KR0174254B1

KR0174254B1 - 전이억제제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0174254B1
Application number: KR1019940023475A
Authority: KR
Inventors: 김민영; 김성규; 장기룡; 강성종
Original assignee: 김정재; 주식회사한일합섬
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR960010860A

Abstract

본 발명은 전이억제제 TIMP-2를 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA 벡터를 대장균에 삽입시켜 형질전환된 대장균을 배양하고, 이 대장균을 발현시켜 전이억제제 TIMP-2를 제조하는 방법이다.

Description

전이억제제(TIMP-2) 및 그의 제조방법

제1도는 발현벡터 pGEMEX-1의 제한효소 지도이고,

제2도는 TIMP-2 유전자를 함유하는 플라스미드 pGEMX-TP의 제조공정 개략도이다.

제3도는 SDS-폴리아크릴아마이드로 전기영동한 정제된 TIMP-2의 단백질을 나타내는 그림이다.

제4도는 지모그람에 의한 TIMP-2의 활성확인을 나타내는 그림이다.

제5도는 인베이젼에세이에 의한 TIMP-2의 전이억제 작용을 나타내는 그림이다.

본 발명은 유전자 재조합 기술로 개발한 전이억제제 TIMP-2(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase) 및 그의 제조방법과 용도에 관한 것이다.

전이(Metastasis)는 암환자 사망의 주원인이 되고 있으며, 암세포가 일차 종양괴로부터 분리되어 해부학적으로 먼 곳에 있는 조직이나 장기에 착상하여 성장하는 현상이다. 암세포가 원격장기로 전이하려면 우선 암세포가 주위조직으로 침습해 들어가야한다. 정상적인 상피세포는 기저막(basement membrance)에 의해 둘러싸여 주위 간질로부터 격리되어 있으며, 혈관내피세포 밖의 기저막은 암세포가 혈관으로부터 조직 실질로 침투하는데 장벽이 되므로 기저막은 암세포 침윤에 대한 일차 방어벽이 된다. 따라서, 기저막의 붕괴는 전이가 일어나고 있음을 알려준다.

기저막은 불용성이고 연속적이며, 큰 단백질이 통과할 수 없는 연성구조로 되어있다. 기저막의 주성분은 type Ⅳ 콜라겐, 라미닌, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸으로 되어있다.

전이가 일어나는 첫 단계는, 암세포가 기저막에 있는 라미닌 또는 지질에 있는 피브로넥틴과 같은 기질에 암세포가 세포표면의 수용체를 통해 부착한다. 고정된 암세포는 가수분해효소를 분비하거나, 숙주세포로 하여금 효소를 분비하게 하여 기질을 분해하는 것이다. 세 번째 단계는 암세포가 가수분해된 기질의 부분을 통해서 이동하는 것이다. 계속되는 기질의 침습은 이 세 단계를 반복하여 일어난다.

전이하는 암세포는 분해효소를 생산하여 효과적으로 세포의 기질을 약하게 하거나 파괴할 수 있다. 전이하는 암세포에서 활성이 증가하는 분해효소 중 type Ⅳ 콜라게네이즈는 암의 전이와 직접적인 관계가 있다고 여러 연구에서 보고되고 있다.(Garbisa et al. Cancer Res. 47 1523-1528(1987), Gehlsen et al., Science 241, 1228-1229(1989) ; Ura et al., Cancer Res. 49, 4615-4621(1989). Type Ⅳ 콜라겐은 기저막의 주요골격을 이루고 있고, 암세포가 전이되기 위해서는 이것을 붕괴시킬수 있어야만 한다. Type Ⅳ 콜라게네이즈는 이 type Ⅳ 콜라겐을 특이적으로 붕괴시키는 효소이며, 이 효소는 분자량이 92 kDa과 72 kDa의 두 가지 아형이 있는 것으로 알려지고 있다(Collier et al., J.Biol.Chem. 263, 6579-6589(1989) ; Wilhelm et al. J.Biol.Chem. 264, 17213-17221(1989)).

이 효소들의 과잉발현이나 높은 활성은 악성종양이나 류마치스 관절염 등과 같은 여러 종류의 병리학적 상태와 연관되어 있으며, 전이하는 암세포에서 높게 발현된다고 보고되고 있다. Type Ⅳ 콜라게네이즈는 금속단백분해효소(metalloproteinase)훼밀리에 속하며, 이 훼밀리에 속하는 효소는 불활성의 전효소로 생성, 분비되며 트립신이나 플라스민과 같은 효소로 처리하거나 유기수은 화합물에 노출하면 활성화된다(Stetler-Stevenson et al. J.Biol.Chem. 264, 1353-1356(1989)).

실제로 암세포가 주위조직으로 침습하는 것은 활성화된 효소분자와 이를 길항시키는 억제분자와의 평형, 즉 양성과 음성 조절단백질의 평형에 의해 조절된다고 생각되고 있다(Liotta et al. Cell 64, 329-336(1991)). 생체에는 type Ⅳ 콜라게네이즈 작용을 억제하는 천연의 단백질이 존재하는데 이를 TIMP(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase)라고 한다(Liotta et al. Cell 64, 327-336(1991)).

TIMP-1은 92 kDa type Ⅳ 콜라게네이즈와 1:1로 결합하여 효소의 기능을 억제한다. TIMP-2는 21 kDa의 단백질로서, 잠복형이거나 활성화된 72 kDa type Ⅳ 콜라게네이즈와 1:1로 결합하며 잠복형 92 kDa type Ⅳ 콜라게네이즈와도 결합하여 효소기능을 억제한다(Stetler-Stevensen et al. J.Biol.Chem. 264, 17374-17378(1989) ; Stetler-Stevensen et al. J.Biol.Chem. 265, 13933-13938(1990)).

암세포도 TIMP를 만들어내며, 실제로 사람의 악성흑종에서 72 kDa type Ⅳ 콜라게네이즈와 TIMP-2가 복합체를 이루고 있음을 보고하였다(Steler-Stevenson et al. J.Biol.Chem. 264, 17374-17378(1989)). Albini등은(Albini et al. J.Natl. Cancer Inst. 83, 775-779(1991))사람의 섬유육종 HT-1080배양액에 억제제인 TIMP-2를 넣어 분해효소와 분해효소 억제제의 평형을 깨뜨려 HT-1080 암세포가 기저막을 침습하여 통과하는 것을 막는 것을 보여주었다.

TIMP-2를 제조하는 방법으로서는 유럽 특허공개 제 404, 750호 인체의 폐섬유아세포에 SV-40를 작용시켜 악성종양세포로 전환시키고, 이 세포를 배양한 후 type Ⅳ 콜라게네이즈와 결합되어 있는 TIMP-2를 분리하여 정제하는 방법이 개시되어 있다.

또한 PCT 국제공개 WO 90-11287호(1990년 10월 4일)에는 인체의 흑색종세포(A 2058)배양액에서 TIMP-2를 분리, 정제하는 방법도 개시되어 있다.

그러나 유전공학적 방법으로는 오직 포유동물세포에 발현 벡타를 삽입하여 배양, 발현시켜 제조하는 방법만이 알려져 있으며, 이때 사용되는 동물세포는 백시나 비루스 마말리안 세포(vaccina virus mammalian cell)가 알려져 있다.(Fridman et al., Biochem. J. 289, 411-416(1993))

그 이유는 TIMP-2는 디설파이드 결합이 6개가 되어 대장균에서 발현되어 홀딩시키기가 어렵기 때문에, 현재까지 유전공학적 방법으로 얻으려면 동물세포 발현벡터로 형질전환시킨후, 동물세포 배양을 통해 얻고 있었던 것이다. 쥐의 TIMP-1을 대장균에서 발현시켰으나 홀딩(folding)이 잘 되지않아 수율이 상당히 낮았다는 보고가 있다(Cocuzzi et al., FEBS 307, 375-378(1992)).

따라서, 본 발명의 목적은 TIMP-2의 유전자를 재조합한 DNA 기술을 이용하여 대장균(Escherichia coli)에서 다량 발현후 성공적으로 홀딩시켜 고순도의 TIMP-2로 정제한후, 72 kDa type Ⅳ 콜라게네이즈의 활성을 억제시키는 전이억제제의 제공에 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

[TIMP-2의 제조]

TIMP-2의 유전자는 샘부룩 등의 방법(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harber Laboratory, Cold Spring Harber, NY)에 따라 분리하였다. 본 발명자들은 간암환자의 간암조직으로부터 분리한 mRNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 다음의 2가지 시발체를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 실시하여 TIMP-2 유전자를 증폭시킨 후 정제하여서 얻었다.

상기 5' -시발체는 Nde Ⅰ 인식부위를 삽입하고, 3' -시발체에는 Hind Ⅲ 인식부위를 삽입한 것이다. 이렇게 하여 얻어진 TIMP-2 유전자를 필요하다면 합성링커(linker)와 함께 적당한 셔틀벡터에 삽입하여서 TIMP-2 단백질 발현벡터를 얻는다. 본 발명자들은 셔틀벡터로서 pGEMEX-1(Promega, 제1도 참조)를 사용하였는 바, pGEMEX-1을 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 처리한 후 여기에 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 처리한 TIMP-2 유전자를 삽입시키고, 이 발현 플라스미드를 pGMX-TP라 명명하였다(제2도 참조). 본 출원인은 상기 발현 플라스미드 pGMX-TP로 대장균(E. coli)JM 109(DE 3)를 형질전환시켜 이 형질전환된 미생물을 대장균 JM pGMX-TP라 명명하고, 한국 미생물 보존협회에 1994년 9월 16일자로 기탁번호(KCCM - 10057)로 기탁하였다.

TIMP-2 단백질은 상기 대장균 JM 109(DE 3) 또는 상기발현 플라스미드 pGMX-TP로 형질전환된 다른 대장균을 적당한 조건에서 LB(Luria-Bertani)배지에서 배양후 이소프로필 티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)로 단백질 발현을 유도하면 TIMP-2의 단백질이 대장균 세포질에 인클루젼 바디(inclusion body)로 생성된다. 인클루젼 바디(inclusion body)를 단백질 변성체로 용해시키고 원래형태(native)의 TIMP-2로 홀딩(folding)시킨 후 정제하여 제조한다.

[TIMP-2]의 용도

TIMP-2는 암의 전이억제제 이외에도 다음과 같은 질병에 쓰일 수 있다.

과다한 금속단백 분해효소의 활성에 의한 질병, 관절염, 당뇨병성 망막증, 비대성 반흔, 건선, 점막 및 상피조직의 궤양, 자가면역에 의한 염증, 페손상, 육아종성 질환, 기저막의 분해와 관련된 질병, 즉 낭창, 자가면역성 신경장애, 근세포 파괴, 즉 심근경색증, 사구체 이상에도 사용될 수 있으며 배 또는 태반의 부착이나 침습을 막아서 피임약으로도 쓰일 수 있다. 특히 안과질환 중 신생혈관성 녹내장, 눈의 혈관형성 등 안압을 낮추는데 쓰일 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

[실시예 1]

TIMP-2의 제조

1.1. 간압(hepatoma) cDNA 라이브러리의 제조

채취 즉시 급냉시켜 -70℃에서 보관한 사람의 간암조직으로부터 mRNA 정제키트(Quick Prep. Micro, Pharmacia)를 사용하여 구아니디니움 티오시아네이트/N-라우로일 사르코신으로 추출하고 올리고(dT)-셀루로스 컬럼을 이용하여 mRNA를 정제하였다. 정제된 mRNA를 가지고, 랜덤 프라이머를 사용하는 리보클론 cDNA 합성 시스템(Promega)를 이용하여 λgtll cDNA 클로닝 벡터에 연결하여 라이브러리를 제조하였다.

1.2. TIMP-2 유전자의 증폭 및 정제

사람의 간암조직으로부터 제조한 헤파토마 cDNA 라이브러리를 주형(template)으로 하고, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 이용될 시발체를 DNA합성기(ABI사)로 합성하여, PCR을 실시하였다. 유전자 증폭기는 DR BAE(Fine PCR Precision Ind. Co.)를 사용했다.

시발체의 올리고 뉴클레오타이드 배열은 다음과 같다.

PCR 반응액의 조성은 전체 100μl 중 dNTP(2.5mM) 10μl, DNA 주형 10μl, 각각의 시발체 100pmole, 10x 완충용액 10μl, 벤트중합효소(2단위, New England Biolab) 1μl를 함유하고 있으며, 광물성 유(mineral oil)를 반응액 위에 넣었다. 반응조건은 94℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후 45 내지 55℃에서 1분간 어닐링(annealing)시키고 72℃에서 1분간 중합반응시키며 이러한 반응사이클을 35회 내지 40회 반복하였으며, 마지막 사이클에서는 상기 변성, 어닐링 및 중합반응을 각각 5분씩 실시하였다.

반응이 끝난 후 광물성 유를 클로로포름으로 제거하고, 1% 평판 아가로즈젤에서 전기영동한 후 에티디움부로마이드로 염색하여 PCR 반응물인 TIMP-2 유전자의 위치를 확인하였다. DNA 밴드를 잘라내어 유전자 세정키트(Gene Clean Kit, Bio 101사)로 정제하였다. 정제된 PCR 산물 2μ에 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ를 가하여, 37℃에서 12시간 반응시킨 다음, 유전자 세정키트로 TIMP-2 DNA를 정제하였다.

1.3. TIMP-2 유전자 염기서열 확인

USB 사의 염기서열 확인 키트를 이용하였다. 먼저 pGMX-TP 플라스미드 5μl에 0.1볼륨의 2M NaOH, 2mM EDTA를 넣고 37℃에서 30분간 방치하여 변성시켰다. 0.1볼륨의 3M 아세트산 나트륨(pH 4.5)를 가하여 중화시킨 후 에탄올 침전을 시켰다. 침전물을 7μl의 증류수에 녹인 후 2μl의 씨퀀스 반응 완충액과 1μl의 시발체(5μg)를 가한 후 65℃에서 2분간 가열 후 천천히 식혔다. 식은 용액에 0.1M DTT 1μl와 씨쿼네이즈 폴리머라제 2μl를 가한 후 잘 섞고, 이 3μl에 터미네이션 혼합물(A, C, G, T) 각각 2.5μl를 섞었다. 37℃에서 5분간 방치 후 4μl의 정지용액을 섞은 후 75℃에서 2분간 가열하였다. 6% 아크릴 아미드, 7M 요소 TBE 겔 상에서 전기영동하였다. 50w의 전력으로 전개한 후 겔을 말리고 라디오그램을 하여 염기서열을 읽어 TIMP-2 유전자임을 확인하였다.

1.4. pGEMEX-1 벡터에의 클로닝

운반체 pGEMEX-1(Promega) (제1도 참조) 1μl을 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 처리한 다음 1% 평판 아가로즈젤 상에서 절단된 것을 확인한 후 유전자 세정키트로 정제하였다. 실시예 1.2.에서 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 처리한 TIMP-2 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 상기제한효소로 절단한 pGMEX-1에 연결시켰다. 여기서 얻은 반응산물로 대장균 균주 JM 109(DE 3)(Promega Cat #p9801)를 형질전환시키기 위해, 대장균을 50ml LB 용액에 O.D.600이 0.4 정도 되도록 배양시킨 후 원심분리하고, 침전된 세포 펠랫을 RFⅠ용액(100mM RbCl, 50mM MnCl₂, 30mM 초산나트륨, 10mM CaCl₂, 15%(w/v)글리세롤) 10ml에 현탁하여 얼음에서 30분간 방치시킨 후 원심분리하여 침전을 얻었다. 여기서 얻은 펠렛을 RFⅡ용액(10mM MOPS, 10mM RbCl, 75mM CaCl2, 15%(w/v)글리세롤) 4ml에 현탁시킨 후 그중 100μl를 취하여 여기에 상기에서 준비된 TIMP-2 유전자를 함유하는 운반체 pGMX-TP를 가하였다. 이 혼합용액을 얼음 속에서 30분간 방치한 후 42℃에서 90초 동안 열처리하고 얼음에서 2분간 냉각시킨 후 1ml의 LB 배지를 가하였다. 1시간 동안 37℃에서 배양한 후 LB-아가 플레이트에 도포한 후 20시간 배양하였다. 이렇게 하여 얻은 형질전환체의 콜로니를 취하여 4ml의 LB 배지에서 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리 정제하여, 제한효소 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 절단하였다. 1% 평판 아가로즈젤상에서 전기영동하고 에티디움브로마이드로 염색하여 pGEMEX-1 절편과 TIMP-2 DNA 절편을 확인하였다. 확인된 플라스미드를 pGMX-TP라 하였다(제2도).

1.5. TIMP-2 유전자의 발현 및 정제

상기 실시예 1.4.에서 얻어진 플라스미드 pGMX-TP를 함유하는 대장균 균주 JM pGMX-TP(KCCM - 10057)를 엠피실린(100μl/ml)이 든 LB 배지 200ml에서 흡광도(O.D.600)가 0.5가 될 때까지 배양한 후 IPTG 0.1mM을 첨가하여 37℃에서 250rpm으로 3-4시간 배양시켰다. 배양된 대장균을 원심분리하여 침전시킨 후, 세포 침전물을 20mM Tris(pH 7.6), 10% 솔비톨, 라이소자임(100μl/ml), 200mM NaCl, 10mM EDTA 및 1mM PMSF 용액에 2g(wet weight)/ml 농도로 현탁시켜 소니케이터(sonicator, Branson사)로 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 4℃, 25,000xg로 10분간 원심분리 후 침전물을 차가운 증류수에 녹인 후 다시 원심분리하였다. 침전물을 1-6M 요소, 1-5mM DTT, 50mM CAPS(pH 7.5-pH 10.5) 용액에 단백질 농도가 2-3mg/ml이 되도록 녹인 후 실온에서 10시간 이상 방치하였다. 다시 홀딩(refolding)된 용액을 투석막(Dialysis membrane ; spectra pore사 cut off 6-8,000)을 사용하여 20mM Tris(pH 7.5) 1mM PMSF 용액에 투석하였다. 투석한 용액을 4℃, 10,000xg에서 10분간 원심분리 후 20mM Tris pH 7.5로 평형화된 음이온 교환칼럼, 예를 들면 DEAE-Seharose 4B 칼럼 또는 Mono-Q에 주입하였다. 주입 후 칼럼에 부착치 않은 물질들을 평형 완충용액으로 씻어낸 후 50mM NaCl 용액이 함유된 평형 완충용액으로 용출하였다.

TIMP-2를 양이온 교환칼럼, 예를 들면 Mono-Q나 S-세파로스칼럼을 이용하여 정제할 수도 있다. 이때 pH를 6-8로 조정하고 100mM의 NaCl용액으로 용출하였다. 이렇게 하여 얻은 TIMP-2를 젤 여과 칼럼으로 한번 더 정제하면서 NaCl을 제거한 후 SDS-폴리아크릴아마이드 상에서 전기영동하여 순도를 확인하였다(제3도).

제3도에서 첫 번째는 표준분자량의 단백질이고 두 번째는 대장균의 인클루젼 바디 단백질이며, 세 번째는 고순도로 정제된 TIMP-2의 단백질을 나타낸다.

[실시예 2]

TIMP-2의 활성측정

2.1. 지모그람(Zymogram)

사람의 섬유육종 HT-1080(ATCC CCL121)을 서브콘프루언트하게 DMEM 10% FSB 배지에서 배양한 후 배지를 제거한다. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 용액으로 2회 세척 후 혈청이 없는 DMEM 배지로 교환하고, 15-20시간 배양 후 배지를 회수하고 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 type Ⅳ 콜라게네이즈를 포함하는 상층액을 얻었다. SDS-폴리아크리아마이드 젤을 만들 때, 젤라틴의 최종농도가 0.1%가 함유되도록 젤라틴을 첨가하여 공중합 시킨다. 스택킹 겔에는 젤라틴을 첨가하지 않는다. 상기의 HT-1080 배양액(무혈청 배지)에 동량의 2x non-reducing Tris/글리신 SDS 샘플완충액을 가하고 상온에서 10분정도 방치시킨 후 겔에 로오딩한다. Tris/Gly SDS 러닝 버퍼(pH 8.3)에서 125볼트의 일정전압으로 고정시키고 염료가 겔의 바닥에 닿을 때까지 약 2시간 정도 전개시킨다. 전개 후 젤을 2.5% 트리톤 x-100용액에 담궈 약 30분 동안 실온에서 서서히 교반한다. 용액을 버리고 젤을 전개용액(50mM Tris, 0.2M NaCl, 5mM CaCl₂및 0.02% Brij35(w/v)(pH 7.6))에 넣고 37℃ 항온기에서 하룻밤 방치하여 Type Ⅳ 콜라게네이즈를 활성시킨다. 이때 정제한 TIMP-2를 5μl/ml와 10μl/ml의 농도가 되도록 각각의 전개용액에 가하여 37℃ 항온기에서 하룻밤 방치하여 type Ⅳ 콜라게네이즈 활성을 억제하는 것을 확인하였다(제4도).

2.2. 인베이젼 에세이(Invasion Assy)

Modified Boyden chamber(Costar, USA)의 lower chamber에 0.1% BSA가 함유된 DMEM에 1/500-1/1000로 희석한 매트리겔(Collaborative Biomedical Products사)을 넣는다. 그 위에 매트리겔을 50-80μg 코팅한 폴리카보네이트 필터(Coster, USA)를 얹고 캡을 닫는다. 상층 챔버에 HT1080 cell(8x10⁴세포)현탁배지와 TIMP-2용액(최종농도 10μg)을 넣는다. CO₂배양기에서 6시간 배양 후 필터를 분리한다. 필터를 크리스탈바이오렛으로 염색한다. 10분 후 필터를 물로 세척한 후 건조시킨다. 100x 현미경으로 투과한 세포의 수를 측정한 결과 10μg 농도의 TIMP-2를 넣은 것은 HT1080세포가 기저막을 통과하는 것을 대조군에 비해 75±5% 정도 억제하였다(제5도).

Claims

전이억제제 TIMP-2를 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA 벡터를 대장균에 삽입시켜 형질전환된 대장균을 배양하고, 이 대장균을 발현시켜 전이억제 TIMP-2를 제조하는 방법에 있어서, 형질전환된 대장균 JM pGMX-TP(KCCM - 10057)을 사용하고 대장균 세포내의 TIMP-2의 인클루젼 바디를 단백질 변성체와 환원제를 포함하는 알칼리 완충액으로 용해시킴과 동시에 TIMP-2 단백질을 리폴딩(refolding) 시켜 정제시킴을 특징으로 하는 전이억제제 TIMP-2의 제조방법.
제 1항에 있어서, TIMP-2를 코오딩하는 시발체 DNA 염기서열이

임을 특징으로 하는 TIMP-2의 제조방법.
제 1항의 방법에 의해 제조된 TIMP-2.
TIMP-2 단백질을 코오딩하는 유전자를 포함하는 발현 플라스미드 pGMX-TP.
제 4항의 발현 플라스미드 pGMX-TP로 형질전환된 대장균 JM pGMX-TP(KCCM - 10057).