JPWO2019188552A1 - 微生物の細胞及び／又はウイルスの測定方法 - Google Patents

微生物の細胞及び／又はウイルスの測定方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスを精度よく定量する方法を提供することを課題とする。本発明の課題を解決する手段は、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスを測定する方法であって、微生物の細胞及び／又はウイルスを含む被検試料から測定用試料を調製する測定用試料調製工程と、前記測定用試料中の微生物の細胞及び／又はウイルス固有のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を測定する増幅産物測定工程と、増幅産物測定工程の測定結果に基づき前記微生物の細胞及び／又はウイルスの数を測定する測定工程と、を有し、前記測定用試料調製工程は、微生物の細胞及び／又はウイルスからＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する操作を含まず、前記測定用試料調製工程は、前記被検試料に含まれる前記微生物の細胞及び／又はウイルスに対し、超音波処理と間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を含むことを特徴とすることである。

Description

本発明は、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスの測定方法に関する。
現在、乳製品をはじめとして、乳酸菌などの微生物を添加した食品が広く消費者に受け入れられている（非特許文献１〜４）。ここで、乳酸菌などの微生物を含む食品を提供するにあたり、食品等の出荷検査や受け入れ先の受け入れ検査等で食品中の微生物含有量を測定する必要がある。
微生物の検出・定量の技術として、例えば、被検試料をメンブランフィルターでろ過後、適当な培地中で培養し、生育したコロニーを観察する方法が知られている（特許文献１）。
また、乳酸菌検出培地として改変ＮＢＢ培地を使用する方法（非特許文献５）、ＫＯＴ培地を使用する方法（非特許文献６）も知られている。さらに、菌体中のＡＴＰを利用し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による化学発光を用いる方法（非特許文献７、非特許文献８）、また、培地中の菌の生育を培地の電気伝導度の変化で捕らえる方法（非特許文献９）も知られている。
また、汚染の検出や、ウイルスによる感染の検出を目的として、ウイルスの検出・定量が広く行われている。
ウイルスの検出・定量の技術としては、例えば、インフルエンザウイルスの検出・定量を目的として、ウイルスに対する抗体とウイルスの核蛋白質との抗原抗体反応を利用する方法が知られている（特許文献２）。
特開平６−３１１８９４号公報 特開２００５−１６４４９６号公報
Yoshikawa, T. et al. 2009. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73: 1439-1442. Inoue, R. et al. 2010. Immunol Med Microbiol. 61: 94-102. Iwabuchi, N. et al. 2012. Immunol Med Microbiol. 66: 230-239. Nishibayashi, R. et al. 2015. Plos One | DOI:10.1371/journal.pone.0129806. Back, W. 1980. Brauwelt. 120: 1562. Taguchi, H. et al. 1990. J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 72. Hysert, D. W. et al. 1976. J. Am. Soc. Brew. Chem. 34: 145. Soejima, T. et al. 2009. FEMS Microbiol. Lett. 294: 74-81. Vogel, H. & Bohak, I. 1990. Brauwelt. 130: 414.
前述した背景において、被検試料中の微生物の細胞やウイルスを迅速かつ精度よく測定することのできる技術が求められていた。すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の細胞やウイルスを迅速かつ精度よく測定することのできる技術を提供することを課題とする。
前記課題を解決する本発明は、
微生物の細胞及び／又はウイルスを含む被検試料から測定用試料を調製する測定用試料調製工程と、
前記測定用試料中の微生物の細胞及び／又はウイルス固有のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を測定する増幅産物測定工程と、
増幅産物測定工程の測定結果に基づき前記微生物の細胞及び／又はウイルスの数を測定する測定工程と、
を有し、
前記測定用試料調製工程は、微生物の細胞及び／又はウイルスからＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する操作を含まず、
前記測定用試料調製工程は、前記被検試料に含まれる前記微生物の細胞及び／又はウイルスに対し、超音波処理と間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を含むことを特徴とする。
本発明によれば、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスを精度良く測定することができる。また、微生物の細胞からＤＮＡを抽出する操作を行わないため、被検試料中の微生物の細胞を迅速に測定することができる。
本発明の好ましい形態では、前記細胞は生細胞である。
本発明の好ましい形態では、前記分散操作の繰り返し回数は２０回〜１００回である。
分散操作の繰り返し回数を２０回〜１００回とすることで、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスをより精度良く測定することができる。
本発明の好ましい形態では、前記超音波処理が、出力１０Ｗ〜１００Ｗ、処理時間０．１秒〜１秒の条件の超音波処理である。
超音波処理の条件を出力１０Ｗ〜１００Ｗ、処理時間０．１秒〜１秒の条件とすることで、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスをより精度良く測定することができる。
本発明によれば、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスを精度よく測定することができる。
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
＜１＞微生物の細胞及び／又はウイルスの測定方法
本発明の方法は、被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスをデジタルＰＣＲ法により測定する方法である。
本発明の方法は、微生物の細胞及び／又はウイルスの量を決定する方法に限定されず、微生物の細胞及び／又はウイルスの存在を量についての測定値と共に検出する方法も含む。
測定対象となる微生物の細胞としては、デジタルＰＣＲ法により、該微生物のＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し得る限り特に制限されないが、例えば、細菌、糸状菌、酵母等の細胞を挙げることができる。
中でも、本発明の方法は、グラム陽性細菌の細胞を対象とすることが好ましい。グラム陽性細菌としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属細菌、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ウェイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、又はビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌等を挙げることができる。
特にラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌やビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌には人体に有利な生理活性を示すものがあることから、本発明の方法は、ラクトバチルス属細菌及び／又はビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の細胞の測定に適用することが好ましい。
ラクトバチルス属細菌としては、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等を挙げることができる。
ビフィドバクテリウム属細菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、及び、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスに再分類されている）を挙げることができる。
ウイルスとしては、デジタルＰＣＲ法により、該ウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し得る限り特に制限されないが、例えば、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、肝炎ウイルス等を挙げることができる。また、最外殻エンベロープの有無も制限されない。
また、本発明の方法に用いることのできる被検試料に特に制限はなく、例えば、食品、生体試料、ワクチン製剤、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等を挙げることができる。
特に、生体に有利な生理活性を有する微生物の細胞を測定することの有用性の観点から、食品を被検試料とすることが好ましい。食品として、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；チョコレート、キャラメル、キャンディ、ケーキ、ビスケット、クッキー等の菓子；牛乳、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品等の高栄養流動食品、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品を挙げることができる。
本発明において、被検試料は、前述の食品、生体試料、ワクチン製剤、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等そのものであってもよく、これらを希釈もしくは濃縮したもの、又はその他任意の前処理をしたものであってもよい。前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等を好ましく挙げることができる。
また、被検試料中に存在する測定対象の微生物の細胞及び／又はウイルス以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物は、これらを分解する活性を有する酵素による処理等によって除去又は低減させてもよい。被検試料が乳、乳製品、乳又は乳製品を原料とする食品である場合には、被検試料中に存在する微生物の細胞及び／又はウイルス以外の細胞としてウシ白血球及び乳腺上皮細胞等を挙げることができる。
前記酵素としては、夾雑物を分解することができるものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素を挙げることができる。
酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよい。中でも、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等を挙げることができる。
また、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ（登録商標）等を挙げることができる。
また、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ等を挙げることができる。
また、本発明においては、被検試料を希釈することがより好ましい。被検試料を希釈することで、後述する分散操作で被検試料に含まれる微生物の細胞及び／又はウイルスをより効率よく分散させることができる。
被検試料の希釈倍率は、好ましくは３倍〜３５倍、より好ましくは５倍〜３０倍の範囲内とすることがより好ましい。
被検試料の希釈倍率が上記範囲内にあることで、後述する分散操作で被検試料に含まれる微生物の細胞及び／又はウイルスをより効率よく分散させることができる。
＜２＞ 本発明の方法における各工程について
以下、本発明の方法における各工程について、詳細に説明する。
（１）測定用試料調製工程
測定用試料調製工程は、被検試料に必要な試薬の添加や処理を行い、デジタルＰＣＲ法を用いた増幅産物の測定に供するための測定用試料（核酸増幅反応液）を調製する工程である。
そして、測定用試料調製工程は、被検試料に含まれる微生物の細胞及び／又はウイルスを、超音波処理と間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を含む。
超音波処理と間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を含むことで、デジタルＰＣＲチップの一つのウェルに複数の細胞が含まれた凝集体が分注されてしまうことを防ぎ、定量性を向上させることができる。
以下、分散条件のより好ましい形態について説明する。
本発明における、超音波処理の一回当たりの時間は、好ましくは０．１秒〜１秒、より好ましくは０．３秒〜０．９秒、さらに好ましくは０．４秒〜０．８秒、特に好ましくは、０．４５秒〜０．７５秒である。
また、本発明における、間欠処理の一回当たりの時間は、好ましくは０．１秒〜０．７秒、より好ましくは０．２５秒〜０．５５秒である。
また、本発明における、超音波処理の出力は、好ましくは１０Ｗ〜１００Ｗ、より好ましくは２５Ｗ〜４５Ｗ、さらに好ましくは３０Ｗ〜４０Ｗである。
また、本発明における、分散操作の繰り返し回数は、好ましくは２０回〜１００回、より好ましくは３５回〜８０回である。
ここで、超音波処理の一回当たりの時間が０．３秒〜０．４５秒である場合の、分散操作の繰り返し回数は、好ましくは３０回〜９０回、より好ましくは４０回〜６０回である。
また、超音波処理の一回当たりの時間が０．４５秒〜０．７５秒である場合の、分散操作の繰り返し回数は、好ましくは２５回〜８５回、より好ましくは３０回〜５０回である。
また、超音波処理の一回当たりの時間が０．７５秒〜０．９秒である場合の、分散操作の繰り返し回数は、好ましくは２０回〜８０回、より好ましくは２５回〜４５回である。
また、超音波処理の総処理時間（超音波処理の一回あたりの時間×繰り返し回数）は、好ましくは２秒〜１００秒、より好ましくは１２秒〜４１秒である。
以上の条件とすることで、被検試料中の微生物の細胞やウイルスをより迅速かつより精度よく測定することができる。
分散操作には、超音波装置を用いることができる。そして、前述の各種条件は、用いる超音波装置の設定を変更することにより調整することができる。
なお、分散操作は後述する各種試薬や薬剤の添加前、各種試薬や薬剤の添加後の何れの段階であっても行うことができる。
また、測定用試料調製工程では、被検試料に含まれる微生物の細胞及び／又はウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出を行わない。被検試料に含まれる微生物の細胞及び／又はウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出を行わないことで、より迅速に被検試料に含まれる微生物の細胞及び／又はウイルスを測定することができる。
なお、本発明において、「ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出を行う」とは、積極的に細胞を破壊又は溶解して核酸を採取又は精製する操作を意味する。すなわち、細胞を実質的に破壊又は溶解せずにプライマー等の核酸増幅に必要な成分を細胞内に流入させること、増幅産物の一部分を細胞内に留まらせること若しくは細胞外に流出させることは、「ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する」に含まない。
測定用試料調製工程では、デジタルＰＣＲ法に通常用いられる試薬を添加する。具体的には、後述するターゲット領域を増幅するためのプライマー、増幅産物を測定するためのプローブのほか、ｄＮＴＰ混合液、ＤＮＡポリメラーゼ等通常のデジタルＰＣＲに用いられる試薬を添加する。プライマー及びプローブ以外の試薬としては、例えば後述するデジタルＰＣＲ装置を用いる場合には、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ３Ｄ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｖ２（×２）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることができる。
また、測定用試料調製工程では、被検試料に核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加することが定量性の向上の観点から好ましい。
特に、測定用試料調製工程で被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出を行わない本発明においては、被検試料に核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加することが、定量性の向上のために有効である。
ここで「核酸増幅阻害物質」とは、核酸増幅反応又は核酸伸張反応を阻害する物質であって、例えば、ＤＮＡの鋳型に吸着する正電荷阻害物質、又は核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）に吸着する負電荷阻害物質等を挙げることができる。前記正電荷阻害物質としては、カルシウムイオン、ポリアミン、ヘム（ｈｅｍｅ）等を挙げることができる。また、負電荷阻害物質としては、フェノール、フェノール系化合物、ヘパリン、グラム陰性菌の細胞壁外膜等を挙げることができる。食品や臨床検体中には、このような核酸増幅反応を阻害する物質が多く含まれているといわれている。
前述したような核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２−マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチームから、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素等の親水性薬剤が例示できる。これら親水性薬剤は１種のみを用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
前述した親水性薬剤のうち、ポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール４００又はポリエチレングリコール４０００が好ましく例示できる。ベタインとしては、トリメチルグリシンやその誘導体等を挙げることができる。また、ホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素としては、ウサギ筋肉由来のグリコーゲンホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素を挙げることができる。なお、グリコーゲンホスホリラーゼとしては、グリコーゲンホスホリラーゼｂが好ましい。
特に、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びリゾチームを使用することが好ましい。
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に代表されるアルブミンは、ヘム（ｈｅｍｅ）のような核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅阻害を低減させている可能性が示唆されている（Abu Al-Soudら）。
また、Ｔ４ジーン３２プロテインは１本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質であり、核酸増幅過程で鋳型となっている１本鎖ＤＮＡに予め結合することにより鋳型が核酸分解酵素によって分解されることを防いでいるか、または、ＢＳＡと同様の核酸増幅阻害物質に結合することにより核酸増幅阻害を低減しているのであろうと考えられている（Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470, 2000））。
さらに、ＢＳＡ、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤（proteinase inhibitor）は、タンパク質分解酵素（proteinase）に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際ＢＳＡ又はタンパク質分解酵素阻害剤（大豆トリプシンインヒビターやα２−マクログロブリン）の添加により核酸合成酵素が分解を受けずに核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている（Abu Al-Soudら）。
また、デキストランは、一般にグルコースを原料として乳酸菌が合成する、多糖類である。ここで、ムチンという同様の多糖類−ペプチド複合体が腸管粘膜に接着することも報告されており（Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74:1936-1940, 2008）、デキストランが負電荷阻害物質（核酸合成酵素に吸着）、又は正電荷阻害物質（核酸に吸着）に予め吸着することにより、それら阻害物質に結合する可能性は十分あるものと推察される。
また、リゾチームは、牛乳中に多数含まれている核酸増幅阻害物質と吸着する（前記Abu Al-Soudら）。
以上のことから、アルブミン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、デキストラン、及びリゾチームに代表される親水性薬剤は、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤であるといえる。
アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、乳アルブミン、ヒト血清アルブミン等を挙げることができる。これらの中ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく例示できる。アルブミンは精製品でもよく、本発明の効果を損わない限りグロブリン等の他の成分と組み合わせて用いてもよい。また、アルブミンは分画物であってもよい。
測定用試料（核酸増幅反応液）中のアルブミンの濃度は、例えば、通常０．０００１〜１質量％であり、好ましくは０．０１〜１質量％であり、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。
測定用試料調製工程においては、測定用試料におけるアルブミンの濃度が前記範囲となるように、被検試料にアルブミンを添加することが好ましい。
デキストランとしては、デキストラン４０やデキストラン５００等が挙げられ、特にデキストラン４０を好ましく挙げることができる。
測定用試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１〜８％であり、好ましくは１〜６％であり、より好ましくは１〜４％である。
測定用試料調製工程においては、測定用試料におけるデキストランの濃度が前記範囲となるように、被検試料にデキストランを添加することが好ましい。
Ｔ４ジーン３２プロテインとしては、市販品（例えば、ロシュ社製：ｇｐ３２とも呼ばれる）を用いてもよい。
Ｔ４ジーン３２プロテインの測定用試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１〜１％であり、好ましくは０．０１〜０．１％であり、より好ましくは０．０１〜０．０２％である。
測定用試料調製工程においては、測定用試料におけるＴ４ジーン３２プロテインの濃度が前記範囲となるように、被検試料にＴ４ジーン３２プロテインを添加することが好ましい。
リゾチームとしては、卵白由来のリゾチームを好ましく挙げることができる。
測定用試料（核酸増幅反応液）中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１〜２０μｇ／ｍＬであり、好ましくは６〜１５μｇ／ｍＬであり、より好ましくは９〜１３μｇ／ｍＬである。
測定用試料調製工程においては、測定用試料におけるリゾチームの濃度が前記範囲となるように、被検試料にリゾチームを添加することが好ましい。
測定用試料調製工程においては、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤として、リゾチーム及びポリエチレングリコールの少なくとも一方を用いることが好ましい。
リゾチームとポリエチレングリコールは食品に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質を阻害するため、これらを被検試料に添加することにより、微生物の細胞及び／又はウイルスの定量性を向上させることができる。
また測定用試料調製工程において、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤として、リゾチーム及びポリエチレングリコールを組み合わせて用いることが特に好ましい。
リゾチームとポリエチレングリコールが核酸増幅阻害物質に協奏的に作用し核酸増幅阻害物質の表面構造を変質させるため、これらを組み合わせて用いれば、被検試料に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質をより効率的に阻害することができる。
また、測定用試料調製工程においては、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡ又はＲＮＡの溶液にマグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩等を添加することが好ましい。
マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等を挙げることができる。
測定用試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度が、例えば、１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜６ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡ又はＲＮＡの溶液にマグネシウム塩を添加することが好ましい。
有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩を挙げることができる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。また、リン酸塩として、ピロリン酸等を挙げることができる。これらは１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。
測定用試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度が、例えば、合計量で０．１〜２０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡ又はＲＮＡの溶液に有機酸塩又はリン酸塩を添加することが好ましい。
なお、測定用試料調製工程において、前述したプライマー、プローブを含むデジタルＰＣＲ法を用いた核酸増幅、増幅産物の測定のための試薬、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩の添加の順序は問わず、また、同時に（あらかじめ混合する形態を含む）添加してもよい。
（２）増幅産物測定工程
増幅産物測定工程は、測定用試料調製工程で調製した測定用試料中の前記細胞のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を測定する工程である。
デジタルＰＣＲ法は、測定対象となるＤＮＡ又はＲＮＡを含む試料を多数のウェルを備えるチップに分配し、ウェルごとに個別に核酸増幅を行い、各ウェルでの「増幅の有無」を検出し、シグナルのあるウェルの数をターゲットのコピー数として直接的に算出する方法である。
デジタルＰＣＲは、市販のデジタルＰＣＲ装置を用いることができる。デジタルＰＣＲとして、例えば、２００００ウェルを備える疎水性のチップにより解析を行うＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ３Ｄ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることが好ましい。
核酸増幅反応の条件は特に限定されず、ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域の長さ、プライマーのＴＭ値などを考慮して適宜設定することができる。
各ウェルにおける核酸増幅の有無は、蛍光分子などで標識されたプローブを増幅産物にハイブリダイズさせることにより判別することができる。すなわち、核酸増幅反応が起こったウェルではプローブに由来するシグナルが観察される。蛍光分子で標識されたプローブを用いる場合には、ケミルミフォトメータなどの装置によってウェルから発する蛍光を検出することができる。
本発明において「ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域」とは、測定対象である微生物及び／又はウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡのうち、デジタルＰＣＲによる増幅の目的とする領域である。例えば、被検試料に測定対象の微生物及び／又はウイルスと異なる種類の細胞が含まれる場合には、ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域は、測定対象の微生物及び／又はウイルスに特異的な配列を含むように設定することが好ましい。また、目的によっては複数種の微生物及び／又はウイルスに共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。
ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域の長さとしては、通常５０〜５０００塩基、又は５０〜３０００塩基を挙げることができる。核酸の増幅に用いるプライマーは核酸増幅法の原理に基づいて適宜設定することが可能であって、上記ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
好ましいＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域の例は、５Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子、ｔＤＮＡ遺伝子、及び病原遺伝子等の各種特異遺伝子である。これらの遺伝子の一つ又はその一部をターゲットとしてもよく、２又はそれ以上の遺伝子にまたがる領域をターゲットとしてもよい。
特に、ラクトバチルス・パラカゼイの細胞を測定対象とする場合には、配列番号１及び配列番号２に示すプライマーセット、配列番号３に示すプローブを用いることができる（表３参照）。同プライマーセットは、ラクトバチルス・パラカゼイの１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の一部を特異的に増幅することができる。
特に、ビフィドバクテリウム・ブレーベの細胞を測定対象とする場合には、配列番号４及び配列番号５に示すプライマーセット、配列番号６に示すプローブを用いることができる（表７参照）。同プライマーセットは、ビフィドバクテリウム・ブレーベの１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の一部を特異的に増幅することができる。
また、複数種の微生物及び／又はウイルスに共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の細胞及び／又はウイルスを測定することができる。また、特定の微生物及び／又はウイルスに特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の微生物の細胞及び／又はウイルスを測定することができる。
また、測定対象が生菌である場合には、加熱工程を含むことが好ましい。
ここで、本発明における加熱工程は、増幅産物測定時のＰＣＲのサーマルサイクルが加熱工程を兼ねていてもよく、また、別途被検試料若しくは測定用試料に熱を加える工程であってもよい。
加熱工程を含むことで、生菌のＤＮＡが流出することなく細胞膜が損傷し、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、プローブ等の成分が細胞内に侵入するため、被検試料中の特定の微生物の細胞及び／又はウイルスをより精度よく測定することができる。
加熱工程における加熱温度は、好ましくは８０℃以上、より好ましくは８５℃以上、より好ましくは９０℃以上、さらに好ましくは９５℃以上である。
このような形態とすることで、生菌のＤＮＡが流出することなく細胞膜が損傷し、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、プローブ等の成分が細胞内に侵入するため、被検試料中の特定の微生物の細胞及び／又はウイルスをより精度よく測定することができる。
また、加熱工程における加熱時間は、好ましくは５分以上、より好ましくは７分以上、さらに好ましくは９分以上である。
このような形態とすることで、生菌の細胞膜が損傷し、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、プローブ等の成分が細胞内に侵入するため、被検試料中の特定の微生物の細胞及び／又はウイルスをより精度よく測定することができる。
また、加熱工程における加熱時間は、好ましくは２０分以下、より好ましくは１５分以下、さらに好ましくは１２分以下である。
このような形態とすることで、生菌のＤＮＡが流出することなく細胞膜が損傷し、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、プローブ等の成分が細胞内に侵入するため、被検試料中の特定の微生物の細胞及び／又はウイルスをより精度よく測定することができる。
なお、加熱工程における各種条件は、用いるデジタルＰＣＲ装置の設定を変更することにより、調整することができる。
（３）生物の細胞及び／又はウイルスの数の測定工程
測定工程は、増幅産物測定工程の測定結果に基づき微生物の細胞及び／又はウイルスの数を測定する工程である。
前述した増幅産物測定工程では、デジタルＰＣＲチップに備えられた全ウェルに対する、核酸増幅反応が陽性又は陰性であるウェルの数又は割合に関する情報が得られる。この情報に基づき被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスの定量値を算出する方法は、特に制限されず、例えば、ポアソン分布モデルに適合させて解析する方法を挙げることができる。なお、核酸増幅反応が陽性又は陰性のウェルに関する情報から微生物の細胞及び／又はウイルスの定量値を算出する計算は、専用のクラウド型解析ソフトを用いて行うこともできる。
以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［試験例１］分散条件が測定結果に与える影響について
試験例１では、分散条件が測定結果に与える影響について検討を行った。
（１）被検試料の調製
クリニカル食品１０ｍｌに、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）死菌体をその菌体濃度が２．０ × １０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう添加した。その後、表５に示す希釈溶媒を用いて２０倍希釈し、被検試料とした。
（２）測定用試料の調製
（２−１）分散操作
前記（１）で得られた被検試料を３ｍｌ採取した。採取した被検試料に対し、超音波機器（ＢＲＡＮＳＯＮ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０ＡＡ 株式会社セントラル科学貿易 社製）を用いて、氷水中で表５に示す条件の分散操作を行った。
（２−２）測定用試料の調製
分散操作後の被検試料２μｌを表１に示すＰＣＲマスターミックスに加えることで、測定用試料を調製した。
Figure 2019188552
ここで、表１中のｃＤＢＣ（濃縮ダイレクトコンポーネントの略）は、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤である。そして、ｃＤＢＣは、ウシ血清アルブミン（シグマ社、以下、ＢＳＡと表記）、クエン酸三ナトリウム２水和物（関東化学社、以下、ＴＳＣと表記）、塩化マグネシウム６水和物（ナカライテスク社、以下、ＭｇＣｌ２と表記）、卵白リゾチーム（和光純薬、以下、単にリゾチームと表記）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標：シグマ社）を、表２に示す濃度となるよう混合することにより、調製した。
Figure 2019188552
また、使用したフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの配列を表３に示す。
Figure 2019188552
（３）増幅産物の測定及び細胞の定量
調製した測定用試料を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ２０Ｋ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔ ｖ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）のチップ中の各ウェル（およそ１８，０００ウェル）に、専用のローダーを用いて８６５ｐＬずつ分注した。分注後、デジタルＰＣＲ装置（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、表４に示すＰＣＲサーマルサイクル条件により、デジタルＰＣＲを実施した。
Figure 2019188552
キット専用のチップリーダーを用いて緑色蛍光を発するウェル数及びその蛍光強度を計測し、増幅産物の測定を行った。
その増幅産物の測定結果に基づき、ポアソン分布に従ってデジタルＰＣＲに供した被検試料に含まれるラクトバチルス・パラカゼイ特異遺伝子のコピー数を専用のクラウド型解析ソフトを用いて算出した。
（４）結果
表５にデジタルＰＣＲの結果を示す。
Figure 2019188552
（５）考察
表５に示す結果より、超音波処理と間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を行うことにより、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができることがわかった。
ここで、比較例１と各実施例の結果の比較から、分散操作の繰り返し回数を２０回以上とすることで、被検試料中の微生物の細胞の凝集を抑え、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができることがわかった。
また、実施例１〜実施例３と、実施例４〜実施例５の結果の比較から、分散操作の繰り返し回数を１００回以下とすることで、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができることがわかった。なお、分散操作の繰り返し回数が多い場合は、細胞膜が崩壊し、ＤＮＡが流出してしまうことにより、被検試料中の微生物の細胞の定量精度が低下したものと考えられる。
［試験例２］菌種の選択及び、菌体の生死が測定結果に与える影響について
試験例２では、菌種の選択及び、菌体の生死が測定結果に与える影響について検討を行った。
（１）被検試料の調製
（１−１）生菌懸濁液の調製
ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＭＣＣ１２７４（Ｂ−３株）をＬ−Ｃｙｓｔｅｉｎ含有ＭＲＳブロスで１６時間嫌気培養した。
培養後洗浄し、同容量の０．１％Ｔｗｅｅｎ８０−ＰＢＳと混合し、生菌懸濁液を調製した。調製した生菌懸濁液の濃度をバクテリア計算盤を用いて測定をしたところ、１．６×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。
（１−２）死菌懸濁液の調製
ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＭＣＣ１２７４（Ｂ−３株）をＬ−Ｃｙｓｔｅｉｎ含有ＭＲＳブロスで１６時間嫌気培養した。培養後に、オートクレーブ機を用い７０℃、２分加熱処理した。加熱処理後洗浄し、同容量の０．１％Ｔｗｅｅｎ８０−ＰＢＳに懸濁させ、死菌懸濁液を調製した。その後、死菌懸濁液をＴＯＳ寒天培地で培養し、コロニーを形成しないことを確認した。また、調製した死菌懸濁液の濃度をバクテリア計算盤を用いて測定をしたところ、５．３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。
（１−３）被検試料の調製
（１−１）、（１−２）で調製した各菌体を含む懸濁液を、各菌体の濃度が２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう、市販の牛乳（森永乳業株式会社製）に添加した。その後、菌体を含む牛乳を０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０−ＰＢＳを用いて２０倍に希釈することにより、被検試料を調製した。
（２）測定用試料の調製
（２−１）分散操作
前記（１）で得られた被検試料を３ｍｌ採取した。採取した被検試料に対し、超音波機器（ＢＲＡＮＳＯＮ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０ＡＡ 株式会社セントラル科学貿易 社製）を用いて、氷水中で表８に示す条件の分散操作を行った。
（２−２）測定用試料の調製
分散操作後の被検試料２μｌを表６に示すＰＣＲマスターミックスに加えることで、測定用試料を調製した。
Figure 2019188552
ここで、表６中のｃＤＢＣは、試験例１と同様のものを用いた。
また、使用したフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの配列を表７に示す。
Figure 2019188552
（３）増幅産物の測定及び細胞の測定
試験例１と同様の方法で、デジタルＰＣＲを実施した。
（４）結果
デジタルＰＣＲの結果を表８に示す。
Figure 2019188552
（５）考察
表８の結果より、菌種の選択及び菌体の生死を問わず、超音波処理と、間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を行うことにより、分散操作を行わない比較例２、比較例３に比して、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができることがわかった。
［試験例３］被検試料の選択、及び被検試料の希釈倍率が測定結果に与える影響について
試験例３では、被検試料の選択、及び被検試料の希釈倍率が測定結果に与える影響について検討を行った。
（１）被検試料の調製
表９に示すとおり、菌体を食品に添加した。その後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０−ＰＢＳを用いて表９に示す希釈倍率となるよう菌体含有食品を希釈することにより、被検試料を調製した。
（２）測定用試料の調製
（２−１）分散操作
前記（１）で得られた被検試料を３ｍｌ採取した。採取した被検試料に対し、超音波機器（ＢＲＡＮＳＯＮ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０ＡＡ 株式会社セントラル科学貿易 社製）を用いて、氷水中で表９に示す条件の分散操作を行った。
（２−２）測定用試料の調製
分散操作後の被検試料を、フィルターバッグを用いて濾過し、不溶成分を除去した。
不溶性分除去後の被検試料２μｌを表１に示すＰＣＲマスターミックスに加えることで、測定用試料を調製した。
（３）増幅産物の測定及び細胞の測定
試験例１と同様の方法で、デジタルＰＣＲを実施した。
（４）結果
デジタルＰＣＲの結果を表９に示す。
Figure 2019188552
（５）考察
表９の結果より、被検試料の希釈倍率を問わず、超音波処理と、間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を施すことにより、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができることがわかった。
また、表９の結果より、被検試料の種類に関係なく、超音波処理と、間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を施すことにより、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができることがわかった。
［試験例４］測定対象以外の菌体の存在が測定結果に与える影響について
試験例４では、測定対象以外の菌体の存在が測定結果に与える影響について検討を行った。
（１）被検試料の調製
ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）以外の菌体を含む食品１０ｇに、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）を表１０に示す菌体濃度となるよう添加した。その後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０−ＰＢＳを用いて表１０に示す希釈倍率となるよう食品に希釈することにより、被検試料を調製した。
（２）測定用試料の調製
（２−１）分散操作
前記（１）で得られた被検試料を３ｍｌ採取した。採取した被検試料に対し、超音波機器（ＢＲＡＮＳＯＮ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０ＡＡ 株式会社セントラル科学貿易 社製）を用いて、氷水中で表１０に示す条件の分散操作を行った。
（２−２）測定用試料の調製
分散操作後に、試験例１、試験例２と同様の方法で、測定用試料を調製した。
（３）増幅産物の測定及び細胞の測定
試験例１と同様の方法で、デジタルＰＣＲを実施した。
（４）結果
デジタルＰＣＲの結果を表１０に示す。
Figure 2019188552
（５）考察
表１０の結果より、測定対象以外の菌体の存在に関係なく、超音波処理と、間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を施すことにより、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができることがわかった。
本発明は食品等の出荷検査や受け入れ先の受け入れ検査における菌体含有量の測定及びウイルスの定量に応用することができる。

Claims (4)

  1. 被検試料中の微生物の細胞及び／又はウイルスを測定する方法であって、
    微生物の細胞及び／又はウイルスを含む被検試料から測定用試料を調製する測定用試料調製工程と、
    前記測定用試料中の微生物の細胞及び／又はウイルス固有のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を測定する増幅産物測定工程と、
    増幅産物測定工程の測定結果に基づき前記微生物の細胞及び／又はウイルスの数を測定する測定工程と、
    を有し、
    前記測定用試料調製工程は、微生物の細胞及び／又はウイルスからＤＮＡ又はＲＮＡを抽出する操作を含まず、
    前記測定用試料調製工程は、前記被検試料に含まれる前記微生物の細胞及び／又はウイルスに対し、超音波処理と間欠処理とを連続して繰り返す分散操作を含むことを特徴とする、方法。
  2. 前記細胞が生細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分散操作の繰り返し回数が、２０回〜１００回である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記超音波処理が、出力１０Ｗ〜１００Ｗ、処理時間０．１秒〜１秒の条件の超音波処理である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。

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