CZ306790A3 - Způsob výroby nových plasmidů a jejich použití při získávání aktivátoru plasminogenu - Google Patents

Description

Tři léčení uzávěrů cév,podmíněných fibrinem jako například infarktu srdce,plicňích embolií,onemocnění končetin spojeném s uzávěrem arterií atd. kraji akti vátcry plasminogenu významnou roli.Asi od počátku 50tých let je známé, že v lidské moči je obsažen proteolytický enzym,kteýý vyvolává přeměru plasminogenu v plasmin , to zn. v enzym, který způsobuje štěpení fibřinu v rozpustné polypeptidy a tím uvolnění uzávěrů podmíněných fibrinem, Tento aktivátor plasainogenu byl nazván urokínása a ukázalo se,že skutečně existuji různé formy urokinázy,Všechny tyto formy se ale odvozují přímo od stejného předchůze molekuly|zymcgenu prourokinásy ,známchoasi od poloviny 70tých let.Poté co se ukázalo,že tato prourokináza má strukturu s jedním řetězcem,byla označena jako sen- TA / .single chain urínary plasminogen aetivator/. Tento scu-TA sestává ze 411 aminokyselin a je v přirozeně se vyskytující forma glykoiy^ván na aminokyselině 302.

-2Z různých prací je znána gentechnologická výroba neglyko3ylované části proteinu scu-PA,které byla označena jako *rscu-PA / rekombinantní scu-PA/, nebo také volným názvem *sarupláza^tt. Při terapeutickém nasazení rscu-PA se ukázalo,že tento s ohledem na účinek a snášenlivost předčí tradiční fibrinolytika /«rovn, lancet 1989, str. 363-868/.

?

Pro výrobu neglykosylováného aktivátoru plasminogenu rscu-PA se používají prokaryonty, o čemž bylo v literatuře již uvedeno několik údajů. Až dosud známé postupy pro rscu-PA spočívají na expresi strukturního genu scu-PA izolovaného z lidských tkání.Bohužel se při tom dosáhly jen nízké výnosy exprese,které nedovolují vyrábět hospodárně žádaný produkt ve větších •nožstvích.Tak popisuje například Hihino et al. in ’ í

Agric. Biči,,, Chem, 52 , 329-336 /1988/ pro rscu-PA výrobu v E,. coli jen 2$ výnos exprese,měřeno na celkovém proteinu bakteria.Ka druhé straně nejsou v evropské patentové přihlášce 92 182 A2 ani Kolmesem et al. /10/ dosažené výnosy exprese přesně uváděny. Při dopracování těchto údajů se ale získalo u různých kmenů méně než 2 % proteinu bakterií na rscu-PA.

Budiž poukázána nato, že stejně jako v mnoha případech exprese eukaryotických proteinů v bakteriích i rscu-PA v buňce - který se-zde dále označuje jako

3protein předstupněm vzniká ve formě denaturováného vméstkoveho tělesa,které se po intermediární izolaci musí prosprávnou teinchemieky zřasit zpět na/terciární strukturu rscu-PA. Takto získaný produkt se může potom pro zjištění vytvořeného množství rscu-PA převést například přídavkem plas· minu na neglykosylovanou urokinázu se dvěma řetězci /ⁿrtcu PA /,jejíž enzymatická, aktivita se zjištuje a může sloužit jako míra vzniklého množství rscu-PA. Přirozeně se ale může zjistit výtěžek proteinu předstupně popřípadě rscu-PA a tím i výnos exprese,například denzitometrickým vyhodnocením elektroforetického gelového dělení veškerých proteinů»

Nyní bylo s překvapením zjištěno,že pomocí plasmidů transformovaných bakterií vyrobených podle vynálezu se dosáhne mnohokrát vyššího výsledku exprese než s identickými kmeny transformovanými plasmidy známými ze stavu techniky.Plasmidy vyrobené podle vynálezu jsou v souladu s tím co bylo uvedeno lepší než všechny dosud známé plasmidy pro získávání rscu-PA popři· pádě jeho proteinu předstupně.Pro úplnost je nutné se zmínit o tom,že se se o sobě známým způsobem pomocí jíž shora pro analytické úošLy zmíněným štěpením rscu-PA,na· příklad s plasminea,může získat xtcu-PA i v technickém měřítku,poté co se v důsledku předloženého vynálezu stal

-4rscu-FA dobře přístupným.

Plasnidy,které lae získat podle vynálezu se dále vyznačují tím, že jejich operou vykazuje regulovatelný, popřípadě syntetický promotor, Shine-halgarovu sekvenci,účinnou jako vazné místo ribozomů,startovací kodon,syntetický strukturní gen pro sou- FA a směrem dolů cd strukturního genu alespoň jeden termit nátor.S výhodou jsou přítomny dva po sobě následující terminátory,u nichž se zejména jedná o trp A termináter a/nebo tet A/orf 1 terminátor z Tn 10,srovnej Schollmeier et el. /6/.

U regulovatelného promotoru se jedná zejména o Trp-promótor nebo Tac-promotor.

V kontrolním regionu plasmidu vyrobeného podle vynálezu činí vzdálenost mezi Shine-h&lgarncvou sekven cí a startovací® kodonem 6 - 12 , s výhodou 8-10 nukleotidů·

O konstrukce strukturního genu ,který lze zavádět do nových plasmidů se vestavují s výhodou sekvence bází kódující právě přítomné aminokyseliny ,uvedené v následující tabulce.Iři tom nemusí být ve strukturní® genu splněny současně všechny tyto znaky·

aminokyseliny	triplet
arginin	CG!
leuoin	GIG
valin	GIT
prolin	CCG
glycin	GGT
Sa druhé straně jo při výstavbě strukturního genu
výhodné zabránit tak dalece	jak jen je to nožné použi-
tí následujících kodonůjpze dále uvedené aminokyseliny
/přiěemS opět nemusí být splněny ršrrkuy tyto znaky pro
všechny aminokyseliny/:
kodon,kterému je	amishkyselina
třeba se vyhnat
A$A	isoleucin
G$a	valin
CCG	'prolin
/ MG	. lysin
AGG»ÁGA,GGGtCGA	arginin
GGátGGG .	glycin

Výběrem kodonů podle vynálezu pr© jednotlivé aminokyseliny ve etrukturním genu jakož 1 vpředu uvedených znaků kontrolního regionu se ©o možná nejvíce zgbrání vytvoření stabilních sekundárních struktur mezi strukturním genem a kontrolním regionem.

Iro získání syntetického strukturního genu se nejdříve syntetizují jako monoprovazec oligonukleotidy v úse * cích o 40 až 80 bázích. S výhodou se tyto vyrobí v l^unoXe» kulovém měřítku metodou pevných fází popsanou Adamsem et al,/7/ pomocí DBA-syntetizeru /model Biosearch 8600 řir44.

my Bew Brunswick Scientiíic Co./ Jako monoměrní synthony se pří tom používají v obchodě běžné ^-kyanoethylea chráněné diisopropylaminofosforamidity nyní potřebných descxyribonukleotidů. ío odštěpení od nosiče se koncové provazce chráněné ještě tritylem deionizují za sterilních podmínek gelovou filtrací a předčistí a potom se ve dvou krocích podrobí prvnímu dělení pomocí HP10 s obrácenými fázemi /reversed phase”-11110/.Získaný hlavní produkt se detrityluje a po dvou dalších čistících krocích pomocí ZFIG s obrácenými fázemi / reversed pkase-EřLC/ se získá požadovaný oligonukleotid vysoce čistý, jak to . ukazuje gelová elektroíoretická analysa /1AGE/.

až 9

». Ze skupin/těchto jednotlivých provazců se potom získá ©si £00 nukleotidů dlouhých dvouprovascových ťragraentů tím,že se jednoprovazcové oligonukleotidy,které nestojí na konci na konci 5'íosíorylují a nyní získané komplementární provazce ee anelují a ligují s oligonukleotIdy,které stojí na konci. Γο ligaci se vytvořené

-7klonování schopné dvouprovazcové fragmenty použijí potom ve vhodných linearizováných vektorech.Další postup vyplývá z níže uvedených příkladů.

Zkratky použité v předložené přihlášce vynálezu mají následující význam s bp; párové báze

232 52 : aulou vojsextič firmy whaiman

2DTA: ethylendiamintetraoctové kyselina

ITGTí isopropyl-^-h-thíogalaktopyranosid

TAG2 : polyakrylamidová gelová elektroforéza

TU : Tloug unita ’

SDSí natriusdodecylsuliat *

S.D.-sekvence: Shine-Palgarnova sekvence

Tris-HCl í tríshydrorymethylaminoaethanhydrochlorld Tween 80 ; polyethylenoryd/20/sorbitaňmonooleát íro konstrukci nových plasaidů podle vynálezu se vychází s výhodou od komerčního plasmidu pBS 322 /4363 bp/. S výhodou se z tohoto eliminuje nic/bom-region a/nebo gen rezistentní vůči tetracyklinu.Tři tom není nutné gen s resistenců vůči tetraoyklinu dokonale odstmanít,spíše postačí,když se $. odstraní do té míry že plasmld nepropůjčí jím transformovaným kmenům balete* rií žádnou xesistenci vůči tetracyklinu.Tomocí těchto opatření /odstranění» aie/boa regionu a alespoň části »8genu reslstentnífco vůči tetr&eyklinu/ se získá tak zvaný **vysoce bezpečný pl&smid.

Výhodná strategie konstrukce nového plasmidu podle vynálezu,vycházející ,jak je vpředu uvedeno, od modifikovaného plasmidu pBB 322 / nebo jiného zde uvedeného předem známého plasmidu / spatřuje další krok ve vestavbě syntetického “Multi eloníng sítě’ mezi místa řezu Eco RI a Hind III. Tento multi cloning site /srovn. obr, 2/ vykazuje pevně urěenýjá sled míst řezu,mezi těmito se nacházející báze jsou voleny libovolně s výjimkou sekvence mezi Xba I a Kde I,která obsahuje vazné místo ribozomů /'Shine-Dalgornovu sekvenci/ z B. subtilis lyl .©peronu 5^-AAGGAG-3/4/ jakož i pevně stanovenou vzdálenost mezi S.E, sekvencí a startovacím kodonem ATG. Báze BAAAT následující po sekvencí S.h. jsou převzaty ze /4/ a pomocí GATATG místa řezu Sde I spojeny. Tím tedy činí vzdálenost mezi S.h. sekvencí a ATG 8 párových bází.Vzdálenosti mezi jednotlivými místy řezu Multi olomlng 'site by měly s ohledem na technickoklonovací důvody mít délku minimálně asi 20 nukleotidů, ěímš se usnadní oddálení mez i fragmentů,

Pomocí tohoto Multi cloning site se do plasmidu zavedou řezná místa,-která » výhodou po vestavbě trnaskripčního terminátoru- umožní poposobě následující stav9 bu dílcíoh sekvencí seu-Ta strukturního genu, s výhodou počínaje od řj^/^Xí^^onečného G požadovaného proteinu,tedy od konce 3'provazce DBA strukturního genu,který se ®é vyrobit, jakož i vestavbu například syntetického plaamidu nebo i plasmidu isolovaného z jiného plaeEidu nebo i komerčního Trp promotoru.Dokonalá sekvence nukleotidu takto získaného scu-HA strukturního genu je s údaje® aminokyselin odpovídajících jednotlivénu kolonu znázorněné na obr. 15.

Jiné z nových plasmidů se dají podle vynálezu získat z plasmidu konstruovaného jak bylo vpředu uvedeno , například tí®, že se řezy s Eco El a Hind III získá syntetický scu-PA strukturní gen se všemi regulačními jednotkami a potom se vestaví do jiného plasaidu,který je schopen ©é v nnterobakteriaeeích, zejména v£. coli autonomně rozmnožovat,a který se aa tímto účele® lineami zuje a zkrátí řezy s Eco Bi a Hind III. V principu em stejnýmzpůsob, ale za využití míst řezu Bco Bi a Iba se dá vyměnit například Trp promotor za Tac promotor / a obráceně/ v plassidu získané® podle vynálezu,

Analgioky se může vyjít také od jiných známých plassidů,které obsahují singulární £co Si a Hind III místa řezu, jako například pUC 9, pUC 12,pUC 13,pUC 18, pUC 19 a jiné, ϊ

*10pové plassídy s prodlouženouvzdáleEaatí ses i Shine-DslgarBoVGu sekvencí a startovacím kodonem a TG se dají podle vynálezu získat tín,že se plasaid, konstruovaný jak byl© shora popsáno,ve kterém uvedená yzdálď' , .......... __________________--Λ-------- ~ - - -------------2 činí například 3 nukleotidů, řeže a Kde I, rszultu' . / <·.- jíex ní sta řezu se doplní a po tes·, se vínik*'' < ' _jíeí blunt-konce ligu jí,'· čímž se vytvoří pož-r-’ _r klovaný nový plasBšid,ve kteres v . d.2- sekvencí a startovacím kodoneis x například 10 nukleotidů.

Jak již bylo-řečeno .vykazují ’ bakterie tran.sfor.movane plasmídy vyrobenými podle .vynálezu mnohonásobně vyssí. expresní výtěžek' aer bylo sošné dosáhnout u těch. u kterýhh byla transformace 'prováděna' plassiď ý známými ze stavu techniky.Cbvzlašbě vhodné hostitelské organihiay pro plasnidy,které lze získat podle vynálezu,jsou fase* dy druhu .2» coli a příbuzných ůnterobakter.iaeeae, jako například kmeny íseudojaonas,.S&lwonella,Bnterobacter > Klehsiella nebo Serratia.

Výhodné, hostitelské ..organismy jsou kmeny druhu K » coli jako například 3. eoli GRÍ-l a zejména .fasety B* eolí podskupiny £12 jako například >. coli K12 JM01 /k$GQ 33376 ./, 3. coli £12 JM103 /ATCC 39403/, 2.coli K12 JM 1©$ /bSM 4162/, S.coli -£12 - kmen ATCC 33-446 nebo i £«.. celí £12 PE1 /AICC '33349/$?

-11Zavedení exprese do expresních systémů L. coli , které obsahují Tac promotor, se může provádět například přídavkem laktózy nebo odejmutím glukózy s vý hodou ale přídavkem isopropyl-p-3-thiogalaktopyranosidu. Jestliže je ale· v plasmidu přítomen Trp promotor, pak se indukce provádí s výhodou kyselinou indolylakrylovou,indolyloctovou nebo indolylpropionovou. Samozřejmě se mohou použít stejným způsoben i jiné známé induktory. '

Po indukci a dosažení předem stanovené hustoty buněk, se buňky odstředí a zbytek po odstředění se po rozmíchání ve vodném roztoku soli,převede například do homogenizetoru,ve kterém se buňky pomocí tlakového rozdílu nechají popraskat. Po opakovaném odstředění se získá ve zbytku protein rscu-PA předstupně vcdleve vodě nerozpustných zlomků buněk atd, Opracováním s roztokem guanidhydrochloridu přejde protein předstupně do· roztoku a po novém odstředění se zby* obsahující lý roztok zpracuje s redox systémem /například/redukovacýjá a oxidovaný^ glutathion/, čímž se vytvoří přirozené konforma.ee t.zn, vyvolá se tvorba požadovaného rseu-ΤΔ. Tento je po to x přítomný v reakční směsi v rozpuštěné formě· a může se izolovat obvyklými čistícími kroky / například chromatografií a ná-12sledující lyofilizaeí / v čisté .formě.

pro analytické účely se s výhodou postupuje ták, že se kmeny 2. coli transformované plasmidem,který se má zkousat, fermentují a po dosažení předem stanovené optické hustoty suspenoe buněk se exprese rscu-PA proteinu předstupně indukuje vhodným induktorea.ro odpo * vídající době trvání fermentace se alikvotní části odeberou a z těchto částí odstředěné buňky se potom rozloží lysozyae® / 1 ae lysozymu pro 50 ml 50 cK Sris-hydro chloridového pufru s pH 8,0, 50 wM BBTA a 15 # sacfea rózy/. Homogenlsát lyžovaných buněk se solubilizuje ve 4 až 5 M roztoku guanidinhydrochloridu a po zředění na 1,2 M guanidinhydroehlorid se zá přídavku redukčního činidla /glutathionu,merkaptoethanolu nebo cysteinu/ podrobí na dobu 2 až 5 hodin reakci zpětného řasení /srovn. B. Maklér et al. in /11//· Takto získaná rsou-PA. s jením řetězcem se po přídavku plasminu převede na rtcu-PA se dvěma řetězci,jejícá aktivita se potem určuje se substráte» S2444 / pyroGlu-Gly-Argp-nitroanllid| Sabi Diagnostika,Švédsko/,který se dá odštěpit pouze aktivními urokináeasí se dvěma řetězci. Tato aktivace rscu- PA plasslnea se provádí v 50- Trie*pufra,12 mtó natriuschloridu,0,02 #

Tween při pfi 7,4 a 37 °0,Poměr rscu-PA k plasminu by měl činit asi 100 až 1500 k 1 , vztažen© na mola-13ritu, nebo asi 8.000 až 36*000 ku 1 vztaženo na jednotky enzymu. Testovací inkubace se provádí v 50 zsld Trispufru , 33 eM natriumchlorldu při pH 8,8 a v přítomnosti. 0,36 aprotinu / pro inhibici plasminu / a 0,27 nK S 2444 při 37 °C, Vždy podle obsahu rscu-ΪΑ ve vzorku se reakce zastaví po 5 až 60ti minutové inkubaci přídavkem 90/ kyseliny octové a při 405 nm se změří oxtihkce. Podle údajů výrobce substrátu S 2444 předsta vuje p-ML tomto postupu směna extinkce CyO5 za minutu při 405 na aktivitu 25 Plur -jédnotek/ml testovaného roztoku.

Výtěžkyrscu-PA, které se získají při použití různých plasmidů vyrobených podle vynálezu v proteinu předstupně získaném u různých bakterií,byly reprodu kovány na cbr. 10,12 a 14,

Jak vyplývá z obr. 11, jakož i dále uvedených xídajů níže následujících příkladů- zejména tabulky 1 a tabulky 2 -,vyvolávájí plasmidy,které lze získat podle ' vynálezu s výhodou ve kmenech h. coli tvorbu předstupně proteinu rscu-PA a výtěžkem exprese 10 až 25 / hmot.* zejména 14 až 20 fy hmot.- vytvořeného celkového proteinu. Výtěžek exprese je tedy při použití nových plasmidů při nejmeněíiE 10 až 15krát vyšší než výtěžek získaný se znýmými plasmidy ,jako například >D£ 54 trp 207 -1· —14—

Přiložené výkresy a jejich obr. znázorňují:

Obr. la a 13 : konstrukci plasmidu pBB 153 z ko * merčního plasmidu pBB. 322. Při tom se poposobě oddálí nio/boa -region a velká část genu resistentního vůči tetracyklinu.

Obr. 2 : sekvenci nukleotidu syntetického aulti eloning site.

Obr. 3 s konstrukci plasmidu pBB 153-01. Znázorněna je vestavba syntetického multi cloning site do plasaidu pBP 153 mezi místy řezu Bco BI a Hind III.

Obr. 4 s konstrukci plasaidu pBJ 153-01 2. fragment CIA I x Hind III se nahradí odpovídajícím fragmentem ’ϊ 2 pXasmldu pBT 61 /5/, na kterém se nachází tet A/orf I terminátor z Tn 10 /6/.

Obr. 5a až 5g j sekvence nukleotidu syntetických fragmentů pro gen kódující humánní seu-BA / jejichž vepopaana stavba je vytvoření strukturního genu pro scu-BA v plasmidu podle vynálezu, vycházeje od plasoidu pBB 153-01 1 v příkladech ld až lf a znázorněna na obr.

’ i

6,7 a 9,

Obr. 6a až 6o : konstrukci placmidu pBB 158-C2 1' až pBB 153-06 T vestavbou fragmentů oligonukleotidu M 4 až :·> 8, po Čí na je C-kcccem požadovaného proteinu /v .

souladu e 3'konce© PBA provaze© /»po Sinaje plasmidem p33? 15 8-01 i.

Obr. 7a až 7c : konstrukci plasmidu pEP 153-08 I pomocí pomocné konstrukce v plasmidu pUC 19 / srovnej příklad le/.

Obr, 8; sekvence nukleotidu syntetického irp-promotoru.

Obr, 9í konstrukci expresního plasmidu pro pro tein předstupně humánní rscu-PA,pSE 160. Strukturní gen pro scu-IA je znázorněn černým pruhem mezi místy řezu Kde I a Cla I. ·

Obr. 10 ϊ Výtěžky exprese proteinu předstupně humanní/jí rscu -PA / stanoveno jako aktivita rteu-PA po zpětném zřasení a aktivaci / v různých kmenech n.

coli transformovaných pBE 160 / o-o / nebo plaorni* des pUE 54 trp 207-1 /10/ /»—.....-» / za kontroly Irppromotoru v závislostí na čase po indukcí kyselinou indolakrylovou k časovému okamžiku 0. Udány jsou aktivity rtcu-PA zjištěné se substrátem S 2444 v Ploug-Units na ml fermentačního media s optickou hustotou rovnou · pří 573 nm.

Obr. 11 ; donsitogram S03-PAGB proteinů z &, coli transformovaných pEP 161 K12 diú 103-buněk po feraenta16 ei před /A/ po 6 hodin po přídavku /B/ kyseliny indolakrylové jako indukioru.

Obr, 12í výtěžky exprese proteinu předstupně humánního recu-PA / stanoveno jako rtcu-PA aktivita po zpětném zřasení a aktivaci/ v E. coli & 12 J.CLO3 transformováno pBP 171, t.sn. sa kontroly Tac-promotoru.Indukce se prováděla v Sase 0 IPTG. Uvedena je zjištěná aktivita mteu-PA vůči substrátu S v Ploug -Units na 1 ml fermentačního media s optickou hustotou rovnou 1 při 578 nm.

Obr. 13 í Prodloužení vzdálenosti mezi Shíne-Eal:· garnovou sekvencí /82/ a startovacím kodonem AíG z 8 na 10 bází vyplněním giíst řezu lite I a následující ligací vzniklých blunt-konců»

Obr, 14 í výtěžky exprese proteinu předstupně humánního rscu-PA / stanoveno jako rteu-PA aktivita po zpětném zřasení a aktivaci/ sa kontroly promotoru írp v E. coli GfíT-l transformováno plasmidem pBE 161 /0----0 / i

nebo pBF 163 Z^””^/. Indukce se prováděla kyselinou indolakrylovou bezprostředně po.časovém okamžiku 0.

Uvédeny jsuu rtcuPA aktivity zjištěné se substrátem S 2444 ,v Ploug- Units na ml fermemtaSníko média s optickou hustotou rovnou 1 při 573 na,.

Obr, 15a a 15b s dokonalé nukleolidová sekvence scu-l’A strukturního genu s údajem aminokyselin odpovídajících. jednotlivým kodcnúm.

Restrikčni enzymy používané v příkladech provedení se běžně prodávají / srovn. např, Sachr. Chem. lechn Xab. & , 939 »1937/,

Kultivační mediu© používané v příkladech pro selek ci klonů, obsahuje v Utrus 7,8 g peptonu z masa, 7,8 g peptonu z kaseínu,10 g extraktu kvasnic, 5,6 g natriumchloridu a 10 g glukózy. Toto médium se za tepla doplní 10 g agaru na litr a nalije se ns desky.

Příklad 1

Konstrukce expresního plasmidů pBP 160 pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scu-lA- genem za kontroly Trp promotoru a/ Konstrukce plasmidů pBK 153 i/ 2 plasmidů pBR 322 / Pharmacia ,č. 27-4902,4363 hp/ se nie/bon region ,který se nachází mezi bázemi

2207 a £263 /1/ oddálí následovně / srovn. i obr. 1/ pBB 322 se u báze 2298 rozřízne hde I a tím linearizuje pomocí

Přečnívající konce se vyplní přes řill in ” reakce , a tím se získají blunt - konce,Potom se rozřízne u báze 2068 s Evu II a oba blunt konce zbylé části pBfi 322 se opět ligují pomocí běžné techniky s 14 ligázou.lo-13tom se ligov&ný podíl transformuje v kompetentní buňky B. coli £12 1C3 /AICC 35403/ /3/* Transformované buňky se kultivují na mediu za přídavku 150 pg ampicilínu/ial. Ze získaných klonů se vyberou ty,které obsahu jí plasrid pBP 157,který se liší od výchozího plasnidu pBK 322 a/ Pst I x EspíS II b/ Pst I x Bal x Bal-, c/ Pst I x Ava I-fragrenty menšími o 228 nukleotidů. Obě singulární místa Pesu PvuII a Kde I obsažené v p3B 322 nejsou již v plasxiéu pBP 157 přítomny.

ii/ 2 pBP 157 se se oddálí velká část genu resistentního vůči tetraeyklínu říznutím s -uco' HV x hru I a následující ligaeí vznikajících blunt konců. Po trcnsfcrmaci v £. coli £12 Já 103 a kultivací na médiu se 150 ,ug aapícílinu/ml se získají klony, ze kterých se vyberou ty,které obsahují plascid pBP 153. Tento je o 787 nukleotidů menší než pBP 15^ a liší se kromě toho tis ?e chybí, ní sto řezu Bas HI. Transformace kmenů bakterií pBP 158 neposkytuje tímto žádnou resietenci vůči tetraeyklínu· b/ konstrukce pBP 153-01, vestavba synteriokého site s velkým počtem klonů

Z pBP 158 se řezem o Bco SI x Hind. III oddálí fragment obsahující 31 nukleotidů a do mezery se ligu je syntetický multi cloning site,jehož sekvence je znázorněna na obr. 2. Po transformaci podílu ligace v E. eoli E12 CM 103 a kultivaci na médiu 150 ^ug ampicilinu /ml se vyberou ty klony,které obsahují plasmid pBP 153*01. Tento se liší od pBP 153 přídavnými singulárními místy řezu Xba I,iíde I,Sac I, Lag I,

Κρη I, Spe I jakož i druhým Pst-I místem řezu,/obr.

3/.

c/ konstrukce pBB 158 01 2, vestavba transkripčního terminátoru ..

Z pBP 153-01 se oddálí fragment Cla X x Hind XII' mníti cloning site a nahradí se fragmentem Cla I x Hind III z pBT 61 /5/, na kterém se nachází tet A/»rf I terminátor z Tn 10/6/.

Po transformaci do kmene £. coli E12 «ΠΊ -103 a kultivaci na médiu 150 yng ampicilinu/ml se vyberou ty klony,které obsahují plasmid pBP 153-01 I. .Tento se liší od pBP 158-01 fragmentem Cla I x Hind. III ,který je větší o 297 nukleotidů./obr. 4/.

&/ vestavba .syntetického fragmentu Ά 4 - H 8 pro · scu-PA- gen, konstrukce plasraidu pBP 153-02 T - pBP 15S-06-T

Všechny syntetické fragmenty jsou popsány na obr· a · 5 g. Tyto jsou vloženy do příslušných vektorů jako fragmenty dvojitých provazcú o délce asi 200 nukleotidů* Za tím účelem se vektory s restrikčními enzymy, odpovídající právě uvedený® místům ře8U_trozřížnou a oddělí se od fragmentujkterý. o© ®á oddálit elektroforásou

20na agarosovém gelu, elektroelucía čištěním přes Ďh 52. Potom následuje lígaoo s příslušným dvouprovazcovým sys tetický a fragmentem pomocí i4 ligázy, transformace v B. coli K12 103 / obr. 6a aš 6c/ & selekce na médiu obsahu jícítn acpicilin.

f/ Ligace fragmentu M 8 mezi Bam HI a Cla I v plas mldu pB? 158-01 T. .

Vznikne plassid pB? 153-02 X.

Olígonůkleotid 019 kóduje C-terminální sekvenci sou -PA. Za Stop-kodonem IAA se nachází místo řezu HSe I,. následované přídavnými transkripčními terminál nimi sekvencemi trpA terminátoru /3/ e.Ž Clo. I, i i/ liga co fragmentu K 7 mezi Spc I a Bam BI v plas-i:u pí? 153-02 ϊ ,

Vznikne plasvid pB? 158-03 T.

ííi/ lígaoo fragmentu fei 6 mezi Ipn I a Spe I v plassidu pB? I53-O3 I.

Vznikne pB? 153-04· Ϊ.

i v/ ligaee fragmentu fí 5 mezi Lag I a ICpn Iv plasmidu pBB 158-04 T.

Vznikne plasmíd pB? 158-05 T.

v/ lígace fragmentu M 4 mezi Sac I a Bag 1 v plasmídu pBB 158-05 T.

-21Ze získaných klonů i - v se vyberou ty,které se qó předchůdců, liší přítomnosxí vestavěného nového fragmentu v přezkoušené správné sekvenci.

e/vestavba syntetických fragmentů M 2 a K 3 pro scu-IA gen; konstrukce pBP 158-03 T

Vzhledem k. tomu, že pro vestavbu fragmentů íí 2 a K 3 je nezbytný Pst I-řez a na piasmidu pB? 153 až dosud pro tento účel používaném se nachází ještě jedno místo řezu Pst I / v genu rezistentním vůči ampicílínu/, které by při následujícím klonování ručilo, postupuje se následovně / obr. 7 a až 7c/:

i/ Z plaomidu pUC 1@ ,který se obvykle prodává / např, Pharmacia/ se nultí oloniag sítě a dodatečně 212 nukleotidů ve směru vzůru po proudu oddá&í jako fragment Kde I x Hind III. Do.vzniklé mezery se potom liguje syntetickoý multi cloning site s plasmidu pBP 158-04-3 Ϊ jako.fragment Kde I x Eind IXI. Tento plasmid pBP 158-04-3 Ϊ se získá z plasmidu pBP 158-02 T / sřovn. příklad Idí / vestavbou fragmentu S 6 oligonukleotidu a odpovídá plasaidu pBB buňkách

158-04 T bez fragmentu íí 7. BO transformaci v/2. coli £ 12. JM 103 a kultivaci na médiu se 150 pg anpicílinu/ml se vyberou ty klony,které obsahují plasmíd pUC 19-04-3. Igmto se liší od >00 19 přítomno-22 stí fragmentu Kde I x Hind III o délce 712 nukleotidů.

ii/ Z pUC 19-C4-3 se oddálí fragment Pst I x Sac I, isoluje se linearizovaný vektor a liguje se s fragmentem oligonukleotidu X 3. Γο transformaci v 2. coli K12 JM 103 a kultivaci na mediu se 150 |ig atopicilinu/sl se vyberou ty klony., které obsahují plascid pUC 19-07 . Tento liší se od pUC 19-04-3 fragmentem Pst I x Sac o délce 139 nukleotidů , který obsahuje fragment ?! 3 se správnou sekvencí.

iii/ Z plasmidu pUC 19-07 ,který byl vpředu popsán se oddálí fragment I x Pst a do mezery se liguje fragment £í 2, 2o transformaci v 2, coli K 12 JI5 103 a kultivaci na mediu se 130 yUg aa/picilinu/ml se vy berou ty klony,které obsahují plasmid pUC 19-08.Tento se liší od pUC 19-07 přítomností Kde I x Pst 1 frag mentu M 2 o délce 246 bp se správně přezkoušenou sekvencí.

iv/ Zplasmidu pUC se oddálí fragmenty a K 3 jako fragment kde I x Sac I a do větší ěásti/získané po Pesu s Kde I x Sac I se liguje.Po transformaci v 2. coli £12 JM 103 a kultivaci na mediu se 150 fug ampicilinu se vyberou ty klony,které obsahují plasmid p32?

23153-08 Τ· Tento se liší od pBP 158-06 přítomností Kde 1 x Sac I o déloe 435 nukleotidů.

f/ Konstrukce plasmidů pBS¹ 160, vestavba syntetického Trp .promotoru

Sekvenee Trp promotoru popsaná pod /9/ se převezme až k místu řezu Xba I a na konci 5*se prodlouží sekvencí 5^- AATTCTGAAAT-3*. lim βθ konstruuje místo řezu JEeo-BI /obr. 8, fragment Π 1 /. Jednotlivé pro vaze© 021 a 021 A se anelují a ligují do plasmidů pBE 153-08 X říznutého hco hl x Xba X /obr. 9/. ío trans formaci do B. coli £12 JM 103 a kultivaci na médiu se ISO PS ampie’linu/ml se vyberou ty klony,které obsahují pB> 160. Blassid pB3? 160 se liší od všech shora popsaných předchůdců tím,že jím transformované kmeny bakterií B, coli sa přídavku kyseliny imdolakrylové extrimují protein předstupně xesu-BA.

g/ Test na expresi pBB

Různé kmeny coli transformované plaomiden/160 ,například B. coli GR'í-1, E.coli £12 JIO.03 jakož i B, coli £12 Ai'CC 31446, se za stejných podmínek fermentují v médiu sestávajícím se 38 xsíi amoniumsulfétu, . 56 mM fosforečnanového pufru pH 7,0, 1 ®M magnesíwasulfátu, 1% kvasniěníko extraktu, 1/ glukózy,které obsahuje 150 mg axapieilinu na litr, a indukujeýčj mg

-24—· kyseleny indolakrylové exprese proteinu pře·-stupně rscu-BA. řro srovnání se ^>ředu uvedené- kmeny transformují předepsaným plasmidem,který obsahuje gen pro lidskou prourokínézu z banky clhA, získaný z De* troit 562 buněk aíffiA /10/, a nese označení pDK 54 trp 207-1, a potom se za stejných podmínek fermentuje a podrobí indukcí.

Před indukcí a každou hodinu po indukci se podobu celkem 6 hodin buňky odpovídající'suspensi buněk s optickou hustotou /00/ 1 odstřelují při 578 nm a pro testování še použije výtěžek exprese.

ii/ zpětné zřasení proteinu předstupně na rscu* PA, jeho štěpení na rtcu-fA a měření aktivity

Odstředěné buňky se, jak je zde dále shora popsáno, se rozloží lysosymem a potom se homogenát rozložených buněk použije jak je slora popsáno pro měření aktivity.

Zjištěné výtěžky exprese po měření aktivity rtcu-TA, vytvořeného z rscu-BA / získaného z proteinu přestupně/ jsou znázorněny na obr. 10. Z toho vyplývá, še kmeny £. colí,které byly transformovány plasmi* dempBP 160 poskytují 10 až 15krát vyšší výtěžek exprese než stejné kmeny S. coli transformované plas-25ciidea pUK 54 trp 207-1 /10/ známým z literatury. Kromě toho vyplývá z toho,že výtěžek exprese ve všech kmenech se v závislosti na plasmidu použitém pro trans· formaci pohybuje při přibližně stejných hodnotách, tj.> že zejména kmeny trasnformované plasmidea pBP 160 / ne* závisle na jednotlivém kmeni £. coli / poskytují vždy několikanásobně vyšší výtěžek exprese než identické kmeny transformované známým plasmide© pUK 54 trp 207-1»

Příklad 2 a/ Konstrukce expresního plasr.idu pBP -161 pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scu-BA genem za kontroly promotoru Trp

Blasmid 322 se řeše Bco El a Hind XII. Vznikající fragment o délce 31 nukleotidů se oddálí preparativní elektroforézou na agarosovém gelu. Zbývající podíl pBR 322 se eluuje z gelu olektroelucí a čistí chromatografií přes D£ 52. pEE

Plassid/160 /příklad lf/ se rovněž řeže Bco El a Eind III a fragment £co EX x Hind III o délce 1684 nukleotidů,který obsahuje syntetický scu-EA gen se všemi jednotkamiregulace /promotor Irp/ se oddělí elektroforézn na agarosovéxa gelu a eluuje a ěistí jak jo shora popsáno»

-26Takto získané fragmenty se ligují obvyklým způsobem ligásou T4 a potom se v 1. coli I£12 JL1 103 transformují.Po báttivaci na nc-diu se 150 jUg ampici linu/ml se vyberou ty klony,které obsahují fragment Sco Eí x Hind III o délce 1634 nukleotidů a po přídavku kyseliny indolakrylové produkují protein předstupně rson-TA. Tyto klony obsahují ;lasnid phl 161, b/ Test na expresi

k. coli GHirl, i. coli K12 Jk 103 a 2. coli 1 12 ATCC 31 446 se transformují pBT 161 a pston se fermentují způsobem popsaným v příkladě lg/ a výsledek exprese se testuje. Výtěžky proteinu předstupně rsouΓΔ se určují jako rtcu-ϊΑ aktivita,po 1 až 6 hodinách po Indukci jsou srovnatelné s hodnotami výtěžku znázorněnými na obr. 10 pro použití plasnidu pBP 160 pro transformaci.

Buněčná peleta získaná odstřenováním analogicky jako v příkladě lgi/ so může rozložit i vařením v 0,25 M Tris HC1 pufru,pE 3,0 se 4 SDS,1 £ cerkaptoethanolu ' a 20 š® glycerinu,Takto rozpuštěné proteiny se oddělí SDS-íáGE a zviditelní se obarvením Ooomassieblue. Obarvené gely se vyhodnotí densitonetričky a plochy pod píky se integrují«Bodíl proteinu předstupně rscu5A vytvořený po ind^uci © kyselinou indolakrylovou rsx-» { * se z lištuje odečtením plochy pásu identifikovaného jako protein předstupně před indukcí od pasu zjištěného po indukci .Na obr. 11 je znázorněn denšitogram proteinů získaných z buhěk E. coli K 12 PS 103, V předloze né® příkladu Siní podíl proteinu předstupně rscu-PA pc indukci 17,9 / hmot. veškerého bakteriálního proteinu.

Další příklady jsou uvedeny v tabulce.

Tabulka 1

Podíl proteinu předstupně rscu-PA v celkovém proteinu v procentech / kmen 1. coli transformováno pBP 161 pDK54 trp 207*1 /30,

X 12 ATCC 31446	14	1,5
K 12 JK 103	17,9	1,9
GfíT-l	17,8 -	1,7

Příklad 3

Konstrukce expresního plasmidupro protein předstupně rscu-PA se syntetický®. scu-PA genem za kontroly promotoru trp vpER 322 s deleeí v genu rezistentním vůči tetraeyklinu a/ Konstrukce plasmidu pDR 322 čel

Plasaid pBfi 322 se řeže lico BV a Kru I, vznikající fragment velikosti 737 nukleotidů se oddálí elektro*

-28forézou na agorosovém gelu, zbytkový podíl pBR 322 se eluuje z gelu elektroelucí a čistí ae přes D±. $2.Konce blunt pHE 322 Eco BV x Kru 1 zbytkového podílu se ligují obvyklým způsobem T4 ligázou.lo transformaci v

B. coli K12 JH 103 a po kultivaci na médiu se 150 pg ampicilicu/ml se vyberou ty klony,z nichž alikvotuí část po přenesení na medium a 25 tetracyklinu/ml na tomto neroste,t.j. nemá resistenci vůči tetracyklinu-Klony obsahují plasmid pEB 322 del,který se liší od pBK 322 tím,že je o 787 nukleotidů menší a nelze ho ji? řezat Leo RV a Kru I.

b/ konstrukce plasmidu pBB 162 pBR 322 del se >eže Eco hl a Hind III. Vznilfající fragment o délce 31 nukleotidů se oddělí preparativní elektroforézou na agarosovém gelu, zbylý podíl pBB 322 del se eluuje z gelu elektroelucí a čistí se přes DB 52.

stejným způsobem pBP se z-íateá/Bco Rl x Hind III fragment s délkou 1684 nukleotidů,který obsahuje syntetický seu-BA gen se všemi regulačními jednotkami /promotor trp/.

Oba fragmenty se llgují obvyklým způsobem ϊ'4-ligázou a potom se transformují v buňkách i.cůi K12 JM 103·* lo kultivaci na médiu 150 ampicilinu/ml se vyberou klony,které obsahují fragment sžinn RQo Rl x Hind III o délce 1654 bp a po přídavku 62 pg indolakxylové kyseliny/ul produkují protein předstupně -rsou-PA. Tyto klony obsahují plaonid pn? 162.

c/ Test exprexe

2. coli GET-l se transformuje p2B 162, a potom se fermentuje způsobem popsaným v příkladu lg/ a výsledek exprese se stanoví testem. Výtěžek proteinu předstupně rscu-ΧΆ stanovený 6 hodin po indukci činí 13C0 10/ffiX buněčné suspense s ortiekou hustotou 1 s je srovnatelný s hodnota®! výtěžku znázorněnými ns obr. 10 pro expresi po transformaci x., coli Ghi-1 a plasniden p2F 160.

Příklad 4 a/ Konstrukce expresního plasmidu pl! 171 pro protein předstupně rscu-PA se syntetickým scu-lA genem za kontroly promotoru Tac

Jlasnid pBT 162 se řeže ico SX a Xba I. Vznikající fragment dlouhý 74 nukleotidů se oddělí prepa r&tivní elektroforézou na agar©sovám gelu,zbytkový podíl plasEidu se eluuje elektroelucí a potom se čistí přes £E 52.

plasmidu ptao SBT /bSK 5018/ se izoluje frag ment hco SI x Xba I,který obsahuje promotor Tac. X tomu se ptao SET xozřízně £eo fil x Xba I a fragment se

30oddělí preparativní 11GB.fragment se eluuje zahřátí© na 65 °C v amoniumacetátovém/srs pufru,pB 8,0, z mechanicky rozmělněného pol;_; akrylamidu a čistí se vícenásobnou extrakcí fenolem,který je nasycen 1 h Trispuíress, pE 8,

Oba takto získané fragmenty se ligují obvyklým způsobem T4 llgázou a potom se transformují v ώ. coli K 12 J'4 103. Γ-o kultivaci na médiu 150 jug ampiciiinu/ml se vyberou klony,které po přídavku IPTG produkují rscuΪΑ protein předstupně.Tyto klony obsahuj?' plasmid pBf 171.

b/ lest exprese

3. coli £ 12 díl 103 se transformuje phf 171, a potom se ^ermcntuje způsobem popsaným v příkladu lg/ a výsledek exprese se testuje. Indukce se provádí ale s IPTG / konečná koncentrace 0,5 mil/'.

Výtěžky rocu-lA proteinu předstupně , stanovené aktivita jako/rtcu-lA 6 hodin po indukci jsou znázorněny na obr,

12.Tyto jsou srovnatelné s hodnotami výtěžků znázorněnými na obr. 10 pro použití plasmidů pBl 160 ve stejném kmenu 2, coli.

Tříklad 5 a/ Konstrukce expresního plasmidů pBl 172 pro pro-31tein předstupně rscu-ΙΑ se syntetickým scu- PA ge ne® za kontroly promotoru xae v p£il 322 se daleci v genu resistentr.ío vůči tetracjklinu

Plasmid pBB 322 del / viz příklad 3a/se řeše Bco HI x Hind III. Vznikající fragment s délkou 31 nukleotidů se oddělí preparativní elektroforézou na ag&rosovéc gelu,zbytkový podíl pBB 322 del se elu uje z gelu elektroelucí a potom se čisti přes D£

52.

Z pBP 171 / píklad 4a/ se stejným způsobem zí ská syntetický scu-PA gen se všemi regulačními jednotkami /promotor Tac /.

Oba takto' získané 'ragsenty se ligují obvyklým buňkách způsobem lígázou Ϊ4 a potom se transformují v/B. co· li K 12 JH 103 .Po kultivaci na médiu se 150 pg a© picilinu/ml se vyberou klony,které produkuj í v přítomnosti 0,5 IPTG rscu-PA protein předstupně.Tyto klony obsahují* plasmid pBF 172.

b/ test exprese coli 212 dli 103 s© transformuje pBP 172, a potom se fermontujc způsobem popsaným v příkladu lg/ a testuje se výsledek exprese. Indukce se pro vádí ale s IřGT / konečná koncentrace 0,5 ra>l/. Výtěžky rscu-IA proteinu předstupně stanovené jako

-32aktivita rtcu-PA 3 až 6 hodin pc indukci činí asi 1100 W/mlbuněčné suopense s optickou hustotou 1 a jsou srovnatelné s hodnotami výtěžků znázorněnými na obr. 10 pro použití plasmidu pB3 160 ve stejném kemu L. coli.

Příklad 6 gněns vzdálenoctí mezi Ghinc Dalgarnovou sekvencí a startovací® koloně® v expresním plasiiidu pro rscu* PA protein předstupně

Ctartovací kodon Ak’G ve všech konstrukcích, popsaných v příkladech 1 až 5 je· součásti hdc I- ni sta řezu -CArAIG-. Kde I řeže sa první© A hexanukleoti dovou sekve.ei a poskytuje 5*konoe,které přečnívají o dvě báze.«Jestliže se konec 3'doplhí, t.j, konstruují se tak blunt- konce, a pak se znovu liguje,pro dlouží se dotyčná sekvence o 2, páry bází. Současně se elixinuje lide 1 ©ísto.dak je zřejmé z obr. 13,pro dlouží se v ta© znázorněných příkladech vzdálenost od S,2. sekvence až ke startovacímu kodonu o 8 až 10 párů bází. Déle je vysvětleno experimentální provedení na jedno© příklad:

a/ konstrukce plasmidu pB! 163

Plasmid pBP 161 se řeže Kde 1, a poto© se přečnívající konce vyplní Klenowý© fragmente© polymerá-33zy JSA I /2/. íotcm bq jKA liguje jako obvykle ligazou T4 a potom se transformuje v ±>, coli £ 12 Já 103· lo kultivaci ha mediu obsahujícím ampieilin se vyberou klony,které obsahují plasmid pBP 163. Tento se liší od pBP 161 že schází místo LSe I a přídavnými bázemi v oblasti vodícího místa Kde I / srovn. obr. 13/.

b/ test exprese

h. coli GI/1’ 1. se transformuje plasmidem p3? 163, a potom se fermentuje způsobem popsaným v příkladu lg/ a výsledek exprese se testuje.Výtěžky rscu-PA proteinu předstupně, stanovené po zpětném zřasení a aktivaci jako aktivita rtcu-BA pro ml buněčné suspense s optickou hustotou 1 až 6 hodin po indukci 62 mg kyseliny indolakrylové ,jsou uvedeny na obr. 14. Tyto jsou srovnatelné s hodnotami výtěžku znázorněnými na obr.

pro použití plaamidu pBV 160 ve stejném kmeni L. coli.

Claims (8)

1. Způsob výroby nových p.lasidú pro použití při získávání aktivátoru plarminogcnu,vykračující oc tím, že se do plac^idu pT£ 322,sc kterého byla odstraněna níc/bcxa-xegion a/nebc alespoň část genu resisten.tr iho vůči tctrccyklinu,®.ezí viste řezu kco El a hind XII vloží nultí clo‘ig-oite se eekvencí nukleotidů uve* děnou na obr. 2,která ®.á mezi místy řezu Xba I a l.de I Shine-· Balgarrovců sekvenci a ve vzdálenosti 6 až 12, s výhodou 8 a.ž 1.0 nukleotidů ,obsahuje startovací kodon ATS a a jejich pcrocí o sobě známá® způsobe® vestavěné jeden nebo dva transkripční terminátory,syntetické dílčí sekvence scu- íá strukturního genu, s výhodou počínaje od konce 3'strukturního genu, jakož i regulovatelný promotor a tak získá plssmidy,které vykazují následující znaky :

-35-..

a/ opéron plasmidu obsahuje regulovatelný promotor,Shire-lalg3xnovou sekvenci účinnou jako vazebné rísto ríbozoců, startovací kodon, syntetický strukturní gen pro urin-plasminogencvý aktivátor scuΓΑ* s jedním řctrsccm obsahující 411 zbytků aminokyselin a ve směru po proudu dolů od strukturního genu jeden.až dva terminátory, b/ plasridy jsou vhodné pro expresi nscu-lA pro* tcinu předstupně s výtěžkem exprese alespoň 10 $ hmot. celkového vytvořeného proteinu v inierobakte- . riaceae, s výhodou ve kmenech hscherichia coli,

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím,že jako regulovatelný promotor je vestavěn promotor Trp nebo Tac pomocí Mul ti eloning site.

3. Způsob podle bodů 1 a 2 , vyznačující se tító> Se jakc regulovatelný promotor se vestaví syntetický promotor Trp s nukleoiidovou sekvencí podle obr. 3.

4. Způsbb podle bodů 1 a 2 , vyznačující se tím, že jako regulovatelný promotor se vestaví promotor Tac z plasmidu ptač SET /ESM 5018/, •

5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako popesobé následující trenskripční terminátory vestaví terminátor trp A a/nebo tet A/orf 1 terminátor ζϊΗ 10 do ©peronu nových plasmtdů.

*» jfc··

6. Způsbb podle bodu 1, vyznačující oe tím, še sepomocí hulat/ c'oríú£ cite veotaví v dílčích krccích strukturní gen c< sekvencí nukleotidu podle obr.

15.

7. Způsob výroby nových plasmldů podle bodu 1, vyznačující so tím,že se *,co hl x Hind III fragment κ plašTÍdu zinkaného podle bodů 1 až 6 vestaví o sobě známým způsoben jako expresní kazeta do jiného plasmidu v .unterobakteríaeeae, s výhodou dc~. coli se vestaví autonomně rozvrožovámí schopný plasmid.

3. Způso' výroby novýcl plosnidů podle bodu 1 , vyznačující se tí”·, $^r· se v plasmidu , získaném po dle bodů 1 až 7 prodlouží vzdálenost mezi .Ohine-haly.-rnovou sekvencí a. startovacím kodonem řezem s kde 1, vyplněním vzniklých raíct řozu a následující ligaci vzniklých blunt-konců.

9. Použití plasmidu, výrobě, ého podle bodů 1 až 8 při získávání aktivátoru plasminogenu,vyznačující se tím,že se plasmidem transformuje kxpen nnterobakteriaceae, s výhodou kmen K, eoli a to o sobě známým způsobem, exprese scu-ΒΔ stzukrního genu se indukuje, vzniklý rseu-ΙΆ protein předstupně se oacělí od media a rozložených buněk bakterií,protein předstupně se solubílizuje a potom se působením redox systému, zřasí zpět na rscu-J?A.

-3Ί~

Použití plasmíďu vyrobeného podle hodů 1 až 3 při získávání aktivátoru pla;ninogenu ,podle hodu S, vyznáčující co tín, žese plesmidem transformuje kmen species £. coli, s výhodou kmen 2, coli K12 a potom se podupuje podle bodu 9*