CN109844131A - 用于测试分析仪的非生物危害性溶液和方法 - Google Patents

用于测试分析仪的非生物危害性溶液和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可以用于向分析仪的用户呈现测试结果而不借助于人体血液或血浆的溶液和方法，从而克服每次使用分析仪时使用血液或血浆的缺点。在一些实施方案中，提供了与一种或多种血液凝固传感器底物一起使用以产生与凝血时间相关的信号的溶液，其中所述溶液是非生物危害性的。

Description

用于测试分析仪的非生物危害性溶液和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月20日提交的标题为“用于测试分析仪的非生物危害性溶液和方法”的美国临时申请62/410,565的权益。前述的全部内容在此引入作为参考。
背景
在疾病的检测和治疗中，研究患者的血液特性是有用的。这通常通过采集血液样品来完成，例如来自手指针刺的小样本，或来自静脉或动脉抽取的较大样本。可以在多种分析仪中分析血液，包括床旁检测(point-care)设备。床旁检测血液分析仪由多种人使用，例如医院或临床环境中的医疗专业人员，以及患者自己进行自我测试。通常从患者抽取血液样品并且将其应用于分析仪以获得结果。凝固中的这些测试包括但不限于活化凝血时间(ACT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)，凝血酶原/国际标准化比例(PT/INR)测试以确定血液的某些凝固特性等。
典型的ACT床旁检测测试可以包括将血液应用到测试条上，其中测试条包含接触活化剂，例如高岭土或接触活化剂激活血液中的组分以触发凝块的形成。
典型的PT/INR床旁检测测试可以包括将血液应用到测试条上，其中测试条包含组织因子以刺激血液凝块的形成。不同的分析仪可以测量凝块形成的不同方面。例如，Siemens Healthineers Xprecia Stride系统测量由血液与引入的组织因子反应形成的组分。
多种用户需要正确使用和了解床旁检测分析仪如何操作，并且有必要培训每个用户来操作分析仪。床旁检测分析仪通常包括多个步骤以获得血液样品的性质的正确读数，并且可以取决于血液样品的性质提供不同的结果/输出。一些用户，特别是自测患者，可能不熟悉床旁检测分析仪的使用和一般技术。用户可能需要进行分析器的若干操作以熟悉程序、输出和用户界面。一些床旁检测分析仪，例如那些测试凝固特性的分析仪，仅响应血液或衍生自血液的血浆样品，其中不正确的液体或不正确的操作将导致错误。
因此，训练潜在用户操作床旁检测分析仪可能是困难的，因为它通常需要潜在的生物危害性样品，例如血液或血浆或液体质量对照品来提供结果。有时在训练或演示期间需要多次测试，因此可能需要多个样品。可能需要多次手指针刺样品，导致一个人多次受伤。在其它情况下，可以从受训者或训练者以外的人那里采集血液，这引入污染、疾病传播和生物危害性废物产生的可能性。
在其它情况下，进行演示的人可能没有接受过处理潜在生物危害性溶液的培训。实例包括：
1)高管向潜在投资者的介绍。
2)研发科学家的公开讲座。
3)营销专家在临床会议上的演示。
4)由工程人员故意生成/测试错误。
5)软件工程师测试新算法。
6)销售人员对新用户的培训。
7)技术人员对返回的传感器进行快速评估。
在其它场合，例如大学演讲厅或会议中的贸易展区，可能无法建立用于处理生物危害性样品例如血液或液体质量对照品的演示血液凝固传感器的区域。实例包括。液体质量对照品也是不利的，因为它们昂贵，缺乏稳定性，通常需要重构，这可能是不方便的，并且包括生物危害性材料，例如血浆。
这些缺点使得成功演示和训练使用床旁检测分析器可能是困难或昂贵的，和/或引入健康风险。
本文公开了克服在血液凝固分析仪(例如床旁检测分析仪)的演示、训练或其它非诊断用途中使用血液或血浆的一些缺点的溶液和方法。
概述
如本文所述，获得用于非诊断目的的血液或血浆样品可能是困难的，并且产生危害性废物。
本发明涉及可用于向分析仪的使用者提供测试结果而不使用人血液或血浆的溶液和方法，从而克服每次使用分析仪时使用血液或血浆的缺点。
在一些实施方案中，本文公开的溶液用于与一种或多种血液凝固传感器底物一起使用以产生与凝血时间相关的信号，其中所述溶液是非生物危害性的。在一些实施方案中，本文公开的溶液包括蛋白水解酶，其切割其C-末端含有与电化学媒介体(mediator)或者比色或荧光报告基团连接的氨基酸的肽。在一些实施方案中，酶切割精氨酸的羧基侧。在一些实施方案中，氨基酸可以通过酰胺键与电化学媒介体或者比色或荧光报告基团连接。
在本发明的一些实施方案中，蛋白水解酶从肽释放无活性的电化学媒介体以产生活性电化学媒介体。在一些实施方案中，活性电化学媒介体可以通过电化学方法定量。在一些实施方案中，电化学方法可以是计时电流法。在一些实施方案中，蛋白水解酶是丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以是胰蛋白酶或凝血酶。
在本文公开的本发明的一些实施方案中，溶液可以进一步包括缓冲剂、表面活性物质和/或稳定剂。在一些实施方案中，该溶液还可以包含用于克服分析器中的错误检查的组分。
在一个实施方案中，提供了非生物危害性稳定的溶液，其可以包含切割凝血酶底物的蛋白酶。例如，蛋白酶可以是胰蛋白酶或凝血酶。
在一些实施方案中，本文公开的蛋白酶例如胰蛋白酶可以通过多种方法稳定，包括低温、相对高浓度的二价阳离子例如钙或镁、赖氨酸残基的还原性甲基化和/或冻干蛋白酶然后用单独的液体样品重构。
本文还提供了可以稳定溶液中的蛋白酶的支持实体。所述支持实体可以包含稳定组分以防止蛋白酶的自溶。例如，在一些实施方案中，胰蛋白酶可以通过钙离子稳定。在一些实施方案中，支持实体可以包含pH缓冲剂。一些分析仪对样品进行测试，例如确保条带已正确填充，未被损坏，并且放置的液体是血液。在一些实施方案中，添加例如盐的元素可以使仪表接受不含血液的非生物危害性样品。
本文公开的本发明的一些实施方案涉及包含一种或多种非生物危害性溶液的试剂盒，和/或包含一种或多种固体和液体以产生一种或多种非生物危害性溶液的试剂盒。
本发明的一些实施方案包括使用本文公开的非生物危害性溶液与一种或多种血液凝固传感器底物生成凝血时间的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括将本文公开的非生物危害性溶液与一种或多种与电化学媒介体连接的血液凝固传感器底物混合，测量电化学媒介体，并且生成凝血时间。
一些实施方案包括用于产生如本文所公开的非生物危害性溶液的方法，其用于与分析仪中的一种或多种血液凝固传感器底物一起使用以生成凝血时间。该方法可以包括将pH缓冲剂与蛋白水解酶混合，基于分析仪的时间尺度和阈值确定蛋白水解酶的浓度，并且产生非生物危害性溶液，用于与分析仪中的一种或多种血液凝固传感器底物一起使用来生成凝血时间。
本发明的一些实施方案涉及胰蛋白酶，其用作非生物危害性溶液中的蛋白水解酶，以模拟血液中的凝血酶。
附图简述
图1是经典血液凝固途径的构成示意图。
图2A和2B是用实施例1中描述的测试溶液获得的测试结果的图示。
图3显示了测试溶液的稳定性数据的图示。
图4A和4B是用实施例2中描述的测试溶液获得的测试结果的图示。
图5A和5B是用实施例3中描述的测试溶液获得的测试结果的图示。
详述
本文公开了非生物危害性材料，其在应用于分析仪的测试条时产生响应。一些血液凝固传感器含有与报告基团连接的肽。当内源性或外源性血液凝血途径被激活时，产生的凝血酶将报告基团从肽上切下，从而使报告基团具有电化学活性或改变其分光光度特征。在两个电极之间施加电势使得使用计时电流法或其它电化学技术来感测电活性报告基团。通过检测透射、反射或荧光来检测吸光度或其它光学性质的变化能感测生色或荧光报告基团。
本文描述的本发明的实施方案涉及可以包含蛋白水解酶的非生物危害性溶液。蛋白水解酶可以是丝氨酸蛋白酶。例如，酶可以是胰蛋白酶等。丝氨酸蛋白酶可以在精氨酸或赖氨酸的羧基侧切割肽。取决于分析仪，多种浓度的丝氨酸蛋白酶可以用于产生一定范围的凝血时间。例如，浓度可以基于配制溶液的测试的时间尺度和检测细节。本领域技术人员将能够使用关于测定本文公开的测试的浓度的本文教导来测定其它测试的浓度。例如，如果特定浓度的蛋白水解酶产生的凝血时间响应太快而不能证明特定类型的血液凝固试验，那么蛋白水解酶的浓度可以降低。
蛋白水解酶可以是胰蛋白酶、菠萝蛋白酶(来自菠萝)、木瓜蛋白酶(来自木瓜)、猕猴桃素(来自猕猴桃)、无花果蛋白酶(来自无花果)、重组因子Xa(精氨酸旁边的切割)、重组凝血酶、链霉蛋白酶(来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus))等。酶可以是冻干的。
本文所述的发明在测试溶液中使用蛋白水解酶例如胰蛋白酶，以模拟凝血酶的作用。该策略起作用是因为胰蛋白酶和凝血酶都是丝氨酸内肽酶，其在精氨酸或赖氨酸的羧基侧切割肽。多种浓度的胰蛋白酶可用于产生一定范围的凝血时间。
胰蛋白酶可以从多种非生物危害性无脊椎动物或脊椎动物来源中分离，例如小龙虾、被囊动物、七鳃鳗、鲑鱼、鸡、猪、小鼠等。
在一些实施方案中，可以选择胰蛋白酶浓度以模拟临床样品中通常遇到的INR值的范围。在其它实施方案中，可以使用落入多种分析仪所采用的预期用于液体质量对照品(LQC)溶液的INR值范围内的胰蛋白酶浓度。
本文公开的溶液和方法被设计为提供落入临床情况中预期的INR或ACT结果的典型范围内的值。本文报道的APTT值指示全血，一阶段、未校准的APTT值。对于本领域技术人员显而易见的是，调整可以将表观APTT值调整至落入不同范围内。
可以通过多种方法稳定蛋白水解酶。例如，酶可以用以下方法来稳定：低温、相对高浓度的二价阳离子例如钙或镁、赖氨酸残基的还原性甲基化和/或冻干蛋白酶然后用单独的液体样品重构。
在一些实施方案中，本文公开的溶液在4、20、30或40摄氏度(并且优选约4摄氏度或约20摄氏度)的温度具有超过1周、2周、3周、4周、5周、6周、12周、4个月、6个月、1年、2年、3年、4年或更长的贮存期限。
非生物危害性溶液还可以包含缓冲剂、表面活性物质、稳定剂或其任何组合。使用的缓冲剂、表面活性物质和/或稳定剂可以取决于分析仪确定。缓冲剂可以是Tris、MOPS、Hepes、PIPES等。表面活性物质可以是清洁剂，优选非离子性的，例如Tween-20、Triton X-100、Brij35、Nonidet P40等。稳定剂可以是钙、镁等。可以取决于分析仪调节缓冲剂、表面活性物质和/或稳定剂的浓度。在一些实施方案中，本发明不需要抗微生物防腐剂。
非生物危害性溶液还可以包含克服分析仪的错误陷阱的组分。例如，可以加入组分例如甘油、右旋糖或羟甲基纤维素等，以增加溶液的粘度，或者可以使用组分来添加或改变溶液的颜色。此外，可以添加盐以调节溶液的离子含量。
本发明的实施方案涉及试剂盒，其包含在瓶子或小瓶中的预混合的非生物危害性溶液。在其它实施方案中，试剂盒可以包含含有冻干蛋白水解酶的第一瓶或小瓶，和含有液体的第二瓶或小瓶。第一和第二小瓶的溶液可以在使用前混合。该试剂盒可以进一步包含使用该溶液的说明书。
本发明的实施方案涉及产生非生物危害性溶液的方法，所述非生物危害性溶液与一种或多种血液凝固传感器底物一起使用以产生与凝血时间相关的信号。该方法可以包括将pH缓冲剂与蛋白水解酶混合，并且基于分析仪的时间尺度和阈值确定蛋白水解酶的浓度。在一些实施方案中，pH的选择可以通过胰蛋白酶活性的最佳pH范围(pH7-9)来指导。
图1显示了形成凝块的经典凝固途径。在例如床旁检测分析仪上进行的不同测试试图测量人类患者血液的凝血时间或能力。通过将人血液样品置于测试条上并且通过血液与活化剂的表面接触测量内源性途径来进行一项测试，例如活化凝血时间(ACT)。测试条上的典型活化剂可以是高岭土。将血液应用于测试条上将激活血液中的内源性途径，引起凝固级联，产生许多血液因子，其与血液或测试条的组分例如磷脂和钙离子反应以从凝血酶原形成凝血酶。在未受伤的健康患者中，凝血酶通常不会以可察觉的浓度存在。
另一个测试是凝血酶原时间/国际标准化比例(PT/INR)，其测量通过外源性途径的凝血，如图1所示。这里，血液样品可以应用于掺入组织因子的测试条。与组织因子相互作用的血液样品模拟组织损伤，并且产生因子IIa(凝血酶)。
在分析仪例如由Abbot Point of Care制造的i-Stat手持式血液分析仪中，测量在测试条中产生的凝血酶水平以确定血液样品的凝血能力。凝血酶底物被样品中形成的凝血酶切割；该过程生成离去基团。凝血酶在氨基酸精氨酸的羧基侧切割肽链。可以使用多种检测方法来检测切割的离去基团，例如已知的比色或电化学方法。
实施例
实施例1：UBI PT/INR条
在第一个实施例中，向0.5 M Tris，pH7.5，50mM CaCl2和1mg/mL Tween-20中加入多种浓度的胰蛋白酶(0.0625ug/mL至10ug/mL)。在该实施例中，使用猪胰胰蛋白酶。
选择使用的胰蛋白酶浓度范围以模拟临床样品中通常遇到的INR值范围。然而，如本文所述，在其它用途中，使用落入多种分析仪所采用的液体质量对照品(LQC)溶液所预期的INR值的范围内的胰蛋白酶浓度也可能是有利的。
选择pH值为7.5是由胰蛋白酶活性的最佳pH范围(pH7-9)指导的。在该实施例中，相对高浓度的钙用于稳定胰蛋白酶以防止自溶。包括非离子型清洁剂Tween-20，因为它涂覆塑料表面并且有助于防止或减缓稀释的蛋白质粘附到表面和变性。
该实施例中的溶液被认为是非生物危害性的。当使用Siemens HealthineersXprecia Stride条和等效仪表作为液体质量对照品溶液进行测试时，所产生的瞬变不会被用于检测部分填充和暴露条的仪表中的多种错误陷阱算法所困。因此，该实施例中的非生物危害性溶液如同它们是液体质量对照品样品一样被仪表读取。典型的液体质量对照品溶液是生物危害性的，由血浆制成，并且一旦产生就具有短可存活寿命。
通过“LQC算法”获得的INR值范围跨越临床样品中将遇到的范围(参见图2A)。X轴的简单变换使数据线性化(参见图2B)。图2A和2B的值在下表1中提供。
表1.
[胰蛋白酶](ug/mL) 1/胰蛋白酶(mL/ug) INR
10 0.1 0.72
10 0.1 0.73
1 1 1.56
1 1 1.56
0.0625 16 12.92
0.0625 16 12.16
0.125 8 5.64
0.125 8 5.67
0.25 4 3.70
0.25 4 3.90
0.5 2 2.14
0.5 2 2.19
在含有10mM Tris，pH7.5，50mM CaCl2，1mg/mL Tween-20和0.1mg/mL靛胭脂(蓝色食品染料以帮助用户看到溶液)的溶液中加入0.87、1.6和3.8ug/mL TrypZean(玉米中表达的牛胰胰蛋白酶的重组形式)。将溶液储存在-20、4、20、30和40℃，并且历经294天的时间在多个时间进行测试。INR的变化小于0.5单位(INR值小于2)或30％(INR值大于2)被认为是可接受的。
图3中的结果显示，在4和20℃储存的3.8ug/mL胰蛋白酶溶液在整个试验期间的结果在可接受的范围内。3.8ug/mL胰蛋白酶溶液在多种温度的贮存期限总结在下表中。结果表明该溶液可以在极端温度存活(几次冻融循环，或在40℃几天)。此外，可以将溶液如上所述混合，并且在使用前将其在冷藏温度储存4年或在20℃储存1年。相反，典型的LQC样品必须在混合后20分钟内使用。
表2.
温度(℃) 贮存期限(天) 注解
-20 9次冻融循环
4 1648 4.5年
20 420 1.1年
30 85 12.1周
40 17 2.4周
上述实施例使用相对高的钙浓度和相对低的温度来防止胰蛋白酶的自溶。还有其它获得稳定的胰蛋白酶溶液方法，包括例如：
1)胰蛋白酶中赖氨酸残基的还原性甲基化。
2)使用专门设计的重组胰蛋白酶分子，该分子已经过稳定优化。重组方法的另一个优点是胰蛋白酶不是动物来源，因此极不可能含有病原生物。
实施例2：UBI ACT条
在第二个实施例中，为正在开发的内源性途径测定1创建非生物危害测试溶液。
图4A显示了内源性途径测定1凝血时间与多种胰蛋白酶浓度(6.25至125ng/mL)的关系图，图4B显示了线性化转化。图4A和4B的值在下表3中提供。
表3.
实施例3：UBI活化的部分促凝血酶原激酶时间条
非生物危害性测试溶液也可用于正在开发的内源性途径测定2，其使用不同的接触因子激活剂。
图5A显示了内源性途径测定2凝血时间与多种胰蛋白酶浓度(62.5至250ng/mL)的关系图，图5B显示了线性化转化。图5A和5B的值在下表4中提供。
表4.
实施例4：Abbott i-Stat仪表和ACT卡匣
可以将非生物危害性溶液与i-Stat仪表和ACT卡匣一起使用。
下表5显示了用不同浓度的胰蛋白酶(6.25至34.4ng/mL)获得的凝血时间。
表5.
[胰蛋白酶](ng/mL) ACT(秒)
34.4 91
6.25 393

Claims (15)

1.与一种或多种血液凝固传感器底物一起使用以产生与凝血时间有关的信号的溶液，其中所述溶液是非生物危害性的。
2.根据权利要求1的溶液，其包含蛋白水解酶，所述蛋白水解酶切割肽，所述肽的C-末端含有与电化学媒介体或者比色或荧光报告基团连接的氨基酸。
3.根据权利要求2的溶液，其中所述酶切割精氨酸的羧基侧。
4.根据权利要求2的溶液，其中所述氨基酸通过酰胺键与所述电化学媒介体或者比色或荧光报告基团连接。
5.根据权利要求2的溶液，其中所述蛋白水解酶从所述肽释放无活性的电化学媒介体以产生活性电化学媒介体。
6.根据权利要求5的溶液，其中所述活性电化学媒介体通过电化学方法定量。
7.根据权利要求6的溶液，其中所述电化学方法是计时电流法。
8.根据权利要求2的溶液，其中蛋白水解酶是丝氨酸蛋白酶。
9.根据权利要求8的溶液，其中丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶或凝血酶。
10.根据权利要求2的溶液，其还包含缓冲剂、表面活性物质和/或稳定剂。
11.根据权利要求2的溶液，其还包含克服分析器中的错误检查的组分。
12.试剂盒，其包含一种或多种非生物危害性溶液，或产生一种或多种非生物危害性溶液的固体和液体。
13.使用非生物危害性溶液与一种或多种血液凝固传感器底物生成凝血时间的方法，该方法包括：
将非生物危害性溶液与一种或多种与电化学媒介体连接的血液凝固传感器底物混合；
测量电化学媒介体；和
生成凝血时间。
14.用于产生非生物危害性溶液的方法，所述非生物危害性溶液与分析仪中的一种或多种血液凝固传感器底物一起使用以生成凝血时间，该方法包括：
将pH缓冲剂与蛋白水解酶混合；
基于分析仪的时间尺度和阈值确定蛋白水解酶的浓度；和
生成非生物危害性溶液以与分析仪中的一种或多种血液凝固传感器底物一起使用以生成凝血时间。
15.用作非生物危害性溶液中的蛋白水解酶以模拟血液中的凝血酶的胰蛋白酶。
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