CN103743809B

CN103743809B - 一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法

Info

Publication number: CN103743809B
Application number: CN201410028583.9A
Authority: CN
Inventors: 邢丽红; 孙伟红; 李兆新; 翟毓秀; 郭江涛; 郭萌萌; 吴海燕; 唐锡招
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2034-01-21
Also published as: CN103743809A

Abstract

一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，属于水产品检测技术领域，它包括样品提取、净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件及代谢产物的结构分析。本发明应用液相色谱‑串联质谱‑离子阱技术，采用pMRM法能够准确测定预见的代谢产物，并能检测到低浓度的代谢产物；采用QTrap独有的MRM‑IDA‑EPI工作模式，一次进样，既可得到相应代谢产物的MRM色谱图，又可得到其MS²质谱图。本发明可以检测到包括环丙沙星在内的10种代谢产物，其中有两种新发现的代谢产物的质谱响应强度远大于环丙沙星。本发明填补了我国目前没有海参中恩诺沙星代谢产物检测方法的空白，对研究其它药物的代谢产物及未知药物筛查提供了新的借鉴思路。

Description

一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，是一种用高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）法检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法。

背景技术

恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)属于第三代喹诺酮类合成抗菌药物，是水产养殖中主要抗菌药物之一，其作用机理为通过抑制细菌DNA回旋酶亚基A的活性,抑制酶的切割与连接功能，使DNA、RNA及蛋白质的合成受干扰，从而起到抑菌、杀菌的目的。然而，恩诺沙星的不规范使用和滥用可以在动物体、食品、

环境和消费者体内引起细菌耐药性增强，严重威胁人类和动物的健康。

恩诺沙星在环境中和在动物体内具有不同的降解或代谢途径，其在环境中的降解产物和在动物体内的代谢产物亦各不相同。研究表明，环境作用，如介质的极性、离子、pH值及与生物分子的结合等因素，是影响氟喹诺酮类物质光化学特性的关键因素。Li Yan发现恩诺沙星在水溶液中有包括环丙沙星在内的11种氧化降解产物。Michela发现土壤中的恩诺沙星在光诱导下有10种降解产物。恩诺沙星的光解产物主要通过三种途径降解：氧化降解哌嗪侧链，脱氟反应，氟溶剂分解。大鼠口服恩诺沙星后，在体内可检测到6种代谢产物，包括环丙沙星、葡糖苷酸恩诺沙星和其它4种代谢产物；恩诺沙星在褐腐真菌(Gloeophyllum striatum)作用下有11种降解产物,其中8种降解产物的结构得到确定。在毛霉(Mucorramannianus)作用下仅产生3种代谢产物，分别是N-氧化恩诺沙星、N-乙酰化环丙沙星和去乙烯恩诺沙星。在锯缘青蟹口灌恩诺沙星给药后血淋巴中发现3种代谢产物，包括环丙沙星、羟基化恩诺沙星和加氧恩诺沙星。兔肌注恩诺沙星后，在体内检测到6种代谢产物，包括环丙沙星、加氧恩诺沙星及其他四种代谢产物。恩诺沙星在食用动物体内的代谢产物除环丙沙星外，关于其他代谢产物的研究还较少。

现有报道研究代谢产物时主要借助离子阱质谱或飞行时间质谱法，通过研究化合物裂解机制分析代谢产物。离子阱质谱具备多级串级功能，适合分子结构方面的定性研究，能够给出分子局部的结构信息，但不能做多反应监测(MRM)和中性丢失扫描，无法筛选特征结构分子。由于在筛选未知化合物时采用一级质谱全扫描，在灵敏度方面有欠缺。飞行时间质谱属于高分辨质谱，可以有助于未知化合物的定性和m/z近似离子的区别，分析速度快，但价格昂贵，较精密，维护成本高。而本发明采用高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）法分析海参中恩诺沙星代谢产物，该方法同时具备多反应监测(MRM)、选择反应监测扫描（SRM）、中性丢失功能和多级串级功能，利用该方法可以检测海参中恩诺沙星未知代谢产物，根据给出的母离子与碎片离子的关系对其代谢产物进行结构解析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法。本发明应用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）技术，采用pMRM法准确测定预见的代谢产物，采用QTrap独有的MRM-IDA-EPI工作模式，在进行三重四极杆质谱工作的同时，还能进行线性离子阱质谱的工作，一次进样，既可得到恩诺沙星在海参体内代谢产物的MRM色谱图，又可得到其代谢产物的MS²质谱图。本方法可以检测到海参体内10种代谢产物，除检测到恩诺沙星最主要的代谢产物环丙沙星外，还检测到恩诺沙星的另两种主要代谢产物，一种为环丙沙星的同分异构体，一种为恩诺沙星的加氢还原产物，且这两种新发现的代谢产物的质谱相应强度远大于环丙沙星。恩诺沙星在海参体内的代谢机制与其他动物体内的代谢机制有差异。

本发明是按照以下操作方法完成的：

一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，样品经无水硫酸钠脱水后，用酸化乙腈提取其中的恩诺沙星及其代谢产物，提取液浓缩后，用乙腈水溶液溶解残留物，用正己烷除脂，用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）法进行测定，根据母离子与碎片离子的关系，对样品中的恩诺沙星及其未知代谢产物进行结构分析，所用的液相色谱-串联质谱-离子阱质谱实验所用的仪器条件如下：

（1）色谱条件：

a)色谱柱：C₁₈反相色谱柱，2.1mm×150mm，5μm；

b)柱温：35℃；

c)流速：0.35mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：0.1%（体积比）甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1；

（2）质谱条件：

离子源参数：

a)离子化模式：电喷雾离子源（ESI）；

b)扫描方式：正离子扫描；

c）碰撞气CAD，Medium；

d）气帘气Curtain gas，35psi;

e）雾化气Gas1，30psi；

f)辅助加热气Gas2，30psi；

g)喷雾电压IS：5500V；

h)离子源温度TEM：500℃；

（3）化合物参数：

恩诺沙星的代谢产物通过MRM-IDA-EPI模式来分析，其中MRM扫描的IDA阈值为500cps，EPI扫描速率为1000amu/s，CE为40±15eV，DP为50V，驻留时间20ms；MRM离子对则需根据恩诺沙星的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离。

一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，它包括样品提取、净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件和代谢产物的结构分析，具体步骤如下：

（1）样品提取

样品加入无水硫酸钠后，涡旋混合均匀，再加入酸化乙腈超声波提取，提取液经氮气吹干，吹干后的残留物待净化；

（2）净化

加入乙腈水溶液涡旋溶解步骤（1）所述的残留物，再加入正己烷，涡旋混合，静置分层后，取下层清液，高速离心，过0.22μm有机相微孔滤膜后得到样品待测液，供液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）仪分析测定；

（3）标准曲线的绘制

精确称取恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星和环丙沙星的混合标准系列溶液，进高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）法分析，绘制标准曲线；

进一步，步骤（3）所述的标准溶液的配制方法为称取的恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成浓度为100μg/mL标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星及环丙沙星的混合标准系列溶液，所述的定容溶液为乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为1：9。

（4）实验所用的仪器条件

色谱条件如下：

a)色谱柱：C₁₈反相色谱柱，2.1mm×150mm，5μm；

b)柱温：35℃；

c)流速：0.35mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1；

表1流动相梯度洗脱条件

时间/（min）	A0.1%甲酸水溶液/（%）	B乙腈/（%）
			0	90	10
1	90	10
			6	70	30
11	40	60
			16	10	90
18	90	10
			20	90	10

质谱条件如下：

离子源参数：

a)离子化模式：电喷雾离子源（ESI）；

b)扫描方式：正离子扫描；

c）碰撞气CAD，Medium；

d）气帘气Curtain gas，35psi;

e）雾化气Gas1，30psi；

f)辅助加热气Gas2，30psi；

g)喷雾电压IS：5500V；

h)离子源温度TEM：500℃；

化合物参数：

恩诺沙星的代谢产物通过MRM-IDA-EPI模式来分析，其中MRM扫描的IDA阈值为500cps，EPI扫描速率为1000amu/s，CE为40±15eV，DP为50V，驻留时间20ms；MRM离子对则需根据恩诺沙星的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子；

（5）代谢产物的结构分析

①定性测定

在同样测试条件下，样品待测液中目标化合物的保留时间应与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5%以内，且检测到的碎片离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中碎片离子相对丰度一致；

②海参体内代谢产物的MRM-IDA-EPI分析

采用MRM-IDA-EPI模式分别测定样品待测液和空白对照组，针对预设定的每一组离子对，对比分析样品待测液和空白对照组的MRM提取离子流色谱图的差异性，对代谢产物的准分子离子、保留时间和提取离子对进行分析，找出恩诺沙星在海参体内的可能的代谢产物，同时结合MS²的EPI质谱图，对其碎片离子进行质谱分析，最后再根据恩诺沙星的分子结构推测代谢产物的结构。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

1.现有的关于未知代谢产物的检测方法主要有两种，一种是离子阱质谱法，即通过对比分析样品待测液和空白对照组的一级全扫描质谱图，再对可能的代谢产物进行MSⁿ分析，根据代谢产物的色谱行为及质谱碎片，鉴定代谢产物，但对于低浓度的代谢产物却无法得到相应的质谱图；另一种是高分辨飞行时间质谱法，虽然可以精确测定未知化合物的分子量，区别m/z相近的离子，且分析速度快，但是所用仪器价格昂贵，精密度高，维护成本高。

未知代谢产物往往浓度低、基质复杂，而本发明采用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）法分析海参中恩诺沙星代谢产物，该方法灵敏度高，且同时具备MRM、SRM、中性丢失功能和多级串级功能。其可能代谢产物的母离子和碎片离子可通过pMRM法来确定。pMRM是从理论上预知代谢产物的MRMs，然后进行IDA分析，通过预知得到的代谢产物，很好的推测代谢产物的MRM离子对。因为原药和代谢产物都具有共同的母核，质谱的裂解规律也类似，所以可以具此推测出代谢产物的母/子离子，只要知道原药的母离子和主要子离子，那么就可以建立代谢产物的MRM离子对。pMRM能够准确测定预见的代谢产物，是最灵敏和最具选择性的代谢产物鉴定方式。

2.Qtrap系统是将三重四极杆质谱技术与线性离子阱质谱技术有机地结合在一起，其独有的工作模式MRM-IDA-EPI模式，在进行三重四极杆质谱工作的同时，还能进行线性离子阱质谱的工作。MRM-IDA-EPI是在普通的MRM扫描后加了EPI，利用该模式，一次进样，既可得到恩诺沙星在海参体内代谢产物的MRM色谱图，又可得到其代谢产物的MS²质谱图。采用MRM-IDA-EPI模式分析海参中恩诺沙星的代谢产物，既具有前处理简单、选择性好的优点，还可同时提高灵敏度，其采集的数据比传统三重四极杆质谱的数据更加可靠。

3.本发明应用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）技术，采用pMRM法，能够准确的测定预测的代谢产物，既能排除干扰准确定性，又能结合质谱图对恩诺沙星的代谢产物的结构进行分析。相对现有的检测技术而言，本方法既具有串联四级杆质谱的高灵敏度、准确定量功能，又具有串级质谱功能，此外该仪器成本低廉，较易普及，本发明在定性、定量、灵敏度和准确度方面都具有明显的优势。

附图说明

图1为恩诺沙星的提取离子流色谱图、质谱图；

图2为环丙沙星的提取离子流色谱图、质谱图；

图3为海参样品提取离子流色谱图和质谱图：（1）空白海参样品中332>288，332>245，332>217提取离子流色谱图；（2）注射恩诺沙星停药后4h海参样品中332>288，332>245，332>217提取离子流色谱图；（3）海参体内代谢产物M1(m/z332)的质谱图；（4）海参体内代谢产物M2(m/z332)的质谱图。

图4为M1、M2的结构式。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例恩诺沙星在海参体内氮去乙基代谢过程代谢产物的测定

本实施例为利用高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）技术分析海参中恩诺沙星代谢产物的方法。海参样品用无水硫酸钠脱水，酸化乙腈提取样品中的恩诺沙星及其代谢产物，提取液浓缩后，经正己烷去脂，采用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）法，对海参中的恩诺沙星代谢产物及其结构进行分析。

恩诺沙星在生物体内有多种代谢途径，被转换成多种代谢产物，在体内各种酶的作用下，可发生N-氧化反应、N-脱烷基化反应、N-乙酰化反应及哌嗪环的降解等化学反应。已有研究表明，恩诺沙星在不同生物体内的代谢产物有明显差异。而海参的生理结构与水产品其它种类差异较大，恩诺沙星作为广谱抗菌药，在海参养殖业的疾病防控中应用广泛，然而恩诺沙星在其体内的代谢产物研究尚属空白。我们选取恩诺沙星最具代表性的代谢过程作为验证的实施例，其中样品组为经过恩诺沙星浸泡4h后的海参，空白对照组为没有给药的海参。

1.本实施例选用的仪器及设备：液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）仪

（1）HPLC部分（岛津公司，型号LC-20A），使用高压液相泵，配有自动进样器，柱温箱，使用CAPCELL PAK C₁₈反相色谱柱，150mm×2.1mm,5μm。

（2）5500Qtrap质谱仪（AB SCIEX公司）：配有ESI离子源，三重四极杆，碰撞池，离子阱，真空系统，气路控制系统；

（3）超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-600DE）；

（4）高速离心机：4000r/min（Thermo Fisher）；

（5）涡旋混合器(Talboys)；

（6）氮吹仪（Organomation Associates）；

（7）高速离心机(Sigma,1-14)；

（8）分析天平：感量0.00001g（德国赛多利斯公司，型号CP225D）；

（9）天平：感量0.01g(德国赛多利斯公司，型号CPA1003P)；

（10）0.22μm水相微孔滤膜（艾杰尔）；

（11）纯度≥99.99%的氮气；

2.配制标准溶液与试剂

（1）乙腈(Merck)。

（2）甲醇(Merck)。

（4）甲酸（BIOSZUNE LIFE SCIENCES DEP）。

（5）无水硫酸钠：优级纯（国药集团化学试剂有限公司）。

（6）0.1%甲酸水溶液：准确移取1mL甲酸，用水稀释并定容至1L，混匀后备用。

（7）酸化乙腈：99mL乙腈中加入1mL甲酸。

（8）恩诺沙星、环丙沙星标准储备液：分别称取恩诺沙星、环丙沙星标准品各约10.0mg，用1mL甲酸溶解，再用甲醇溶解并定容至100mL，配成浓度分别为100μg/mL的标准储备液，-20℃冷冻保存。

（9）恩诺沙星、环丙沙星混合标准使用液：分别准确移取1mL恩诺沙星和环丙沙星标准储备液，用甲醇稀释并定容至10mL，配成恩诺沙星和环丙沙星浓度均为10μg/mL的混合标准使用液，2℃～8℃冷藏保存。

所用的试剂除特殊说明外均为色谱纯，整个实验过程中用水均为超纯水。

3.样品处理的步骤

（1）提取

称取(2±0.02)g试样，于50mL具塞离心管中。加入2g无水硫酸钠，涡旋混匀，再加入5mL酸化乙腈（含1%体积的甲酸），涡旋混合1min，超声波提取10min。4000r/min离心5min，取上清液于10mL离心管中。残渣中加5mL酸化乙腈（含1%体积的甲酸），重复提取一次，合并两次提取液，于40℃水浴氮气吹干，吹干后的残留物待净化。

（2）净化

在步骤（1）残留物中，加1.0mL10%（体积比）乙腈水溶液，涡旋溶解步骤（1）所述的残留物，再加入2.0mL正己烷涡旋混合30s，静置分层后，取下层清液，以10000r/min离心5min，过0.22μm滤膜得到样品待测液或对照组待测液，供液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）仪测定。

（3）标准曲线的绘制

准确移取适量恩诺沙星、环丙沙星混合标准使用液，采用定容溶液稀释，所述的定容溶液为乙腈：0.1%甲酸水溶液体积比为10：90；配制成恩诺沙星和环丙沙星溶液浓度均为0.002μg/mL、0.005μg/mL、0.010μg/mL、0.020μg/mL和0.050μg/mL混合标准系列溶液，进液相色谱-串联质谱-离子阱质谱（LC-MS/MS-Qtrap）分析，绘制标准曲线。

4.实验所用的仪器条件

色谱条件如下：

a)色谱柱：CAPCELL PAK C₁₈MGⅡ反相色谱柱，2.1mm×150mm，5μm；

b)柱温：室温；

c)流速：0.35mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1。

质谱条件如下：

离子源参数：

a)离子化模式：电喷雾离子源（ESI）；

b)扫描方式：正离子扫描；

c）碰撞气CAD，Medium；

d）气帘气Curtain gas，35psi;

e）雾化气Gas1，30psi；

f)辅助加热气Gas2，30psi；

g)喷雾电压IS：5500V；

h)离子源温度TEM：500℃。

化合物参数

恩诺沙星的代谢产物通过MRM-IDA-EPI模式来分析。其中MRM扫描的IDA阈值为500cps，EPI扫描速率为1000amu/s，CE为40±15eV，DP为50V，驻留时间20ms。MRM离子对则需根据恩诺沙星的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子。恩诺沙星在海参体内发生脱乙基化反应后的可能代谢产物母离子、子离子等见表2。

表2恩诺沙星的可能代谢产物母离子、子离子等

（5）代谢产物的结构分析

①定性测定

在同样测试条件下，样品待测液中目标化合物的保留时间应与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5%以内，且检测到的碎片离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中碎片离子相对丰度一致。

②恩诺沙星和环丙沙星的结构分析

对恩诺沙星和环丙沙星标准品待测液进行一级扫描质谱分析，其准分子离子峰[M+H]分别为m/z360和332，没有其他加和离子，色谱保留时间分别为5.16min，4.7min。采用MRM-IDA-EPI方式进行对恩诺沙星和环丙沙星的准分子离子m/z360和332进行质谱裂解规律分析，得到恩诺沙星的主要碎片离子有m/z316[MH-CO₂]和245[MH-CO₂-C₂H₅NC₂H₄]。恩诺沙星质谱裂解特征是中性丢失-44Da和-115Da。环丙沙星的主要碎片离子有m/z288[MH-CO₂]、245[MH-CO₂-C₂H₄N]。环丙沙星质谱裂解特征是中性丢失-44Da和-87Da。

③M1、M2结构分析

由图3可知，代谢产物M1、M2的准分子离子均为m/z332，主要碎片离子均含有m/z314[MH-H₂O]，288[MH-CO₂]，245[MH-CO₂-HNC₂H₄]。与原形药物恩诺沙星相比，代谢产物M1、M2的分子量减少了28Da，推测是恩诺沙星氮去乙基的化合物。M1的保留时间为4.70min，与环丙沙星对照品基本一致，M1的质谱图与环丙沙星的质谱图基本一致，且碎片离子丰度比与环丙沙星标准品相一致，确定代谢产物M1为环丙沙星。代谢产物M2与环丙沙星对照品具有相似的碎片离子，但却具有不同的保留时间7.75min，推测M2是环丙沙星的同分异构体。

从提取离子色谱图上可以看出，M2的离子质谱响应信号远远高于环丙沙星。从目前已有的研究结果显示，恩诺沙星在不同生物体内的代谢产物有较大差异，而恩诺沙星在动物体内的主要代谢产物是环丙沙星，其他代谢产物含量很低。但从本实验结果来看，恩诺沙星在海参体内代谢的主要产物除环丙沙星之外，M2也是主要代谢产物之一。

根据色谱及质谱信息，推测M1、M2的结构式见图4。

本发明方法同样适用于恩诺沙星在其他水产动物体内、陆生动物体内或其它环境条件下的代谢产物检测。

Claims

1.一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，其特征在于样品经无水硫酸钠脱水后，用酸化乙腈提取其中的恩诺沙星及其代谢产物，提取液浓缩后，用乙腈水溶液溶解残留物，用正己烷除脂，用液相色谱-串联质谱-离子阱质谱法进行测定，根据母离子与碎片离子的关系，对样品中的恩诺沙星及其未知代谢产物进行结构分析，所用的液相色谱-串联质谱-离子阱质谱实验所用的仪器条件如下：

(1)色谱条件：

a)色谱柱：C₁₈反相色谱柱，2.1mm×150mm，5μm；

b)柱温：35℃；

c)流速：0.35mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：0.1％体积比甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1；

表1流动相梯度洗脱条件

(2)质谱条件：

离子源参数：

a)离子化模式：电喷雾离子源；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)碰撞气CAD，Medium；

d)气帘气Curtain gas，35psi；

e)雾化气Gas1，30psi；

f)辅助加热气Gas2，30psi；

g)喷雾电压IS：5500V；

h)离子源温度TEM：500℃；

(3)化合物参数：

恩诺沙星的代谢产物通过MRM-IDA-EPI模式来分析，其中MRM扫描的IDA阈值为500cps，EPI扫描速率为1000amu/s，CE为40±15eV，DP为50V，驻留时间20ms；MRM离子对则需根据恩诺沙星的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子；恩诺沙星在海参体内发生脱乙基化反应后的可能代谢产物母离子、子离子见表2；

表2恩诺沙星的可能代谢产物母离子、子离子

2.根据权利要求1所述的一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，其特征在于它包括样品提取、净化、标准曲线的绘制、实验所用的仪器条件和代谢产物的结构分析，具体步骤如下：

(1)样品提取

(2)净化

加入乙腈水溶液涡旋溶解步骤(1)所述的残留物，再加入正己烷，涡旋混合，静置分层后，取下层清液，高速离心，过0.22μm有机相微孔滤膜后得到样品待测液，供液相色谱-串联质谱-离子阱质谱仪分析测定；

(3)标准曲线的绘制

精确称取恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星和环丙沙星的混合标准系列溶液，进高效液相色谱-串联质谱-离子阱质谱法分析，绘制标准曲线；

(4)实验所用的仪器条件

色谱条件如下：

a)色谱柱：C₁₈反相色谱柱，2.1mm×150mm，5μm；

b)柱温：35℃；

c)流速：0.35mL/min；

d)进样量：10μL；

e)流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1；

表1流动相梯度洗脱条件

质谱条件如下：

离子源参数：

a)离子化模式：电喷雾离子源；

b)扫描方式：正离子扫描；

c)碰撞气CAD，Medium；

d)气帘气Curtain gas，35psi；

e)雾化气Gas1，30psi；

f)辅助加热气Gas2，30psi；

g)喷雾电压IS：5500V；

h)离子源温度TEM：500℃；

化合物参数：

(5)代谢产物的结构分析

①定性测定

在同样测试条件下，样品待测液中目标化合物的保留时间应与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5％以内，且检测到的碎片离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中碎片离子相对丰度一致；

②海参体内代谢产物的MRM-IDA-EPI分析

3.根据权利要求1所述的一种检测海参中恩诺沙星代谢产物的方法，其特征在于步骤(3)所述的标准溶液的配制方法为称取的恩诺沙星和环丙沙星标准品，先用醋酸溶解，再用甲醇稀释并定容，配制成浓度为100μg/mL标准储备液，采用定容溶液稀释配制恩诺沙星及环丙沙星的混合标准系列溶液，所述的定容溶液为乙腈与0.1％甲酸水溶液的体积比为1：9。