde DNA (felt 10).

Prøvene vist i figur 1.8 ble også hybridisert med gpt-genproben (figur

1.9). Det forventede enkle hybridiseirngssignal ble oppnådd med plakkene Al, A4,

Cl, C2, C4, E3 og E4 (figur 1.9, feltene 1,4, 5, 6, 8, 11 og 12). Plakken A2 (felt 2)

hadde gpt-genet integrert i 45 kb-båndet. (Det svake signal i 145 kb-båndet kan skyldes forurensning med en andre mindre art, eller sekundære

rekombinasjonshendelser.) Plakken A3 (felt 3) har gpt-gensekvenser integrert i 145

kb- og 45 kb-båndene, mens plakken C3 (felt 7) har en integrasjon av de sekvensene i 145 kb-båndet og i Notl-setet. Plakkene A2, A3 og C3 er sannsynlige rekombinanter som oppstod ved uriktig intracellulær rekombinasjon av homologe sekvenser som er til stede i modellgenkassettinnføyeisen og i de inverterte repetisjoner av virus-DNA-

en.

Som med vacciniavirus-DNA-proben, ga småplakkene E1-E4 bare svake hybridiseringssignaler (figur 1.9, feltene 9-12), noe som indikerer at viruset i disse plakkene ikke hadde replikert like omfattende som de i plakker med normal størrelse. Villtypevirus-DNA-en og uinfisert CV-l-celle-DNA hybridiserte ikke med gpt-genproben (figur 1.9, feltene 13 og 15).

Orienteringen og kopiantallet av gpt-geninnføyelsene ble bestemt ved

hjelp av fordøyelse av prøvene vist i figur 1.9 med Pstl og "Southern blot"-analyse. De forventede størrelser til nye Pstl-fragmenter som skriver seg fra innføyelse av gpt-

genet, er vist i figur 1.11. Hybridisering med gpt-genproben avslørte at mønstrene til plakkene Al, A4, Cl og C2 (figur 1.10, feltene 1,4, 5 og 6) omfattet et enkelt Pstl-fragment på 4,1 kb, som forventet for den enkelte innføyelse i "a"-orienteringen (figur 1.11). For plakk El var et svakt hybridiseirngssignal fra et 21 kb-bånd, som ble observert bare ved lange eksponeringer av flekken, i overensstemmelse med "b"-orienteringen til gpt-geninnføyelsen.

Strukturene til virus-DNA-ene fra plakkene C4 og E3 (figur 1.10, feltene 8 og 11) var i overensstemmelse med dobbelttandeminnføyelser i "b"-orienteringen. I dette tilfellet forventes hybridiserende fragmenter på 21 og 1,1 kb (figur 1.11). Strukturen til viruset i plakk E4, som omfatter to fragmenter på 4,1 og 1,1 kb, er i overensstemmelse med en tandeminnføyelse av to gpt-gener i "a"-orienteringen. DNA-en fra plakkene A2, A3 og C3 oppviste mer komplekse mønstre, noe som indikerer innføyelser i flere seter, noe som ikke ble ytterligere analysert.

Som en oppsummering hadde fem av åtte plakker med normal størrelse i det andre kloningsforsøk, genomstrukturer forventet for innføyelse av en eneste gpt-genkassett i det unike Notl-sete i vacciniavirusgenomet. De saktere voksende småstørrelseplakker oppviste ustabile strukturer som ble tapt under etterfølgende plakkrensingstrinn.

Eksempel 2

Direkte molekylær kloning av et selektivt markørgen ( E . coli - gpi ) i et unikt ( Noti) spaltningssete i et modifisert avipoxvirusgenom ( fjærfekoppervirusklon f- TK2a)

Dette eksemplet illustrerer den generelle anvendbarhet av direkte molekylær kloning av modifiserte cytoplasmiske DNA-virusgenomer ved å illustrere en anvendelse på modifiserte avipoxvirusgenomer som er fremstilt in vitro og pakket in vivo. Avipoxvirus har de største genomer i poxvirusfamilien. Genomet til fjærfekoppervirus (FPV) er ca. 300 kb i størrelse og FPV-rekombinanter som uttrykker fremmedgener, har hittil blitt konstruert bare ved hjelp av markørrednings-teknikker [se f.eks. Boyle and Coupar, Virus Res., 120: 343-356 (1988); Taylor et al., Vaccine, 5: 497-503 (1988)].

Det foreliggende eksempel illustrerer fremstilling av et modifisert fjærfekoppervirus ved direkte molekylær kloning av en genekspresjonskassett bestående av en poxviruspromoter som driver E. co/z'-gpt-genet i et unikt Notl-sete i genomet i et rekombinant fjærfekoppervirus f-TK2a. Dette Notl-sete befinner seg i lacZ-genet som tidligere ble innføyd i denne rekombinanten ved intracellulær rekombinasjon. Kunstig fremstilt DNA pakkes i primære kyllingembryofibroblastere infisert med HP2-hjelperfjærfekoppervirus som replikerer saktere enn f-TK2a-rekombinanten. Utvelgelse med hensyn på gpt-positive plakker fører til isolering av kunstig fremstilte fjærfekoppervirus. Ettersom lacZ-markørgenet inaktiveres ved en innføyelse i Notl-setet, skiller avkomviruset seg fra vektorvirus som mangler en innføyelse, ved en fargeløs fenotype i blåplakkanalysen med hensyn på lacZ-genekspresjon.

Rensing av fjærfekoppervirus og DNA:

Fjærfekoppervirus(FPV)-stamme HP1 [Mayr & Malicki, Zentralblatt f. Veterinårmedizin, Reihe B, 13: 1-12 (1966)] og den svekkede stamme HP 1.441 (passering nr. 441 av HP1) ble erholdt fra A. Mayr, Miinchen. Fjærfekoppervirusstammen HP2 ble avledet fra HP 1.441 ved plakkrensing. Primære kyllingembryofibroblastere (CEF) ble fremstilt som beskrevet i europeisk patentsøknad med publikasjonsnr. 338.807. Cellene ble dyrket i vevskulturmedium 199 (TCM 199; Gibco BRL) supplert med 5 % kalvefosterserum, glutamin og antibiotika. Fjærfekoppervirus ble renset ved hjelp av to på hverandre følgende sukrosegradienter i henhold til Joklik, W. K., Virology 18: 9-18 (1962). Virus-DNA ble fremstilt ved hjelp av proteinase K/SDS-fremgangsmåten i følge Gross-Bellard et al., Eur. J. Biochem. 36: 32-38 (1973).

Konstruksjon av en fjærfekoppervirus vektor ( f- TK2a) med et unikt ( Noti) spaltningssete i det innføyde DNA- segment: Vacciniavirus-tk-genet sammen med E. co/z-lacZ-genet ble innføyd i intergenområdet mellom tk-genet og 3'-orf i fjærfekoppervirus. Plasmidene pTKm-VVtka og pTKm-VVtkb ble konstruert ved å klone det funksjonelle vacciniavirus-tk-gen i mellomproduktplasmidet pTKm-sPl 1. Etter intracellulær rekombinasjon av pTKm-VVtka og pTKm-VVtkb med villtypefjærfekoppervirus-DNA, ble det skapt to nye FPV-vektorer kalt hhv. f-TK2a og f-TK2b. Hver vektor inneholder to funksjonelle tk-gener, det endogene FPV-gen og det innføyde vacciniavirus-tk-gen, i tillegg til det innføyde lacZ-gen, som alle kan anvendes som et ikke-essensielt sete for innføyelse av fremmed-DNA. Notl-setet i lacZ-genet er særlig et unikt spaltningssete i f-TK2a- og b-vektorene og er derfor fordelaktig for direkte molekylær kloning av fremmed-DNA i disse vektorene. Fullstendige detaljer vedrørende konstruksjonen av fjærfekoppervirus vektorene f-TK2a og f-TK2b er gitt i US-patentsøknaden med tittelen "Recombinant Fowlpox Virus", Scheiflinger et al., som krever prioritet fra en tilsvarende europeisk søknad innlevert samtidig med denne søknaden.

ln v/ vo- pakking i apeceller:

8 x IO<6> CEF-celler infiseres med 0,2 pfu/celle av hjelpervirus (HP2) i 21. For pakking av kunstig fremstilte FPV-genomer anvendes 1 ug renset ligeringsreaksjonsprodukt. Celler transfiseres med DNA-er ved hjelp av kalsiumfosfatutfellingsteknikken (Graham and van der Eb, 1973) og det inkuberes i 15 min ved værelsestemperatur. 9 ml medium (TCM 199, 10 % kalvefosterserum, glutamin og antibiotika) pr. én ml utfelling tilsettes til cellene. Etter 41 byttes mediet og det inkuberes i ytterligere to dager. Det fremstilles forråd med ubearbeidet virus i henhold til standardfremgangsmåter (Mackett et al., 1985). Plakkanalyser og gpt-utvelgelse gjøres som beskrevet av Scheiflinger et al., 1991.

Direkte molekylær kloning i et unikt Notl- spaltningssete i et fjærfekoppervirusgenom: Den rekombinante FPV-stamme f-TK2a (Scheiflinger et al., 1991) er egnet som en vektor for direkte kloning av en genkassett, f.eks. en modell-gpt-genkassett som her beskrevet, i et unikt Notl-spaltningssete. Dette Notl-setet i vektoren er i det kodende området til et lacZ-gen, som tjener som en fargescreeningsmarkør som inaktiveres etter geninnføyelse. Således danner lacZ-positive virus blå plakker i nærvær av det kromogene substrat X-Gal, mens virus med innføyelser i dette Notl-setet oppviser en fenotype med hvite plakker. Genomet i f-TK2a-vektoren har også inkorporert genet for vacciniavimstymidinkinase (tk) som også tjener som et alternativt geninnføyelsesområde. Både lacZ- og tk-genene ble innføyd i fjærfekoppervirusgenomet i intergenbmrådet mellom fjærfekopper-tymidinkinasegenet og den åpne leseramme i 3'-enden ved konvensjonelle metoder (Scheiflinger et al., 1991).

Mønstre for DNA-spaltning med Noti ble fastslått for genom-DNA-ene til FPV-virusene HP 1.441 og vektorstammen f-TK2a (figur 2.1). HP 1.441 ble avledet fra en virulent FPV-stamme gjennom svekking ved hjelp av seriepassering i kyllingembryofibroblastere. HP 1.441 er den 441. passering av HP1 og brukes som en vaksinestamme mot fjærfekopper (Mayr & Malicki, 1966) og er godt tilpasset for hurtig replikasjon i cellekultur.

DNA fra HP 1.441 ble analysert som en referanse for FPV-vektorstammen f-TK2a som er et derivat av HP 1.441. Restriksjonsanalysen av HP 1.441-DNA-en (figur 2.1, feltene 1 og 2) viste at denne stammen ikke har noen Notl-seter. Spaltning av vektor-f-TK2a-DNA med Noti resulterte i to store fragmenter på ca. 100 og 200 kb (figur 2.1, felt 4).

Direkte molekylær konstruksjon av et fjærfekoppervirus som uttrykker gpt- genet: En modellgenekspresjonskassett omfattende E. co//-gpt-genet ble konstruert i plasmidet pN2-gpta som inneholder gpt-genet drevet av en "tidlig"/"sen" poxviruspromoter flankert av Notl-seter (figur 1.3).

For kloning i vektoren f-TK2a, skjæres gpt-genkassetten ut fra sitt plasmid og ligeres med Notl-spaltet genom-DNA fra f-TK2a som skissert i figur 2.2. Ligert DNA transfiseres i fjærfekopperhjelpervirusinfiserte CEF-celler. Gpt-positive plakker som forblir hvite under et belegg inneholdende X-Gal, analyseres ytterligere ved hjelp av "Southern blotting" etter infeksjon av kyllingembryofibroblastere. Total celle-DNA isoleres og de separerte Notl-fragmenter underkastes "Southern blotting" med <32>P-merkede DNA-er fra hjelperfjærfekopper- (HP2) og gpt-gensekvensene, som beskrevet i eksempel 1. Gpt-positive virus inneholdende gpt-genet på 1,1 kb Notl-fragmentet indikerer at korrekt ligering har inntrådt i kloningstrinnet.

Fremstilling av modifiserte virus med begge innføyelsesoirenteringer i ett konstruksjonstrinn: Foreliggende eksempel illustrerer også hvordan virus med en enkelt kopi av den innføyde genkassett i hver orientering, samt virus inneholdende flere kopier av det innføyde gen, kan utvinnes fra et enkelt, direkte molekylært kloningstrinn. Orienteringen til DNA-innføyelsen i utvalgte, kunstig fremstilte fjærfekoppergenomer bestemmes ved hjelp av "Southern blotting" av DNA-er spaltet med passende restriksjonsenzymer. Som vist i figur 2.2, kan DNA innføyd i en virus-DNA være enten i "a"- eller "b"-orientering. For preliminære analyser av innføyelsesantall og - orientering med den foreliggende modellgenkassett, fordøyes f.eks. total DNA i celler infisert med utvalgte plakker med restriksjonsendonukleasen Clal og Noti, og separeres på en 0,8 % agarosegel. "Blotten" hybridiseres med en gpt-genprobe og en fj ærfekoppervirusprobe.

I de Notl-fordøyde DNA-prøver av rekombinante virus, skjæres gpt-kassetten ut som et 1,1 kb-stort fragment. Spaltning med Clal av DNA-er som har en innføyelse i a- eller b-orienteringen, resulterer også i forskjellige karakteristiske fragmenter som hybridiserer med en gpt-genprobe, som bestemt ut fra strukturene vist i figur 2.2.

Eksempel 3

Heterolog innpakking av kunstig fremstilt ortopox( vaccinia)- virusgenom- DNA ved hjelp av et avipox( fjærfekopper)- hjelpervirus og påfølgende utvelgelse med hensyn på rekombinanter i vertsceller av en art hvor hjelperviruset ikke kan replikere

Heterolog innpakking av poxvirus-DNA, f.eks. innpakking av en ortopoxvirus-DNA ved hjelp av et avipoxvirus, er ikke blitt rapportert. Foreliggende eksempel viser imidlertid at in v/vø-innpakking av ekstracellulært fremstilt vacciniavirus-DNA kan oppnås ved hjelp av fjærfekoppervirus i kyllingembryofibroblastere. Bruken av et vektorvirus med et annet vertsområde enn hjelpervirusets, gir en enkel og effektiv fremgangsmåte for rensing av et kunstig fremstilt virus i ett plakkanalysetrinn. I foreliggende eksempel ble således det rekombinante ortopoxvirus utvunnet ved hjelp av plakkanalyse på pattedyrceller (CV-1) som ikke understøtter full replikasjon av avipoxhjelperviruset. Innlemmelse av en dominant selektiv markør i den DNA som er innføyd i vektoren, letter på fordelaktig måte bruken av selektive plakkanalysebetingelser for eliminering av virus omfattende vektor-DNA som mangler den ønskede innføyelse.

En annen fordel ved den heterologe innpakkingsfremgangsmåte er den reduserte mulighet for rekombinasjon mellom vektor og hjelpervirus. F.eks. tilhører ortopox- og avipoxvirus forskjellige slekter, har forskjellige morfologier og replikasjonsmuligheter og har bare minimal sekvenshomologi til felles, slik som vist ved mangel på krysshybridisering under standard hybridiseringsbetingelser. Homolog rekombinasjon av genomene til avipox- og ortopoxvirus er derfor ytterst usannsynlig og bruk av disse to virus kan praktisk talt eliminere uønskede rekombinasjonshendelser som ofte inntrer mellom homologe sekvenser fra nært beslektede virus [Fenner & Comben, Virology 5: 530-548 (1958); Fenner, Virology 8: 499-507 (1959)]. En alternativ fremgangsmåte for forhindring av vektorhjelperrekombinasjon under innpakking, er å bruke rekombinasjonsmangelfulle virusstammer eller vertsceller.

I dette eksemplet ble en modellekspresjonskassett omfattende et markørgen ( E. co/i-gpt-genet drevet av en poxviruspromoter) innføyd ekstracellulært i et unikt Smal-sete i vacciniavirus-DNA. Bruken av dette restriksjonsenzymet for å spalte virus-DNA-en gir butte ender som på fordelaktig måte kan ligeres til buttendede DNA-innføyelser fremstilt ved hjelp av hvilken som helst annen nuklease som gir butte ender, eller f.eks. ved å bruke en polymerase eller eksonuklease til å skape butte ender fra en innføyelse med enkelttrådede ender.

For innpakking ble den fremstilte genom-DNA transfisert i fjærfekoppervirusinfiserte vertsceller hvor både vaccinia- og fjærfekoppervirus kan replikere (kyllingembryofibroblastere). Ettersom vertsområdet til fjærfekopperhjelperviruset er begrenset til fugleceller, ble vacciniaviruskloner valgt ved hjelp av plakkrensing av avkom fra de transfiserte celler på pattedyrvertsceller (CV-1-nyreceller fra afrikansk grønnape). Samtidig utvelgelse med hensyn på gpt-genekspresjon ble brukt til isolering av bare modifiserte vacciniavirus. I motsetning til den vanlige fremgangsmåte for fremstilling av poxvirusrekombinanter hvor det ved én intracellulær genetisk krysning vanligvis bare kan innføyes én kopi av et fremmedgen i en eneste orientering, ble foreliggende eksempel begge mulige orienteringer av en enkelt innføyelse, samt doble innføyelser av modellgenkassetten identifisert som produkter av en enkelt, ekstracellulær genomisk modifikasjonsreaksjon.

Forsøksresultatene i foreliggende eksempel viser at innpakkingseffektiviteten for ligerte vacciniavirus-DNA-er ved hjelp av fjærfekopperhjelpervirus, var lav sammenlignet med innpakking av intakt vacciniavirus-DNA med fjærfekoppervirus, som gir utbytter i området 5 x IO<3> til 1 x 10<4> pfu pr. 6 x IO<6> kyllingembryofibroblastere etter tre dager med replikasjon. I ett innpakkingsforsøk (fremstilling av plakker betegnet "F12"-serien, infra) var utbyttet av innpakkede modifiserte virus 9 x IO<2> pfu, og i et andre forsøk (ved fremstilling av "F 13"-serien) 5 x IO<2> pfu, pr. 6 x IO<6> kyllingceller. Én kilde for denne forholdsvis lave innpakkingsfrekvens i disse forsøkene, er mangelen på defosforyleringsbehandling av vektor-DNA-armene som derfor var i stand til å religere effektivt uten noen inn-føyelse. Slik behandling ble unngått fordi defosforylering av buttendede DNA-fragmenter vanligvis er ineffektive. Dette problemet kan overvinnes med konstruksjon av vertsvirusstammer med multiple spaltningsseter med "klebrige" ender som mulig-gjør styrt ("tvunget") kloning, hvorved innføyelsen av fremmed-DNA-fragmenter gjøres mye mer effektiv.

En annen faktor som påvirker innpakkingseffektiviteten, er forstyrrelse på det cellulære nivå mellom hjelperviruset og det innpakkede virus. Under standard innpakkingsbetingelser replikerer hjelperviruset (fjærfekopper) vanligvis innen tre dager med inkubasjon til titere på ca. 1 x IO<8> pfu pr. 6 x IO6 kyllingembryofibroblastere. Det store overskudd av fjærfekoppervirus sammenlignet med innpakket vacciniavirus, skaper forhold som gir negative forstyrrelsesfenomener og inhiberer replikasjon av det innpakkede virus.

Denne forstyrrelsen minimaliseres ved å bruke pattedyrceller for innpakking i kombinasjon med fjærfekopperhjelpervirus som beskrevet i eksempel 7.1 dette tilfellet understøtter vertscellene ikke full replikasjon av hjelper-fjærfekopperviruset. Selv om ingen testing av ligerte vacciniavirus-DNA for innpakkingseffektivitet ved fjærfekoppervirus er blitt gjort i en pattedyrvertscelle, ble det oppnådd et innpakkingsutbytte på 2 x IO<6> pfu pr. 8 x IO<6> pattedyrceller (CV-1) med uspaltet vacciniavirus-DNA.

I hver virusrekombinant frembragt ved hjelp av intracellulær rekombinasjon med et bestemt innføyelsesplasmid, har en innføyelse én orientering avhengig av polariteten til de homologe, flankerende områder i det plasmidet. Pga. transkripsjonene forstyrrelsesfenomener, f.eks. (Ink & Pickup, 1989), avhenger ekspresjonsnivåer for gener innføyd i en poxvirus vektor, av orienteringen til fremmedgenet i forhold til virusgenomet. Det er derfor ønskelig å oppnå modifiserte virus med begge mulige orienteringer i ett reaksjonstrinn. En av fordelene ved fremgangsmåten i dette eksemplet er at begge mulige orienteringer av den innføyde DNA oppnås i én ligeringsreaksjon, noe som muliggjør øyeblikkelig screening med hensyn på varianter som har det høyeste ekspresjonsnivå. Den foretrukne orientering av kassetten i dette eksemplet i det utvalgte Smal-innføyelsessete i vacciniavirus er "b"-orienteringen, noe som bevises av det faktum at flesteparten av modifiserte virus hadde denne genomstruktur. I denne kassetten er P7.5-promoteren som kontrollerer fremmedgenet, i den inverterte gjentakelsesorientering i forhold til det endogene 7.5 kDa polypeptidgen. Som omtalt i eksempel 1, er de endogene 7.5 kDa polypeptidgener lokalisert i de inverterte enderepetisjoner i vacciniagenomet. Avstanden mellom P7.5-promoteren i gpt-genet og P7.5-promoteren i den venstre enderepetisjon, er ca. 20 kb. Derfor burde "a"-orienteringen være mindre stabil og oppnås sjeldnere, i overensstemmelse med den observasjon at denne orienteringen ble funnet bare to ganger. Virusisolatene F13.4 (orientering a) og vF12.5 (orientering b) ble imidlertid propargert til stor skala med gpt-utvelgelse og ble funnet å ha stabile, forutsakte strukturer. Stabiliteten til forskjellige strukturer som omfatter flere innføyelser uten utvelgelse, gjenstår å bli bestemt.

Ligeringene inneholdt flere gangers overskudd av innføyelse i forhold til vektoren, slik at innføyelse av flere kopier av kassetten ble favorisert, slik som iakttatt. Det er imidlertid uklart hvorfor doble innføyelser var hyppigere i dette eksemplet enn i eksempel 1. Pga. interne rekombinasjonshendelser forventes bare visse konfigurasjoner av multiple innføyelser å være stabile. Ytterligere undersøkelser for å evaluere stabilitet av virus med multiple innføyelser og det optimale forhold mellom vektor og innføyelse for stabilitet og ekspresjonsnivå som avhenger av kopiantall, kan alt utføres om nødvendig for hver konstruksjon, i henhold til det som her fremgår.

Rensing av virus og DNA:

Virusene og fremgangsmåtene ifølge eksemplene 1 og 2 ble brukt.

Fremstilling av virus- DNA:

Virus-DNA renset fra virioner ble spaltet med Smal og renset ved hjelp av én fenolekstraksjon og tre kloroformekstraksjoner. I det første forsøket nedenunder ble 2 ug spaltet virus-DNA ligert med 400 ng (34 ganger molart overskudd) av det innføyde fragment (1,1 kb Hpal-Dral-fragmentet skåret ut fra plasmid pTKgpt-Fls) i et volum på 30 jj,1 i 401 med 15 enheter T4-ligase (Boehringer, Inc.). Det andre ligeringsforsøket ble gjort under de samme betingelser, bortsett fra at det ble brukt et 17 gangers molart overskudd av den 1,1 kb-store Smal-innføyelsen og 5 enheter ligase.

In vzvo- heterolog innpakking i fugleceller:

Kyllingembryofibroblastere (6 x IO<6>) ble infisert med hjelperviruset (0,5 pfu/celle HP 1.441) og inkubert i 21. 2 ug ligert DNA ble transfisert i de infiserte celler og behandlet videre som beskrevet for den homologe innpakkingsrfemgangsmåte i eksempel 1. Den initiale plakkanalyse ble gjort i CV-1-celler som beskrevet i eksempel 1.

Demonstrasjon av innpakking av modifisert vacciniavirus- DNA ved hjelp av fj ærfekopperhj elpervirus: Utformingen av dette forsøket er vist i figur 3.1. Vacciniavirusgenom-DNA ble fremstilt fra sukrosegradientrensede virioner, kuttet med restriksjonsendonukleasen Smal og ligert med den buttendede fremmedgenkassett. Ligert DNA ble transfisert i fjærfekoppervirusinfiserte kyllingembryofibroblastere for innpakking. Avkomvirus ble identifisert ved hjelp av plakkanalyse på pattedyrceller (CV-1) som ikke understøtter fullstendig replikasjon av fjærfekoppervirus, hvorved det ble fremstilt infeksiøse virioner.

Nærmere bestemt ble først Hpal-Dral-fragmentet som bærer modellgenkassetten (inneholdende gpt-genet drevet av vacciniavirus-P7.5-promoteren), skåret ut fra plasmidet pTKgpt-Fls (Falkner & Moss, 1988) og ligert direkte i det unike Smal-sete i vacciniavilltypevirus (WR-stamme). gpt-genet ble valgt for å muliggjøre positiv utvelgelse av modifiserte virus (Boyle & Coupar, 1988; Falkner & Moss, 1988). Det eneste Smal-sete i vacciniavirus-DNA befinner seg i den åpne leseramme A5 IR i Hindlll-A-fragmentet i genomet. A5 IR-genet er ikke essensielt for virusreplikasjon i cellekultur (Goebel et al., 1990).

Ligert materiale ble transfisert i kyllingembryofibroblastere infisert med fjærfekopperhjelpervirus. Etter tre dager ble cellene høstet og et ubehandlet virusforråd ble fremstilt. Innpakket vacciniavirus ble identifisert ved plakkanalyse på en nyrecellelinje (CV-1) fra afrikansk grønnape i medium som selekterer med hensyn på celler infisert med et virus som bærer gpt-genet. Denne utvelgelsesfremgangsmåte forhindrer virus som inneholder selvligert villtypevacciniavirus-DNA fra å danne plakker, mens modifiserte virus som inneholder en innføyd modell-gpt-genkassett får gjøre det.

Innpakkingsfrekvensen var lav i innledende forsøk. Titeren av gpt-positivt vacciniavirus i det ubehandlede forråd fremstilt fra 6 x IO<6 >kyllingembryofibroblastere var i området 1 x IO<2> til 1 x 10<3> pfu. 13 gpt-positive plakker ble amplifisert under gpt-utvelgelse i CV-1-celler. Total DNA i infiserte celler ble isolert, fordøyd med Hindlll, separert på en 0,7 % agarosegel og bearbeidet videre for analyse ved hjelp av "Southern blotting" med en gpt-genprobe. Som vist i figur 3.2, ble det oppnådd flere virus med "blot"-mønstre forutsakt for forskjellige modifiserte genomstrukturer.

I feltene 2,4,11 og 13 (svarende til plakkene nr. F12.3, F12.5, F13.3 og F13.5) er det synlig et enkelt hybridiseringsfragment på ca. 45 kb, som forventet når én kopi av genkassetten innføyes i virusgenomet i "b"-orienteringen i virusgenomet (se figur 3.3). Et forventet nytt fragment på 5,2 kb er også til stede i alle tilfeller og fremkommer også når de samme DNA-er testes som i figur 3.2 under anvendelse av en vacciniavirusprobe.

To virus med mønstre i overensstemmelse med "a"-orienteringen ble oppnådd i feltene 7 og 12 (svarende til plakkene nr. F 12.8 og F13.4), hvor et enkelt gpt-hybridiserende fragment på ca. 5,7 kb er forventet. Det 5,7 kb-store fragment i felt 7 er mer synlig ved mer langvarige eksponeringer av autoradiografien. Mønsteret som

ses i felt 5 (plakk F12.6) kan representere en enkelt innføyelse i "a"-orienteringen,

men det forventede 5,7 kb-bånd er noe større av ukjente grunner.

Mønsteret til tre virusisolater er i overensstemmelse med en tandeminnføyelse i "a"-orienteringen (feltene 1, 6 og 10, svarende til plakkene nr.

F 12.2, F12.7 og F13.2). I disse tilfellene forventes to gpt-positive hybridiserende fragmenter på 5,7 og 1,1 kb (se også figur 3.3). Fragmenter på 5,7 og 1,1 kb ble også observert i ekvimolare mengder med virus-DNA-en i en "blot" hybridisert med en vacciniavirusprobe.

Genomet i isolatet i felt 3 (plakk F 12.4) inneholder sannsynligvis en tandemduploinnføyelse i "b"-orienteringen. I dette tilfellet forventes to fragmenter på

45 kb og 1,1 kb å hybridisere med gpt-genet.

Virus-DNA-en i felt 9 (plakk F 13.1) kan omfatte en hode-til-hode-dobbeltinnføyelse. I dette tilfellet forventes et 45 kb og et 5,7 kb fragment å

hybridisere med en gpt-genprobe. I tillegg bør imidlertid en slik DNA inneholde et nytt 0,6 kb-stort fragment som hybridiserer med en vaccinia-DNA-probe, og dette fragmentet ble faktisk påvist på en "blot" hybridisert med en vacciniaprobe. Det forventede 5,7 kb-store fragment var ikke desto mindre noe mindre enn forutsakt og ga et hybridiseirngssignal som var svakere enn forventet. Bekreftelse av strukturen til denne rekombinanten krever derfor mer detaljert analyse.

Ytterligere analyse avslørte at virusene F 12.7 og F 12.3, ovenfor fortolket

til å ha doble innføyelser med tandem "a"-strukturer, og viruset F 12.4, ovenfor fortolket til å doble innføyelser med tandem "bystrukturer, har i virkeligheten multiple tandeminnføyelser i hhv. "a"- eller "b"-orienteringene. "Southern blot"-analysen i figur 3.2 skjelner ikke mellom doble tandem- og multiple tandeminnføyelser.

Eksempel 4

Konstruksjon av en ortopoxvirus( vaccinia) vektor ( vdTK) med et retningsbestemt masterkloningssete og plasmider med forenlige ekspresjonskassetter

Dette eksemplet demonstrerer anvendelse av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse til å skape nye poxviruskloningsvektorer ved styrt molekylær modifikasjon og kloning av eksisterende poxvirusgenomer. Dette eksemplet beskriver særlig en vacciniavirusvektor (vdTK) som muliggjør retningsbestemt innføyelse (dvs. "tvungen kloning") av fremmedgener i et "multippelkloningssete"-segment bestående av flere forskjellige endonukleasespaltningsseter som hvert er unikt i vektorgenomet. Tvunget kloning eliminerer behovet for utvelgelses- eller screeningsfremgangsmåter

for å skjelne de ønskede rekombinanter fra vektorvirus som mangler en innføyelse, ettersom forenlighet mellom DNA-ender spaltet ved hjelp av forskjellige nukleaser

forhindrer religering av vektorarmene uten en fremmed innføyelse. Fremgangsmåten med tvungen kloning er følgelig den mest effektive måte å innføye et fremmed gen i en virusvektor på.

Den retningsbestemte vektor vdTK skapes ved innføyelse av et multippelkloningssete (bestående av unike Noti-, Smal-, Apal- og Rsrll-seter) i stedet for tymidinkinasegenet (tk) i vacciniavirus (se figur 4.1 A). Dette ikke-essensielle sted er det sted som hyppigst brukes for innføyelse av fremmedgener i vacciniavirus, hovedsakelig fordi positiv utvelgelse av tk-negative virus er tilgjengelig. Når ligert vdTK-vektor-DNA innpakkes ved hjelp av et tk-positivt hjelpervirus, kan således vektorviruset velges positivt fra overskuddet av hjelpervirus. Innføyelse av fremmed-DNA i vacciniavirus-tk-stedet ved hjelp av konvensjonelle metoder, resulterer videre generelt i stabile rekombinanter.

Multippelkloningssetet i den nye vdTK-vektor består av Noti- og Smal-spaltningsseter som er unike i vektoren. Før innføyelse av multippelkloningssetet deleteres Noti- og Smal-spaltningsseter som foreligger på forhånd i villtypevacciniaviruset (WR-stamme) ved direkte molekylære modifikasjoner i henhold til foreliggende oppfinnelse. Virus med de ønskede modifikasjoner påvises ved screeningsteknikker basert på polymerasekjedereaksjonen (PCR) for amplifikasjon av spesifikke nukleinsyresekvenser.

Dette eksemplet beskriver også et sett plasmider som letter ekspresjon av DNA-er som koder for fullstendige eller partielle åpne leserammer i vdTK-vacciniavektoren. Foreliggende oppfinnelse omfatter innføyelse av åpne leserammer direkte i en poxvirusekspresjonsvektor som har alle korrekte regulatorelementer passende plassert for ekspresjon av den innføyde åpne leseramme. Foreliggende vdTK-vektor er imidlertid ikke utstyrt med slike regulatorsekvenser for ekspresjon av en innføyd åpen leseramme som mangler sine egne transkripsjons- og translasjonssignaler. Plasmidene ifølge dette eksemplet gir følgelig passende genekspresjonskassetter for rutinebinding av åpne leserammer til poxviruspromoterer og eventuelt til et translasjonsstartkodon. En åpen leseramme og tilknyttede regulatorsekvenser overføres så effektivt til vdTK-vektormasterkloningssetet ved tvungen kloning. Modifiserte virus med innføyelsen i en av orienteringene kan oppnås ved å bruke ett eller to plasmider som har ekspresjonskassetten i den ønskede orientering innenfor masterkloningssetet. Genekspresjonskassettene i plasmidene som her er eksemplifisert, har to "nested" sett med restriksjonsenzymspaltningsseter for å lette kloning av åpne leserammer i vdTK-vektoren. Kassettene har et masterkloningssete bestående av de samme unike setene som masterkloningssetet i vdTK-vektoren. I tillegg inneholder kassettene i midten av dette masterkloningssetet mange forskjellige seter for hyppig å kutte enzymer som kan anvendes for innføyelse av åpne leserammer i kassettene. DNA-er innføyd i en kassett ved hjelp av de hyppige kuttingsseter, er således flankert på begge sidene med flere forskjellige unike seter som er egnede for tvungen kloning av kassetten i masterkloningssetet i vdTK-vektoren.

Dette eksemplet beskriver også genekspresjonskassetter egnet for innføyelse i et enkelt unikt sete i vacciniavirusvektoren vdTK. For å overvinne den reduserte kloningseffektivitet ved å bruke et enkelt en2ym for spaltning av vektor-DNA-en, omfatter ekspresjonskassettene i disse plasmidene E. co/z-gpt-genet som en selektiv markør.

vdTK-vacciniavektorsystemet anvendes fortrinnsvis sammen med den heterologe innpakkingsfremgangsmåte beskrevet i eksemplene 3 og 7. Plasmidene som inneholder gpt-markøren kan også brukes med homologe hjelpervirus som mangler gpt-markøren. Eksempler på konstruksjoner for ekspresjon av polypeptider under anvendelse av vdTK-vektoren og beslektet plasmidsystem, er presentert nedenunder i eksempel 5.

I tillegg til de ovenfor nevnte fordeler gir ekspresjonskassettplasmidene ifølge oppfinnelsen også et middel for å overvinne et generelt problem med uforenlighet mellom endene av spaltede poxvirusvektor-DNA-er og mange innføyelses-DNA-er, som et bekvemt alternativ til den vanlige bruk av syntetiske adaptor-DNA-segmenter. Isolering av DNA-fragmenter som koder for åpne leserammer, lettes således vanligvis ved bruk av restriksjonsendonukleaser med gjenkjennelsessekvenser som er korte og følgelig opptrer tilfeldig ved høye frekvenser i alle naturlige DNA-sekvenser. På den annen side er slike hyppig kuttende enzymer generelt ikke egnet for virkningsfull direkte kloning i så store genomer som f.eks. de i poxvirus, ettersom slike enzymer spalter store DNA-er i mange fragmenter. Religering av disse fragmentene ville inntre i tilfeldig rekkefølge og gi få intakte virusgenomer. Innføyelsesseter i en vacciniavektor er derfor fortrinnsvis spaltningsseter for restriksjonsendonukleaser som kutter sjeldent og som det er lite sannsynlig vil bli brukt for isolering av åpne leserammefragmenter eller innføyelses-DNA-er generelt. De foreliggende plasmider overvinner denne generelle uforenlighet ved å muliggjøre virkningsfull innføyelse av fragmenter fra hyppigkuttere i plasmidet etterfulgt av virkningsfull overføring i vacciniavektoren ved bruk av enzymer som kutter sjeldent.

Delesjon av det unike Notl- spaltningssete fra villtypevacciniavirus ( WR):

Det unike Notl-setet i vacciniavirus kan elimineres ved innføyelse i dette setet av et "NotI-delesjonsadaptor"-segment med kohesive ender som er forenlige for ligering med Notl-spaltet DNA, men som mangler sekvenser påkrevd for gjen-kjennelse av Notl-endonukleasen. Sekvensene dannet ved hjelp av de ligerte kohesive ender til den Notl-spaltede virus-DNA og virus-DNA og adaptor, er således ikke spaltbar ved hjelp av Noti. Denne adaptoren inneholder også flere utvalgte restriksjonsendonukleasespaltningsseter for styrt innføyelse av DNA-fragmenter.

Nærmere bestemt kuttes ett ug vacciniavirus-WR-villtype-DNA med Noti og ligeres med ett ug av den dobbelttrådede Notl-delesjonsadaptor. Adaptoren består av to delvis komplementære tråder: odNl (sekvens med identifikasjonsnr. 16) og odN2 (sekvens med identifikasjonsnr. 23). Den sentrale del i adaptoren inneholder restriksjonsendonukleasespalmingssetene Stul, Dral, Sspl og EcoRV. For ligeringsreaksjonen brukes annealerte adaptoroligonukleotider. Det ligerte materialet transfiseres i fjærfekoppervirusinfiserte kyllingembryofibroblastere og innpakkes som beskrevet i eksempel 3.

En alternativ fremgangsmåte for deletering av det eneste Notl-sete i vacciniavirus (WR-stamme) er skissert i figur 4.1, panel B. I det første trinnet kuttes vacciniavirus-DNA med SacI, SacI-"I"-fragmentet isoleres fra agarose med lavt smeltepunkt og klones i Sacl-setet i et egnet plasmid, slik som pTZ19R (som lar seg erholde fra Pharmacia, Inc.). Det resulterende plasmid, pTZ-SacI, kuttes med Noti, behandles med Klenow-polymerase for å fylle igjen de klebrige ender og religeres. Det ligerte materialet transfiseres i E. co//-celler (HB 101). Koloniene isoleres i henhold til standard kloningsfremgangsmåter. Det resulterende plasmid, pTZ-SacIdN, har Notl-setet deletert og brukes i et revers-gpt-utvelgelsesforsøk som beskrevet av Isaacs, S. N. Kotwal, G. & Moss B. Virology, 178: 626-630 (1990), modifisert på følgende måte: CV-1-celler (8 x IO6) infiseres med 0,2 pfu av virusisolatet vp7, et vacciniavirus som i det eneste Notl-sete har integrert en gpt-genkassett (se eksempel 1). Deretter transfiseres en kalsiumfosfatutfelling inneholdende 20 ug DNA fra det modifiserte Sacl-fragment fremstilt fra plasmidet pTZ-SacIdN, i cellene. Cellene behandles videre som beskrevet i innpakkingsfremgangsmåten i eksempel 1. Forråd av ubehandlet virus brukes til å infisere muse-STO-celler (erholdt fra American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC# CRL 1503) i nærvær av 6-tioguanin (6-TG). Dette er en negativ utvelgelsesrfemgangsmåte som krever tap av gpt-genet for at et virus skal replikere (Isaacs et al., 1990), og fører derfor i foreliggende tilfelle til integrasjon av det modifiserte SacI-'T'-fragment og derved delesjon av gpt-genet. Alle plakker som vokser i nærvær av 6-TG burde mangle gpt-genet og inneholder et modifisert SacI-'T"-rfagment. Det beregnede utbytte er i området 0,1-0,2 % av de totale plakkene (dvs. den normale hyppighet av rekombinanter i denne type markørredningsforsøk). Ettersom utvelgelsesfremgangsmåten er svært virkningsfull (Isaacs et al., 1990), forventes ikke identifikasjon av de korrekte strukturer å kreve undersøkelse av store antall kloner. Uansett om den første fremgangsmåte ovenfor eller denne alternative fremgangsmåte brukes til å deletere det eneste Noti i vacciniavirus, kan imidlertid den følgende screeningsfremgangsmåte brukes til å identifisere den ønskede konstruksjon.

Identifikasjon ved hjelp av PCR- screening av virus ( vdN) med Notl- setet deletert: Vacciniaviruskloner med Notl-setet deletert kan identifiseres ved analyse av plakker som vokser i en cellelinje (CV-1) som ikke understøtter vekst av fjærfekopperhjelperviruset. DNA-ene til virus i individuelle plakker analyseres ved hjelp av en PCR-basert screeningsmetode på følgende måte.

Den første primer for PCR-reaksjonen er oligonukleotidet odNl, (sekvens med identifikasjonsnr. 16) og den andre primeren var odN3 (sekvens med identifikasjonsnr. 24). Sekvensen til den andre primer er lokalisert i vacciniavirusgenomet ca. 770 bp nedstrøms fra den første primersekvens. Templatet er total DNA fra 1 x IO<6> CV-1-celler infisert med halvparten av virus fra en enkelt plakk. DNA fremstilles ved hjelp av standardteknikker og ca. 50 ng anvendes til PCR-reaksjonen. PCR-reaksj onene utføres i henhold til standardteknikker under anvendelse av kommersielt tilgjengelige PCR-sett. Positive PCR-reaksj oner gir et DNA-fragment på ca. 770 bp. Et slikt virus med Notl-setet deletert betegnes "vdN".

Delesjon av det unike Smal- restriksjonssetet fra vacciniavirus vdN:

WR-stammen av vacciniavirus inneholder et eneste Smal-sete i en åpen leseramme (A51R) som ikke er essensielt for virusreplikasjon i cellekulturer (Goebel et al., 1990). Selv om dette setet kan brukes for fremmedgeninnføyelse, deleteres imidlertid i det foreliggende eksempel dette setet til fordel for å skape en mer allsidig vacciniavirusvektor ved å innføre et nytt, unikt Smal-sete som del av en multippel-kloningssetekassett.

Følgelig kuttes vdN-virus-DNA (1 ug) med Smal og ligeres med et overskudd av en heksamerlinker som har gjenkjennelsessekvensen for restriksjonsnukleasen Hindlll (odSl, 5'-AAGCTT-3'). Innføyelse av denne linkeren i vacciniavirus-Smal-spaltningssetet resulterer i ødeleggelse av Smal-gjenkjennelsessekvensen og innføringen av en ny Hindlll-gjenkjennelsessekvens. Det ligerte materialet pakkes inn ved transfeksjon i cva-celler som er blitt infisert med fjærfekoppervirus, som beskrevet i eksempel 7.

Alternativt deleteres det eneste Smal-setet i vacciniavirus (WR-stamme) i henhold til fremgangsmåten skissert i figur 4.1, panel C, ved å modifisere et klonet fragment av vacciniavirus-DNA i stedet for å modifisere den fullstendige vacciniavirus-DNA direkte. I et første trinn kuttes vacciniavirus-DNA med Sali, Sall-F-fragmentet isoleres fra agarose med lavt smeltepunkt og klones i Sall-setet i et egnet plasmid, slik som pTZ9R (som lar seg erholde fra Pharmacia, Inc.). Det resulterende plasmid, pTZ-SalF, har to Smal-seter, ett i et multippelkloningssete og det andre i vacciniasekvensene (figur 4.1, panel C). pTZ-SalF fordøyes delvis med Smal, og I-Scel-linkere tilsettes på følgende måte: første tråd, I-Scel-linker 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 25) og dens komplementære tråd, I-Scel-linker 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 26). Det korrekte plasmid med Smal-setet deletert fra vacciniasekvensene identifiseres ved spaltning med Smal og I-Scel. Sluttplasmidet, pTZ-SalFdS, brukes til å inn-føre Smal-delesjonen i et vacciniavirusgenom under anvendelse av det omvendte gpt-genseleksjonsforsøk som beskrevet for delesjon av Notl-setet, bortsett fra at foretrukket virus som skal modifiseres, er isolatet F12.5, et virus som har integrert i det eneste Smal-setet en gpt-genkassett (se eksempel 3).

Den resulterende innføyelse av et sete for endonuklease I-Scel som er fordelaktig for styrt molekylær kloning pga. dette enzymet, isolert fra gjær, gjenkjenner et 18-mer-sete og kutter derfor tilfeldige DNA-sekvenser svært sjeldent. F.eks. kutter I-Scel gjærgenomet bare én gang. Thierry, A., Perrin, A., Boyer, J., Fairhead, C, Dujon, B., Frey, B. & Schmitz, G. Nucleic Acids Res. 19: 189-190

(1991). I-Scel er kommersielt tilgjengelig fra Boehringer, Inc. Et I-Scel-sete innføres fordelaktig i en vektor som ikke har noen foruteksisterende seter for det enzymet, og det skapes derved en ny vektor med et eneste sete som kan brukes for geninnføyelser. Hvorvidt en vacciniavirus-DNA eller en annen vektor-DNA inneholder et sete for I-Scel-spaltning kan bestemmes ved hjelp av rutinemessige restriksjonsanalyser av vektor-DNA-en.

Når denne alternative fremgangsmåte for delesjon av Smal-setet fra vacciniavirus-DNA brukes, er rekkefølgen av trinn for konstruksjon av vektoren vdTK som følger: delesjon av Smal-setet, resulterende i virus vdS (se ovenfor); delesjon av Notl-setet ved innføyelse av Notl-gpt-genkassetten (se eksempel 1) i det eneste Notl-sete i vdS ved kloning og innpakking, resulterende i viruset vdSNgpt, og revers-gpt-utvelgelse som beskrevet ovenfor, under anvendelse av vdSNgpt og pTZ-SacIdN som substrater for markørredningsforsøket; og delesjon av tk-genet som skissert nedenunder i det foreliggende eksempel.

En alternativ fremgangsmåte hvorved vektor-vdTK faktisk ble konstruert, er som følger. Smal-setet i vacciniavilltypevirus ble deletert, hvorved mellomproduktviruset vdS ble dannet. I et annet forsøk ble Notl-setet deletert fra vacciniavilltypevirus, hvorved mellomproduktviruset vdN ble dannet. Viruset vdSN ble erholdt ved saminfeksjon under anvendelse av begge virusene i CV-1-celler og PCR-screening av det rekombinante virus (det som ble dannet ved hjelp av en enkelt genetisk kryssingshendelse). Levedyktigheten til de forskjellige mellomproduktene ble bestemt ved titreringer.

Tabell 4.1 A viser resultatene etter at individuelle isolater fra vdN-kloningsforsøket ble plakkrenset fem ganger (for å sikre at villtypevirusfrie kloner var erholdt) og så amplifisert. Etter titrering ble forråd av ubehandlet virus fra den første amplifikasjon, sammen med villtypekontroll (WR-WT), brukt til å infisere CV-1-celler ved 0,1 pfu/celle. Disse cellene ble høstet etter 48 t og brukt til å fremstille ubehandlede forråd som ble retitrert. Disse resultatene er vist i tabell 4.1 B. Isolatene vdN/Al #6.1111 og vdN/Al #10.1111 ble betegnet hhv. klon vdN#6 og vdN#10 og brukt til virusfremstillinger i stor skala.

Tabell 4.2 A viser resultatene etter at enkeltisolater av vdS-kloningsforsøket var plakkrenset fem ganger og så amplifisert og titrert. Ubehandlede forråd av den første amplifikasjon sammen med villtypekontroll (WR-WT) ble brukt til å infisere CV-1-celler ved 0,1 pfu/celle. Cellene ble høstet etter 48 t og de resulterende ubehandlede forråd ble retitrert. Disse resultatene er vist i figur 4.2 B. Isolatene vdS# 7.11 ble betegnet hhv. klon vdS#2 og vdS#7 og brukt til virusfremstillinger i stor skala. I dette tilfellet ble virusisolatet som oppviste de beste vekstkarakteristika, valgt ut for å bli amplifisert og dyrket i stor skala.

Identifikasjon ved PCR- screening av virus ( vdSN) med Smal- setet deletert:

Kloner av vdSN-vacciniaviruset med Smal-setet deletert, identifiseres ved hjelp av PCR-screening på følgende måte.

Den første primer for PCR-reaksjonen er oligonukleotidet odS2 (sekvens med identifikasjonsnr. 27) og den andre primer er oligonukleotidet odS3 (sekvens med identifikasjonsnr. 28). Sekvensen til oligonukleotid odS2 er lokalisert i vacciniagenomet ca. 340 bp oppstrøms fra Smal-setet, mens sekvensen til oligonukleotidet odS3 er lokalisert ca. 340 bp nedstrøms fra dette setet. Templatet er total DNA fra CV-1-celler infisert med en virusplakk, som beskrevet ovenfor for vdN-identifikasjon. Det PCR-amplifiserte bånd på ca. 680 bp testes med hensyn på mottakelighet for Smal, med resistens overfor Smal-spaltning som indikerer innføyelse av Hindlll- eller I-Scel-linkeren, mens villtypekontroll-DNA kuttes i to stykker på ca. 340 bp. Et vacciniavirus med den ønskede innføyelse av en linker i Smal-setet betegnes vdSN.

Delesjon av det kodende område i tymidinkinasegenet fra vacciniavirus vdSN:

Fra vacciniavirus vdSN utvikles en ny vektorstamme (betegnes vdTK) ved å erstatte tymidinkinasegenet (tk) som befinner seg i et genetisk stabilt område i vacciniagenomet, med et segment bestående av flere unike restriksjonsendonukleasespaltningsseter (figur 4.1 A).

Den kodende sekvens for tymidinkinase (tk) deleteres først fra et plasmid (pHindJ-1) omfattende et segment av vacciniagenomet (Hindlll-J-segmentet) hvor tk-genet er lokalisert (se figur 4.2). I stedet for tk-genet innføyes så et multippelkloningssete med de unike setene Noti, Smal, Apal og Rsrll, flankert av Sfil-seter. Til sist overføres det modifiserte virussegment i vacciniavirusgenomet

vdSN som så ble betegnet vdTK (figur 4.1 A). For ytterligere å lette tvungen kloning kan også hver av de to Sfil-setene gjøres unike i vektoren ved å utforske de variable egenskapene til Sfil-gjenkjennelsessekvensen (GGCCNNNNNGGCC). Sekvensene til to Sfil-seter er som følger: Sfil(l), GGCCGGCTAGGCC (sekvens med identifikasjonsnr. 29) og Sfil(2), GGCCATAT'AGGCC (sekvens med identifikasjonsnr. 30). Dette plasmidet som inneholder den endelige modifikasjon av tk-genet (pHindJ-3), konstrueres fra forløperplasmid pHindJ-1 ved "loop-out"-mutagenese, og delesjon av tk-genet bekreftes ved sekvensanalyse.

Konstruksjon av forløperplasmid pHindJ- 1:

Vacciniavilltypevirus-DNA ble kuttet med Hindlll og de resulterende fragmenter ble separert på en 0,8 % agarosegel med lavt smeltepunkt. Hindlll-J-fragmentet ble skåret ut under UV-lys og preparert i henhold til standardteknikker. Fragmentet ble innføyd i det eneste Hindlll-sete i plasmidet pTZ19R (Pharmacia,

Inc.), noe som resulterte i pHindJ-1.

Konstruksjon av plasmid pHindJ- 2:

Plasmid pHindJ-1 transfiseres i E. cø/z-stamme NM522 og enkelttrådet DNA fremstilles ved superinfeksjon med hjelperfagen M13K07 ifølge fremgangsmåten gitt av Pharmacia. Den enkelttrådede DNA tjener som templatet for seterettet mutagenese med primeren odTKl (sekvens med identifikasjonsnr. 31). Denne primeren er komplementær til promoterområdet og området rundt translasjonsstoppkodonet i tk-genet. I dets sentrale del inneholder det de unike restriksjonsseter BamHI, Hpal, Nrul og EcoRI. Mutagenesefremgangsmåten utføres med et mutagenesesett levert av Amersham, Inc., i henhold til håndboken tilveiebrakt av leverandøren.

For konstruksjon av pHindJ-2, er tk-gensekvensen blitt beskrevet i Weir J.P. & Moss B. J. Virol. 46: 530-537 (1983). tk-gensekvensen er tilgjengelig i EMBL Data Library under identifikasjonen (ID) PVHINLJ. Sekvensen til vektordelen (pTZ19R) i plasmidet er tilgjengelig fra Pharmacia, Inc. Sekvensen rundt det deleterte vacciniavirustymidinkinasegen (tk) i plasmidet pHindJ-2 er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 4. 5'-området i tk-genet (basene #1-19 i den foreliggende liste; basene #4543-#4561 i ID PVHINLJ) etterfølges av de unike restriksjonssetene BamHI, Hpal, Nrul og EcoRI, og 3'-området i tk-genet (basene #44-#67 angitt i listen; basene #5119-#5142 i ID PVHINLJ). Basene #4562-5118 i ID PVHINLJ, som inneholder en del av tk-promoteren og det tk-genkodende området, er deletert i pHindJ-2.

Konstruksjon av plasmidet pHindJ- 3:

Plasmid pHindJ-2 fordøyes med BamHI og EcoRI og en dobbelttrådet linker inneholdende de unike restriksjonssetene Noti, Smal, Rsrll og Apal flankert av Sfil-seter, innføyes. Linkeren består av oligonukleotidene P-J(l) (sekvens med identifikasjonsnr. 32) og P-J(2) (sekvens med identifikasjonsnr. 33).

Den modifiserte sekvens i pHindJ-3 er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 5. Det innføyde multippelkloningssete svarer til oligonukleotid P-J(l). Den innføyde sekvens starter i stilling 21 og slutter i stilling 99. De flankerende sekvenser er de samme som beskrevet i pHindJ-2, supra.

For å innføye tk-delesjonen i vacciniavirus, fordøyes plasmid pHindJ-3 med Hindlll og et forkortet Hindlll-J-fragment med en tk-gendelesjon brukes til et markørredningsforsøk som beskrevet av Sam and Dumbell, 1981. Virus med tk-genet deletert isoleres ved hjelp av tk-negativ utvelgelse (Mackett et al., 1982) og identifiseres med etterfølgende PCR-screening.

Nærmere bestemt skjæres det modifiserte Hindlll-fragment som er til stede i pHindJ-3, ut med Hindlll og isoleres med en agarosegel med lavt smeltepunkt. Markørredningen utføres hovedsakelig som beskrevet av Sam and Dumbell (1981) med de følgende modifikasjoner. 5 x IO<6> CV-1-celler infiseres med 0,2 pfu pr. celle av vacciniavirus vdSN. Etter én times inkubasjon transfiseres én ml av en kalsiumfosfatutfelling inneholdende 1 (ig av det modifiserte Hindlll-J-fragment i de infiserte celler. Etter to dagers dyrking fremstilles et forråd av ubehandlet virus som beskrevet i eksempel 1 og titreres på humane 143B-tk-negative celler i nærvær av bromdeoksyuridin (BrdU) som beskrevet av Mackett et al, 1982. Tk-negative plakker kan videre analyseres ved PCR-screening.

Identifikasjon av tymidinkinasedelesjonsviruset ( vdTK) ved PCR- screening:

Den første primer for PCR-reaksjonen er oligonukleotid odTK2 (sekvens med identifikasjonsnr. 34), sekvensen som er lokalisert ca. 300 bp oppstrøms fra tk-genet. Den andre primer, odTK3 (sekvens med identifikasjonsnr. 35), er lokalisert ca. 220 bp nedstrøms fra stoppkodonet i tk-genet. Templatet er total DNA fra CV-1-celler infisert med en virusplakk, som beskrevet for vdN-screening. Amplifikasjons-produktet som fås fra virus med tk-gendelesjonen, er ca. 520 bp, mens villtypekontrollen gir et fragment på ca. 1,1 kb.

Konstruksjon av plasmider som omfatter genekspresjonskassetter for overføring til vdTK- vektoren: Plasmidet pAO er basisplasmidet som inneholder et masterkloningssete bestående av de unike setene i masterkloningssetet i vdTK-vacciniavirusvektoren. Plasmid pAO ble konstruert ved å erstatte multippelkloningssetet i et kommersielt tilgjengelig plasmid med et segment bestående av de unike setene til vdTK-vektoren og et Xhol-sete, som illustrert i figur 4.3.

For å deletere multippelkloningssetet i pBluescript II SK-^-fagemidet (Stratagene), ble plasmidet nærmere bestemt fordøyd med SacI og Asp718. Det store vektorfragment ble ligert med en adaptor bestående av de annealerte oligonukleotidene P-A(O.l) (sekvens med identifikasjonsnr. 36) og P-A(0.2) (sekvens med identifikasjonsnr. 37).

Multippelkloningssetet i pAO [svarende til oligonukleotidet P-A(O.l)] og de tyve basene i de 5'- og 3'-flankerende områder i pBluescriptll SK-^ er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 6. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 95. (Den første "A"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2187, den siste "G"-rest i 3'-enden svarer til stilling nr. 2301 i plasmidet pAO).

Konstruksjon av plasmidene pAl og pA2:

Plasmidene pAl og pA2 ble utformet for innføyelse i DNA-segmenter, f.eks. syntetiske eller naturlige promoterrfagmenter. De ble konstruert ved å innføye i Xhol-setet i pAO en linker som omfatter et andre multippelkloningssete med hyppig kuttende enzymer som ikke spalter pAO. Begge plasmidene har den samme struktur, bortsett fra orienteringen til det andre multippelkloningssetet (figur 4.3).

pAO-plasmidet ble fordøyd med Xhol og ligert med en adaptor bestående av de annealerte oligonukleotidene P-A(l.l) og P-A(1.2). Plasmider med begge mulige orienteringer for adaptoren ble isolert og betegnet pAl og pA2.

Multippelkloningssetet i pAl [svarende til oligonukleotidet P-A(l.l)] og de tyve basene i de 5'- og 3'-flankerende områder i pAO er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 7. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 83. (Den første "C"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2222, den siste "C"-resten i 3'-enden svarer til stilling nr. 2324 i plasmidet pAl.)

Multippelkloningssetet i pA2 [svarende til oligonukleotidet P-A(1.2)] og de tyve basene i 5'- og 3'-endene i pA2 er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 10. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 195. (Den første "C"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2252, den siste "G"-rest i 3'-enden svarer til stilling nr. 2466 i plasmidet pA2-Sl).

Konstruksjon av plasmidene pAl- Sl og pA2- Sl:

Plasmidene pAl-Sl og pA2-Sl gir den sterke syntetiske poxviruspromoter Sl, inkludert et translasjonsstartkodon, etterfulgt av et eneste EcoRI-sete egnet for innføyelse av åpne leserammer som ikke har et tilknyttet startkodon. Promoter Sl er en modifisert versjon av en sterk poxvirus-"sen"-promoter betegnet P2.

Plasmidene pAl-Sl og pA2-Sl fås ved innføyelse av et første, dobbelttrådet promoterfragment i Ndel- og BamHI-setet i hhv. pAl eller pA2 ved tvungen kloning (figur 4.4, panel A). Nærmere bestemt fordøyes vektor pAl med Ndel og BamHI, og ligeres med en adaptor bestående av de annealerte oligonukleotidene P-P2ml.l og P-P2ml.2. Det resulterende plasmid betegnes pAl-Sl.

Den syntetiske promotersekvens i pAl-Sl (svarende til oligonukleotidet P-P2ml.l)) og tyve baser i de 5'- og 3'-flankerende områder i pAl, er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 9. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 193. (Den første "C"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2228, den siste "G"-rest i 3'-enden svarer til stilling nr. 2440 i plasmidet pAl-Sl.)

Vektoren pA2 ble fordøyd med Ndel og BamHI og ligert med en adaptor bestående av annealerte oligonukleotider P-P2ml.l og P-P2ml.2, som for pAl-Sl ovenfor. Det resulterende plasmid betegnes pA2-S 1.

Den syntetiske promotersekvens i pA2-Sl (svarende til oligonukleotidet P-P2ml .2)) og tyve baser i de 5'- og 3'-flankerende områder i pA2, er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 10. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 195.

(Den første "C"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2252, den siste "G"-rest i 3'-enden svarer til stilling nr. 2466 i plasmidet pA2-Sl.)

Konstruksjon av plasmidene pAl- S2 og pA2- S2:

Plasmidene pAl-S2 og pA2-S2 inneholder den sterke syntetiske promoter S2, en modifisert versjon av en sterk "sen" syntetisk poxviruspromoter beskrevet av Davison & Moss, J. Mol. Biol. 210: 771-784 (1989). Disse plasmidene gir ikke et translasjonsstartkodon med promoteren og er derfor egnet for innføyelse av fullstendige åpne leserammer som omfatter et startkodon. Promoterne har forskjellige orienteringer med hensyn til vdTK-masterkloningssetet i disse to plasmidene.

Plasmidene pAl-S2 og pA2-S2 fås ved tvungen kloning av et andre, dobbelttrådet promoterfragment i Hpal- og EcoRI-setene i henholdsvis pAl og pA2 (figur 4.5, panel A). Nærmere bestemt fordøyes plasmid pAl med enzymene Hpal og EcoRI, og ligeres med en syntetisk linkérsekvens bestående av de annealerte oligonukleotidene P-artP(5) og P-artP(6). Det resulterende plasmid betegnes pAl-S2.

Den syntetiske promotersekvens i pAl-S2 (svarende til oligonukleotidet P-artP(5)) og tyve baser i de 5'- og 3'-flankerende områder i pAl, er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 11. Innføyelsessekvensen starter i stilling 21 og slutter i stilling 68.

(Den første "T"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2240, den siste "A"-rest i 3'-enden svarer til stilling nr. 2327 i plasmidet pAl-S2.)

På lignende måte fordøyes plasmidet pA2 med enzymene Hpal og EcoRI og ligeres med de annealerte oligonukleotidene P-artP(5) og P-artP(6) som for pAl-S2. Det resulterende plasmid betegnes pA2-S2. Den syntetiske promotersekvens i pA2-S2 (svarende til oligonukleotidet P-artP(6)) og tyve baser i de 5'- og 3'-flankerende områder i pA2, er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 12. Innføyelsen starter i stilling 21 og slutter i stilling 72. (Den første "T"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 2263, den siste "A"-rest i 3'-enden svarer til stilling nr. 2354 i plasmidet pA2-S2.)

Etter innføyelse av en åpen leseramme i et av plasmidene pAl-Sl, pA2-Sl, pAl-S2 eller pA2-S2, kan hele ekspresjonskassetten skjæres ut og innføyes ved tvungen kloning i tilsvarende seter i virusvektoren vdTK. Kassetten kan innføyes i virusgenomet i hvilken som helst av de to orienteringer avhengig av det anvendte kloningsplasmid.

Konstruksjon av plasmider omfattende ekspresjonskassetter med en selektiv markør ( pN2gpt- S3A og pN2gpt- S4): Ved siden av plasmider utformet for tvungen kloning beskrevet ovenfor, ble det konstruert to ytterligere plasmider for overføring av gener i ett unikt (Noti) sete i en poxvirusvektor ved hjelp av det selekterbare markørgen for E. coli- gpt. De gir også to ytterligere poxviruspromoterer ved siden av Sl- og S2-promoterne beskrevet ovenfor.

Plasmidet pN2gpt-S3 A (figur 4.7) kan brukes til å innføye åpne leserammer som mangler sitt eget initieringskodon. Genene som skal overføres til vacciniavirus (gpt-markøren og den åpne leseramme), kan fjernes enten med Noti alene eller med to enzymer, f.eks. Noti og Smal (eller Rsrll eller Apal). Det fjernede fragment innføyes så i det eller de tilsvarende sete(r) i virusvektoren vdTK.

Plasmidet pN2gpt-S4 (figur 4.7) kan brukes til å innføye fullstendige åpne leserammer, inkludert et AUG-translasjonsstartkodon. Kassettene bestående av gpt-markørgenet og den åpne leseramme kan fjernes som beskrevet for pN2gpt-S3A. Promoterne S3A og S4 er modifiserte versjoner av sterke poxvirus-"sen"-promotere. Disse plasmidene ble konstruert ved først å lage plasmidene pN2-gpta og pN2-gptb (figur 4.6) som inneholder et E. cø//-gpt-gen drevet av vacciniavirus-P7.5-promoteren, flankert av flere unike restriksjonsseter inkludert Noti (figur 1.3). Innføyelse av S3A- eller S4-promoterfragmentet i de unike Pstl- og Clal-setene i pN2-gptb, resulterer i plasmidene pN2gpt-S3A og pN2gpt-S4.

Konstruksjon av plasmidene pN2- gpta og pN2- gptb:

Se eksempel 1 og figur 4.6.

Konstruksjon av plasmid pN2gpt- S3A:

Opphavsplasmidet pN2-gptb ble fordøyd med Pstl og Clal og ligert med en syntetisk linkersekvens bestående av oligonukleotidene P-artP(7) og P-artP(8)

(sekvens med identifikasjonsnr. 40). Det resulterende plasmid ble betegnet pN2gpt-S3A.

Den syntetiske promotersekvens i pN2gpt-S3 A (svarende til oligonukleotidet P-artP(7)) og tyve baser i de 5'- og 3'-flankerende områder i pN2-gptb, er vist for pN2gpt-S3A i sekvens med identifikasjonsnr. 13. Den Innføyde DNA-sekvens starter i stilling 21 og slutter i stilling 107. (Den første "T"-rest i 5'-enden svarer til stilling nr. 3328, den siste "A"-rest i 3'-enden svarer til stilling nr. 3454 i plasmidet pN2gpt-S3 A).

Konstruksjon av plasmid pN2gpt- S4:

Plasmidet pN2-gptb ble fordøyd med Pstl og Clal og ligert med en adaptorsekvens bestående av oligonukleotidene P-artP(9) og P-artP(lO) (sekvens med identifikasjonsnr. 41). Det resulterende plasmid ble fordøyd med pN2gpt-S4.

Den syntetiske promotersekvens i pN2gpt-S4 (svarende til oligonukleotidet P-artP(9)) og tyve baser i de 5'- og 3'-flankerende områder i pN2-gptb, er vist i pN2gpt-S4 i sekvens med identifikasjonsnr. 14. Den Innføyde DNA-sekvens starter i stilling 21 og slutter i stilling 114. (Den første "T"-rest i 5'-enden svarer til base #3328, den siste "A"-rest i 3'-enden svarer til stillingsbase #3461 i plasmidet pN2gpt-S4).

Eksempel 5

Ekspresjon av polypeptider i en vacciniavirusvektor ( vdTK) ved direkte molekylær innføyelse av genekspresjonskassetter

Dette eksemplet demonstrerer den letthet hvorved klonede gener kan innføyes i en vacciniavirusvektor (vdTK) ifølge foreliggende oppfinnelse for hurtig dannelse av poxvirusekspresjonskonstruksjoner under anvendelse av direkte molekylær innføyelse av genekspresjonskassetter beskrevet i eksempel 4. Her er bruk av vdTK-vektorkassettsystemet for å lage konstruksjoner for å uttrykke flere bestemte modellpolypeptider, beskrevet, inkludert humane blodproteiner (protrombin og varianter av plasminogen) og et humant virusantigen (HIV gpl60).

Konstruksjon av et modifisert vacciniavirus ( vPTl) som uttrykker humant protrombin: Humant protrombin (PT) tjener som en modell for fremmedproteinekspresjon i en vacciniavirusvektor ifølge foreliggende oppfinnelse. Et cDNA-kodende protrombin er tidligere blitt påvist å være uttrykkbart ved hjelp av et konvensjonelt konstruert, rekombinant vacciniavirus, som beskrevet i PCT/EP91/00139 av Falkner et al. ("Falkner-søknaden").

En modifisert protrombin-cDNA fjernes som et 2,0 kb EcoRI-fragment fra plasmidet pTKgpt-PTHBb, og innføyes i det eneste EcoRI-sete i plasmidet pAl-Sl (eksempel 4, figur 4.4), noe som resulterer i plasmidet pAlSl-PT (figur 5.1). I ekspresjonskassetten til dette plasmidet drives protrombin-cDNA-en av den syntetiske poxviruspromoter Sl som også gir et translasjonsinitieringskodon.

Sekvensen til humant protrombin er blitt publisert: Degen S. J. F., MacGillivray R. T. A. & Davie, E. Biochemistry, 22, s. 2087-2097 (1983). Denne sekvensen er tilgjengelig i EMBO-databiblioteket under identifikasjonen (ID) HSTHR1. Sekvensen i ID HSTHR1 er ikke fullstendig; den mangler de første 19 bp i det protrombinkodende området. Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har sekvensert den manglende del i cDNA-en i ID HSTHR1 og presenterer denne nedenunder.

Pga. de mange modifikasjoner og baseendringer er den hele sekvensen til foreliggende humanprotrombin-cDNA-klon, inkludert Sl-promoteren og de 20 basene i plasmidflankerende sekvenser, vist i sekvens med identifikasjonsnr. 15.

Ved hjelp av fremgangsmåtetrinnene skissert i Falkner-søknaden (PCT/EP91/00139), ble cDNA-en modifisert på følgende måte: to tilleggskodoner (basene #22-27) ble innført, noe som resulterte i inkorporeringen av to nye aminosyrer; den 3'-utranslaterte sekvens ble fjernet ved innføring av et EcoRI-sete: basene #1963-1965 (#1920-1922 ID HSTHR1) ble endret fra TGG til GAA ved stedrettet mutagenese.

Én baseparendring ble funnet i foreliggende PT-cDNA som resulterer i et nytt Ncol-sete: base #525 (#482 i ID HSTHR1) endres fra C til A. Dette er en stille mutasjon ettersom CCC-kodonet (Pro) endres til CCA (Pro), noe som resulterer i et nytt Ncol-sete. (Den første base i sekvens med identifikasjonsnr. 15 fra pAlSl-PT svarer til base #2394 og den siste base til #4381 i den fullstendige sekvens til plasmid pAlSl-PT.)

For overføring i vacciniavirusvektoren vdTK fjernes kassetten fra plasmidet pAlSl-PT med Noti- og Rsrll-endonukleaser og isoleres etter separasjon på en agarosegel med lavt smeltepunkt. Virusvektoren vdTK-DNA spaltes med Noti og Rsrll, ekstraheres med fenol og utfelles med etanol. Det lille Notl-Rsrll-sammenknyttende fragment i multippelkloningssetet i vektor-DNA-en går tapt under etanolutfellingstrinnet. Vacciniavektorarmene ligeres med et tyve gangers molart overskudd av kassett. Innpakking av ligert vacciniavirus-DNA med fjærfekopperhjelpervirus i kyllingceller er beskrevet i eksempel 3. Innpakkede virus fra plakker fremstilt ved infeksjon av CV-1-celler plakkrenses igjen og det fremstilles små ubehandlede forråd. Virusisolatene kan analyseres videre ved hjelp av "Southern blotting" og ekspresjonsanalyse som beskrevet i Falkner-søknaden. Et virusisolat med den korrekte genomstruktur for innføyelse av protrombin-cDNA-en betegnes vPTl. Et lignende rekombinant vacciniavirus fremstilt ved hjelp av markørredning induserte protrombinekspresjon i Vero-celler ved aktivitetsnivåer på ca. 50-60 mU/ml cellekultursupernatant. Se Falkner-søknaden.

Konstruksjon av et vacciniavirus ( vGPgl) som uttrykker humant glu- plasminogen: Den naturlig forekommende form av plasminogen (Pg) har en aminoende som starter med aminosyren glutaminsyre (glu) og kalles derfor glu-plasminogen (glu-Pg). En delvis bearbeidet form av plasminogen som mangler de første 77 aminoende-aminosyrene (aktiveringspeptidet), kalles lys-plasminogen (lys-Pg). Affiniteten til lys-Pg for dets substrat fibrin, er mye høyere enn affiniteten til glu-Pg. I tillegg er rekombinant lys-Pg betydelig mer stabilt enn glu-Pg i supernatanter fra cellekulturer infisert med en (konvensjonell) vacciniarekombinant som bærer glu-Pg-genet.

Den komplette humanplasminogen-cDNA (inkludert dens translasjonsstart- og -stoppkodoner) ble fjernet fra et plasmid (phPlas-6) som et Ball-Smal-fragment. Sekvensen til humanplasminogen er blitt publisert av Forsgren M, Raden B, Israelsson M, Larsson K «fe Heden L-O, FEBS Letters, 213, s. 254-260

(1987), og er tilgjengelig i EMBO-databiblioteket (GenBank) under identifikasjonen (ID) HSPMGR. Sekvenser i dette plasmidet er derfor ikke blitt inkludert i foreliggende sekvensliste, ettersom dette plasmidet ikke er en unik kilde for plasminogen-DNA-sekvensen. Det kodende området i foreliggende plasminogensekvens atskiller seg imidlertid fra den publiserte sekvens i det minste i ett nukleotid: "A"-resten i stilling #112 (ID HSPMGR) er en "G"-rest i foreliggende DNA, noe som resulterer i en aminosyresubstitusjon (Lys—>Glu).

Plasminogen-cDNA-en ble innføyd i Hpal-setet i plasmidet pN2gpt-S4 (eksempel 4, figur 4.7) som ble valgt ut for å konstruere en genekspresjonskassett med en selekterbar markør, ettersom plasminogen-cDNA-en inneholder to Apal-seter og ett Rsrll-sete og derfor ikke muliggjør bruken av ekspresjonskassettene utformet for

tvungen kloning. Det resulterende plasmid ble betegnet pN2gpt-GPg (figur 5.2).

Det sammenknyttende området i S4-promoteren som omfatter initieringskodonet til plasminogen (base #32 i denne listen; base #55 i ID HSPMGR), er vist for pN2gpt-GPg i sekvens med identifikasjonsnr. 17. Det kodende området i glu-plasminogen ble utelatt i sekvenslisten. Sekvensen fortsetter med stoppkodonet (base #35 i denne listen; base #2485 i ID HSPMGR) og 25 baser i den 3'-utranslaterte plasminogensekvens. Denne sekvensen etterfølges av 29 baser i multippelkloningssetet i phPlas6 og av 20 baser i multippelkloningssetet i plasmid pN2gpt-S4.

For å overføre glu-plasminogengenkassetten til et vacciniavirusgenom isoleres Notl-fragmentet i pN2gpt-GPg, som inneholder de to genene og deres promotere (P7.5-promoteren som regulerer gpt-utvelgelsesmarkøren, og S4-promoteren som regulerer glu-plasminogengenet), fra en agarosegel med lavt smeltepunkt og renses. Denne kassetten ligeres med armer av vacciniavirus vdTK-DNA kuttet med Noti. Innpakking og plakkrensing er beskrevet i eksempel 3. Et virus med den korrekte stiiiktur for den innføyde plasminogen-genkassett betegnes vN2gpt-GPg. Dette viruset brukes for ekspresjon av plasminogen i CV-1-celler, som beskrevet for et analogt vacciniavirus konstruert ved hjelp av markørredningsteknikker. Utskilt glu-Pg i cellekultursupernatanter ble påvist ved et nivå på ca. 1,5 \ xglIO6 celler etter 24 timers infeksjon med et konvensjonelt konstruert vacciniavirus under standardbetingelser for dyrking av vacciniavirus vektorer for ekspresjon av fremmed-proteiner i cellekultur, glu-plasminogenet i cellekultursupernatanten var bare påvisbar i nærvær av en proteaseinhibitor (50 ug/ml aprotinin).

Konstruksjon av et vacciniavirus ( vLPgl) som uttrykker humant lys- plasminogen: En sekvens som koder for lys-plasminogen, ble fremstilt ved delesjon av det 231 bp-store kodende området for de første 77 aminosyrene (Glul-Lys77) i plasminogen fra den komplette plasminogen-cDNA, som vist i figur 5.3. Denne sekvensen ble innføyd i genekspresjonskassetten i et plasmid (pN2gpt-S4) som har et selekterbart markørgen ( E. coli- gpt), resulterende i plasmidet betegnet pN2gpt-LPg (figur 5.3).

I dette plasmidet er forsekvensen (som koder for signalpeptidet som medierer sekresjon) direkte fusjonert med det første nukleotidet i lysinrest 78 i plasminogen. Det nye signalpeptidspaltningssete dannet ved fusjonen, er lik med mange kjente signalspaltningsseter. Se f.eks. von Heinje, Eur. J. Biochem., 133, s. 17-21 (1983).

I tillegg ble et Ncol-sete innført på stedet for initieringskodonet i Pg-cDNA for å lette kloning i det eneste Ncol-sete i plasmidet pN2gpt-S4, og for å oppnå den optimale sammenheng mellom promoteren og det Pg-kodende område. For å lette fjerning av Pg-cDNA med Ncol, ble ett av de to innvendige Ncol-seter (NcoI(2); figur 5.3) deletert fra Pg-cDNA-en på følgende måte.

Plasmidet phPlas6 ble overført til E. co//-stamme NM522 og enkelttråd-DNA ble fremstilt ved superinfeksjon med hjelperfagen M13K07. Den første runde med mutagenese ble gjort med to oligonukleotider, oNcol og oNco2, under anvendelse av den enkelttrådede phPlas6-DNA som et templat, med et kommersielt tilgjengelig mutagenesesett (Amersham, Inc.). Oligonukleotidet Ncol omdanner to A-rester oppstrøms fra plasminogenstartkodonet til to C-rester, resulterende i et Ncol-sete rundt startkodonet uten å endre det kodende området i plasminogenforsekvensen. Oligonukleotidet oNco2 omdanner en T- til en C-rest i det interne Ncol-sete (NcoI(2)) i Pg-cDNA-en, hvorved man fikk en stille mutasjon som inaktiverer dette Ncol-sete.

Det kodende område for aminosyrene 1-77 i plasminogen ble deletert ved et andre "loop-out"-mutagenesetrinn under anvendelse av 42-basers oligonukleotid oNco3. Alle mutasjoner ble bekreftet ved sekvensering og restriksjonsanalyse.

Plasmidet som har de tre mutasjonene, phLplas, ble linearisert med Smal og delvis fordøyd med Ncol. Det 2,2 kb-store NcoI-Smal-fragment ble isolert og innføyd i plasmid pN2gpt-S4 som var blitt kuttet med Ncol og Smal. Det resulterende plasmid ble betegnet pN2gpt-LPg.

Pga. de mange modifikasjonene i plasminogen-cDNA-en i pN2gpt-LPg, er den fullstendige sekvens til NcoI-Smal-fragmentet i pLplas, inkludert 20 baser i S4-promoteren og 20 baser i det nedstrøms plasmidområde i pN2gpt-S4, vist i sekvens med identifikasjonsnr. 18. Plasminogen-cDNA-sekvensen ble modifisert på følgende måte: de tidligere to A-restene i stillingene #19 og #20 (basene #53 og 54 i ID HSPMGR) ble endret til to C-rester, resulterende i et Ncol-sete; base #21 i denne listen (#55 i ID HSPMGR) er A-resten i plasminogenstartkodonet: base #2220 (base #2485 i ID HSPMGR) er T-resten i stoppkodonet; base #111 i ID HSPMGR (base #77 i denne listen) ble knyttet sammen med base #343 i ID HSPMGR (base #78 i denne listen), resulterende i delesjon av sekvensen som koder for "aktiveringspeptidet"; T-resten #926 (base #1191 i ID HSPMGR) ble endret til en C-rest (konservativ utbytting), resulterende i forsvinning av et intern Ncol-sete.

For å overføre lys-plasminogen-genkassetten til et vacciniavirusgenom, ligeres Notl-fragmentet i pN2gpt-LPg inneholdende genekspresjonskassetten bestående av to promotergen-kombinasjoner (P7.5-promoter-gpt-genet og S4-promoter-lys-plasminogengenet) med Notl-spaltet vacciniavirus-vdTK-vektor-DNA og innpakkes som beskrevet i eksempel 7. Isolatet som har den korrekte struktur for den innføyde genkassett, betegnet vN2gpt-LPg, brukes for ekspresjon av lys-plasminogen i CV-1-celler under betingelser tidligere anvendt for en konvensjonelt konstruert rekombinant under standardbetingelser for dyrking av vacciniavirus-ekspresjonsvektorer for fremstilling av proteiner i cellekultur. Utskilt lys-Pg i cellekultursupernatanter ble påvist ved et nivå på ca. 1,0-2,0 ug/10<6> celler etter 24

timers infeksjon med den konvensjonelle rekombinant, lys-plasminogenet i cellekultursupernatanten var stabilt uten tilsetning av en proteaseinhibitor.

Konstruksjon av et vacciniavirus ( vgp 160- 1) for å uttrykke humant immunsviktvirusglykoprotein 160 ( HIV gpl60): Den komplette åpne leseramme i HIV gp 160 fas på et 2,5 kb-stort EcoRV-fragment fjernet fra replikativ form (RF) DNA fra en M13-fag [mpPEenv;

Fuerst et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2538-2544 (1987)]. Dette fragmentet innføyes i

plasmidet pN2gpt-S4 som skissert i figur 5.4.1 det resulterende plasmid, pN2gpt-

gpl60, reguleres gpl60-genet av den syntetiske vacciniaviruspromoter S4.

Sekvensen til HIV gpl60 er blitt publisert av Råtner, L. et al., Nature,

313, s. 277-284 (1985). Sekvensen til klon BH8 er tilgjengelig i EMBO-

databiblioteket (GenBank) under identifikasjonen (ID) HIVH3BH8. gpl60-sekvensen er derfor ikke inkludert i sekvens med identifikasjonsnr. 19, men det sammen-

knyttende området i S4-promoteren og et EcoRV HIV-gpl60-fragment inkludert initieringskodonet til gpl60-gen (base #28 i denne listen; base 226 i ID HIVH3BH8),

er vist. EcoRV HIV-gpl60-fragmentet stammer fira M13-fagen (replikativ form)

mpPEenv beskrevet i Fuerst, T. R., Earl, P. «fe Moss, B., Mol. Cell. Biol., 7, s. 2538-

2544 (1987). Sekvensen fortsetter med stoppkodonet (base #31 i denne listen; base #2779 i ID HIVH3BH8) og halvparten av det nedstrøms EcoRV-sete. Denne sekvensen etterfølges av 20 baser i multippelkloningssetet til plasmid pN2gpt-S4. Den første base (T) i denne listen svarer til base #3368, den siste basen (G) til #5973 i sekvensen til pN2gpt-gpl60.

For å overføre HIV gpl60-genekspresjonskassetten til et

vacciniavirusgenom ligeres Notl-fragmentet, som inneholder begge

genpromoterkombinasjonene (P7.5-promoter-gpt-utvelgelsesmarkøren og S4-promoter-gpl60-genet), med Notl-spaltet DNA fira vacciniavirusvektoren vdTK og innpakkes som beskrevet i eksempel 7. Et isolat med den korrekte irmføyelsesstruktur i kassetten, betegnet vN2gpt-gpl60, brukes for ekspresjon av gp 160 i celler fra afrikansk grønnape (Vero) under betingelser som tidligere er blitt brukt for en konvensjonelt konstruert rekombinant. Barrett et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 6, s. 159-171 (1989).

Konstruksjon av en vacciniavirusvektor som sørger for screening med hensyn på modifiserte virus som bærer innføyelser, ved saminnføyelse av et lacZ- gen:

For å demonstrere screeningen med hensyn på innføyelse ved

saminnføyelse av et E. cø//-lacZ-gen i kombinasjon med den styrte kloningsfremgangsmåte, gir plasmidet pTZgpt-S3 AlacZ en nyttig modellkonstruksjon (figur 5.5). Plasmidet pTZ19R (Pharmacia, Inc.) ble kuttet med Pvul 1 og det store 2,5 kb vektorfragment ble fremstilt og ligert med Notl-linkere (Boehringer, Inc.). Det resulterende plasmid, pTZ-N, har en delesjon i multippelkloningssetet som er lokalisert innenfor sekvensene i alfa-komplementeringspeptidet i pT219R-plasmidet. Mulige rekombinasjonshendelser mellom lacZ-genet som skal innføyes i pTZ-N, og sekvensene i alfa-komplementeringspeptidet er derfor utelukket.

For å konstruere en genekspresjonskassett for direkte molekylær kloning fjernes det 1,2 kb-store Notl-fragment som inneholder gpt-genkassetten, og S3A-promoteren fra pN2gpt-S3A (eksempel 4) og innføyes i pTZ-N, resulterende i plasmidet pTZgpt-S3A. Det 3,0 kb-store EcoRI-lacZ-fragment (fjernet fra plasmid pTKgpt-FlsB; Falkner & Moss, 1988) innføyes i det eneste EcoRI-sete i pTZgpt-S3A. Det resulterende plasmid betegnes pTZgpt-S3AlacZ.

Det 4,4 kb-store Notl-fragment i dette plasmidet, bestående av de to markørgenene ( E. coli- gpt og -lacZ), ligeres med Notl-spaltet DNA fra virus-vdTK (eksempel 4). Ligerings- og innpakkingsbetingelsene er beskrevet i eksempel 3. Det beregnede utbytte av modifiserte virus i tilfellet med gpt-utvelgelse er beskrevet i eksempel 3.

En ytterligere vacciniavirusvektor ble konstruert på følgende måte. Plasmidene pTZS4-lacZa og pTZS4-lacZb ga nyttige modellkonstruksjoner (figur 5.6). Plasmid pTZ-N ble konstruert som ovenfor. Genekspresjonskassetten, det 1,2 kb-store Notl-fragment som inneholder gpt-genkassetten, og S4-promoteren ble fjernet fra pN2gpt-S4 (eksempel 4) og innføyd i pTZ-N, resulterende i plasmidet pTZgpt-S4. Et 3,3 kb-stort Smal-StuI-lacZ-fragment ble fjernet fra plasmid placZN<*> som var konstruert ved fordøyelse av plasmidet pFP-Zsart (europeisk patentsøknad nr. 91 114 300.6, Recombinant Fowlpox Virus) med Noti og ligering av pFP-Zsart med oligonukleotidetP-Notl (5-GGCCAT-3'). Dette 3,3 kb-store Smal-StuI-lacZ-fragment ble innføyd i det eneste Smal-sete i pTZgpt-S4. De resulterende plasmider ble betegnet pTZS4-lacZa og pTZS4-lacZb.

Det 4,5 kb-store Notl-fragment fira dette plasmidet ble ligert med den Notl-spaltede DNA fra virus-vdTK og innpakket som beskrevet ovenfor.

Kombinasjonen av lacZ- og gpt-utvelgelse i et eneste kloningstrinn byr ikke på noen fordel ettersom alle gpt-positive plakker vil inneholde lacZ-genet. For konstruksjonen av virus med innføyelser på forskjellige steder, er det imidlertid ønskelig med en andre screeningsfremgangsmåte. Markøren av første valg er gpt-markøren, men lacZ-screening byr på en alternativ fremgangsmåte for påvisning av innføyelser, f.eks. når målvirusgenomet allerede inneholder en kopi av en selekterbar

markør, slik som E. cø/z-gpt-genet.

For slik screening plates to ml av 1/10, 1/100 og 1/1.000 fortynninger av ubehandlede virusforråd fremstilt etter innpakking (se eksempel 3) ut på 30 store (diameter på 8,5 cm) petriskåler (10 petriskåler pr. fortynning). Blåplakkanalysen gjøres i henhold til standardfremgangsmåter. Chakrabarti, S., Brechling, K. & Moss, B., Mol. Cell. Biol. 5, s. 3403-3409 (1985).

Eksempel 6

Konstruksjon av en vacciniavirusvektor ( vS4) med et rettledende masterkloningssete under transkripsjonskontroll av en sterk " sen"- vacciniaviruspromoter

Foreliggende eksempel beskriver en vacciniaviruskloningsvektor (vS4) som er utformet for direkte molekylær innføyelse av en komplett åpen leseramme i et masterkloningssete som er funksjonelt bundet til en vacciniaviruspromoter. Bruk av denne vektoren i henhold til fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse, muliggjør følgelig innføyelse av gener direkte i en poxvirusvektor uten separat konstruksjon av et innføyelsesplasmid, som krevet ved konvensjonell konstruksjon av rekombinante poxvirus ved intracellulær rekombinasjon. Denne vektoren forebygger også behovet for separat konstruksjon av en genekspresjonskassett for overføring til en vacciniavirusvektor ved direkte molekylær innføyelse, som beskrevet ovenfor.

Masterkloningssetet i vektor S4 befinner seg i det genetisk stabile sentralområdet i vacciniavirusgenomet og består av flere spaltningsseter som er unike i vektoren og som derved muliggjør rettledende innføyelse. S4-promoteren umiddelbart oppstrøms fra masterkloningssetet er en sterk syntetisk variant av en "sen"-vacciniaviruspromoter. Denne ekspresjonsvektoren er egnet for direkte kloning og ekspresjon av store åpne leserammer som omfatter et translasjonsstartkodon, som illustrert her ved hjelp av en cDNA som koder for et humant blodprotein, von Willebrand-faktoren (vWF).

Konstruksjon av vacciniavirusvektoren vS4:

En adaptor som inneholder den syntetiske vacciniaviruspromoter S4, innføyes i vacciniavirusvektoren vdTK (eksempel 4, figur 4.1) i det unike Notl-sete (figur 6.1). Innføyelse av de utvalgte adaptoroligonukleotider inaktiverer det oppstrøms Notl-sete, mens det nedstrøms Notl-sete forblir funksjonelt som et unikt kloningssete.

Nærmere bestemt spaltes DNA (1 ug) fra vektoren vdTK (eksempel 4, figur 4.1) med Noti og ligeres med (0,5 ug) annealerte oligonukleotider P-artP(l 1)

(sekvens med identifikasjonsnr. 38) og P-artP(12) (sekvens med identifikasjonsnr. 39). Ligeringsblandingen innpakkes og plakker identifiseres som beskrevet i eksempel 3.

Plakker underkastes PCR-screening som beskrevet (eksempel 4, identifikasjon av virus-vdTK ved PCR-screening). Et isolat med innføyelsen i den korrekte orientering betegnes vS4.

Innføyelse av von Willebrand- faktor- cDNA- en i vS4:

Plasmid pvWF inneholder den komplette von Willebrand-faktor-cDNA flankert av Notl-seter. Sekvensen til human-vWF er blitt publisert: Bonthron, D. et al., Nucl. Acids Res., 14, s. 7125-7128, 1986). Sekvensen er tilgjengelig i EMBO-databiblioteket under identifikasjonen (ID) HSVWFR1. Sekvens med identifikasjonsnr. 20 viser sammenknyttingen i virusgenomet av vvWF fra virus-S4-promoteren og det 5'-utranslaterte område i den foreliggende vWF-cDNA i plasmidet pvWF opp til translasjonsstartkodonet (base #249 i denne listen, base #100 i ID HSVWFR1). Det kodende , området i vWF ble utelatt i foreliggende sekvensliste. Sekvensen fortsetter med stoppkodonet (base #252; base #8539 i ID HSVWFR1) og den 3'-utranslaterte sekvens opp til Notl-setet (base #304) og tyve baser med overlapping med 3'-området i virusgenomet til vvWF.

vWF-cDNA-fragmentet frigjøres med Noti, isoleres og ligeres med vS4-vektor-DNA som er blitt spaltet med Noti og behandlet med fosfatase, som illustrert i figur 6.2.

Ett u,g ligert DNA pakkes som beskrevet i eksempel 7. Plakker plukkes

ut og analyseres ved hjelp av PCR-screening. Den første primer for PCR-reaksjonen er oligonukleotid odTK2 som befinner seg ca 300 bp oppstrøms fra tk-genet; revers-primeren ovWFl befinner seg i vWF-genet ca. 50 bp nedstrøms fra initieringskodonet. PCR-amplifikasjon inntrer bare når vWF-innføyelsen er i den korrekte orientering i forhold til S4-promoteren i vektoren. PCR-positive plakker identifiseres og analyseres videre. Dersom utbyttet av ønsket modifisert virus er lavt, i størrelsesorden 0,1-0,01

%, så kan de alternativt identifiseres ved hjelp av in szfø-plalddiybridiseringsmetoder tilpasset fra de som er kjent innen teknikken. Se f.eks. Villareal, L. P. & Berg, P. Science, 196, s. 183-185 (1977).

En virusklon som har cDNA-innføyelsen ved hjelp av PCR eller hybridisering og som videre oppviser det forventede restriksjonsmønster med Pvull, betegnes vvWF. Slike vektorer kan testes med hensyn på ekspresjon av von Willebrand-faktor som beskrevet for andre humanproteiner i eksempel 5, passende modifisert i henhold til prinsipper for genteknikk som er godt kjent av fagfolk innen teknikken.

Eksempel 7

Heterolog innpakking av ortopox( vaccinia)- virusgenom- DNA ved hjelp av et avipox( fjærfekopper)- hjelpervirus og samtidig utvelgelse med hensyn på modifisert virus i vertsceller av en art hvor hjelperviruset ikke kan replikere

Eksempel 3 beskriver innpakking av modifisert vacciniavirus-DNA med fjærfekopperhjelpervirus i fugleceller og påfølgende isolering av avkomvirusplakker i pattedyrceller (CV-1) hvor avipoxhjelperviruset ikke kan replikere. Det foreliggende eksempel illustrerer innpakking av vacciniavirus-DNA ved hjelp av fjærfekopper direkte i CV-1-celler, hvorved samtidig innpakking og vertsområdeutvelgelse for innpakkede virus muliggjøres. Ved siden av å eliminere hjelpervirus fra startforrådet av avkom, omgår denne fremgangsmåten det tidkrevende behov for å fremstille primærkulturer av kyllingembryofibroblaster for hvert innpakkingsforsøk. I stedet kan også kontinuerlige pattedyrcellelinjer som er vanlig brukt for vacciniavirusreplikasjon, også brukes for innpakking av vacciniavirus med fjærfekopperhjelpervirus.

Det er kjent at fjærfekoppervirus (FPV) replikerer fullstendig bare i fugleceller; ikke noe synlig avkomvirus fas fra infiserte pattedyrceller. Det nøyaktige punkt i livssyklusen til FPV hvor replikasjon avbrytes i pattedyrceller, er ikke kjent. FPV er imidlertid kjent for å produsere virusproteiner i pattedyrceller og til og med indusere beskyttende immunitet i pattedyr når det brukes som en levende vaksine. Taylor et al., Vaccine, 6, s. 497-503 (1988). FPV har ikke desto mindre blitt påvist tidligere å ha en evne til innpakking av heterolog poxvirusgenom-DNA, særlig direkte fremstilt vacciniavirus-DNA.

I et innledende forsøk ble CV-1-celler (5 x IO<6>) infisert med én pfu/celle av fjærfekoppervirus (stamme HP 1.441) og inkubert i én time. Deretter ble en kalsiumfosfatutfelling (én ml inneholdende ett ug vacciniavirusvilltype-DNA) transfisert i de infiserte celler. Etter 15 min ved romtemperatur ble det tilsatt 10 ml medium (DMEM, 10 % kalvefosterserum). Cellene ble inkubert i fire timer og mediet ble byttet ut. Cellene ble så inkubert i seks dager og et ubehandlet virusforråd ble fremstilt. Avkomviruset ble titrert på CV-1-celler. Typiske vacciniaplakker var synlige etter to dager.

Innpakkingseffektivitetens avhengighet av mengden av genomvirus-DNA ble bestemt over et område med DNA-mengder fira 0,1-10 ug pr. 5 x IO<6> CV-1-celler. Se figur 7.1. DNA-mengder over 1 jag (f.eks. 10 jag) ga en grov kalsiumfosfatutfelling som reduserte transfeksjonseffektiviteten uttrykt i pfu/ug av tilført DNA. Figur 7.1.

Avhengigheten til utbyttet av det innpakkede vacciniavirus av inkubasjonstiden for innpakking, ble analysert ved å bruke en konstant mengde vacciniavirusvilltype-DNA (1 ug) og en konstant mengde FPV-hjelpervirus

(1 pfu/celle) under betingelsene beskrevet ovenfor for startforsøket i dette eksemplet, bortsett fra at mediet tilsatt 15 minutter etter transfeksjon ble byttet ut etter fire timer og cellene ble så inkubert i ytterligere 1-5 dager før fremstilling av et forråd av ubehandlet virus (totalvolum 2 ml). Virusforråd fra kontrollceller infisert med FPV alene og inkubert i 5 dager ga ingen synlige plakker. Dette forsøket ble gjentatt tre ganger og et typisk resultat er vist i tabell 7.1 nedenunder.

Titeren for innpakket vacciniavirus påvist ved hjelp av plakkanalyse på pattedyrceller (CV-1) økte kontinuerlig fra ca. IO<2> pfu/ml ved 24 timer til ca. 2 x IO<7 >etter 120 timer. Inkubasjonstider i området 48-72 timer ga passende nivåer med innpakket vacciniavirus (mellom IO<4> og IO<6> pfu/ml) og er derfor egnet for rutineinnpakking av vacciniavirus-DNA ved hjelp av fjærfekoppervirus i pattedyrceller.

Vaccinia-DNA kan pakkes i pattedyrceller som er forgjeves infisert med fjærfekoppervirus. Det ble påvist tidligere at fjærfekoppervirus også kan infisere pattedyrceller, men viruslivssyklusen fullføres ikke i disse ikke-typiske vertsceller. Avhengig av celletypen stanser virusvekst enten i det tidlige eller det sene stadium og synlig fjærfekoppervirus dannes ikke (Taylor et al., 1988). Disse funnene forårsaket en undersøkelse i pakking av vaccinia-DNA i en kontinuerlig pattedyrcellelinje.

Sammenflytende monolag av CV-1-celler ble infisert med 0,05 pfu pr. celle av FPV-stammen HP 1.441 og så transfisert med en ligeringsblanding bestående av Notl-spaltet vacciniavirus-DNA og en gpt-genkassett med Notl-flankerende seter. Nærmere bestemt ble vaccinia-DNA (1 jag) fordøyd med Noti og ligert med angitte mengder av innføyelse-DNA (P7.5-gpt-genkassett). Det unike Notl-sete i vacciniavirus befinner seg i et intergenområde i HindIII-F-fragmentet. Goebel, et al., Virology, 179, s. 247 (1990). Etter inkubasjon i tre dager ble cellene høstet og forrådet av ubehandlet virus ble titrert på CV-1-celler i nærvær (+MPA) og i fravær (-MPA) av gpt-selektivt medium. Resultatet er oppsummert i tabell 7.2.

Det viktigste resultat var at fjærfekoppervirus kunne pakke den modifiserte vaccinia-DNA i en celletype som forhindrer dens egen vekst. Dessuten var utbyttet av kimærplakker i området 5-10 %. Dette stemmer godt overens med den klassiske in vzvo-rekombinasjonsteknikk hvor vanligvis ca. 0,1 % av de totale plakker er rekombinanter. Ligering av vektorarmene alene (tabell 7.2, forsøk nr. 5) resulterte i en høyere titer sammenlignet med ligeringsforsøkene 1-4 med innføyelse, sannsynligvis pga. mangel på tilstedeværende forurensninger i de agaroserensede innføyelsesmolekyler.

Noen av de isolerte virus ble plakkrenset og ytterligere karakterisert. De oppviste de typiske Hindlll-restriksjonsmønstre hos vacciniavirus og i tillegg fremmedgenbånd som er karakteristiske for de to mulige orienteringene av enkelt-innføyelsen. Med innføyelse i Notl-setet ble ingen virus med multippelinnføyelser observert.

Heterologt pakkede kimærvacciniavirus krysshybirdiserer ikke med fjærfekoppervirus. For å undersøke effektene av heterolog innpakking ved hjelp av FPV på strukturen til kimærvacciniavirus, ble DNA-er fra isolatene F13.4, F12.5, F13.2, F13.2 og F 12.4, sammen med DNA-er fra fire rensede isolater fra Notl-kloningsforsøket og fjærfekopperviruskontrollene, fordøyd med Hindlll, og de resulterende fragmenter ble separert ved elektroforese og analysert ved hjelp av "Southern"-hybridisering med en fjærfekoppervirusprobe fremstilt fra sukrosegradientrensede virioner. Ingen krysshybirdisering av vacciniavirusene med FPV-DNA ble observert.

Eksempel 8

Homolog innpakking av kunstig fremstilt vacciniavirusgenom- DNA ved hjelp av en vacciniavirusvetrsområdemutant ( vdhr) som er ute av stand til å replikere i en human cellelinje

Foreliggende eksempel illustrerer konstruksjon og utnyttelse av et hjelperpoxvirus bestående av delesjoner som begrenser dets vertsområde, særlig evnen til å replikere i visse humancellelinjer. Modifisert vacciniavirus som er fritt for hjelpervirus, kan derfor fremstilles ved innpakking av vektor-DNA med dette mutanthjelpervirus og isolere kloner av det fremstilte virus ved å infisere passende humanceller.

Dette mutante hjelpervirus er avledet fra vertsområdemutanter av vacciniavirus som er ute av stand til å replikere i mange forskjellige humanceller, og som oppviser endrede cytopatiske effekter på mange andre celler som er mottakelige for infeksjon av villtypevacciniavirus. Se f.eks. Drillien et al., Virology, 111, s. 488-499 (1981). Nærmere bestemt omfatter genomet i dette hjelperviruset mutasjoner av to. vertsområdegener som til sammen forhindrer det fra å replikere i humanceller (MRC 5) hvor bare vacciniavirusgenomer med minst ett intakt vertsområdegen kan replikere.

Konstruksjon av vertsområdemutantvacciniaviruset vdhr:

Genomlokaliseringen og DNA-sekvensen i ett vacciniavirusgen som er påkrevd for replikasjon i humanceller, er blitt beskrevet av Gillard et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 5573-5577 (1986). Nylig er dette genet blitt betegnet KIL (Goebel et al., 1990). Et andre vacciniavirusvertsområdegen er blitt kartlagt [Perkus et al., J. Virology, 63, s. 3829-2836 (1990)]. Dette andre gen (betegnet C7L ifølge Goebel et al., 1990) ligger i et område som omfatter deler av Hindlll C- og Hindlll N-fragmentene. Dette området er deletert i vacciniavirus-WR6/2-stammen [Moss et al., J. Virol. 40, s. 387-395 (1981)]. Stamme WR-6/2 mangler derfor C7L-vertsområdegenet.

Hjelperviruset vdhr som mangler både KIL- og C7L-vertsområdegenene, er konstruert fra den C7L-negative stamme WR-6/2 ved hjelp av markørretning med et modifisert EcoRI-K-fragment hvorfra KIL-vertsområdegenet er deletert. Se figur 8.1. Dette modifiserte EcoRI-K-fragment omfatter et selektivt markørgen ( E. coli- gpt-genet) for å lette utvelgelse med hensyn på modifiserte WR-6/2-genomer som omfatter det modifiserte EcoRI-K-fragment, ved å bruke intracellulær markørredning som beskrevet av Sam & Dumbell, 1981. En betinget letal mutant som mangler evnen til å vokse i humane cellelinjer, er også blitt beskrevet av Perkus et al., 1989.

Nærmere bestemt subklones det 5,2 kb-store EcoRI-K-fragment av vacciniavirusvilltype-DNA i plasmidet pFP-tkl8i. Det resulterende plasmid betegnes pFP-EcoKl. Vacciniavirusvertsområdegenet KIL (Gillard et al., 1986) deleteres og samtidig innføres et unikt Notl-sete ved "loopout"-mutagenese under anvendelse av oligonukleotidet P-hr(3) (sekvens med identifikasjonsnr. 42). Det resulterende plasmid betegnes pEcoK-dhr.

Plasmidet pFP-tkl8i ble konstruert ved modifikasjon av plasmidet pFP-tk-10.4 (se Falkner et al., europeisk patentsøknad nr. 89 303 887.7, publikasjon EPA 0 338 807, eksempel 3 på side 8). Plasmid pFP-tkl0.4 ble fordøyd med Ncol og ligert; med en adaptor bestående av annealerte nukleotider P-Ncol(l) og P-NcoI(2), resulterende i innføringen av multippelkloningssete i det eneste Ncol-sete i FPV-tk-genet med restriksjonsendonukleasespaltningssetene EcoRI, Noti og Hindlll.

Sekvensen til vacciniavirus er blitt publisert av Goebel, S. J. et al., Virology, 179, s. 247-266 (1990). Den er tilgjengelig i EMBO-databiblioteket (GenBank) under aksesjonsnr. M35027. Sekvensen til vacciniavirusvertsområdegenet KIL er blitt publisert av Gillard. S. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 5573-5577 (1986) og er tilgjengelig i EMBO-databiblioteket (GenBank) under identifikasjonen (ID) PXVACMHC. Den kodende sekvens til KIL-genet er derfor ikke inkludert i sekvens med identifikasjonsnr. 21.1 pEcoK-dhr er KIL-genet deletert og erstattet med et Notl-sete. Det sammenknyttende området mellom PXVACMHC-sekvensen og Notl-seteinnføyelsen er vist (basene #1-20 i denne listen, svarende til basene #72-91 i ID PXVACMHC). Det kodende område i KIL ble deletert og erstattet med et Notl-sete etterfulgt av to G-rester (basene #21-30 i sekvenslisten). Sekvensen fortsetter med 20 bp flankeringsområde (basene #31 -50 i denne listen; basene #944-963 i ID PXVACMHC).

I et ytterligere trinn lineariseres pEcoK-dhr med Noti og ligeres med en 1,1 kb-stor P7.5-gpt-genkassett avledet fra plasmid pN2-gpta (eksempel 4) ved Notl-fordøyelse. Det resulterende plasmid pdhr-gpt brukes til å frembringe hjelperviruset vdhr.

Notl-kassetten (som omfatter P7.5-promoter-gpt-genkassetten) innføyd i pEcoK-dhr og tyve baser av de 5'- og 3'-flankerende områder er vist for pdhr-gpt i sekvens med identifikasjonsnr. 22. Det flankerende område (basene #1-20 i denne listen) svarer til basene #72-91 i ID PXVACMHC (se sekvens med identifikasjonsnr.

21 for pEcoK-dhr). Den innføyde DNA-sekvens starter i stilling 21 (den første "G" i et Notl-sete) og slutter i stilling 1189 (den siste "C"-rest i et Notl-sete). A-resten i translasjonsinitieringskodonet i gpt-genet svarer til stilling #548. T-resten i translasjonsstoppkodonet i gpt-genet svarer til stilling #1004. Sekvensen fortsetter med 20 baser flankeringsområde (basene #1192-1209 i denne listen; basene #944-961 i ID PXVACMHC). De to "G"-restene #1190 og 1191 i denne listen svarer til stilling 29 og 30 i pEcoK-dhr.

For å overføre Eco-K-fragmentet til vacciniavirus transfiseres plasmidet i primære kyllingembryofibroblasterceller infisert med vacciniavirusdelesjonsmutant WR-6/2. Modifiserte virus velges som gpt-positive (under anvendelse av mykofenolsyre). Et gpt-positivt virus plakkrenses tre ganger i CEF-celler og betegnes vdhr.

Karakterisering av vdhr- hjelperviruset:

Strukturen til gpt-positivt vacciniavirus vdhr analyseres ved hjelp av "Southern blotting" og vertsområdetester. vdhr-viruset er i stand til å danne plakker på kyllingembryofibroblaster og to apecellelinjer (BSC40 og Vero), men er ufullkomment for replikasjon i humancellelinjen MRC-5.

Innpakking av fremstilt vacciniavirus- DNA under anvendelse av vertsområdemutanten vdhr som et hjelpervirus: En konstruksjon for ekspresjon av en cDNA som koder for humant protrombin, viser nytten av denne fremgangsmåten. Produktet fra en ligeringsblanding beskrevet i eksempel 5, figur 5.1, transfiseres i kyllingembryofibroblaster infisert med vdhr som et hjelpervirus. Etter 2 dager testes cellene og et forråd av ubehandlet virus fremstilles. Innpakket virus analyseres med hensyn på plakkdannelse på humanceller (MRC 5) hvor den ønskede vacciniavirus replikerer, men det mutante vdhr-hjelpervirus ikke replikerer.

Etter tre dager farges cellene med nøytralrød og plakker velges ut for videre analyse ved hjelp av "Southern blotting". Modifiserte vacciniaviruskloner med den ønskede struktur identifiseres. Virus som har gjennomgått rekombinasjon med det svært homologe hjelpervirus, forventes også.

Eksempel 9

Konstruksjon av nye kimære vacciniavirus som koder for HIV- gpl60 ( vP2-gpl60MN A, vP2- gpl60MN B og vselP- gp^ pMN) og ekspresjon av rekombinant gp! 60MM i vero- celler

Det foreliggende eksempel illustrerer konstruksjon ved hjelp av direkte molekylær kloning av en vacciniavirusrekombinant for storskalaproduksjon av gpl60 fra HIV-lMN-isolatet. Produksjon av gpl60 fra HIVII1B-isolatet beskrevet av Råtner et al., Nature, 313, s. 277-284 (1985), under anvendelse av en konvensjonelt konstruert vacciniavirusekspresjonsvektor, er blitt beskrevet av Barrett et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 5, s. 159-171 (1989). HIV,IIB-isolatet er imidlertid en sjelden HIV-variant. Forsøk på å utvikle vaksiner basert på HIV-kappeproteiner burde inkludere mer representative HIV-1-isolater, slik som MN-isolatet. Gurgo et al., Virology, 164, s. 531-536 (1988), Carrow et al., Aids Research and Human Retroviruses, 7, s. 831-839 (1991). Foreliggende vacciniavirusvektorer ble følgelig konstruert via direkte molekylær kloning for å uttrykke gpl60-proteinet fra HIVMN-isolatet.

Konstruksjon av plasmidet pP2- gpl60MN og av de kimære virus vP2- gptl60MN A og vP2- gpl60M!£B

Strategien med innføyelse av gpl60-genet i vacciniavirus omfattet: (i) modifikasjon av gpl60-genet ved å fjerne det store 5'-utranslaterte område (5-UTR) og innføre et egnet kloningssete oppstrøms fra startkodonet, (ii) kloning av det modifiserte gpl60-gen nedstrøms fra den sterke "sen"-fjærfekoppervirus-P2-promoter (europeisk patentsøknad nr. 91 114 300.6, 26. august 1991), og (iii) innføyelse av et buttendet fragment bestående av P2-gpl60- og P7.5-gpt-genkassettene i det eneste restriksjonsendonukleasespaltningssete i passende virusvertsstammer, f.eks. i Smal-setet i vertsvacciniastammen vdTK (eksempel 4), Smal- eller Notl-setene i vacciniastammen WR 6/2 (Moss et al., J. Virol., 40, s. 387 (1981)) eller vacciniavilltypestammen WR.

For disse formål ble et nytt Smal-sete innført i plasmidet pN2gpt-S4 (eksempel 4), resulterende i plasmidet pS2gpt-S4 (fig. 9.1, sekvens med identifikasjonsnr. 62). Deretter ble S4-promoteren byttet ut med P2-promoteren, resulterende i plasmidet pS2gpt-P2 (sekvens med identifikasjonsnr. 63). Dette plasmidet muliggjør kloningen av komplett åpen leseramme (orfs), men kan også brukes til å klone ukomplett orfs som mangler sitt eget startkodon; startkodonet tilveiebringes f.eks. ved kloning i det eneste Ncol-sete (CCATGG) i dette plasmidet. Konstruksjon av plasmidene og virusene er beskrevet nærmere nedenunder. For modifikasjonen av gpl60-genet, ble et PCR-frembragt, proksimalt fragment byttet, noe som førte til en gpl60-genkassett med en minimal <5->UTR. Denne kassetten er til stede i sluttkonstruksjonen, plasmidet pP2-gpl60MN (figur 9.1, sekvens med identifikasjonsnr. 69). Ytterligere karakteriseringer av plasmidet er vist i den følgende tabell.

pP2gpl60mn ( 6926 bp) ( sekvens med identifikasjonsnr. 69)

Plasmidene ble konstruert på følgende måte.

pS2gpt- S4:

Plasmidet pN2gpt-S4 (eksempel 4) ble fordøyd med Xbal og ligert med en Smal-adaptor (sekvens med identifikasjonsnr. 43: 5-CTAGCCCGGG-3'), hvorved Xbal-setet ble inaktivert og et Smal-sete ble dannet. Det resulterende plasmid ble betegnet pS2gpt-S4 (sekvens med identifikasjonsnr. 62). Ytterligere kjennetegn ved dette plasmidet er vist i den følgende tabell.

pS2gpt- S4 ( 4145 bp) ( sekvens med identifikasjonsnr. 62)

pS2gpt- P2:

S4-promotersegmentet i plasmid pS2gpt-S4 ble fjernet ved spaltning med Pstl og Hpal og erstattet med et 172 bp-stort PstI-HpaI-P2-promotersegment. Dette promotersegmentet ble frembragt ved hjelp av PCR med plasmidet pTZgpt-P2a (Falkner et al., europeisk patentsøknad nr. 91 114 300.6, 26. august 1991) som templatet og oligonukleotidene P-P2 5'(1) og P-P2 3'(1) som primerne. PCR-produktet ble kuttet med Pstl og Hpal, og ligert til det Pstl- og Hpal-kuttede, store fragment i pS2gpt-S4. Sekvensen til P-P2 5'(1) (sekvens med identifikasjonsnr. 44) er: 5'-GTACGTACGG CTGCAGTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAG-3'; sekvensen til P-P2 3'(1) (sekvens med identifikasjonsnr. 45) er: 5'-TCTGACTGAC GTTAACGATT TATAGGCTAT AAAAAATAGT ATTTTCTACT-3 5. Den korrekte sekvens i PCR-fragmentet ble bekreftet ved sekvensering av sluttplasmidet, betegnet pS2gpt-P2 (sekvens med identifikasjonsnr. 63). De anvendte sekvensprimere var P-SM(2) (sekvens med identifikasjonsnr. 46), 5<*->GTC TTG AGT ATT GGT ATT AC-3' og P-SM(3) (sekvens med identifikasjonsnr. 47), 5'-CGA AAC TAT CAA AAC GCT TTA TG-3'. Ytterligere kjennetegn ved plasmidet pS2gpt-P2 er vist i den følgende tabell.

pS2gpt- P2 ( 4277 bp) ( sekvens med identifikasjonsnr. 63)

pMNevn2:

Plasmidet pMNenvl ble tilveiebrakt av R. Gallo (National Cancer Institute, Bethesda, Maryland). 25 inneholder gpl60-genet fira HIV-MN-stammen klonet som et 3,1 kb-stort EcoRI-PvuII-fragment i vektoren pSP72 (Promega, Inc.). Det 0,6 kb-store EcoRI-Asp718-fragment i pMNenvl ble erstattet med et 0,13 kb-stort EcoRI-Asp718-fragment, idet store deler av det 5'-utranslaterte område i gpl60-genet ble fjernet. Dette 0,13 kb-store fragment ble frembragt ved hjelp av PCR under anvendelse av plasmidet pMNenvl som templat og oligonukleotidene P-MN(l) og P-MN(2) som primerne. Den forreste primer P-MN(l) innførte i tillegg et Stul-sete 1 bp oppstrøms fra startkodonet. Sekvensen til P-MN(l) (sekvens med identifikasjonsnr.

48) er 5'-AGCTAGCTGA ATTCAGGCCT CATGAGAGTG AAGGGGATCA

GGAGGAATTA TCA-3'; Sekvensen til P-MN(2) (sekvens med identifikasjonsnr. 49) er 5-CATCTGATGC ACAAAATAGA GTGGTGGTTG-3'. Det resulterende plasmid ble fordøyd med pMNenv2. For å utelukke mutasjoner ble det PCR-genererte fragment i dette plasmidet sekvensert med primerne P-seq(2) (sekvens med identifikasjonsnr. 50) 5'-CTG TGG GTA CAC AGG CTT GTG TGG CCC-3' og P-seq(3) (sekvens med identifikasjonsnr. 51) 5'-CAA TTT TTC TGT AGC ACT ACA GAT C-3'.

pP2- gpl60MN:

Det 2,7 kb-store StuI-PvuII-fragment som inneholder MN-gpl60-genet, isolert fra plasmidet pMNenv2, ble innføyd i Hpal-setet i pS2gpt-P2, resulterende i plasmidet pP2-gpl60MN (sekvens med identifikasjonsnr. 69).

De kimære virus vP2-gpl60MNA og vP2-gpl60MNB ble konstruert på følgende måte: Smal-fragmentet bestående av P2-gpl60- og P7.5-gpt-genkassettene ble innføyd ved direkte molekylær kloning i det eneste Smal-sete i vertsvacciniastammen vdTK (eksempel 4), resulterende i de kimære virus vP2-gpl60MNA og vP2-gpl60MNB (figur 9.2). Nærmere bestemt ble vacciniavirus vdTK fra eksempel 4 kuttet i sitt eneste Smal-sete og ligert med det 4,0 kb-store Smal-fragment som inneholder P7.5-gpt-gen- og P2-gpl60-genkassettene. Tilsvarende ble vacciniastammen WR6/2 kuttet i sitt eneste SmaI-(NotI-)sete og ligert med det 4,0 kb-store SmaI-(NotI-)-fragment som inneholder P7.5-gpt-gen- og P2-gpl60-genkassettene. Kloningsfremgangsmåtene ble utført som beskrevet i eksempel 1.1 viruset vP2-gpl60MNA transkriberes gpl60-genet i den samme retning som genene som er samlet rundt det virale tymidinkinasegen; i viruset vP2-gpl60MNB transkriberes gpl60-genet i den omvendte retning. Ettersom genstillingseffekter kan virke inn på ekspresjonsnivåer i vacciniakonstruksjoner, ble også SmaI-(NotI-)fragmentet bestående av P2-gpl60- og P7.5-gpt-genkassettene, innføyd i SmaI-(NotI-)setet i WR-6/2-stammen. Innpakkingen in vivo ble gjort som beskrevet i eksempel 3.

Kimærvirusenes struktur

For å bekrefte de teoretiske strukturene til kimærvirusene (figur 9.3) ble det utført "Southern blot"-analyser. DNA-er fra de rensede virus spaltes med Pstl og resulterende fragmenter separeres på en agarosegel, overføres til en nitrocellulosemembran og hybridiseres til et vacciniatymidinkinasegen (tk) og en gpl60-genprobe. Med tk-genproben er, i tilfellet med vP2-gpl60MNA, de forutsakte 6,9 og 14,3 kb-store fragmenter synlige, og for vP2-gpl60MNB er de forutsakte 8,7 og 12,5 kb-store fragmenter synlige. Med gpl60-proben (pMNenvl) er de forutsakte 14,3 kb av vP2-gpl60MNA og 8,7 kb-store fragment av vP2-gpl60MNB synlige, noe som bekrefter integreringen av fremmedgenkassettene i to forskjellige orienteringer.

Ekspresjonsundersøkelser med kimærvirusene vP2- gpl60MN A og vP2- gp! 60M^B

Veroceller velges for ekspresjonsundersøkelser. Vekst av celler, infeksjon med kimærvirusene og rensing av det rekombinante gpl60-protein, utføres som beskrevet av Barrett et al., supra.

" Western blots" av gpl60

"Western blots" gjøres hovedsakelig som beskrevet av Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 6672-6676 (1979). Det første antistoffer et monoklonalt muse-anti-HIV-gpl20-antistoff (Du Pont, Inc., #NEA9305) brukt ved en 1:500-fortynning. Det andre antistoff er et geit-anti-mus-IgG (H+L) koblet med alkalisk fosfatase (BioRad, Inc., #170-6520) brukt ved en 1:1.000-fortynning. Reagensene (BCIP og NBT) og fargingsprotokoller er fra Promega, Inc.

Konstruksjon av plasmidet pselP- gpl60MN og av kimærviruset vselP- gpl60MN

Den syntetiske "tidlig/sen"-promoteren selP (sekvens med identifikasjonsnr. 70) (S. Chakrabarti & B. Moss, se europeisk patentsøknad nr.

91 114 300.6, rekombinant fjærfekoppervirus) som er én av de sterkeste kjente vacciniaviruspromotere, ble brukt i dette eksemplet for å uttrykke gpl60-genet fra HIV-l-MN-stammen. Først ble plasmidet pselP-gpt-L2 konstruert (fig. 9.4). Dette plasmidet omfatter selP-promoteren etterfulgt av et multippelkloningssete for inn-føyelsen av fremmedgener, enten som komplette eller ukomplette åpne leserammer, og translasjonsstoppkodoner i alle leserammer etterfulgt av vacciniavirus-"tidlig"-transkripsjonsstoppsignalet, TTTTTNT. Rohrmann et al., Cell, 46, s. 1029-1035

(1986). P7.5 gpt-genkassetten er lokalisert ved siden av promoteren og tjener som en dominant utvelgelsesmarkør. Falkner et al., J. Virol., 62, s. 1849-1854 (1988). selP-promoter/markørgenkassettene er flankert av restriksjonsendonukleasespaltningsseter som er unike i vacciniavirusgenomet (Sfil, Noti, Rsrll) og kan også fjernes som buttendede fragmenter (f.eks. ved spaltning med Hpal og SnaBI). For å bli i stand til å innføye gpl60-genet i pselP-gpt-L2, ble et Ncol-sete innført rundt translasjonsstartkodonet. Denne mutasjonen resulterer i utbytting av aminosyren arginin (AGA) med alanin (GCC). Denne mutasjonen i den andre aminosyren i signalpeptidet vil sannsynligvis ikke virke inn på virkningsfull ekspresjon av gpl60-genet. Kloningsfremgangsmåten og sekvensen rundt villtypegenet og det modifiserte gpl60-gen er skissert i figur 9.5. For å innføre denne mutasjonen i gpl60-genet, ble det byttet ut et PCR-generert, proksimalt fragment. Konstruksjonen av plasmidene er beskrevet nærmere nedenunder.

pL2:

For konstruksjonen av pL2, ble det 0,6 kb-store Xbal-Clal-fragment i plasmidet pTM3 (Moss et al., Nature, 348, s. 91 (1990)) byttet ut med et Xbal-Clal-adaptorfragment bestående av de annealerte oligonukleotidene o-542 (sekvens med identifikasjonsnr. 52) 5'-CGA TTA CGT AGT TAA CGC GGC CGC GGC CTA GCC GGC CAT AAA AAT-3' og o-544 (sekvens med identifikasjonsnr. 53) 5'-CTA

GAT TTT TAT GGC CGG CTA GGC CGC GGC CGC GTT AAC TAC GTA AT-3'.

Mellomproduktplasmidet som skriver seg fra dette kloningstrinnet, ble kalt pLl. Det 0,84 kb-store Aatll-Sphl-fragment (deler av ikke-kodende gpt-sekvenser) ble byttet ut med Aatll-Sphl-adaptorfragmentet bestående av de annealerte oligonukleotidene o-541 (sekvens med identifikasjonsnr. 54: 5'-CTT TTT CTG CGG CCG CGG ATA TGG CCC GGT CCG GTT AAC TAC GTA GAC GT-3') og 0-543 (sekvens med identifikasjonsnr. 55: 5'-CTA CGT AGT TAA CCG GAC CGG GCC ATA TAG GCC GCG GCC GCA GAA AAA GCA TG-3'). Det resulterende plasmid ble kalt pL2.

PTZ- L2:

Xbal-Sphl-fragmentet (bestående av T7-promoter-EMC-T7-terminatorsegmentet, multippelkloningssetet og P7.5-gpt-genkassetten) ble behandlet med Klenow-polymerase og innføyd mellom PvuII-setene i plasmidet pTZ19R (Pharmacia, Inc.). Det resulterende plasmid ble kalt pTZ-L2 (sekvens med identifikasjonsnr. 64). Ytterligere trekk ved dette plasmidet er vist i tabellen nedenunder. pTZ- L2 ( 4701 bp) ( sekvens med identifikasjonsnr. 64)

PTZselP- L2 og pselP- gpt- L2:

Det 0,6 kb-store Clal-NcoI-fragment (T7-promoter-EMC-sekvensen) ble erstattet med et syntetisk promoterfragment bestående av de annealerte oligonukleotidene o-selPI (sekvens med identifikasjonsnr. 56: 5-CGA TAA AAA

TTG AAA TTT TAT TTT TTT TTT TTG GAA TAT AAA TAA GGC CTC-3'; 51-mer) og o-selPII (sekvens med identifikasjonsnr. 57: 5'-CAT GGA GGC CTT ATT

TAT ATT CCA AAA AAA AAA AAT AAA ATT TCA ATT TTT AT 3<*>). Det

resulterende mellomproduktplasmid pTZselP-L2 inneholder fortsatt T7-temiinatoren og et Hpal-sete som ble fjernet i det følgende kloningstrinn, hvorved det ble innføyd et vaccinia-"tidlig"-transkripsjonsstoppsignal og størrelsen til P7.5-promoterfragmentet ble redusert fra 0,28 til 0,18 kb. Det 239 bp-store Sall-Ndel-fragment ble byttet ut med

Sall-Ndel-adaptoren bestående av de annealerte oligonukleotidene O-830 (sekvens med identifikasjonsnr. 58: 5'-TCG ACT TTT TAT CA-3') og 0-857 (sekvens med identifikasjonsnr. 59: 5'-TAT GAT AAA AAC-3'). Det resulterende plasmid ble kalt pselP-gpt-L2 (sekvens med identifikasjonsnr. 65). Ytterligere trekk ved denne konstruksjonen er vist i tabellen nedenunder.

pselP- gpt- L2 ( 3878 bp) ( sekvens med identifikasionsnr. 65)

pselP- gpl60MN:

Det 3,1 kb-store env-gen som inneholder EcoRI-PvuII-fragmentet fra pMNenvl, ble innføyd i det EcoRI- og Stul-kuttede plasmid pselP-gpt-L2, resulterende i mellomproduktplasmidet pselP-gp 160.1. Det 0,8 kb-store Ncol-Nsil-fragment fra pselP-gpl60 ble byttet ut med et PCR-generert 0,31 kb-stort Ncol-Nsil-fragment, resulterende i sluttplasmidet pselP-gpl60MN (sekvens med identifikasjonsnr. 66). Ytterligere trekk ved dette plasmidet er vist i tabellen nedenunder. pselP- gpl60MN ( 6474 bp) ( sekvens med identifikasjonsnr. 66)

Primerne anvendt til PCR-reaksjonen var o-Neol (40-mer), sekvens med identifikasjonsnr. 60: 5'-GAG CAG AAG ACA GTG GCC ATG GCC GTG AAG

GGG ATC AGG A-3', og o-Nsil (30-mer), sekvens med identifikasjonsnr. 61: 5-CAT AAA CTG ATT ATA TCC TCA TGC ATC TGT-3'. For videre kloning ble PCR-produktet spaltet med Ncol og Nsil.

Kimasrvirus vselP- gpl60MNA- vselP- gpl60MNB konstrueres på følgende måte Hpal-fragmentet bestående av selP-gpl60- og P7.5-gpt-genkassettene innføyes ved direkte molekylær kloning (fig. 9.6) i det eneste Smal-sete i vacciniastammen WR6/2 [Moss et al., J. Virol., 40, s. 387-395 (1981)] som er en sterkt svekket vacciiuavirusstamme. Se Buller et al., Nature, 317, s. 803-815 (1985). Vacciniavirusstammen WR6/2 (Moss et al., suprd) kuttes i sitt eneste Smal-sete og ligeres med det 4,0 kb-store Hpal-fragment som inneholder P7.5-gpt-gen- og selP-gpl60-genkassettene. Kloningsfremgangsmåtene utføres som beskrevet i eksempel 1.

De resulterende kimærvirus, vselP-gpl60MNA og vselP-gpl60MNB, renses og karakteriseres ytterligere. I viruset vselP-gpl60MNA transkriberes gpl60-genet i den samme retning (fra venstre mot høyre) som genene samlet rundt innføyelsessetet [den åpne leseramme A51R, Goebel et al., Virology, 179, s. 247-266 (1990)]. I viruset vselP-gpl60MNB transkriberes gpl60-genet i den omvendte retning. Innpakkingen in vivo gjøres som beskrevet i eksempel 3.

Struktur til kimærvirusene

For å bekrefte de teoretiske strukturene til kimærvirusene (fig. 9.7) utføres "Southern blot"-analyser. DNA i de rensede virus ble spaltet med Sali og fragmenter separeres på en agarosegel, overføres til en nitrocellulosemembran og hybridiseres til vaccinia-SalF-fragmentprobe (pTZ-SalF) og en gpl60-genprobe (pMNenvl). Med SalF-fragmentproben er de forutsakte 6,8 og 10,7 kb-store fragmentene for vselP-gpl60MNA synlige, og for vselP-gpl60MNB er de forutsakte 3,5 og 13,7 kb-store fragmentene synlige. Med gpl60-proben ses de samme fragmenter, men det 10,7 kb-store fragmentet i vselP-gpl60MNA og det 3,5 kb-store fragmentet i vselP-gpl60MNB gir mindre sterke signaler ettersom bare ca. 400 bp av hvert totale fragment er homologt med proben.

Ettersom direkte kloning også resulterer i integrasjon av tandenraiultimerstrukturer, fordøyes vimsenes DNA også med Xbal som ikke kutter den innføyde DNA. Xbal-villtypefragmentet er 447 bp i størrelse. Integrasjon av én kopi av innføyelsen med størrelse 3,8 kb resulterer i et fragment på 4,3 kb. I multimerstrukturer øker størrelsen til det 4,3 kb-store fragment i trinn på 3,8 kb.

Ekspresjonsundersøkelser med kimærvirusene vselP- gpl60MNA og vselP- gpl60MNB

Veroceller brukes for ekspresjonsundersøkelser. Cellevekst, infeksjoner med kimærvirusene og rensing av det rekombinante gpl60-protein utføres som beskrevet av Berrett et al., supra.

Eksempel 10

Konstruksjon av nye kimære vacciniavirus som koder for humanprotein S ( vProtS) og ekspresjon av rekombinant protein S

Dette eksempel illustrerer konstruksjonen av rekombinant protein S uttrykt ved hjelp av kimært vacciniavirus. Humanprotein S er et 70 kDa-glykoprotein som er involvert i reguleringen av blodkoagulering. DiScipio et al., Biochemistry, 18, s. 89-904 (1979). cDNA og genom-DNA i protein S er blitt klonet og karakterisert. Lundwall et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 6716 (1986); Hoskins et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84, s. 349 (1987), Edenbrandt et al., Biochemistry, 29, s. 7861

(1990), Schmidel et al., Biochemistry, 29, s. 7845 (1990).

Humanprotein S, normalt syntetisert som et 70 kDa protein i lever- og endotelceller (DiScipio et al., supra), er blitt uttrykt i permanente cellelinjer avledet fra humane 293- og hamster-AV12-664-celler (adenovirustransformerte cellelinjer) ved nivåer på opp til 7 ug/10<6> celler/dag (Grinnell et al., Blood, 76, s. 2546 (1990)) eller i system med muse-C127-celle og papillomvirus ved lignende ekspresjonsnivåer. Malm et al., Eur. J. Biochem., 187, s. 737 (1990). Proteinet avledet fra de sist nevnte celler var større enn plasmaavledet protein S, sannsynligvis pga. avvikende glykosylering.

Ved den foreliggende ekspresjon av protein S anvendes en dobbelt genkassett bestående av den komplementære DNA for humanblodfaktorproteinet S og gpt-genet som begge reguleres av en vacciniapromoter. Dette ble klonet inn i det unike Notl-sete og pakket i fjærfekopperhjelpervirusinfiserte pattedyrceller. Humanprotein S ble uttrykt i infiserte veroceller ved nivåer på 4-6 ug pr. IO<6> celler.

For cellescreeningen ble det for optimal ekspresjon av protein S ved hjelp av det kimære vacciniavirus, anvendt 5 forskjellige vertscellelinjer, WI 38 (humant embryolungefibroblast), CV-1 og vero (apenyreceller), Chang-lever og SK Hepl. Protein S lot seg ikke skjelne fra plasmaavledet protein S ved flere kriterier: det rekombinante materiale avledet fra de infiserte celler av denne cellelinjen viste de samme elektroforetiske migreringsmønstre og de samme kromatografiske elueringsprofiler som plasmaavledet protein S. Dette indikerer at den korrekte posttranslasjonelle modifikasjon av dette kompleksglykoprotein hadde inntrådt. Metodene er beskrevet nærmere nedenunder.

Konstruksjon av plasmidet pN2- gptaProtS

Enkelttrådet DNA fremstilt fra plasmidet pBluescript-ProtS, som omfatter den cDNA som koder for humanprotein S (tilveiebrakt av R. T. A. McGillivray), ble brukt til å mutagenisere området rundt translasjonsstartkodonet i det kodende området for protein S i et Ncol-sete (CCATGG). Den mutagene primer, oProtSl (sekvens med identifikasjonsnr. 68) har sekvensen 5-ACC CAG GAC CGC CAT GGC GAA GCG CGC-3'; mutagenesen ble utført som beskrevet i mutageneseprotokollen (Amersham, Inc.). Signalpeptidet muteres i det den andre aminosyren endres fra Arg til Ala (figur 10.1 B og sekvens med identifikasjonsnr. 77 og 79). Dette innfører det påkrevde Ncol-setet for videre kloning og bringer ATG-startkodonet i en optimal sammenheng for translasjon. Dette kan forbedre utskillelsen av protein S.

Proteinet S-cDNA ble deretter fjernet som et Ncol-Notl-fragment og innføyd i vacciniainnføyelsesplasmidet pTKgpt-selP (Falkner et al., suprd), et plasmid som tilveiebringer en sterk syntetisk vacciniapromoter. Promoterprotein-S-genkassetten ble så fjernet som et Bglll-Notl-fragment og innføyd i plasmidet pN2-gpta (eksempel 1), resulterende i pN2-gptaProtS (sekvens med identifikasjonsnr. 67). Ytterligere trekk ved denne konstruksjon er vist i den følgende tabell.

pN2- gptaProtS ( 6811 bp) ( sekvens med identifikasionsnr. 67)

I dette plasmidet transkriberes gpt-genet kontrollert av vacciniavirus-P7.5-promoteren og protein S-cDNA-en forskjellig og flankeres med Notl-seter.

Innføyelse av cDNA- en for humanprotein S i det eneste Notl- sete i vacciniavirus, hvorved man får vProtS

Notl-fragmentet bestående av gpt-genet og protein S-genkassetter ble ligert med vacciniavektorarmer og transfisert i FPV-infiserte CV-1-pattedyrceller. Bare innpakket vacciniavirus formerte seg under disse betingelsene. Nærmere bestemt ble vacciniavilltype-DNA fra WR-stammen (1 ug) kuttet med Noti og enzymet ble varmeinaktivert i 30 min ved 65 °C. Vektoren ble ligert over natten med 1 ug av den 3,8 kb-store gpt/protein S-genkassetten (fjernet som et Notl-fragment fra plasmidet pN2gpta-ProtS) i 30 ul under anvendelse av 15 enheter T4-DNA-ligase.

Forrådene av ubehandlet virus fremstilt etter fem dagers inkubasjon ble titrert i nærvær og i fravær av mykofenolsyre (MPA). Denne fremgangsmåten skjelner kimært virus fra tilbakeligert villtypevirus. Med MP A 4 x IO<4> og uten legemidlet ble 6 x IO<5> pfu/10<6> vertsceller erholdt. Ca. 6-7 % av virusplakkene var kimære virus. Ti av de gpt-positive isolater ble plakkrenset to ganger, dyrket til små, ubehandlede forråd og brukt til å infisere CV-1-celler. Total-DNA ble fremstilt, kuttet med restriksjonsenzymene SacI og Noti, og underkastet "Southern blot"-analyse (figur 10.2). Sacl-fordøyelsesproduktet, hybridisert med det klonede SacI-I-fragment (plasmid pTZ-SacI, eksempel 4), muliggjorde bestemmelsen av orienteringen til den innføyde DNA ettersom SacI kutter innføyelsene asymmetrisk. I alle ti isolatene var innføyelsene i "a"-orienteringen (fragmenter på 6,3 og 4,6 kb, se figur 10.2A og C), noe som indikerte at denne konfigurasjonen er sterkt foretrukket. Notl-fragmentene ble hybridisert med protein S-proben. I dette tilfellet ble den 3,8 kb-store Notl-genkassett frigjort (figur 10.2B).

Ekspresjon av humanprotein S ved hjelp av et kimært vacciniavirus

Ubehandlede forråd ble dyrket fra gpt-positive kimære virus og brukt til infeksjon av forskjellige pattedyrcellelinjer. Monolag med 5 x IO<6> celler ble infisert med 0,1 pfu/celle i nærvær av serumfritt medium (DMEM) supplert med 50 ug/ml vitamin K og inkubert i 72 timer. Supernatanter ble samlet opp og protein S-antigen ble bestemt ved å bruke et ELISA-testsett fra Boehringer Mannheim, FRG (sett nr. 1.360.264). Syntetiserte mengder av protein S er angitt i tabell I i millienheter (1 U svarer til 25 jig protein S).

Alternativt ble 10 ul supematant fra vero-celler analysert i en "Western blot" under anvendelse av 50 ng humanplasmaavledet protein S som en standard og et polyklonalt museserum som er spesifikt for "hu Prot S" (Axell) (figur 10.3). "Blots" ble farget ved å bruke et polyklonalt geit-anti-mus-serum konjugert med alkalisk fosfatase (Dakopatts) og NBT/BCIP som substrat.

Rensing av rekombinant protein S fra cellekultursupernatanter ble utført som beskrevet av Grinnell et al., 1990.

Eksempel 11

Konstruksjon av nye kimære vacciniavirus som koder for humanfaktor IX og ekspresjon av rekombinant faktor IX

En dobbelt genkassett bestående av den komplementære DNA for den humane blodfaktor IX og gpt-genet som begge reguleres av en vacciniapromoter, ble klonet i det unike Notl-sete i vacciniavirus WR-genom og pakket i fjærfekopperhjelpervirusinfiserte pattedyrceller. Humanfaktor IX ble uttrykt i flere celletyper.

Human koagulasjonsfaktor IX er et 56 kDa glykoprotein som er involvert i reguleringen av blodkoagulering. Denne koagulasjonsfaktor gjennomgår komplekse ettertranslasjonelle modifikasjoner: vitamin K-avhengig karboksylering av de første 12 glutaminrester, glykosylering, 3-hydroksylering av en asparaginsyre og proteinprosessering i aminoende. Davie, E. W., "The Blood Coagulation Factors: Their cDNAs, Genes and Expression", Hemostasis and Thrombosis, Colman, R. W., Hirsh, J. Marder, V. J. and Salzman, E. W., red., J. B. Lippincott Co. (1987). Hemofili B, en X-kromosombundet blødersykdom, forårsakes av mutasjon av faktor IX. Pasienter med hemofili behandles for tiden med utbytting av plasmautvunnet faktor

IX.

cDNA og genom-DNA for faktor IX ("FIX") er blitt klonet og karakterisert og FIX er blitt uttrykt i permanente cellelinjer. Busby et al., Nature, 316, s. 271 (1985); Kaufman, et al., J. Biol. Chem., 261, s. 9622 (1986); Balland, et al., Eur. J. Biochem., 172, s. 565 (1922) og Lin et al., J. Biol. Chem., 265, s. 144 (1990). Ekspresjon av faktor IX i vacciniarekombinanter er også blitt beskrevet. De la Salle, et al., Nature, 316, s. 268 (1985).

Konstruksjon av plasmid pN2gpta- FIX

FIX-cDNA-en (vennlig tilveiebrakt av R. T. A. MacGillivray) ble kuttet ut fra plasmidet pBluescript-FIX med EcoRI og ligert med det EcoRI-lineariserte plasmid pTM3. Moss, et al., Nature, 348, s. 91 (1990). Enkelttrådet DNA ble isolert fra et rekombinant plasmid som inneholdt FIX-innføyelsen i den korrekte orientering, og et Ncol-sete (CCATGG) ble innført rundt FIX-ATG-startkodonet ved hjelp av oligonukleotidmediert stedrettet mutagenese under anvendelse av oligonukleotid

oFIX.l (sekvens med identifikasjonsnr. 71: 5"-TCA TGT TCA CGS GCT CCA TGG CCG CGG CCG CAC C-3') og et kommersielt mutagenesesett (Amersham, Inc., sett nr. PPN 1523). Vektor og FIX-NcoI-seter ble fusjonert, innføyd DNA ble isolert ved hjelp av Ncol- og Notl-fordøyelse og ligert med den NcoI/Notl-kuttede vektor pTKgpt-selP. Falkner et al., supra. Promoter/FIX-kassetten ble kuttet ut fra dette plasmidet med Bglll og Noti og ligert med den BamHI/Notl-lineariserte vektor pN2-gpta (eksempel 1). Fra denne konstruksjonen ble en Notl-kassett inneholdende FIX-cDNA-en (under kontroll av selP-promoteren) og gpt-genet (under kontroll av vaccinia-P7.5-promoteren), isolert og brukt for in v/fro-molekylær kloning og innpakking som beskrevet i eksempel 10.

Ytterligere kjennetegn ved dette plasmidet er vist i tabellen nedenunder.

pN2gpta- FIX ( 5532 bp) ( sekvens med identifikasjonsnr. 72)

Innføyelse av cDNA- en for humanfaktor IX i det eneste Notl- sete i vacciniavirus

Før innføyelse av faktor-IX-cDNA-en i vacciniavirus ble denne cDNA innføyd i plasmidet pN2-gpta, resulterende i plasmidet pN2gpta-FIX (figur 11.1 A, sekvens med identifikasjonsnr. 72). For å oppnå den optimale sekvenssammenheng mellom den syntetiske vacciniapromoter og det kodende området for faktor IX, ble det 5'-utranslaterte område for faktor IX deletert ved innføring av et nytt Ncol-sete i startkodonet til faktor IX og fusjon av dette Ncol-sete med Ncol-setet tilveiebrakt av promoteren. Denne mutasjonen resulterte i et mutert signalpeptid (figur 11.1 B). I villtypefaktor IX er den andre aminosyren i signalpeptidet en glutaminrest, mens i pN2gpta-FIX er den andre aminosyren en glutaminsyrerest.

Notl-fragmentet bestående av gpt-genet og faktor IX-genkassettene ble ligert med vacciniavektorarmene og transfisert i FPV-infiserte CV-1-pattedyrceller. Bare innpakket vacciniavirus formerte seg under disse betingelser. De ubehandlede virusforråd fremstilt etter fem dagers inkubasjon, ble titrert i nærvær og i fravær av mykofenolsyre (MPA). Denne fremgangsmåten skjelnet kimære fra tilbakeligerte villtypevirus. Med MP A 5 x IO<4> og uten legemidlet ble det erholdt 5 x IO<6> pfu/IO<6 >vertsceller. I dette eksemplet var ca. 1 % av virusplakkene kimærvirus. Ti av de gpt-positive isolater ble plakkrenset to ganger, dyrket opp til små ubehandlede forråd og ble brukt til å infisere CV-1-celler. Total-DNA ble fremstilt fra åtte cellekulturer infisert med de respektive virusisolater, fordøyd med restriksjonsenzymene Sful, Ndel og Noti, og underkastet "Southern blot"-analyse.

Sful-fordøyelsesproduktet, hybridisert med faktor-IX-proben, muliggjorde bestemmelse av orienteringen av den innføyde DNA ettersom Sful kutter innføyelsene asymmetrisk. I alle åtte isolatene var innføyelsene i "a"-orienteringen (fragmenter på 6,3 og 4,6 kb, se figur 11.2), noe som indikerer at denne konfigurasjonen er sterkt foretrukket. NdeI-(NotI-)fragmentene ble også hybridisert med faktor-IX-proben. I dette tilfellet ble et fragment av 656 kb (den 3,8 kb-store Notl-genkassetten) frigjort, noe som beviser den forutsakte struktur.

Ekspresjon av humanfaktor IX

Ubehandlede forråd ble dyrket fra åtte enkeltplakkisolater og brukt for infeksjon av forskjellige pattedyrcellelinjer. 5 x IO6 celler i en 10 cm petriskål ble infisert med 0,1 pfu/celle i nærvær av serumfritt medium (DMEM) og 50 ug/ml vitamin K. Infiserte celler ble inkubert i 72 timer inntil celler begynte og fjernes i fra bunnen av petriskålen. Supernatanter ble samlet opp, cellefragmenter ble fjernet ved sentrifugering og FIX-mengder ble bestemt ved å bruke et ELISA-testsett fra Boehringer Mannheim, FRG (sett nr. 1.360.299). Mengder av FIX-antigen og av faktor IX-aktiviteter er gitt i tabell 11.1.

Alternativt ble 10 ul supernatant fra veroceller analysert i en "Western blot" under anvendelse av 50 ng humanplasmautvunnet huFIX som standard og et polyklonalt museserum som er spesifikt for huFIX (Axell). "Blots" ble farget under anvendelse av et polyklonalt geit-anti-mus-serum konjugert med alkalisk fosfatase (Dakopatts) og NBT/BCIP som substrat. Som vist i fig. 11.3, migrerte det rekombinante materialet som et bredt bånd på lignende måte som standarden av plasmautvunnet faktor IX. Koagulasjonsanalyser av den delvis rensede, vero-celleavledede faktor IX viste at ca. 50 % av materialet var aktiv faktor IX. Virusisolatet #5, betegnet vFIX#5, ble dyrket i stor skala og brukt til videre forsøk.

Som i tilfellet med protein-S-kimærvirusene (eksempel 10), hadde de faktor IX-uttrykkende kimærer innføyelser i én foretrukken orientering.

Proteinet fra transkripsjon av det aktuelle gen (faktor IX og protein S) var fra høyre mot venstre, dvs. den samme retning som genene samlet rundt Notl-setet. Det synes derfor som om sterkt transkriberte enheter må være innstilt i den foretrukne transkripsjonsretning når de klones i Notl-samlingen. Virus med denne konfigurasjonen av innføyelsen er sterkt foretrukket og oppviser de beste vekstkarakteristika. Transkripsjonsretningen til den andre genkassetten, P7.5-gpt-genet, var fra venstre mot høyre. P7.5-promotersegmentet er derfor i en omvendt gjentakelseskonfigurasjon i forhold til det nærliggende, endogene gen som koder for 7.5 kDa-proteinet, dvs. den forventede stabile konfigurasjon er foretrukket. Ettersom ingen kimærer med den omvendte orientering ble funnet, er "b"-orienteringen sannsynligvis ustabil. Innføyelse av de ovenfor nevnte genkassetter i "b"-orienteringen ved hjelp av rekombinasjon in vivo, ville ha mislykkes og ført til den feilfortolkning at Notl-intergenområdet er vesentlig for virusvekst. Denne situasjon illustrerer én av fordelene ved den direkte kloningsfremgangsmåte: bare "tillatte" strukturer dannes.

Ved innføyelse av enkle små genkassetter ble det oppnådd begge orienteringer og multimerer (eksempel 1), mens med innføyelse av komplekse genkassetter (forskjellig transkriberte dobbeltgenkassetter med homologier til intergener, slik som P7.5-promotersegmentet) ble det dannet foretrukne strukturer.

Cellescreeningen for optimal faktor IX-ekspresjon viste at infeksjon av CV-1- og SK-Hepl-celler resulterte i de høyeste antigennivåer. Materialet fira CV-1-celler hadde de høyeste koagulasjonsaktiviteter (tabell 11.1), noe som indikerer at denne cellelinjen har effektive ettertranslasjonelle modifikasjonssystemer. Faktor IX er tidligere blitt uttrykt i det vanlige vacciniaekspresjonssystem under anvendelse av P7.5-promoteren og HepG2- og BHK-celler (De la Salle et al., 1985). Cellelinjer med bedre vekstkarakteristika, som vero- og CV-1-celler, er blitt påvist å gi høyere ekspresjonsnivåer med de foreliggende virus pga. forbedrede promotere og metoder. I tillegg synes delesjon av det 5'-utranslaterte område i faktor IX-cDNA og modifikasjonen av signalpeptidet å ha positive virkninger på sekresjons- og ekspresj onsni våer.

Eksempel 12

Konstruksjon av det kimære fjærfekoppervirus f- envIIIB og ekspresjon av rekombinante HIVIIIB- kappeproteiner i kyllingembryofibroblaster

Storskalaproduksjonen av gp 160 i vacciniavirus-vero-celleekspresjonssystemer er tidligere blitt beskrevet (Barrett et al., 1989). Ettersom vacciniavirus fortsatt er patogen for mange virveldyr, inkludert pattedyr, og fjærfekoppervirus er vertsbegrenset til fuglearter, har vi utviklet et avipoxbasert ekspresjonssystem (US-patentsøknad mr. 07/734.741 og CIP derav). Kimære fjærfekoppervirus er nå blitt konstruert ved direkte molekylær kloning for å uttrykke kappegenet til HIV-l-IIIB-isolatet (Råtner et al., 1985). I dette rekombinante virus reguleres env-genet ved hjelp av en sterk syntetisk "sen"-promoter. For fremstilling av kappeglykoproteiner brukes det kimære fjærfekoppervirus til å infisere kyllingembryoaggregatcellekulturer. Mundt et al., PCT/WO 91.709.937.

Konstruksjon av og struktur til det kimære fjærfekoppervirus f- envIIIB

For konstruksjon av f-envIIIB (figur 12.1) ble en dobbelt genkassett bestående av P7.5-promoter/gpt-genet og S4-promoter/gpl60-genet fjernet som et Notl-fragment fra plasmidet pN2gpt-gpl60 (eksempel 5). Denne kassetten ble ligert med Notl-spaltet genom-DNA fra fjærfekopperviruset f-TK2a (eksempel 2) og kimærvirus ble isolert som beskrevet under materialer og metoder. Total-DNA fra kyllingembryofibroblaster infisert med 12 forskjellige plakker ble fordøyd med Sspl og analysert ytterligere ved hjelp av "Southern blotting" og hybridisering med et isolert gpl60-fragment som en probe (figur 12.2A). De forutsakte fragmenter med 3,7, 1,0 og 0,8 kb ble funnet i 11 tilfeller, noe som indikerer at gpl60-genet var blitt integrert i "b"-orienteringen (figur 12.2B). Ett virusisolat, f-LF2e, hybridiserte ikke til gp 160-proben.

Det faktum at én foretrukket orientering av innføyelsen eksisterer, peker mot en mulighet at "b"-orienteringsvirus har vekstfordeler sammenlignet med "a"-orienteringen, "a"-orienteringen kan til og med være ustabil. Det å la virusvektoren velge den beste orientering kan anses som en fordel ved den direkte kloningsfremgangsmåte.

Ekspresjonsundersøkelser med kimærviruset f- envIIIB

Ekspresjonsundersøkelser ble gjort i kyllingembryofibroblaster (CEF). Sammenflytende monolag av CEF-er ble infisert med 0,1 pfu pr. celle av de forskjellige ubehandlede virusforrådene, dyrket i fem dager. Totale celleproteiner ble separert på 10 % polyakrylamidgeler, overført på nitrocellulosemembraner og prosessert videre som beskrevet i materialer og metoder. En "Western blot" som viser ekspresjonen av gpl60, gpl20 og gp41, er vist i figurene 12.3 og 12.4. Alle virusisolater bortsett fra f-LF2e, induserte ekspresjon av env-glykoproteinene. Viruset f-LF2e var også negativt i "Southern blot" og bærer derfor ikke gpl60-gensekvensene.

Konstruksjon av f- envIIIB

To mikrogram DNA fra vertsvirusvektor f-Tk2a (eksempel 2) ble kuttet med Noti og ligert med 500 nanogram av genkassetten bestående av P7.5-promoter/gpt-genet og S4-promoter/gpl60-genet. Ligeringen ble utført i et volum på 20 ul og med 5U ligase i 4 dager ved 12°C. Ligeringsblandingen ble transfisert i 6 x IO<6> CEF-er infisert med 0,5 pfu pr. celle av HP2, et fjærfekopperisolat erholdt ved plakkrensing av HP 1.441. Etter en inkubasjonstid på 5 dager ble det fremstilt et ubehandlet forråd (sluttvolum 1 ml) som ble amplifisert. Det ubehandlede forråd ble titrert på CEF-er i seksbrønners plater og dyrket i 5 dager under gpt-utvelgelse (25 (ag/ml mykofenolsyre, 125 ug xantin). Celler hvor den minimale fortynning resulterte i en synlig cytopatisk effekt, ble innhøstet og amplifisert to ganger ifølge den samme fremgangsmåte. Det erholdte, ubehandlede forråd fra den andre amplifikasjon ble titrert på CEF-er i nærvær av gpt-utvelgelse og 12 enkeltplakker (f-LF2a-l) ble plukket ut.

" Western blots" av gpl60

"Western blots" ble utført i det vesentlige som beskrevet av Towbin et al., supra. For gpl60/gpl20-påvisning var det første antistoff et monoklonalt muse-anti-HIV-gpl20-antistoff (Du Pont, Inc. nr. NEA9305) brukt i en fortynning i forholdet 1:500. For gp41-påvisningen ble det humane anti-HIV-gp41-3D6-Mab (tilveiebrakt av H. Katinger, Universitåt fur Bodenkultur, Inst. fur Angewandte Mikrobiologie) brukt ved en fortynning på 1:500. Det andre antistoff var et geit-anti-mus-IgG (H + L) koblet med alkalisk fosfatase (BioRad, Inc. nr. 170-6520) brukt i en fortynning på 1:1000. Reagensene (BCIP og NBT) og fargingsprotokollene er fra Promega, Inc.

Claims (39)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et modifisert chordopoxvirus ved hjelp av direkte molekylær Idoning av et modifisert chordopoxvirusgenom, karakterisert ved at den omfatter (i) modifisering av et renset DNA-molekyl som omfatter et genom fra en chordopoksvirus, under ekstracellulære betingelser for å danne et modifisert DNA-molekyl som omfatter det modifiserte virusgenom; (ii) introduksjon av nevnte modifiserte DNA-molekyl inn i en vertscelle hvorved nevnte modifiserte virusgenom pakkes inn i infeksiøse virioner; og (iii) infeksiøse virioner bestående av nevnte modifiserte virusgenom, utvinnes fra nevnte vertscelle.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinnet med å modifisere DNA-molekylet under ekstracellulære betingelser omfatter et trinn med spaltning av DNA-molekylet med en sekvensspesifikk endonuklease.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at trinnet med modifisering av DNA-molekylet omfatter et trinn med innføyelse av en første DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i nevnte chordopoxvirusgenom.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den første DNA-sekvens innføyes i det første genom i et spaltningssete for en sekvensspesifikk endonuklease.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at spaltningssetet for en sekvensspesifikk endonuklease er et unikt sete i det nevnte genom.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det nevnte genom er et vacciniavirusgenom og det unike sete er et spaltningssete for bakterierestriksjonsendonukleasen utvalgt fra gruppen bestående av Noti, Smal, Apal og Rsrll.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at vacciniavirusgenomet er fra vacciniavirus vdTK som vist i Figur 4.IA.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 7, karakterisert ved at det nevnte genom omfatter en andre DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et chordopoxvirusgenom og nevnte andre DNA-sekvens settes inn i et unikt sete.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 5, karakterisert ved at det nevnte genom er et fjærfekoppervirusgenom som omfatter en sekvens av et Escherichia co//-6-galaktosidasegen og det unike sete er et spaltningssete for den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 9, karakterisert ved at den første DNA-sekvens innføyes i det nevnte genom mellom et første spaltningssete for en første sekvensspesifikk endonuklease og et andre spaltningssete for en andre sekvensspesifikk endonuklease.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at både det første og det andre spaltningssete er unike i det første genom.

12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 11, karakterisert ved at minst en del av den første DNA-sekvens som innføyes i det første genom, er under transkripsjonskontroll av en promoter.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at promoteren er lokalisert i den første DNA-sekvens som innføyes i det første genom.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12 til 13, karakterisert ved at promoteren er lokalisert i det nevnte modifiserte virusgenom oppstrøms for den første DNA-sekvens som innføyes i det første genom.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at promoteren utnyttes av en RNA-polymerase som kodes for av det modifiserte virusgenom.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at promoteren er egnet for initiering av transkripsjon ved hjelp av en RNA-polymerase fra cohordopoxviruset.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at promoteren omfatter en modifikasjon av en naturlig forekommende promoter fra chordopoxviruset.

18. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 17, karakterisert ved at trinnet med å modifisere DNA-molekylet omfatter et trinn med deletering av en DNA-sekvens fra det første genom.

19. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 17, karakterisert ved at trinnet med å modifisere DNA-molekylet omfatter et trinn med substitusjon av en DNA-sekvens i det første genom.

20. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 19, karakterisert ved at den videre omfatter infisering av nevnte vertscelle med et andre chordopoxvirus omfattende et andre genom som uttrykkes for å pakke nevnte modifiserte virusgenom inn i infeksiøse virioner.

21. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene krav 1 til 20, karakterisert ved at introduksjonen av nevnte modifiserte DNA-molekyl inn i nevnte vertscelle utføres ca. én time etter infeksjon av nevnte første vertscelle med nevnte andre chordopoxvirus.

22. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 21, karakterisert ved at ekspresjon av nevnte andre genom i nevnte vertscelle ikke produserer infeksiøse virioner omfattende nevnte andre genom.

23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 22, karakterisert ved at nevnte modifiserte virusgenom er et modifisert vacciniavirusgenom, nevnte andre genom er et fjærfekoppervirusgenom, og nevnte vertscelle er en pattedyrcelle.

24. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 23, karakterisert ved at trinnet med å utvinne infeksiøse virioner bestående av nevnte modifiserte virusgenom omfatter et trinn med infeksjon av en andre vertscelle med infeksiøse virioner fremstilt ved hjelp av den første vertscelle, under slike betingelser at ekspresjon av det andre genom i den nevnte vertscelle ikke gir infeksiøse virioner bestående av det andre genom.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at det modifiserte virusgenom er et modifisert vacciniavirusgenom, det andre genom er et fjærfekoppervirusgenom og den andre vertscelle er en pattedyrcelle.

26. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 25, karakterisert ved at nevnte modifiserte virusgenom omfatter et selektivt markørgen, nevnte andre genom mangler nevnte selektive markørgen og trinnet med infeksjon av nevnte vertscelle utføres under betingelser som selekterer for et genom som uttrykker nevnte selektive markørgen.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at ekspresjon av nevnte selektive markørgen i vertscellen gir nevnte resistens mot et cytotoksisk medikament som er til stede under infeksjon av nevnte vertscelle i et nivå som er tilstrekkelig til å selektere for et genom som uttrykker nevnte selektive markørgen.

28. Modifisert chordopoxvirus, karakterisert ved at det kan dannes ved direkte molekylær kloning av et chordopoxvirusgenom ved (i) modifisering under ekstracellulære betingelser av et renset DNA-molekyl omfattende et genom fra et chordopoxvirus ved a) kløyving av nevnte DNA-molekyl i et unikt sekvensspesifikt endonuMeasespaltningssete og irmsetting av en DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i nevnte genom i nevnte sete, eller b) spaltning av nevnte DNA-molekyl i et første unikt og et andre unikt sekvensspesifikt endonuWeasespaltningssete, og innsetting av en DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende, i nevnte genom mellom nevnte seter for å danne et modifisert DNA-molekyl omfattende nevnte modifiserte virusgenom; (ii) introduksjon av nevnte modifiserte DNA-molekyl inn i en vertscelle hvorved nevnte modifiserte virusgenom pakkes inn i infeksjons virioner; og (iii) utvinning av infeksiøse virioner omfattende nevnte modifiserte virusgenom fra nevnte vertscelle.

29. Modifisert virus ifølge krav 28, karakterisert ved at nevnte DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i nevnte genom i et chordopoxvirus, er et multippelt ldoningssete.

30. Modifisert virus ifølge krav 28, karakterisert ved at nevnte DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i nevnte genom i et chordopoxvirus, er et DNA som koder for et polypeptid.

31. Modifisert virus ifølge ethvert av kravene 28 til 30, karakterisert ved at nevnte chordopox-virusgenom er et vacciniavirusgenom og nevnte unike sete er et spaltningssete for en bakteriell restriksjonsendonuklease utvalgt fra gruppen bestående av Noti, Smal, Apal og Rsrll.

32. Modifisert virus ifølge ethvert av kravene 28 til 31, karakterisert ved at nevnte chordopoxvirusgenom omfatter en andre DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i et genom i et chordopoxvirus og nevnte andre DNA-sekvens innsettes i nevnte unike restriksjonssete.

33. Modifisert virus ifølge kravene 28 til 30, karakterisert ved at nevnte chordopoxvirusgenom er et fjærfekoppervirusgenom omfattende en andre DNA-sekvens fra et Escherichia coli |3-galaktosidasegen og nevnte unike sete er et spaltingssete for den bakterielle restriksjonsendonuklease Noti.

34. Modifisert virus ifølge ethvert av kravene 28 til 33, karakterisert ved at minst én del av nevnte DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i nevnte chordopoxvirusgenom som er innsatt i nevnte unike sete, er under transkripsjonskontroll av en promoter.

35. Modifisert virus ifølge krav 34, karakterisert ved at nevnte promoter er lokalisert i nevnte første DNA-sekvens som innsettes i nevnte første genom.

36. Modifisert virus ifølge krav 34, karakterisert ved at nevnte promoter er lokalisert i nevnte modifiserte virusgenom oppstrøms for nevnte første DNA-sekvens som er innsatt i nevnte genom.

37. Modifisert virus ifølge krav 34, karakterisert ved at nevnte genom er et chordopoxvirusgenom og nevnte promoter omfatter en modifikasjon av en naturlig forekommende chordopoxviruspromoter.

38. DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter et modifisert chordopoxvirusgenom som kan dannes ved direkte molekylær kloning ved modifisering under ekstracellulære betingelser av et renset DNA-molekyl fra et chordopoxvirusgenom ved a) spalting av nevnte DNA-molekyl i et unikt sekvensspesifikt endonukleasespaltingssete og innsetting av en DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i virusgenomet i nevnte sete, eller b) spalting av nevnte DNA-molekyl i et første unikt og et andre unikt sekvensspesifikt endonukleasespaltingssete, og innsetting av en DNA-sekvens som ikke er naturlig forekommende i virusgenomet, mellom nevnte seter for å danne et modifisert DNA-molekyl omfattende nevnte modifiserte virusgenom.

39. Anvendelse av et modifisert virus ifølge ethvert av kravene 28 til 37 for fremstilling av et rekombinant protein fra en vertscelle.