CN103476459A

CN103476459A - 抗凝血剂解毒剂

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Publication number: CN103476459A
Application number: CN2012800157134A
Authority: CN
Inventors: J.范莱恩; K.卡纳达; R.卡朋汉弗; N.奥埃尔; T.利岑布格尔; C.R.萨科; S.辛格; A.K.沃特曼
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2012-03-27
Publication date: 2013-12-25
Also published as: EA201301090A1; TN2013000388A1; US20140377265A1; WO2012130834A1; CL2013002551A1; CO6771448A2; JP2014515740A; ECSP13012997A; UY33994A; BR112013025031A2; CA2827787A1; PE20140964A1; US8821871B2; EP2691156A1; KR20140009437A; IL227653A0; SG193552A1; MX2013011092A; NZ613543A; MA34978B1

Abstract

本发明涉及针对抗凝血剂、特别是针对达比加群的抗体分子，以及所述抗体分子作为此类抗凝血剂的解毒剂的用途。

Description

抗凝血剂解毒剂

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其是抗凝血疗法的领域。

现有技术

抗凝血剂为预防血液凝固的物质；即，抗凝血剂可以使血液停止凝固。抗凝血剂广泛用作治疗人血栓性疾病的药物，例如在易感者中预防原发性及继发性深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞及中风。

一类重要的口服抗凝血剂通过拮抗维生素K的作用而起作用，例如包括华法林在内的香豆素类。第二类化合物通过辅因子间接抑制凝血，例如抗凝血酶III或肝素辅因子II。此包括数种低分子量的肝素产物，其通过抗凝血酶III主要催化抑制Xa因子(以及针对凝血酶的程度较小)(贝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、达替肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin)，小链寡糖(磺达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux))通过抗凝血酶III仅抑制Xa因子。类肝素(达那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate))通过两种辅因子起作用，且抑制Xa因子及凝血酶两者。第三类则为凝血的直接抑制剂。直接Xa因子抑制剂包括阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)，且直接凝血酶抑制剂包括二价水蛭素(比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin))以及单价化合物阿加曲班(argatroban)及达比加群(dabigatran)。

由于血液凝固为停止出血的生物机制，因此抗凝血疗法的副作用是可能发生不期望的出血事件。因此需要提供一种能够阻止所述抗凝血剂相关的出血事件发生的解毒剂(antidote)(Zikria及Ansell，Current Opinion in Hematology2009,16(5)：347-356)。一种实现此目标的方法为在给药抗凝血剂后中和患者体内所存在的抗凝血剂化合物活性。

目前可使用的抗凝血剂解毒剂为鱼精蛋白(用于中和肝素)及维生素K(用于中和类似华法林的维生素K拮抗剂)。对于罹患严重创伤及严重出血且接受低分子量肝素治疗的患者而言，新鲜冷冻血浆及重组因子VIIa也可作为非特异性解毒剂使用(Lauritzen B.等人，Blood，2005，607A-608A)。也有报导指出鱼精蛋白片段(美国专利第6,624,141号)及小合成肽(美国专利第6,200,955号)作为肝素或低分子量肝素解毒剂；且凝血酶突变蛋白(美国专利第6,060,300号)可用作凝血酶抑制剂的解毒剂。已有报导指出凝血酶原中间体及衍生物可用作水蛭素及合成凝血酶抑制剂解毒剂(美国专利第5,817,309号及第6,086,871号)。对于Xa因子直接抑制剂而言，已有报导指出失活Xa因子类似物可用作解毒剂(WO2009042962)。此外，重组VIIa因子已经用于逆转抗凝血酶III依赖性Xa因子之间接抑制剂(例如磺达肝素及艾卓肝素)的效应(Bijsterveld NR等人，Circulation,2002,106:2550-2554；Bijsterveld NR等人，British J.of Haematology,2004(124)：653-658)。有关抗凝血剂逆转的方法的综述提供于Schulman及Bijsterveld，Transfusion Medicine Reviews2007：21(1),37-48中。

国际专利申请案WO2011089183公开可结合及中和达比加群活性的抗体。

对于抗凝血疗法提供改良的解毒剂存在需求，且具体地，为针对类似达比加群的直接凝血酶抑制剂提供解毒剂，该特异性解毒剂至今尚无人公开。

发明概述

在一个方面中，本发明涉及一种能够中和抗凝血剂的活性的抗体分子。

在另一方面中，该抗体分子针对抗凝血剂具有结合特异性。

在另一方面中，该抗凝血剂为一种直接凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂或维生素K拮抗剂。

在另一方面中，该抗凝血剂为达比加群(dabigatran)、阿加曲班(argatroban)、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)、水蛭素(hirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)、阿哌沙班(apixaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、去纤维蛋白多核苷酸(defibrotide)、雷马曲班(ramatroban)、抗凝血酶III或Drotrecoginα。

在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯(dabigatranexetilate)及/或达比加群的O-酰基葡糖苷酸的抗体分子。

在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯和/或达比加群的O-酰基葡糖苷酸的抗体分子，其对于人而言具有降低的免疫原性。

在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯和/或达比加群的O-酰基葡糖苷酸的抗体分子，其具有改良的理化性质，尤其是在水性溶剂中具有改良的溶解度。

在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯和/或达比加群的O-酰基葡糖苷酸的抗体分子，其在宿主细胞中具有改良的生产能力，尤其是造成改良的产物收率。

在另一方面中，该抗体分子为多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体的片段，尤其为Fab、Fab'或F(ab')₂片段、单链抗体，尤其为单链可变片段(scFv)、域抗体、纳米抗体、双价抗体(diabody)或DARPin。

在另一方面中，本发明涉及一种如上所述的抗体分子，其用于医药中。

在另一方面中，本发明涉及一种如上所述的抗体分子，其用于治疗或预防抗凝血疗法所产生的副作用。

在另一方面中，该副作用为出血事件。

在另一方面中，本发明涉及一种治疗或预防抗凝血疗法所产生的副作用的方法，该方法包括将有效量的如上所述抗体分子给药至有此需要的患者。

在另一方面中，本发明涉及包含所述抗体分子以及容器和标签的试剂盒。

附图说明

图1：利用凝血酶凝血时间测试，观察到凝血时间会随着达比加群浓度增加而增长。200nM的浓度会造成凝血时间比基线增加约5倍，且该浓度用于第一组及第二组实验中。最后一组实验中采用500nM的浓度(超治疗浓度)。

图2：四种针对达比加群的不同抗体(A至D)均可使人血浆中达比加群所延长的凝血时间中和。人血浆中的基线凝血时间为10.9秒，当使200nM达比加群与血浆预先培养时，凝血时间延长至51秒。将各抗体添加至经200nM达比加群预先培养的血浆中，并再培养5分钟。随后，通过添加凝血酶，开始凝血酶凝血时间。各抗体会以不同程度逆转达比加群的凝血时间。浓度最高的溶液会造成抗凝血活性的最大逆转。

图3：将浓度递增的多克隆抗体(抗体D)添加至已与200nM达比加群预先培养的人血浆中，测量其作用。基线凝血时间为11秒，添加达比加群延长凝血时间至63.7秒。随后，测定递增浓度的抗体对逆转达比加群所延长凝血酶凝血时间的作用。最低浓度将凝血酶凝血时间降低至43.9秒。较高的浓度将凝血酶凝血时间完全降至基线水平，并造成达比加群的抗凝血作用的完全中和。添加非特异性兔多克隆抗体(方块)对逆转达比加群的抗凝血作用无影响。

图4：将浓度递增的多克隆抗体(抗体D)添加至已与500nM达比加群预先培养的人血浆中，测量其影响。基线凝血时间为10.9秒，添加该较高浓度达比加群时，延长凝血时间至111.7秒(增加约10倍)。抗体的1:2稀释液或原液逆转达比加群所延长凝血酶凝血时间的效应与浓度具有相关性。最高浓度也会使凝血酶凝血时间完全逆转至基线水平，且甚至使超治疗浓度的达比加群的抗凝血作用完全中和。

图5：小鼠单克隆抗体(克隆22)逆转人血浆及人全血中达比加群的抗凝血作用。将浓度递增的小鼠单克隆抗体添加至已与30nM达比加群预先培养的人血浆或全血中。通过添加1.5至2U/ml的凝血酶开始该测试，并测量凝血时间。将存在及不存在该化合物下的凝血时间差异定义为100%达比加群活性。该抗体以剂量依赖性方式抑制达比加群-介导的凝血时间延长。

图6：自克隆22抗体产生的小鼠Fab逆转人血浆中达比加群的抗凝血作用。将浓度递增的小鼠Fab添加至已与7nM达比加群预先培养的人血浆中。也测试完整抗体，作为阳性对照组。通过添加0.4U/ml的凝血酶开始该测试，并测量凝血时间。将达比加群介导的凝血时间增加的完全阻断定义为100%抑制。该Fab以剂量依赖性方式抑制人血浆中达比加群所诱发的凝血时间延长。

图7：小鼠单克隆抗体(克隆22)逆转人血浆中的达比加群酰基葡糖苷酸的抗凝血作用。将浓度递增的小鼠抗体添加至已与7nM达比加群酰基葡糖苷酸或达比加群预先培养的人血浆中。通过添加0.4U/ml的凝血酶开始该测试，并测量凝血时间。将该化合物介导的凝血时间增加的完全阻断定义为100%抑制。该抗体以剂量依赖性方式抑制人血浆中达比加群酰基葡糖苷酸所诱发的凝血时间延长。

图8：所选嵌合抗体在凝血酶凝血时间测试中抑制达比加群活性。添加递增浓度的抗体至已与7nM达比加群一起预培育的人类血浆中。完整抗体亦作为阳性对照进行测试。由添加0.4U/mL凝血酶开始分析并且测量凝血时间。将达比加群介导的凝血时间增加完全阻断定义为100%抑制。抗体以剂量依赖性方式抑制人类血浆中由达比加群诱发的凝血时间延长。

图9：Fab VH5c/Vk18(SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100)及VH5c/Vk21(SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:101)在凝血酶凝血时间血浆分析中抑制达比加群活性。如上所述进行分析。

图10：Fab VH5c/Vk18(SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:100)及VH5c/Vk21(SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:101)在血浆和全血凝血酶凝血时间测试中抑制达比加群活性。如上所述进行分析。

图11：Fab-达比加群复合物的晶体结构。A：Fab18/15(WO2011089183)与达比加群的复合物的晶体结构。B：Fab VH5c/Vk18(SEQ ID NO:99及SEQID NO:100)与达比加群的复合物的晶体结构。C：在含有Fab18/15的晶体结构中所见的达比加群的构型。D：在具有VH5c/Vk18的晶体结构中所见的达比加群的伸长构型。

图12：所计算的包含CDR(左侧)或完整Fv区(右侧)的(A)Fab18/15、(B)Fab VH5c/Vk18及(C)Fab VH5c/Vk18的空间聚集趋势(SAP)。

图13：用相应Fab表达构建体转染的CHO细胞在分批补料运行之下得到(A)Fab18/15(B)Fab VH5c/Vk18和(C)Fab VH5c/Vk21的效价。

发明详述

抗体(也称为免疫球蛋白，缩写为Ig)为发现于脊椎动物血液或其他体液的γ球蛋白，且可通过免疫系统用以识别及中和外来物体，例如细菌及病毒。所述抗体通常为由各具有两个大重链及两个小轻链的基本结构单元所组成，以形成(例如)具有1个单元的单体、具有2个单元的二聚体或具有5个单元的五聚体。抗体可通过非共价键相互作用而结合至称为抗原的其他分子或结构。此结合是特异性的，也就是抗体会以高亲和力方式仅结合至特定结构。被抗体所识别的抗原的独特部分称为抗原表位或抗原决定基。结合至该抗原表位的抗体部分有时称为互补位，其位于该抗体的所谓的可变域或可变区(Fv)中。该可变域包括三个被骨架区(FR)隔开的所谓的互补决定区(CDR)。

在本发明上下文中，所提及的CDR是根据Chothia的定义(Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.1987,196：901–917)以及Kabat(E.A.Kabat、T.T.Wu、H.Bilofsky、M.Reid-Miller及H.Perry，Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institutes of Health，Bethesda(1983))。

本领域已经进一步开发出抗体，且使所述抗体成为医学及技术中具有多功能的工具。因此，在本发明上下文中，术语“抗体分子”或“抗体”(本文作为同义词使用)并不只包括自然界中所发现的抗体(该抗体包括例如两条轻链及两条重链，或仅包括两条重链(如在骆驼物种中))，也包括所有包含至少一个具有抗原结合特异性的互补位及具有与免疫球蛋白可变域类似结构的分子。

因此，本发明的抗体分子可为多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体的片段，尤其为Fv、Fab、Fab'或F(ab')₂片段、单链抗体，尤其为单链可变片段(scFv)、小模块免疫药物(SMIP)、域抗体、纳米抗体、双价抗体。

多克隆抗体是指具有不同氨基酸序列的抗体分子的集合，且可通过本领域公知的方法，从接受抗原免疫的脊椎动物的血液中获得。

单克隆抗体(mAb或moAb)为氨基酸序列相同的单一特异性抗体，单克隆抗体可通过杂交瘤技术，从被称为杂交瘤的杂交细胞株制备产生的，该称为杂交瘤的杂交细胞是指可产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤(B细胞癌)细胞融合的克隆(Kohler G、Milstein C，Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity.Nature1975；256：495-7)。或者，单克隆抗体可通过在宿主细胞中的重组表达法制备(Norderhaug L、Olafsen T、Michaelsen TE、Sandlie I.(1997年5月)，“Versatile vectors for transient andstable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells”，JImmunol Methods204(1)：77–87；参见下文)。

对人的应用而言，往往需要降低源自其他物种(如小鼠)的抗体的免疫原性。这可通过构建嵌合抗体，或通过称为“人源化”的方法来实现。在本文中，“嵌合抗体”应理解成将包含衍生自一种物种(例如小鼠)的序列部分(例如可变域)融合至衍生自不同物种(例如人)的序列部分(例如恒定域)的抗体。“人源化抗体”为一种包括源自非人物种可变域的抗体，其中某些氨基酸发生突变，使该可变域整体序列更类似接近于人可变域的序列。抗体的嵌合化及人源化的方法也是本领域公知的(Billetta R、Lobuglio AF，“Chimeric antibodies”.Int RevImmunol.1993;10(2-3):165-76；Riechmann L、Clark M、Waldmann H、WinterG(1988)，“Reshaping human antibodies for therapy”，Nature：332:323)。

此外，已经开发基于衍生自人基因组序列的产生抗体的技术，例如通过噬菌体展示技术或使用转基因动物(WO90/05144；D.Marks、H.R.Hoogenboom、T.P.Bonnert、J.McCafferty、A.D.Griffiths及G.Winter(1991)，“By-passing immunisation.Human antibodies from V-gene libraries displayed onphage.”J.Mol.Biol.,222,581-597；Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86,2000；S.Carmen及L.Jermutus，“Concepts in antibody phage display”，Briefings inFunctional Genomics and Proteomics20021(2)：189-203；Lonberg N、Huszar D，“Human antibodies from transgenic mice”，Int Rev Immunol.1995；13(1)：65-93；Brüggemann M、Taussig MJ，“Production of human antibody repertoires intransgenic mice”，Curr Opin Biotechnol.1997年8月，8(4)：455-8)。所述抗体为本发明上下文中的“人抗体”。

本发明的抗体分子也包括保持抗原结合特性的免疫球蛋白片段，如Fab、Fab'或F(ab')₂片段。通过免疫球蛋白的断裂(例如通过蛋白消化)或通过重组表达所述片段可获得所述片段。例如通过常规技术，例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶(WO94/29348)或内切蛋白酶Lys-C(Kleemann等人，Anal.Chem.80,2001-2009,2008)可实现免疫球蛋白消化作用。以木瓜蛋白酶或Lys-C消化抗体通常会产生两个相同的称为Fab片段的抗原结合片段(每一片段具有单一的抗原结合位点)及残留的Fc片段。经胃蛋白酶处理则会产生F(ab')₂。通过宿主细胞中重组表达制备Fab分子的方法详细说明于下文中。

已开发出多种技术以将免疫球蛋白可变域或衍生自所述可变域的分子置于不同的分子背景内。根据本发明，这些也应视为“抗体分子”。一般而言，这些抗体分子在尺寸上小于免疫球蛋白，且包括单一氨基酸链或由数条氨基酸链组成。例如单链可变片段(scFv)为免疫球蛋白重链及轻链的可变区的融合体，利用短接头(通常为丝氨酸(S)及甘氨酸(G))连在一起(WO88/01649；WO91/17271；Huston等人，International Reviews of Immunology，第10卷，1993,195-217)。“单域抗体”或“纳米抗体”在单一的Ig样域中具有抗原结合位点(WO94/04678；WO03/050531；Ward等人，Nature.1989年10月12日；341(6242)：544-6；Revets等人，Expert Opin Biol Ther.5(1)：111-24,2005)。可将一或多个具有针对相同或不同抗原的结合特异性单域抗体连在一起。双价抗体为由两条氨基酸链组成的二价抗体分子，其包含两个可变域(WO94/13804；Holliger等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1993年7月15日；90(14)：6444-8)。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF；Srinivasan及Roeske，Current Protein Pept.Sci.2005,6(2)：185-96)。有一种不同概念产生所谓的小模块免疫药物(SMIP)，其包括连接至单链铰链的Fv域及缺乏恒定域CH1的效应子结构域(WO02/056910)。

在另一方面中，本发明的抗体分子甚至可能与免疫球蛋白可变域仅具有远距结构相关性，或根本没有所述相关性，只要其具有相当于免疫球蛋白可变域的特定的结合特异性及亲和力即可。所述非免疫球蛋白“抗体模拟物”(有时称为“支架蛋白”)可能基于A蛋白、载脂蛋白、纤维结合蛋白域、锚蛋白通用序列重复域及硫氧还蛋白的基因(Skerra，Current Opinion in Biotechnology2007,18(4)：295-304)。本发明上下文中的优选实施方案为经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin's；Steiner等人，J Mol Biol.2008年8月24日；382(5)：1211-27；Stumpp MT、Amstutz P，Curr Opin Drug Discov Devel.2007年3月；10(2)：153-9)。

可将抗体分子融合(成为融合蛋白)或另外连接(通过共价键或非共价键)至对该抗体分子的特性具有所需影响的其他分子实体。例如可能需要改善抗体分子的药代动力学性质、例如体液(如血液)中的稳定性，特别是在单链抗体或域抗体的情况下。已在此方面开发诸多技术，尤其为延长所述抗体分子在循环中的半衰期，如聚乙二醇化(WO98/25971；WO98/48837；WO2004081026)；将抗体分子融合或共价连接至对血清蛋白(如白蛋白)具有亲和力的另一抗体分子(WO2004041865；WO2004003019)；或使抗体分子表达为具有全部或部分血清蛋白(如白蛋白或转铁蛋白)的融合蛋白(WO01/79258)。

在另一方面中，所述抗体分子对抗凝血剂具有结合特异性。“结合特异性”指抗体分子对该抗凝血剂的结合亲和力显著高于对结构上无关的分子的结合亲和力。

亲和力为抗体分子上的单一抗原结合位点与单一抗原表位之间的相互作用。其以缔合常数K_A=k_ass/k_diss或解离常数K_D=k_diss/k_ass表示。

在本发明的一方面中，如通过表面等离子共振分析法(Malmqvist M.,“Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigenaffinity and kinetics.”，Curr Opin Immunol.1993Apr;5(2):282-6)所测定，该抗体与抗凝血剂的结合亲和性的KD值范围为0.1pM至100μM，优选为1pM至100μM，优选为1pM至1μM。也可使用动态排除分析(KinExA)技术，测量抗体亲和性(Darling,R.J.及Brault P-A.，“Kinetic exclusion assay technology：Characterization of Molecular Interactions.”，ASSAY and Drug DevelopmentTechnologies.2004年12月，2(6)：647-657)。

可通过称为亲和性成熟的方法来增强抗体分子的结合亲和性(Marks等人，1992,Biotechnology10:779-783；Barbas,等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813；Shier等人，1995,Gene169:147-155)。因此，本发明也包括亲和性成熟的抗体。

在本发明另一方面中，该抗体分子能够中和抗凝血剂的活性。即，在与该抗体分子结合之后，该抗凝血剂即无法发挥其抗凝血活性，或此活性程度已显著下降。优选地，当针对所讨论的抗凝血剂采用适当的活性分析，特别是采用对凝血酶敏感的凝血分析，如蛇静脉酶(ecarin)凝血时间或凝血酶凝血时间测定时(H.Bounameaux、Marbet GA、Lammle B，等人，“Monitoring ofheparin treatment.Comparison of thrombin time,activted partial thromboplastintime,and plasma heparin concentration,and analysis of the behaviour ofantithrombin III”，American Journal of Clinical Pathology198074(1)：68-72)，抗体结合后的抗凝血活性会下降至少2倍、5倍、10倍或100倍。

为了制备本发明的抗体分子，本领域技术人员可自多种本领域公知的方法中选择(Norderhaug等人，J Immunol Methods1997,204(1)：77–87；Kipriyanow及Le Gall，Molecular Biotechnology26：39-60,2004；Shukla等人，2007,J.Chromatography B,848(1)：28-39)。

抗凝血剂为本领域公知的，如上文所述。在本发明另一方面中，该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂或维生素K拮抗剂。维生素K拮抗剂的实施例为包括华法林在内的香豆素类。Xa因子的间接主要抑制剂的实例为通过抗凝血酶III的活化产生作用的肝素类物质，其包括数种低分子量的肝素产物(贝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、达替肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin))、某些寡糖(磺达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux))、类肝素(达那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate))，及直接Xa因子抑制剂(阿哌沙班(apixaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban))。凝血酶抑制剂的实施例包括二价水蛭素(比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin))、及单价化合物阿加曲班(argatroban)及达比加群(dabigatran)。

因此，在另一方面中，该抗凝血剂为达比加群、阿加曲班、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、阿哌沙班、伊度沙班、奥米沙班、利伐沙班、去纤维蛋白多核苷酸、雷马曲班、抗凝血酶III或Drotrecoginα。

本发明上下文中优选的抗凝血剂为达比加群(CAS211914-51-1，N-[2-(4-甲脒基苯基氨基甲基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基羰基]-N-(2-吡啶基)-β-丙氨酸)，其具有化学式(II)：

达比加群为WO98/37075(其公开了具有凝血酶抑制作用及延长凝血酶时间的作用的化合物)所公开，其名称为1-甲基-2-[N-(4-甲脒基苯基)-氨基甲基]-苯并咪唑-5-基-甲酸-N-(2-吡啶基)-N-(2-羟基羰基乙基)-酰胺。也可参见Hauel等人，J Med Chem2002,45(9)：1757–66。

达比加群以式(III)的前药提供：

该式(III)化合物(称为达比加群酯(dabigatran etexilate)，CAS211915-06-9；3-[(2-{[4-(己基氧基羰基氨基-亚胺基-甲基)-苯基氨基]-甲基}-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基)-吡啶-2-基-氨基]-丙酸乙酯)进入人体后即转化为活性化合物(II)。达比加群酯的一种优选的多晶型物为甲磺酸达比加群酯。

达比加群主要适应症为手术后预防深静脉血栓形成、治疗经确诊的深静脉血栓形成及预防罹患心房纤维性颤动患者中风(Eriksson等人，Lancet2007,370(9591)：949–56；Schulman S等人，N Engl J Med2009,361(24)：2342-52；Connolly S等人，N Engl J Med2009,361(12)：1139–51；Wallentin等人,Lancet2010,376(9745)：975-983)。

在人体内，羧酸酯部分基团的葡糖苷酸化为达比加群的主要人体代谢途径(Ebner等人，Drug Metab.Dispos.2010,38(9):1567-75)。其结果是形成了1-O-酰基葡糖苷酸(β端基差向异构体)。该1-O-酰基葡糖苷酸除了少数水解为苷元外，也可在水溶液中发生非酶性酰基转移，导致形成2-O-、3-O-及4-O-酰基葡糖苷酸。使用纯化的1-O-酰基葡糖苷酸及其异构性重排产物的实验显示，其使活化部分促凝血酶原激酶时间延长的效力与达比加群相当。

在本发明另一方面中，该抗体分子结合达比加群及达比加群酯。

在本发明另一方面中，该抗体分子结合达比加群及达比加群的O-酰基葡糖苷酸，特别是达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸。

在本发明另一方面中，该抗体分子还结合达比加群的2-O-酰基葡糖苷酸、3-O-酰基葡糖苷酸及4-O-酰基葡糖苷酸。

在本发明另一方面中，该抗体分子能够中和达比加群及达比加群的O-酰基葡糖苷酸的活性，特别是达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的活性。

在下文中，除非另外指示，否则提及SEQ ID No.是指表1的序列。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有选自SEQ ID NO:1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61及67的CDR1、选自SEQ ID NO:2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62及68的CDR2及选自SEQ ID NO:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57及63的CDR3的重链可变域，以及具有选自SEQ ID NO:4、10、16、22、28、34、40、46、52、58及64的CDR1、选自SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41、47、53、59及65的CDR2及选自SEQ ID NO:6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66及69的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2及SEQ ID NO:3的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2及SEQID NO:6的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:8的CDR2及SEQ ID NO:9的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:10的CDR1、SEQ ID NO:11的CDR2及SEQ ID NO:12的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:14的CDR2及SEQ ID NO:15的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:16的CDR1、SEQ ID NO:17的CDR2及SEQ ID NO:18的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:19的CDR1、SEQ ID NO:20的CDR2及SEQ ID NO:21的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:22的CDR1、SEQ ID NO:23的CDR2及SEQ ID NO:24的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:25的CDR1、SEQ ID NO:26的CDR2及SEQ ID NO:27的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:28的CDR1、SEQ ID NO:29的CDR2及SEQ ID NO:30的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:31的CDR1、SEQ ID NO:32的CDR2及SEQ ID NO:33的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:34的CDR1、SEQ ID NO:35的CDR2及SEQ ID NO:36的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:37的CDR1、SEQ ID NO:38的CDR2及SEQ ID NO:39的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:40的CDR1、SEQ ID NO:41的CDR2及SEQ ID NO:42的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:43的CDR1、SEQ ID NO:44的CDR2及SEQ ID NO:45的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:46的CDR1、SEQ ID NO:47的CDR2及SEQ ID NO:48的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:49的CDR1、SEQ ID NO:50的CDR2及SEQ ID NO:51的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:52的CDR1、SEQ ID NO:53的CDR2及SEQ ID NO:54的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:55的CDR1、SEQ ID NO:56的CDR2及SEQ ID NO:57的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:58的CDR1、SEQ ID NO:59的CDR2及SEQ ID NO:60的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:61的CDR1、SEQ ID NO:62的CDR2及SEQ ID NO:63的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:64的CDR1、SEQ ID NO:65的CDR2及SEQ ID NO:66的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子对达比加群具有结合特异性且包含具有SEQ ID NO:67的CDR1、SEQ ID NO:68的CDR2及SEQ ID NO:9的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:64的CDR1、SEQ ID NO:65的CDR2及SEQ ID NO:69的CDR3的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:70的重链可变域及SEQ ID NO:71的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:72的重链可变域及SEQ ID NO:73的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:74的重链可变域及SEQ ID NO:75的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:76的重链可变域及SEQ ID NO:77的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:78的重链可变域及SEQ ID NO:79的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:80的重链可变域及SEQ ID NO:81的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:82的重链可变域及SEQ ID NO:83的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:84的重链可变域及SEQ ID NO:85的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:86的重链可变域及SEQ ID NO:87的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:88的重链可变域及SEQ ID NO:89的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:90的重链可变域及SEQ ID NO:91的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:92的重链可变域及SEQ ID NO:93的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:92的重链可变域及SEQ ID NO:94的轻链可变域。

在本发明的另一方面中，任一上述轻链可变域融合于SEQ ID NO:97的恒定域。

在本发明的另一方面中，任一上述重链可变域融合于SEQ ID NO:98的恒定域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:95的重链及SEQID NO:96的轻链。

在某些方面中，本发明涉及于水性介质中的溶解性较高且聚集趋势较低的针对达比加群的抗体。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子为scFv分子。在此格式中，本文公开的可变域可以以适当接头肽彼此融合。构建体可自N端至C端按以下顺序包含这些元件：(重链可变域)-(接头肽)-(轻链可变域)、或(轻链可变域)-(接头肽)-(重链可变域)。

使可编码sFv构建体的核酸在宿主细胞(如，大肠杆菌、毕赤酵母菌或哺乳动物细胞系，例如CHO或NS0)中重组表达以产生功能性scFv分子的方法是本领域公知的(参见例如：Rippmann等人，Applied and EnvironmentalMicrobiology1998,64(12):4862-4869；Yamawaki等人，J.Biosci.Bioeng.2007,104(5)：403-407；Sonoda等人，Protein Expr.Purif.2010,70(2)：248-253)。

具体地，可如下制备本发明的scFv抗体分子。在可诱导的启动子的控制下，于不同的大肠杆菌菌株(如W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294)中表达该构建体。该启动子可选自lacUV5、tac、T7、trp、trc、T5、araB。培养基优选完全符合Wilms等人，2001(Wilms等人，Biotechnology and Bioengineering2001，73(2)：95-103)、DeLisa等人，1999(DeLisa等人，Biotechnology and Bioengineering1999,65(1)：54-64)所限定或为其等效物。然而，在批次培养基和/或补料培养基中补充氨基酸(例如异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸)或复合培养基组分(例如大豆蛋白胨或酵母提取物)可是有利的。以补料-分批模式进行发酵工艺。条件：温度20至40℃、pH5.5至7.5、DO保持在20%以上。消耗初始碳源之后，用如上所述的补料培养基(或等效物)补充该培养物。当发酵器中的细胞干重达到40至100g/L时，用对应于所使用的启动子系统(例如IPTG、乳糖、阿拉伯糖)的适当诱导物诱导该培养物。可通过将各诱导物长时间分别补充入发酵器中(以脉冲式全诱导或部分诱导的方式，或其组合方式)来进行该诱导。生产阶段应持续至少4小时。通过在转筒离心机、管状转筒离心机或多盘式离心机(disk stack centifuge)中离心，回收所述细胞，舍弃培养物上清液。

将大肠杆菌细胞块重新混悬于4-至8-倍量的溶胞缓冲液(磷酸盐或Tris缓冲液，pH7至8.5)中。优选通过高压使溶解细胞均质化，接着于转筒、管状转筒或多盘式离心机中离心回收细胞集结块。用20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA、2M尿素、0.5%Triton X-100，pH8.0洗涤含有scFv包涵体的细胞块2至3次，接着使用20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA，pH8.0进行两步骤的洗涤。最终，通过转筒、管状转筒或多盘式离心机离心，回收scFv包涵体。

可在含有促溶剂(如6M胍-HCl或8至10mM尿素)的100mM甘氨酸/NaOH、5mM EDTA、20mM二硫苏糖醇、pH9.5至10.5溶液中溶解scFv包涵体。在培养30至60分钟之后，将溶液离心，并回收含有目标蛋白的上清液，用于随后的重折叠(refolding)。优选以分批补料模式，通过在重折叠缓冲液中将该蛋白溶液以1:10至1:50稀释至0.1至0.5mg/ml的最终蛋白浓度，来进行重折叠。重折叠缓冲液可含有50至100mM Tris和/或50至100mM甘氨酸、50至150mM NaCl、1至3M尿素、0.5至1M精氨酸、2至6mM的氧化还原系统，例如半胱氨酸/胱氨酸或氧化/还原谷胱甘肽，pH9.5至10.5。在4℃培养24至72小时之后，任选使用0.22μm过滤器过滤重折叠溶液，稀释并将pH调至pH7.0至8.0。通过结合模式的阳离子交换色谱(例如ToyopearlGigaCap S-650M、SP琼脂糖凝胶FF或S HyperCel^TM)在pH7.0至8.5下，分离蛋白。通过线性递增的NaCl梯度，进行洗脱。合并含有目标蛋白的级份，且随后在以非结合模式的阴离子交换柱(例如Toyopearl GigaCap Q-650M、Q-琼脂糖凝胶FF、Q HyperCelTM)上分离，接着进行阳离子交换纯化步骤(例如SP Sepharose HP)。合并目标蛋白纯度至少90%的级份，且通过透析或分子排阻色谱法在PBS中调配。通过还原性SDS-PAGE，分析所制备的scFv分子的同质性及产物品质，其中该可在约26kDa处的单一主要条带中检测到该scFv。该scFv的其他特征分析法包括质谱、RP-HPLC及SE-HPLC。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子为Fab分子。在该格式中，以上公开的可变域可各自融合于免疫球蛋白恒定域，优选人类来源的免疫球蛋白恒定域。因此，重链可变域可融合于CH₁域(所谓Fd片段)，且轻链可变域可融合于CL域。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:99的重链及SEQID NO:100的轻链。优选地，抗体分子为Fab分子。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子包含SEQ ID NO:99的重链及SEQID NO:101的轻链。优选地，抗体分子为Fab分子。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子为由SEQ ID NO:99的重链及SEQID NO:100的轻链组成的Fab分子。

在本发明的另一方面中，所述抗体分子为由SEQ ID NO:99的重链及SEQID NO:101的轻链组成的Fab分子。

可使用编码Fab构建体的核酸，以在宿主细胞(如，大肠杆菌、毕赤酵母菌或哺乳动物细胞系(例如CHO或NS0))中表达所述重链及轻链。本领域已知可使所述链的适当地折叠、缔合及二硫键合至包括Fd片段及轻链的功能性Fab分子的方法(Burtet等人，J.Biochem.2007,142(6),665-669；Ning等人，Biochem.Mol.Biol.2005,38：204-299；Quintero-Hernandez等人，Mol.Immunol.2007,44：1307-1315；Willems等人，J.Chromatogr.B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.2003；786：161-176)。

具体地，可如下于CHO细胞中制备本发明Fab分子。根据制备商的说明书，使用Lipofectamine^TM及Plus^TM试剂(Invitrogen)，用编码该Fab分子的重链及轻链的表达构建体转染在不含血清的培养基的混悬液中生长的CHO-DG44细胞(Urlaub G.、Kas E.、Carothers,A.M.、及Chasin,L.A.(1983).Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammaliancells.Cell33,405-412)。48小时后，在含有200μg/ml的抗生素G418且不含次黄嘌呤及胸腺嘧啶的培养基中筛选出所述细胞，以产生经稳定转染的细胞群。随后，以递增浓度(至多100或400nM)添加甲氨蝶呤(MTX)至培养基，使所述稳定转染物进行基因扩增。所述细胞一旦适应，则进行10至11天的分批补料发酵，以制备Fab蛋白物质。

于化学上受限制的不含血清的培养基中，培养CHO-DG44细胞及其稳定转染体的混悬液培养物。每隔2至3天，分别以3×10⁵至2×10⁵细胞/mL的接种密度传代培养原种培养物。细胞于5%CO₂、37℃及120rpm下的MultitronHT培养器(Infors)中的摇瓶中生长。对于补料分批实验而言，在不含抗生素或MTX的BI-专用生产培养基中，将细胞以3×10⁵细胞/ml接种至摇瓶中。在37℃及5%CO₂(随后，随着细胞数增加，其降至2%)下，以120rpm搅拌所述培养物。每日测定包括细胞数、存活率、pH、葡萄糖及乳酸浓度的培养参数，且根据需要，使用碳酸盐将pH调整至pH7.0。每隔24小时，添加BI-专用补料溶液。在不同时间点，自上清液取样，通过ELISA测定Fab产物浓度。10至11天后，通过离心收集该细胞培养液，并转移至纯化实验室。

通过色谱及过滤法，自所述补料-分批培养物的上清液纯化Fab分子。采用亲和色谱法(例如蛋白G或蛋白L)作为主要捕获步骤。或者，结合亲和性及结合容量低的情况下，通过利用该分子的pI的阳离子交换色谱(CEX)，来捕获该Fab。通过其他正交纯化步骤，移除宿主细胞蛋白及杂质，例如DNA或病毒。

通过电泳法(例如SDS-PAGE)分析所制备的Fab分子的同质性及产物品质，其中SDS-PAGE可在约50kDa处检测到Fab，其为单一主要条带。该Fab产物的其他特征分析法包括质谱、等电点聚焦及分子排阻色谱。随后，通过BIAcore分析法分析结合活性。

通过夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)，定量分析所述细胞培养物上清液中的Fab或全长IgG分子。可使用对抗人-Fc片段(Jackson Immuno ResearchLaboratories)及人κ轻链(过氧物酶-共轭，Sigma)所产生的抗体检测该全长IgG。通过山羊多克隆抗人IgG(H及L，Novus)固定该Fab片段，并通过对抗人IgG所产生的绵羊多克隆抗体(过氧物酶-共轭，该结合位点)检测。

也可通过酶裂解自全长抗体分子产生Fab分子。此方法的优点为可应用稳健且高效的发酵及纯化的平台工艺，该工艺适于在所需产物品质下扩大规模及提高产率。对于纯化而言，可采用重组A蛋白树脂的亲和色谱法作为主要捕获步骤，其通常产生高纯度。

为此目的，将编码Fab序列的重链融合至人IgG抗体分子的Fc区域。随后，使用脂质转染法，将所得的表达构建体转染至在不含血清的培养基中悬浮生长的CHO-DG44细胞中。48小时之后，在含有200μg/ml的抗生素G418且不含次黄嘌呤及胸腺嘧啶的培养基中筛选所述细胞，以产生经稳定转染的细胞群。随后，以递增浓度(至多100或400nM)添加甲氨蝶呤(MTX)至培养基中，使所述稳定转染物进行基因扩增。所述细胞一旦适应，即进行10至11天的补料分批发酵，以制备IgG蛋白物质。

使用重组蛋白A-亲和色谱法，自该培养物上清液纯化该IgG蛋白。为了获得所需的中和Fab片段，在木瓜蛋白酶的存在下培养该全长IgG，所述木瓜蛋白酶在铰链区内裂解IgG，因而释放两个Fab片段及Fc-部分。

通过亲和色谱法(例如蛋白G或蛋白L)分离Fab分子。或者，结合亲和性及结合容量低的情况下，通过利用该分子的pI的阳离子交换色谱(CEX)来捕获Fab。通过其他正交纯化步骤移除宿主细胞蛋白及杂质，例如木瓜蛋白酶、DNA或病毒。

在本发明的另一方面中，该抗体分子为如本文所述的抗体分子的氨基酸序列变体。

可通过引入适当的核苷酸改变抗体DNA，或通过肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。所述变体包括例如删除和/或插入和/或取代本文实施例的抗体的氨基酸序列内的残基。可进行删除、插入及取代的任何组合，以形成最终构建体，条件是该最终构建体具有所需特性。氨基酸变化也可改变该人源化或变体抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数量或位置。

鉴定抗体的某些残基或区域为突变优选位置的适用方法为称为“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham及Wells所述(Science,244：1081-1085(1989))。此处，由中性或带负电荷的氨基酸(通常为丙氨酸)来识别(例如带电残基，如arg、asp、his、lys、及glu)并置换目标残基的残基或基团，以影响所述氨基酸与抗原的相互作用。随后，通过在取代位点处或为其进一步引入或引入其他变体，来纯化那些对所述取代官能展现敏感度的氨基酸位置。因此，虽然预定引入氨基酸序列变体的位点，但是无需预定突变本身的性质。例如为了分析在指定位点的突变的性能，在该目标密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变，并针对所需活性筛选所表达的抗体变体。

氨基酸序列插入法包括长度范围为自一个残基至含有100个或更多残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合体，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入体。末端插入体的实施例包括与抗原表位标签融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括与酶或多肽的抗体的N-或C-末端的融合体，其延长该抗体的血清半衰期。

另一类型的变体为氨基酸取代变体。这些变体已移除该抗体分子中至少一个氨基酸残基，并将一个不同的残基插入该位置。取代突变基因最受关注的位点包括高可变区，但是也包括FR变化。保守性取代基示于以下表中，标题为“优选取代基”。如果所述取代造成生物活性的变化进而带来更实质性的变化，则可引入这些称为“示例性取代基”的取代基或如下参考氨基酸类别的取代基，并筛选产物。

在蛋白化学中，通常认为：在保持下列各项特性下，通过选择具有显著不同效用的取代法，来实现抗体的生物学特性：(a)取代区域中的多肽骨架的结构，例如呈片型或螺旋构象，(b)在目标位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链性质将天然存在的残基分为以下几组：

(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水性：cys、ser、thr；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：asn、gin、his、lys、arg；

(5)影响链定向的残基：gly、pro；及

(6)芳香性：trp、tyr、phe。

非保守性取代将会使所述类型中的一成员改变成另一类型。

任何不参与保持该人源化或变体抗体的适当构象的半胱氨酸残基也可经取代(一般经丝氨酸取代)，以提高该分子的氧化稳定性、避免异常交联，或为细胞毒性或细胞生长抑制性化合物提供确定的共轭点。反之，可使该抗体增加半胱氨酸键以提高其稳定性(尤其是当该抗体为抗体片段(如Fv片段)时)。

一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一或多个高可变区残基。一般而言，用于进一步开发所筛选得到的变体将比产生其的亲本抗体具有改善的生物特性。产生所述取代变体的一个便利方法就是使用噬菌体展示法的亲和性成熟。简而言之，使数个高可变区位点(例如6至7个位点)突变，以在各位点产生所有可能的氨基取代。因此所产生的抗体变体会以单价方式，由丝状噬菌体颗粒展示为与各颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体。随后，针对其生物活性(例如结合亲和性)，筛选所述噬菌体展示的变体。为了识别用于修饰的候选高可变区位点，可进行丙氨酸扫描突变，以识别主要负责抗原结合的高可变区残基。或者，或此外，可能宜分析该抗原-抗体复合物的晶体结构，以识别该抗体与人达比加群之间的接触点。根据本文所述的技术，所述接触残基及邻近残基为候选的取代基。一旦产生所述变体，则使一组变体接受如本文所述的筛选，且可在一或多个相关分析法中筛选具有卓越特性的抗体，用于进一步研发。

另一类抗体的氨基酸变体改变该抗体的初始糖基化模式。“改变”指删除一或多个该抗体中出现的碳水化合物部分，和/或添加一或多个该抗体中不存在的糖基化位点。

在某些实施方案中，需要改良本发明的抗体，以添加糖基化位点。抗体的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接是指该碳水化合物部分附接在天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸及天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)为碳水化合物部分经酶促附接天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中出现其中任一种三肽序列即产生可能的糖基化位点。O-连接的糖基化是指由糖类N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、木糖中之一附接羟基氨基酸(最常使用丝氨酸或苏氨酸，但是也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)。因此，为了使既定蛋白(例如抗体)糖基化，将该蛋白的氨基酸序列经工程改造为含有一或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)。也可通过添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基来改变原抗体的序列(对于O-连接的糖基化位点)。

通过各种本领域已知的方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。所述方法包括(但不限于)自天然来源中分离(若天然存在氨基酸序列变体时)或通过如本文所述的抗体分子的先前制备的变体或非变体型的寡核苷酸介导的突变(或定点突变)、PCR突变，及序列盒诱变法制备。如上所述，本发明的抗体分子的抗原为抗凝血剂。使用该抗原，通过使动物免疫化或通过如噬菌体展示方法自序列库筛选抗体序列，以产生抗体分子。

动物的免疫化方案为本领域公知。为了获得适当的免疫反应，可能需要将该抗原与佐剂(如，磷酸铝、氢氧化铝、角鲨烯或弗氏完全/不完全佐剂)组合。

本发明上下文中的抗原(如达比加群)大多数为相当小的有机分子，有时在给药给动物后，其无法刺激抗体形成。因此，可能需要将该抗原附接至大分子(如半抗原)上。

在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包括如上所述的抗体分子和药物载体。

为了用于治疗，将抗体分子包括至适于促进对动物或人给药的药物组合物中。可通过将该抗体分子与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干或其他干制剂或水溶液或水性或非水性混悬液的形式，来制备该抗体分子的典型制剂。载体、赋形剂、修饰剂或稳定剂在其使用剂量及浓度应无毒性。它们包括缓冲液系统，如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其他无机或有机酸及其盐；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂，如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双胺、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁基醇或苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮或聚乙二醇(PEG)；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖、寡糖或多糖及其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子(counter-ion)，如钠；金属错合物(例如Zn-蛋白错合物)；和/或离子或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM(聚山梨醇酯)、PLURONICS^TM或脂肪酸酯类、脂肪酸醚类或糖酯类。该抗体制剂中也可含有有机溶剂，如乙醇或异丙醇。该赋形剂也可具有改变释放性或改变吸收性的功能。

在一方面中，该药物组合物包含所述抗体分子浓度为10至20mg/ml的水性缓冲溶液，或由此溶液制成的冻干物。

优选的施用模式为肠胃外施用，通过输注或注射(静脉内、肌内、皮下、腹膜内、皮内)，但是也可采用其他施用模式，如通过吸入、透皮、鼻内、口含、口服。

在另一方面中，本发明涉及一种如上所述的抗体分子，其用于治疗或预防抗凝血疗法的副作用，尤其是出血事件。

在另一方面中，本发明涉及如上所述的抗体分子在药物制备中的用途，所述药物用于治疗或预防本文所述的疾病或病症，特别是抗凝血疗法的副作用。

在另一方面中，本发明涉及一种如上所述的抗体分子，其用于逆转抗凝血剂的过量，特别是达比加群或达比加群酯的过量。

在另一方面中，本发明涉及一种如上所述的抗体分子，其用作抗凝血剂的解毒剂，特别是达比加群或达比加群酯的解毒剂。

在另一方面中，本发明涉及一种治疗或预防抗凝血疗法的副作用的方法，其包括向有此需要的患者给药有效量的如上所述的抗体分子。

在另一方面中，本发明涉及一种治疗抗凝血疗法过量事件的方法，其包括向有此需要的患者给药有效量的如上所述的抗体分子。

在另一方面中，本发明涉及用于在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中降低达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的血浆浓度的方法，其包括给予逆转剂的步骤，该逆转剂可中和患者中达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性。

在另一方面中，本发明涉及中和达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸活性的逆转剂，其用于正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中，其中该患者有被认为威胁生命的或导致血流动力学损伤的大出血，或其中该患者需要紧急医疗程序。

在另一方面中，本发明涉及一种在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中降低达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的血浆浓度的方法，其中该患者有被认为威胁生命的或导致血流动力学损伤的大出血，或其中该患者需要紧急医疗程序，该方法包括给予逆转剂的步骤，该逆转剂可中和患者中达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性。

在另一方面中，本发明涉及一种在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中逆转达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的抗凝血作用的方法，其中该患者有被认为威胁生命的或导致血流动力学损伤的大出血，或其中该患者需要紧急医疗程序，该方法包括给予逆转剂的步骤，该逆转剂可中和患者中达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性。

在一项优选实施方案中，该逆转剂为一种针对达比加群的抗体分子，其能中和达比加群、达比加群酯和/或1-O-酰基葡糖苷酸的抗凝血活性。在另一项优选实施方案中，该逆转剂为本文所述的针对达比加群的抗体分子。

优选地，血浆中达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的浓度高于0nM但少于1000μM，且其中该用于中和达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性的逆转剂以达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸相对于逆转剂的化学计算量存在。

在另一方面中，血浆中达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的浓度高于0nM但少于1000μM，且其中该用于中和达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性的逆转剂以达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸与逆转剂的摩尔比为1:1至1:100存在。

在另一方面中，血浆中达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的浓度为30nM至1000μM，且其中该用于中和达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性的逆转剂以达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸与逆转剂的在30nM至1000μM之间的某一比例存在。

在另一方面中，本发明涉及一种在由于凝血功能损伤或创伤而正在经受出血或有出血危险的患者中逆转或降低达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的活性的方法，其包括以下步骤：

(a)测定患者中达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸存在的量；

(b)给予有效量的药物以逆转或降低该患者中测定的达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的活性；

(c)监测该患者的凝血酶凝固时间以确保达到达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的活性的逆转或降低。

在一优选方面中，达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸活性的逆转为100%。在另一优选方面中，达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸活性的降低是指患者中达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的活性降低10%至99%。

所需给药抗体的“治疗有效量”为预防、减轻或治疗抗凝血疗法的副作用所需的最小量，具体为可有效止血的最小量。这可使用化学计量的抗体分子达成。

例如达比加群以推荐剂量给药时，可达到200nM的血浆浓度。当使用分子量为约50kD的单价抗体分子时，例如使用当静脉推注时，可在约1mg/kg的剂量下达到中和。在另一实施方案中，施用于人患者的Fab分子的剂量可为每次施用50至1000mg，例如100、200、500、750或1000mg。根据情况(例如达比加群已经过量地给药于患者)，给药甚至更高的剂量是合适的，例如每次施用1250、1500、1750或2000mg。合适的剂量可根据所给药的抗凝血剂的类型及剂量、自给药后所经历的时间、该抗原分子的性质、该患者的病症及其他因素而不同。本领域的技术人员已知确定治疗上有效且安全剂量的方法。

在另一方面中，本发明涉及一种抗体分子，其对达比加群和/或达比加群酯具有结合亲和性。优选地，如例如通过表面等离子共振分析(Malmqvist M.,“Surface Plasmon resonance for detection and measurement of antibodyantigenaffinity and kinetics.”Curr Opin Immunol.1993Apr;5(2):282-6)或动态排除分析(KinExA)技术(Darling,R.J.及Brault P-A.,“Kinetic exclusion assay technology：Characterization of Molecular Interactions.”ASSAY and Drug DevelopmentTechnologies.2004年12月2(6)：647-657)所测定，该抗体分子与达比加群和/或达比加群酯结合的亲和性的K_D值范围为0.1pM至100μM，优选1pM至100μM，更优选为1pM至1μM。

本发明的抗体分子也可用于分析及诊断操作，例如以确定样品(如血浆、血清或其他体液)中的抗原浓度。例如该抗原分子可用于酶联免疫吸附分析法(ELISA)，如实施例中所述。因此，在另一方面中，本发明涉及包含如本文所述的抗体分子的分析及诊断试剂盒，及各自的分析及诊断方法。

在另一方面中，本发明涉及一种制备如前述技术方案中任一项的抗体分子的方法，其包括：

a.提供一种宿主细胞，其包含一或多个编码与表达调控序列功能相关的抗体分子的核酸，

b.培养该宿主细胞，及

c.自该细胞培养物回收该抗体分子。

本发明还涉及一种含有用于中和口服抗凝血剂的物质(特别是直接凝血酶抑制剂)的制品和试剂盒。所述制品包括具有标签的容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶及试管。所述容器可由多种材料制成，例如玻璃、金属、塑料或其组合。所述容器中装有药物组合物，该药物组合物包含本文所述的抗体或达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐。药物组合物中的活性物质是具体的抗体或达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐。抗体容器上的标签指出该药物组合物用于在体内中和或部分中和达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐。

本发明的试剂盒包括一各或多个上文所述的容器。其还可包括作为商品所需以及使用者可能需要的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、填充剂、针、注射器以及带有使用说明书的包装。

在本发明的一个实施方案中，该试剂盒包括本文所述的任一抗体或其药物组合物。例如，该试剂盒可包括(1)本文所述的任一抗体或其药物组合物、(2)容器和(3)标签。

在另一实施方案中，该试剂盒包括本文所述的任一抗体或其药物组合物，以及达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐。达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐的形式可为固体、液体或凝胶的形式。在一个优选的实施方案中，所述达比加群酯的药学上可接受的盐为甲磺酸盐。在另一优选的实施方案中，达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐每剂量单位的规格为约50mg至约400mg、约75mg至约300mg、约75mg至150mg或约110mg至约150mg，以每天一次(QD)或每天两次(BID)给药。例如，该试剂盒可包括：(1)本文所述的任一抗体或其药物组合物，(2)达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐的药物组合物，(3)容器和(4)标签。

在另一实施方案中，该试剂盒包括：(1)第一药物组合物，其包含达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐，(2)第二药物组合物，其包含本文所述的任一抗体或其组合物，(3)指示将所述第一和第二药物组合物分别给药于患者的说明书，其中所述第一和第二药物组合物包含于分别的容器中，且将所述第二药物组合物给药于需要中和或部分中和达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的患者。

本发明还为正在接受达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者提供中和或部分中和达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的诊断方法，该方法包括给药本文所述的任一抗体、其组合物或其药物组合物。具体地，本发明提供了在患者中中和或部分中和达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的方法，该方法包括以下步骤：(a)确认患者正在接受达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗，且确认该患者服用的量；(b)在进行凝固或凝血试验或分析之前，用本文所述的任一抗体或其组合物中和达比加群或其1-O-酰基葡糖苷酸，其中达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸会干扰该试验结果或分析结果的精确读数；(c)使用来自患者的样品进行该凝固或凝血试验或分析，以确定达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸不存在的情况下血块形成的水平；和(d)调节达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐给药患者的量，以在患者中达到血块形成和分解之间的适当平衡。抗体与达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的摩尔比介于0.1至100之间，优选介于0.1至10之间。试验结果或分析结果的精确读数可为纤维蛋白原水平、活化蛋白C抵抗或相关测试的精确读数。

实施例

I.多克隆抗达比加群抗体的制备

为了制备多克隆抗达比加群抗体，用两种不同的半抗原以半抗原与载体蛋白(BSA)的不同的摩尔输入比来制备3种不同的免疫原。

为了筛选，制备辣根过氧化物酶(HRP)缀合物，并进行酶-免疫吸附分析法(ELISA)。

通过在蛋白A琼脂糖凝胶FF上的亲和色谱法，进一步纯化多克隆抗体。

1.材料及方法

测试化合物(达比加群)

1.1用于合成免疫原及示踪物的半抗原

1.2半抗原的合成

如下合成所述半抗原(半抗原1及半抗原2)：

半抗原1：2-[(4-甲脒基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-甲酸[2-(4-氨基-丁基氨基甲酰基)-乙基]-苯基-酰胺

1a3-[(4-甲基氨基-3-硝基-苯甲酰基)-苯基-氨基]-丙酸甲酯

在室温，在搅拌下将三乙胺(50.2mmol)滴加至4-甲基氨基-3-硝基-苯甲酰氯(23.3mmol)及3-苯基-氨基-丙酸甲酯(23.3mmol)在80mL无水四氢呋喃(THF)中的溶液中。三小时后，将该反应混合物蒸发至干，用水研磨残余固体，并通过过滤分离该固体产物。

产率：99%

C₁₈H₁₉N₃O₅(357.36)

TLC(硅胶；二氯甲烷/乙醇19:1)：R_f=0.48

1b3-[(3-氨基-4-甲基氨基-苯甲酰基)-苯基-氨基]-丙酸甲酯

在室温，于乙醇中，使用Pd(10%，Pd/C)作为催化剂进行氢化反应，还原产物1a的硝基。

产率：99%

C₁₈H₂₁N₃O₃(327.38)

TLC(硅胶；二氯甲烷/乙醇9:1)：R_f=0.23

质谱(ESI)：[M+H]⁺=328

1c3-({3-[2-(4-氰基-苯基氨基)-乙酰基氨基]-4-甲基氨基-苯甲酰基}-苯基-氨基)-丙酸甲酯

在室温，使1b产物(23.2mmol)及N-(4-氰基-苯基)-甘氨酸(23.2mmol)与CDI(23.2mmol)于无水THF中偶合。反应完成后，将该混合物蒸发至干，且未再进一步纯化即使用该粗产物。

产率：97%

C₂₇H₂₇N₅O₄(485.54)

质谱(ESI)：[M+H]⁺=486

1d3-({2-[(4-氰基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-苯基-氨基)-丙酸甲酯

将1c产物(22.6mmol)在100mL浓乙酸中的溶液加热至回流，持续1小时。随后，将该溶液蒸发至干，用水研磨残余固体，并在搅拌下，将pH调整至约8至9。通过乙酸乙酯萃取分离该粗产物，并经硅胶色谱法(洗脱液：二氯甲烷/乙醇1:1)纯化。

产率：58%

C₂₇H₂₅N₅O₃(467.52)

TLC(硅胶；二氯甲烷/乙醇9:1)：R_f=0.71

质谱(ESI)：[M+H]⁺=468

1e3-({2-[(4-氰基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-苯基-氨基)-丙酸

将氢氧化钠(20.0mmol)添加至1d产物(13.0mmol)在100mL甲醇中的溶液中。在40℃，搅拌该混合物2.5小时，且随后蒸发至干。用100mL水搅拌残余固体，并用浓乙酸将pH调整至约6。通过过滤分离所沉淀的产物，用水洗涤，并在60℃干燥。

产率：88%

C₂₆H₂₃N₅O₃(453.49)

TLC(硅胶；二氯甲烷/乙醇9:1)：R_f=0.33

质谱(ESI)：[M+H]⁺=454

1f{4-[3-({2-[(4-氰基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-苯基-氨基)-丙酰基氨基]-丁基}-氨基甲酸叔丁酯

在室温，搅拌1e产物(5.23mmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲

四氟硼酸盐(TBTU，5.23mmol)及N-甲基-吗啉(5.23mmol)在20mL DMF中的溶液30分钟。随后，添加(4-氨基-丁基)-氨基甲酸叔丁酯(5.23mmol)，并在室温再搅拌该混合物24小时。随后，用水(100mL)稀释该混合物，并通过乙酸乙酯萃取分离该产物。

产率：92%

C₃₅H₄₁N₇O₄(623.75)

TLC(硅胶；二氯甲烷/乙醇9:1)：R_f=0.51

1g2-[(4-甲脒基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-甲酸[2-(4-氨基-丁基氨基甲酰基)-乙基]-苯基-酰胺

将1f产物(4.81mmol)溶于HCl的饱和乙醇溶液(250mL)中，并在室温搅拌该混合物过夜，且随后在30℃蒸发至干。将残余的粗物质溶于200mL无水乙醇中，随后添加碳酸铵(48.1mmol)，并在室温搅拌该混合物过夜。蒸发该溶剂之后，用约5mL乙醇研磨残余粗物质，过滤分离未溶解的物质，且在30℃蒸发该溶剂。随后，将该产物溶于30mL水中，并用约2g木炭搅拌该溶液，过滤并蒸发至干。

产率：90%

C₃₀H₃₆N₈O₂(540.67)

TLC(反相RP-8；甲醇/5%NaCl水溶液9:1)：R_f=0.79

质谱(ESI)：[M+H]⁺=541

[M+Cl]^-=575/7

半抗原2：2-[(4-甲脒基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-甲酸[2-(2-氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基]-吡啶-2-基-酰胺

2a3-({2-[(4-氰基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-吡啶-2-基-氨基)-丙酸

将3-({2-[(4-氰基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-吡啶-2-基-氨基)-丙酸乙酯(41.4mmol)添加至氢氧化钠(50.0mmol)在500mL乙醇及50mL水中的溶液中。在室温，搅拌该混合物3小时，随后蒸馏出约350mL乙醇，添加约100mL水，并将pH调整至6。随后，添加乙醚(50mL)，并搅拌该混合物过夜。通过过滤分离该产物，且无需进一步而纯化使用。

产率：78%

C₂₅H₂₂N₆O₃(454.48)

2b{2-[3-({2-[(4-氰基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基}-吡啶-2-基-氨基)-丙酰基氨基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯

在室温，搅拌2a产物(2.20mmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲

四氟硼酸盐(TBTU,2.20mmol)及N-甲基-吗啉(2.20mmol)在无水四氢呋喃(100mL)中的溶液15分钟。随后，添加(2-氨基-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(2.20mmol)，并在室温再搅拌该混合物24小时。用40mL水稀释该混合物，通过乙酸乙酯萃取，分离该产物，并通过色谱法(硅胶；二氯甲烷/甲醇15:1)纯化。

产率：61%

C₃₂H₃₆N₈O₄(596.68)

质谱(ESI)：[M+H]⁺=597

[M+H]^-=595

2c2-[(4-甲脒基-苯基氨基)-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-甲酸[2-(2-氨基-乙基氨基甲酰基)-乙基]-吡啶-2-基-酰胺

将2b产物(1.34mmol)添加至HCl在无水乙醇(30mL)中的饱和溶液中。在室温搅拌该溶液5小时，随后在30℃蒸发至干。添加乙醇(30mL)及碳酸铵(13.0mmol)，并在室温搅拌该混合物过夜。随后，蒸发该溶剂，残留物使用约4mL二氯甲烷/甲醇(30:1)的混合物研磨5次，过滤并蒸发，以自无机盐中分离该产物。

产率：27%

C₂₇H₃₁N₉O₂(513.61)

质谱(ESI)：[M+Cl]^-=548/50

[M+HCl+Cl]^-=584/6

[M+H]⁺=514

2.化学品

2.1用于试剂合成的化学品

2.2用于ELISA的化学品

2.3用于ELISA的缓冲液

使用来自Elgastat Maxima-HPLC超纯水处理系统的水，制备缓冲溶液。

3.免疫原的合成

为了刺激兔的免疫系统以制备针对达比加群的多克隆抗体，使用1,4-苯醌或1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)作为偶合剂，使所述半抗原(半抗原1及半抗原2)与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶合，来合成三种免疫原(批号GL256、GL258及GL262)。

合成GL256时，使用1,4-苯醌作为具有两个反应性位点的同型双官能性(homobifunctional)化合物。首先，在酸性pH下，仅在该两个位点中的一处与氨基反应，且在碱性pH下，另一位点在最低聚合度下反应。

使用1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)作为偶合剂，以半抗原对载体蛋白的不同的输入比合成GL258及GL262。

3.1GL256的合成

向0.75μMol BSA在8.5mL0.1M KH₂PO₄-缓冲液(pH=4.5)中的溶液中，添加0.416mMol1,4-苯醌(于1.5mL乙醇中)，在室温及黑暗下培养1.5小时。随后，使该溶液通过经0.15M NaCl平衡的sephadex G25柱，以除去过量的1,4-苯醌(最终体积12.5mL)。

在搅拌下，将2.5mL(0.15μMol)纯化的BSA-溶液缓慢添加至525μMol半抗原半抗原1溶于2mL0.1M NaHCO₃/Na₂CO₃-缓冲液(pH=8.5)中的溶液中。在添加该BSA溶液期间，将pH调整至约8.0。该半抗原与该载体蛋白的摩尔输入比为3500:1。

在室温培养过夜之后，由该免疫原相对于1升蒸馏水透析6次。薄层色谱法显示，没有未结合的半抗原的斑点残留于该半抗原-载体缀合物中。

取该免疫原分装冷冻储存在-20℃。通过UV吸收光谱在302nm处测定，该免疫原上清液中的BSA经半抗原取代的程度为约1:18。最终溶液中的免疫原含量为0.75mg GL256/mL。

3.2GL258的合成

在室温，制备158μMol半抗原2在6.3mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液。添加158μMol1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)，并先在10℃培养4小时，且随后在室温培养30分钟。用薄层色谱法检查该化学反应，且为约20-25%。

随后，将0.75μMol BSA溶于2mL0.13M NaHCO₃溶液中，并在搅拌下滴加1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。将pH调整至约8.3。随后，在搅拌下将该半抗原溶液(6.3mL)及4mL0.13M NaHCO₃溶液滴加至该BSA溶液中，且将pH调整至8.4。针对该免疫原GL258而言，该半抗原与该载体蛋白的摩尔输入比为210:1。

在室温及搅拌下培养过夜之后，由该免疫原相对于1升蒸馏水透析6次。薄层色谱法显示，没有未结合半抗原的斑点残留于该半抗原-载体缀合物中。

该免疫原分装冷冻储存在-20℃。通过UV吸收光谱在302nm处测定，该免疫原上清液中的BSA经半抗原取代的程度为约1:5。最终溶液中的免疫原含量为0.28mg GL258/mL。

3.3GL262的合成

在室温，制备225μMol半抗原2在8.75mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液。添加225μMol1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)，并在10℃培养4小时。用薄层色谱法检查该化学反应，且为约20至25%。

随后，将0.49μMol BSA溶于2mL0.13M NaHCO₃溶液中，并在搅拌下滴加1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。将pH调整至约8.2。随后，在搅拌下，将该半抗原溶液(8.75mL)及6mL0.13M NaHCO₃溶液滴加至该BSA溶液中，且将pH调整至8.3。针对该免疫原GL262而言，该半抗原与该载体蛋白的摩尔输入比为460:1。

该免疫原分装冷冻储存在-20℃。通过UV吸收光谱在302nm处测定，该免疫原上清液中的BSA经半抗原取代的程度为约1:32。最终溶液中的免疫原含量为0.71mg GL262/mL。

4.缀合物的合成

4.1GL261的合成

在室温制备37.4μMol半抗原2在1.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液。添加37.5μMol1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)，且先在10℃培养4小时，随后在室温培养30分钟。用薄层色谱法检查该化学反应，且为约20至25%。

随后，将1.125μMol辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.4mL0.13M NaHCO₃溶液中，并在搅拌下滴加0.267mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。将pH调整至约8.2。随后，在搅拌下，将该半抗原溶液(22.5μMol)及0.57mL0.13M NaHCO₃溶液滴加至该HRP溶液中，且将pH调整至8.4。针对该HRP缀合物GL261而言，该半抗原与该HRP的摩尔输入比为20:1。

在室温及搅拌下培养过夜之后，通过凝胶色谱法将该HRP缀合物自有机溶剂及过量的半抗原中分离。使该溶液通过经0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0平衡的sephadex G25柱。

在最终浓度的半抗原-HRP缀合物(示踪物，5.64mg/mL)中加上BSA(其形成约10mg/mL的浓度)、等体积的甘油(以避免冻结)及百里酚晶体(以避免细菌生长)。将该示踪物溶液标为批号GL261并分装储存于-20℃。

通过UV光谱在302nm处测定，HRP经半抗原取代的程度为约1:0.2。

使用邻苯二胺(OPD)作为底物及使用天然HRP作为参考物质，于BSA-阻断的微量培养板中测量该示踪物的比活性。在黑暗中培养经稀释的HRP标准品或该半抗原-HRP缀合物与底物溶液的混合物30分钟，用硫酸终止反应，并在490nm处测量吸光度。残留活性为天然HRP的94%，且该缀合物制剂在甘油中的比活性为611U/mL。

示踪物规格总结：

5.免疫化及抗体的制备

5.1兔的免疫化

用100μg免疫原GL256、GL258及GL262在0.5mL0.9%NaCl溶液及0.5mL弗氏完全佐剂(CFA)中的乳液，使12只3个月大的雌性金吉拉兔(Chinchilla Rabbit)免疫。在下一个月进行数次追加免疫化。针对第三次免疫化，使用0.5mL弗氏不完全佐剂(IFA)。每次都在四个皮下位点及四个肌内位点处进行免疫化。

A组-免疫原GL256

B组-免疫原GL258

C组-免疫原GL262

免疫化方案：

*1至12号兔在第5次免疫化后10天完全放血。

在使用甲苯噻嗪(

Bayer，Leverkusen，Germany)及盐酸氯胺酮(

Parke-Davis，Freiburg，Germany)的麻醉下，自颈动脉进行放血。

5.2兔血清的分析

血清通过将凝固的兔血离心而制备。通过硫酸铵沉淀法并通过SephadexG25柱的脱盐，获得蛋白级分。

通过标准ELISA操作，在该兔血清所分离的各蛋白级分中筛选抗达比加群效价。

筛选-ELISA：

5.3于兔血清中检测抗达比加群抗体

最后三栏：针对达比加群的值

第2次抽血

最后抽血

自第2次抽血筛选所有兔的蛋白级分之后，显然，兔5号(#54)与优选的半抗原(半抗原2)具有抗达比加群抗体的最高效价。此外，仅使用低浓度的分析物(达比加群)即可置换抗体结合位点的示踪物。

在最后的第3次抽血的筛选中，因为缺少关于所用免疫原的信息，所以使用低浓度的分析物(达比加群)置换抗体结合位点的示踪物用作主要决定标准。因此，兔2、3及5号用于进一步纯化。

5.4多克隆抗体的纯化

兔5号(#54)第2次抽血及兔2、3及5号第3次抽血(最后一次抽血)的抗血清使用硫酸铵沉淀。在10℃，以4500U/分钟离心该沉淀30分钟，自该溶液分离，并再溶于Tris缓冲液中。重复此操作。通过在蛋白A琼脂糖凝胶FF上的亲和色谱法进一步纯化。该柱缓冲液为0.01M Tris pH=7.5，且使用0.1M甘氨酸pH=3.0洗脱。合并含有兔IgG的级分。通过在280nm的UV光谱，测定蛋白浓度。

抗体规格总结：

II.达比加群的中和

进行两个系列的实验，以显示所述抗体于活体外针对达比加群抗凝血活性的效果。从实验室中得到这四种多克隆抗体，并在人血浆中进一步测试。该测试为功能测试(凝血酶凝血时间)。

测试描述：

简言之，抽取全血至3.13%柠檬酸钠中，获得人血浆。随后离心，获得不含血小板的血浆，并转移至单独的试管中并冷冻，直至在测试当天需要时。在测试当天，使血浆在37℃解冻。

凝血酶凝血时间测试操作如下。首先，将凝血酶在所提供的缓冲液(DadeBehring测试试剂盒)中稀释至制备商规格(3IU/ml凝血酶)，并预热至37℃。在制成后2小时以内使用。所有测试均在市售的CL4凝血机(Behnk Electronics,Norderstadt,Germany)上进行。用吸管吸取50μL血浆加至所提供具有磁力搅拌子的测光管中，并在CL4机器中已预热至37℃的孔中搅拌2分钟。此时，添加100μL凝血酶溶液，并由该CL4自动记录血浆样品凝固所需的时间。在添加凝血酶及开始测量之前，先在所提供的测光管中的血浆中将达比加群预先培养5分钟。如果抗体也进行测试(至多50μL原液)，则在开始凝固之前，需另外在37℃培养5分钟(即，与达比加群一共培养10分钟，与抗体一共培养5分钟，且随后用凝血酶启动凝血)。

首先，通过将浓度递增的达比加群添加至人血浆中并测量在添加凝血酶之后的凝血时间，制成达比加群标准曲线(图1)。随着达比加群的浓度增加，该凝血酶凝血时间呈现依赖于浓度的增加。

对于第一组中和实验而言，将临床相关浓度的200nM达比加群添加至所有血浆样品中用于中和。所有4种抗体制剂均能使含有达比加群的血浆的凝血时间缩短(图2)。中和的程度与各抗体制剂中的蛋白浓度相关。随后，将具有最高浓度(D)的抗体溶液连续稀释，并在独立的另一组实验中测试其中和200nM达比加群抗凝血活性的能力。在图3中可看到，随着抗体浓度增加，达比加群引起的抗凝血活性呈现依赖于浓度的抑制。此外，当将非特异性兔多克隆抗体(蓝色方块)添加至含有达比加群的血浆中时，其没有中和抗凝血活性的能力。其对浓度依赖的变化及无法中和非特异性抗体的结果表示该抗体特异性地针对达比加群逆转抗凝血作用。

然而，这些浓度的达比加群是临床相关的，且使用更高浓度可能发生出血或过量。因此，也在图1中标准曲线的最高达比加群浓度(500nM)测试抗体抑制抗凝血活性的能力。图4示例性说明了抗体D也可抑制高浓度的达比加群。

III.单克隆抗-达比加群抗体的制备和表征

1.单克隆抗-达比加群抗体及Fab的制备

使用与载体蛋白(如血蓝蛋白及免疫球蛋白)缀合的半抗原1(参见实施例1.1)使小鼠免疫化，并产生杂交瘤(根据标准操作)。使自该培养物上清液纯化的单克隆抗体结合至达比加群-蛋白缀合物，且该结合可与溶液中的达比加群竞争结合，其半数最大抑制浓度在1至10nM范围内。通过木瓜蛋白酶裂解所述单克隆抗体，随后通过蛋白A除去Fc域，产生Fab。

使用标准方法，克隆所述小鼠抗体的重链及轻链的可变区并测序。序列通过所述抗体的蛋白谱分析及N-末端测序来确证。产生编码嵌合抗体的DNA构建体，该嵌合抗体包含特异性小鼠可变区及人IgG恒定区，且该蛋白于HEK293细胞中表达并纯化。

为降低潜在免疫原性，通过上述标准方法使小鼠单克隆抗体克隆35E6及27A9的序列人源化。通过于哺乳动物细胞(例如HEK293；CHO细胞)中短暂转染来产生人源化Fab且依次通过用苯甲脒琼脂糖进行亲和层析及尺寸排阻层析进行纯化。

2.表征单克隆抗达比加群抗体及Fab

9个单克隆抗体克隆DBG22(克隆22)、35E6、45B9、48E1、49F8、6A7F1、2F1E5、3B4E7、1F6G8、2D2E3及27A9的可变域的序列描述于表1中。SEQ IDNO67、68、69、92、93、94、99、100及101表示最优化及/或人源化的序列。Fab化合物VH5C/VK18包含HCVH5C(SEQ ID NO:99)作为重链及LCVK18(SEQ ID NO:100)作为轻链。Fab化合物VH5C/VK21包含HCVH5C(SEQ IDNO:99)作为重链及LCVK21(SEQ ID NO:101)作为轻链。因此，VH5C/VK18与VH5C/VK21两者均包含具有SEQ ID NO:67的CDR1、SEQ ID NO:68的CDR2及SEQ ID NO:9的CDR3的重链可变域，以及SEQ ID NO:64的CDR1、SEQ ID NO:65的CDR2及SEQ ID NO:69的CDR3的轻链可变域。两种Fab共有SEQ ID NO:92的重链可变区(VH5C)。VH5C/VK18包含SEQ ID NO:93的轻链可变区(VK18)，且VH5C/VK21包含SEQ ID NO:94的轻链可变区(VK21)。

在表1中，字母“CDR”表示互补决定区，“VH”表示重链可变区，“VK”表示κ轻链可变区，“CL”表示轻链恒定区，且“CH”表示重链恒定区，“LC”表示抗体分子的轻链，且“HC”表示抗体分子的重链。举例而言，“VHCDR1DBG22”表示克隆DBG22的重链可变域的第一CDR(CDR1)，且“DBG22VH”表示克隆DBG22的重链可变区。

表1

依实施例II中所述的凝血酶凝血时间测试，测试小鼠单克隆抗体克隆22中和人血浆中的达比加群抗凝血活性的能力。该抗体以剂量依赖性方式完全逆转人血浆中达比加群介导的依赖凝血酶的凝血时间延长(图5)。该抗体也有效抑制人全血中的达比加群功能。自此抗体产生的Fab阻断人血浆中的达比加群活性，表明单价抗原结合域可中和化合物的抗凝血活性(图6)。

达比加群在人体中的主要代谢途径为通过羧基部分的葡糖苷酸化。达比加群酰基葡糖苷酸已显示药理活性(Ebner等人，Drug Metab.Dispos.2010,38(9)：1567-75)。为了测试该小鼠单克隆抗体克隆22是否能中和这些代谢产物，自经达比加群处理的恒河猴的尿液中纯化达比加群酰基葡糖苷酸，并在凝血酶凝血时间测试中评估。该抗体剂量依赖性地在人血浆中逆转达比加群酰基葡糖苷酸-介导的依赖凝血酶的凝血时间延长，其与使用达比加群所观察到的效力类似(图7)。因此，该抗体有效阻断出现在人体中的达比加群代谢产物的抗凝血活性。

使用Kinexa技术，测定该Fab及包括克隆22的小鼠-人嵌合抗体的亲和性。将恒定浓度的Fab或嵌合抗体与多种浓度的达比加群培养，直至达到平衡。该培养之后，通过与生物素缀合的达比加群类似物所偶合的中性链亲和素(neutravidin)珠捕获该抗体，来测定游离抗体的浓度。用经FITC标签的抗-小鼠IgG(Fab特异性)F(ab')₂片段，检测所捕获的Fab。用与Cy5缀合的抗-人IgG检测所捕获的嵌合抗体。使用1:1结合模型，计算解离常数。所述实验的结果总结于下表中。

抗达比加群抗体的亲和力

抗体	表观Kd
		克隆22Fab	48pM
克隆22嵌合Ab	34pM

FAB与嵌合抗体两者均以高亲和力结合达比加群。

凝血酶凝血时间测试

凝血酶凝血时间操作如下。首先，将凝血酶在所提供的缓冲液(DadeBehring测试试剂盒)中稀释至制备商规格(3IU/ml凝血酶)，并预热至37℃。在制成后2小时以内使用。所有测试均在市售的CL4凝血机(Behnk Electronics,Norderstadt,Germany)上进行。用吸管吸取50μL血浆加至所提供具有磁力搅拌子的测光管中，并在CL4机器中已预热至37℃的孔中搅拌2分钟。此时，添加100μL凝血酶溶液，并由该CL4自动记录血浆样品凝固所需的时间。在添加凝血酶及开始测量之前，先在所提供的测光管中的血浆中将达比加群预先培养5分钟。如果抗体也进行测试(至多50μL原液)，则在开始凝固之前，需另外在37℃培养5分钟(即，与达比加群一共培养10分钟，与抗体一共培养5分钟，且随后用凝血酶启动凝血)。

嵌合抗体及人源化Fab在凝血酶时间分析中的活性分别展示于图8-10中。

亲和力测定(Kinexa方法)

使用

技术测定Fab及小鼠-人类嵌合抗体的亲和力。将恒定浓度的Fab或嵌合抗体与各种浓度的达比加群一起培育直至达到平衡。在此培育之后，通过将抗体捕捉于中性链亲和素珠粒上来测定游离抗体的浓度，所述珠粒与生物素结合的达比加群类似物偶合。用经FITC标记的抗人IgG(Fab特异性)F(ab')₂片段检测所捕捉的Fab。用与Cy5结合的抗人IgG检测所捕捉的嵌合抗体。使用1:1结合模型计算解离常数(K_D)。

使用动力学直接法(Kinetics Direct method)用

仪器测量速率常数(k_on及k_off)。在此方法中，将结合搭配物(binding partner)混合于溶液中，且随时间探测游离活性结合位点的浓度，因为活性结合位点由于形成复合物而消耗。在指定时间间隔下收集数据点且分析信号。以此方式，直接测量k_on且解离速率k_off计算为k_off=K_D×k_on。

表：使用

技术测定的嵌合抗体的K_D值。

表：人源化Fab VH5C/VK18及VH5C/VK21的K_D值、k_on及k_off

Fab-达比加群复合物的形成及结晶

将Fab浓缩至10mg/ml，与2摩尔浓度过量的达比加群混合且在4℃下培育1小时。按1:1混合复合物与结晶溶液。复合物在25%PEG1500、0.1M SPG缓冲液(pH7)中结晶。

数据收集及结构测定

所有晶体的数据集皆在Paul Scherrer Institut的Swiss light Source beamlinePXI-X06SA上收集。所有数据集皆用autoPROC套件处理(Vonrhein,C.,Flensburg,C.,Keller,P.,Sharff,A.,Smart,O.,Paciorek,W.,Womack,T.及Bricogne,G.(2011).Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.Acta Cryst.D67,293-302.)。

Fab VH5C/VK21:达比加群晶体以单位晶胞尺寸

的空间群P212121生长且衍射分辨率为

复合物结构通过使用同源Fab结构(PDB-ID1C1E)作为起始搜寻模型，用phaser程序(CollaborativeComputational Project，第4号.1994.“The CCP4Suite:Programs for ProteinCrystallography”.Acta Cryst.D50,760-763；Phaser crystallographic software.McCoy AJ,Grosse-Kunstleve RW,Adams PD,Winn MD,Storoni LC,Read RJ.J.Appl.Cryst.(2007).40,658-674.)进行分子置换加以解析。对电子密度图的分析显示达比加群的清晰电子密度。用Coot进行多轮模型构建并用autoBUSTER进行改进来改良完整结构(“Coot:model-building tools for molecular graphics”Emsley P,Cowtan K Acta Crystallographica Section D-BiologicalCrystallography60:2126-2132第12部分特刊第1期2004年12月；Bricogne G.,Blanc E.,Brandl M.,Flensburg C.,Keller P.,Paciorek W.,Roversi P,Sharff A.,Smart O.S.,Vonrhein C.,Womack T.O.(2011).BUSTER第2.11.2版.Cambridge,United Kingdom:Global Phasing Ltd)。

Fab VH5C/VK18:达比加群晶体分别以空间群P21及P212121生长。具有空间群P21的晶体显示单位晶胞尺寸且衍射分辨率为

具有空间群P212121的晶体显示单位晶胞尺寸

且衍射分辨率为

两种复合物结构均通过使用FabVH5C/VK21的结构作为起始搜寻模型，用phaser程序进行分子置换加以解析。对电子密度图的分析显示达比加群的清晰电子密度。用Coot进行多轮模型构建并用autoBUSTER进行改进来改良完整结构。

空间聚集趋势(SAP)的计算机分析

如(1)中所述计算各原子及各残基的空间聚集趋势(SAP)，但残基疏水性参数取自(2)。Fv SAP计算为抗体可变域中所有正性残基SAP值的总和。CDRSAP计算为抗体互补决定区中所有正性残基SAP值的总和。已计算来自蛋白数据库(protein data bank，PDB)的850种不同抗体结构的Fv SAP及CDR SAP，从而产生该两种性质的平均(μ_Fv及μ_CDR)及标准偏差值(σ_Fv及σ_CDR)。

接着根据以下各式计算抗体的Fv SAP及CDR SAP的Z评分

Z评分(Fv SAP)=(Fv SAP-μ_Fv)/σ_Fv及

Z评分(CDR SAP)=(CDR SAP-μ_CDR)/σ_CDR。

结果(图11)：

人源化Fab 18/15：

Z评分(Fv SAP)=1.06

Z评分(CDR SAP)=1.00

人源化Fab VH5C/VK18：

Z评分(Fv SAP)=-0.61

Z评分(CDR SAP)=-0.84

人源化Fab VH5C/VK21：

Z评分(Fv SAP)=-0.61

Z评分(CDR SAP)=-0.78

Fab18/15(参见WO2011089183)所具有的溶剂暴露疏水性表面大于蛋白数据库中已知抗体的平均值。

意外的是，VH5C/VK18(SEQ ID NO:99/SEQ ID NO:100)与VH5C/VK21(包含SEQ ID NO:99/SEQ ID NO:101)两者所具有的溶剂暴露疏水性表面均小于蛋白数据库中已知抗体的平均值(负性Z评分)。这表明这些化合物在水性介质中的溶解度增加且聚集趋势较低，从而使其更适用于抗体浓度较高的稳定药物制剂。

(1)Chennamsetty等人，Proc Natl Acad Sci;2009,106(29)，第11937-11942页。

(2)Cowan及Whittaker,Pept Res;1990,3(2)，第75-80页。

CHO细胞中Fab的表达

按如下过程产生Fab：短暂转染入CHO DG44，然后选择并生成稳定的细胞池。图13显示了用Fab18/15(参见WO2011089183)、Fab VH5c/Vk18和FabVH5c/Vk21分批补料运行的效价。出乎意料地，相比于Fab18/15，FabVH5c/Vk18和Fab VH5c/Vk21显示效价高出5-10倍。

Claims

1.一种针对达比加群的抗体分子，其包含具有选自SEQ ID NO:1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61及67的CDR1、选自SEQ ID NO:2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62及68的CDR2及选自SEQ ID NO:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57及63的CDR3的重链可变域，以及具有选自SEQID NO:4、10、16、22、28、34、40、46、52、58及64的CDR1、选自SEQ IDNO:5、11、17、23、29、35、41、47、53、59及65的CDR2及选自SEQ ID NO:6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66及69的CDR3的轻链可变域。

2.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ IDNO:2的CDR2及SEQ ID NO:3的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2及SEQ ID NO:6的CDR3的轻链可变域。

3.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ IDNO:8的CDR2及SEQ ID NO:9的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ ID NO:10的CDR1、SEQ ID NO:11的CDR2及SEQ ID NO:12的CDR3的轻链可变域。

4.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ IDNO:14的CDR2及SEQ ID NO:15的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:16的CDR1、SEQ ID NO:17的CDR2及SEQ ID NO:18的CDR3的轻链可变域。

5.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:19的CDR1、SEQ IDNO:20的CDR2及SEQ ID NO:21的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:22的CDR1、SEQ ID NO:23的CDR2及SEQ ID NO:24的CDR3的轻链可变域。

6.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:25的CDR1、SEQ IDNO:26的CDR2及SEQ ID NO:27的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:28的CDR1、SEQ ID NO:29的CDR2及SEQ ID NO:30的CDR3的轻链可变域。

7.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:31的CDR1、SEQ IDNO:32的CDR2及SEQ ID NO:33的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:34的CDR1、SEQ ID NO:35的CDR2及SEQ ID NO:36的CDR3的轻链可变域。

8.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:37的CDR1、SEQ IDNO:38的CDR2及SEQ ID NO:39的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:40的CDR1、SEQ ID NO:41的CDR2及SEQ ID NO:42的CDR3的轻链可变域。

9.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:43的CDR1、SEQ IDNO:44的CDR2及SEQ ID NO:45的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:46的CDR1、SEQ ID NO:47的CDR2及SEQ ID NO:48的CDR3的轻链可变域。

10.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:49的CDR1、SEQID NO:50的CDR2及SEQ ID NO:51的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:52的CDR1、SEQ ID NO:53的CDR2及SEQ ID NO:54的CDR3的轻链可变域。

11.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:55的CDR1、SEQID NO:56的CDR2及SEQ ID NO:57的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:58的CDR1、SEQ ID NO:59的CDR2及SEQ ID NO:60的CDR3的轻链可变域。

12.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:61的CDR1、SEQID NO:62的CDR2及SEQ ID NO:63的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:64的CDR1、SEQ ID NO:65的CDR2及SEQ ID NO:66的CDR3的轻链可变域。

13.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQ ID NO:67的CDR1、SEQID NO:68的CDR2及SEQ ID NO:9的CDR3的重链可变域，以及具有SEQ IDNO:64的CDR1、SEQ ID NO:65的CDR2及SEQ ID NO:69的CDR3的轻链可变域。

14.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:70的重链可变域及SEQ ID NO:71的轻链可变域。

15.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:72的重链可变域及SEQ ID NO:73的轻链可变域。

16.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:74的重链可变域及SEQ ID NO:75的轻链可变域。

17.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:76的重链可变域及SEQ ID NO:77的轻链可变域。

18.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:78的重链可变域及SEQ ID NO:79的轻链可变域。

19.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:80的重链可变域及SEQ ID NO:81的轻链可变域。

20.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:82的重链可变域及SEQ ID NO:83的轻链可变域。

21.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:84的重链可变域及SEQ ID NO:85的轻链可变域。

22.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:86的重链可变域及SEQ ID NO:87的轻链可变域。

23.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:88的重链可变域及SEQ ID NO:89的轻链可变域。

24.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:90的重链可变域及SEQ ID NO:91的轻链可变域。

25.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:92的重链可变域及SEQ ID NO:93的轻链可变域。

26.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:92的重链可变域及SEQ ID NO:94的轻链可变域。

27.如权利要求1至26中任一项的抗体分子，其中该轻链可变域融合于SEQ ID NO:97的恒定域。

28.如权利要求1至25中任一项的抗体分子，其中该重链可变域融合于SEQ ID NO:98的恒定域。

29.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:95的重链及SEQ IDNO:96的轻链。

30.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:99的重链及SEQ IDNO:100的轻链。

31.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQ ID NO:99的重链及SEQ IDNO:101的轻链。

32.如前述任一项权利要求的抗体分子，其为多克隆抗体；单克隆抗体；人抗体；人源化抗体；嵌合抗体；抗体的片段，特别是Fab、Fab'或F(ab')₂片段；单链抗体，特别是单链可变片段(scFv)；小模块免疫药物(SMIP)；域抗体；纳米抗体；双价抗体；或经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。

33.如前述任一项权利要求的抗体分子，其用于医药中。

34.如前述任一项权利要求的抗体分子，其用于治疗或预防抗凝血疗法的副作用及/或用于逆转抗凝血剂的过度给药。

35.如权利要求34的抗体分子，其中该副作用为出血事件。

36.一种治疗或预防抗凝血疗法的副作用或抗凝血疗法中的过度给药事件的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的前述任一项权利要求的抗体分子。

37.一种制备如前述任一项权利要求的抗体分子的方法，其包括

(a).提供宿主细胞，其包含一或多个编码与表达调控序列功能相关的抗体分子的核酸，

(b).培养该宿主细胞，及

(c).自该细胞培养物回收该抗体分子。

38.试剂盒，其包含如权利要求1至32中任一项的抗体或其药物组合物。

39.试剂盒，其包含：

(a)如权利要求1至32中任一项的抗体或其药物组合物；

(b)容器；及

(c)标签。

40.试剂盒，其包含如权利要求1至32中任一项的抗体，以及达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐。

41.一种在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中中和或部分中和达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的方法，其包括给予权利要求1-32中任一项的抗体或其药物组合物。

42.一种在患者中中和或部分中和达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的方法，该方法包括以下步骤：

(a)确认患者正在接受达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗，且确认该患者服用的量；

(b)在进行凝固或凝血试验或分析之前，用权利要求1至32中任一项的抗体中和达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸，其中达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸会干扰该试验结果或分析结果的精确读数；

(c)使用来自患者的样品进行该凝固或凝血试验或分析，以确定达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸不存在的情况下血块形成的水平；和

(d)调节达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐给药患者的量，以在患者中达到血块形成和分解之间的适当平衡。

43.在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中降低达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的血浆浓度的方法，其包括给予逆转剂的步骤，该逆转剂中和患者中达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性。

44.一种在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中逆转达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的抗凝血作用的方法，其中该患者有被认为威胁生命的或导致血流动力学损伤的大出血，或其中该患者需要紧急医疗程序，该方法包括给予逆转剂的步骤，该逆转剂可中和患者中达比加群或1-O-酰基葡糖苷酸的活性。

45.一种在由于凝血功能损伤或创伤而正在经受出血或有出血危险的患者中逆转或降低达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸的活性的方法，其包括以下步骤：

46.权利要求43至45任一项的方法，其中所述逆转剂为针对达比加群的抗体分子。

47.中和达比加群或达比加群的1-O-酰基葡糖苷酸活性的逆转剂，其用于正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中，其中该患者有被认为威胁生命的或导致血流动力学损伤的大出血，或其中该患者需要紧急医疗程序。

48.权利要求47的逆转剂，其为针对达比加群的抗体分子。