JPH02203799A - エステラーゼの色原体基質及びそれを用いるイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素に関し、更に詳細には、エステラーゼに対
する基質及びアッセイにおけるその使用に関する。

（従来の技術） 迅速さ及び感度の良さの両方を備えた種々のアッセイシ
ステムが流体中の物質の濃度を測定するために開発され
てきた。イムノアッセイは抗原もしくはハゲテンが特＾
的抗体に結合することに依存しており、そしてそれらは
高い特異性及び優れた感度を提供できるので、大変有用
であった。これらのアッセイは上記の試薬の一つが標識
された状態で使用され、その欅識された試薬はしばしば
トレーサーと呼ばれている。イムノアッセイ法は溶液中
もしくは固体支持体上で実施され、結合したトレーサー
を遊離の（非結合の）トレーサーから分離する必要のあ
る異なる成分からなっていても、又は分離工程を必要と
しない均質成分からなっていても良い。

酵素はイムノアッセイにおいて標識として良く用いられ
る。慣用的な酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において、
酵素は特異的に結合する抗原−抗体対の一つの成分に共
有結合しており、そして得られた酵素結合物は基質と反
応して検出もしくは測定できる信号を提供する。その信
号は肉眼もしくはスペクトロフォトメーター法によって
検出できる色変化であっても良く、又は、蛍光によって
検出できる生成物への基質の変換であつても良い。

慣用的ＥＩＡは競合法もしくはサンドイツチ法のどちら
かによって５ｊ！施でき、それらはシエウルス（Ｓｃｈ
ｍｓｒｓ）らの米国特許第３．６５４．０９０号明細書
に開示されている。

他の状況において、酵素それ自身についてのアッセイが
示されるであろう、！ｌ！際、酵素アッセイは大きな病
院の実験室における全仕事の２５％を占めており、そし
て２０〜２５種類の酵素が日常的にアッセイされている
。これらの日常的アッセイの詳細な方法は臨床もしくは
診断化学のどのような標準的教科書中にも記載されてい
る。

酵素アッセイにおいて、例えば、血清、尿及び脳を髄液
のような体液中の酵素濃度が正常値範囲内であるか正常
値を越えているかが測定される。

あるアッセイにおいては、異常な酵素濃度は細菌もしく
はウィルス感染の結果であり、特定の酵素のアッセイは
特定の病原菌の診断となる。また他の場合には、血清の
ような体液中に正常時には存在しない酵素が検出される
ことは組織もしくは器官の損傷の指標となる。ＥＩＡに
よれば、酵素についてのアッセイは基質を検出もしくは
測定できる信号を提供する生成物に変換する酵素の触媒
作用に依存している。

エステラーゼ類はＥＩＡの標識として良く使用される。

−船釣に使用される基質はインドキシルエステル及びニ
トロフェノールのエステルである。

クラマー０：ｒｔ＋ｕｒ）らはＪｏｎｒ■ｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｌａ（ｉｃｘｌＣｈｃｍｉｓｌｒ７．２３５．１７
１５．　（１９６０）に２．６−ジクロロインドフェニ
ルアセテート、３’、５゛−ジクロロインドフェニルア
セテート及び３゛、５″−ジブロモインドフェニルブチ
レートがコリンエステラーゼによって加水分解されるが
、アセチルコリンエステラーゼには加水分解されないこ
とを開示している。その著者は″３°、５゛二置換基質
はアセチルコリンエステラーゼには加水分解されないこ
とは予期されなかった“と述べている。

クラマーらの米国特許第３．５１５，６４４号明細書は
コリンエステラーゼによる３　’、５　゛−ジクロロイ
ンドアエニルアセテートの加水分解の阻害に依存スるア
ンチコリンエステラーゼ化合物の検出法を開示している
。

バレンドスツ（Ｂｓｒｅｍｄｓｔ）はＩｎＬ＊ｒｌｌｉ
ｅｍ＊ｌ　Ｊｅｅｒｍｓｌ　ｏｆ　Ｅｍｖ＋ｒｏｍ禦ｔ
ｎｔ＊ｌ　Ａｌ１ｙｔ＋ｃ＊ｌ　Ｃｂｓｍ＋５ｌｒｙ、
　６゜１９（＋９７９）にブチリルコリンエステラーゼ
が２．６−ジクロロインドフェニルアセテートを加水分
解することを開示している。

チイウ（Ｃｂｉｕ）らはＬｉ１ｒ　Ｓｃｉ！ｎｃｅ、　
９．４６５（１９７０）に、クラマーらのデータとは反
対に、アセチルコリンエステラーゼが２．６−ジクロロ
インドフェニルアセテート及びブチレートの両方を加水
分解することを開示している。

どのような酵素アッセイに８いても、基質に関する主な
条件は酵素についての高い感度の検出法を提供すること
である。最も慣用的な色原体基質は最初無色であり、そ
して酵素による反応によって色を与える。理想的には、
基質は高い吸収係数（即ち、単位分解当たり濃い色）を
有している完全に可溶性の生成物を与えなければならな
い、また、基質は安価で、安全でそして使用し易くなけ
ればならない。

（発明の構成） 本発明の一つの態様はエステラーゼの色原体基質である
４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオキシフェニ
ル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−オン
、（３，５−ジクロロインドアェニルブチレート）であ
りこれ以降ＤＣＩＰＢという。

本発明の他の態様においては、基質をリガンドのイムノ
アッセイにおいて使用することができる。

好ましいアッセイは、抗リガンドが固体支持体に固定さ
れておりそしてリガンドもしくはｔａ２の抗リガンドの
どちらかと結合しているエステラーゼ、好ましくはカル
ボキシエステラーゼヲ含ムトレーサーと接触させられる
ようなＥＩＡである。抗リガンド、リガンド及びトレー
サーの結合後、固体相をＤＣＩＰＢと接触させる。ＤＣ
ＩＰＢはエステラーゼによって切断されて２．６−ジク
ロロインドフェノールになり、そしてその色が測定され
る。

本発明のイムノアッセイは、トレーサーの加水分解酵素
成分がブロックされた阻害剤からブロック基を除去して
アッセイ媒体中に）ＫＬ　ニー　”　’剤を放出するよ
うな２酵素アツセイとして実現される。

リガンド濃度に比例する遊離の阻害剤はエステラーゼに
よるＤＣＩ　ＰＢの２．６−ジクロロインドフェノール
への変換を阻害する。

本発明の他の態様は液体中に存在すると推定される加水
分解酵素（本発明のこの態様においては未知酵素と呼ば
れる）アッセイである。加水分解酵素は上記に述べられ
た２酵素アツセイ、即ち加水分解酵素がブロックされた
阻害剤からブロック基を除去し、そして生じた阻害剤が
エステラーゼによるＤＣＩ　ＰＢから２．６−ジクロロ
インドフェノールへの変換を阻害するアッセイによって
アッセイされる。

本発明の第３の態様はリガンドもしくは酵素のアッセイ
を実施するためのＤＣＩＰＢを含む物質のキットである
。

従って、本発明は、インドキシルのエステルのような従
来の他の基質に比べて非常に安定なエステラーゼ、好ま
しくはカルボキシエステラーゼの基質を提供する。その
基質及びエステラーゼの反応による生成物、２．６−ジ
クロロインドフェノールは水溶液中で可溶であり、濃い
青色で６２０ｎｍに吸収極大、及び比較的高い消衰係数
［（ｍｌ　、８　Ｘ　１０　’ｍ−’ｃ　ｍ−’）を有
している。これらの性質はそれを肝臓エステラーゼの検
出、加水分解酵素のアッセイもしくはリガンドのＥＩＡ
のどちらにおいても他の基質に比べて優れたものにして
いる。

ここで図面について簡単に説明する。

第１図は、本発明の基質を用いた抗原の典型的サンドイ
ッチアッセイの結果を表している。

第２図は、本発明の基質を用いた抗原の２酵素アツセイ
の結果を表している。

第３図は、本発明の基質を用いた加水分解酵素の２酵素
アツセイの結果を表している。

本発明は多くの異なった形の実施態様によって実現され
るが、本開示は本発明の原理の例示と考えられるべきで
ありそして本発明をここに述べられた実Ｘ態様に限定す
る意図ではないという理解の下に、本発明の詳細な好ま
しい実ｉｓ様を述べる。本発明の範囲は特許請求の範囲
及びその均等物によって判断されるべきである。

本発明の色原体基質、ＤＣＩ　ＰＢは寅！ｆｖｌの７４
に従って２．６−ジクロロインドフェノールから調製さ
れる。

酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サ
ンドインチ法もしくは競合法のどちらでも酵素としてカ
ルボキシエステラーゼ及び酵素基質としてＤＣＩＰＢを
用いて行うことができる。

別法として、２もしくはそれ以上の連続的酵素反応がア
ッセイ信号を増幅するｌ；めに行われ、最終酵素反応は
カルボキシエステラーゼによるＤＣＩＰＢから２．６−
’；クロロインドフェノールへの変換の触媒作用である
ような２酵素アツセイがある。２酵素構成の場合、アッ
セイ感度はカルボキシエステラーゼの特定のブロックさ
れた阻害剤をアッセイ媒体中に含めることによって増強
される。

免疫学的反応が未知サンプル中のリガンドの検出のため
の本発明の方法で使用される。ここで使用される“免疫
学的反応“という用語は抗原と抗体、ハプテンと抗体、
又はどのような抗原の適当な類似体、抗体、又は特異的
に結合するハプテンの特異的結合反応を意味している。

免疫学的反応はどのような適当な液体中でも行うことが
できる。例えば、その液体は、血清、尾、脳を髄液又は
胸水等のようなリガンドを含むと推定される体液であっ
ても良い、別法として、その液体は水、生理食塙水もし
くは適当な緩衝液、又は体液及びリガンド含んでいると
推定されるサンプルを添加された他の液体の混合物であ
っても良い。

本発明の好ましい実施態様において、ｌもしくはそれ以
上のアッセイ成分は固体支持体の表面に固定されても良
い。この分野では良く知られているように、固体支持体
はアッセイに影響を支質的に及ぼさないどのような支持
体でありでも良い。

使用できる固体支持体の例示としてはガラス及びポリエ
チレン、ポリ７ツ化ビニリデン及びポリスチレン等の重
合体物質である。そのような支持体は、シート状、チュ
ーブ状、ウェル、膜又はマイクロタイタープレートのよ
うなプレート状の適当などのような形状にも製造するこ
とができる０例えば、アッセイ成分は、チューブ、好ま
しくは閉じた一端を有するプラスチックチューブもしく
はマイクロタイタープレートのウェルの内壁及び底部ｊ
；、又はナイロンもしくはニトロセルロース膜のような
膜に固定される。好ましくは、所望の量の抗リガンドを
固体支持体に固定した後、支持体上の残っている結−ｆ
！ｒ部位を不活性蛋白質で満たしても良い。不活性蛋白
質は、例えば、オブアルブミンのように支持体に付着で
き且つ下記に述べるようにリガンド、抗リガンド及びト
レーサーの間の特異的結合反応にどのような方法によっ
ても影響を与えないどのような蛋白質でも良い。

好ましくは、固体支持体に固定された抗リガンドをリガ
ンド及びトレーサーとインキュベーションして両方を固
体支持体に結合させる。影響を及ぼす物質を除去するた
めの洗浄工程の後、残りのアッセイ成分を添加して、そ
してアッセイを下記に述べるように完了させる。

リガンドはどのような起源であっても良く、抗原、抗体
又はハプテンであっても良い。例えば、リガンドは体液
中に存在する抗原であっても良く、又は体液中から単離
されて後緩衝液のような異なった液体に導入されたもの
であっても良い。その他の場合、リガンドは体液以外の
起源、例えば、微生物の培養物又はその細胞抽出物であ
っても良い。

好ましいリガンドは抗原であり、最も好ましくは体液中
に存在するウィルス抗原、例えば単純ヘルペスウィルス
（Ｈ５Ｖ）、アデノウィルス、インフルエンザＡウィル
ス、バラインフルエンザ３ウイルス及び呼吸シンシチア
ルウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｍｃｙｔｉｓ
ｌ　ｗｉｒｅｓ）がある。

抗リガンドを液体中でリガンドと接触させて免疫学的反
応を訴導する。抗リガンドは抗原であっても又はモノク
ロナールもしくはポリクロナールのどちらの抗体であっ
ても良く、又はリガンドと特異的に反応するそれらの適
切などのような類似体であっても良い。更に、抗リガン
ドは複数の結合抗体、例えば、第１の抗体１こ特異的に
結合したｍ２の抗体からなる抗体複合体であっても良い
。

別法として、リガンドは数種の異なり！；抗リガンド、
例えば、リガンドの異なった表面区域に同時に結合する
数種のモノクロナール抗体分子の混合物又はポリクロナ
ール抗体の集合物に結合しても良い。−船釣に、第２の
抗体は異なった種において第１の抗体に対して作製され
る。複合体における複数の結合抗体は約２個ないし１０
個もしくはそれ以上の抗体を含んでいる。本発明のサン
ドイッチ法において、本質的に全てのリガンドに結合す
るために十分な結合部位を有している過剰の抗リガンド
を使用することが好ましい。

本発明のＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて、トレーサーの酵素部
分はリガンドに結合した（Ｕ合アッセイ）又は抗リガン
ドに結合した（サンドイッチアッセイ）カルボキシエス
テラーゼであっても良い、もし、アッセイが２酵素アツ
セイである場合、トレーサーは下記に述べられるリガン
ドに（ｌ！１合アライ）もしくは抗リガンド（サンドイ
ッチアッセイ）に結合した第１の酵素及び第２の酵素と
して働くカルボキシエステラーゼからなる。リガンドも
しくは抗リガンドへの酵素の結合は好ましくは共有結合
であり、そして免疫学的反応に先立って行われる。酵素
のリガンドもしくは抗リガンドへの共有結合は慣用的で
あり、当業者には良く知られている。

２酵素アツセイにおける第１の酵素はブロックされた阻
害剤からブロック基を取り除く、適当な第１の酵素はホ
スファターゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ及びグリコ
シダーゼ等の一般的加水分解酵素である。制限的ではな
い禦１の酵素の例示としては、トリプシン、トロンビン
、ホ乳類肝臓エステラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、又は最も好ましくはアルカ
リホスファターゼがある。

リガンド、抗リガンド及びトレーサーを含んでいる液体
は、もし必要ならば結合を誘導するためにインキュベー
ジＢンされる。インキエベーシ叢ンは結合を容易にする
どのような温度及び時間でも行うことができるが、好ま
しくは約２０℃ないし４０℃で約１分間ないし４時間で
ある。結合している抗リガンド、リガンド及びトレーサ
ーはこれ以降結合画分という、結合していない抗リガン
ド、リガンド及びトレーサーはこれ以降遊離画分という
。アッセイは結合画分及び遊離画分の間に平衡が達成さ
れること、但し必ずしも必要ではない、によって実施さ
れても良い。

結合画分はアッセイ混合物液体相中の液体画分から濾過
、デカンテーシ履ン、遠心分離、吸引等のどのような慣
用的方法によっても分離できる。

免疫学的反応が固体支持体上で行われたとき、液体相は
簡単にデカンテーシβンでき、そして固体支持体を洗浄
して遊離画分及びアッセイに影響を与える物質の除去を
確実にして、そして水、生理食塩水もしくは緩衝液のよ
うな適当な液体中に再懸濁する。そして次に、ブロック
された阻害剤を添加して、下記に述べるように、ｐＨを
ブロック基の非酵素的除去を引き起こさない値、好まし
くは６〜８に調整する。

ブロックされた阻害剤は第１の酵素によって変換されて
カルボキシエステラーゼの阻害剤となるどのような物質
であっても良い、好ましいブロックされた阻害剤は２つ
の成分、阻害剤及びブロック基を含んでいる。最も好ま
しいブロックされた阻害剤はそのブロック基が第１の酵
素によって除去されそして阻害剤がアッセイ媒体中に放
出されるまでカルボキシエステラーゼに対して非反応性
であるブロックされた阻害剤である。ブロック基は好ま
しくは第１の酵素によって実質的に選択的に切断される
結合によって阻害剤に結合しているものであり、そして
その阻害剤成分は好ましくは実質的に第１の酵素に影響
を与えずにカルボキシエステラーゼの活性を阻害するべ
きである。

カルボキシエステラーゼは本発明のＥＬ　Ｉ　ＳＡにお
ける好ましい酵素であり、且つ本発明の２酵素アツセイ
における好ましい酵素である０本発明はどのような起源
からのカルボキシエステラーゼも考慮しているが、肝臓
のカルボキシエステラーゼを使用することが好ましく、
更に好ましくはブタ肝臓カルボキシエステラーゼのよう
なホ乳類の肝臓カルボキシエステラーゼであり、最も好
ましくはウサギの肝臓カルボキシエステラーゼ、ＲＬＥ
である。

上記に述べたようｊ；、トレーサーの加水分解酵素成分
はブロック基をブロックされた阻害剤から切断して、カ
ルボキシエステラーゼの阻害剤を提供する。適当な阻害
剤及びブロックされた酵素阻害剤は下記の一般式Ｉ： （式中、Ｒｓは（ＣＨ＊）　４８　Ｈｚ、（式中、Ｂ基
の性質は、後で述べるようにこの化合物が阻害剤である
かブロックされた阻害剤であるかを決定する。）で示さ
れる。

一般式ｌにおいて、Ｒ１はＨ１炭素原子数１〜６個の分
岐した若しくは直鎖の低級アルキル、ニトロ、アルコキ
シ、ハロゲンおよびその類似体であり；ＸはＯ％Ｓ％Ｎ
Ｒ，であり、但しＲ１はＨまｔ；は炭素原子数１−６個
の低級アルキルであり；ｎは１〜６であり；ＡはＦまた
はＣＦ！であり；およびＢはＨｌ　リン酸もしくはリン
酸塩、グリコジル基、アミノ酸のカルボキシル基を介し
てＸに共有結合しているリジンもしくはアルギニン残基
のようなアミノ酸基、アセチルもしくはブチリル基のよ
うな炭素原子数２〜４ｍのアシル基、または下記の一般
式■： （ＣＨり３Ｎ　Ｈ−Ｃ ＼ ＮＨ！ またはベンジルであり；Ｒ１はＨ１分岐したもしくは直
鎖の炭素原子数１〜４個の低級アルキルもしくはヒドロ
キシ−低級アルキル、ｃＨ＊ｃｏ。

Ｈまたは（ＣＨｘ）ＩＣＯＯＨであり；Ｒ１は炭素原子
数１〜４個の分岐したもしくは直鎖の低級アルキルもし
くは低級アルコキシ、フェニール、またはベンジルオキ
シであり；およびｑはθ〜１０である）で表されるペプ
チドである。

ＢがＨの場合、一般式ｌは酵素阻害剤を表している。Ｂ
がＨ以外の他の基である場合、一般式Ｉはブロックされ
た酵素阻害剤を表している。Ｂがリン酸もしくはその塩
である場合、Ｂは下記の一般式■： （式中、ＰはＸと結合し、ｎは上記に述べたようである
）であることを意味している。

一般式ｌに示された阻害剤およびブロックされた阻害剤
は当業者の通常の知識の範囲内で一般的化学反応を組み
合わせて合皮することができる。

適当な、−船釣方法を下記の実施例に示した。次に示し
た有効な酵素阻害剤の表は例示のためにのみ示されたも
のである。

］　、　１，１．１−トリフルオロート（喀−ヒドロキ
シフェニル）プロパノン ＮＭＲデータ；（ＣｔｌＣ１υ−３，９１（ｓ、　２１
１）、　５．２１（ｂｓ、　ｌ１ｌ）、　６．９０（！
、　２１［）、　７．１０（ｄ、　２Ｈ）Ｋｉ（Ｍ）お
よびエステラーゼ；　ＣＯＸ　ｌ１ｌ−’ＬＥ ２、１，１．１−トリフルオロート（３−ヒドロキシ７
二二ル）−２−プロパノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣ１３）　−４，００（ｓ、　２
Ｈ）、　４．８０（ｂｓ、　ＩＢ）、　６．１０（ｍ、
　３１１）、　７．３０（＋ａ、　Ｉｎ）Ｋｉ（Ｍ）お
よびエステラーゼ：＞１０’″’、ＰＬ３、１，１．１
−トリフルオロート（４−ヒドロキシフェニル）−２−
ブタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣＩ））　−ＬＨ（ｍ、　４Ｈ）
、　４．ｌｏ（ｂｓ、　ＩＨ）、　！、Ｈ（ｄｄ、　４
ＩＩ）Ｊｉ、６０！１ｔＫｉ（Ｍ）およびエステラーゼ
；　ＣＯＸ　ｔＧ−’ＬＥ ４　、１，１．１−トリフルオロ−４−（トヒドロキシ
フェニル）−２−ブタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣ１３）　−Ｃ９４（１，２１１
）、　３．０５（ｔ、　　２ｉｌ）、　　５．７０（ｂ
ｓ、　　Ｉｎ）、　　６．１０（＋ａ、　　３１１）、
　　１．１５（鳳、　　Ｉｎ） Ｋｉ（Ｍ）およびエステラーゼ；　１．ｏｘ　１（１−
ｔＬＥ ５、１，１．１−トリフルオロ−５−（４−ヒドロキシ
７エ二ル）−２−ペンタノン ＮＭＲデータ：（ＣＤＣＩ３）　−１，９１（ｔ、　２
Ｈ）、　１５！（ｔ、　　２Ｈ）、　　２．６Ｋ（１，
２８）、　　５．２３（ｂｓ、　　Ｉｎ）、　　６．９
５（１，２Ｈ）、　　フ、ｕ（ａ、　　２Ｂ）Ｋｉ（Ｍ
）およびエステラーゼ；１．ＯＸｌじ魯ＬＥ ６、１，１．１−トリフルオロ−５−（３−ヒドロキシ
フェニル）−１−ペンタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣＩコ）−１，５５（Ｐ、　２Ｂ
）、　１７０Ｃｔ、　　２１１）、　　ｌｊ５（１，２
１１）、　　５．４０（ｂｓ、　　１Ｂ）、　Ｇ、１０
（騰、　コＩＩ）、　　７．３０（ｍ、　　ＩＩＩ）Ｋ
ｉ（Ｍ）およびエステラーゼ；　１．７Ｘ　ＩｌｌすＲ
ＬＥ ？、　１，１．１−トリフルオロー６−（トヒドロキシ
７工二ル）−２−ヘキサノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣｌ２）　−１，Ｈ（軌４１１）
、　１５り（ｑ、　２Ｂ）、　２．ｔＯ（ｑ、　２！ｌ
）、　５．５５（ｔ＋ｓ、　ＩＨ）、　６ＡＴ（ｄ、　
　Ｉｌり、　　）、ｏｔ（ｄ、　　２ｉ＋）Ｋ　ｉ　（
Ｍ　）８　ヨびエステラーゼ：　Ｌ（ＩＸ　Ｉｌｌ−”
ＲＬＥ ８　、１，１．ｌｊ、！−ペンタフルオロー５−（４−
ヒドロキシフェニル）−トペンタノン ＮＭＲデータ；（ＣＤＣｌ２）　−２，５４（鳳、　２
１１）、　３．１１４（ｓ＋、　［）、　４．７５（ｂ
ｓ、　ＩＩＩ）、　！、！Ｄ（ｄ、　２Ｂ）、　？、ｌ
０（ａ、　！Ｂ） Ｋｉ（Ｍ）およびエステラーゼ；　１．ＯＸ　ｌ１ｌ−
’ＬＥ 上記表中、ＰＬＥはブタ肝臓エステラーゼ（Ｅ　、Ｃ。

３．１．１．ｌ）；　ＲＬＥはウサギ肝臓エステラーゼ
（Ｅ、Ｃ，３，１，１，１）である・前に述べたように
、本発明の他の！ｌ！ｔｌＦＡ１ｒ！Ａ様はトレーサー
が第１の酵素に結合した予め決められた量のリガンドで
あるような競合アッセイである。

競合アッセイにおいて、使用した抗リガンドの量はアッ
セイ中に存在する全てのリガンド及びトレーサーと結合
するには不足しているので、リガンド及びトレーサーは
抗リガンドの結合部位の限られた数について競合する。

従って、競合アッセイにおいて、抗リガンドに結合する
リガンド及びトレーサーの量（結合画分）はアッセイ液
体中のそれらの濃度に対して反比例する。

もし、更に信号増幅が必要ならば、アッセイ媒体中の複
数の試薬が順番に反応して最終的なブロックされた阻害
剤のブロック除去を導くような多段階カスケード増幅を
行うことができる０本発明のこの実施態様について述べ
るならば、前述された第１の酵素を、アッセイ媒体中の
試薬を前述の第２酵素に対するブロックされた阻害剤の
ブロックを解除する二次酵素に酵素化学的に変換する一
次酵素と考えると良い、更に、二次酵素、またはそれに
統〈酵素は追加の試薬と反応してブロックされた阻害剤
のブロックが取り除かれるまで酵素反応のカスケードを
統ける追加の酵素を提供する。

アッセイ媒体中に添加される試薬の適当な選択によって
、所望の数の増幅段階を実行することができる。

本発明の範囲内に入る殆ど無数の競合及びサンドイッチ
アッセイ態様を考えることができることは明らかである
。更に、本発明はリガンドの検出及びリガンド濃度の測
定のどちらかに適当な態様のアッセイも提供できる。リ
ガンド濃度は未知サンプルによって生じた信号の大きさ
を本質的に同一の条件下のアッセイにおいである範囲の
既知量のリガンドにつし１てアッセイで測定された信号
の大きさと比較することによって測定できる。本発明の
方法をリガンド濃度の測定に使用する場合、信号強度を
適当な装置、例えばベックマンＤＵ７スペクトロフオト
メーター（ベックマン・インスツルメント社、イルビン
、カリフォルニア）のようなスペクトロフォトメーター
で読み取るとことができる利点がある。

本発明の別の態様において、上記のブロックされた阻害
剤を含む２酵素アツセイは流体中に存在すると推定され
る未知酵素の測定にも使用することができる。本発明の
この実施態様において、未知酵素は上記の２酵累アツセ
イにおけるトレーサーの第１の酵素成分に対応する。従
って、ブロックされた阻害剤からプロツク基を除去する
ことのでさるどのような未知酵素も測定することができ
る。好ましい未知酵素は上記に述べたように加水分解酵
素である。従って、未知酵素についてのアッセイにおけ
る全ての工程及び試薬はアッセイがリガンド、抗リガン
ド及び免疫学的反応を含んでいないことを除いて上述の
２酵素アツセイと同一である。

本発明の他の態様は本発明の方法に従ってリガンドもし
くは酵素についてアッセイを行うための物質のパッケー
ジまたは試薬キットである。キットは固体支持体に固定
された抗リガンド、エステラーゼ、好ましくはカルボキ
シエステラーゼ、及びＤＣＩ　ＰＢを含んでいても良い
、キットの一つの態様としては、エステラーゼが第２の
抗リガンドに結合されていても良い、キットの第２の態
様としては、キットはエステラーゼのブロックされた阻
害剤及び第２の抗リガンドに結合されていている加水分
解酵素を含んでいる。キットはリガンドについての標準
、例えば予め定められた濃度の１もしくは１以上のリガ
ンドサンプルを含んでいても良く、またはアッセイの実
施に有益な他の試薬、酵素基質、又は他の標識されたも
しくはｌＩ議されていない特異的リガンド、抗リガンド
又はそれらの複合体を含んでいても良い、生理食塩水ま
たは緩衝液のような溶液を含んでいても良い、キットの
構成要素は別々の容器、例えばバイアルのような容器で
供給しても良く、また、２もしくはそれ以上の構成要素
を一つの容器中で混合して供給しても良い。

実施例における共通の方法 一般的分析技術−フラッシュ（Ｎｓｓｋ）シリカゲルク
ロマトグラフィーをＩＣＮシリカゲル３２〜６３メツシ
ユで３〜７　ｐｓｉ、で行った０分析ＴＬＣはＥＭサイ
エ〉テイフイク社製のアルミニウム板上の０．２５ｍｍ
、５Ｘ２０ｃｍのシリカゲルプレートで行った。調製Ｔ
ＬＣはＥＭサイエンテイフィク社製のガラス板上の２．
０ｍｍ、２０Ｘ２０ｃｍのシリカゲルプレートで行った
。融点はトーマス拳ホーバー（丁ｂａｓｓｓ　Ｂｏｏマ
ｔｒ）キャピラリー融点装置で行った、そして補正はし
なかった。ＮＭＲスペクトルはＩＢＭ　　ＷＰ−２００
ＳＹスペクトロフオトメーターに記録し、そして化学シ
フトはトリメチルシランに対する相対ｐｐｍで記載した
。ＨＰ　Ｌ　Ｃ１１Ｕ　Ｖ検出を有するウオターズ５１
０．２ポンプシステムでブラウンレー（Ｂｒｏｖｎｌｅ
ｅ）ＡＸ３００　７ｘ２５０ｍｍカラム上の２つの溶媒
系の一つを用いて行った；システムＡ）では最初に３０
ｍＭ　　ＮＨａＯＡｃ、ｐＨ６，５で５分間保持し、次
に３０分間で２．０Ｍ　　ＮＨ，ＯＡｃへの直線勾配を
行い、更に５分間１．０Ｍ　　ＮＨ，ＯＡｃで保持した
；システムＢ）では３０ｍＭＮＨ４０ＡＣ％ｐＨ６，５
のインクラチック（ｉｓｅｅｒｓｌｉｅ）ｆｉ衝系を４
０分間使用した。流速は１．ｏｍ！／分であった。ガス
クロマトグラフィーはＪ＆Ｗサイエンティフイク社から
購入できる３０Ｍ　　ＤＢ−１メガボレ（ＭＢ＊ｂｏｒ
ｃ）カラムを使用してＦＩＤおよび自動インジェクター
を装備したＨ、Ｐ、５８４０Ａガスクロマトグラフイー
で行った。ＧＣ条件は下記のようであった；１００℃で
３分間保持し、次にｌＯ℃／分の勾配で２５０℃にして
、更に１６．０ｍｍ　７分の流速で２５０℃で３分間保
持した。

阻害定数をｐＨ８，０の５０ｍＭトリス中で測定した。

酵素および阻害剤を周囲温度で２０分間インキュベーシ
ョンした。そして、酵素に対する基質を添加して、加水
分解の速度をスペクトロフォトメーターで測定した。Ｐ
ＬＥおよびＲＬＥに対する基質はＯ−ニトロフェニル−
ブチレート、およびＡＣｈＥｊ二対してはアセチルチオ
コリンおよびエルマン（Ｈ１ｍ＊ｎ’ｓ）試薬であった
。

次の実施例は本発明を更に説明するために提供されるが
、いかなる場合も本発明を制限するものと考えるべきで
はない。

実施例１ ４−［（ＬＳ−ジクロロ−４−ブチリルオキシフェニル
）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−！−オン（
ＤＣＩＰＢ）の調製 ｉの丸底フラスコにアセトニトリル７５０ｍ１　及１／
Ｌ６−ジクロロインドフェノール（ナトリウム塩、水和
物）　３０．０　ｇ　（０，１０３簡ａｔ）を入れた。

無水酪酸（２５ｍＱ１０．１５３簡ａｔ）をピッ９フ１
０ リル１０ｍｆｆ１と添加漏斗中で混合しｔ；。この混合
物を良く撹拌された反応混合物中に１時間以上をかけて
滴下した。撹拌は更に１６時間、周囲温度で続けられ、
そして反応混合物を減圧下のロータリーエバポレーター
で濃縮した。得られたシロップを酢酸エチル５　０　０
　ｍｌ！　テ希釈し、ＩＮａ！ｒｔｉ２５０ｍ１及び飽
和炭酸水素ナトリウム２００ｍ１で洗浄し、そして無水
硫酸マグネシウムで乾燥した。粗生成物をロータリーエ
バポレーターでシロップになるまで濃縮した。無水酪酸
との反応は２つの反応性フェノラート中心のどちらかと
起こるｔ；めに、その粗製物質中には異性体が存在して
いた。

これらの異性体を酢酸エチル／ヘキサン（１５７８５）
中のシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーによっ
て分離した。その両分の精製度を酢酸エチル／ヘキサン
（２０７８０）中のＴＬＣによって評価した。所望の化
合物はＲｆｆ１ｌｏ、３２であり、その他の異性体は０
．３８であった。望ましくない異性体が混入した両分を
再びクロマトグラフィーにかけた。プールされた生成物
は６４％の収率（２２，２ｇ）で得られた。　ＮＭＲ（
ＣＤＣｌ　　３）　　：　　１．６９（１，３Ｂ）、　
　１．Ｈ（鳳、　　ＩＩＩ）、　　！、＄７（亀。

２Ｂ）、　ＬＨ（■、　２Ｂ）、　ＬｔＯ（ｓ、　２Ｂ
）、　７．０７（纏、　ＩＩ）。

７．２５（ｄ、　ＩＩＩ） 実施例２ ジアンモニウム［４−（３−オキソ−４，４，４−）リ
アルオロブチル）フェニルコリン酸 Ａ、エチルト（４−メトキシベンジル）−トオキソ−４
゜４．４−　）リフルオロブタノエートの調製還流コン
デンサー、滴下漏斗、アルゴン入口、およびマグネット
撹拌を備えたｌリッターの４つ首の丸底フラスコに水素
化ナトリウムの５０％（Ｗ／Ｖ）油分散液７．１７　ｇ
　（０，１４９Ｍ）　８よび無水エチルエーテル３００
ｍｆｆ１を入れた。その溶液を撹拌しながら無水エタノ
ール（９ｍｌ）をゆっくりと添加した。水素の発生が停
止して後、エチル４，４．４−トリフルオロアセトアセ
テ−）　２５　ｇ（０，１３６モル）およびトメトキシ
ペンジルクロリド２１．３ｇ（０，１３６モル）の混合
物を１時間をかけて添加した０次に、その混合物を一晩
還流し、冷却し、水、ｌＮｍｍで抽出し、無水Ｍｇ５Ｏ
１で乾燥し、そして溶媒をロータリーエバポレーターで
減圧下で除去した。粗反応混合物３３゜５ｇを６０Ｘ３
００ｍｍシリカゲルカラムで酢酸エチル／ヘキサン（２
５／７　Ｓ’）の混合物を用いるクロマトグラフィーに
かけた。同じ画分を集めて、所望の（分光分析的に複合
体）生成物９．４ｇ（２３％）を油状物として得た。Ｎ
　Ｍ　Ｒ（ＣＤＣｌ２）：　　１．２６（ｍ、　　３Ｂ
）、　　３．７７（ｓ、　　３１１）、　　４．Ｈ（ｍ
、　　ｆｉｌ）、　　７．１１Ｓ（−１２Ｂ） Ｂ、　！、１．１−トリフルオロー４−（４−ヒドロキ
シ７エ二ル）−ブタン−２−オンの調製 還流コンデンサー、アルゴン入口、およびマグネット撹
拌を備えた１００ｍ１の丸底フラスコにエチル２−（４
−メトキシベンジル）−トオキソー４．４．４−トリフ
ルオロブタノエート（１）２．０５ｇ　（６，７１ａｉ
ｌ）　、３１％（ｗ／ｖ）ＨＢｒの酢酸溶液２０ｍＡ、
および水１０ｍ１！を入れた。この混合物を一晩１２０
°Ｃで加熱し、冷却し、減圧下で濃縮し、そしてジクロ
ロメタンおよび水で分配した。有機層を水性重亜硫酸塩
、及び炭酸水素ナトリウム塩飽和液で順番に抽出し、そ
して無水硫酸マグネシウムで乾燥した。そして溶媒を減
圧下で除去した。

相反２１混合物は５０ｘ３００ｍｍシリカゲルカラムで
酢酸エチル／′ヘキサン（５０１５０）の混合物を用い
てクロマトグラフィーを行った。同じ画分を集めて、溶
媒を減圧下で除去して生成物６゜Ｏｍｇ　（４１％）を
透明な油状物として得た。ＮＭＲデータ；（ＣＤＣｌ２
）　：　ｌ！Ｓ（＊、　４１１）、　５．４１１（ｂｓ
、　ＩＢ）、　６．９３（ｄｄ、　４！１）Ｊｉ、！０
ＨＸＣ，ジエチル〔ト（３−オキソ−４，４，４−トリ
フルオロブチル）フェニル］ホスフェートの調製アルゴ
ン入口およびマグネット撹拌を備えｔ；ｌＯｍｊの丸底
フラスコに１．１．１４リフルオロ−４−［（−ヒトミ
キンフェニル）ブタン−２−オン４００　ｍ　ｇ（１，
８ｍＭ）、ジエチルクロロホスフェート４００　ｍ　ｇ
　（２、３ｍ　Ｍ　）　、無水ピリジンＯ，１５ｍｆｌ
およびジクロロメタン５ｍｆｌを入れた。この混合物を
一晩周囲温度で撹拌し、塩酸ピリジニウムをａ過で除去
し、０．２ＮＨＣ１で抽出し、水で抽出し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した。そして溶媒を減圧下で除去して
、粗生成物５００ｍｇを茶色の油状物としてｔ！ｔだ。

酢酸エチル／ヘキサン（５Ｑ１５　Ｑ）　を用いたＸ製
ＴＬＣ７：よって透明な油状物２００ｍｇ（３１％）を
得ｆ−，ＮＭＲＣＣＤＣ１ｉ）　　：　　ｉ，５ｏ（ｍ
、　６Ｂ：！、　３．０（＋＋！、４Ｂ）、　４．２０
（ぬ、４■）、７．１５（ｓ、４Ｂ） Ｄ、ジアンモニウムＬト（トオキソー４，４．４−トリ
フルオロブチル）フェニルｊホスフェートノ調製アルゴ
ン入口およびマグネット撹拌を備えた２５ｍ１の一つ首
丸底７ラスフにジクロロメタン５．０ｍｇ、ジエチル【
ト０−オキソー４，４．４−トリフルオロブチル）フェ
ニル〕ホスフェ−）　（Ｉ［［）　１４０ｍｇ　（０，
４ｍＭ）８よびブロモトリメチルシラン２　、Ｏｍｌを
入れた。この混合物を３時間周囲温度で撹拌して後、メ
タノールｌｏｍｌを添加して、そして揮発性物質を減圧
下で線表した。残渣を水に溶解し、モしてｐＨを７．０
に１．ＯＮ水酸化ナトリウムで調整した。その水性溶液
をジエチルエーテルで抽出し、そして凍結乾燥して白い
固体１９０ｍｇを得た。この物質を１０ｍ１の水に溶解
し、モしてアニオン交換ＨＰＬＣによって精製した。勾
配条件は：最初に２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６，
５で５分間保持し：次に２０分間以上で１．ＯＭＩＨｍ
アンモニウム濃度まで直線的に上げ：そして１．０Ｍ酢
酸アンモニウム中に１５分間保持した。流速２．５ｍｌ
／分で、生成物は約３２分に溶出した。カラム容量は２
０ｍｇであった。数回のＨＰＬＣ操作からの生成物をプ
ールし、凍結乾燥して５０ｍｇ（３７％）の生成物を得
た。融点ｍｐは２３５〜２４０℃、ＮＭＲ（ＤｘＯ）：
　　１．ｔｏ（ｍ、　　２Ｈ＞、　　１５６（ｍ、　　
２１１）、　　４．４５（ｉ。

！１０１１）、　１ｌｌ（ｄａ、　４１１）Ｊ・ＬＨｆ
ｌｔ寅施例３ アデノウィルスのサンドイッチＥＬ　Ｉ　ＳＡ抗体の調
製： アデノウィルスに対するモノクロナール抗体を慣用的方
法によって、精製ヘキソン蛋白質で免疫されたＢａ１ｂ
／ｃマウスから得た。

抗体−ブタ肝臓カルボキシエステラーゼ結合体の調製： 商業的に利用できるブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）（
シグマ・ケミカル・コ（Ｓｉ（ｔｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏ。

））をリン酸緩衝生理食塩水、Ｉ）　Ｈ７，６に対して
完全に透析した。この物質を“２工程”グルタルアルデ
ヒド法を用いて抗−アデノウィルスモノクロナール抗体
に結合した：ｐＨ７，２の５０ｍＭリン酸８００ｍ１中
のＰＬＥ２．０ｍｇを２０℃で０．１６％グルタルアル
デヒドで５０分間活性化した。これに抗体１．６ｍｇを
添加して最終体積を１．０６ｒｎｌにした。室温で７５
分間のインキュベージ１ンの後、結合物をサイズ排除ク
ロマトグラフィーで単離した。

免疫学的サンドイッチの構築： ポリスチレンマイクロウユル（ヌンク（Ｎａｍｅ）、デ
ンマーク）をｐＨ９，５の１０ｍＭ＃、ｌｔ！水素ナト
リウム中にｍ１当たり２５ｐｇの抗−アデノウィルスモ
ノクロナール抗体を含んでいる溶液を各ウェル当たり２
００μｇで１時間、３７℃で被覆した。インキュページ
５ンに続いて、プレートをウェル当たり２００μｉのト
リス緩衝生理食塩水（１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７
，５（ＴＢＳ））で２回洗浄した。ウェル当たり１５０
μｌの用量で、超音波分散されたアデノウィルスに感染
したＨｅＬａｍ！Ｐｌ懸濁液（抗Ｍ）を３倍毎の一連の
希釈物としてプレートに入れＩ；、同様の操作を非感染
（対照）細胞について行った。抗原の希釈液は０，２％
カゼイン及び０．０５％ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレー）　（７１１１ＥＥＮ−２１１）を含んで
いるＴＢＳである。そのプレートを再び３７℃で１時間
インキュベーションし、゛そして０゜２％カゼインを含
むＴＢＳで２回洗浄した。抗−アデノウイルス°抗体−
ブタ肝臓エステラーゼ結合物を各ウェルｊ二ｍ１当たり
約２０μｇの濃度で添加した（ウェル当たり１５０μｍ
）。再度、プレートを３７℃で１時間インキュベーショ
ンして、モしてウェル２００μ直のＴＢＳ−カゼイン緩
衝液で３回洗浄した。

信号の発生二 基質、ＤＣＩ　ＰＢをｐＨ９，０の５０ｍＭジェタノー
ルアミン１部と５０　ｒｎ　Ｍ　トリス、ｐ）ｉ７゜５
．２０％メタノール１部の混合物からなる溶液中でＯ，
１８ｍＭの濃度で調製した。この溶液を最終容量３００
μｔとなるように各ウェルに添加して、室温で５分間イ
ンキュベーションした。１ｍ　Ｍ　１　、　Ｉ　、　ｌ
−トリフルオロアセトフェノンのｐＨ７゜５の５０ｍＭ
トリス溶液を各ウェル当たり５０μ直を添加して、酵素
活性を停止した。各ウェルの光学的濃度を６２０ｎｍで
測定した。結果を第１図に示した。

実施例４ インフルエンザＡの２酵素アツセイ インフルエンザＡに対するモノクロナール抗体を慣用的
方法によって作製し、それはインフルエンザＡ株ＰＲ８
／３４で免疫されたマウス由来である。

インフルエンザＡに対するポリクロナール抗体は一連の
インフルエンザＡ株：ＰＲ／８／３４、Ａ２タイワン（
Ｔａｉｗａｎ）、ビクトリア（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）、及
びＡ２／ｆ３本（１１ｐａ＊）で免疫されたヤギから単
離された。

ポリスチレンマイクロタイタープレートを、ｐＨ９，５
，１０ｍＭ炭酸塩、２０ｍＭ−ｃチレンジアミンテトラ
アセテート（ＥＤＴＡ）溶液中で１時間３７℃で２μｇ
／ウェルのポリクロナール抗体で被覆した。そのプレー
トをＴＢＳ中に２％（Ｗ／ｖ）カゼインを含んでいる洗
浄緩衝液で３回洗浄した。

抗原保存液をインフルエンザＡＣＷＳＮ株）に感染した
マジンーダービー（Ｍｉｄｉｍ−Ｄａｒｌ＋ｙ）イヌ腎
［（ＭＤＣＫ）ｍ胞から調製した。洗浄した細胞を、ｏ
、ｉ％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０　ｍ　Ｍ　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　　１　ｍ　Ｍ　エチレンビス（オ
キシエチレンニトリロ）テトラアセテート（ＥＧＴＡ）
、０．０５％ツイーン−２０，０，１％フェノールレッ
ド、０．０１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含ｌＯｍＭ）
リス緩衝液に添加した。この抗原調製物を２倍毎にプレ
ートで連続的に入れた。そのプレートを上記のようにイ
ンキュベージタンして抗原を捕獲抗体と結合させて、緩
衝液で洗浄し、そして洗浄緩衝液で希釈されたアルカリ
ホスファターゼに結合した抗−インフルエンザモノクロ
ナール抗体を含むトレーサー溶液と再びインキュベージ
タンした。過剰のトレーサーをデカントして、そして洗
浄緩衝液で３回洗浄した。

ｐ）ｌ（１，ｏの５０ｍＭジェタノールアミン（ＤＨＯ
Ａ）中の実施例２で得られたブロックされた阻害剤（１
ｘ　ｌｏ−’Ｍ）及びウサギ肝臓エステラーゼ（ＲＬＥ
）（５ｘ　１０−’Ｍ）の混合物を各ウェル＜１ｓｏｐ
ｅ）に添加し、そして室温で２０分間インキュベーショ
ンした。

ＤＣＩＰＢ溶液（２０％メタノールを含むｐＨ７，５の
５０ｍＭ）リス中に０．３５ｍＭの濃度）を各ウェルに
添加した（１５０μΩ）。５分間のインキュベージタン
の後、ｐ　Ｈ７，５の５０ｍＭトリス中の１ｍＭ　１，
１．１−）リフルオロアセトフェノン（ＴＦＡＰ）の溶
液４０μＣを反応を止める！二めに添加しｔ二。

抗原を存していない対照ウェルは約５分間以内に濃い色
を一般的に示した。商業上利用できるエステラーゼ阻害
剤１．１．ｉ）リフルオロアセトフェノン（ＴＦＡＰ）
（アルドソーソチ・ケミカル・）（ＡｌｄｒｉＬ、ｈ　
Ｃｈｅｍｉｃｍｉ　Ｃｏ、）、ウイスコンンン州ミルウ
オキー）の添加は色形成工程を止めた。同じ効果を遊離
阻害剤（実施例２の生成物Ｂ）の添加によって達成した
。“停止“後、高い濃度の抗原を有している試験ウェル
は数時間の間熱色のままであつに　。

各ウェルの光学的濃度を６２０ｎｍで測定した。

第２図は、７０−・ラボラトリーズ・ムルチスカン（Ｆ
ｌｅｖ　Ｌ＆ｂｅｒＮｏｒｉｔｓ　Ｍｕｌｔｉｓｋｓａ
）ＭＣのマイクロプレート読み取り装置で測定された色
形成と抗原１度の関係を示している。対照ウェル中の溶
液の光学的濃度（ＯＤ）は突貫的に一定で約１．０であ
り、そして試験ウェル中の溶液の光学的濃度（ＯＤ）は
抗原濃度に反比例しておりそして非常に低い抗原濃度で
は対照の値に近すいている。

実施例５ 二重アッセイによる酵素検出 マイクロタイターグレートＪこ０．５ｍＭＭｇＣ１及び
０．０２％（Ｗ／Ｖ）オブアルブミンを含んでいるｐＨ
９，０の５０ｍＭジュタノールアミン塩υ塩緩衝液２０
０μＣ／ウユルを添加した。

アルカリホスファターゼを５倍毎に希釈してこれらのウ
ェルに添加した。ウサギ肝臓カルポキシエステラーゼ及
びブロックされた阻害剤の混合物５０μ虚をジェタノー
ルアミン緩衝液中で調製して、そして直ぐに各ウェルに
添加した。各ウェルの最終濃度は：　６．ＯＸ　１０−
’Ｍエステラーゼ、１．５ＸＩＯ−’Ｍブロックされた
阻害剤であっｔ；０周囲温度で２０分間のインキュペー
ジ謂ンに続いて、ｐＨ７，０の３００ｍＭ）リス及びメ
タノール（４０／６０）からなる溶液中の２ｍＭＤＣＩ
ＰＢ溶液５０μｔを各ウェルに添加した。各ウェル中の
最終濃度は：　３．３　ｘ　１０−’ＭＤＣＩ　ＰＢ、
　　１０％メタノールであった８発色を３分間行わせ、
モしてエステラーゼ停止溶液５０μ直を添加した（ｐＨ
７，５の５０ｍＭトリス中の１ｍＭＩ、Ｉ、Ｉ−トリフ
ルオロアセトフェノン）。その生成物をスペクトロフォ
トメーターによって６２０ｎｍで定量した（第３図）。

要約すると、本発明は液体サンプル中に非常に低濃度で
存在するリガンドの検出及び測定のためのアッセイ法に
おける新規な色原体基質及び該新規基質の使用を提供す
る０本アッセイはＥＬＩＳＡ又は第１の酵素がブロック
基を除去して第２の酵素の阻害剤を生成する２酵素法に
よって実施される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、光学的濃度とウェル当たりの全蛋白質量の関
係をプロットした図面である。 第２図は、光学的濃度とウェル当たりの物質量の関係を
プロットした図面である。 第３図は、光学的濃度とウェル当たりのアルカリホスフ
ァターゼ量の関係をプロットした図面である。 （外４名） ｔＭコＹ：）　二！Ｉｌｌ　　（ｔａ）ｎｙｎ）光鴬自
ブ；基庵

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオキシフ
   ェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−
   オンからなるエステラーゼの基質。 ２、液体中のリガンドを測定する方法であつて、ａ）リ
   ガンドを含んでいると推定される第１の液体を、固体支
   持体上に固定された抗リガンド及び加水分解酵素を含ん
   でいるトレーサーと混合し、それによって前記抗リガン
   ドが前記リガンドと結合し且つ前記トレーサーが前記リ
   ガンド及び前記抗リガンドの一方に結合して、前記支持
   体上に結合相を生成させ； ｂ）前記支持体を前記第１の液体から分離し；ｃ）前記
   支持体を、エステラーゼ及びブロックされたフルオロケ
   トンを含んでいる第２の液体と接触させ、それによって
   前記加水分解酵素が前記ブロックされたフルオロケトン
   をフルオロケトンに変換し、前記フルオロケトンが前記
   第２の液体中に放出され； ｄ）４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオキシフ
   ェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−
   オンを前記第２の液体に添加して、それによって前記エ
   ステラーゼによる前記４−［（３，５−ジクロロ−４−
   ブチリルオキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘ
   キサジエン−１−オンから２，６−ジクロロインドフェ
   ノールへの変換を前記フルオロケトンによって阻害し；
   及びｅ）前記リガンドを前記２，６−ジクロロインドフ
   ェノールに起因する色形成の阻害によって検出すること
   ； からなる上記方法。 ３、液体中の抗原を検出する方法であって、ａ）抗原を
   含んでいると推定される第１の液体を、固体支持体上に
   固定されている第１の抗体及びアルカリホスファターゼ
   と結合している第２の抗体と混合し、それによつて前記
   抗原が前記第１及び第２の抗体と結合して、前記支持体
   上に結合相を生成させ； ｂ）前記支持体を前記第１の液体から分離し；ｃ）前記
   支持体を、カルボキシエステラーゼ及びブロックされた
   阻害剤を含んでいる第２の液体と接触させ、それによっ
   て前記アルカリホスファターゼが前記ブロックされた阻
   害剤を前記カルボキシエステラーゼの阻害剤に変換し、
   前記阻害剤が前記第２の液体中に放出され； ｄ）４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオキシフ
   ェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−
   オンを第２の液体に添加して、それによって前記カルボ
   キシエステラーゼによる２，６−ジクロロインドフェノ
   ールへの変換を前記阻害剤によって阻害し；及び ｅ）前記抗原を前記第２の液体中の２，６−ジクロロイ
   ンドフェノールに起因する色形成の阻害を検出すること
   によって検出すること； からなる上記方法。 ４、液体中のリガンドをイムノアッセイする方法であっ
   て、 ａ）リガンドを含んでいると推定される液体を、固体支
   持体上に固定された抗リガンド及びエステラーゼを含ん
   でいるトレーサーと混合して、前記リガンド、抗リガン
   ド及びトレーサーの間の結合を起こさせて、結合画分を
   生成させ； ｂ）前記結合画分を、４−［（３，５−ジクロロ−４−
   ブチリルオキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘ
   キサジエン−１−オンと接触させて、それによって前記
   エステラーゼが前記４−［（３，５−ジクロロ−４−ブ
   チリルオキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキ
   サジエン−１−オンを２，６−ジクロロインドフェノー
   ルに加水分解し；及び ｃ）前記リガンドを前記２，６−ジクロロインドフェノ
   ールの色に関連した信号によって検出すること； からなる上記方法。 ５、液体中の加水分解酵素を測定する方法であって、 ａ）加水分解酵素を含んでいると推定される液体を、カ
   ルボキシエステラーゼ及びブロックされた阻害剤と混合
   して、前記加水分解酵素は前記ブロックされた阻害剤を
   カルボキシエステラーゼの阻害剤に変換し、それによっ
   て前記液体中に前記阻害剤を放出させ； ｂ）４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオキシフ
   ェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−
   オンを前記液体に添加して、前記カルボキシエステラー
   ゼは前記４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオキ
   シフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−
   １−オンを２，６−ジクロロインドフェノールに変換す
   ることができ、前記阻害剤は前記カルボキシエステラー
   ゼを阻害し；及び ｃ）前記未知酵素を前記２，６−ジクロロインドフェノ
   ールに起因するの色形成の阻害によって測定すること； からなる上記方法。 ６、固体支持体に固定された抗リガンド、エステラーゼ
   及び４−［（３，５−ジクロロ−４−ブチリルオキシフ
   ェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−
   オンからなる液体中のリガンドのアッセイを行うための
   物質のキット。 ７、前記エステラーゼに対するブロックされた阻害剤及
   び第２の抗リガンドに結合した加水分解酵素を更に含む
   請求項６記載のキット。 ８、前記エステラーゼが前記リガンド及び第２の抗リガ
   ンドの一つに結合している、請求項６記載のキット。 ９、既知濃度のリガンドを含んでいる液体を少なくとも
   一つ更に含んでいる、請求項６記載のキット。 １０、カルボキシエステラーゼ、前記カルボキシエステ
   ラーゼに対するブロックされた阻害剤及び前記カルボキ
   シエステラーゼの基質として働く４−［（３，５−ジク
   ロロ−４−ブチリルオキシフェニル）イミノ］−２，５
   −シクロヘキサジエン−１−オンからなる加水分解酵素
   のアッセイを行うための物質のキット。