CN101535498A - 电化学法测定血液样品中Xa因子抑制剂的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂(尤其是肝素和分级的或低分子量肝素以及直接的Xa因子抑制剂)的方法和装置，其特征在于，在第一步中将血液样品与检测试剂并与已知量的X因子试剂和诱导X因子转化成Xa因子的活化试剂接触，所述检测试剂含有至少一种由能由凝血酶裂解并通过羧基末端与产电物质酰胺基连接的肽残基组成的凝血酶底物，随后在第二步中，利用电化学方法测定作为测量信号的通过Xa因子介导的凝血酶活化而从凝血酶底物上裂解出的产电物质的量或活性和/或其时程，并最后在第三步中，根据该测量信号确定要分析的血液样品中Xa因子抑制剂的量或与其相关的测量值(尤其是与其相关的凝固时间)。

Description

电化学法测定血液样品中Xa因子抑制剂的方法和设备
技术领域：
本发明涉及电化学测定血液样品中Xa因子抑制剂(尤其是肝素和肝素衍生物以及直接的Xa因子抑制剂)的方法。
另外，本发明涉及基于干燥化学的测试元件和测试元件分析系统，其用于电化学测定血液样品中的Xa因子抑制剂，尤其是肝素和肝素衍生物以及直接的Xa因子抑制剂。
背景技术：
抗凝血剂(其尤其还包括肝素)经常被用于临床实践来预防和治疗止血紊乱(凝血系统紊乱)。肝素和肝素衍生物尤其被用于治疗和预防血栓栓塞疾病。它们非常有效地预防和治疗腿血管血栓、肺部栓塞并用于治疗不稳定型心绞痛和急性心肌梗塞。它们也经常在手术期间使用，尤其是用于心脏手术(旁路)和输血。
肝素的作用主要基于其与抗凝血酶III(ATIII)的相互作用，从而使它们改变ATIII的构型。这加速了某些凝血酶(凝血酶(FIIa)、Xa因子(FXa)和因子IXa)的失活，因此延迟了凝血。因此可将肝素归于Xa因子抑制剂。其它Xa因子抑制剂诸如有某些寡糖(如戊糖磺达肝素(Fondaparinux))或仍在临床开发中的并可归于不同物质类型的低分子量的直接的Xa因子抑制剂。除了已经使用了很长时间的未分级(unfraktioniert)的肝素(UFH＝肝素)之外，自十九世纪八十年代末以来使用了各种分级的肝素或低分子量肝素(＝LMWH)。分级的肝素现在已经代替UFH用于许多适应症了，而且其从未分级的肝素通过化学或酶促解聚作用制备，其中形成只有标准肝素约1/3大小的级分。由此减弱了这些LMWH对凝血酶的效果，而优先使得Xa因子失活。由于它们有更有利的药物动力学，因此分级的肝素比常规未分级的肝素具有其它优势。有关这些类型的物质的临床作用和意义的综述可在“肝素和低分子量肝素”(Mechanisms of Action，Pharmakokinetics，Dosing，Monitoring，Efficacy，and Safety)，Hirsh等；Chest2001；119：第64页-第94页中找到。
由于生物利用度的个体差异、蛋白质结合和30-150分钟的短半衰期，需要监视给药未分级的肝素的患者，由此避免可能的剂量过大(
Figure A200780040819D0006085212QIETU
)带来的出血倾向增加、或剂量不足(Unterdosierung)带来的血栓形成风险增加。在常规临床治疗中，经常利用活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)，也通过凝血酶凝固时间(TCT)或活化凝固时间(ACT)来进行以UFH治疗的监护。这些化验就是所谓的全局化验，因为它们非特异性地反映了凝血酶诱导的纤维蛋白凝块的形成。主要用于测定内部系统因子活性的aPTT测试，主要对肝素对凝血酶的抑制效应灵敏。aPTT测试对0.1-0.7U/ml的肝素范围敏感，但aPTT的正常范围以及其治疗范围非常强地取决于试剂和所使用的分析仪。另一种限制因素是样品稳定性，其尤其是在血液样品存放过久之后常常导致错误的结果。这类全局凝固化验的其它缺点还有，通常需要复杂的实验过程，其需要专门训练的人员来获得可重复的结果，并且这些测试需要相对高的试剂消耗。
在给药低分子量肝素时，由于其改善的药物动力学，对于通常的患者来说，并不绝对需要监视。可是，推荐在治疗开始时检查治疗，而且尤其对于由于其肾排泄改变而致肾功能不全的患者来说，它是必须的，并对于是极端体重、新生儿、儿童和孕妇的患者或使用它们几周内或刚有外伤或手术之后，也推荐使用监视。
在常规临床治疗中，尤其使用aPTT以监视LMWH，然而该测试对于该抗凝血剂来说仅具有不足够的灵敏性，而且其以非常强的程度依赖于所用的检测试剂。
FXa测试是适于监视低分子量肝素效应的检测测试。
迄今的FXa测试通常以生色测试或以凝固测试来进行，其中生色测试测量Xa因子活性，而凝固测试测量凝固。测试原理都遵循相同的测试历程：
1.FXa+[肝素/抗凝血酶III]→[FXa/肝素/ATIII]复合物+剩余的FXa
2.a)剩余的FXa从FXa特异性底物上裂解出生色残基(生色测试)
b)剩余的FXa裂解凝血酶原以形成凝血酶(通过凝血酶诱导的纤维蛋白交联进行的凝固测试)
当加入样品时，测试试剂中以确定量存在的Xa因子与样品中含有的肝素和抗凝血酶III结合，并与它们形成未活化的复合物。剩余的Xa因子裂解生色底物或与样品中含有的其它凝血因子形成凝血酶，而且凝血酶裂解纤维蛋白原以形成纤维蛋白(凝块形成)。裂解的底物的多少取决于Xa因子的活性。Xa因子的活性进而取决于样品中含有的肝素的量。虽然生色测试对于样品中FXa活性有特异性，但是凝固测试并不专门测量FXa活性，而通常对于LMWH来说，比对于aPTT更灵敏。
若干种生色测试可通过商业途径获得，但是仅有少数几种凝固测试(Sigma公司的Heptest，Pharmanetics公司的ENOX测试)是可通过商业途径获得的。这些各类测试仅适度地互相并与aPTT相关联，因为它们带有不同的终点。生色测试给出活性而非凝固时间。可是，凝固时间和Xa因子活性之间仅有中度的相关性。此外，这些生色测试需要分离血浆，而且它们不能直接用于全血样品中。由于复杂的样品准备和运行步骤以及所需的装置，这些测定方法是耗时、费力并需要复杂设备的。尽管Heptest输出凝固时间作为结果，可是在相同肝素浓度时，它可以是非常不同的，这取决于患者不同的肝素灵敏性。此外，需要确定肝素校正曲线，然后由其中读出测试结果。至今，仅有单一的Xa因子测试可用作为干燥化学测试，并由此还适于现场护理(Point of Care)仪器(Pharmanetics公司的ENOX测试)，其利用Bayer AG的快速点分析仪上的测试卡来进行。该测试专门为依诺肝素用于经皮腔内血管成形术而开发，而且仅能区分依诺肝素浓度>1U/ml和<1U/ml的情况，这特别是因为其它分级的肝素和未分级的肝素干扰测试，因而并不适于常规监测低分子量肝素。
WO 03/050298记载了这一如下的干燥化学Fxa测试的原理：要检查的样品优选是柠檬酸化的全血，将它与至少含有Xa因子活化剂(优选是鲁塞尔蝰蛇毒)和均匀分布的磁性颗粒的干燥化学试剂混合。样品中含有的X因子通过试剂中含有的Xa因子活化剂被转化成Xa因子，该Xa因子继而通过凝血酶原-凝血酶转化使纤维蛋白原转化成纤维蛋白，由此形成凝块。经光学方法通过观察由外部振荡磁场造成的反应批料中磁性颗粒的迁移率(Beweglichkeit)，来检测该凝块。因此，该测试原理是以纤维蛋白凝块形成为基础的，所述纤维蛋白凝块形成仅在检测由Xa因子引发的多级反应级联中的反应进程期间形成，其中除了Xa因子还包括酶和辅因子。因此，诸如纤维蛋白的聚合和交联需要存在钙离子和通过凝血酶依赖性活化而由失活的因子XIII形成的活化的因子XIIIa。因此，通过测定纤维蛋白凝块的方式来测定Xa因子也依赖于其它要素(essentiellenFaktor)和可能的干扰效应。除了该间接检测方法，WO 03/050298所述的检测方法需要复杂的检测和评估系统来进行Xa因子的测定。因此，在一个方面，凝固反应所发生的测试载体必须具有保证试剂和磁性颗粒与样品优良并均一混合的专门装置，而在另一方面，用于测定Xa因子活性的评估系统必须具有用于产生振荡磁场(如借助移动永磁体)的装置和用于照射并以光度检测磁性颗粒移动的光学系统。
WO 01/63271记载了一般的基于干燥化学的电化学传感器，用于测定血液凝固或各种凝血因子，所述电化学传感器在惰性载体上具有至少两个电极以及干燥的试剂，所述干燥的试剂含有由能由血液凝血系统蛋白酶裂解并通过羧基末端与被取代的胺(尤其是与苯二胺残基)酰胺基(amidisch)连接的肽残基组成的蛋白酶底物。在蛋白酶诱导的裂解之后，这些被取代的胺用作为第2类电子载体并可被用于电化学测定蛋白酶活性。除了通过蛋白酶凝血酶活性来确定凝固时间的所谓的全局测试(如aPTT、PT或ACT)之外，WO 01/63271还记载了可用于测定各个凝血因子或其抑制剂的测试。对于这种情况，WO 01/63271教导了使用特别为要测定的凝血因子而定制的底物，其肽部分特异性适配要测定的蛋白酶，由此通过该蛋白酶可特异性裂解它，并且被取代的胺作为可电化学检测的颗粒特异反映该蛋白酶的活性。当转用于Xa因子测试时，这意味着使用了由能由Xa因子裂解并通过羧基末端与被取代的胺(尤其是与苯二胺残基)酰胺基连接的肽残基组成的蛋白酶底物。其中，该测试原理类似于生色Xa因子测试原理，其中也使用Xa因子特异性底物的酶促裂解产物来测定Xa因子。
发明内容
本发明的目的是提供用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的方法和装置，其避免了现有技术的缺点。
本发明的目的尤其是提供用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的方法，其可简便地由未经专门培训的人员在时间、设备或人力要求低的情况下实施，并在短时间内产生可靠的结果。
本发明的目的尤其是提供用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的简单实施方法，其用尽可能少的方法步骤数和所需的试剂和/或设备来实施，由此能够快速、分散地(dezentral)在诸如重症监护病房或医院病房中直接分析。
本发明的目的尤其是提供用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的方法和装置，其使得也能直接在全血中进行测定，由此不需要任何复杂的样品准备步骤。
本发明的目的尤其是提供用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的方法和装置，其满足试剂保存性和稳定性的要求，并使得能尽可能准确并特异性地进行测定。
本发明的目的尤其是提供用于测定血液样品中的肝素(尤其是分级的肝素或低分子量肝素)以及直接的Xa因子抑制剂的方法和装置。
本发明的解决方案：
为了实现所述任务，本发明提供了用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的方法、电化学测试元件和测试元件分析系统以达到本专利独立权利要求所述的这些目的。优选的具体实施方式在从属权利要求中被声明。
为了实现这些目的，本发明特别记载了用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的方法，其特征在于，在第一步中，使要分析的血液样品与检测试剂并与已知量的Xa因子接触，所述检测试剂含至少一种由能由凝血酶裂解并通过羧基末端与产电物质酰胺基连接的肽残基组成的凝血酶底物，随后在第二步中，利用电化学方法测定作为测量信号的通过Xa因子介导的凝血酶活化而从凝血酶底物上裂解的产电物质的量或活性和/或其时程，并最后在第三步中，根据该测量信号确定要分析的血液样品中Xa因子抑制剂的量或与其相关的测量值(尤其是与其相关的凝固时间)。
根据本发明，在该方法的第一步中，已知量的Xa因子不直接作为Xa因子试剂加入，而是通过向样品加入已知量的X因子试剂和活化试剂而进行，其使得X因子转化成Xa因子。
本发明所述的方法进一步依照示例性的实施例来阐述：
测试原理的基础是通过电化学测量来测定由Xa因子诱导的凝固反应所形成的凝血酶的酶活性，其中至少一种裂解产物在电极上电化学测定。特别可使用三肽底物作为凝血酶特异性底物，所述三肽底物例如是还原的Chromozym TH(甲苯磺酰-甘氨酰-脯氨酰-精氨酸-4-苯基重氮酸乙酸盐(tosyl-glycy-prolyl-arginine-4-nitroanilide acetate))，其通过三肽部分的羧基末端与产电物质酰胺基连接。这类产电物质在WO 01/63271中有举例说明，并且其尤其可以是被取代的苯胺，特别是硝基苯胺衍生物或苯二胺。检测反应如下进行：
酶(凝血酶)从底物上裂解出产电物质，在本实施例中，其是苯二胺，其在电极上被氧化成苯二胺。在一个优选的具体实施方式中，在裂解产物被氧化的同时，在电极上发生辅助物质的还原(例如从刃天青到试卤灵)，可测量由此产生的与裂解产物的量相关的电流强度。因此，在本电化学反应中，刃天青在阴极上作为辅助物质被还原，而苯二胺在阳极上被氧化。双电极系统优选被用于电化学法测量凝血酶活性，其中一方面选择工作电极上的电势，使其高到足以氧化从凝血酶释放出的苯二胺，在另一方面，使其低到不还原三肽的残基。阴极(工作电极)和阳极(对电极)间的电势差由恒电位仪控制。在本实施例中，可选择约550mV的电势差作为合适的电势差，由此使得只在电极上发生所希望的反应。
对于本发明所述的方法，该电化学测试原理如下运用于Xa因子抑制剂测试中：
在反应批料中除了检测试剂，还有通过加入已知量的X因子试剂而形成的已知量的Xa因子和使X因子转化成Xa因子的活化试剂。要分析的血液样品含有待测定的Xa因子(FXa)抑制剂，其优选是肝素。该抑制剂与反应批料中以已知量并过量存在的Xa因子和血液样品中存在的抗凝血酶III形成化学计量的复合物。在该过程中，Xa因子(FXa)的残存量仍旧是依赖于样品中Xa因子抑制剂浓度的浓度。现在，这能与血液样品中存在的凝血酶原(并与其中还存在的Va因子)反应形成凝血酶原复合物并随后反应形成凝血酶，该凝血酶可如上所述通过凝血酶依赖性酶促裂解产电物质和电化学检测物质来测定。
样品中存在越多Xa因子抑制剂，与ATIII形成复合物后剩余的Xa因子(FXa)越少，并形成越少的凝血酶。本测量原理在严格意义上不检测凝固时间，即它不是借助纤维蛋白形成的凝固测试，而是借助电化学方法测定凝血酶形成的时程。
实施例2和图1示例性显示了根据本发明的方法而得的该电化学测定凝血酶的结果。
本发明所述的活化的Xa因子与凝血酶检测试剂的应用，相对于生色Xa因子测试和WO 01/63271中所述的方法，给出了更多有关凝血系统生理状态的信息，因为在该情况下，它不裂解人造的Xa因子特异性底物并用于测量Xa因子活性，而例如在生理凝固过程中才形成凝血酶。根据本发明，利用凝血酶特异性底物能电化学测定该凝血酶的形成，并利用合适的算法来例如转换成凝固时间。相对于基于测定Xa因子诱导的纤维蛋白凝块形成的Xa因子抑制剂测试，如Heptest或ENOX测试，本发明具有的优势有，通过电化学方法的测定简单得多而且能以较少人力和设备投入来实施。由于用本发明所述的方法测定Xa因子活性是通过测定生理凝固级联中才天然产生的下游凝血因子(凝血酶)的活性进行的，在一个方面，测定Xa因子抑制剂的生理活性的方式是比用使用非生理Xa因子底物操作的生色测试和WO 01/63271中所述的方法更接近天然的系统，在另一方面，Xa因子活性的检测在凝固级联中较早的时间点上进行，比用基于测定Xa因子诱导的纤维蛋白凝块形成的测试的情况要早，由此位于凝血酶形成和纤维蛋白凝块形成之间的下游凝血因子不影响Xa因子活性的测定。这能在生理系统中比用以前已知的测试更准确并更特异性地得到有关Xa因子活性的信息。
本发明的解决方案尤其还能在全血中进行Xa因子抑制剂的测定，因为相对于生色测量方法，在所用的电化学方法中，它不需要分离干扰性(尤其是有色)的血液成分。通过相对用于检测的产电物质匹配控制电极，诸如通过适配所选择的电极电势，可能使检测用于检测的产电物质基本不受样品或试剂中存在和潜在的其它干扰性物质影响。
为了测定Xa因子抑制剂，根据本发明需要向要检测的样品加入至少以下物质或它们必须存在于样品中：已知量的X因子、活化试剂和可从其酶促裂解出产电物质的肽性凝血酶底物作为检测试剂。
可是，用于凝血酶测试中的许多已知的凝血酶底物(包括广泛使用的Chromozym TH)不具有绝对和排他性的凝血酶特异性，而是也能被其它酶裂解。
Xa凝固因子是丝氨酸蛋白酶，其天然识别凝血酶原的氨基酸序列-Ile-Glu-Gly-Arg-，并通过裂解该序列而活化天然的凝血酶原底物以形成凝血酶。除了该生理底物，Xa因子也能酶促裂解其它具有这一或其它裂解序列的肽。因此，肽性凝血酶底物(尤其是广泛使用的Chromozym TH)也能通过Xa因子来裂解。该Xa因子的低底物特异性会在本发明所述的方法中带来问题，尤其是在该也能通过Xa因子裂解的凝血酶底物被用作检测试剂并已经在加入样品前就与Xa因子进行接触而由此被转化的情况下，带来问题。因此，已经能够转化凝血酶底物部分，使得其不再可供凝血酶介导的检测反应所使用，因此会因影响测量结果。该不希望的副反应尤其在Xa因子和凝血酶底物长时间接触的时候发生，例如，如果这些两种物质被同时导入液体检测试剂中，会是这种情况。
对于前述示例性的测量系统，这意味着，如果在开始检测反应前，Xa因子和用作凝血酶底物的还原的Chromozym TH已经能互相长时间反应，凝血酶底物部分已经被裂解，由此试剂中存在显著不确定量的裂解的产电物质。这种情况尤其会发生在这两种物质一起存在于液体试剂中的时候，或对于干燥化学测试的情况，在它们产生时以液体形式进行接触的时候。因此，普通的2h总保留时间已经足以仅由Xa因子作用而裂解约25％的还原的Chromozym TH。对于本发明所述的电化学方法，该Xa因子诱导的过早产生的底物降解的结果尤其会使测量信号在开始凝血酶引起裂解还原的Chromozym TH前，偏移至较高的电流强度而且在最小值时也已经具有高的电流强度，因为在样品中已经由于Xa因子的酶促作用而释放出苯二胺作为产电物质存在。
根据本发明，通过如下方式至少部分解决了过早产生的Xa因子引起底物降解的问题：在反应批料中已知量的Xa因子通过如下方式获得：向样品加入已知量的X因子试剂和将无蛋白水解活性的X因子转变成为蛋白水解活性的Xa因子的活化试剂。
令人惊讶的是，本发明所述的该方法显示，通过该试剂组合能获得特别简单并稳定的测试元件构造。在加入或活化活化试剂前，在试剂中不存在活化的Xa因子而是存在无活性的X因子的事实，使得能够在测定反应开始前已经将检测试剂与X因子接触，而不产生过早产生的Xa因子引发的底物降解并由此干扰测定。
在尤其优选的具体实施方式中，血浆凝固外部途径的活化剂或参与复合物被用作活化试剂。尤其是天然产生的活化剂或凝血因子(如组织因子和/或VIIa因子)可被用作活化试剂，而且除了这些天然产生的活化剂或凝血因子，它也可能使用其它活化剂，如合成制备的活化剂。
在进一步优选的具体实施方式中，血浆凝固内部途径的活化剂或参与复合物被用作活化试剂。尤其是天然产生的活化剂或凝血因子，如XIIa因子或使X因子转换成Xa因子的物质(如鲁塞尔蝰蛇毒(RVV-X))可被用作活化试剂，而且除了这些天然产生的活化剂，也可使用其它活化剂，如合成制备的活化剂。
在该情况下，在测量过程前或之中，活化试剂可作为外部试剂而被加入至样品或其它试剂中，或者它可以已经存在于血液样品中。这也可类似地适用于其它Xa因子活化或检测反应过程所需的物质上。因此，尤其可通过要分析的血液样品来提供进一步所需的凝血因子，如V因子或抗凝血酶。
在该变体的尤其优选的具体实施方式中，与将活化试剂加入样品在空间或时间上分开地将X因子试剂加入样品。
X因子试剂和活化试剂的分离避免了不希望的过早产生的X因子向Xa因子的转化。基础是在测量开始时尽可能准确已知的Xa因子量，这进而对于测定Xa因子抑制剂有着决定性影响。在这种情况下，与将活化试剂加入样品在空间和/或时间上分开地向样品加入X因子试剂。
干燥化学试剂通常通过将它们作为溶液以线形方式施加到测试元件上并去除溶剂，由此来施加到测试元件上，由此使它们以干燥化学形式在那儿存在。这是尤其有益的，因为干燥化学形式的试剂通常能比湿化学试剂满足显著更高的保存性和稳定性要求。通过提供液体重新溶解干燥化学试剂并优选直接在要分析的血液样品中溶解它们，在给定的时间内能转化成更有活性但更不稳定的溶解形式。
在测试元件上不同分隔室中安排不同试剂能在开始Xa因子抑制剂测定前，基本防止这些试剂的接触。这也能使这些试剂的不希望的副反应大大受抑制。优选存在于各个分隔室中的试剂仅能通过样品液体互相接触。在湿化学方法中这例如能以如下方式实现，试剂溶液存在于不同的液体空间中，并直到开始Xa因子抑制剂测定才与样品进行接触，其中例如通过泵的方式将它们从这些空间加入到样品中，或让样品先后流经不同的液体空间。
能导致与将活化试剂和X因子试剂加入样品的在空间和/或时间上分开的优选方法和装置，尤其可被设定成分开的试剂线的形式。
为了根据本发明测定Xa因子抑制剂，除了X因子试剂和活化试剂，还必须存在检测试剂。这些试剂可以在开始测定前位于至少部分在空间上分开的分隔室中。由于根据本发明，在开始检测反应前尽可能不存在Xa因子，因此在优选的具体实施方式中，也可能使X因子试剂或活化试剂与检测试剂一起存在。对于湿化学方法，这也可相似地适用于试剂的汇合和混合。因此，对于这种情况，X因子试剂或活化试剂能在试剂溶液中与检测试剂在一起存在。直到缺少的试剂成分(X因子试剂或活化试剂)被加入到该试剂混合物中，才形成Xa因子。
这些试剂混合物使得以较少的方法步骤或试剂分隔室就能运行并由此更容易和更成本有利地生产并更容易处理的测定方法和装置称为可能。
在尤其优选的具体实施方式中，X因子试剂是检测试剂的组分，其中与将活化试剂加入样品在空间或时间上分开地向样品加入检测试剂/X因子试剂的组合。
可以与前述的在空间上或时间上分开地(尤其是以分开的试剂线的形式)将活化试剂和X因子试剂加入样品的方法和装置相似，设计出在空间上或时间上分开地将活化试剂和检测试剂/X因子试剂的组合加入样品的优选方法和装置。
尤其是，检测试剂/X因子试剂的组合可在加入活化试剂之后被加入。在优选的具体实施方式中，通过在样品流动方向先后设置试剂线(Reagenzstriche)来在空间上分开试剂，由此使它们的试剂由样品先后活化，这对应于时间上错开地加入到样品。在这种情况下，试剂线可以彼此分开地存在或者也可以相互接触(例如相邻存在)或者完全或部分错开地彼此叠置施加。在尤其优选的具体实施方式中，活化试剂的试剂线至少部分在样品流动方向上排列在检测试剂/X因子试剂组合的试剂线的上游，优选以部分重叠或彼此叠置的试剂线形式，其中对于后者的情况，活化试剂的试剂线施加在检测试剂/X因子试剂组合的试剂线之上。
实施例3和图2显示了在测试元件上用活化试剂和检测试剂/X因子试剂组合的试剂线的不同安排方式来进行电化学测定凝血酶的例子。
在该变化方案的优选的具体实施方式中，在与将活化试剂加入样品相同的步骤中将X因子试剂加入样品中。
例如对于湿化学反应，这可以通过诸如泵或吸液管，将两种试剂一起从其各自储存的分隔室(储存容器)中加入样品来进行。可是，也可能首先使X因子试剂和活化试剂合并，然后向样品加入这种其中形成Xa因子的试剂混合物。
在尤其优选的具体实施方式中，X因子试剂和活化试剂都以干燥状态存在，而且X因子直到与样品接触才转变成Xa因子。
干燥化学试剂的应用使它们能以未活化的形式储存在一起，而不在试剂之间发生化学反应。直至干燥化学试剂被润湿，试剂才转变成它们能互相反应的状态。在优选的具体实施方式中，该干燥化学试剂的“活化”通过液体血液样品本身引起。
在尤其优选的具体实施方式中，X因子试剂、活化试剂和检测试剂作为干燥化学试剂一起存在并直到与样品接触X因子才转化成Xa因子。
由于干燥化学试剂的应用使它们能以未活化的形式储存在一起，而不在试剂之间发生化学反应，这些本发明所述的方法和装置能使所有测定Xa因子抑制剂中所需的试剂储存在共同的分隔室中而不产生过早产生的Xa因子引起的凝血酶底物降解。仅当加入液体样品的时候，X因子才以基本确定的起始点和时程转化成Xa因子，由此最终使已知量的Xa因子存在于样品中，这构成了根据本发明的原理测定Xa因子抑制剂的基础。由此原则上能利用所属领域技术人员已知的方法，使所有测定Xa因子抑制剂所需的试剂合并为单一的干燥化学试剂线或点，这使得能简便并成本有利地生产，而且能简便并更不容易出错地操作。
本发明所述的用于测定Xa因子抑制剂的方法和装置尤其可有益地被用于测定肝素(尤其是分级的或低分子量肝素)。其它能利用本发明所述的方法和装置有益地测定的Xa因子抑制剂尤其可以是间接选择性或直接的Xa因子抑制剂。
Xa因子抑制剂在本发明的范围中可被理解为所有直接或间接影响Xa因子活性(尤其是降低活性)的物质，因而能影响(尤其是延迟)血液凝固级联过程。直接的Xa因子抑制剂对于Xa因子有直接的影响，因此影响其活性，而间接的Xa因子抑制剂不直接与Xa因子相互作用，而影响其数量和形成或需要使其活化的辅因子。例如，它们可以是抗凝血剂，其在Xa因子前作用于凝固级联中存在的凝血因子，并参与其形成和/或调节。间接选择性Xa因子抑制剂的例子有某些与抗凝血酶III联合作用的戊糖，如磺达肝素(Fondaparinux)和依达肝素(Idraparinux)，与肝素不同，它们对Xa因子有选择性。直接的Xa因子抑制剂的例子是奥米沙班(Otamixaban)或雷扎沙班(Razaxaban)。
本发明的另一方面涉及带有基于干燥化学的电化学传感器的测试元件，其用于测定Xa因子抑制剂，尤其是未分级的肝素、分级的或低分子量肝素、间接选择性Xa因子抑制剂或直接的Xa因子抑制剂，其在惰性载体上具有至少两个电极和含有由能由凝血酶裂解并通过羧基末端与产电物质以酰胺基连接的肽残基组成的凝血酶底物的检测试剂，以及至少一定量的X因子试剂和活化试剂。
本发明所述的测试元件尤其适于实施前述本发明所述的用于测定血液样品中Xa因子抑制剂的方法。
本发明所述的测试元件尤其是基于干燥化学的电化学测试元件。这类测试元件含至少两个电极，其中至少一个电极是所谓的工作电极。它们不必含典型的参比电极，如Ag/AgCl参比电极，而仅仅需要至少一个工作电极和对电极。电极可由所有常见电极材料构建，如金属、贵金属、合金或石墨，优选由诸如金或钯的贵金属、或石墨构建。测试元件的不同电极可由相同或不同材料组成。在尤其优选的具体实施方式中，测试元件含有都由金组成的工作电极和对电极。
这类电化学测试元件的具体实施方式，尤其是对于材料的选择、电极和试剂的安置以及测试元件的生产，在诸如US 5762770、US 6270637或WO 01/63271的现有技术中有记载，对于所属领域技术人员来说是已知的。
在优选的具体实施方式中，试剂以一种或多种试剂线的方式被施加到电极上。这些能以相互分开或者部分或完全重叠的方式提供。此外，根据本发明，可能不直接在电极上施加并干燥试剂，而是在紧接着电极(诸如在电极附近的平坦基材上)施加并干燥试剂。在这种情况下，测量时，试剂与样品被转移至电极处。备选地，为此可以将试剂施加到多孔材料(如非织造物(Vlies)、纸、膜等)中，例如以可分离的方式浸渍。在这种情况下，在与电极接触前，样品必须流过这些材料，由此试剂能释放到样品中。也可能将试剂的各个成分施加到测试元件的不同分隔室中，例如将检测试剂施加到电极之上或与电极紧邻，但是X因子试剂和活化试剂在空间上与其分开(如进一步远离(entfernt)该电极)或浸渍在不同的层(如膜或羊毛)中。
根据本发明，测试元件含有X因子试剂和将X因子转化成Xa因子的活化试剂，其中与X因子试剂至少部分在空间上分开地(尤其是在样品流动方向上至少部分安置在X因子试剂之前)使活化试剂存在于测试元件上。
例如在优选的具体实施方式中可以由此实现：将X因子试剂和活化试剂以分离的试剂线安置在测试元件上。这些可以以相互分开或相互接触的方式存在。尤其优选的排列方式是其中活化试剂的试剂线在样品流动方向上至少部分排列在X因子试剂的试剂线的上游，而且至少部分与该试剂线接触，尤其是至少部分重叠该试剂线。在该具体实施方式中，检测试剂存在于另一分隔室中，并尤其是以另一试剂线中，可是，其至少能部分与活化试剂和X因子试剂的试剂线接触。
在尤其优选的具体实施方式中，检测试剂与活化试剂或X因子试剂一起存在于测试元件上。由于活化试剂或X因子试剂都不能单独产生或形成活化Xa因子，检测试剂可与这些试剂之一混合而不使检测试剂发生过早产生的Xa因子引起的降解，由此不产生不希望的对Xa因子抑制剂测定的干扰。将检测试剂加入这两种其它试剂之一中能省略掉一个试剂分隔室，则能使用更简单的和更成本有利地生产的测试元件结构。例如在尤其优选的具体实施方式中，这能通过这样排列来实现，在所述排列中，活化试剂的试剂线在样品流动方向上至少部分排列在X因子试剂的试剂线之前，而且至少部分与该试剂线接触，尤其是至少部分重叠该试剂线，而且检测试剂与X因子试剂一起存在于一个试剂线中。
在另一具体实施方式中，测试元件包含干燥化学形式的X因子试剂和能使X因子转化成Xa因子的活化试剂，其中活化试剂与X因子试剂一起并任选还与检测试剂一起存在于测试元件上，而且其中直到与样品接触才发生X因子向Xa因子的转化。由于X因子试剂和活化试剂以干燥化学形式存在于测试元件上，因此它们以它们不能相互反应的形式存在。所以，X因子试剂和活化试剂能一起被储存于一个分隔室中而不形成Xa因子。直至加入液体，尤其是直至接触样品液体时，这两种试剂才能相互反应，然后X因子才能被转化为Xa因子。
例如在优选的具体实施方式中，这通过将X因子试剂和活化试剂一起以共同的试剂线设置在测试元件上实现。在该具体实施方式中，检测试剂可存在于另外的分隔室中，尤其是另外的试剂线中，可是它能至少部分与组合的活化剂/X因子试剂的试剂线接触。
在尤其优选的具体实施方式中，也可将检测试剂加入至X因子试剂和活化试剂中，从而使所有测定Xa因子抑制剂需要的试剂存在于测试元件上单一的分隔室中，尤其是单一的试剂线中。如已经叙述的，干燥化学试剂的应用能使X因子试剂和活化试剂一起共同施加在一个分隔室中而不形成Xa因子。由此也能将检测试剂加入至该试剂组合中，因为没有活化的Xa因子，也就不会发生过早产生的Xa因子引起的检测试剂降解。尤其是，本发明的解决方案能使所有用于测定Xa因子抑制剂需要的试剂施加于单一分隔室中，这使得能产生更简单的和更成本地生产的测试元件结构。
本发明的另一方面涉及电化学测试元件分析系统，其含有至少一种本专利权利要求书所述的测试元件和电流或电压测量仪器。这类仪器的应用能通过电极上产生的电流来检测在Xa因子抑制剂测定进程中形成的产电凝血酶底物裂解产物，尤其是苯二胺。在尤其优选的具体实施方式中，测量电流时程。优选以准恒电位的方式来实施电化学法测定，更优选利用双电极系统，其中连接一个电极同时用作参比和对电极，而连接另一电极作为工作电极。在这双电极系统上施加恒压，并随时间测量电流。该方法也被称为安培计测量法。在该过程中，测量电流的时程并在开始测定反应一段时间后测得的电流超过预先确定的阈值时，进行测定。该时间段是在凝固反应进程中Xa因子引起的凝血酶底物转化的量度，其进而依赖于样品中存在的Xa因子抑制剂的量。
除了所述的安培计测量法，也可能使用伏特计测量法。在这种情况下，并不在电极之间控制恒压，而是电压从起始值向终值线性地变化，随后再次回归到起始值。该过程在完整的测量持续时间中可被重复若干次。对于伏特计测量法，进行电流相对于电压作图并且可得到对应于重复的彼此连接的电流-电压曲线(循环伏安曲线)。使用合适的电压范围，电子载体的氧化峰和还原峰被显示于这些曲线中。如果没有其它氧化-还原活性物质在所覆盖的电势范围内被氧化或还原，从而不额外地影响电流，则这些峰的高度直接与电子载体的浓度成正比。当测量浓度变化时，可以视需要不考虑该干扰。如果现在能画出峰极大点的电流值或各个电流-电压循环(Strom-Spannungsschleife)随时间的曲线所包围面积(对应于电荷转移(Ladungsumsatz))，也能得到电子载体浓度在测量持续时间以由循环周期给出的时间光栅(Zeitraster)形式的变化图。然后能像安培计测量法那样使用该信息来测定Xa因子抑制剂。这类方法在诸如WO 01/63271中有记载。
尤其可用根据本发明的方法和装置来测定血液样品中的Xa因子抑制剂。在本发明的意义上，术语血液样品不但包括未处理的血液(全血)而且包括可随后通过物理和/或化学和/或生物化学进一步处理从天然血液样品中得到的血液衍生物或血液制品。在对本申请意义中，尤其可将血清或血浆视作为血液衍生物。在对本申请意义中，测定Xa因子抑制剂可以是任何定性、定量或半定量测定Xa因子抑制剂。
具体实施方案
本发明进一步通过以下示例性的实施例和附图来阐述。
图1示例性显示了符合本发明所述的方法的电化学测定Xa因子抑制剂的初步测量结果。
图2显示了测试元件上以活化试剂和检测试剂/X因子试剂组合的试剂线的不同排列方式电化学凝血酶测定的结果。
实施例1：本发明所述的测试元件的示例性构造
本发明所述的测试元件的可能构造及其制备如下示例性描述。
例如，惰性载体材料可由聚酯薄膜(如Melinex薄膜)构成。利用各种方法，如用金蒸镀载体薄膜，然后激光熔蚀所希望的电极结构，可以将电极结构施加在该薄膜上，而其它生产这些电极结构的方法也是所属领域技术人员所熟悉的，如蚀刻法或印刷法。任选随后能以绝缘层来提供电极结构的某些部分。
现在将测定所需的试剂施加于带有其电极结构的载体材料上。对此，可设想所属领域技术人员已知的各种方法，尤其是印刷或刮涂法，其中将溶解形式的试剂以试剂线的形式施加到测试元件上，然后至少部分去除溶剂，从而在测试元件上提供干燥化学形式(即未活化形式)的试剂。这类方法在诸如WO 01/63271中有记载。
在这类涂覆方法中，试剂通常被溶解于基础批料中，该基础批料包含能尽可能优化试剂溶液的处理的物质。
该基础批料的示例性组成如下(其溶解于双蒸水中)：
 
浓度(括号中：根据本发明的可能的范围)       物质 物质的功能 供应商
3.5g/l(0-50g/l) Keltrol F 成膜剂 Roche DiagnosticsGmbH            
5g/l(0-75g/l) 羟丙基纤维素 增稠剂 Hercules
1g/l(0-10g/l) Mega 8 清洁剂 Roche DiagnosticsGmbH            
20g/l(0-200g/l) Mowiol 成膜剂 Kuraray
 
基础缓冲液
120mM(10-500mM) HEPES pH缓冲液 Sigma
10g/l(0.1-100g/l) RPLA 4(血清白蛋白) 保护性蛋白质 Roche DiagnosticsGmbH            
30g/l(0-200g/l) 甘氨酸 稳定剂，增溶剂   Roche DiagnosticsGmbH            
75g/l(0-300g/l) 蔗糖 稳定剂，增溶剂   Roche DiagnosticsGmbH            
现在将每种特定试剂成分(如凝血酶底物、X因子、活化试剂；各自或以组合形式)混入到该基础批料中并以空间确定的方式(如作为试剂线或试剂点)施加于测试元件上。去除溶剂后，现在在测试元件上存在有确定并稳定的试剂线或试剂点，其中试剂可以稳定形式长期储存而不丧失活性。在优选的具体实施方式中，还在测试载体上另外施加横向隔板和覆盖薄膜，来区隔出可吸收基本确定体积的样品并将其传送到试剂分隔室和电极上的毛细管通道。
实施例2：对应干本发明所述的方法和装置夹电化学测定Xa因子抑制剂的 示例性的过程
为了进行Xa因子抑制剂测定，将足够量(如1-1000μl，优选约10μl)的要分析的血液施加于本发明所述的测试元件上，施加方式能使其与位于测试元件上的试剂分隔室和电极接触，例如，所述测试元件可以优选根据实施例1来制备。这优选通过在测试元件上提供毛细管通道并在测试元件上的毛细管通道内适当地配置试剂分隔室和电极实现。在优选的具体实施方式中，样品液体、测试元件和/或Xa因子抑制剂测定所需的其它装置可被恒定在某个温度，尤其是约37℃的温度。将测试元件连接在合适的测量装置上，用以检测电化学检测反应，例如连接于尤其能测量并储存电流时程的电流测量系统上。
图1示例性显示了根据本发明所述的方法来电化学测定Xa因子抑制剂的时程(zeitlichen Verlauf)。在该情况下，使用符合实施例1的测试元件。
该曲线显示了测量得到的电流强度的时程，所述电流强度是其从凝血酶底物上经凝血酶诱导裂解后通过氧化苯二胺而形成的。在x轴上对上样血液样品后的以秒计的时间t，并在y轴上对各个时间点上测得的以毫微安培(nanoamper)计的电流强度I作图。曲线首先经过最低点，然后随着苯二胺氧化的增加而提高，最后达到最高点，然后由于底物消耗而持续下降。例如使用阈值算法，来进行对这种电流时程的评估以确定反映检测反应进程的时间测量值。该算法将阈值(如60nA)加到计算出的最小值上，且该算法对所有测量保留。可以将达到的最小值的时间确定作为凝血酶转化的时间测量值，直到其达到该阈值。由于以这种方式确定的凝血酶转化的时间测量值依赖于活化的Xa因子的活性/浓度，而且这进而依赖于存在的Xa因子抑制剂的数量或浓度，因此以这种方式确定的时间值能被用于推导出Xa因子抑制剂的存在，超过或低于某浓度或Xa因子抑制剂的数量或浓度。为了实现该目的，例如可能利用已知Xa因子抑制剂浓度的样品来产生曲线，其使这些浓度与根据本发明确定的其时间参数相关联。
而且利用合适的算法，这些确定了的时间参数还可被用于确定其它的相关参数和与可能存在的Xa因子抑制剂的量相关的测量值，尤其是凝固时间。
实施例3：试剂线的排列方式对含有X因子试剂和活化试剂的测试元 件的影响
图2显示了以测试元件上活化试剂和检测试剂/X因子试剂组合以不同排列方式的试剂线进行电化学凝血酶测定的结果。对于每种情况，都显示了测得的电流强度的时程，其中在x轴上对施加血液样品后的以秒计的时间t，并在y轴上对各个时间点上测得的以毫微安培计的电流强度I作图。在本实施例中，检测试剂/X因子试剂组合的试剂线上包含0.8ml还原的Chromozym TH和38.1μlX因子(american diagnostica公司的X因子；对应于2U/ml Xa因子)，活化试剂的试剂线上含有80μl鲁塞尔蝰蛇毒(Pentapharm Ltd.的鲁塞尔蝰蛇毒(RVV-X))和0.04％磷脂(PHL)。
以以下变化形式来施加试剂线：
曲线A：首先施加检测试剂/X因子试剂组合的试剂线，然后在该线上施加活化试剂的试剂线。
曲线B：首先施加检测试剂/X因子试剂组合的试剂线，然后在该线上施加活化试剂的试剂线，其中错开地施加活化试剂的试剂线，从而使其至少部分在样品流动方向上位于检测试剂/X因子试剂组合的试剂线之前，并至少部分与该线重叠。
图2中的两条曲线据显示，最小值相对于较高的电流值和低的初始电流都没有位移。这表明，用根据本发明的这些优选的方法和装置，通过至少部分在空间上将试剂分开在两个分隔室中(尤其是试剂线)，能大大抑制过早产生的底物降解。
相对于直接在检测试剂/X因子试剂组合的试剂线上施加活化试剂的试剂线(曲线A)，在样品流动方向上于检测试剂/X因子试剂组合的试剂线之前错开地施加活化试剂的试剂线(曲线B)显示出较低的电流极大值和延迟的反应动力学。直接在检测试剂/X因子试剂组合的试剂线上施加活化试剂的试剂线，主要由于具有更快的反应动力学，因而对于本发明测定Xa因子抑制剂(尤其对于诊断应用)来说尤其具有优势。

Claims (13)

1.用于测定血液样品中的Xa因子抑制剂的方法，
其特征在于，
a)使要分析的血液样品与检测试剂并与已知量的X因子试剂和诱导X因子转化成Xa因子的活化试剂接触，所述检测试剂含至少一种由能由凝血酶裂解并通过羧基末端与产电物质酰胺基连接的肽残基组成的凝血酶底物，
b)利用电化学方法测定作为测量信号的通过Xa因子介导的凝血酶活化而从凝血酶底物上裂解出的产电物质的量或活性和/或其时程，和
c)根据该测量信号确定要分析的血液样品中Xa因子抑制剂的量或与其相关的测量值，尤其是与其相关的凝固时间。
2.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，
血浆凝固外部途径的活化剂或参与复合物，尤其是组织因子和/或VIIa因子，或血浆凝固内部途径的活化剂或参与复合物，尤其是XIIa因子或诱导X因子转化成Xa因子的物质，被用作活化试剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，
其特征在于，
与将活化试剂加入样品在空间上或时间上分开地将X因子试剂加入样品。
4.根据权利要求3所述的方法，
其特征在于
X因子试剂是检测试剂的组分，而且与将活化试剂加入样品在空间上或时间上分开地，尤其是在将活化试剂加入样品之后，将该检测试剂/X因子试剂的组合加入样品中。
5.根据权利要求1或2所述的方法，
其特征在于，
在将活化剂加入样品的同一步骤中将X因子加入样品中。
6.根据权利要求5所述的方法，
其特征在于，
X因子试剂和活化试剂一起以干燥状态存在而且直到与样品接触X因子才转化成Xa因子。
7.根据权利要求6所述的方法，
其特征在于，
X因子试剂、活化试剂和检测试剂一起以干燥状态存在而且直到与样品接触X因子才转化成Xa因子。
8.根据前述权利要求之一所述的方法，
其特征在于，
Xa因子抑制剂是肝素，尤其是分级的或低分子量肝素，间接选择性或直接的Xa因子抑制剂。
9.带有基于干燥化学的电化学传感器的测试元件，用于测定Xa因子抑制剂，尤其是未分级的肝素和分级的或低分子量肝素、间接选择性Xa因子抑制剂和直接的Xa因子抑制剂，所述测试元件在惰性载体上具有至少两个电极和含有检测试剂以及至少一定量的X因子试剂和活化试剂，所述检测试剂含至少一种由能由凝血酶裂解并通过羧基末端与产电物质酰胺基连接的肽残基组成的凝血酶底物。
10.根据权利要求9所述的测试元件，
其特征在于，
所述活化试剂以与X因子试剂至少部分在空间上分开地存在于测试元件上，尤其是至少部分设置在样品流动方向上X因子试剂的上游。
11.根据权利要求10所述的测试元件，
其特征在于，
所述检测试剂与所述活化试剂或X因子试剂一起存在于测试元件上。
12.根据权利要求9所述的测试元件，
其特征在于，
它含有X因子试剂和诱导X因子转化成Xa因子的活化试剂作为干燥的化学试剂，而且活化试剂与X因子试剂一起并任选还与检测试剂一起存在于该测试元件上，从而直到与样品接触才使X因子转化为Xa因子。
13.电化学测试元件分析系统，
其包括
至少一种电流或电压测量装置和根据权利要求9至12之一所述的测试元件。
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