CN102471768B

CN102471768B - 用于微生物检测的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102471768B
Application number: CN201080033156.XA
Authority: CN
Inventors: 副岛隆志; 弗兰克·施利特-迪特里希
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2030-07-23
Also published as: KR101383389B1; EP2458002A4; JPWO2011010740A1; WO2011010740A1; CA2768699C; CN102471768A; AU2010275576B2; RU2527897C2; US9394572B2; US20120122082A1; NZ597138A; EP2458002B1; US10329604B2; CA2768699A1; EP2458002A1; CN103820578B; RU2012106617A; MX2012001000A; JP4825313B2; AU2010275576A1

Abstract

将试验样品中微生物的活细胞与死细胞或损伤细胞相区别并借助以下步骤来检测：步骤(a)其中向所述试验样品中添加药物学制剂，当用具有波长50至700nm的光照射时所述药物学制剂与DNA或RNA共价结合；步骤(b)其中用具有波长350至700nm的光照射添加有交联剂的所述试验样品；步骤(c)其中在抑制核酸扩增抑制剂作用的药物学制剂的存在下，通过使用核酸扩增方法，在不从所述细胞中提取核酸的情况下扩增所述试验样品中的所述微生物的DNA或RNA的目标区域；以及步骤(d)其中分析由此获得的扩增产物。

Description

用于微生物检测的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及用于检测包含于食品、生物样品和环境样品如工业用水和自来水中的微生物的方法和试剂盒。更精确地，本发明涉及用于检测微生物的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒能够选择性检测包含于食品、生物样品、抽汲样品(swab sample)和环境样品如工业用水和自来水中的微生物的活细胞。

背景技术

平板培养法已通常用于食品、生物样品、抽汲样品或环境样品中的总活菌数的测定。然而，平板培养法需要约两天至一个月的时间来获得结果。

由于灭菌技术和食品加工技术的改进，甚至在细胞以极少量存在的情况下，对于存在于试验样品中的微生物活体状态与微生物死亡状态的识别的需求增加。在食品卫生检查和临床试验领域中，尤其是作为细菌快速检测法，尝试通过PCR将对细菌特异的基因扩增至能够视觉观察到基因的量，来测定细菌的存在与否或者定量细菌。然而，如果以细菌DNA为靶标，则也会检测到试验样品中原本包含的死细胞的背景，因而通过PCR获得的阳性结果不一定表明活细菌的存在。因此，食品卫生和临床试验领域的现状是，尽管PCR是高度敏感和快速的技术，但并未广泛应用。

近来，尝试通过用作为靶标的mRNA的逆转录酶制备cDNA并用对各种细菌特异的引物进行PCR，来只检测和定量试验样品中的微生物的活细胞。然而，在该方法中，并未抑制死细胞自身mRNA的逆转录，并且当在试验样品中包含10⁴cfu/ml或 10⁴cfu/g以上的死细胞时，会检测到死细胞的背景。因此，不能说该方法足以作为测定活体和死亡状态的方法。

具体地，作为使用PCR法区别微生物如细菌的活体状态与死亡状态的方法，已公开了专利文献1和2中记载的方法。然而，使用PCR法区分微生物如细菌的活体和死亡状态的这些方法存在以下问题。

对公开于专利文献1中的技术而言，提及实施例用于识别包含于在100℃下进行10至30分钟的高温长时间灭菌(sterilization)的煮沸食品中的死细胞和包含于进行乙醇灭菌或甲醛灭菌的食品的微生物。然而，特别是后一类型的处理，实际上并没有食品进行此类巴氏消毒法(pasteurization)处理。并且，并不认为存在：在目前食品工业中进行主流巴氏消毒法(低温长时间巴氏消毒法(LTLT巴氏消毒法)、高温短时间巴氏消毒法(HTST巴氏消毒法)或超高温巴氏消毒法(UHT巴氏消毒法))的食品中仅活体微生物的检测，和在施用抗生素的传染病患者的临床试样中仅活体特定病原菌的检测。另外，在以10⁴cfu/ml以上的浓度包含死细胞背景的食品或临床试样的试验样品的情况中，源于死细胞的最终PCR扩增产物的量超过了专利文献1的技术的检测极限，因此不可能确定通过PCR获得的试验样品的阳性响应是源于活细胞还是源于死细胞。

此外，作为专利文献2的技术，公开了通过利用与活细胞的RNA/DNA的摩尔比相比，死细胞RNA/DNA的摩尔比的相对减少来识别活细胞与死细胞的方法。在该方法中，提取总RNA，通过使用逆转录反应来制备互补DNA，然后进行PCR来计算其Ct值，通过使用单独制备的校准曲线(calibration curve)来获得RNA的摩尔浓度。分别地，通过PCR扩增与该RNA相对应的染色体DNA的区域从而获得其Ct值，基于校准曲线计算染色体 DNA的摩尔浓度从而获得RNA/DNA摩尔比。即，上述方法需进行复杂的总RNA提取并使用逆转录反应和PCR两步。因此，该技术在定量性和快速性上次于靶向DNA的一般PCR。此外，在活细胞中连续不断地产生RNA，然而在初期源于死细胞的RNA随时间的流逝而被分解。因此，该技术缺乏稳定性。此外，在以高浓度包含死细胞的食品或临床试样中，可通过该技术检测到仅1/10该浓度的活细胞。因此，在需要快速性、高灵敏度和准确性的食品卫生检查和临床试验领域中难以应用该技术。

专利文献3中公开了一种通过区分微生物的活细胞(有生活力并可培养的细胞)和死细胞或损伤细胞(有生活力但不可培养的细胞(VNC细胞))，从而选择性检测微生物的活细胞的方法。专利文献3所公开的方法为包括以下步骤的方法：用拓扑异构酶阻害剂(poison)和/或DNA旋转酶阻害剂处理试验样品的步骤、从试验样品中提取DNA和通过PCR扩增所提取DNA的目标区域的步骤以及分析扩增产物的步骤，并且例举了单叠氮乙锭(ethidium monoazide)作为拓扑异构酶阻害剂或DNA旋转酶阻害剂。

非专利文献1还公开了一种其中使用单叠氮乙锭的方法。该方法为包括以下步骤的检测方法：向试验样品添加单叠氮乙锭并用光照射该样品的步骤、照射后从该样品中提取DNA的步骤以及使用所提取的DNA作为模板通过PCR扩增特定区域的步骤。此外，在非专利文献1中公开了一种通过结合微生物培养和实时PCR来定量活细胞数的半定量技术。

此外，作为用于更加清楚地区分微生物的活细胞和损伤细胞的方法，公开了专利文献4中记载的方法。该方法为包括以下步骤的方法：向试验样品添加交联剂的步骤，所述交联剂通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够交联DNA；用具有 350nm至700nm波长的光照射添加了交联剂的试验样品的步骤；移除在用光照射的试验样品中包含的交联剂的步骤；向除去交联剂的试验样品中添加培养基并温育试验样品的步骤；向温育的试验样品再次添加交联剂的步骤，所述交联剂通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够交联DNA；用具有350nm至700nm波长的光照射添加了交联剂的试验样品的步骤；从试验样品中提取DNA并通过核酸扩增法扩增所提取DNA的目标区域的步骤以及分析扩增产物的步骤。

其间，表明存在这样一种可能性，即：在通过PCR扩增核酸时，白蛋白可抑制PCR抑制剂的抑制活性，或促进PCR反应(非专利文献2)。此外，还表明钙抑制PCR反应，但通过添加镁离子可容许钙对PCR的抑制(非专利文献3)。

此外，公开了一种使用细菌DNA作为模板进行PCR反应的方法，其中在不从细菌中提取DNA的情况下进行PCR反应(非专利文献4、专利文献5)。在专利文献5中，公开了在DNA指纹法中在细菌中进行随机PCR，并提及将磷酸盐和十二烷基硫酸盐作为核酸合成的缓冲组合物的组分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：PCT申请(KOHYO)的日文译文的特表2003-530118号公报

专利文献2：国际专利公布WO2002/052034号

专利文献3：国际专利公布WO2007/094077号

专利文献4：国际专利公布WO2009/022558号

专利文献5：国际专利公布WO2004/104196号

非专利文献：

非专利文献1：Rudi，K.等人，Letters in Applied Microbiology， 2005，Vol.40，pp.301-306

非专利文献2：Forbes，B.E.等人，Journal of Clinical Microbiology，1996，34(9)，pp.2125-2128

非专利文献3：Bickley，J.等人，Letter in Applied Microbiology，1996，22，pp.153-158

非专利文献4：Kimberly，A.等人，BioTechniques，31，2001，pp.598-607

发明内容

发明要解决的问题

通过前述使用拓扑异构酶阻害剂和/或DNA旋转酶阻害剂或者交联剂的方法，可以高敏感度地选择性检测微生物的活细胞，特别是克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、李斯特菌属(Listeria)和沙门氏菌属(Salmonella)细菌等的活细胞。然而，期望进一步改进的方法，特别是用于高灵敏或高准确地检测埃希氏菌属(Escherichia)或沙门氏菌属细菌的活细胞的方法。

本发明的目的为提供用于同包含于食品或生物样品中的微生物的死细胞或损伤细胞相比，更加有选择地检测所述微生物的活细胞的新方法以及用于进行此方法的试剂盒。

用于解决问题的方案

本发明的发明人对识别微生物生存与死亡的方法(可应用于各种灭菌法并适用于高检测灵敏度的食品卫生检查)以及在医院或临床实践中检测传染病患者的特定病原体的方法进行了广泛的研究。结果，本发明人发现通过以下步骤可以高灵敏度地实现上述识别：向试验样品添加通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂；用具有350nm 至700nm波长的光照射试验样品；添加用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂(镁盐和有机酸盐或磷酸盐)，并通过核酸扩增反应扩增溢出细胞的微生物的染色体DNA。由此，完成了本发明。

即，本发明提供通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的方法，其包括以下步骤：

a)向所述试验样品添加通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂；

b)用具有350nm至700nm波长的光照射添加了所述试剂的所述试验样品；

c)在抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的存在下，通过核酸扩增法，在不从所述细胞中提取核酸的情况下扩增包含于所述试验样品的所述微生物的DNA或RNA的目标区域；和

d)分析扩增产物。

在本发明的优选实施方案中，所述目标区域的扩增在微生物细胞中进行。

在前述方法的优选实施方案中，在前述步骤c)中，在选自表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐中的一种或多种的存在下进行所述目标区域的扩增。

在前述方法的优选实施方案中，在所述步骤c)之前，重复进行所述步骤a)和b)。

在前述方法的优选实施方案中，在所述步骤a)之前，进行以下步骤e)：

e)用存在于所述试验样品中的具有分解除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒(colloidal particle)、脂质或糖类的活性的酶处理所述试验样品。

在前述方法的优选实施方案中，所述酶选自蛋白酶、脂质降解酶和糖类降解酶。

在前述方法的优选实施方案中，所述试验样品为食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土壤和抽汲样品之一。

在前述方法的优选实施方案中，所述微生物为细菌或病毒。

在前述方法的优选实施方案中，所述细菌为革兰氏阴性菌。

在前述方法的优选实施方案中，其中通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭(ethidium diazide)、单叠氮丙锭(propidium monoazide)、补骨脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。

在前述方法的优选实施方案中，用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂由以下组成：选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白(T4 gene 32 protein)、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。

在前述方法的优选实施方案中，所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。

在前述方法的优选实施方案中，所述磷酸盐为焦磷酸盐。

在前述方法的优选实施方案中，所述目标区域为50至5,000个核苷酸的目标区域。

在前述方法的优选实施方案中，所述目标区域为相应于选自所述试验样品的DNA的5S rRNA基因、16S rRNA基因、23SrRNA基因和tRNA基因中的基因的目标区域。

在前述方法的优选实施方案中，所述核酸扩增法为PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC或微阵列法。

在前述方法的优选实施方案中，PCR作为实时PCR来进行，从而同时进行PCR和所述扩增产物的分析。

在前述方法的优选实施方案中，通过使用标准曲线来进行所述扩增产物的分析，所述标准曲线表示所述微生物的量与所述扩增产物之间的关系，并通过使用所述微生物的标准样品来建立。

作为本发明的试剂盒，提供一种用于检测试验样品中微生物的活细胞的试剂盒，其通过核酸扩增法来识别所述活细胞与死细胞或损伤细胞，所述试剂盒包括以下组分：

1)通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂；

2)用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂；和

3)一种或多种通过核酸扩增法扩增将要检测的微生物的DNA或RNA目标区域的引物。

在前述试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒进一步包括选自表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐的一种或多种。

在前述试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒进一步包括具有分解存在于所述试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶。

在前述试剂盒的优选实施方案中，所述核酸扩增法为PCR、RT-PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC或微阵列法。

在前述试剂盒的优选实施方案中，通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单叠氮丙锭、补骨脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。

在前述试剂盒的优选实施方案中，用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂由以下组成：选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。

在前述试剂盒的优选实施方案中，所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。

在前述试剂盒的优选实施方案中，所述磷酸盐为焦磷酸盐。

在前述试剂盒的优选实施方案中，所述酶选自蛋白酶、脂质降解酶和糖类降解酶。

附图说明

[图1]在本发明的方法中获得的PCR扩增产物的电泳照片，“活”表示活细胞，“损伤”表示损伤细胞

[图2]显示通过本发明的方法进行的微生物活细胞检测的结果的电泳照片

[图3]显示通过常规方法进行的微生物活细胞检测的结果的电泳照片，“活”表示活细胞，“损伤”表示损伤细胞

[图4]阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)细菌的未加热生理盐水悬浮液的荧光显微照片和立体显微照片

[图5]阪崎肠杆菌细菌的未加热生理盐水悬浮液的上清液的荧光显微照片和立体显微照片

[图6]重复热循环后阪崎肠杆菌细菌的生理盐水悬浮液的荧光显微照片和立体显微照片

[图7]重复热循环后阪崎肠杆菌细菌的生理盐水悬浮液的上清液的荧光显微照片和立体显微照片

[图8]悬浮于未加热预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的荧光显微照片和立体显微照片

[图9]悬浮于未加热预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的上清液的荧光显微照片和立体显微照片

[图10]重复热循环后悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的荧光显微照片和立体显微照片

[图11]重复热循环后悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌的上清液的荧光显微照片和立体显微照片

[图12]显示在未加热状态或重复热循环后阪崎肠杆菌细菌的生理盐水悬浮液或其上清液的流式细胞术结果的图

[图13]显示在未加热状态或重复热循环后悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细菌或其上清液的流式细胞术结果的图

[图14]16S-23S rRNA基因扩增产物的电泳照片，在本发明的方法中该扩增产物是使用各种固定液处理的阪崎肠杆菌细菌获得的。Ct值用平均值和SD表示，SD在括号内示出

L：100bp DNA梯带(DNA ladder)

A：固定液A

B：固定液B

C：固定液C

S：未固定

[图15]ompA基因扩增产物的电泳照片，在本发明的方法中该扩增产物是使用各种固定液处理的阪崎肠杆菌细菌获得的。Ct值用平均值和SD表示，SD在括号内示出

A：固定液A

B：固定液B

L：100bp DNA梯带

[图16]通过使用阪崎肠杆菌细菌的PCR(16S-23S rRNA基因扩增反应)前后获得的电泳照片

泳道2和3：PCR反应混合物的上清液

泳道5和6：PCR反应后从通过离心洗涤两次的沉淀物(pellet)中提取的DNA

泳道7和8：直接从细胞提取的DNA

泳道9和10：临PCR前从实际用于试验的细胞中提取的DNA

泳道13和14：从添加PCR产物后洗涤的细胞中提取的DNA

L：100bp DNA梯带

B：固定液B

S：未固定

[图17]在生理盐水或预处理剂的存在下进行热处理的阪崎肠杆菌细菌的悬浮液及其离心的上清液的电泳照片

L：100bp DNA梯带

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明的优选实施方案。然而，本发明不限于以下优选实施方案，并可在本发明的范围内自由变化。除非特别说明，本说明书的百分比表示为质量百分比。

通过本发明的方法而待检测的靶标包括所有种类的核酸，具体地，包括单链DNA、双链DNA、单链RNA和双链RNA，只要靶标能够被最终扩增即可。其中，检测靶标优选DNA、特别优选双链DNA。

<1>本发明的方法

本发明的方法为通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的方法，其包括以下步骤：

b)用具有350nm至700nm波长的光照射添加了所述试剂的试验样品；

d)分析扩增产物。

在本发明的说明书中，术语“试验样品”是指包含待检测微生物的活细胞的对象物。试验样品不特别限定，只要可通过核酸扩增法对染色体DNA或RNA的特定区域扩增来检测微生物的存在即可。优选的实例包括食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土壤和抽汲样品等。

特别地，食品的优选实例包括：饮品如软饮料、碳酸软饮料、营养饮料(supplement drink)、果汁饮料和乳酸菌饮料(包括这些饮料的浓缩物和粉末)；冰糖果类产品如冰淇淋、冰冻果子露(ice sherbets)和刨冰；乳制品如加工乳、乳饮料、发酵乳和黄油；肠内食品(enteral food)、流体饮食、婴儿用乳、运动饮料；以及功能性食品如特定保健用途的食品和健康辅助食品(dietary supplements)等。

生物样品的实例包括血样、尿样、脑脊液样品、滑液样品、胸膜渗液(pleural effusion)样品、痰样品、粪便样品、鼻腔粘膜样品、喉部粘膜样品、洗胃溶液样品、脓汁样品、皮肤粘膜样品、口腔粘膜样品、呼吸器官粘膜样品、消化器官粘膜样品、眼结膜样品、胎盘样品、生殖细胞样品、产道样品、母乳样品、唾液样品、呕吐物和水疱内容物等。

环境用水的实例包括自来水、地下水、江河水和雨水等。

在本发明中，试验样品可为任何如上所述的食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土壤和抽汲样品等本身，或可为任何其稀释或浓缩产物，或通过除本发明的方法以外的预处理所获得的任何产物。预处理的实例包括热处理、过滤和离心等。

进一步，异物如试验样品中除微生物以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质和糖类等可通过用具有降解它们的活性的酶处理等来除去或减少。在试验样品为任何乳、乳制品和由乳或乳制品生产的食品的情况下，试验样品中除微生物以外的细胞的实例包括牛白细胞和乳腺上皮细胞等。同时，在试验样品为任何生物样品如血样、尿样、脑脊液样品、滑液样品和胸膜渗液样品的情况下，所述细胞的实例包括红细胞、白细胞(如粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)和血小板等。

所述酶不特别限定，只要其可降解异物并不损害待检测微生物的活细胞即可，其实例包括，例如，脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶。其中，可使用一种酶或两种以上酶，但优选使用脂质降解酶和蛋白质降解酶二者，或脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶全部。

脂质降解酶的实例包括脂肪酶和磷酸酶等，蛋白质降解酶的实例包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶等，以及糖类降解酶的实例包括淀粉酶和纤维素酶等。

所述“微生物”是将要通过本发明的方法检测的对象物，并不特别限定，只要其可通过核酸扩增法检测，并且用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂以不同于在微生物的死细胞或损伤细胞的方式对所述微生物的活细胞起作用即可。优选的实例包括细菌、真菌、酵母和病毒等。细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌二者。革兰氏阳性菌的实例包括葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、链球菌属(Streptococcus)细菌如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、李斯特菌属(Listeria)细菌如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、分支杆菌属(Mycobacterium)细菌如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)和鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)和梭菌属(Clostridium)细菌如肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)和产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)等。革兰氏阴性菌的实例包括肠细菌，其典型实例为埃希氏菌属(Escherichia)细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌属(Enterobacter)细菌如阪崎肠杆菌、柠檬酸杆菌属细菌如克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)和克雷伯氏菌属细菌如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)以及沙门氏菌属细菌、弧菌属(Vibrio)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌和军团菌属(Legionella)细菌等。病毒的实例包括具有包膜的病毒如流感病毒和不具有包膜而仅具有核壳体(nuleocapsids)的病毒如诺如病毒(noroviruses)、轮状病毒(rotaviruses)和腺病毒(adenoviruses)。

对于病毒而言，已知存在测量水中病毒的活化和失活的方法，其中使光反应性核酸交联剂(EMA)作用于试验样品，然后通过RT-PCR仅测定活化的病毒(http://www.recwet.t.u-tokyo.ac.jp/furumailab/j/sotsuron/H21/H21 sotsuron.html，Development of ethidium monoazide(EMA)-RT-PCR for selective detection of enteric viruses，关于健康相关的水微生物(water microbiology)的第15次国际研讨会(2009年5月31日-6月05日，Ursulines会议中心，Naxos，希腊))。即，表明EMA不渗入活化的病毒，但仅渗入具有严重物理损伤的核壳体的失活病毒，因此，活化病毒(活)和失活病毒(死)可由EMA区别。因此，认为本发明不仅可应用于细菌、丝状真菌和酵母，还可应用于病毒。

在本发明中，“活细胞”是指当在通常优选的培养条件下培养时，处于细胞可增殖并显示微生物的代谢活性的状态(有生活力并可培养的状态)的细胞，并且基本上无细胞壁损伤的细胞。如上所述的代谢活性，可例举ATP活性、酯酶活性等。在本发明中，为了方便起见，病毒颗粒也称为“细胞”。对于病毒而言，“活细胞”是指处于可感染哺乳动物细胞并增殖的状态的病毒。

“死细胞”为处于即使其在最优培养条件下培养也不能增殖、也不显示代谢活性的状态(死亡状态)的细胞。此外，“死细胞”处于以下状态：尽管保持了细胞壁的结构，但细胞壁自身高度损伤，显示弱渗透性的核染色剂如碘化丙锭可渗入或透过细胞壁。对于病毒而言，“死细胞”是指处于不能感染哺乳动物细胞的状态的病毒。

“损伤细胞”(损伤细胞或有生活力但非可培养细胞)为处于以下状态的细胞：由于因人工压力或环境压力而损伤，即使当细胞在通常优选的培养条件下培养也难以增殖，其与活细胞相比显示较低水平的代谢活性，但与死亡细胞相比显示显著水平的代谢活性。对于病毒而言，“损伤细胞”是指处于即使感染哺乳动物细胞也不能在细胞内增殖的状态的病毒。

在本说明书中，除非特别说明，“活细胞”、“死细胞”和“损伤细胞”分别意指微生物的活细胞、死细胞和损伤细胞。

特别地，在食品卫生检查和临床试验领域中，由于温热处理或施用抗生素而显示损伤细胞状态的细菌的检测引起了注意，本发明提供用于检测微生物的方法，所述方法不仅能够检测活细胞，而且还能够识别活细胞与死细胞或损伤细胞。

对于所有活细胞、损伤细胞和死亡细胞，细胞数的单位通常为细胞数(细胞)/ml。在本说明书中，细胞数用对数表示，“log₁₀细胞/ml”意指10^a个细胞/ml。

活细胞数可用形成菌落数(cfu/ml(菌落形成单元/ml))估算，形成菌落数通过在适当的平板培养基中在最优条件下培养获得。可通过例如将活细胞悬浮液进行热处理(例如沸水中的热处理)来制备微生物的损伤细胞的标准样品。在此样品中的损伤细胞数可用热处理前活细胞悬浮液中的cfu/ml估算。尽管用于制备损伤细胞的在沸水中热处理的时间依据微生物的类型而变化，但是在实施例中所述细菌的损伤细胞例如可通过约50秒的热处理来制备。此外，微生物的损伤细胞的标准样品还可通过用抗生素处理来制备。在此情况中，损伤细胞的细胞数可基于形成菌落数(cfu/ml)来估算，所述形成菌落数是当细胞在适当的平板培养基上在最优条件下培养时所观察到的形成菌落数，即，用抗生素处理活细胞悬浮液，然后除去抗生素，测量通过悬浮液的可见光(波长：600nm)的透光度，即，悬浮液的浊度，测量的浊度可与已知活细胞浓度的活细胞悬浮液相比较，从而计算用抗生素处理的损伤细胞数。

对于病毒而言，细胞数的单位用噬斑形成单位(pfu或PFU，plaque-forming unit)表示。

本发明的方法用于微生物的活细胞的检测，并且不同于活细胞的微生物的细胞可为损伤细胞或死细胞。

在本发明中，“活细胞的检测”包括试验样品中活细胞有无的测定以及试验样品中活细胞量的检测二者。活细胞量不限定至绝对量，并可为相对于对照样品中活细胞量的相对量。而且，“通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测活细胞”意指与死细胞或损伤细胞相比更加选择性地检测活细胞。此外，“识别活细胞与死细胞或损伤细胞”包括从死细胞与损伤细胞二者识别活细胞。

下文中，将针对各步骤解释本发明的方法。如上所述，本发明的方法在以下描述的步骤之前可包括用具有分解存在于试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶处理试验样品的步骤。

(1)步骤a)

将通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的试剂添加到试验样品中。即，用该试剂处理试验样品中的微生物。

如下文所述，该试剂插入双链DNA或RNA并通过用光照射而共价结合至所述DNA或RNA从而交联分子。另外，推定通过用光照射使试剂共价结合至单链DNA或RNA，从而抑制PCR反应。下文中该试剂也可简称为“交联剂”。

与微生物的损伤或死细胞以及体细胞如牛白细胞、白细胞或血小板相比，交联剂优选对微生物的活细胞具有不同的作用。更具体地，与微生物的活细胞的细胞壁相比，交联剂优选为可更容易穿过微生物的损伤细胞或死细胞的细胞壁以及体细胞如牛白细胞、白细胞或血小板的细胞膜的交联剂。

交联剂的实例包括单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、补骨脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素和单叠氮丙锭等。可单独使用这些交联剂的一种，或可组合使用其两种以上。

可适当地设定用交联剂处理的条件。例如，易于识别微生物的活细胞与微生物的死或损伤细胞的条件可通过以下测定：向待检测的微生物的活细胞和微生物的死或损伤细胞的悬浮液中添加各种浓度的交联剂；使悬浮液静置各种时间段；通过离心分离细胞；并通过核酸扩增法分析细胞。此外，易于从各种细胞中识别微生物的活细胞的条件可通过以下测定：向待检测的微生物的活细胞和体细胞如牛白细胞或血小板的悬浮液中添加各种浓度的交联剂；使悬浮液静置各种时间段；通过离心分离所述细胞和所述各种细胞；并通过核酸扩增法分析细胞。具体地：例举用单叠氮乙锭处理的条件为4至10℃、1至100μg/ml 的终浓度下处理5分钟至48小时；用双叠氮乙锭处理的条件为4至10℃、1至100μg/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用单叠氮丙锭处理的条件为在4至10℃、1至100μg/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用补骨脂素处理的条件为在25至37℃、1×10^-5至10μg/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用4，5′，8-三甲基补骨脂素处理的条件在25至37℃、1×10^-5至10μg/ml的终浓度下处理5分钟至48小时；用8-甲氧基补骨脂素处理的条件为在25至37℃、1×10^-5至10μg/ml的终浓度下处理5分钟至48小时。

(2)步骤b)

接下来，用具有350nm至700nm波长的光照射包含交联剂的各试验样品。

与微生物的活细胞的细胞壁相比，交联剂可容易地穿过死细胞和损伤细胞的细胞壁。因此，如果在上述时间段内进行处理，认为交联剂基本上不穿过微生物的活细胞的细胞壁，但穿过微生物的损伤或死细胞或死亡体细胞的细胞壁。结果，认为交联剂移入死亡体细胞、死亡和损伤的微生物细胞，并随后与染色体DNA或RNA形成氢键，然后用具有350nm至700nm波长的光照射的交联剂与DNA分子交联或与RNA共价结合，结果引发染色体DNA的变形或RNA被交联剂修饰，最终导致染色体DNA破坏(disruption)(片段化(fragmentation)/切割(cleavage))，或者RNA不行使核酸扩增反应模板的作用。

具有350nm至700nm波长的光可包括至少具有350nm至700nm波长的光，光可为单波长光或多波长光。此外，所有光组分可在350nm至700nm的范围内，或光可包括具有短于350nm波长的短波长光和/或具有长于700nm波长的长波长光。强度分布中的峰优选在350nm至700nm的范围内。优选地，所述光不包括仅由光照射就达到切割微生物的染色体DNA的程度的短波长组分。

当损伤或死细胞的染色体DNA比微生物的活细胞的染色体DNA更优选地破坏时，通过核酸扩增法扩增活细胞的染色体DNA的目标区域，而损伤或死细胞的目标区域破坏(切割)，导致抑制核酸扩增反应。结果，能够比损伤或死细胞更有选择性地检测微生物的活细胞。

此外，当损伤或死细胞的RNA比微生物活细胞的RNA更优选地被交联剂修饰时，通过核酸扩增法扩增活细胞的RNA的目标区域，而损伤或死细胞的RNA的目标区域被修饰，导致抑制核酸扩增反应。结果，能够比损伤或死细胞更有选择性地检测微生物的活细胞。

在本发明的优选实施方案中，交联剂为单叠氮乙锭，所述方法包括用具有350nm至700nm波长的光照射添加了单叠氮乙锭的试验样品。与微生物活细胞的细胞壁相比，单叠氮乙锭(EMA)能够容易地穿过损伤或死细胞的细胞壁。因此，认为EMA基本上不穿过微生物的活细胞的细胞壁但穿过微生物的损伤或死细胞的细胞壁或者死亡体细胞的细胞膜。

注意，在血液中的白细胞和血小板为活细胞的情况下，EMA可更容易地穿过无菌水或低渗盐溶液中的细胞的细胞壁。

关于DNA，特别地，EMA移入死亡体细胞以及微生物的损伤和死细胞，并随机插入核DNA，插入的EMA通过用具有350nm至700nm波长的光照射，转换成氮宾(nitrene)并共价结合至核DNA从而交联DNA分子。然后，推定在多处共价结合至染色体DNA的碱基和脱氧核糖的EMA引起染色体DNA的大规模变形，导致染色体DNA的破坏(片段化)。

另外，关于双链RNA(包括部分双链RNA)，EMA移入死亡体细胞以及微生物的损伤和死细胞并随机插入RNA，然后插入的EMA通过用具有350nm至700nm波长的光照射，传换成氮宾并共价结合至RNA从而交联RNA分子。然后，推定在多处共价结合至RNA的碱基的EMA引起RNA的大规模变形，导致RNA的破坏(片段化)。

此外，关于单链DNA或RNA，推定EMA移入死亡体细胞以及微生物的损伤和死细胞，然后通过用具有350nm至700nm波长的光照射，插入的EMA转换成氮宾，共价结合至DNA或RNA。

只要与微生物的活细胞的细胞壁相比交联剂可更容易地穿过损伤或死细胞的细胞壁，且交联剂通过用具有350nm至700nm波长的光(长波长紫外光或可见光)照射可交联DNA或共价结合至RNA从而破坏染色体DNA或修饰RNA，则还可使用除单叠氮乙锭以外的交联剂。

可适当地设定EMA处理的条件。例如，能够容易地识别微生物的活细胞与死细胞和损伤细胞的条件可通过以下来设定：向待检测微生物的活细胞以及损伤细胞或死细胞的悬浮液添加各种浓度的EMA，静置各种时间段，然后用可见光照射它们，如需要通过离心等除去细胞，并通过核酸扩增法进行分析。还可通过使用各种照射时间进行如上所述的实验来适当地设定光照射的优选条件。光照射条件的具体实例包括在距离试验样品10至50cm处用100至750W和前述波长的光的照射5分钟至2小时。光的照射优选在低温，例如用冰冷却样品下进行。

在前述步骤a)中交联剂的添加和步骤b)的光照射处理可重复2个以上的循环。在此情况下，优选使在第一次的步骤a)中交联剂的浓度与第二次或以后的步骤a)中的相比更高，并使第二次或以后的步骤a)中交联剂的浓度与第一次的步骤a)中的相比更低。

例如，如果使EMA在高浓度例如10μg/ml以上起作用，尽管死细胞的细胞壁或细胞膜的通透性变得更高，但活细胞的通透性也变高(Microbiology and Immunology，2007，51，pp.763-775；Journal of Clinical Microbiology，2008，46，pp.2305-2313)。另一方面，如果使EMA在低浓度例如低于10μg/ml起作用，尽管可避免渗透入活细胞，但进入死细胞的渗透率也降低，因此，死细胞也可通过核酸扩增反应检测。因此，优选在第一次的步骤a)中使用高浓度的交联剂，并在第二次和以后的步骤b)中调低交联剂的浓度。

具体地，第一次的步骤a)中交联剂的终浓度，例如，在单叠氮乙锭的情况下为10至100μg/ml、在双叠氮乙锭的情况下为10至100μg/ml、在单叠氮丙锭的情况下为10至100μg/ml、在补骨脂素的情况下为2×10^-5至10μg/ml、在4，5′，8-三甲基补骨脂素的情况下为2×10^-5至10μg/ml或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为2×10^-5至10μg/ml。另外，在第二次和以后的步骤a)中的交联剂的终浓度，例如，在单叠氮乙锭的情况下为1至10μg/ml、在双叠氮乙锭的情况下为1至10μg/ml、在单叠氮丙锭的情况下为1至10μg/ml、在补骨脂素的情况下为1×10^-5至9μg/ml、在4，5′，8-三甲基补骨脂素的情况下为1×10^-5至9μg/ml或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为1×10^-5至9μg/ml。

另外，优选使第一次的步骤a)的处理时间短于第二次和以后的步骤a)的处理时间。具体地，第一次的步骤a)的处理时间为，例如，在单叠氮乙锭的情况下为5分钟至1小时、在双叠氮乙锭的情况下为5分钟至1小时、在单叠氮丙锭的情况下为5分钟至1小时、在补骨脂素的情况下为5分钟至1小时、在4，5′，8-三甲基补骨脂素的情况下为5分钟至1小时或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为5分钟至1小时。在第二次和以后的步骤a)的处理时间，例如，在单叠氮乙锭的情况下为6分钟至48小时、在双叠氮乙锭的情况下为6分钟至48小时、在单叠氮丙锭的情况下为6分钟至48小时、在补骨脂素的情况下为6分钟至48小时、在4，5′，8-三甲基补骨脂素的情况下为6分钟至48小时或在8-甲氧基补骨脂素的情况下为6分钟至48小时。

在前一循环的步骤b)和后一循环的步骤a)之间，可加入除去未反应的交联剂的步骤。此外，在步骤b)和以下描述的步骤c)之间，可添加除去交联剂的步骤。步骤a)中未反应的交联剂在步骤b)中通常基本上失活。因此，作为除去交联剂的方法，提及离心试验样品以便将包含微生物的沉淀与包含交联剂的上清液分离并除去上清液的方法。在该情况下，除去交联剂后，可任选地添加用洗涤剂洗涤微生物的步骤。

(3)步骤c)

然后，在用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的存在下，在不从细胞中提取核酸的情况下，通过核酸扩增法来扩增在光照射处理后包含于试验样品中的微生物的DNA或RNA的目标区域。

具体地，向包含试验样品的核酸扩增反应溶液中添加用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂，并进行核酸扩增反应。

此外，除了用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂以外，可向扩增反应溶液中添加表面活性剂、镁盐或有机酸盐或磷酸盐。这些物质可独立使用或这些的任意两种以上作为组合物来使用。特别优选添加所有这些物质。不限定用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂、表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐的添加顺序，并且它们可同时添加。

核酸扩增抑制物是抑制核酸扩增反应或核酸延伸反应(extension reaction)的物质，其实例包括吸附到核酸(DNA或RNA)模板的正电性抑制物和吸附到核酸生物合成酶(DNA聚合酶等) 的负电性抑制物等。正电性抑制物的实例包括钙离子、多胺和血红素等。负电性抑制物的实例包括苯酚、苯酚类化合物、肝素和具有外膜的革兰氏阴性菌细胞壁等。据说此类抑制核酸扩增反应的物质大量地存在于食品或临床试验样品中。

上述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的实例包括选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。聚乙二醇的实例包括聚乙二醇400和聚乙二醇4000。甜菜碱的实例包括三甲基甘氨酸及其衍生物等。磷酸化酶和乳糖脱氢酶的实例包括兔肌糖原磷酸化酶和乳糖脱氢酶。作为糖原磷酸化酶，优选糖原磷酸化酶b。

特别优选使用白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白或溶菌酶。

作为降低包含于试验样品(假设为血液、粪便和肉类)中的核酸扩增抑制物的抑制作用的尝试，评价通过向PCR反应混合物中添加如上所述的物质的抑制作用的降低(Abu Al-Soud，W.等人，Journal of Clinical Microbiology，38：4463-4470，2000)。

教导存在以下可能：典型实例为BSA(牛血清白蛋白)的白蛋白可通过结合至核酸扩增抑制物如血红素来降低核酸扩增的抑制(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，认为存在两种可能性，即，T4噬菌体基因32编码蛋白为单链DNA结合蛋白，其在核酸扩增过程中预先与充当模板的单链DNA结合以避免核酸酶对模板的降解，并且不抑制而是促进核酸扩增反应，或者其与核酸扩增抑制物如BSA结合从而不抑制而是促进核酸扩增反应(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，进一步教导以下可能性：BSA、T4噬菌体基因32编码蛋白和蛋白酶抑制剂与蛋白酶结合以减少蛋白水解活性，从而最大程度地显示核酸生物合成酶的作用。事实上，蛋白酶可保留在牛的乳或血液中，还报道了一个实例，在此情况下，通过添加BSA或蛋白酶抑制剂(如，大豆胰蛋白酶抑制剂和α2-巨球蛋白)避免了核酸生物合成酶的分解，核酸扩增反应有利地进行(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，葡聚糖通常为使用葡萄糖作为原料通过乳酸菌合成的多糖，也有报道称类似的多糖和称为粘蛋白的肽的复合体粘附到肠粘膜上(Ruas-Madiedo，P.，Applied and Environmental Microbiology，74：1936-1940，2008)。因此，可估计葡聚糖预先吸附到负电性抑制物(吸附到核酸生物合成酶)或正电性抑制物(吸附到核酸)，然后与这些抑制物结合。

此外，估计溶菌酶吸附到被认为在牛乳中大量存在的核酸扩增抑制物(如上所述的Abu Al-Soud等人)。

综上所述，如上所述以白蛋白、T4噬菌体基因32编码蛋白、葡聚糖和溶菌酶为代表的此类物质为用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂。

白蛋白的实例包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、乳清蛋白和人血清白蛋白等。其中，优选牛血清白蛋白。白蛋白可为纯化产物，除非降低本发明的作用，否则白蛋白可包含其他组分如球蛋白。此外，白蛋白还可为分级产物(fractionation product)。试验样品(核酸扩增反应溶液)中白蛋白的浓度，例如，通常为0.0001至1质量％，优选0.01至1质量％，更优选0.2至0.6质量％。

葡聚糖的实例包括葡聚糖40和葡聚糖500等。其中，优选葡聚糖40。试验样品(核酸扩增反应溶液)中葡聚糖的浓度，例如，通常为1至8％，优选1至6％，更优选1至4％。

试验样品(核酸扩增反应溶液)中T4噬菌体基因32编码蛋白(如，由Roch A.G.生产的T4噬菌体基因32编码蛋白，也称为gp32) 的浓度通常为0.01至1％，优选0.01至0.1％，更优选0.01至0.02％。

溶菌酶的实例包括源于蛋清的溶菌酶。试验样品(核酸扩增反应溶液)中溶菌酶的浓度，例如，通常为1至20μg/ml，优选6至15μg/ml，更优选9至13μg/ml。

表面活性剂的实例包括非离子表面活性剂如曲拉通(Triton，Union Carbide注册商标)、诺乃(Nonidet，Shell)、吐温(Tween，ICI的注册商标)和玻雷吉(Brij，ICI的注册商标)系列的那些，阴离子表面活性剂如SDS(十二烷基磺酸钠)，以及阳离子表面活性剂如十八烷基二甲基苄基氯化铵。曲拉通系列表面活性剂的实例包括曲拉通X-100等，诺乃系列表面活性剂的实例包括诺乃P-40等，吐温系列表面活性剂的实例包括吐温20、吐温40、吐温60、吐温80等，玻雷吉系列表面活性剂的实例包括Brij56等。

核酸扩增反应溶液中表面活性剂的类型和浓度不特别限定，只要促进PCR试剂渗入微生物细胞并且基本上不抑制核酸扩增反应即可。具体地，SDS的浓度，例如，通常为0.0005至0.01％、优选0.001至0.01％、更优选0.001至0.005％，还更优选0.001至0.002％。对于其他表面活性剂，例如，在诺乃P-40的情况下，浓度通常为0.001至1.5％、优选0.002至1.2％、更优选0.9至1.1％。在吐温20的情况下，浓度通常为0.001至1.5％、优选0.002至1.2％、更优选0.9至1.1％。在Brij56的情况下，浓度通常为0.1至1.5％、优选0.4至1.2％、更优选0.7至1.1％。

当表面活性剂包含在用于核酸扩增反应的酶溶液中时，表面活性剂可仅由源于酶溶液的表面活性剂组成，或可进一步添加相同类型或不同类型的表面活性剂。

镁盐的实例包括氯化镁、硫酸镁和碳酸镁等。试验样品(核酸扩增反应溶液)中镁盐的浓度，例如，通常为1至10mM、优选2至6mM、更优选2至5mM。

有机酸盐的实例包括柠檬酸、酒石酸、丙酸和丁酸等的盐。盐的种类的实例包括钠盐和钾盐等。此外，磷酸盐的实例包括焦磷酸等的盐。这些可独立使用或其两种或三种以上作为混合物使用。试验样品(核酸扩增反应溶液)中有机酸盐或磷酸盐的浓度，例如，依据总量通常为0.1至20mM、优选1至10mM、更优选1至5mM。

常规方法中，在核酸扩增反应前进行从细胞的核酸提取，而在本发明中不进行此类核酸提取。从细胞的核酸提取意指，例如，从由酶学或物理方法破坏或溶解的细胞中收集或纯化核酸。在本发明中，不进行从细胞提取核酸的此类处理，例如，通过酶学或物理方法破坏或溶解细胞来收集或纯化核酸的处理。

在用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂以及如果需要的其他组分的存在下，通过核酸扩增法扩增已存在于细胞中的DNA或RNA的目标区域。作为用于核酸扩增的模板，使用微生物细胞悬浮液或用蛋白质降解酶、脂质降解酶、糖类降解酶等处理的微生物细胞悬浮液，不进行用于制备模板的核酸的提取。核酸扩增法优选包括在高温例如90至95℃、优选93至95℃、更优选94至95℃下热变性核酸的步骤。

优选在微生物细胞中进行目标区域的扩增。在本发明中，如实施例所示，在微生物细胞中极有可能获得扩增。即，推定在核酸扩增反应中通过高温处理来维持细胞形态，并且在优选的实施方案中，前述组分的作用，从而染色体DNA保留在细胞内，但由于在微生物的细胞膜或细胞壁中形成孔或空隙，因此核酸扩增等所需的引物、酶流入细胞，在细胞内发生扩增反应，然后取决于扩增产物的基因长度，一部分扩增产物保留在细胞中或流出细胞外。然而，也不能否认染色体DNA或RNA的极小部分通过细胞膜或细胞壁的孔或空隙流出细胞外的可能性。

在任何情况下，在基本上无细胞的破坏或溶解的情况下，核酸扩增所需的组分如引物流入细胞、一部分扩增产物保留在细胞中或从细胞流出，以及染色体DNA或RNA从细胞流出不包括在“核酸提取”中。此外，尽管不能否定除上述以外的机制的存在，但是即使在此情况下，所述方法也遵守“不进行核酸提取”的定义，只要不进行通过例如酶学或物理方法破坏或溶解细胞收集或纯化核酸的处理即可。

此外，即使当从细胞流出的染色体DNA或RNA充当模板，并且在细胞外发生核酸扩增反应时，如果主要的扩增产物形成于细胞内，则可以说核酸扩增反应“在微生物细胞内进行”。具体地，例如，如果80％以上、优选90％以上、更优选99％以上的扩增产物形成于微生物细胞内，可判断核酸扩增反应在微生物细胞内进行。

核酸扩增法的实例包括PCR法(White，T.J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))、LAMP法(环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification)：Principal and application of novel gene amplification method(LAMP method)，Tsugunori Notomi，Toru Nagatani，BIO INDUSTRY，Vol.18，No.2，15-23，2001)、SDA法(链置换扩增(Strand Displacement Amplification)：Edward L.Chan等人，Arch.Pathol.Lab.Med.，124：1649-1652，2000)、LCR法(连接酶链反应(Ligase Chain Reaction)：Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.88，p.189-193，1991)、TMA法(转录介导的扩增(Transcription-Mediated-Amplification)：Sarrazin C.等人，J.Clin.Microbiol.，vol.39：pp.2850-2855(2001))、TRC法(转录-反转录协同法(Transcription-Reverse Transcription-Concerted method)： Nakaguchi Y.et al.，J.Clin.Microbiol.，vol.42：pp.4248-4292(2004))、HC法(杂交捕获法(Hybrid Capture)：Nazarenko I.，Kobayashi L.et al.，J.Virol.Methods，vol.154：pp.76-81，2008)和微阵列法(Richard P.Spence等人，J.Clin.Microbiol.，Vol.46，No.5，pp.1620-1627，2008)等。在本发明中，尽管PCR法是特别优选使用的，但核酸扩增法不限定于此。

在本发明中，“目标区域”不特别限定，只要选择可通过使用本发明的引物的PCR来扩增并使待检测的微生物能够检测的染色体DNA或RNA的区域即可，其可取决于目的而适当地选择。例如，当不同于待检测微生物细胞的类型的细胞包含于试验样品中时，目标区域优选包含对待检测微生物特异的序列。进一步，取决于目的，目标区域可为包含多种微生物的共有序列的一种目标区域。此外，目标区域可由单一区域或两个以上区域组成。如果使用适于特异于待检测微生物的目标区域的引物对(primer set)和适于众多种微生物的染色体DNA的引物对，则可同时测量作为监测对象的微生物的活细胞量和众多种微生物的活细胞量。目标区域的长度，例如，通常为50至5000个核苷酸。

用于核酸扩增的引物可基于各种核酸扩增法的原理来选择，并不特别限定，只要该引物可特异性扩增上述目标区域即可。

目标区域的优选实例包括各种特异性基因如5S rRNA基因、16S rRNA基因、23S rRNA基因、tRNA基因和致病基因。可以将这些基因的任一或这些基因的任一的一部分作为靶标，或可以将延伸至两种以上基因的区域作为靶标。例如，对于大肠菌(coliform bacteria)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌而言，可通过使用SEQ ID NOS：1和2所示的引物对来扩增16SrRNA基因的一部分。进一步，可通过使用SEQ ID NOS：3和4所示的引物对来扩增延伸至16S rRNA基因的一部分、tRNA基因和23S rRNA基因的一部分的区域。

在检测的目标微生物为病原菌时，目标区域可以是致病基因。致病基因的实例包括：李斯特菌属细菌的李斯特菌素O(hlyA)基因；沙门氏菌属细菌的肠毒素基因和侵袭基因(invA)；病原性大肠杆菌O-157、O-26、O-111等的vero细胞毒素基因；肠杆菌属细菌的外膜蛋白A(ompA)基因(阪崎肠杆菌)和大分子合成(MMS)操纵子(阪崎肠杆菌)；军团菌属细菌的巨噬-侵入蛋白(mip)基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐热溶血素基因和耐热类溶血素毒素基因；痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)和肠侵袭性大肠杆菌的ipa基因(invasion plasmid antigen gene，侵袭质粒抗原基因)和invE基因(侵袭基因)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的肠毒素基因；蜡状芽孢杆菌的呕吐毒素(cereulide)基因和肠毒素基因和肉毒梭状芽孢杆菌的各种毒素基因等。此外，致病基因的引物的实例包括，例如，对于李斯特菌属细菌的hlyA基因为SEQ ID NOS：5和6所示的引物对；对于阪崎肠杆菌的ompA基因为SEQ ID NOS：7和8所示的引物对；以及对于阪崎肠杆菌的MMS操纵子为SEQ ID NOS：9和10所示的引物对。

此外，在具有包膜的流感病毒的情况下，目标区域的实例包括血凝素(H蛋白)基因和神经氨酸酶(N蛋白)基因，杯状病毒(Calicivirus)科病毒(其典型实例包括诺如病毒(noroviruses))的RNA聚合酶基因，和编码各种衣壳蛋白的基因区域等。作为食物中毒病毒，除了诺如病毒以外，还有轮状病毒和腺病毒，在诺如病毒的情况下，作为目的基因，其RNA聚合酶基因和编码各种衣壳蛋白的基因区域可用作目标区域。

如果使用适于两种以上微生物的引物，可检测试验样品中两种以上微生物的活细胞。此外，如果使用特异于特定细菌的一种引物或多种引物，可检测试验样品中特定细菌的活细胞。

核酸扩增反应的条件不特别限定，只要基于各种核酸扩增法(如PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC、微阵列法等)的原理可特异性地扩增核酸即可，并且条件可适当地设置。

(4)步骤d)

随后，分析通过核酸扩增法所获得的扩增产物。扩增产物的分析在步骤c)后进行，或与步骤c)同时进行，取决于步骤c)中所采用的核酸扩增法。例如，在使用实时PCR的情况下，步骤d)可与步骤c)同时进行。

分析方法不特别限定，只要该方法可检测或定量核酸扩增产物即可，其实例包括电泳。注意，对于核酸扩增法在使用PCR法的情况下，可使用实时PCR法(ogva等人，Appl.Environ.Microbiol.，vol.66，2000，pp.4266-4271；Nogva等人，Appl.Environ.Microbiol.，vol.66，2000，pp.4029-4036)。

电泳能够评价核酸扩增产物的量和大小。此外，实时PCR能够快速定量PCR扩增产物。

在采用实时PCR的情况下，如果扩增的循环数在1至10的范围内，则荧光强度的变化通常为噪音级(noise level)并在零左右。因此，所述强度被认为是不包含扩增产物的空白样品。计算变化的标准差(SD)，通过将SD值乘以10所获得的值定义为阈值。将第一次实现大于阈值的值的PCR循环数称为“循环阈值(Ct值)”。因此，在PCR反应液中DNA模板的起始量越大，Ct值越小，而模板DNA的量越小，Ct值越大。即使模板DNA的量相等，在对于该区域的PCR反应中，PCR的目标区域已切割的模板比例越高，Ct值越大。

此外，扩增产物的有无还可通过分析扩增产物的解链温度 (TM)谱(melting temperature pattern)来确定。

所有前述方法还可用于优化本发明方法的各种条件。

当通过本发明的方法检测微生物的活细胞时，在PCR扩增产物的分析中确定微生物活细胞有无及其定量的精度可通过使用标准曲线来增加，所述标准曲线表示微生物的量和扩增产物之间的关系并通过使用微生物标准样品(其中微生物已鉴定)来制备。尽管可使用初步制备的标准曲线，但优选对标准样品与试验样品同时通过进行本发明方法的步骤来制备的标准曲线。此外，如果事先已确定了微生物的量与DNA或RNA的量之间的关系，则从微生物中分离的DNA或RNA也可用作标准样品。

<2>本发明的试剂盒

本发明的试剂盒为利用核酸扩增法通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的试剂盒，所述试剂盒包括通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合DNA或RNA的试剂、用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂以及通过核酸扩增法扩增待检测微生物的DNA或RNA的目标区域的一种或多种引物。本发明的试剂盒可用于实现本发明的方法。

此外，本发明的试剂盒可进一步包括选自表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐中的任何一种或多种。

此外，本发明的试剂盒可进一步包括具有分解存在于试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶。

酶、能够共价结合DNA或RNA的试剂和用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂，以及如需要时的表面活性剂、镁盐和有机酸盐或磷酸盐，可为包含所有这些组分的单一组合物的形式，或包含任意组合的组分的两种或多种溶液或组合物的形式。

核酸扩增反应优选PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC或微阵列法。试剂盒中的交联剂和培养基与本发明的方法所述的交联剂和培养基相同。

在本发明的试剂盒的优选实施方案中，能够共价结合DNA或RNA的试剂优选选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单叠氮丙锭、补骨脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。特别优选使用单叠氮乙锭。

此外，用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂的实例包括选自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌体基因32编码蛋白、乙酰胺、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白、四甲基氯化铵、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脱氢酶中的一种或多种。

此外，镁盐的实例包括氯化镁、硫酸镁和碳酸镁等。

此外，有机酸盐的实例包括柠檬酸、酒石酸、丙酸和丁酸等的盐。盐的种类的实例包括钠盐和钾盐等。此外，磷酸盐的实例包括焦磷酸的盐等。这些可独立使用或以其两种或三种以上的混合物使用。

此外，所述酶不特别限定，只要其可降解存在于试验样品中的异物如除微生物以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质和糖类，并且不损害待检测微生物的活细胞即可，所述酶的实例包括脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶。其中，可使用一种酶或两种以上酶，但优选使用脂质降解酶和蛋白质降解酶二者，或脂质降解酶、蛋白质降解酶和糖类降解酶全部。

本发明的试剂盒可进一步包括稀释液、能够共价结合DNA 或RNA的试剂的反应用反应液、核酸扩增用酶和反应液以及描述本发明的方法的说明书等。

实施例

在下文中，参考以下实施例更具体地描述本发明。然而，本发明不受限于这些实施例。

[实施例1]

通过使用阪崎肠杆菌作为大肠菌的典型细菌，检测用于明确识别活细胞和死细胞的条件。

1.试验材料和培养方法

1-1)使用菌株和培养方法

在37℃下通过使用脑心浸液肉汤(Brain Heart Infusion Broth)(BHI肉汤：Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)培养阪崎肠杆菌ATCC51329 16个小时。将5ml体积培养肉汤(culture broth)放入15ml falcon管(Becton Dickinson Labware，NJ)中，并在4℃和3,000×G下进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后向沉淀物添加5ml生理盐水从而制备阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液原液(stock)(8.95±0.01 log₁₀细胞/ml，n＝2)。进一步，用生理盐水将该活细胞悬浮液稀释10倍从而制备阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液(7.95±0.01 log₁₀细胞/ml，n＝2)。

进一步，将1ml前述活细胞悬浮液原液放入1.5ml体积的小离心管(microtube)(Eppendorf，Hamburg，Germany)，将管浸入沸水50秒并急冷(quench)，证实此后的细菌在标准琼脂培养基(Eiken，Tokyo，Japan)上不形成任何菌落，从而制备阪崎肠杆菌的损伤细胞悬浮液原液。在标准琼脂培养基上对活细胞悬浮液中阪崎肠杆菌的活细胞数计数，同时通过使用分光光度计U-2800A(Hitachi，Japan)在600nm波长下进行比浊法从而计算出活细胞数与浊度间的关系。

进一步，用市售巴氏消毒牛乳将活细胞悬浮液原液稀释10倍从而制备阪崎肠杆菌的活细胞乳悬液(7.95±0.01 log₁₀细胞/ml，n＝2)。

此外，用市售巴氏消毒牛乳将损伤细胞悬浮液原液稀释10倍从而制备阪崎肠杆菌的损伤细胞乳悬液(7.95±0.01 log₁₀细胞/ml，n＝2)。

1-2)单叠氮乙锭(EMA)处理和光照处理

用无菌水将单叠氮乙锭(EMA，Sigma，St.Louis，MO)溶解为1000μg/ml，并用0.20μm的过滤器(Minisart-plus，Sartorius AG，Gottingen，Germany)进行过滤灭菌从而制备原液，该原液在-20℃下避光保存。

将体积为10μl的EMA溶液(1000μg/ml)加入阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞的悬浮液(1ml)中，将悬浮液于4℃下避光静置10分钟。然后，悬浮液置于距可见光源(100V PRF 500W Flood eye，Iwasaki Electric Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)20cm的位置，并在冰上用光照射5分钟。在4℃和15,000×G下将各EMA处理的样品进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后加入1ml生理盐水洗涤沉淀物，向沉淀(细胞)加入10μl无菌水以在无菌水中悬浮细胞，使用5μl悬浮液作为PCR扩增用样品。

通过以下方法使阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞乳悬液(1ml)进行EMA处理和光照射处理。首先，在4℃和15,000×G下使各阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞乳悬液(1ml)进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后加入1ml生理盐水。添加体积为3μl的蛋白酶(源于芽孢杆菌属细菌，Sigma)从而在37℃下用蛋白酶处理细胞1小时，然后使悬浮液进行冷冻离心(4℃，15,000×G，10分钟)，除去上清液，添加1ml生理盐水，然后避光添加10μlEMA溶液(1000μg/ml)。此后所使用的方法与前述“阪崎肠杆菌的活细胞和损伤细胞悬浮液(1ml)”所描述的方法相同。

1-3)PCR扩增

向5μl PCR扩增用样品中添加包括二水合柠檬酸三钠(TSC，Kanto，Kagaku)和六水氯化镁(Nakarai-Tesque)的试剂和进一步包含选自牛血清白蛋白(BSA，Sigma)、葡聚糖(低分子，M.W.：50,000至70,000，Nakarai-Tesque)、T4噬菌体基因32编码蛋白(gp32，Nippon Gene)、十二烷基硫酸钠(SDS，Nakarai-Tesque)、Brij56(Sigma)和蛋清溶菌酶(Wako pure chemical Industries)中的一种或多种的试剂。添加到PCR扩增用样品并具有各组成的各试剂还可称为预处理剂。以下示出预处理剂的组成。

组成1：

2％ BSA：5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

0.05％ SDS：1μl

组成2：

2％ BSA：5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

组成3：

20％葡聚糖：2.5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

组成4：

0.1％ gp32：5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

组成5：

2％ BSA：5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

4％ Brij56：12.6μl

组成6：

2％ BSA：5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

500μg/ml蛋清溶菌酶：1.0μl

组成7：

2％ BSA：5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

0.05％ SDS：1μl

4％ Brij56：12.6μl

500μg/ml蛋清溶菌酶：1.0μl

组成8：

2％ BSA：5μl

50mM TSC：1μl

100mM MgCl₂：1.5μl

4％ Brij56：12.6μl

500μg/ml蛋清溶菌酶：1.0μl

组成9：

2％ BSA：5μl

组成10：

仅由下述组分a)至g)组成的PCR缓冲液，不包含组成1至9 的组分

对于PCR扩增，使用引物F：用于16S rRNA基因检测的正向引物16S_10F(5′-AGTTTGATCCTGGCTC-3′，SEQ ID NO：1)和引物R：用于16S rRNA基因检测的反向引物16S_1500R(5′-GGCTACCTTGTTACGA-3′，SEQ ID NO：2)作为PCR引物。

进一步，为了在实时PCR后的扩增产物解链分析(melt analysis)中使取决于温度的荧光物质量的变化最大化(引物微分峰)从而进行高灵敏度检测，制备了由以下组分a)至g)组成的PCR缓冲液，并通过向PCR扩增用样品和预处理剂的混合物中添加该PCR缓冲液来进行PCR扩增。

前述引物的靶标为包括16S rRNA基因的第10至第1500位核苷酸的长DNA(1491bp)。

a)引物F(10pmol/μl)：4μl

b)引物R(10pmol/μl)：4μl

c)Ex-Taq(5U/μl，Takara-Bio)：0.5μl

(包含0.5％吐温20、0.5％诺乃P-40和50％甘油)

d)10×Ex-Taq缓冲液(Takara-Bio)：5μl

e)dNTP混合物(Takara-Bio)：4μl

f)10×SYBR Green I(BMA)：8μl

g)无菌水：为获得包括PCR扩增用样品5μl和预处理剂的55μl总体积所需的体积

通过使用实时PCR装置(iCycler iQ，Bio-Rad，Hercules，CA)根据以下PCR热循环条件进行实时PCR。

1)4℃3分钟(1个循环)

2)94℃30秒(1个循环)

3)94℃20秒；55℃30秒；72℃1分钟30秒(50个循环)

4)95℃3分钟(1个循环)

然后，根据PCR扩增产物的解链分析方案(每隔0.1℃从60℃升高温度，各温度维持8秒并重复该过程总计350次，至最终温度95℃度)，测定PCR扩增产物的解链温度。

作为阳性对照，使用阪崎肠杆菌的8 log₁₀细胞/ml活细胞悬浮液。进一步，作为空白样品，将无任何添加的PCR缓冲液本身用于PCR。

2.结果

实时PCR的结果示于表1。

表1中使用的符号a)至f)表示以下内容。此外，用于预处理剂的“Lyso”意指蛋清溶菌酶。

a)阪崎肠杆菌的活细胞数和损伤细胞数：7.95±0.01 log₁₀细胞/ml(生理盐水和市售巴氏消毒牛乳中)

b)通过将活细胞浸入沸水50秒制备的损伤细胞

c)意指无EMA处理

d)EMA处理(10μg/ml、10分钟、4℃避光)+可见光照射(5分钟)

e)用平均值±SD(n＝2)表示的实时PCR的Ct值

f)nd意指通过实时PCR未获得目标基因的扩增

表1

从表1所示的组成1和2的结果来看，在细菌中直接进行PCR的该系统中，清楚地实现了生理盐水中阪崎肠杆菌的活体状态和损伤状态的识别(活细胞和损伤细胞的识别)，以及牛乳中阪崎肠杆菌的活体状态和损伤状态的识别，并根据基于充当实时PCR反应速度指标的Ct值的评价，在生理盐水和牛乳中阪崎肠杆菌(活细胞，无EMA处理)的Ct值间或者在进行各种条件的EMA处理的活细胞的Ct值间，未观察到显著差异。从这些结果中发现，预处理剂中包含或不包含表面活性剂SDS是没有区别的。在用组成7和8所获结果的比较来看，也观察到了如上所述相同的现象。

从用组成2、3和4所获结果的比较来看，对于组成中包含任何白蛋白、葡聚糖和T4噬菌体基因32编码蛋白的所有情况，清楚地实现了阪崎肠杆菌的活体状态和损伤状态的识别(生理盐水和牛乳中)，并且未观察到生理盐水和牛乳中阪崎肠杆菌(活细胞，无EMA处理)的Ct值间或者进行各种条件的EMA处理的活细胞的Ct值间的显著差异。基于这些数据，发现可使用白蛋白、葡聚糖和T4噬菌体基因32编码蛋白中的任意一种。

从用组成2和5所获结果的比较来看，用两种组成清楚地实现了阪崎肠杆菌的活体状态和损伤状态的识别(生理盐水和牛乳中)，但教导了非离子表面活性剂Brij56的添加提供了阪崎肠杆菌(活细胞，未用EMA处理和用EMA处理)的Ct值、特别是牛乳中细胞的Ct值显著的降低，因此改善了活细胞检测的灵敏度。此外，在用组成2和6所获结果的比较中，观察到用两种组成都清楚地实现了活体状态和损伤状态的识别(生理盐水和牛乳中)，但存在添加溶菌酶更加改善牛乳中活细胞(未用EMA处理和用EMA处理)检测的灵敏度的趋势。

基于用组成5、6和8所获结果的比较，发现用所有这些组成都清楚地实现了活体状态和损伤状态的识别(生理盐水和牛乳中)，但如组成8所获结果所示的那样，Brij56和蛋清溶菌酶的共存明显地改善活细胞(未用EMA处理和用EMA处理)检测的灵敏度。蛋清溶菌酶直接对革兰氏阳性菌的肽聚糖起作用以水解多糖(N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的β-1，4-键)，然而，在革兰氏阴性菌的情况下，在包含这些多糖的肽聚糖的外面存在外膜(在蛋清溶菌酶行使功能的一侧)，因而蛋清溶菌酶不能起作用。考虑到此作用机制，可认为组成8中的蛋清溶菌酶没有促进作为革兰氏阴性菌的阪崎肠杆菌细胞的溶解(lysis)(破坏)，但在Brij56的存在下强烈作用于预先存在于牛乳中的革兰氏阳性菌的死细胞(≥5log₁₀细胞/ml)的细胞壁从而在物理化学上改变革兰氏阳性菌的细胞壁表面结构，该结构常规上认为是PCR抑制组分，因而细胞壁表面结构不再行使PCR抑制组分的功能。事实上，在用组成5、6和8所获结果的比较中，可看出用组成8显著地改善了牛乳中活细胞检测的灵敏度，但革兰氏阳性菌不作为悬浮在生理盐水中的活细胞间的污染物而存在，对于作为革兰氏阴性菌的阪崎肠杆菌的活细胞，未获得表明组成8特别地改善PCR反应的任何数据。

从以上可认为，在Brij56的存在下，蛋清溶菌酶不参与革兰氏阴性菌的溶解，但在物理化学上改变了原本包含于试验样品中并认为是PCR污染物的革兰氏阳性菌的细胞壁从而使其不能行使PCR抑制组分的功能，因而，结果显著地改善了作为对象物的阪崎肠杆菌(革兰氏阴性菌)的活细胞的检测的灵敏度。这也与以下事实相一致：在用组成2和8所获结果的比较中，未观察到在生理盐水中检测活细胞的灵敏度(Ct值)的任何显著差异，但用组成8获得了在牛乳(包含许多革兰氏阳性菌的损伤细胞和死细胞)中检测活细胞的极其优异的灵敏度。此外，认为蛋清溶菌酶吸附到核酸扩增抑制物上以便使核酸扩增反应正常进行。

基于用组成1、2和9所获结果的比较，认为如果核酸扩增反应抑制物的功能可被BSA抑制，即使不包含镁盐或有机酸盐，也可以识别活细胞与损伤细胞。此外，用组成9，活细胞(未用EMA处理和用EMA处理)和损伤细胞(未用EMA处理)的Ct值延迟了约3，因而考虑到反应性，包含镁盐或有机酸盐的组成1和2更具优势。

最后，从用组成2和10所获结果的比较来看，尽管仅用PCR缓冲液可以识别悬浮在生理盐水中的阪崎肠杆菌的活体状态和损伤状态，但活细胞(未用EMA处理和用EMA处理)的灵敏度(Ct值)极显著地不适宜，此外，在假设牛乳为通常典型的试验样品的情况下，仅用PCR缓冲液不能检测活细胞(未用EMA处理和用EMA处理)和未用EMA处理的损伤细胞，因而认为优选包含至少可减少PCR抑制物影响的试剂(其典型实例为包含白蛋白)以及镁盐和有机酸盐或磷酸盐。

[实施例2]

进行大肠菌和肠杆菌科细菌的活细胞和损伤细胞的识别

1.试验材料和试验方法

1-1)使用菌株和培养方法

在37℃下通过使用脑心浸液肉汤(BHI肉汤：Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)培养以下菌株16小时：大肠菌16个属和肠杆菌科不属于大肠菌的1个属的细菌：产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)JCM1665、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)JCM1658、阪崎肠杆菌ATCC51329、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)JCM1242、水生布戴约维采菌(Budvicia aquilia)JCM3902、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis) NBRC13544、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)JCM1666、非脱羧勒克氏菌(Leclercia adecarboxylata)JCM1667、雷金斯堡预研菌(Yokenella regensburgei)JCM2403、成团泛菌(Pantoea agglomerans)JCM1236、乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)JCM1090、抗坏血酸克吕沃尔菌(Kluyvera ascorbata)JC M2107、戴氏西地西菌(Cedecea davisae)JCM1685、E.coli(大肠杆菌)DH5α和肠炎沙门氏菌IID604。

此外，通过使用BHI培养基，在30℃下培养以下菌株16个小时：属于大肠菌的2个属的2个种的细菌，美洲爱文菌(Ewingella americana)JCM4911和威斯康星米勒菌(Moellerella wisconsensis)JCM5894。

培养后将5ml体积的各培养肉汤(culture broth)收集在15mlfalcon管(Becton Dickinson Labware，NJ)中，并在4℃和3,000×G下冷冻离心10分钟，除去上清液，然后向沉淀(颗粒)添加5ml生理盐水，并用生理盐水将悬浮液稀释10倍从而制备各菌株的活细胞悬浮液。

此外，将1ml前述活细胞悬浮液置于1.5-ml体积的小离心管(Eppendorf，Hamburg，Germany)中，将管浸入沸水50秒并急冷。证实各浸入沸水中的悬浮液在标准琼脂培养基(Eiken，Tokyo，Japan)上不形成任何菌落，从而制备大肠菌和肠杆菌科细菌的损伤细胞悬浮液。

将如上所述制备的活细胞悬浮液和损伤细胞悬浮液用作以下试验的试验样品。

在标准琼脂培养基上对活细胞悬浮液中的大肠菌和肠杆菌科细菌的活细胞数计数，同时通过使用分光光度计U-2800A(Hitachi，Japan)在600nm波长下进行比浊法从而计算出活细胞数与浊度间的关系。

1-2)单叠氮乙锭(EMA)处理和光照处理

用无菌水将单叠氮乙锭(EMA，Sigma，St.Louis，MO)溶解为1000μg/ml，并用0.20μm的过滤器(Minisart-plus，Sartorius AG，Gottingen，Germany)进行过滤灭菌从而制备原液(EMA溶液)，，该原液在-20℃下避光保存。

将体积为10μl的EMA溶液(1000μg/ml)加入体积为1ml的各试验样品(活细胞悬浮液和损伤细胞悬浮液)中，将混合物于4℃下避光静置10分钟。

然后，试验样品置于距可见光源(100V PRF 500W Flood eye，Iwasaki Electric Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)20cm的位置，并在冰上用可见光照射5分钟。

在4℃和15,000×G下将EMA-处理的和可见光照射的试验样品进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后加入1ml生理盐水洗涤沉淀物，使悬浮液进一步进行冷冻离心以收集沉淀。重复此洗涤处理多次，然后向沉淀(细胞)加入10μl无菌水以在无菌水中悬浮细胞，从而制备CPR扩增样品。

1-3)PCR扩增

向PCR扩增用各样品添加包括下述组成1)至3)中的牛血清白蛋白(BSA，Sigma)、二水合柠檬酸三钠(TSC，Kanto，Kagaku)和六水氯化镁(Nakarai-Tesque)的试剂，并向5μl PCR扩增用样品中添加包括十二烷基硫酸钠(SDS，Nakarai-Tesque)的4)的表面活性剂。

在以下描述中，由具有组成1)至3)的试剂和4)的表面活性剂组成的组合物还可称为预处理剂。

1)2％ BSA：5μl

2)50mM TSC：1μl

3)100mM MgCl₂：1.5μl

4)0.05％ SDS：1μl

对于PCR扩增，使用引物F：用于16S rRNA基因检测的正向引物16S_10F(SEQ ID NO：1)和引物R：用于16S rRNA基因检测的反向引物16S_1500R(SEQ ID NO：2)作为PCR引物。

进一步，为了在实时PCR后的扩增产物解链分析中使取决于温度的荧光物质量的变化最大化(一次微分峰)从而进行高灵敏度检测，制备了由以下组分a)至g)组成的PCR缓冲液，并通过向PCR扩增用样品和预处理剂的混合物中添加该PCR缓冲液来进行PCR扩增。

a)引物F(10pmol/μl)：4μl

b)引物R(10pmol/μl)：4μl

c)Ex-Taq(5U/μl，Takara-Bio)：0.5μl

(包含0.005％吐温20和0.005％诺乃P-40)

d)10×Ex-Taq缓冲液(Takara-Bio)：5μl

e)dNTP混合物(Takara-Bio)：4μl

f)10×SYBR Green I(BMA)：8μl

g)无菌水：16μl

1)4℃3分钟(1个循环)

2)94℃30秒(1个循环)

3)94℃20秒；55℃30秒；72℃90秒(50个循环)

4)95℃3分钟(1个循环)

然后，根据PCR扩增产物的解链分析方案(每隔0.1℃从60℃升高温度，各温度维持8秒并重复该过程总计350次，至最终温度95℃)，测定PCR扩增产物的解链温度。

作为阳性对照，使用阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液(8log₁₀细胞/ml)以相同的方式进行PCR扩增。进一步，作为空白样品，将无任何试验样品添加的PCR缓冲液本身用于进行PCR扩增。

1-4)凝胶电泳

通过使用0.5×TAE制备2％琼脂糖凝胶(2％ Seakem GTG琼脂糖，FCM BioProducts，Rockland，ME)。

将体积为10μl的PCR扩增产物加入琼脂糖凝胶中，并进行电泳。

用1μg/ml的溴化乙锭溶液将凝胶染色，作为密度图(densitograph)来观察，通过使用AE-6950H Image Saver HR(Atto Co.，Japan)采集和保存其图像。

2.结果

实时PCR的结果示于表2。此外，最终的PCR扩增产物的电泳结果示于图1。

图1中所使用的符号的含义如下。

EMA+：EMA处理(10μg/ml、10分钟、4℃避光)+可见光照射(5分钟)

EMA-：无EMA处理

PC：阳性对照，其中使用体积为5μl、8log₁₀细胞/ml的阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液

NC：阴性对照，其中使用无菌水代替DNA模板

M：100bp DNA梯带

损伤细胞：使用通过将活细胞悬浮液浸入沸水50秒而制备的损伤细胞

各菌株的活细胞悬浮液的细胞数如下。

E.coli：大肠杆菌DH5α(7.91±0.20log₁₀细胞/ml)

S.enteritidis：肠炎沙门氏菌IIP 604(8.07±0.02 log₁₀细胞/ml)

K.oxytoca：产酸克雷伯氏菌JCM1665(8.38±0.08 log₁₀细胞/ml)

C.koseri：克氏柠檬酸杆菌JCM1658(8.02±0.06 log₁₀细胞/ml)

E.sakazakii：阪崎肠杆菌ATCC51329(7.95±0.01 log₁₀细胞/ml)

S.fonticola：居泉沙雷氏杆菌JCM1242(7.47±0.01 log₁₀细胞/ml)

B.aquilia：水生布戴约维采菌JCM3902(6.98±1.50 log₁₀细胞/ml)

R.aquatilis：水生拉恩氏菌NBRC13544(7.38±0.14 log₁₀细胞/ml)

E.americana：美洲爱文菌JCM4911(7.47±0.43 log₁₀细胞/ml)

H.alvei：蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei JCM1666(8.04±0.22log₁₀细胞/ml)

L.adecarboxylata：非脱羧勒克氏菌JCM1667(7.46±0.20log₁₀细胞/ml)

M.wisconsensis：威斯康星米勒菌JCM5894(7.85±0.34log₁₀细胞/ml)

Y.regensburgei：雷金斯堡预研菌JCM2403(8.03±0.13log₁₀细胞/ml)

P.agglomerans：成团泛菌JCM1236(7.67±0.78 log₁₀细胞/ml)

B.agrestis：乡间布丘氏菌JCM1090(7.76±0.00 log₁₀细胞/ml)

K.ascorbata：抗坏血酸克吕沃尔菌JCM2107(7.80±0.02 log₁₀细胞/ml)

C.dayisae：戴氏西地西菌JCM1685(7.56±0.10 log₁₀细胞/ml)。

表2

表2中使用的符号a)至f)具有以下含义。

a)大肠菌/肠杆菌科细菌的活细胞数

纵列内的数值意指实时PCR的Ct值

b)通过将活细胞悬浮液浸入沸水50秒来制备损伤细胞

c)意指无EMA处理

d)意指EMA终浓度为10μg/ml

e)Ct值用平均值±SD(n＝2)表示

f)n.d.意指PCR进行两次，但在两次PCR中都未扩增出目的基因

如表2所示，活细胞的EMA未处理组的Ct值(与实时PCR曲线的上升相一致的循环数)为13至22，活细胞的EMA处理组的Ct值为16至24。此外，损伤细胞的EMA未处理组的Ct值为15至22，所有组均提供良好的PCR扩增结果。然而，在所有大肠菌和肠杆菌科细菌的损伤细胞的EMA处理组，未获得目标基因的扩增。

此外，如图1所示的电泳结果所示，仅对于所有大肠菌和肠杆菌科细菌的损伤细胞的EMA处理组不能检测到表示PCR扩增产物阳性结果的任何条带。

基于以上结果，可知通过进行本发明的方法，对于大肠菌的16个属和肠杆菌科的2个属能够识别活细胞和损伤细胞以及识别活细胞和死细胞。进一步，对于常规检测困难的物种，例如埃希氏菌属细菌和沙门氏菌属细菌，也可以识别活细胞和损伤细胞。

[实施例3]

进行接种到食品，即牛乳中的大肠菌和肠杆菌科细菌的活细胞和损伤细胞的识别

1.试验材料和试验方法

1-1)使用菌株和培养方法

在37℃下通过使用脑心浸液肉汤(BHI肉汤：Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)培养以下菌株16小时：肠杆菌科的1个属和大肠菌的12个属的细菌：抗坏血酸克吕沃尔菌JCM2107、戴氏西地西菌JCM1685、克氏柠檬酸杆菌JCM1658、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)NRBC3321、居泉沙雷氏菌JCM1242、雷金斯堡预研菌JCM2403、水生拉恩氏菌NBRC13544、蜂房哈夫尼菌JCM1666、非脱羧勒克氏菌JCM1667、成团泛菌JCM1236、阪崎肠杆菌ATCC51329、大肠杆菌DH5α和肠炎沙门氏菌IID604。

培养后将5ml体积的各培养液收集在15ml falcon管(Becton Dickinson Labware，NJ)中，并在4℃和3,000×G下冷冻离心10分钟，除去上清液，然后向沉淀(颗粒)添加5ml生理盐水，并用生理盐水将悬浮液稀释10倍从而制备各菌株的活细胞悬浮液。

将如上所述制备的活细胞悬浮液用作以下试验的试验样品。

1-2)细菌悬浮液对食品的接种以及沉淀的收集

通过使用上述制备的各种大肠菌和肠杆菌科细菌的活细胞悬浮液向22.2ml市售巴氏消毒牛乳(未通过培养法检测活细胞)接种9至25个细胞。

向22.2ml牛乳接种一种大肠菌或肠杆菌科细菌。

此外，作为空白样品，制备无任何活细胞悬浮液添加的22.2ml牛乳(未接种细菌)。

将如上所制备的接种大肠菌和肠杆菌科细菌的活细胞的牛乳和未接种任何细菌的牛乳在37℃和3,000×G下离心5分钟，上清液表面上的脂质层和作为中间层存在的水层通过倾析而除去从而收集沉淀。

接种大肠菌或肠杆菌科细菌的活细胞的牛乳和未接种任何两种细菌的牛乳的收集沉淀(颗粒)包含原本存在于市售牛乳中并通过灭菌而死灭(extinct)的细菌的死细胞(包括大肠菌等的革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌(≥6 log₁₀细胞))。

因此，由接种大肠菌或肠杆菌科细菌的活细胞的牛乳所制备的沉淀被判断为包含死细胞和活细胞。

1-3)酶处理

向如上所制备由接种大肠菌或肠杆菌科细菌的活细胞的牛乳制备的各沉淀(试验样品)，添加预先在37℃保温的10ml脑心浸液肉汤(BHI)，并将细胞悬浮于其中。用生理盐水(25U/ml)将蛋白酶K溶液(相当于1250U/ml，EC.3.4.21.64，Sigma)稀释50倍，将由此制备的25μl稀释的酶溶液添加到悬浮液中从而在37℃下进行酶处理3小时。

在37℃和3,000×G下将酶处理的试验样品离心5分钟，除去上清液，再次收集沉淀。

1-4)单叠氮乙锭(EMA)处理和光照处理

向酶处理后的沉淀添加1ml生理盐水并搅拌混合物后，将用与实施例2相同的方式制备的10μl EMA溶液(1000μg/ml)添加到混合物中，将混合物在4℃下避光静置10分钟。

然后，用与实施例2相同的方式进行可见光照射和洗涤处理，向沉淀添加5μl无菌水从而制备PCR扩增用样品。

1-5)PCR扩增

如实施例2那样，向5μl PCR扩增用样品添加预处理剂。

对于PCR扩增，使用引物F：用于16S rRNA基因检测的正向引物16S_1234F(5′-CTACAATGGCGCATACAAAGAGAAG-3′，SEQ ID NO：3)和引物R：用于23S rRNA基因检测的反向引物23S_1703R(5′-CCTTCTCCCGAAGTTACGGCACCAT-3′，SEQID NO：4)作为PCR引物。

进一步，为了在实时PCR后的扩增产物解链分析中使取决于温度的荧光物质量的变化最大化(一次微分峰)从而进行高灵敏度检测，制备了包括以下组分a)至g)的PCR缓冲液，并通过向PCR扩增用样品和预处理剂的混合物中添加41.5μl该PCR缓冲液来进行PCR扩增。

PCR引物包含16S rRNA基因的1234至1258位核苷酸、tRNA 基因(76bp)和23S rRNA基因的1至1703位核苷酸，其靶标为包含间隔子区域(约364bp)的长DNA(约2450bp)。

a)引物F(10pmol/μl)：4μl

b)引物R(10pmol/μl)：4μl

c)Ex-Taq(5U/μl，Takara-Bio)：0.5μl

(包含0.5％吐温20、0.5％诺乃P-40和50％甘油)

d)10×Ex-Taq缓冲液(Takara-Bio)：5μl

e)dNTP混合物(Takara-Bio)：4μl

f)10×SYBR Green I(BMA)：8μl

g)无菌水：16μl

1)95℃3分钟(1个循环)

2)95℃30秒；60℃40秒；68℃3分钟(40个循环)

3)95℃3分钟(1个循环)

然后，根据PCR扩增产物的解链分析方案(每隔0.1℃从60℃升高温度，各温度维持8秒并重复该过程总计350次，至最终温度95℃)，测定PCR扩增产物的解链温度

作为阳性对照，使用8log₁₀细胞/ml的阪崎肠杆菌活细胞悬浮液以相同的方式进行PCR扩增。进一步，作为空白样品，使用无任何试验样品添加的PCR缓冲液本身进行PCR扩增。

1-6)凝胶电泳

通过使用0.5×TAE制备0.8％琼脂糖凝胶(Seakem GTG琼脂糖，FCM BioProducts，Rockland，Me)。

将体积为5至10μl的PCR扩增产物加入琼脂糖凝胶中以进行电泳。

在通过用0.5×TAE将SYBR Gold核酸凝胶染料(Invitrogen， Eugene，Oregon，USA)稀释10,000倍而制备的溶液中，浸入电泳后的琼脂糖凝胶15分钟从而染色，然后该凝胶作为密度图来观察，通过使用AE-6950H Image Saver HR(Atto Co.，Japan)采集和保存其图像。

2.结果

实时PCR的结果示于表3。另外，最终的PCR扩增产物的电泳结果示于图2。

在图2中使用的符号的含义如下。

KP：肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)

CK：克氏柠檬酸杆菌(C.koseri)

EC：大肠杆菌(E.coli.)

SE：肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)

KA：抗坏血酸克吕沃尔菌(K.ascorbata)

CD：戴氏西地西菌(C.dayisae)

SF：居泉沙雷氏菌(S.fonticola)

YR：雷金斯堡预研菌(Y.regensburgei)

RA：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)

HA：蜂房哈夫尼菌(H.alvei)

LA：非脱羧勒克氏菌(L.adecarboxylata)

PA：成团泛菌(P.agglomerans)

ES：阪崎肠杆菌(E.sakazakii)

乳：未用大肠菌接种的市售巴氏消毒牛乳

阳性：阳性对照(阪崎肠杆菌，将5μl 8 log₁₀CFU/ml用作PCR模板)

阴性：阴性对照(将5μl无菌水用作PCR模板)

L：100bp DNA梯带

表3

在表3中使用的符号a)至c)的含义如下。

a)大肠菌的活细胞数，n＝2至8的情况下进行测定

b)相对于通过基于实时PCR的解链分析(TM模式)的扩增产物的测定总数的阳性结果数

c)相对于通过电泳和凝胶染色(SYBR Gold)法的扩增产物的测定总数的阳性结果数

从表3所示的结果可看出，在通过以下制备的样品中，大肠菌数(活细胞)增加至90至2,900个细胞：在22.2ml巴氏消毒牛乳中接种各种大肠菌(活细胞)的9至25个细胞、然后离心乳、并在BHI培养基中进行蛋白酶K处理并温育(活大肠菌的增殖步骤)。

另外，由于进行PCR扩增产物的解链分析和PCR扩增产物的电泳，可以检测所有13个菌株的活细胞。此外，从未用大肠菌(活细胞)接种的牛乳获得的PCR扩增产物在解链分析和电泳中都显示阴性结果。

从上述结果揭示出，通过本发明的方法来识别接种到食品如牛乳中的大肠菌和肠杆菌科细菌的活细胞与死细胞(活细胞检测)可以检测接种到食品如牛乳中的大肠菌和肠杆菌科细菌的活细胞。因此，即使是对于难以识别活细胞与死细胞的各种细胞，也可以将此类识别广泛应用于食品如牛乳，并具高灵敏度的检测活细胞。

[对照例1]通过常规方法的活细胞检测

通过靶向16S rRNA(长DNA)的EMA-PCR法检测大肠菌(还包括肠杆菌科细菌细胞)的高浓度损伤细胞，其中所述细胞进行了EMA处理，然后通过DNA提取纯化DNA，并用作模板。

1.试验材料和试验方法

1-1)使用菌株和培养方法

该试验的方法是根据日本专利4217797号(国际专利公布WO2002/052034号)进行的。

通过使用脑心浸液肉汤(BHI肉汤，Eiken，Tokyo)在37℃下培养大肠杆菌DH5α、肠炎沙门氏菌IID604、产酸克雷伯氏菌JCM1665和克氏柠檬酸杆菌JCM1658。

从细胞处于对数生长期的各培养肉汤中收集预定体积(10ml)的等分试样，并在4℃和8,000×G下冷冻离心15分钟。除去上清液后，向沉淀物添加10ml生理盐水以再次悬浮细胞，进行类似的洗涤操作，然后向沉淀物添加10ml生理盐水，所得悬浮液用作活细胞悬浮液。通过使用L琼脂板培养基测定活细胞数。

通过将1ml活细胞悬浮液放入1.5ml小离心管中，并将小离心管浸入沸水中50秒来制备损伤细胞(损伤细胞悬浮液)。通过该处理获得的损伤细胞未在标准琼脂培养基上形成菌落。

1-2)细菌的EMA处理和光照处理

用无菌水将EMA(Sigma，St.Louis，MO，USA)溶解为1000μg/ml，并用0.20μm的过滤器(Minisart-plus，Sartorius AG， Gottingen，Germany)进行过滤灭菌。

将体积为10μl的EMA溶液(1000μg/ml)加入到大肠杆菌DH5α(7.91±0.02log₁₀细胞/ml)的活细胞和损伤细胞悬浮液(1ml)中，并于4℃下避光静置10分钟。

然后，将悬浮液置于距可见光源(100V PRF 500W Flood eye，Iwasaki Electric Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)20cm的位置，并在冰上用光照射5分钟。

在4℃和15,000×G下将各EMA-处理的样品进行冷冻离心10分钟，除去上清液，然后用1ml生理盐水进行类似的洗涤操作。

肠炎沙门氏菌IID604的活细胞悬浮液和损伤细胞悬浮液(8.47±0.02log₁₀细胞/ml)、产酸克雷伯氏菌JCM1665(8.38±0.08log₁₀细胞/ml)和克氏柠檬酸杆菌JCM1658(8.02±0.06log₁₀细胞/ml)也进行与用于大肠杆菌DH5α的处理相同的EMA处理。

1-3)来自大肠菌(包括肠杆菌科细菌)的DNA的提取

除去EMA处理后所得各悬浮液的上清液，然后向沉淀(细胞)中加入0.5ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，向混合物中加入10μl蛋白酶K溶液(相当于1,250μg/ml，Sigma)，向混合物中加入200μl10％(w/v)SDS溶液，并且在50℃温育混合物过夜。

然后，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀法(EP)进行DNA提取

向提取并纯化的DNA添加150μl体积的无菌水，基于UV260nm下的吸光度(OD₂₆₀)估算浓度。另外，基于OD₂₆₀/OD₂₈₀估算纯度。

1-4)实时PCR

通过使用引物F：用于16S rRNA基因检测的正向引物16S_10F(SEQ ID NO：1)和引物R：用于16S rRNA基因检测的反向引物16S_1500R(SEQ ID NO：2)，制备具有下述组成的PCR缓冲液。

a)Ex-Taq(5U/μl，Takara-Bio)：0.5μl

b)10×Ex-Taq缓冲液(Takara-Bio)：5μl

c)dNTP混合物(Takara-Bio)：4μl

d)引物F(10pmol/μl)：4μl

e)引物R(10pmol/μl)：4μl

f)SYBR Green I(2×)(BMA)：10μl

g)无菌水：22.5μl

向50μl前述PCR缓冲液中加入相当于150ng的量的模板DNA，通过使用实时PCR装置(iCycler iQ，Bio-Rad，Hercules，CA)根据以下PCR热循环条件进行实时PCR。

1)4℃3分钟(1个循环)

2)94℃30秒(1个循环)

3)94℃20秒；55℃30秒；72℃90秒(50个循环)

4)95℃3分钟(1个循环)

然后，根据PCR扩增产物的解链分析方案(每隔0.1℃从60℃升高温度，各温度维持8秒并重复该过程总计350次，至最终温度95℃)，测定PCR扩增产物的解链温度.

1-5)凝胶电泳

用1μg/ml的溴化乙锭溶液将凝胶染色，作为密度图来观察，通过使用AE-6950H Image Saver HR(Atto Co.，Japan)采集和保存其图像。

2.结果

通过进行实时PCR所获得的Ct值(扩增曲线超过极限值的 PCR循环数)示于表4。另外，电泳结果示于图3。

图3中使用的符号的含义如下。

克雷伯氏菌属细菌：产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)JCM1665(8.38±0.08log₁₀细胞/ml)

柠檬酸杆菌属细菌：克氏柠檬酸杆菌(C.koseri)JCM1658(8.02±0.06log₁₀细胞/ml)

埃希氏菌属细菌：大肠杆菌(E.coli)DH5α(7.91±0.20log₁₀细胞/ml)

沙门氏菌属细菌：肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)IIP604(8.47±0.02log₁₀细胞/ml)

EMA+：EMA处理(10μg/ml、10分钟、4℃避光)+可见光照射(5分钟)

EMA-：无EMA处理

NC：阴性对照，其中使用无菌水代替DNA模板

M：100bp DNA梯带

损伤细胞：通过将活细胞悬浮液浸入沸水中50秒制备的损伤细胞

表4

表4中使用的符号a)至f)指示以下。

a)克雷伯氏菌属细菌、柠檬酸杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌的活细胞数

纵列内的数值意指实时PCR中所获的Ct值

b)通过将活细胞悬浮液浸入沸水50秒制备的损伤细胞

c)意指无EMA处理

d)意指EMA终浓度为10μg/ml

e)Ct值用平均值±SD(n＝2)表示

f)n.d.意指未进行PCR扩增反应，未观察到Ct值

根据表4中所示的结果，通过对大肠杆菌和肠炎沙门氏杆菌的活细胞进行EMA处理，在实时PCR中未提供Ct值的显著变化。另外，在损伤细胞的情况下，与未处理的细胞的Ct值相比，EMA处理的大肠杆菌细胞显示较高的Ct值，约18，EMA处理的肠炎沙门氏杆菌细胞显示较高的Ct值，约14，因此观察到虽然PCR扩增存在被抑制的趋势，但PCR仍显示阳性反应(Ct值：40±1.4和34±1.1)。

从使用最终PCR扩增产物识别活细胞和损伤细胞的结果(图3)来看，对于大肠杆菌DH5α和肠炎沙门氏杆菌IID604，在EMA处理的损伤细胞的样品中也获得了目的基因的条带，因此活细胞与损伤细胞的识别不能被充分地证实。

另一方面，对于克雷伯氏菌属细菌和柠檬酸杆菌属细菌，当活细胞进行EMA处理时，未观察到Ct值显著增加的任何现象，但当损伤细胞进行EMA处理时，PCR扩增反应完全被抑制，因此，不能测定Ct值，从而可以识别活细胞和损伤细胞。

[实施例4]

检测50次PCR热循环后在预处理剂的存在下阪崎肠杆菌细胞的裂解(溶解(lysis))的程度如何

1.试验方法

以10⁸个细胞/ml的量将阪崎肠杆菌ATCC51329菌株(ES)细胞悬浮于生理盐水或表5中所述预处理剂溶液中(此后也称为“DB(直接缓冲液(direct buffer))”)来制备悬浮液(0.25mL)。将各悬浮液分成25μl的份，分别将其放入200μl的PCR管中，使用95℃15秒、60℃20秒和72℃30秒的循环进行PCR热循环重复步骤(50次)，并再次混合成一份(总计0.25ml)作为PCR扩增用样品。从上述0.25ml样品中，收集2.5μl的一份，并加入到12.25μl表5中所述的预处理剂溶液(条件是无菌水的体积改为2.7μl)中，将下述12.75μl PCR缓冲液加入混合物以进行PCR(相当于表6中所述的悬浮液I)。作为引物，使用ompA_F：用于ompA基因检测的正向引物(5′-ggatttaaccgtgaacttttcc-3′，SEQ ID NO：7)，和ompA_R：用于ompA基因检测的反向引物(5′-cgccagcgatgttagaaga-3′，SEQ ID NO：8)。

PCR缓冲液组成：

a)ompA_F(10pmol/μl)：2μl

b)ompA_R(10pmol/μl)：2μl

c)Ex-Taq(5U/μl，Takara-Bio)：0.25μl

(包含0.5％吐温20、0.5％诺乃P-40和50％甘油)

d)10×Ex-Taq缓冲液(Takara-Bio)：2.5μl

e)dNTP混合物(Takara-Bio)：2μl

f)10×SYBR Green I(BMA)：4μl

然后，将247.5μl残余PCR扩增用样品(从0.25ml体积中提取2.5μl后的PCR扩增用样品)进行冷冻离心(10,000×g，5分钟，4℃)，向2.5μl上清液中加入12.25μl预处理剂溶液和12.75μl PCR缓冲液以进行PCR(上清液I)。然后，向通过前述离心获得的沉淀物添加0.25ml生理盐水或表5所述的预处理剂溶液以制备悬浮液，向2.5μl各上清液添加12.25μl预处理剂溶液和12.75μl PCR缓冲液以进行PCR(悬浮液II)。在与上述相同的条件下使残余悬浮液进行冷冻离心，向2.5μl上清液添加表5所述的12.25μl预处理剂溶液和12.75μlPCR缓冲液以进行PCR(上清液II)。其后，重复相同的步骤直到获得悬浮液IV和上清液IV，并用其各自进行PCR。

通过使用实时PCR装置(iCyclery iQ，Bio-Rad，Hercules，CA)根据以下PCR热循环条件进行实时PCR。

1)4℃3分钟(1个循环)

2)95℃15秒；60℃20秒；72℃30秒(50个循环)

3)95℃3分钟(1个循环)

表5

预处理剂溶液(DB)	量(μL)	终浓度
			500μg/mL溶菌酶	0.5	10μg/mL
4％ Brij 58	6.25	1％
			2％ BSA	2.5	0.2％
250mM TSC	0.1	1mM
			750mM MgCl₂	0.1	3mM
320 X SYBR Green I	0.1	1.28X
			无菌水	15.45	-
总计	25	-

2.结果

通过实时PCR扩增测定的Ct值的结果示于表6。表中的说明“未加热”意指未进行根据PCR热循环(重复50次由95℃、60℃和72℃的反应组成的热循环)的热处理的组，和“热循环加热”意指根据PCR热循环进行50次热处理的组。当在标准琼脂培养基板上测定时，用a)表示的在悬浮液IV中的阪崎肠杆菌的活细胞数为10^7.6个细胞/ml，当通过相同方法测定时，用b)表示的上清液 I中的阪崎肠杆菌的活细胞数为10^5.7个细胞/ml。

基于该试验的函数特性，悬浮液IV和上清液I中活细胞数的测定结果揭示在通过冷冻离心生理盐水中阪崎肠杆菌的悬浮液所获得的上清液中也以1％的比例包含活细胞。对于阪崎肠杆菌(生理盐水中)的未加热组，当将悬浮液I或II与上清液I所获的Ct值相比较时，悬浮液组的Ct值较低约5，认为这主要是由于在沉淀(颗粒)中显著地收集了活细胞，在上清液中也收集了极小量的活细胞。即，这样的现象意味着在沉淀和上清液间以特定比分布活细胞。

阪崎肠杆菌(生理盐水中)的热循环加热组的结果意指，通过使生理盐水中阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液进行PCR热循环50次，并然后用上清液和沉淀物进行PCR扩增反应而获得的试验结果，并且当重复PCR热循环时，如果细菌细胞被溶解，并且染色体DNA基本上流出细胞，则测定悬浮液II至IV的Ct值基本上变得不可能。然而，所有的Ct值都低于20，因此PCR反应有利地进行。因此，决定在以下实施例中确定其在生理盐水中进行50次PCR热循环后溶解的阪崎肠杆菌的细胞的程度如何。

表6

另外，在预处理剂的存在下对于阪崎肠杆菌细胞“未加热” 而言，阪崎肠杆菌细胞通过冷冻离心而流入悬浮液的比例与用生理盐水所获得的相比被抑制了10倍，即，比例为0.1至0.2％，显著改进了作为沉淀物的回收效率。如果阪崎肠杆菌细胞仅通过将其置于预处理剂溶液中而溶解，则随着从悬浮液I的步骤到悬浮液IV的步骤进行该过程，Ct值显著增加，如果他们被完全溶解，则在冷冻离心后在上清液中回收到染色体DNA，因此Ct值的测定应变得不可能。然而表6所示的结果并不支持此猜测。

对于阪崎肠杆菌细胞在预处理剂溶液中进行50次PCR热循环的情况应特别注意的地方包括悬浮液I的Ct值比上清液I的Ct值小了超过8，类似地悬浮液II的Ct值比上清液I的Ct值小了超过8，尽管沉淀物的洗涤操作次数增加，但悬浮液III和IV的Ct值未增加。如果在重复PCR热循环期间，阪崎肠杆菌细胞在预处理剂溶液中完全溶解，并且染色体DNA完全流入外部溶液，则悬浮液I和上清液I的Ct值应基本上为相同的值，并且随着其后沉淀物洗涤次数的增加，悬浮液的Ct值应显著增加，或其测定应变得不可能。然而，表6所示的结果并不支持此猜测。相反，悬浮液I的Ct值比上清液I的Ct值小了超过8，估计染色体DNA流出进入上清液的比例最多为约0.1至0.5％(对于上清液I的Ct值的来源，由于重复热循环，比重变小的极小部分的阪崎肠杆菌细胞可在上清液中回收)，并且估计悬浮液I的Ct值的99％以上来源为阪崎肠杆菌细胞中的DNA。即，表明在预处理剂的存在下，即使阪崎肠杆菌细胞进行PCR热循环50次以后，其99％以上不会溶解。

另外，表6所示的阪崎肠杆菌(DB中)的“未加热”组的悬浮液I和上清液I的Ct值分别显著小于“热循环加热”组的悬浮液I和上清液I的Ct值。假设在预处理剂的存在下，大多数阪崎肠杆菌的细胞通过50次PCR热循环而溶解，并且染色体DNA移至溶液侧，则“热循环加热”组的悬浮液I和上清液I的Ct值是相当的。此外，在悬浮液II中，由于阪崎肠杆菌细胞处于其不具有染色体的状态，因而细胞应进入Ct值不能测定的状态。然而，表6所示的结果并不支持此猜测。此外，假设通过由于50次PCR热循环导致的变性来提供前述“未加热”组的悬浮液I和上清液I的Ct值比“热循环加热”组的悬浮液I和上清液I的Ct值显著地小，因为预处理剂中包含蛋白质如蛋清溶菌酶和牛血清白蛋白，所以进一步进行了表7所示的实验。具体实验步骤示于以下。

制备十份25μl具有表5所示的组成的预处理剂溶液，进行50次PCR热循环，并组合以制备250μl预处理剂溶液进行热循环加热。然后，以10⁶至10⁹个细胞/ml的浓度，将从50μl培养肉汤(在其中过夜预培养细胞)获得的阪崎肠杆菌ATCC51329菌株的活细胞沉淀物(洗涤的)加入生理盐水、预处理剂溶液或进行热循环加热的预处理剂溶液中，并在其内悬浮(制备50μl的各悬浮液)。将体积为2.5μl的各悬浮液加入到表5所述的12.25μl预处理剂溶液中(假设无菌水的体积改为2.7μl)，进一步添加12.75μlPCR缓冲液以进行PCR(进行两次测定)。结果示于表7。

表7

不能认为悬浮于预处理剂溶液和进行热循环加热的阪崎肠杆菌活细胞的Ct值显著地大于不进行重复热循环的用生理盐水或预处理剂溶液获得的Ct值，因此其不能是至少表6所示的“热循环加热”组的悬浮液I和上清液I二者Ct值增加的原因。基于这些结果，在预处理剂存在下，使阪崎肠杆菌细胞进行50次PCR热循环，将其冷却至4℃，然后将其返回室温，并使其进行冷冻离心，从而回收在沉淀物和上清液中的染色体DNA，估计通过以上获得的阪崎肠杆菌细胞中的染色体DNA杂乱地缠绕在变性DNA结合蛋白和变性酶周围，并在开始时不可能行使PCR模板的功能。即使上清液I的Ct值来源于在预处理剂存在下通过50次PCR热循环不到1％的阪崎肠杆菌细胞溶解，也认为由于前述原因在PCR开始时94℃下的PCR热循环处理中DNA未完全分离成单链。

[实施例5]

基于使用核染色剂的荧光显微术和立体显微术和基于能够对重复PCR热循环后残余细胞定量的流式细胞术，并通过使用重复PCR热循环前后所获得的样品评价在预处理剂存在下阪崎肠杆菌细胞是否被50次的PCR热循环所溶解(裂解)。

A.荧光显微术和立体显微术

1.实验方法

以与实施例4的方法相同的方式，将10⁹个细胞/ml的阪崎肠杆菌ATCC51329菌株(ES)细胞悬浮于生理盐水或表5中所述的预处理剂中以制备悬浮液(0.25mL)。分别将各悬浮液分成25μl的小份并置于200μl PCR管中，并进行PCR热循环重复步骤(95℃15秒、60℃20秒和72℃30秒，50次)，然后再次将各份混合为一(总计0.25ml)。将各悬浮液分成两半，从其中之一原样收集上清液，另一份进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)。向进行各自处理的0.125ml的各前述悬浮液和上清液中以1.5μl/ml的比例添加SYTO9，将混合物避光维持在4℃15分钟，将2.5μl混合物置于载玻片，用盖玻片覆盖，置于荧光/立体显微镜 AxiosKop2 motplus(镜头：Plan-NEOFLUAR 100×/1.30 oil∞/0.17，光源：独立的KublercoDIX ebq100 isolated，软件：Axio Vision Rel.4.6.3，滤镜：FITC和DIC3，曝光时间：固定的FITC347ms、固定的DIC320ms，LEJ Leistungs elektronik Jena GmbH，Germany)，并用488nm的氩激光作为激发光观察以确认细菌细胞是否发射530nm的绿色荧光。

2.结果

未加热或进行50次PCR热循环的生理盐水中的阪崎肠杆菌悬浮液和将其通过冷冻离心获得的上清液，以及未加热或进行50次PCR热循环的预处理剂溶液中的阪崎肠杆菌悬浮液和将其通过冷冻离心获得的上清液的荧光显微图像分别示于图4至11。即，进行所述实验以使荧光显微图像应当与表6中所述的洗涤步骤I的悬浮液I至上清液I相一致。与这些图像一起，还示出了立体显微图像和立体显微图像与荧光显微图像的叠加图像。

无论是否使用热循环步骤，都在阪崎肠杆菌的生理盐水悬浮液的离心上清液中发现了阪崎肠杆菌的细菌细胞，这也与表6所示的PCR结果相关。如图4和6所示，即使阪崎肠杆菌的细胞在生理盐水中进行了50次PCR热循环，大部分细胞维持了细菌细胞形态(立体显微图像和荧光显微图像)，获得了清晰的SYTO9染色图像，因而认为这些细胞保存了细胞中的染色体DNA。由于在图6所示的立体显微图像中未发现细胞壁碎片，因而表明了一种可能性：表6所示的阪崎肠杆菌生理盐水悬浮液的热循环加热组的悬浮液I和上清液I的Ct值的微小差异并非主要因为由阪崎肠杆菌细胞裂解引起的DNA流出到水相，但观察到因为阪崎肠杆菌细胞由于50次PCR热循环导致比重变小，并且在上清液中回收的阪崎肠杆菌细胞的比例增加(在后述图12的流式细胞术定量结果中也得到了表明)。

另外，如图8和10所示，如生理盐水悬浮液的情况一样，在预处理剂的存在下在50次PCR热循环后未观察到阪崎肠杆菌细胞自身的裂解，认为阪崎肠杆菌细胞保存了细胞中的染色体DNA。然而，作为与使用生理盐水的情况显著的差异，观察到在预处理剂的存在下进行50次PCR热循环后阪崎肠杆菌细胞凝结的现象，但未观察到细菌细胞的裂解。

B.流式细胞术

1.实验方法

以下示出流式细胞术的实验方法。首先，以与实施例4的方法相同的方式，将10⁹个细胞/ml的阪崎肠杆菌ATCC51329菌株(ES)细胞悬浮于生理盐水或表5中所述的预处理剂中以制备悬浮液(0.25mL)。分别将各悬浮液分成25μl的小份并置于200μlPCR管中，并进行PCR热循环重复步骤(95℃15秒、60℃20秒和72℃30秒，50次)，再次将各份混合为一(总计0.25ml)。由于各样品的悬浮液及其上清液用于流式细胞术，所以对于每个样品制备各体积为0.25ml的三份。具体地，第一份由样品本身组成，第二份通过使样品进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)、然后除去上清液并向沉淀加入0.25ml生理盐水以在其中悬浮细胞来制备，以及第三份由通过与上述类似地冷冻离心样品而获得的上清液组成。以1.5μl/ml的浓度向各份中添加SYTO9，将混合物在4℃下避光保存15分钟，用作流式细胞术的试验样品。

测定装置为FACS Calibur(BECTON DICKINSON)，使用488nm的氩激光通过FSC(前散射光测定)和SSC(侧向散射光测定)来识别细菌细胞图。如果SYTO9插入细胞内的染色体DNA，用FL1滤镜(λmax为530nm)通过用上述激光激发可检测到绿色荧光，因而也进行了FL1绘图。尽管不特别使用基于碘化丙锭(PI，propidium iodide)的任何核染色剂，但也用FL3滤镜测定了红色荧光以供参考。流式细胞术测定条件的细节示于表8。

表8

DDM参数：FL1

2.结果

对于阪崎肠杆菌细胞的生理盐水悬浮液及其上清液(未加热或用重复PCR热循环处理)的实验结果示图12，对于悬浮于预处理剂溶液的细菌(包括洗涤一次后重悬的悬浮液)及其上清液(未处理或用重复PCR热循环处理)的实验结果示于图13。对于阪崎肠杆菌细胞的生理盐水悬浮液而言，如果大多数细胞通过50次PCR热循环溶解，则其被分成小份，并不包括在FSC-SSC图的细菌阻挡区域(gate region)(用多边形包围的区域是标绘(plot)细菌的区域)内，在FL1(图中的FL1-H)阳性(+)区域(相对于X轴的右半边区域)无标绘，这意味着其后由SYTO9的绿色荧光或其中的点(plot)应显著减少。然而，对于图12所示的未加热或进行重复PCR热循环的阪崎肠杆菌细胞的生理盐水悬浮液的样品的结果并不支持此猜测。相反，甚至从数值的简单比较，估计甚至在热循环后也有95％的细胞保持了细菌形态，并也保存了染色体DNA。如果考虑到对于两次以上流式细胞术测定的结果而言的固有的标准偏差，数值偏差在测定误差的范围内是高度可能的，可认为基本上100％的阪崎肠杆菌细菌细胞在50次PCR热循环后维持了形态，并保存了染色体DNA。

类似地，基于图13所示的悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细胞(未加热或用重复PCR热循环处理)和通过洗涤并重悬细胞获得的阪崎肠杆菌细胞悬浮液(未加热或用重复PCR热循环处理)的结果，难以认为阪崎肠杆菌的细菌细胞在预处理剂的存在下溶解。基于图12和13所示结果的比较，易于猜测在预处理剂的存在下SYTO9染色有所抑制。因此，认为图13所示的以10¹至10³的FL1-H强度(SYTO9)悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌(未加热或进行热循环，分散细胞)的点是源于阪崎肠杆菌细胞的点是适当的。在此前提下，很明显，基于未加热或进行PCR热循环的悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细胞的数据，阪崎肠杆菌的细菌细胞不溶解，但对于未加热或进行PCR热循环的悬浮于预处理剂溶液的阪崎肠杆菌细胞(通过洗涤并重悬细胞获得)的数据而言，还需要补充。在此情况下，作为大前提，由于对于洗涤一次并在生理盐水中重悬的细胞获得了阪崎肠杆菌SYTO9染色点，所以必须通过使用FL1-H(+)区域来对其评价。在该情况下，尽管对于在PCR热循环后“分散细胞”和“凝结细胞”，在FL1-H(+)区域的总点数明显仍小于未加热的细胞的总点数，如图10所示的结果所估计的那样，如果考虑到“凝结阪崎肠杆菌细胞”的1个点被认为高度可能由至少几个至几十个阪崎肠杆菌的细菌细胞组成，则推测数目等于或高于未加热的细胞，并且如果组合考虑在未洗涤的情况下获得的数据，认为基本上100％的阪崎肠杆菌的细菌细胞未溶解。

[实施例6]

使用阪崎肠杆菌的细菌细胞数和以等于所述细胞中包含的染色体DNA的量的纯化染色体进行实时PCR测定

1.实验方法

从阪崎肠杆菌ATCC29544和ATCC51329菌株的培养肉汤(在其中细胞过夜增殖)中，根据WO2007/094077中记载的DNA提取方法获得无RNA污染的纯化DNA，在260nm和280nm下测定其吸光度值(OD₂₆₀和OD₂₈₀，对于50μg/mlDNA溶液OD₂₆₀＝1.0，细胞长度：1cm)，由OD₂₆₀计算DNA浓度，基于OD₂₆₀/OD₂₈₀估算纯化DNA的纯度。

此外，洗涤前述培养肉汤(在其中细胞过夜增殖)的细胞，然后用无菌水连续稀释从而以4×10³至4×10⁸个细胞/ml的浓度制备阪崎肠杆菌的活细胞悬浮液。然后，根据实施例4的方法，向2.5μl各悬浮液中加入12.25μl表5中所述的预处理剂溶液(假设无菌水的体积改为2.7μl)，并将用于ompA基因检测的12.75μl PCR缓冲液进一步加入到混合物从而以与实施例4的方法相同的方式进行PCR。各PCR管包含10¹至10⁶个阪崎肠杆菌细胞。由于从阪崎肠杆菌1个细胞获得的染色体DNA的量可看作为5fg(5×10^-15g)，通过使用上述值计算包含于各PCR管的染色体DNA的量，向各PCR管中加入等量的前述纯化DNA(2.5μl)，以相同的方式相继加入预处理剂溶液和PCR缓冲液以进行PCR。

2.结果

DNA的纯度示于表9，实时PCR的结果示于表10。从表9所示的结果来看，OD₂₆₀/OD₂₈₀的值为约2.0，因此可分别从两株阪崎肠杆菌各自制备几乎无RNA污染的高纯度DNA。另外，从表10所示的结果来看，对于阪崎肠杆菌细菌的细菌细胞和以相应于相同数量细胞的量的染色体DNA Ct值无显著差异，因此发现，如果100％纯化DNA溶解在管中作为PCR模板行使功能，则阪崎肠杆菌的细菌细胞的100％染色体DNA也作为PCR模板行使功能。

对于在相似的预处理剂溶液或生理盐水中悬浮阪崎肠杆菌细胞、然后向该悬浮液添加如实施例4所示的此PCR缓冲液以进行PCR的情况而言，根据常规知识推测可能存在以下误解：一部分阪崎肠杆菌细胞溶解使得染色体DNA流出到外部溶液，并充当PCR模板引起PCR反应。然而，如果将该假设应用于该情况，则必须基本上100％的阪崎肠杆菌细胞应溶解，但很明显，实施例4和5的试验结果否认了这样的100％裂解现象。即，对于实施例4而言，在表6所示的预处理剂存在下50次PCR热循环后阪崎肠杆菌细胞的悬浮液I和II以及上清液I的Ct值的比较中，如果100％细胞溶解，则上清液I的Ct值需显著小于悬浮液II的Ct值，并且该上清液的Ct值应等于悬浮液I的Ct值。然而，表6所示的结果并不支持此猜测。另外，对于实施例5，基于图13所示的重复PCR热循环前后阪崎肠杆菌细胞数的定量结果(其为流式细胞术测定的结果)，基本上100％细胞的裂解是不可能的，甚至10％的细胞被裂解也是不大可能的。即，根据本发明，“一部分细菌细胞溶解，染色体DNA从中流出到外部溶液以引发PCR”的假设根据一般科学知识至少不能用于预处理剂存在的PCR(50次)。

表9

表10

[实施例7]

从实施例4至6的结果发现，即使在预处理剂存在下用PCR缓冲液进行PCR反应(50次)后，大多数阪崎肠杆菌细胞也不溶解，细胞保存了细胞中的染色体DNA。另一方面，在实时PCR后的PCR扩增产物的TM模式分析中(解链温度测定)，获得了被评价为ompA基因产物的温度峰(thermal peak)，已判定实时PCR是阳性的。然而，准确地说，不确定PCR扩增产物是否存在于细菌细胞、PCR用反应溶液或两者之中。从常识观点，认为PCR扩增产物主要溶解在PCR溶液中，但即使这并未绝对明确，对于根据本发明在预处理剂存在下的PCR，也仍然较不明确。在前述实施例中，表明可在细菌细胞中进行在预处理剂存在下的PCR，但在以下实施例中，将阐明PCR扩增产物也留在细菌细胞中的可能性。

1.实验方法

制备五份500μl阪崎肠杆菌ATCC51329菌株的培养肉汤(9.3×10⁸个细胞/ml)(其中细胞已过夜增殖)，并进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)，除去上清液，然后向沉淀物添加500μl通常的细菌用固定液A(4％多聚甲醛)、或固定液B(甲醇/乙酸＝3/1)、固定液C(Mildform 10N，10％福尔马林，Neutral Buffer Solution Deodorized，Wako Pure Chemical Industries，Osaka)或固定液D(Mildform 10NM，10％福尔马林，Neutral Buffer-Methanol Solution Deodorized，Wako Pure Chemical Industries，Osaka)，将混合物在4℃下温育过夜，以便交联细菌细胞中的染色体DNA和细胞壁蛋白质以事先固定细胞中的染色体DNA。作为对照，通过使用500μl生理盐水代替固定液来制备其中不进行固定的样品。

然后，用500μl生理盐水洗涤细胞三次，最后悬浮于250μl生理盐水中。由于洗涤操作后作为沉淀物的细菌回收率通常认为是80％，并进行了4次离心，所以估计最终制备液中阪崎肠杆菌的细胞浓度为7.6×10⁸个细胞/ml。将体积为250μl的该生理盐水悬浮液进一步稀释10倍。估计该稀释液中阪崎肠杆菌的细胞浓度为7.6×10⁷个细胞/ml。将2.5μl体积的该稀释液用作PCR扩增用样品，并加入到12.25μl表5中所述的预处理剂溶液(假设无菌水的体积改为2.7μl)，并进一步向混合物中加入下文所述的用于革兰氏阴性菌检测的PCR缓冲液12.75μl。对于用各固定液固定的各样品，制备20份体积为27.5μl的份。作为引物，使用实施例3所述的用于16S rRNA基因检测的正向引物16S_1234F(SEQ ID NO：3)和用于23S rRNA基因检测的反向引物23S_1703R(SEQ ID NO：4)。

PCR缓冲液组成：

a)16S_1234F(10pmol/μl)：2μl

b)23S_1703R(10pmol/μl)：2μl

c)Ex-Taq(5U/μl，Takara-Bio)：0.25μl

(包含0.5％吐温20、0.5％诺乃P-40和50％甘油)

d)10×Ex-Taq缓冲液(Takara-Bio)：2.5μl

e)dNTP混合物(Takara-Bio)：2μl

f)10×SYBR Green I(BMA)：4μl

通过使用实时PCR装置(iCycler iQ，Bio-Rad，Hercules，CA) 根据以下PCR热循环条件进行实时PCR。

1)4℃3分钟(1个循环)

2)95℃15秒；60℃20秒；72℃3分钟(30个循环)

3)95℃3分钟(1个循环)

完成PCR后，对于各固定液的20份PCR反应液混合为一，并进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)。收集体积为5μl的上清液并用于0.8％琼脂糖凝胶电泳(SYBR Gold染色，对于所有以下情况通过SYBR Gold染色进行凝胶染色)，弃剩余上清液。向沉淀物加入200μl生理盐水以悬浮细胞。估计悬浮液中阪崎肠杆菌的细菌细胞数为1.5×10⁷个细胞/ml。将SYTO9以1.5μl/ml的浓度加入悬浮液，并将混合物置于4℃避光15分钟，用与实施例5的那些条件相同的条件下进行流式细胞术。作为对照，进行相同的步骤，条件是PCR进行0个循环而不是30个循环，从而获得对照样品。

此外，对于用固定液A和B获得的样品，通过使用实施例4中所述的ompA_F引物(SEQ ID NO：7)和ompA_R引物(SEQ IDNO：8)代替16S_1234F和23S_1703R、实施例4的PCR热循环条件和除前述条件以外的实施例7中的方法来进行PCR，PCR后获得的5μl上清液进行电泳，并且对于PCR后通过除去上清液获得的沉淀物的生理盐水悬浮液，通过使用SYTO9进行流式细胞术测定。

2.结果

各前述固定液处理和PCR(16S-23S rRNA，2450bp)后反应上清液的电泳结果示于图14。实时PCR中测定的相应反应液的 Ct值直接示于其下方。对于PCR后通过除去样品上清液并在生理盐水中悬浮沉淀物而获得的悬浮液，通过使用SYTO9进行的流式细胞术测定结果示于表11。靶向ompA(469bp)基因的PCR后上清液的电泳照片类似地示于图15。对于PCR后通过除去样品上清液并在生理盐水中悬浮沉淀物而获得的悬浮液，通过使用SYTO9进行的流式细胞术测定结果示于表12。从图14所示的结果来看，用固定液B获得的PCR混合物上清液中16S-23S基因(2450bp)产物的量显著大于用其他固定液获得的量，条带亮度(band strength)相当于没有固定(图中的“S”)下所获得的条带亮度。作为细菌的标准固定法，由于固定液A是常用的，并且固定液C和D具有类似于固定液A的组成，所以认为阪崎肠杆菌细胞中染色体DNA和细胞壁蛋白质稳固地交联。基于图14所示的结果，认为固定液B仅具有相当于未固定(S)的功能是适当的，但由于固定液B稳固地交联哺乳动物细胞的染色体和细胞膜蛋白，其在细菌中也略显示固定功能。

表11

表12

表11(表12同样)所示的流式细胞术的结果(象限：4个象限中的LR，即，使用细菌的SYTO9+的数作为指标，在PCR前后阪崎肠杆菌的细菌细胞数的比较)表明即使当通过使用各固定液固定或事先不固定(S)来固定细菌细胞，即，将细菌染色体DNA固定于细胞，然后在预处理剂的存在下重复PCR热循环30次时，大多数细菌细胞也不溶解，但保持形态，染色体保留于细胞中。另外，尽管由电泳照片(图14)表明在PCR反应混合物上清液中也存在靶基因扩增产物，但仅对于用固定液B和未固定(S)获得的样品，观察到在图14的凝胶照片下指示的实时PCR测定的Ct值，并且在用其他固定溶液的实时PCR中未观察到Ct值。

可认为这是因为，在固定液A、C和D的情况下，染色体和细胞壁之间的固定程度高，因此不利于实现在PCR中的热变性(95℃)，因此染色体DNA不能变为单链，并且因此引物对染色体的粘附变弱，但如果将图15所示的靶向ompA基因(469bp)的类似的实验结果(30个循环)考虑在内，用固定液A和B获得的实时PCR中测定的Ct值和获得的条带亮度未显示显著差异，并因此否定了以上假设。

即，认为图14所示的用固定液A、C和D获得的PCR反应混合物上清液中的存在少量靶基因扩增产物，这是因为尽管通过使用被细菌细胞保存的染色体作为模板有利地进行PCR反应本身，但基因产物为图5的5倍长(2450bp)，结果，抑制了细胞中扩增的基因产物流出到外部溶液。如果该假设是正确的，则PCR后在阪崎肠杆菌的细菌细胞中也应检测2450bp的基因扩增产物。这已在实施例8中被证实。如以上所讨论，可总结为即使预先进行用于固定细胞中细菌染色体的处理来抑制染色体流出到外部溶液，基本上100％的细菌细胞也会保持细胞形态，并且即使在重复PCR热循环50次后只要在预处理剂的存在下进行，染色体也保留在细胞中，但虽然如此，PCR反应仍然进行，并且PCR扩增产物也存在于外部溶液中，因此PCR反应主要发生在细菌细胞中。另外，如下述的实施例8所示，在前述条件下，一部分PCR产物也存在于细胞中。

[实施例8]

在实施例4至7中，表明可能在细菌细胞中发生在预处理剂存在下的PCR，即，可能发生原位PCR。原位PCR(例如，Gerard J.等人，American Journal of Pathology，139：847-854，1991)是用于检测和定量基因如掺入人类细胞染色体DNA的HPV基因的技术，其中在检测和定量之前，用如实施例7中所述的此类固定液固定人类免疫细胞以交联染色体DNA和人类细胞膜蛋白，并用蛋白酶短时间处理细胞，或通过微波照射处理人类免疫细胞的细胞膜。

该技术为将PCR用溶液置于固定的人类细胞以诱导人类免疫细胞中的PCR扩增反应的技术，用该技术即使约500bp的PCR产物也不流出细胞外。由于PCR产物不流出细胞外，如果PCR反应终止于小于5至10个循环的初期，其可为不仅能够检测细胞内基因，而且还能够评价参入的基因数的技术。

如果在根据本发明的预处理剂存在下的PCR为原位PCR，则一部分扩增产物也可保留在细菌细胞中，在该实施例中，为了证实该假设而进行了实验。特别是在实施例7中，尽管用固定液B可能将阪崎肠杆菌的染色体DNA与细胞壁蛋白质交联，但观察到以下趋势：与使用其他固定液的情况相比，在预处理剂的存在下PCR扩增产物更多地流出到外部溶液，并且观察到与不使用任何固定液用本发明的技术(不使用固定(S)的技术)所观察到的现象相类似的现象。

因此，研究集中于实施例7中所述的固定液B和无固定(S)，并检测是否即使当大量PCR扩增产物流出到外部溶液时，PCR扩增产物也将部分保留在细菌细胞中。

1.实验方法

制备两份500μl阪崎肠杆菌ATCC51329菌株的培养肉汤(4.3×10⁸个细胞/ml)(在其中细胞过夜增殖)，并进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)，除去上清，然后向各沉淀物中添加500μl固定液B(甲醇/乙酸＝3/1)，在4℃下温育混合物过夜以交联细菌细胞中的染色体DNA和细胞壁蛋白质，由此将DNA预先固定在细胞中。作为对照，通过使用500μl生理盐水代替固定液B来制备不进行固定的样品。其后使用如实施例7的那些相同的方法，最终将样品稀释10倍以获得250μl生理盐水中的阪崎肠杆菌悬浮液。悬浮液中阪崎肠杆菌细胞的浓度估计约为3.5×10⁷个细胞/ml。使用2.5μl体积的该悬浮液作为PCR扩增用样品，并加入到12.25μl表5中所述的预处理剂溶液(假设无菌水的体积改为2.7μl)，向混合物中加入下文所述的用于革兰氏阴性菌检测的PCR缓冲液12.75μl，以便在以下条件下进行PCR。当PCR时，对于用固定液获得的样品和对照样品，分别制备体积为27.5μl的20份。作为引物，使用实施例3所述的用于16S rRNA基因检测的正向引物16S_1234F(SEQ ID NO：3)和用于23S rRNA基因检测的反向引物23S_1703R(SEQ ID NO：4)。

完成PCR后，对于各固定液的20份PCR反应液混合为一，并进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)。收集5μl体积的上清液并用于0.8％琼脂糖凝胶电泳，弃剩余上清液。用500μl生理盐水洗涤沉淀物两次，并通过使用QuickGene SP kit DNA tissue来提取DNA。

另外，制备两份500μl培养肉汤(在其中细胞过夜增殖)(4.3×10⁸个细胞/ml)，并进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)，除去上清液，然后向各沉淀物中添加500μl固定液B(甲醇/乙酸＝3/1)，在4℃下温育混合物过夜。用500μl生理盐水洗涤细胞3次，通过使用QuickGene SP kit DNA tissue(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)提取并纯化DNA。作为对照，通过使用500μl生理盐水代替固定液B来制备不进行固定的样品。根据以上描述，在固定后立即仅进行洗涤并从沉淀物中直接提取DNA的情况下，由于样品总计进行4次离心，所以细胞数为4.3×10⁸×0.5×0.41＝0.9×10⁸个细胞，但在估算的细胞浓度方面，用于PCR的细菌数计算为约3.5×10⁷个细胞/ml×2.5μl×20＝1.8×10⁶个细胞，如果将其后进一步使样品进行3次离心考虑在内，其估计为0.9×10⁶个细胞。

对于各情况，由于PCR前样品中用于DNA提取步骤的细菌数比PCR后样品中的大100倍，为了以相同细胞数使用，制备20份体积各为2.5μl(＝1.8×10⁶个细胞)的阪崎肠杆菌生理盐水悬浮液(3.5×10⁷个细胞/ml)(固定液B和对照S)，在不进行PCR的情况下混合为一，然后通过离心总计洗涤3次，并用于DNA提取。

另外，即使通过前述检测在阪崎肠杆菌细菌细胞内证实约2450bp的长PCR扩增产物，当在预处理剂存在下进行PCR时，如图14或15所示，由于PCR扩增产物存在于外部溶液，可能误解为外部溶液中的PCR扩增产物可吸附于阪崎肠杆菌的细菌细胞壁上，好像PCR扩增产物貌似存在于细胞内部。因此，额外进行了以下实验。

通过向各PCR管中添加2.5μl从阪崎肠杆菌ATCC51329菌株中纯化的包含0.44ng DNA(400pg，包含于8.8×10⁴个细胞中的染色体DNA的量)的DNA水溶液，如前述情况一样添加预处理剂溶液，然后添加PCR缓冲液至总体积为27.5μl来制备20份样品，并在以下所示条件下用其中每一份进行PCR。然后，将20个PCR管的内含物混合为一，向混合的反应液添加50μl 3.5×10⁷个细胞 /ml的阪崎肠杆菌的生理盐水悬浮液(根据实施例7的方法用固定液B或未固定处理，并洗涤3次)，将混合物充分混合，并进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)以除去上清液，将沉淀物洗涤两次并用于DNA提取。

PCR缓冲液的组成：

a)16S_1234F(10pmol/μl)：2μl

b)23S_1703R(10pmol/μl)：2μl

c)Ex-Taq(5U/μl，Takara-Bio)：0.25μl

(包含0.5％吐温20、0.5％诺乃P-40和50％甘油)

d)10×Ex-Taq缓冲液(Takara-Bio)：2.5μl

e)dNTP混合物(Takara-Bio)：2μl

f)10×SYBR Green I(BMA)：4μl

1)4℃3分钟(1个循环)

2)95℃15秒；60℃20秒；72℃3分钟(30个循环)

3)95℃3分钟(1个循环)

2.结果

结果示于图16。分别地，用细胞(所述细胞为用固定液B固定或不固定的阪崎肠杆菌细胞)在预处理剂存在下进行PCR(16S-23S：2450bp)获得的反应混合物的上清液的电泳结果示于泳道2和3，通过从上述PCR后并洗涤两次获得的沉淀物提取DNA获得的DNA的电泳结果示于泳道5和6，直接从固定或未固定的阪崎肠杆菌(其为该实验的试验材料)中提取的DNA的电泳结果示于泳道7和8，在固定或未固定的阪崎肠杆菌细胞用于PCR反应前从其中提取的DNA的电泳结果示于泳道9和10，以及在添加预先制备的PCR扩增产物后从洗涤两次的阪崎肠杆菌细胞中提取的DNA的电泳结果示于泳道13和14。

如泳道13和14的结果所示，表明对于固定和非固定细胞两者，即使PCR基因产物(2450bp)从外部溶液侧吸附于阪崎肠杆菌细菌细胞壁外膜等上，也可通过洗涤两次从细菌中除去PCR基因产物。因此，可吸附于细胞壁外表面的PCR基因产物被认为是保留在细胞中的PCR基因产物，这一不正确解释的可能性被排除。另外，考虑到：在表明从PCR后的沉淀物洗涤两次的细胞中提取的DNA结果的泳道5和6中检测到估计为PCR反应产物的片段，以及从泳道13和14的结果来看，所述片段不是可吸附于细胞壁外侧的PCR产物，泳道5和6的PCR基因产物很可能为保留在细胞中然后提取的PCR基因产物。另外，即使在外部溶液和细胞中的PCR基因产物的浓度变为相同，由于细胞为其细胞壁受损的细菌细胞，因此PCR基因产物处于可自由穿过细胞壁的状态，外部溶液的体积比细胞的体积大10¹⁰倍左右，在外部溶液中的PCR基因产物的量也应比细胞内的大10¹⁰倍左右，即，外部溶液中量的1/10¹⁰应分布于细胞中。然而，基于泳道2、3、5和6的条带亮度的比较，不能认为保留在细胞内的PCR产物的量为1/10¹⁰量。即，表明本发明的方法中发生的PCR很可能是原位PCR。从泳道7和8的结果来看，从用作试验材料的固定和非固定的阪崎肠杆菌细菌细胞中都检测到染色体DNA，但在泳道5、6、9和10中未获得染色体DNA的任何条带。这种不同可能是由用于DNA提取的阪崎肠杆菌细菌细胞的细胞数的不同产生的，具体地，对于DNA提取，9×10⁶个细胞的细胞数非常可能不够，然而对于试验材料在泳道7和8中，细胞数事实上高达9×10⁸ 个细胞。

[实施例9]

使阪崎肠杆菌细胞在生理盐水中或在预处理剂的存在下进行煮沸处理，研究阪崎肠杆菌染色体DNA随处理时间流出到各上清液的程度。

1.实验方法

洗涤阪崎肠杆菌ATCC51329菌株(1.1×10⁹个细胞/ml)的培养肉汤中的细胞(在其中细胞过夜增殖)，并用生理盐水稀释10倍，使悬浮液进行冷冻离心(3000×g、10分钟、4℃)，从而一次收集沉淀物，向沉淀物中添加等体积(500μl)生理盐水或具有表5所示组成的预处理剂溶液，并充分悬浮细胞。然后，用沸水将悬浮液加热0至5分钟，加热后，迅速冷却。分别使加热即刻后的5μl体积各悬浮液和通过冷冻离心各悬浮液获得的体积为5μl的各上清液在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。

2.结果

在图17中，示出了使用沸水，在生理盐水中或在预处理剂的存在下，进行热处理的阪崎肠杆菌染色体流出到上清液的程度。首先，对于泳道2和9的结果而言，尽管未加热细胞，已表明了痕量染色体DNA的存在，但认为这是由于培养肉汤(在其中细胞过夜增殖)中的细胞达到了静止期，因而一部分死细胞溶解，其染色体DNA流出到外部溶液。因此，在评价中忽略此痕量染色体DNA。尽管估计由于加热引起DNA从阪崎肠杆菌的细菌细胞流出到生理盐水中，但即使在煮沸5分钟后，在预处理剂的存在下在悬浮液和上清液中未检测到染色体DNA的任何条带。然而，当基于对泳道10和12的加样孔(well)的观察进行评价时，在悬浮液的情况下在加样孔中观察到条带，但对于上清液未观察到任何条带，这揭示了在预处理剂存在下染色体DNA未流出细菌细胞，而保留在细胞内。另一方面，对于生理盐水的上清液也观察到了加样孔中的条带(泳道5、6和7)，认为它们源于一部分离心后上清中收集的阪崎肠杆菌死细胞，其由于煮沸而比重降低。表6或图12的结果也支持了该估计。由以上结果表明，尽管不同于重复PCR热循环精确的条件，在预处理剂的存在下，即使当细胞进行热处理，DNA也更难流出细菌细胞。

产业上的可利用性

根据本发明的方法，通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞，可高灵敏度微检测微生物的活细胞。基于核酸扩增法，本发明能够简便快捷地识别食品、生物样品、抽汲样品和环境如工业用水、环境用水和废水中的微生物的活细胞、损伤细胞和死细胞。本发明的方法和试剂盒可用于自主检查，并在经济观点中也是有利的。

根据本发明的优选实施方案，其还可应用于以5log₁₀个细胞/ml以上包含大肠杆菌的损伤细胞或死细胞的各种食品的卫生检验或大肠杆菌在血液中传播的儿童菌血症的诊断。

另外，根据本发明的优选实施方案，可从食品中高灵敏度仅检测包括肠杆菌科细菌的大肠菌的活细胞(1CFU/2.22ml乳)，与常规方法(食品检验法/关于乳和乳制品的成分标准的部长级条例)相比更快捷(7小时30分钟)，因而期望其用于工厂出货前和在以乳制造工厂为代表的各种食品工厂中制造后的测定，并且认为其为高度工业可用的。

此外，本发明能够以低浓度快速检测和定量仅活的微生物，关于微生物其不仅包括大肠菌和肠杆菌科细菌还包含包括致病菌的各种细菌和病毒等，因此，其可应用于各种卫生检查、临床试验和过程控制等。

Claims

1.一种通过识别活细胞与死细胞或损伤细胞来检测试验样品中微生物的活细胞的方法，所述方法为非诊断用途的方法并包括以下步骤：

c)在用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂、0.1至1.5%的Brij56、1至10mM的镁盐、和0.1至20mM的有机酸盐或磷酸盐的存在下，通过核酸扩增法，在不从所述细胞提取核酸的情况下扩增包含于所述试验样品的所述微生物的DNA或RNA的目标区域，所述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂为选自0.0001至1质量%的白蛋白、1至8%的葡聚糖、0.01至1%的T4噬菌体基因32编码蛋白、1至20μg/ml的溶菌酶中的一种或多种；和

d)分析扩增产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在微生物细胞中进行所述目标区域的扩增。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤c)之前，重复进行步骤a)和b)。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤a)之前，进行以下步骤e)：

e)用存在于所述试验样品中的具有分解除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶处理所述试验样品。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述酶选自蛋白质降解酶、脂质降解酶和糖类降解酶。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述试验样品为食品、生物样品、饮用水、工业用水、环境用水、废水、土壤和抽汲样品的任一种。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物为细菌或病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌为革兰氏阴性菌。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的所述试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单叠氮丙锭、补骨脂素、4,5',8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述磷酸盐为焦磷酸盐。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目标区域为50至5,000个核苷酸的目标区域。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述目标区域为相应于选自所述试验样品的DNA的5S rRNA基因、16S rRNA基因、23S rRNA基因和tRNA基因中的基因的目标区域。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸扩增法为PCR、RT-PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC或微阵列法。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述PCR作为实时PCR来进行，从而同时进行PCR和所述扩增产物的分析。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过使用表示所述微生物的量和所述扩增产物之间的关系的标准曲线来进行所述扩增产物的分析，所述标准曲线通过使用所述微生物的标准样品建立。

17.一种试剂盒，所述试剂盒在根据权利要求1或2所述的方法中使用并包括以下组分：

2)用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂、0.1至1.5%的Brij56、1至10mM的镁盐、和0.1至20mM的有机酸盐或磷酸盐，所述用于抑制核酸扩增抑制物作用的试剂为选自0.0001至1质量%的白蛋白、1至8%的葡聚糖、0.01至1%的T4噬菌体基因32编码蛋白、1至20μg/ml的溶菌酶中的一种或多种，其中上述各浓度为使用时的浓度；和

3)一种或多种用于通过核酸扩增法扩增待检测的微生物的DNA或RNA的目标区域的引物。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其进一步包括具有分解存在于所述试验样品中的除微生物细胞以外的细胞、蛋白质胶粒、脂质或糖类的活性的酶。

19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述核酸扩增法为PCR、RT-PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA、TRC、HC或微阵列法。

20.根据权利要求17所述的试剂盒，其中通过用具有350nm至700nm波长的光照射能够共价结合至DNA或RNA的所述试剂选自单叠氮乙锭、双叠氮乙锭、单叠氮丙锭、补骨脂素、4,5',8-三甲基补骨脂素和8-甲氧基补骨脂素。

21.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述有机酸盐选自乙酸盐、丙酸盐和柠檬酸盐。

22.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述磷酸盐为焦磷酸盐。

23.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述酶选自蛋白质降解酶、脂质降解酶和糖类降解酶。