CN113652358B - 一种基于竹红菌素的光动力处理抑制克罗诺杆菌生长的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于光敏剂的光动力除菌技术，属于食品除菌的技术的技术领域。目前，食源性病原菌的侵染造成的疾病和急性中毒事件屡见不鲜，对人们的身体健康造成了严重的威胁。目前采用的传统除菌技术多囿于其加热、紫外线或者超高压的使用对食品本身的品质、应用场景和使用价格等有诸多限制。克罗诺杆菌(又称阪崎肠杆菌，Cronobactersakazakii)是一种常见的革兰氏阴性食源性病原菌，其主要存在于奶粉尤其是婴儿配方奶粉中，可引发婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎等一系列疾病，且在某些情况下其死亡率高达40％～80％。本发明使用基于竹红菌素的光动力除菌技术，实现了在可见光条件下的针对克罗诺杆菌的显著除菌效果，并通过各种手段研究了其杀菌途径，为其在食品中应用并逃逸抗性反应提供了依据。

Description

一种基于竹红菌素的光动力处理抑制克罗诺杆菌生长的用途
技术领域
本发明食品除菌的技术的技术领域，尤其涉及一种基于竹红菌素的光动力技术在抑制克洛诺杆菌生长方面的功能用途。
背景技术
食源性疾病主要是摄入有毒食物引起的疾病，发病概率极高，是我国社会面临的公共卫生安全隐患之一。克罗诺杆菌(又称阪崎肠杆菌，Enterobacter sakazakii)是一种常见的革兰氏阴性食源性病原菌，其主要存在于奶粉尤其是婴儿配方奶粉中，可引发婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎等一系列疾病，且在某些情况下其死亡率高达40％～80％。目前使用的食品除菌技术在对食品品质的影响、除菌条件的要求、对人体健康的危害方面具有不同程度的问题，因此开发的除菌技术具有十分显著的应用意义和健康价值。
光动力疗法利用了光敏剂的靶向性，它能够与光敏化合物结合在一起并优先聚集在病理组织上，在吸收了适当波长的光后，开启活化过程，杀灭有害细胞。该技术关键三要素是光敏剂、O2和光照，其核心在于光敏剂对光能的捕捉和转移能力，光敏剂是一类能够吸收光子，并可将能量传递给氧，促使其发生化学反应，而自身恢复到原来的状态，不参与反应的分子。而光动力杀菌通过光敏剂吸收光子能量，并将能量转移给氧，从而产生ROS，这些ROS通过氧化作用攻击有害微生物，达到杀菌的目的。相比于传统的热杀菌或紫外线、超高压等技术，光动力杀菌技术具有灭菌效果好、保持食品风味和营养等优势。我们之前的研究发现，基于竹红菌素的光动力处理能够显著改变苹果切片中金黄色葡萄球菌的活菌数量。但是光动力技术对于革兰氏阳性细菌和阴性细菌的除菌效率具有显著的差异，这种差异是基于细胞壁及细胞外膜的结构造成的，因此本技术能否在可见光的条件下实现对克洛诺杆菌这种革兰氏阴性细菌的有效抑制尚不得而知。
发明内容
本发明提供了一种基于竹红菌素的光动力处理抑制克洛诺杆菌生长的用途。
本发明是通过以下步骤的技术方案得以实现：
所用菌种为克洛诺杆菌(Cronobacter sakazakii)，所使用的培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，其成分为牛肉膏0.3g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.3g，ddH2O 100ml。
(1)菌种预处理
一次活化：冷冻保藏的菌液于常温融化，取50μl于5ml液体培养基中，混匀后置于振动培养箱中37℃恒温培养15h。
二次活化：取200μl一次活化的菌液于10ml液体培养基中，混匀后置于振动培养箱中37℃恒温培养4h。使用紫外分光光度计测量二次活化菌液OD值，当OD值达到0.5-0.6时说明此时菌的生长阶段已经进入对数期(OD值为0.5的菌液菌数量在108量级)。
(2)光动力杀菌
取1ml二次活化后的菌液于1.5ml灭菌EP管中，8000×g离心3min，弃上清，用0.9％生理盐水重悬菌液后加入适量竹红菌素吹吸均匀。加入不同浓度的竹红菌素后，于恒温培养箱中37℃暗孵30min。孵育完成后，将菌液吹吸均匀，加入24孔板中，使用460nm LED灯(功率64.7mW)直照。将光照处理后的菌液移入的1.5ml灭菌EP管中，避光保存。
(3)点涂实验
培养皿表面用马克笔打上间距为5-10mm的横线和竖线，横竖线将会围成若干方格，按照浓度梯度从低到高为每列方格标注上数字。注意点涂菌液的位置不可靠培养皿边缘太近。同时固体培养基必须干燥，不能有水渍。
对经过光照杀菌处理的菌液进行等梯度稀释，每次稀释10倍，依次将菌液稀释到105、106、107。取1μl不同稀释梯度的菌液，点涂在对应方格中，等菌液被培养基完全吸收后，倒置培养皿，放入培养箱恒温培养15h后计数。
首先确定适宜光照强度范围。蓝光透过24孔板的光照强度可以通过控制光照时间来调控。在同样光敏剂浓度下筛选出：实验组与空白对照组对比，菌落数量减少效果显著、菌落数量有减少效果，菌落数量减少效果不明显的光照强度进行实验。
光照强度范围确定之后再确定适宜的竹红菌素浓度范围。在同样光照强度下筛选出：实验组与空白对照组对比，菌落数量减少效果显著、菌落数量有减少效果，菌落数量减少效果不明显的竹红菌素浓度进行实验。
(4)涂布活菌计数
通过平板计数的方法，得到竹红菌素对克洛诺杆菌在不同条件下的杀菌效果数据。首先对菌种进行光动力杀菌处理，再根据需要的浓度对菌液进行等梯度稀释。稀释完成后即可进行涂布实验。取50μl稀释菌液于固体培养基上，用充分灼烧且冷却后的涂布棒涂布均匀。静置15min，将平板倒置，于培养箱中37℃恒温培养15h后计数，根据菌落计数，计算杀菌效率。
所述基于竹红菌素的光动力技术能够显著降低克罗诺杆菌的存活率。
进一步地，当光照强度为19.4J/cm2(5分钟处理)、竹红菌素浓度为30μM时，抑菌率可达到57.4％；当光照强度为58.2J/cm2(15分钟处理)、竹红菌素浓度为30μM时，抑菌率可达到87.5％；
进一步地，在上述处理条件下，细菌的质膜通透性显著提高，显示出细胞结构的受损；
进一步地，在上述处理条件下，细菌的整体形态发生了显著改变，出现了明显的皱缩和不规则的形态；
进一步地，在上述光动力处理条件下，cpxA基因的表达量出现了显著下调，由于该基因是克洛诺杆菌一种重要的二元件调控组分，因此该基因的异常表达提示光动力处理显著改变了细菌的应激状态；
进一步地，在上述光动力处理条件下，鞭毛相关基因flgI，flic，flih均表现出显著下调，由于鞭毛与细菌的运动能力有关，因此提示出光动力处理显著改变了细菌的运动状态；
进一步地，当cpxA基因被敲除以后，突变菌在所述光动力处理条件下的存活率进一步下降，提示出该基因的表达减少是光动力抑菌效应的重要分子路径，也体现出光动力处理能够通过改变细菌的应激反应降低其存活能力的技术效果。
有益效果
本发明使用基于竹红菌素的光动力处理手段有效降低了克罗诺杆菌的存活率。该技术效果是竹红菌素介导的光动力处理在该种食源性病原菌的创造性应用，由于革兰氏阳性细菌对光动力处理更为敏感，因此本技术能否针对克罗诺杆菌这种革兰氏阴性细菌产生除菌效应在本申请之前尚难以预期。本发明给出了本光动力处理技术能用应用于克罗诺杆菌的控制的关键证据，并同时依据光动力处理这种技术本身的性质具有了对传统热杀菌、紫外线杀菌和超高压杀菌的在能源使用、应用场景、设备要求和健康担保方面的优势，因此是一种针对食源性克罗诺杆菌清除的技术的有益应用。另一方面，cpxA基因介导的杀菌途径的识别确实了竹红菌素介导的光动力处理对克罗诺杆菌的抑制效应，并因此获得了针对性逃逸病原菌抗性的靶点和敲除抑制手段。
附图说明
图1为不同竹红菌素浓度下光动力杀菌的效果。H-L-为不进行光照也不加光敏剂的对照处理组；H+L-为不进行光照只加光敏剂的对照处理组；H-L+为只进行光照不加光敏剂的对照处理组；H+L+为进行光动力处理的实验组。
图2为在30uM竹红菌素处理条件下不同光照强度对光动力杀菌效果的影响。H-L-为不进行光照也不加光敏剂的对照处理组；H+L-为不进行光照只加光敏剂的对照处理组；H-L+为只进行光照不加光敏剂的对照处理组；H+L+为进行光动力处理的实验组。
图3为在58.2J/cm2处理条件下不同竹红菌素浓度对光动力杀菌效果的影响。H-L-为不进行光照也不加光敏剂的对照处理组；H+L-为不进行光照只加光敏剂的对照处理组；H-L+为只进行光照不加光敏剂的对照处理组；H+L+为进行光动力处理的实验组。
图4为通过PI染色观察不同光照强度下克罗诺杆菌的存活率，PI染料可以穿过破损细胞或死细胞的细胞膜，并对其DNA染色使其产生红色荧光，但是它不能通过活细胞膜。通过荧光显微镜拍照观察红色荧光数量，可以定性判断光敏剂的杀菌效果同时也可以判断细胞膜的通透性。通过荧光结果统计图看出光照时间15min时杀菌效果达到最强。
图5为SEM电镜扫描图。经过光动力处理显著改变细胞的表面形态，未处理组0-0的菌体形态完整，表面平滑，呈杆状均匀分布，处理组菌体形态变形，菌体表面严重皱缩凹凸不平，细胞膜完整性受到破坏且菌体破裂。
图6为在光动力处理对克罗诺杆菌多个基因表达水平的影响。该研究通过qPCR的检测来完成。
图7为光动力处理对cpxA敲除突变株的存活率的影响。ES，野生株；ΔcpxA，cpxA敲除突变株。
实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
光动力处理与活菌计数手段
所用菌种为克洛诺杆菌(Cronobacter sakazakii)，所使用的培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基，其成分为牛肉膏0.3g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.3g，ddH2O 100ml。
(1)菌种预处理
一次活化：冷冻保藏的菌液于常温融化，取50μl于5ml液体培养基中，混匀后置于振动培养箱中37℃恒温培养15h。
二次活化：取200μl一次活化的菌液于10ml液体培养基中，混匀后置于振动培养箱中37℃恒温培养4h。使用紫外分光光度计测量二次活化菌液OD值，当OD值达到0.5-0.6时说明此时菌的生长阶段已经进入对数期(OD值为0.5的菌液菌数量在108量级)。
(2)光动力杀菌
取1ml二次活化后的菌液于1.5ml灭菌EP管中，8000×g离心3min，弃上清，用0.9％生理盐水重悬菌液后加入适量竹红菌素吹吸均匀。加入不同浓度的竹红菌素后，于恒温培养箱中37℃暗孵30min。孵育完成后，将菌液吹吸均匀，加入24孔板中，使用460nm LED灯(功率64.7mW)直照。将光照处理后的菌液移入的1.5ml灭菌EP管中，避光保存。
(3)点涂实验
培养皿表面用马克笔打上间距为5-10mm的横线和竖线，横竖线将会围成若干方格，按照浓度梯度从低到高为每列方格标注上数字。注意点涂菌液的位置不可靠培养皿边缘太近。同时固体培养基必须干燥，不能有水渍。
对经过光照杀菌处理的菌液进行等梯度稀释，每次稀释10倍，依次将菌液稀释到105、106、107。取1μl不同稀释梯度的菌液，点涂在对应方格中，等菌液被培养基完全吸收后，倒置培养皿，放入培养箱恒温培养15h后计数。
首先确定适宜光照强度范围。蓝光透过24孔板的光照强度可以通过控制光照时间来调控。在同样光敏剂浓度下筛选出：实验组与空白对照组对比，菌落数量减少效果显著、菌落数量有减少效果，菌落数量减少效果不明显的光照强度进行实验。
光照强度范围确定之后再确定适宜的竹红菌素浓度范围。在同样光照强度下筛选出：实验组与空白对照组对比，菌落数量减少效果显著、菌落数量有减少效果，菌落数量减少效果不明显的竹红菌素浓度进行实验。
(4)涂布活菌计数
通过平板计数的方法，得到竹红菌素对克洛诺杆菌在不同条件下的杀菌效果数据。首先对菌种进行光动力杀菌处理，再根据需要的浓度对菌液进行等梯度稀释。稀释完成后即可进行涂布实验。取50μl稀释菌液于固体培养基上，用充分灼烧且冷却后的涂布棒涂布均匀。静置15min，将平板倒置，于培养箱中37℃恒温培养15h后计数，根据菌落计数，计算杀菌效率。
实施例2 PI染色实验
PI染料可以穿过破损细胞或死细胞的细胞膜，并对其DNA染色使其产生红色荧光，但是它不能通过活细胞膜。通过荧光显微镜拍照观察红色荧光数量，可以定性判断光敏剂的杀菌效果同时也可以判断细胞膜的通透性。
将经过光动力杀菌处理后的对照组和实验组样品从24孔板中移入灭菌后的1.5mLEP管中，5000×g离心3min。弃上清，用1×PBS清洗，清洗三次后，加入997μL 0.9％的1×PBS和3μL PI染液，混匀，室温暗孵15-20min。孵育结束后，5000r/min离心3min，弃染液，用1×PBS清洗三次。洗净后立刻制片，通过荧光显微镜观察细菌存活率。为了避免荧光猝灭，若不能立即拍摄，可在菌液中添加一滴抗荧光猝灭剂。
实施例3电镜实验
为了观察经光照处理后阪崎肠杆菌的细胞膜形态和超微结构是否发生改变，利用扫描电子显微镜(SEM)进行检测。制备SEM样品，将经过光动力杀菌处理后的对照组和实验组样品从24孔板中移入灭菌后的1.5mL EP管中。样品8000×g离心3min，用1×PBS清洗三次，洗净后3000×g离心10min。弃上清，添加400μL鲜2.5％戊二醛，室温放置，固定1h，保存在4℃冰箱过夜固定。第二天，5000×g，4℃离心4min，弃上清，加无菌水静置10min后再次离心去上清，重复3次。清洗完成后，用50％、70％、80％、90％的乙醇进行梯度洗脱，每次洗脱后静放15min，去上清。梯度洗脱完成后，加入无水乙醇，室温放置30min后6000×g离心2min，去上清，重复步骤3次，最终即可得到固定好的电镜样品，放入无菌通风橱干中风干后即可待测。检测时，蘸取少量样品于样品台上，在喷金仪中喷金，使用扫描电镜检测观察并采集图像。

Claims (8)

1.一种利用竹红菌素作为光敏剂的光动力除菌技术的用途，其特征在于，该技术能够降低克洛诺杆菌的存活率。
2.一种如权利要求1所述的用途，其特征在于，该技术在光照强度为19.4或58.2 J/cm2、竹红菌素浓度为30 µM的条件下，能够显著降低克罗诺杆菌的存活率。
3.一种如权利要求2所述的用途，其特征在于，当光照强度为19.4J/cm 2、竹红菌素浓度为30μM时，抑菌率可达到57.4％。
4.一种如权利要求1所述的用途，其特征在于，当光照强度为58.2J/cm 2、竹红菌素浓度为30μM时，抑菌率可达到87.5％。
5.一种如权利要求4所述的用途，其特征在于，细菌的质膜通透性显著提高。
6.一种如权利要求5所述的用途，其特征在于，细菌的整体形态发生了显著改变，出现了明显的皱缩和不规则的形态。
7.一种如权利要求3所述的用途，其特征在于，在该处理条件下，克罗诺杆菌的cpxA基因的表达量出现了显著下调，鞭毛相关基因flgI，flic，flih也表现出显著下调。
8.一种如权利要求2所述的用途，其特征在于，当克罗诺杆菌的cpxA基因被敲除以后，突变菌在光动力处理条件下的存活率进一步下降。
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