CZ284692B6 - Způsob izolace a exprese genu, který kóduje streptokinázu, jeho nukletidová sekvence, rekombinantní DNA a transformované mikroorganismy - Google Patents

Způsob izolace a exprese genu, který kóduje streptokinázu, jeho nukletidová sekvence, rekombinantní DNA a transformované mikroorganismy Download PDF

Info

Publication number
CZ284692B6
CZ284692B6 CS912256A CS225691A CZ284692B6 CZ 284692 B6 CZ284692 B6 CZ 284692B6 CS 912256 A CS912256 A CS 912256A CS 225691 A CS225691 A CS 225691A CZ 284692 B6 CZ284692 B6 CZ 284692B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
aaa
gene
gat
gaa
skc
Prior art date
Application number
CS912256A
Other languages
English (en)
Inventor
Mario Pablo Estrada Garcia
Roger Rubiera Chaplen
Aimeé Pérez Hidalgo
Ricardo Serrano Doce
Luciano F. Hernández Marrero
Pedro Rodriguez Collazo
Anaisel Castro Ramirez
Emilio Amable Munoz Munoz
Walfrido Bravo Martinez
Magalys Campos Somavilla
Alicia Pedraza Fernández
José De J. De La Furente Garcia
Luis S. Herrera Martinez
Original Assignee
Centro de Ingenieria Genética y Biotecnologia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro de Ingenieria Genética y Biotecnologia filed Critical Centro de Ingenieria Genética y Biotecnologia
Priority to SK2256-91A priority Critical patent/SK279873B6/sk
Priority to CS912256A priority patent/CZ284692B6/cs
Publication of CZ225691A3 publication Critical patent/CZ225691A3/cs
Publication of CZ284692B6 publication Critical patent/CZ284692B6/cs

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Způsob výroby streptokinasy expresí genu kódujícího tuto streptokinasu, zahrnující transformaci hostitelské buňky expresním vektorem obsahujícím gen streptokinasy, SKC-2, který v podstatě sestává z nukleotidové sekvence vzorce A, jež je operativně vázána k účinnému promotoru a terminátoru transkripce, kultivaci vzniklé transformované hostitelské buňky a izolaci vyrobené streptokunasy. Takto vyrobená streptokinasa a farmaceutický prostředek na její bázi. Izolovaná a purifikovaná nukleotidová kyselina v podstatě sestávající z nukleotidové sekvence vzorce A. Expresní vektor pro expresi v streptokinasy v hostitelské buňce, kterýžto vektor obsahuje gen streptokinasy SKC-2 v podstatě sestávající z nukleotidové sekvence vzorce A operativně připojený k účinnému promotoru a terminátoru transkripce. Hostitelská buňka pro produkci streptokinasy expresí genu kódujícího tuto streptokinasu, přičemž tato hostitelská buňka je transformována výše uvedeným expresním vektorem.ŕ

Description

(57) Anotace:
Způsob výroby streptokínasy expresí genu kódujícího tuto streptokinasu, zahrnující transformaci hostitelské buňky expresním vektorem obsahujícím gen streptokínasy, SKC-2, který v podstatě sestává z nukleotidové sekvence vzorce A, jež Je operativně vázána k účinnému promotoru a terminátoru transkripce, kultivaci vzniklé transformované hostitelské buňky a Izolaci vyrobené streptokínasy. Takto vyrobená streptokinasa a farmaceutický prostředek na její bázi. Izolovaná a purifikovaná nukleotidová kyselina v podstatě sestávající z nukleotidové sekvenATT OCT GOA CCT CAA TTA GTT GTT ATT AGT CTT MA GGA GGA AM ACA act wr agt aec AM CCT ATT CAA tac ttt gm gtc AAC Q0C AM CTC ACC CAA CCT OTC CCA TAT aaa gaa GAA TAT ACT OTA CCA OCT CTC AAA ACC ATC ACA TCT AAA ACC CAC CCA ACT CAT GAC AAT TTT ACT TAC CAT AAA TCT GGT CTC AAA TAT TAC CTC CGC ACT CAC TTS AAC OAA TTG CTA TTA CAC WC MA TAC AM AAT CTC AAA STA GM GAT ATC OQC AAG CGA GAT AAA GAT CCT CCT TAT ACA GCC
GM TOO CTC CTA ACC CTT CCT CCT TTT TST GAA ATT GM GAA MC TTA CCG ATC CCA CAT OAA CAA TTO ATC ATT GAT TTT OCA TAC TTT OCT GAC CAA GAA TTT TTO AAA CCA ATA CAA CM TTT ACT ccc GAT ACT AM CTA CAA GAA TTA CTA QCC TAT ACC ATT GAC ATT T7C CCT GTC AAA MT COG AAT CAA GAA ATA CTT AAA AAA GM AAA CTQ TTC ACC AAA AOC GAC CAC GAT TTA TAC GAT αχ? aer ttt ogt AAT CAC GAT QM CCC GAA GGA GAO TAT ACC CAA GAA ACA CCT ATA CCT <XAC COT CCA TCT act arr gm aoc GAC CTA ACA TCA ACT CO AAA TCA AAA CTT GAA AAA OCT AAC OK CAC AGC GAT OCA ACC AAA GAT OCT TCO CTA AGC OGA CAT AAT CAA OCG AAA TTA AAC CCT GAT ŤTO AAA ACA CTA GCT CAA OCA CAA TAT GAA COT GAC ACO ATT TTA CCA Gaa caa aer tat AAC AAC ACT GAC CAA AM 0M TAT ATC AAA TAC GTT CTC TTA ACA GCT CCT OOT GAT AM ATT ATS GAC TAT ACC AAC OOT ATC AAT OCT AGC TAT OAA CGA GAA GTT GAT AAC CCT AAC
OTC AAC AAC AGC ACO AAT CAA GM CGA CCT GCT CAT aaa cca rrr gct GCT GAC TTA CTA MTT AAC GM GAC ATT ACT OAT CQA OTA ACC TTO CCC OrtQ CQC CTT AOA tct tm oat aro G*C OAT rte AGA GCT ATC GGT GAC AGC ATT TTA AAC TCC TCA ATC OTC ATQ GAT CAA GM GM ATC AAT AAA CTC ATC TCT GAG GAT CCC HT GAT GAT GTC AAC ACC AGC GAA CCT AAC OCT AAA CTA CTC ACC TTA ACT OGA ATA ACC CTT TAT CAT TTA GCC TAT tac MC tac cra GAC AAA TAA
4«
9C
144
112
3««
311 )}<
»4 «33 «· (λ)
32· »7· «72
72·
Ml •1« ·<« »12 ···
10M
10»«
1104
1152
120· .
1245
Způsob výroby streptokinasy, streptokinasa, farmaceutický prostředek, nukleová kyselina, expresní vektor a hostitelská buňka
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby streptokinasy expresí genu, takto získané streptokinasy a farmaceutického prostředku na její bázi. Dále se vynález také týká nukleové kyseliny, expresního vektoru a hostitelské buňky pro expresi genu kódujícího streptokinasu.
Dosavadní stav techniky
Streptokinázy jsou aktivátory plazminogenu z prokaryotických buněk. Obvykle jsou vylučovány z kultivačního média velkým počtem druhů rodu Streptococcus. Tyto druhy mají odlišné serotypy. Jelikož se jedná o bílkoviny bakteriálního původu, byly k nim nalezeny antigenní odezvy (Dykewizc, M. S., McGrath, K. G, Harris, K. E. a Patterson, R., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 78 : 386 - 390; McGrath, K. G. Zeffren, B., Alexander, J., Kaplan, K. a Patterson, R. J., 1985, Allergy Clin. Immunol. 76 :453 -457). Jejich molekulová hmotnost je přibližně 47 000 daltonů.
Způsob patogenního působení rodu Streptococcus není přesně známý, ačkoliv potenciálně musí přispívat k vyloučení nebo zabránění tvorby fibrinových bariér kolem infekce.
Při interakci streptokinázy s plazminogenem, který je v lidské plazmě, se zjistilo, že tato bílkovina je schopná konvertovat plazminogen na plazmin. Plazmin má proteolytickou aktivitu a může rozkládat sraženiny fibrinu na rozpustné produkty.
Streptokináza, urokináza a aktivátor plazminogenu tkáňového typu se v současnosti používají jako trombolytická činidla při léčení nemocí, které dohromady představují jednu z největších příčin úmrtí na světě. Jedná se o infarkt myokardu, plicní, tepennou nebo žilní trombózu, komplikace při chirurgických zákrocích a jiné případy trombóz.
Ačkoliv všechny streptokinázy jsou blízce příbuzné s ohledem na svou funkci, existují mezi nimi lékařsko-chemické a imunologické rozdíly a rozdíly v substrátové specifitě, které svědčí o molekulární heterogenitě streptokináz odlišného původu.
Při produkci streptokinázy se dosahuje nízkých výtěžků, její přírodní producent je patogenní a kmeny rodu Streptococcus, používané pro průmyslovou produkci streptokinázy, vylučují do kultivačního média jiné produkty, jako jsou deoxyribonukleázy, streptolysin nebo hyaluromidáza a proteázy. Kombinace těchto faktů způsobuje, že proces čištění žádaného proteinu je obtížný. Na druhé straně však dosud nebylo možné získat geneticky vylepšené kmeny těchto producentů vzhledem k nedostatečně rozvinuté metodologii genového přenosu.
Uvedené nevýhody způsobily, že se zkoušelo klonování různých izolovaných genů, které kódují uvedené bílkoviny, s použitím prokaryotických a eukaryotických hostitelů.
Patent NDR číslo 249493, Int. Cl.: C 12 N 15/00 popisuje klonování a expresi genu, který kóduje streptokinázu, z kmene H46A Streptococcus equisimilis, patřícímu k rodu Streptococcus typ C, s použitím bakterie E. coli jako hostitelského organismu. Koncentrace proteinu, který je vylučován do média, se pohybují od 0,1 do 1,8 mg/1 v závislosti na stáří kultury.
Kódující sekvence tohoto genu, nazvaná SKC, byla později stanovena včetně svého signálního peptidu. Také došlo k určení primární struktury sousedních oblastí, které se podílejí na řízení
- 1 CZ 284692 B6 transkripce a translace řečeneho genu (Malke, H., Roe, B. a Ferretti, J. J., 1985, Gene 34: 357 62).
Byly stanoveny jiné nukleotidové sekvence genů, které kódují streptokinasu z rodu Streptococcus typu G a A (Water, F., Siegel, M. a Malke, H., Nucl. Acids Res. 17/13/: 1262). Zvláště gen, který kóduje streptokinasu typ A (gen SKA) z kmene 49 typ M Streptococcus piogenes byl klonován aexprimován v kmeni JM109 E. coli a v Streptococcus sanquis Challis 57E (Huang, T. T., Malke, H. a Ferreti, J. J., 1989, Molec. Microb. 3/2/: 197-205).
Koncentrace produkovaného proteinu v případě E. coli byla 0,64 mg/1 a v případě S. sanquis 40 pg/l. V případě E. coli bylo 94 % získaného množství proteinu v periplazmatickém prostoru a 6 % v cytosolu, zatímco v případě S. sanquis byl enzym produkován pouze extracelulámě. Vedle toho mnoho klonů, které produkují streptokinázu v E. coli, bylo velmi nestabilních, protože v některých případech byl SKA gen vyštěpen nebo hostitelské buňky odumřely, což způsobila letální aktivita produktu dotyčného genu.
V případě S. sanquis byla velikost získané proteinové molekuly přibližně o 3000 daltonů menší než velikost přirozené streptokinázy. Zjistila se nepřítomnost 32 aminokyselin zC-konce, avšak biologická aktivita nebyla ovlivněna (Bumett, N.N., 1981, Anal. Biochemistiy 112: 195 - 203).
Pokud se týče obtížnosti klonování a exprese izolovaného SKC genu v E. coli, zjistilo se dále, že genový produkt interferuje s normálním fyziologickým stavem hostitelské buňky, což je vidět z mukosity buněk, které obsahují tento gen. Dále je to patrné z neúplného exportu streptokinázy do periplasmatického prostoru, ze strukturní nestability plazmidů, které obsahují SKC gen a které jsou zkonstruovány pro expresi vysokých koncentrací zmíněného proteinu. Také při klonování genů pro streptokinázu z dalších serotypů rodu Streptococcus v plazmidech E. coli se setkáváme s překážkami a pokusy exprimovat heterologní geny řízené signály exprese-exkrece ze samotného SKC genu byly neúspěšné (Muller, J., Reinert, H. a Malke, H., 1989, Joumal of Bacteriology, duben.: 2202 - 2208).
Později společnosti Phillips Petroleum (patent DD257646, Int. Cl.: C 12N 15/00 aHaggenson, M. J. a další, 1989) provedla expresi streptokinázy v methylotrofní kvasince Pichia pastoris. Tato exprese byla řízena genovými regulačními sekvencemi alkohol-oxidázy. Při použití kontinuální fermentace se výtěžky požadovaného produktu pohybovaly řádově v rozmezí 77 až 250 ml/1 kultivačního média se střední buněčnou hustotou 46 g/1. Tento systém používá SKC gen, obsažený v plazmidu pMF5 v expresních vektorech. Majitelem patentu na plazmid pMF5 je shora uvedená společnost, přičemž licenci jí poskytl Dr. J. J. Ferreti zOklahoma University, USA.
Podstata vynálezu
Vynález je zaměřen na získání vysokého výtěžku streptokinasy v různých hostitelských systémech s použitím expresních vektorů, které obsahují novou nukleotidovou sekvenci. Tato sekvence představuje dosud nepopsanou genetickou variantu, která kóduje bioaktivní streptokinasu. Tato streptokinasa obsahuje aktivní část, odpovídající streptokinase z Streptococcus equisimilis typ C, kmen ATCC-9542. Nový izolovaný gen se nazývá SKC-2 a kóduje bílkovinu se stejnou molekulovou hmotností jako gen SKC. Základní vlastností tohoto genu je jeho stabilita ve vektorech z E. coli a kvasinek. V žádném z pozorovaných případů nebyly zjištěny nepříznivé účinky na buněčný růst a životaschopnost. Tyto vlastnosti umožňují získat větší výtěžky u obou dosud popsaných hostitelů, než bylo až dosud možné. To ukazuje, že získaný produkt je jiná streptokinasa než jsou dosud známé streptokinasy, která vykazuje požadovanou biologickou aktivitu.
-2CZ 284692 B6
Předmětem vynálezu je způsob výroby streptokinasy expresí genu kódujícího tuto streptokinasu, jehož podstata spočívá vtom, že se hostitelská buňka transformuje expresním vektorem obsahujícím gen streptokinasy. SKC-2, který v podstatě sestává z nukleotidové sekvence
ATT GCT GGA CCT GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA TCT GTC AAC AAC AGC 48
CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC 96
ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT GAC CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT 144
GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192
ACT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT AAA CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA 240
AAG GCT ATT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC 288
TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA 336
AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA ACC TTG CCG 384
ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA 432
CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAT CAA GCG AAA TCT GTT GAT GTG 480
GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 528
CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 576
ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC 624
AAA ACC CAC CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC 672
ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG 720
TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAG ATC AAT AAA 768
AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG 816
AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT 864
CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC ACC 912
AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC 960
TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 1008
TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 1056
AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT 1104
ATG GGC AAG CGA CCC GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT 1152
GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG 1200
CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA 1245
jež je operativně vázána k účinnému promotoru a terminátoru transkripce, vzniklá transformovaná hostitelská buňka se kultivuje a izoluje se vyrobená streptokinasa.
Ve výhodném provedení tohoto způsobu je gen SKC-2 izolován z Streptococcus equisimilis typu C kmene ATCC 9542. Genu SKC-2 se může používat bez jeho oblasti kódující signální peptid nebo s touto oblastí.
Hostitelskou buňkou je s výhodou bakterie nebo kvasinka.
Pokud je hostitelskou buňkou bakterie, jedná se s výhodou o bakterii Escherichia coli, například Escherichia coli kmene W3110.
Jako expresního vektoru se v tomto případě s výhodou používá plasmidu obsahujícího gen SKC2 operativně připojený k tryptofanovému promotoru z Escherichia coli a terminátoru transkripce T4, například plasmidu pEKG3 obsaženého v Escherichia coli kmene CBS 243.90.
Pokud je hostitelskou buňkou kvasinka, jedná se s výhodou o kvasinku Pichia pastoris, například Pichia pastoris his kmene MP-36, CBS 244.90.
Jako expresního vektoru se v tomto případě s výhodou používá plasmidu obsahujícího gen SKC2 operativně připojený k alkoholoxidasovému promotoru. A0X1, z Pichia pastoris aglycerylaldehyd-3-fosfátdehydrogenasové terminační sekvenci GAPt z Saccharomyces cerevisiae. Tento expresní vektor může obsahovat jako selekční markér gen his obsažený v Pichia pastoris kmene
CBS 244.90. Expresním vektorem je například plasmid pPESKC-4 obsažený v Pichia pastoris
-3CZ 284692 B6 kmene CBS 244.90. Tento expresní vektor může obsahovat gen SKC-2 bez oblasti kódující signální peptid.
Předmětem vynálezu je dále izolovaná a purifikovaná nukleotidová kyselina v podstatě sestávající z výše uvedené nukleotidové sekvence.
Předmětem vynálezu jsou také výše uvedené expresní vektory a hostitelská buňka pro produkci streptokinasy expresí genu kódujícího tuto streptokinasu, která je transformována některým z výše uvedených vektorů.
Konečně je předmětem vynálezu také izolovaná a purifikovaná streptokinasa v podstatě sestávající z aminokyselinové sekvence kódované nukleotidovou sekvencí znázorněnou výše a farmaceutický prostředek obsahující tuto streptokinasu a farmaceuticky vhodné ředidlo, nosič nebo excipient.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněn plasmid pEKG-3 nesoucí sekvenci genu SKC-2 operativně připojenou k tryptofanovému promotoru z E. coli. U 3' konce tohoto genu je připojen signál pro terminaci transkriopce bakteriofágu T4 za účelem dosažení vyšší stability exprese.
Na obr. 2 je provedeno porovnání mezi aminokyselinovými sekvencemi pocházejícími ze základních sekvencí genů SKC-2, SKC, SKG a SKA.
Na obr. 3 jsou znázorněny plasmidy pPESKC-4 a pPISKC-6 pro extracelulámí a intracelulámí expresi v P. pastoris.
Gen SKC-2 byl získán z genomu Streptococcus equisimilis typ C kmen (ATCC-9542) genovou amplifikací s použitím řetězové polymerační reakce (PCR) ze tří syntetických oligonukleotidů nazvaných SKI, SK2 a SK3 se sekvencemi:
SKI 5' ...TGGAATTCATGAAAAATTACTTATCT... 3'
SK2 5' ...TGGATCCTTATTTGTCGTTAGGGTTATC... 3'
SK3 5' ...GGAATTCATGATTGCTGGACCTGAGTGGCTG... 3'
Tyto primery dále obsahují restrikční místa, která nejsou v genu obsažena a která dovolují přímé klonování v expresním vektoru. Na druhé straně oligonukleotid SK2, který hybridizuje na 5' konci, obsahuje kodón ATG, který se chová jako místo pro iniciaci translace a odstraňuje signální peptid genu SKC-2. Uvedené tři oligonukleotidy se syntetizovaly podle SKC sekvencí publikovaných v Malke, H., Roe, B. a Ferretti, J. J., 1985, Gene 34 : 357 - 362. Pomocí těchto oligonukleotidů se označily přesně hranice fragmentů genu, který kóduje zralý protein nebo hranice kompletního genu včetně části, kódující signální peptid.
Na obr. 1 a 3 je znázorněna rekombinantní DNA, která obsahuje gen SKC-2, v podobě vektorů pro expresi tohoto genu, v bakteriích pEKG3 (obr. 1) a v kvasinkách pPESKC-4 apPISKC-6 (obr. 3). Konkrétně pro expresi v E. coli. SKC-2 gen se svým signálním peptidem nebo bez něj se klonuje za řízení promotorem pro tryptofan a se signálem pro terminaci transkripce fágu T4. Pro kvasinky se použilo expresního vektoru, který je popsán v kubánské přihlášce vynálezu 7/90, kde SKC-2 gen je umístěn za signálním peptidem invertázy sacharózy (SUC 2) a je řízený promotorem genu pro alkohol-oxidázu (AOX 1) z kvasinky Pichia pastoris. Tento expresní vektor dále obsahuje terminační signál genu pro glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (GAPt) z kvasinky Saccharomyces cerevisiae pro extracelulámí variantu exprese. Vektor byl označen pPESKC-4. Pro intracelulámí expresi genu CKC-2 se používá vektor pPISKC-6, který
-4CZ 284692 B6 neobsahuje signální peptid SUC-2 za AOX1 promotorem. Toho se docílí inzercí SKC-2 genu do expresního vektoru pNAO (vektor pNAO laskavě poskytla firma Muzio, CIGB, Havana, Kuba) (Obr. 3). Jako selekční markér se v obou vektorech použije HIS3 gen z S. cerevisiae a expresní kazeta, popsaná výše se lemuje 5' a 3' sekvencemi AOX genu z Pichia pastoris pro integraci.
Mikroorganismy, které vznikly transformací bakterie E. coli kmen W3110 vektorem pEKG3 a mutantu MP-36 kvasinky Pichia pastoris, který je uveden v kubánské přihlášce vynálezu 7/90 expresními vektory pPESKC-4 a pPISKC-6, mají vysoké úrovně exprese streptokinázy, dobrou životaschopnost (produkt nemá negativní efekty na buněčný růst) a vykazují vysokou stabilitu transformačních kmenů.
Transformovaný klon E. coli se nazývá HSK-M a vykazuje úrovně exprese produktu genu SKC2 větší než 350 mg/1 kultivačního média.
Transformovaný kmen Pichia pastoris MSK-M4 produkuje streptokinázu intracelulámě a kmen MSK-M6 extracelulámě. Její množství se pohybuje mezi 1,0 až 1,2 g/1 kultivačního média.
Způsobem popsaným v tomto vynálezu se docílí úrovní exprese, které nikdy nebyly pro tento produkt ohlášeny. To umožňuje dosáhnout optimální čistoty produktu pro jeho podávání lidem a zvířatům bez potřeby vyvinout komplexní a nákladný proces čištění.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci a nikoliv, aby vynález omezovaly. V těchto příkladech se používají jako hostitelské systémy E. coli a Pichia pastoris, avšak pro způsob, popsaný v tomto vynálezu, se dají použít i jiné eukaryotické a prokaryotické buňky.
Příklad 1
Pro izolaci genomové DNA z Streptococcus equisimilis typ C se použije jako její zdroj pro klonování S1 gen z kmene ATCC-9542. Buňky se pěstují v mozko-srdcovém infusním médiu Brain-Heart Infusion Medium (CIBCO) při intenzitě třepání 240 ot/min po dobu 12 hodin, při teplotě 37 °C s tím, že jako inokulum se použije 5 ml inokulační kultury, pěstované 12 hodin v Erlenmayerově baňce o objemu 300 ml. Buňky se shromáždí odstředěním při otáčkách 3000/min a resuspendují se v 8 ml lyzovacího roztoku (4,5 g glukózy; 1,86 g EDTA; 1,51 trisHCI, v 500 ml sterilní vody, pH = 8), přidá se 80 μΐ lysozymu o koncentraci lOmg/ml a suspenze se inkubuje 30 minut při 37 °C. Aby se docílilo účinného prasknutí buňky, přidá se 500 pm pronázy (Boehringer), 1 ml SDS o koncentraci 10% a2%pl EDTA o koncentraci 0,5 M, pH = 8. Suspenze se 2 hodiny inkubuje při teplotě 50 °C za mírného míchání. Dále se suspenze čistí fenolem, směsí fenol-chloroform a chloroformem agenomová DNA se vysráží absolutním ethanolem a octanem amonným o koncentraci 7,5 M.
Získaný výtěžek činí 100 pg na 300 ml Erlenmeyerovu kultivační baňku. Přítomnost genu, který kóduje streptokinázu, se potvrdí technikou Southem blot (Maniatis, T., Frisch, E. F. a Sambrook,
J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA).
Příklad 2
Pro klonování v bakteriích se vezme 1 pg genomové DNA z Streptococcus equisimilis typ C kmen (ATCC-9542) a kódující SKC-2 se zesílí PCR reakcí (Randall, K., Gelfond., D. H., Stoffel,
S., Scharf, S., Higuchi R., Hom, G. R., Mullis, K. B. a Erlich, H. A., 1988, Science 239 : 487 -5CZ 284692 B6
491. Přitom se použijí oligonukleotidy SKI a SK2 pro klonování sjeho signálním peptidem a SK2-SK3 pro klonování bez něj.
Při reakci se použije vždy 100 pmol každého oligonukleotidu, 2 jednotky Tag polymerázy (Perkin, Elmer, USA) a 200 pmol každého DNPT. Reakce se provádí v prostředí 10 mM MgCl2, 100 mM dTT, 10 mM NaCl a 100 pg/ml želatiny.
Provede se třicet amplifikačních cyklů, přičemž v každém cyklu se reakce 1 minutu inkubuje při 95 °C, aby došlo k denaturaci, 45 sekund při 52 °C, aby došlo k hybridizaci oligonukleotidů a 80 sekund při 70 °C za účelem prodloužení. Dosáhne se účinnosti amplifíkace větší než 5 %.
Pro klonování v bakteriích (E. coli) se použije genetický konstrukt, který se liší od dosud popsaných konstruktů pro expresi tohoto produktu. V tomto konstruktu se použije tryptofanový promotor s E. coli a terminační signál z bakteriofágu T4. Fragmenty, zesílené při PCR reakci, se štěpí BamHI a spojí ligací s vektorem ptrip-NcoI-Sl-BamHI (Estrada, Μ. P., Hemández, O. ade laFuente, J., Interferon y Biotecnología 5: 152 - 156). Tento konstrukt se transformuje do preparátu komplementárních buněk, připravených podle Dagert, M. aEhrlich, S. D., 1974, Gene 6: 23 - 28 a Hanahan, D., 1983, J. Mol. Biol. 166: 557 - 580 z E. coli kmen HB 101 / (rBmB-), supE44, ara-14, galK-2, lacYl, proA2, rpsL20, (StrR, xyl-5, mtl-5, mtl-1, racA13/, které mají frekvenci transformace větší než 107 transformantů na g DNA.
Získané kolonie se nanesou na misky s LB médiem (10 g/l trypton, 5 g/l kvasničný extrakt, 10 g/l chlorid sodný) as50pg/ml ampicillinu ahybridizují se podle Maniatis, T., Frisch, E. F. a Sambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA. Jako hybridizační próba se použije fragment získaný amplifikací při PCR reakci, který je značený dATP32 (Amersham UK) a Klenowův fragment DNA polymerázy I z E. coli (Maniatis, T., Frisch, E. F. a Sambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA). Hybridizace se provádí na filtrech Whatman 541 po dobu 30 minut při 37 °C a reakce se ukončí přídavkem EDTA a zahřátím. 4 % kolonií jsou pozitivní klony. Ty se zkoumají restrikční analýzou a vykazují stejný způsob štěpení svíce než 10 restrikčními enzymy. Přesto však se pozitivní klony kontrolují sekvenováním dvouvláknové DNA (Sanger, F., Nickler, S. a Coulson, A. K., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463 5467) s použitím oligonukleotidu o 17 bázích (5'...ATCATCGAACTAGTTAA...3'), který hybridizuje na 3' konci promotoru. Tím se potvrdí, že připojení tohoto nukleotidu k SKC-2 genu je takové, jak bylo požadováno.
Vybraný klon se nazývá pEKG-3 (obr. 1). Tento klon se použije při fermentaci za účelem charakterizace produktu.
Klon plazmidu pEKG3 se čistí s použitím koncentračního gradientu CsCl. Sekvence SKC-2 genu se stanoví pokaždé s použitím 2 g plazmidu a oligonukleotidů, které jsou uvedeny dále jako primery:
SSK-01 5'...GAATCAAGACATTAGTC...3'
SSK-02 5'...GTGGCGCGATGCCAC...3'
SSK-03 5'...GCAACCATTACTGATCG...3'
SSK-04 5'...CCAGTACAAAATCAAGC...3' SSK-05 5'...CTAGČTATCGGTGACAC...3' SSK-06 5'...CAGAGATCAGGTCAG...3' SSK-07 5'...GTTAAGAGCTGCTCGC...3' SSK-08 5'...CCAGTTAAGGTATAGTC...3' SSK-09 5'...TCTCGTTCTTCTTCGG...3'
-6CZ 284692 B6
Postupuje se v zásadě podle Sanger, F., Nickler, S. a Coulson, A. K., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463 - 5467. Použijí se značené nukleotidy dATP32 a S35ATP (Amersham, GB).
Obr. 2 srovnává aminokyselinovou sekvenci odvozenou od základní sekvence genu SKC-2 se sekvencemi odvozenými od genů SKC (Malke, H. aFerretti, J. J., 1985, Gene 34: 357-362), SKA a SKG Walter, F., Siegel, M. a Malke, H., 1989, Nucl. Acids Res. 17/3/: 1262.
Plasmid pEKG3 se transformuje v několika kmenech E. coli, jako jsou W-3110, JM-101, LE392 a MC-1061 a pak se srovnává jejich exprese streptokinázy. Nej lepší výsledky dává kmen w3110 (F- supF supE hsdR galK TrpR metB lacY tonA). Proto se tento kmen vybere a provádí se s ním fermentace. Získají se stabilní úrovně exprese. Více než 20 % celkového množství bílkovin v buňkách tvoří streptokináza. Získá se 350 - 400 mg streptokinázy na litr kultivačního média.
Příklad 3
Pro klonování SK.C-2 genu v kvasinkách se jako hostitel použije kmen MP36 Pichia pastoris. Vytvoří se varianty pro intracelulámí a extracelulámí expresi z plazmidů pNAO a pPS7 (obr. 3) Pro extracelulámí konstrukt se použije signální peptid invertázy sacharózy. V obou případech (extra- i intracelulámí exprese) se gen klonuje za řízení promotoru pro alkohol-oxidázu (AOX), s použitím terminátoru na 3' konci terminačního signálu genu pro glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu z S. cerevisiae a s použitím nekódující 3' oblasti AOX genu pro integraci, což je možné vzhledem k homologii genomu kvasinek. Dále se využívá gen, kódující histidin 3, pro selekci v kmeni MP36 his-.
Vektor pPESKC4 (plazmid pro extracelulámí expresi proteinu) se získá z vektorového konstruktu pPS7-Ncoí-Sl nukleáza-fosfatázy ligaci s SKC-2 genem. SKC-2 gen je zesílen PCR reakcí z pEKG3 s oligonukleotidem SK2 a novým primerem, který hybridizuje s 5' koncem genu a eliminuje ATG kodón, který byl vložen do konstruktu pro expresi u baktérií. V případě intracelulámí exprese se získá pPISKC6 (plazmid pro intracelulámí expresi proteinu) z vektoru pNAO-NcoI-EcoRI-Sl nukleáza-fosfatázy ligaci s pásem SKC-2 genu, který je zesílen reakcí PCR s primery SK2 a SK3, čímž se získá přesný gen, který kóduje streptokinázu s ATG kodónem na svém 5'konci (obr. 3). Oba plazmidy se transformují v kmeni MP36 his s použitím postupu podle Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler. A. Y. aMadden, K. R., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 3376 -3385.
Pozitivní klony se studují Southem blot technikou (Maniatis, T., Frisch, E. F. a Sambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, USA). Podle správné integrace se vybere nejproduktivnější klon v každém případě pro charakterizaci produktu.
Získaná extracelulámí exprese rekombinantní streptokinázy v P. pastoris je 1 až 1,2 g/1 supernatantu kultivačního média. V případě intracelulámího konstruktu je to více než 1,0 g/1 kultury.
Při použití konstruktu pro extracelulámí expresi se získá glykosylovaný protein o molekulové hmotnosti větší než 67 000 D. Technikou Western blotting lze potvrdit, že jeho molekulová hmotnost se po štěpení endoglykosidázou H sníží na molekulovou hmotnost přírodní streptokinázy. Štěpení se provádí s proteinem o koncentraci 1 mg/ml v roztoku citrátu sodného (koncentrace 0,05 M, pH 5,5). Protein se denaturuje přídavkem SDS (konečná koncentrace 0,02%) azahřátím na 100 °C po dobu 10 minut. Potom se reakční směs nechá zchladnout na okolní teplotu a přidá se 200 milijednotek (mU) endoglykosidázy H (endo H). Směs se nechá stát 16 hodin při teplotě 37 °C. Nakonec se 5 minut zahřívá při 100 °C, přidá se 100 mU endo H a inkubuje se 12 hodin při 37 °C. Potom se roztok nanese na 12,5% polyakrylamidový gel a srovná se s nedeglykosylovaným vzorkem.
-7CZ 284692 B6
Streptokinaza produkovaná v Pichia pastoris si při použití obou konstruktů udržuje svou biologickou aktivitu, nemění svou afinitu k plazminogenu a poskytuje ve skutečnosti další alternativu pro použití tohoto proteinu v klinické medicíně.
Příklad 4
Pro ověření biologické aktivity produktu SKC-2 genu se čistá rekombinantní streptokináza, získaná z bakterií nebo z kvasinek, použije pro testy akutní a subakutní toxicity na krysách. Získají se uspokojivé a přijatelné výsledky, které dovolují použití streptokinázy v humánním lékařství a veterinární medicíně. Její fíbrinolytická aktivita in vivo se ověří v klinických textech na zvířatech, v nichž úspěšně probíhá rozpouštění sraženin fibrinu ve věnčitých a stehenních tepnách psů. Krevní parametry se udržují podobné jako jsou parametry popsané v literatuře s tímto typem produktu.
Produkt SKC-2 genu vykazuje specifickou aktivitu 50 000- 100 000 IU/mg, která se měří na miskách s agarózou-fibrinem (Astrup, T. a Mullertz, S., 1952, Arch. Biochem. Biophys. 40: 346 351), s chromatogenním substrátem (Fiberger, P., 1982, J. Clin. Lab. Invest. 42, Suppl. 162: 49 54) a in vitro podle lyže sraženin (Westtund, L. E. a Anderson, L. O., 1985, Thrombosis Research 37: 213 - 223).
Příklad 5
Pro ověření aminokyselinové sekvence, odvozené od základní sekvence SKC-2 genu, se provede analýza čistého produktu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fáze (HPLC-RP) s použitím C8 4,6 x 250 mm kolony (Baker, USA). Eluuje se stupňovitě s použitím gradientu pufru B v pufru A, přičemž délka jednoho stupně je 5 minut, koncentrace pufru B se mění od 0 do 90 % a celková doba eluce je 55 minut. Pufr A je kyselina trifluoroctová (TFA, Pierce, USA) o koncentraci 0,1% v destilované vodě a pufr B je TFA o koncentraci 0,5% v acetonitrilu (Lichrosolv, Měrek, SRN). Průtoková rychlost se udržuje na hodnotě 0,8 ml/min.
U proteinu s vysokým stupněm čistoty se aminokyselinová sekvence, odvozená od základní sekvence získané z SKC-2 genu, ověří sekvenováním pomocí hmotnostní spektrometrie.
Proto se protein štěpí různými enzymy a jejich kombinacemi. Použitými enzymy jsou chymotrypsin, endoproteináza Glu-C, endoproteináza Lys-C a trypsin.
Z analýzy hmotnostních spekter peptidů, které se získají při každém štěpení různými enzymy, se superpozicí zkonstruuje mapa aminokyselinové sekvence proteinu. Tato mapa umožní ověřit, že v tomto případě je 100% korespondence mezi sekvencí SKC-2 genu a aminokyselinovou sekvencí získaného proteinu.
Uložení kmenů
Kmen E. coli HSK-M /pEKG3/, odvozený od kmene E. coli W3110 a obsahující plazmid pEKG3, byl uložen 11. června 1990 uCentraal bureau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, Nizozemsko, a získal depositní číslo CBS 243.90.
Podobně kmen Pichia pastoris MSK-M4 /pPESKC-4/, odvozený od kmene Pichia pastoris MP36 a obsahující plazmid pPESKC-4, byl uložen 11. června 1990 u Centraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS), Baam, Nizozemsko a získal depositní číslo CBS 244.90.
-8CZ 284692 B6
Seznam sekvencí
Sekv. id. č.: 1
Typ sekvence: nukleotid s odpovídajícím proteinem
Délka sekvence: 1245 párů bází
Jednovláknová sekvence
Topologie: lineární
Typ molekuly: genomová DNA
Původní zdrojový organismus: Steptococcus equisimilis ze skupiny C podle Lanfieldovy definice
Přímý experimentální zdroj: kmen ATCC-9542
Rysy: od 1. do 1245. bp maturovaný peptid
Vlastnosti: gen pro streptokinázu genový produkt se váže na lidský plazminogen genový produkt je aktivátorem lidského plazminogenu
ATT Ile 1 GCT GGA CCT Pro GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA TCT GTC AAC AAC AGC 48
Ala Gly Glu 5 Trp Leu Leu Asp Arg 10 Pro Ser Val Asn Asn 15 Ser
CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC 96
Gin Leu Val Val 20 Ser Val Ala Gly Thr 25 Val Glu Gly Thr Asn 30 Gin Asp
ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT GAC CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT 144
Ile Ser Leu 35 Lys Phe Phe Glu Ile 40 Asp Leu Thr Ser Arg 45 Pro Ala His
GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192
Gly Gly 50 Lys Thr Glu Gin Gly 55 Leu Ser Pro Lys Ser 60 Lys Pro Phe Ala
ACT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT AAA CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA 240
Thr 65 AsP ser Gly Ala Met 70 Pro His Lys Leu Glu 75 Lys Ala Asp Leu Leu 80
AAG GCT ATT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC 288
Lys Ala Ile Gin Glu 85 Gin Leu Ile Ala Asn 90 Val His Ser Asn Asp 95 Asp
TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA 336
Tyr Phe Glu Val 100 Ile Asp Phe Ala Ser 105 Asp Ala Thr Ile Thr 110 Asp Arg
AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA ACC TTG CCG 384
Asn Gly Lys 115 Val Tyr Phe Ala Asp 120 Lys Asp Gly Ser Val 125 Thr Leu Pro
ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA 432
Thr Gin 130 Pro Val Gin Glu Phe 135 Leu Leu Ser Gly His 140 Val Arg Val Arg
CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAT CAA GCG AAA TCT GTT GAT GTG 480
Pro 145 Tyr Lys Glu Lys Pro 150 Ile Gin Asn Gin Ala 155 Lys Ser Val Asp Val 160
GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 528
Glu Tyr Thr Val Gin 165 Phe Thr Pro Leu Asn 170 Pro Asp Asp Asp Phe 175 Arg
-9CZ 284692 B6
CCA Pro GGT Gly CTC Leu AAA GAT ACT AAG CTA TTG Leu AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 576
Lys 180 Asp Thr Lys Leu 185 Lys Thr Leu Ala Ile 190 Gly Asp
ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC 624
Thr Ile Thr 195 Ser Gin Glu Leu Leu 200 Ala Gin Ala Gin Ser 205 Ile Leu Asn
AAA ACC CAC CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC 672
Lys Thr 210 His Pro Gly Tyr Thr 215 Ile Tyr Glu Arg Asp 220 Ser Ser Ile Val
ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG 720
Thr 225 His Asp Asn Asp Ile 230 Phe Arg Thr Ile Leu 235 Pro Met Asp Gin Glu 240
TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAG ATC AAT AAA 768
Phe Thr Tyr His Val 245 Lys Asn Arg Glu Gin 250 Ala Tyr Glu Ile Asn 255 Lys
AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG 816
Lys Ser Gly Leu 260 Asn Glu Glu Ile Asn 265 Asn Thr Asp Leu Ile 270 Ser Glu
AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CcC TTT GAT 864
Lys Tyr Tyr 275 Val Leu Lys Lys Gly 280 Glu Lys Pro Tyr Asp 285 Pro Phe Asp
CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC ACC 912
Arg Ser 290 His Leu Lys Leu Phe 295 Thr Ile Lys Tyr Val 300 Asp Val Asn Thr
AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC 960
Asn 305 Glu Leu Leu Lys Ser 310 Glu Gin Leu Leu Thr 315 Ala Ser Glu Arg Asn 320
TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 1008
Leu Asp Phe Arg Asp 325 leu Tyr Asp Pro Arg 330 Asp Lys Ala Lys Leu 335 Leu
TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 1056
Tyr Asn Asn Leu 340 Asp Ala Phe Gly Ile 345 Met Asp Tyr Thr Leu 350 Thr Gly
AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT 1104
Lys Val Glu 355 Asp Asn His Asp Asp 360 Thr Asn Arg Ile Ile 365 Thr Val Tyr
ATG GGC AAG CGA CCC GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT 1152
Met Gly 370 Lys Arg Pro Glu Gly 375 Glu Asn Ala Ser Tyr 380 His Leu Ala Tyr
GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG 1200
Asp 385 Lys Asp Arg Tyr Thr 390 Glu Glu Glu Arg Glu 395 Val Tyr Ser Tyr Leu 400
CGT Arg TAT Tyr ACA Thr GGG Gly ACA Thr 405 CCT Pro ATA Ile CCT Pro GAT Asp AAC Asn 410 CCT Pro AAC Asn GAC Asp AAA Lys TAA 1245
- 10CZ 284692 B6
Sekv. id. č.: 2 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 26 bází
TGGAATTCAT GAAAATTAC TTATCT
Sekv. id. č.: 3 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 28 bází
TGGATCCTTA TTTGTCGTTA GGGTTATC
Sekv. id. č.: 4 typ sekvence: nukleotid délka sekvence 31 bází GGAATTCATG ATTGCTGGAC CTGAGTGGCT G
Sekv. id. č.: 5 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 17 bází ATCATCGAAC TAGTTAA
Sekv. id. č. 6 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 17 bází
GAATCAAGAC ATTAGTC
Sekv. id. č.: 7 typ sekvence: nukleotid délka sekvence:15 bází
GTGGCGCGAT GCCAC
Sekv. id. č.: 8 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 17 bází GCAACCATTA CTGATCG
Sekv. id. č.: 9 typ sekvence: nukleotid délka sekvence:17 bází
CCAGTACAAA ATCAAGC
Sekv. id. č.: 10 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 17 bází
CTAGCTATCG GTGACAC
Sekv. id. č.: 11 typ sekvence: nukleotid délka sekvence 15 bází CAGAGATCAG GTCAG
Sekv. id. č.: 12 typ sekvence: nukleotid délka sekvence 16 bází
GTTAAGAGCT GCTCGC
-11 CZ 284692 B6
Sekv. id. č.: 13 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 17 bází CCAGTTAAGG TATAGTC
Sekv. id. č.: 14 typ sekvence: nukleotid délka sekvence: 16 bází TCTCGTTCTT CTTCGG

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob výroby streptokinasy expresí genu kódujícího tuto streptokinasu, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka transformuje expresním vektorem obsahujícím gen streptokinasy, SKC-2, který v podstatě sestává z nukleotidová sekvence
    ATT GCT GGA CCT GAG TGG CTG CTA GAC CGT CCA TCT GTC AAC AAC AGC 48 CAA TTA GTT GTT AGC GTT GCT GGT ACT GTT GAG GGG ACG AAT CAA GAC 96 ATT AGT CTT AAA TTT TTT GAA ATT GAC CTA ACA TCA CGA CCT GCT CAT 144 GGA GGA AAG ACA GAG CAA GGC TTA AGT CCA AAA TCA AAA CCA TTT GCT 192 ACT GAT AGT GGC GCG ATG CCA CAT AAA CTT GAA AAA GCT GAC TTA CTA 240 AAG GCT ATT CAA GAA CAA TTG ATC GCT AAC GTC CAC AGT AAC GAC GAC 288 TAC TTT GAG GTC ATT GAT TTT GCA AGC GAT GCA ACC ATT ACT GAT CGA 336 AAC GGC AAG GTC TAC TTT GCT GAC AAA GAT GGT TCG GTA ACC TTG CCG 384 ACC CAA CCT GTC CAA GAA TTT TTG CTA AGC GGA CAT GTG CGC GTT AGA 432 CCA TAT AAA GAA AAA CCA ATA CAA AAT CAA GCG AAA TCT GTT GAT GTG 480 GAA TAT ACT GTA CAG TTT ACT CCC TTA AAC CCT GAT GAC GAT TTC AGA 528 CCA GGT CTC AAA GAT ACT AAG CTA TTG AAA ACA CTA GCT ATC GGT GAC 576 ACC ATC ACA TCT CAA GAA TTA CTA GCT CAA GCA CAA AGC ATT TTA AAC 624 AAA ACC CAC CCA GGC TAT ACG ATT TAT GAA CGT GAC TCC TCA ATC GTC 672 ACT CAT GAC AAT GAC ATT TTC CGT ACG ATT TTA CCA ATG GAT CAA GAG 720 TTT ACT TAC CAT GTC AAA AAT CGG GAA CAA GCT TAT GAG ATC AAT AAA 768 AAA TCT GGT CTG AAT GAA GAA ATA AAC AAC ACT GAC CTG ATC TCT GAG 816 AAA TAT TAC GTC CTT AAA AAA GGG GAA AAG CCG TAT GAT CCC TTT GAT 864 CGC AGT CAC TTG AAA CTG TTC ACC ATC AAA TAC GTT GAT GTC AAC ACC 912 AAC GAA TTG CTA AAA AGC GAG CAG CTC TTA ACA GCT AGC GAA CGT AAC 960 TTA GAC TTC AGA GAT TTA TAC GAT CCT CGT GAT AAG GCT AAA CTA CTC 1008 TAC AAC AAT CTC GAT GCT TTT GGT ATT ATG GAC TAT ACC TTA ACT GGA 1056 AAA GTA GAG GAT AAT CAC GAT GAC ACC AAC CGT ATC ATA ACC GTT TAT 1104 ATG GGC AAG CGA ccc GAA GGA GAG AAT GCT AGC TAT CAT TTA GCC TAT 1152 GAT AAA GAT CGT TAT ACC GAA GAA GAA CGA GAA GTT TAC AGC TAC CTG 1200 CGT TAT ACA GGG ACA CCT ATA CCT GAT AAC CCT AAC GAC AAA TAA 1245
    jež je operativně vázána k účinnému promotoru a terminátoru transkripce, vzniklá transformovaná hostitelská buňka se kultivuje a izoluje se vyrobená streptokinasa.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že gen SKC-2 je izolován z Streptococcus equisimilis typu C kmene ATCC 9542.
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se genu SKC-2 používá bez jeho oblasti kódující signální peptid.
    - 12CZ 284692 B6
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se genu SKC-2 používá sjeho oblastí kódující signální peptid.
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je bakterie.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že bakterií je Escherichia coli.
  7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že bakterií ie Escherichia coli kmene W3110.
  8. 8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že expresním vektorem je plasmid obsahující gen SKC-2 operativně připojený k tryptofanovému promotoru z Escherichia coli a terminátoru transkripce T4.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že expresním vektorem je plasmid pEKG3 obsažený v Escherichia coli kmene CBS 243.90.
  10. 10. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj í c í se t í m , že hostitelskou buňkou je kvasinka.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že kvasinkou je Pichia pastoris.
  12. 12. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j í c í se t í m , že kvasinkou je Pichia pastoris his’ kmene MP-36 CBS 244.90.
  13. 13. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že expresním vektorem je plasmid obsahující gen SKC-2 operativně připojený k alkoholoxidasovému promotoru, AOX1, z Pichia pastoris a glycerylaldehyd-3-fosfátdehydrogenasové terminační sekvenci, GAPt ze Saccharomyces cerevisiae.
  14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že expresní vektor obsahuje jako selekční markér gen his 3 ze Saccharomyces cerevisiae.
  15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že expresním vektorem je plasmid pPESKC-4 obsažený v Pichia pastoris kmene CBS 244.90.
  16. 16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že expresní vektor obsahuje gen SKC-2 bez oblasti kódující signální peptid.
  17. 17. Izolovaná a purifikovaná nukleová kyselina v podstatě sestávající z nukleotidové sekvence znázorněné v nároku 1.
  18. 18. Expresní vektor pro expresi streptokinasy v hostitelské buňce, kde vektor obsahuje gen streptokinasy SKC-2 v podstatě sestávající z nukleotidové sekvence uvedené v nároku 1 operativně připojený k účinnému promotoru a terminátoru transkripce.
  19. 19. Expresní vektor podle nároku 18 obsahující gen SKC-2 operativně připojený k tryptofanovému promotoru z Escherichia coli a terminátoru transkripce T4 pro expresi genu SKC-2 v bakterii.
  20. 20. Expresní vektor podle nároku 19, kterým je plasmid pEKG3 obsažený v Escherichia coli kmene CBS 243-90.
    - 13 CZ 284692 B6
  21. 21. Expresní vektor podle nároku 18 obsahující gen SKC-2 operativně připojený k alkoholoxidasovému promotoru A0X1 z Pichia pastoris a glycerylaldehyd-3-fosfátdehydrogenasové terminační sekvenci GAPt ze Saccharomyces cerevisiae.
  22. 22. Expresní vektor podle nároku 21 obsahující jako selekční markér gen his 3 ze Saccharomyces cerevisiae.
  23. 23. Expresní vektor podle nároku 22, kterým je plasmid pPESKC-4.
  24. 24. Hostitelská buňka pro produkci streptokinasy expresí genu kódujícího tuto streptokinasu, přičemž tato hostitelská buňka je transformována expresním vektorem, který obsahuje gen streptokinasy SKC-2 v podstatě sestávající z nukleotidové sekvence uvedené v nároku 1 operativně připojený k účinnému promotoru a terminátoru transkripce.
  25. 25. Hostitelská buňka podle nároku 24, kterou je bakterie.
  26. 26. Hostitelská buňka podle nároku 24, kterou je Escherichia coli.
  27. 27. Hostitelská buňka podle nároku 24, kterou je Escherichia coli kmene W3110.
  28. 28. Hostitelská buňka podle nároku 24, kterou je kvasinka.
  29. 29. Hostitelská buňka podle nároku 24, kterou je Pichia pastoris.
  30. 30. Hostitelská buňka podle nároku 24, kterou je Pichia pastoris his” kmene MP-36 (CBS 244.90).
  31. 31. Izolovaná a purifikovaná streptokinasa v podstatě sestávající z aminokyselinové sekvence kódované nukleotidovou sekvencí znázorněnou v nároku 1.
  32. 32. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou a purifikovanou streptokinasu podle nároku 31 a farmaceuticky vhodné ředidlo, nosič nebo excipient.
CS912256A 1991-07-19 1991-07-19 Způsob izolace a exprese genu, který kóduje streptokinázu, jeho nukletidová sekvence, rekombinantní DNA a transformované mikroorganismy CZ284692B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK2256-91A SK279873B6 (sk) 1991-07-19 1991-07-19 Spôsob výroby streptokinázy, streptokináza, farmac
CS912256A CZ284692B6 (cs) 1991-07-19 1991-07-19 Způsob izolace a exprese genu, který kóduje streptokinázu, jeho nukletidová sekvence, rekombinantní DNA a transformované mikroorganismy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS912256A CZ284692B6 (cs) 1991-07-19 1991-07-19 Způsob izolace a exprese genu, který kóduje streptokinázu, jeho nukletidová sekvence, rekombinantní DNA a transformované mikroorganismy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ225691A3 CZ225691A3 (en) 1993-04-14
CZ284692B6 true CZ284692B6 (cs) 1999-02-17

Family

ID=5359162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS912256A CZ284692B6 (cs) 1991-07-19 1991-07-19 Způsob izolace a exprese genu, který kóduje streptokinázu, jeho nukletidová sekvence, rekombinantní DNA a transformované mikroorganismy

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ284692B6 (cs)
SK (1) SK279873B6 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
SK279873B6 (sk) 1999-05-07
CZ225691A3 (en) 1993-04-14
SK225691A3 (en) 1995-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU644647B2 (en) Polypeptides
CA2551496C (en) 2-micron family plasmid and use thereof
Jennings et al. Analysis of the Escherichia coli gene encoding L-asparaginase II, ansB, and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins
Reidl et al. MalI, a novel protein involved in regulation of the maltose system of Escherichia coli, is highly homologous to the repressor proteins GalR, CytR, and LacI
JPH05502374A (ja) タンパク質および核酸
RU1776276C (ru) Способ получени полипептида со свойствами гирудина
CA2185343A1 (en) Enhanced secretion of polypeptides
CA1340841C (en) Cecropin-like polypeptides with activity against gram-positive and gram-negative bacteria
SK278336B6 (en) Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swing growth hormone-like polypeptides
HU215580B (hu) Eljárás antitrombin hatású polipeptidek és ezek termelésére alkalmas gazdaszervezetek előállítására
CA2061721A1 (en) Vector containing an inducible selection gene system
Tohyama et al. Nucleotide sequence of the streptomycinphosphotransferase and amidinotransferase genes from Streptomyces griseus
López et al. Cell wall hydrolases
AU644657B2 (en) Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant dna and transformed microorganisms
CZ284692B6 (cs) Způsob izolace a exprese genu, který kóduje streptokinázu, jeho nukletidová sekvence, rekombinantní DNA a transformované mikroorganismy
JPH01501996A (ja) 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター
PT96310B (pt) Processo para a preparacao do promotor de transcricao da piruvato-cinase de a.niger, vectores hibridos que o contem e hospedeiros transformados com estes vectores
HU214698B (hu) Eljárás rekombináns deszulfátó-hirudin HV-1 peptidek előállítására
AU618011B2 (en) Preparation of novel protein sweeteners-monellin type
HU216073B (hu) Eljárás sztreptokináz előállítására
CA2043953C (en) Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant dna and transformed microorganisms
JPH06169770A (ja) 新規なポリペプチド、これに関する暗号を有するプラスミド及びこれを製造する方法及びこれを使用する方法
RU2107726C1 (ru) Фрагмент днк, соответствующий гену skc-2, способ экспрессии фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, плазмидный вектор pek g3, обеспечивающий экспрессию фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, плазмидный вектор pes kc-4, обеспечивающий экспрессию фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, штамм бактерий escherichia coli, содержащий плазмидный вектор pekg3 и используемый для экспрессии гена skc-2, и стрептокиназа, полученная при использовании штамма бактерий escherichia coli hsk-m
Nikaidou et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of a pectin lyase gene from Pseudomonasmarginalis N6301
US5928925A (en) Rice ornithine carbamyltransferase gene, and a vector containing said gene and a transformant

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20050719