CN107621508B

CN107621508B - 胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法

Info

Publication number: CN107621508B
Application number: CN201710793160.XA
Authority: CN
Inventors: 王志斌; 张加余; 尚展鹏; 张连中
Original assignee: Beijing Hontest Technology Development Co ltd
Current assignee: Beijing Hontest Technology Development Co ltd
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN107621508A

Abstract

本发明公开了一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法，其包括：(1)样品制备步骤：将含有胡椒碱代谢产物的生物样品匀浆，得到清液；将所述清液上装有反相填料的固相萃取柱，依次采用水和甲醇作为洗脱剂进行洗脱，分别得到水洗脱液和甲醇洗脱液，并收集甲醇洗脱液；将所述甲醇洗脱液挥干，残渣用溶剂溶解，离心，得到样品溶液；(2)检测步骤：将所述样品溶液采用高效液相色谱‑质谱联用法进行检测分析，得到总离子流色谱图。本发明的检测方法灵敏度高，特异性强。

Description

胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法

技术领域

本发明涉及一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法。

背景技术

胡椒碱(Piperine)，化学名(E，E)-1-[5-(1，3-苯并二氧戊环-5-基)-1-氧代-2，4-戊二烯基]-哌啶，其分子式为C₁₇H₁₉NO₃，分子量为285.34。胡椒碱为白色晶体粉末，熔点130～133℃，溶于乙酸、苯、乙醇和氯仿，微溶于乙醚。现代研究证实，胡椒碱具有较强的抗炎、抗氧化、抗惊厥等作用。例如，胡椒碱在150mg·kg^-1剂量下有明显的对抗戊四唑惊厥作用，使惊厥率显著降低。在100、150mg·kg^-1剂量下均有对抗电惊厥的作用，且对大鼠的“听源性发作”均有明显对抗作用。同时，胡椒碱有明显的镇静作用，能减少小鼠的自发性活动，对硫喷妥钠有协同作用，剂量依赖性地延长苯巴比妥钠催眠时间，能使苯巴比妥的血药浓度维持在高水平。由此可见，胡椒碱具有很好的药物开发前景。

胡椒碱的体内药代动力学/药效学是当前国内外的热点之一。关于胡椒碱原形的测定方法有很多，例如纸层析法、薄层色谱法、可见-紫外分光光度法、反相高效液相色谱法等。胡椒碱在动物体内被代谢后，其原形成分以及代谢产物的浓度均很低，一般在微克甚至纳克级别，常见的检测方法很难实现这些成分的检测。

利用现代技术分析对胡椒碱在动物体内的代谢产物进行检测，对于确定胡椒碱在体内的直接作用物质，并真实地反映其药效物质基础，进而对胡椒碱及其类似物进行有效利用，具有重要意义。例如，给Wistar大鼠按170mg·kg^-1剂量灌胃胡椒碱，采用薄层扫描法检测发现，其可以被代谢为胡椒基酸、胡椒醇、胡椒醛和香草酸[Toxicology，1986，40(1)：83-92]。近年来，液质联用技术由于兼顾了液相色谱的分离度和质谱检测器的高灵敏度和高专属性，已经被逐步应用于药物代谢产物的研究中。例如，给Sprague-Dawley大鼠按170mg·kg^-1剂量灌胃胡椒碱，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱进行检测，检测到了大鼠体内的12个代谢产物[Rapid Communications in Mass Spectrometry，2017，31(11)：901-910]。由此可见，这些胡椒碱代谢产物检测方法所检测到的胡椒碱代谢产物的数量和类别均较少，不能充分阐述胡椒碱的体内代谢形式，制约了胡椒碱的体内代谢机理的研究及其进一步的临床应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap)的胡椒碱代谢产物检测方法，该方法灵敏度高，特异性强，能够更全面地阐明胡椒碱的体内的代谢产物。

本发明提供一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法，其包括如下步骤：

(1)样品制备步骤：将含有胡椒碱代谢产物的生物样品的清液上装有反相填料的固相萃取柱，依次采用水和甲醇作为洗脱剂进行洗脱，分别得到水洗脱液和甲醇洗脱液，并收集甲醇洗脱液；将所述甲醇洗脱液挥干，残渣用溶剂溶解，离心，得到样品溶液；

(2)检测步骤：将所述样品溶液采用超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱联用法进行检测分析，检测条件包括：

色谱条件：色谱柱：反相色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液(A)-有机溶剂(乙腈与甲醇体积比为3∶1，B)；梯度洗脱条件：0→2min，5vol％B；2→3min，5→10vol％B；3→17min，10→30vol％B；17→28min，30→60vol％B；28→30min，60→80vol％B；30→35min，80vol％B；柱温为30℃；进样体积为2μL；流速为300μL/min；

质谱条件：电喷雾离子源负离子检测模式(-ESI)，毛细管电压30V，喷雾电压3.0kV，毛细管温度350℃，鞘气30arb，辅助气10arb；采用傅里叶变换(FT)进行全扫描(FS)和母离子列表(PIL)扫描，一级分辨率为30 000，扫描范围m/z 100-1 000；二级质谱采用数据依赖扫描(DDS)，扫描分辨率为15 000，选取上一级丰度最高的至少一个离子峰进行碎片裂解，激活时间30ms，归一化碰撞能量：70％；数据采集系统为Xcalibur 2.1，得到总离子流色谱图。

采用本发明的样品制备步骤，能够有效除去含有胡椒碱代谢产物的生物样品中的杂质成分，减少干扰，同时有效保留胡椒碱代谢产物，使其不致流失而影响后续检测。

根据本发明的色谱条件，能够使胡椒碱代谢产物具有很好的分离度，从而有利于后续的质谱检测。

根据本发明的质谱条件，能够更灵敏地检测胡椒碱代谢产物的质谱信号，为后续进行结构鉴定提供有利条件。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述含有胡椒碱代谢产物的生物样品选自哺乳动物服用胡椒碱后的血浆、尿液或粪便中的一种或多种。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述清液与所述固相萃取柱中的反相填料的重量比为1∶2-10，更优选为1∶3-5。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述水的用量为所述清液体积的1-8倍，更优选为1-6倍；所述甲醇的用量为所述清液体积的1-5倍，更优选为1-4倍。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述甲醇洗脱液挥干的方法为N₂吹干；所述残渣用溶剂溶解的方法为涡旋震荡溶解；所述离心方法为8000-14000rpm下离心5-20min。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述溶剂选自甲醇、乙腈、5-95vol％的乙腈水溶液、5-95vol％的甲醇水溶液；更优选为5vol％的甲醇水溶液和5vol％的乙腈溶液。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述装有反相填料的固相萃取柱提前进行活化处理，所述活化处理方法为：首先采用甲醇进行活化，然后用水进行平衡。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(1)中，所述固相萃取柱为C18固相萃取柱；也可以采用可购买的固相萃取柱，例如Grace Pure SPE固相萃取柱。

根据本发明的检测方法，优选地，步骤(2)中，所述反相色谱柱可以选自如下型号的反相色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)、ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)、ACQUITY UPLC T3 C18(1.8μm，2.1×50mm)、ACQUITY UPLC T3 C18(1.8μm，2.1×100mm)；更优选为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)。

本发明的检测方法还可以包括如下步骤：

(3)胡椒碱代谢产物的筛选步骤：应用高分辨提取离子流法(HREIC)和质量亏损过滤法(MDF)从质谱检测数据中进行筛选，得到胡椒碱代谢产物的提取离子流色谱图；和

(4)胡椒碱代谢产物的分子预测步骤：采用Xcalibur 2.1工作站分子式预测模块，对提取离子流色谱图中的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[10-25]，H[20-40]，O[0-15]，S[0-4]，N[0-4]，Cl[0-4]，环和不饱和双键数(RDB equivalentvalue)[0-15]，质量精度误差在5ppm以内。

采用本发明步骤(3)的筛选步骤能够更好地从复杂的生物基质中筛选胡椒碱代谢产物信号。本发明中，采用高分辨提取离子流法可以结合药物代谢反应来预测胡椒碱代谢产物，并在质量精度误差在5ppm以内定向提取精确分子质量；同时采用质量亏损过滤法，通过设定过滤窗口(质量窗口和质量亏损窗口)获得更为精细的质谱数据集，过滤背景干扰离子，提高化合物筛选效率。两者相互补充，能够更有效地实现对胡椒碱代谢产物的筛选。

通过本发明步骤(4)的参数设定，能够更准确地预测胡椒碱代谢产物的分子式。

本发明的检测方法还可以包括如下步骤：

(5)胡椒碱代谢产物结构鉴定步骤：对椒碱代谢产物的提取离子流色谱图的裂解碎片进行分析，确定其动态诊断离子(DPIs)和中性丢失(NLFs)，通过反向拼装，对胡椒碱代谢产物的结构进行鉴定。

本发明的步骤(5)为复杂生物基质中胡椒碱生物体内代谢产物的信号深入挖掘提供了有力的工具，为全面阐明胡椒碱在动物体内的代谢产物和代谢途径提供了保证。

本发明首次建立了一种灵敏度高，特异性强，方便可行的超高效液相色谱-线性离子阱-静电阱轨道场质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap)的胡椒碱代谢产物检测方法。采用本发明的检测方法，由于有效除去了胡椒碱生物样品中的杂质成分，使胡椒碱代谢产物具有很好的分离度，并能够更灵敏地检测胡椒碱代谢产物的质谱信号，从而有利于对胡椒碱生物样品中胡椒碱代谢产物的检测和分析。根据本发明优选的实施方式，能够检测含有胡椒碱代谢产物的生物样品中包括胡椒碱原形药在内的148个胡椒碱的体内代谢产物，在此基础上可以准确地分析出胡椒碱在体内的代谢途径，对进一步的体内药物代谢动力学研究和临床指导合理用药具有重要意义，也为利用胡椒碱及其类似物的药物开发提供可靠的基础。

附图说明

图1示出了胡椒碱对照品的电喷雾质谱裂解一级图谱。

图2示出了胡椒碱对照品的电喷雾质谱裂解二级图谱。

图3示出了胡椒碱对照品的电喷雾质谱裂解三级图谱。

图4示出了胡椒碱对照品的电喷雾质谱裂解方式。

图5(A-J)示出了胡椒碱代谢产物的高分辨提取离子流图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

以下实施例中，对照品胡椒碱(批号110775-201405，纯度大于98％)购于北京市药品检验所；原料药胡椒碱(纯度大于98％)购于成都普瑞法科技有限公司，可用于定性研究。质谱级乙腈、质谱级甲醇、质谱级甲酸均购于Fisher Scientific(Fair Lawn，NJ，USA)，超纯水由Millipore Synergy UV超纯水机制备。

Thermo Scientific Accela 600 pump HPLC系统：包括在线脱气机、自动进样器、高压二元梯度泵；UPLC通过电喷雾接口与LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪(ThermoScientific，Bremen，Germany)连接；Thermo Xcalibur 2.1工作站；KQ-250DE型数控超声波清洗器(中国昆山市超声仪器有限公司)；Millipore Synergy UV型超纯水机(美国Millipore公司)；R200D型电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；液相色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)(美国Waters公司)；Grace Pure^TM SPE C18-Low固相萃取小柱(500mg/3mL)；FRESCO 21微量离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；TARGIN VX-II型多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司)；TTL-DCI型氮吹仪(北京同泰联科技发展有限公司)。

以下实施例中，含有胡椒碱代谢产物的生物样品的获得方法为：

Sprague Dawley(SD)大鼠，体重(200±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0004，饲养于北京中医药大学动物房(SPF级)：12h昼夜循环，室温恒定在22-24℃，相对湿度保持在55-65％。

血液样本的收集：大鼠适应环境3天，自由饮食饮水，选取健康的SD大鼠18只，分为空白组(6只)和给药组(12只)。实验前禁食12小时，自由饮水，实验时灌胃给予胡椒碱，各大鼠在给药后0.5、1、2、4h分别眼眶静脉取血0.5mL。合并所采集的血样，置于涂满肝素钠的离心管中，3500rpm离心10min，取上清液，得到空白组血样和给药组血样，置于-80℃冰箱冻存。

尿样和粪样的收集：灌胃给药后分别收集24h后的空白组和给药组大鼠的尿和粪。期间供给食物和水。尿样3 500rpm离心10min后取上清-80℃冰箱冻存。粪样置于通风橱中晾干后碾碎，装于离心管中冻存。

上述所有生物样品均用Grace Pure SPE C18固相萃取小柱处理。Grace Pure SPEC18固相萃取小柱先用5mL的甲醇活化小柱，后加入5mL的去离子水平衡固相萃取小柱。

血浆样品的处理方法：将1mL的血浆样品置于已活化的固相萃取小柱，然后用2mL水冲洗杂质，随后用3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。将上述所有甲醇洗脱液，在室温下用N₂吹干，残渣用100μL的5％vol乙腈溶液复溶，涡旋震荡3min后，1 4000rpm离心15min，取上清液。

尿液样品的处理方法：将冻存的尿液样本放到室温下溶解，取2mL的尿液置于已活化的固相萃取小柱，然后用3mL水冲洗杂质，随后用3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。将上述甲醇洗脱液，在室温下用N₂吹干，残渣用100μL的5％vol乙腈溶液复溶，涡旋震荡3min后，14000rpm离心15min，取上清液。

粪便样品的处理方法：取粪样适量，按照1∶5(W∶V)比例加入去离子水，超声60min，3500rpm离心10min，取上清液。取处理好的上清液2mL置于已活化的固相萃取小柱，然后用3mL水冲洗杂质，随后用3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。将上述所有甲醇洗脱液，在室温下用N₂吹干，残渣用100μL的5％vol乙腈溶液复溶，涡旋震荡3min后，1 4 000rpm离心15min，取上清液。

实施例1

胡椒碱代谢产物的检测步骤：

色谱条件：流动相：0.1vol％甲酸水溶液(A)-有机溶剂(乙腈与甲醇体积比为3∶1，B)；梯度洗脱条件：0→2min，5vol％B；2→3min，5→10vol％B；3→17min，10→30vol％B；17→28min，30→60vol％B；28→30min，60→80vol％B；30→35min，80vol％B；柱温为30℃；进样体积为2μL；流速为300μL/min；

质谱条件：电喷雾离子源负离子检测模式(-ESI)，毛细管电压30V，喷雾电压3.0kV，毛细管温度350℃，鞘气30arb，辅助气10arb；采用傅里叶变换(FT)进行全扫描(FS)和母离子扫描(PIL)扫描，一级分辨率为30 000，扫描范围m/z 100-1000；二级质谱采用数据依赖扫描(DDS)，扫描分辨率为15 000，选取上一级丰度最高的至少一个离子峰进行碎片裂解，激活时间30ms，归一化碰撞能量：70％；数据采集系统为Xcalibur 2.1；上述条件下得到总离子流色谱图。

胡椒碱代谢产物的筛选步骤：

应用高分辨提取离子流法和质量亏损过滤法对代谢产物总离子流色谱图进行筛选，得到胡椒碱代谢产物的提取离子流色谱图。一方面，对于简单的、可以预测的代谢产物，例如甲基化、羟基化、硫酸酯化等代谢产物，采用高分辨提取离子流法进行数据筛选。另一方面，对于很多难以预测的代谢产物，尤其是一些复合的代谢反应，应用质量亏损过滤法(MDF)进行筛选。MDF法的分子模板设定为原形、已知代谢物以及它们的结合反应代谢产物(硫酸酯化、葡萄糖醛酸化、葡萄糖化、谷胱甘肽结合等)。其MDF质量过滤窗口为模板分子量整数位的±50Da范围，MDF质量亏损过滤窗口为模板分子量小数位的±50mDa范围。最终，去掉重叠部分，确定了3个MDF过滤模板。a)：原药模板，质量范围为224-354Da，质量亏损范围为68.0-209.4mDa；b)：硫酸酯化模板，质量范围为304-434Da，质量亏损范围为45.5-166.2mDa；c)：葡萄糖醛酸化模板，质量范围为388-544Da，质量亏损范围为115.4-256.8mDa。

胡椒碱代谢产物分子预测步骤：

利用Xcalibur 2.1工作站进行数据处理：采用分子式预测模块，对所有的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C[10-25]，H[20-40]，O[0-15]，S[0-4]，N[0-4]，Cl[0-4]，环和不饱和双键数(RDB equivalent value)[0-15]，质量精度误差在5ppm以内。

胡椒碱代谢产物结构鉴定步骤：

对胡椒碱及代谢产物的质谱裂解碎片进行分析，总结其动态的诊断离子对(pDPIs)和中性丢失，通过反向拼装，对胡椒碱代谢产物的结构进行鉴定。一般来说，一个化合物在质谱裂解过程中，会产生两部分：带电的部分(质谱图中检测到的)和中性丢失部分(质谱图中检测不到的)，二者具有结构互补性。具有相同或相近母核的化合物，大多会产生相同或相似的碎片离子(诊断离子，DPIs)和具有规律性的中性丢失(NLFs)。如此以来，可以通过将DPIs和NLFs结合起来，构建反向分子组装策略，用于胡椒碱代谢产物的鉴定。

以原药胡椒碱为例，产生m/z 286.1436的[M+H]⁺准分子离子峰，可以推断其分子式为C₁₇H₂₀NO₃，质量误差为-0.70ppm。在其在ESI-MS2谱中，[M+H]⁺离子通过中性丢失哌啶环而产生m/z 201[M+H-85]⁺碎片离子，并同时产生m/z 173、m/z 159、m/z 135、m/z 171、m/z143等碎片离子。通过分析，可以将m/z 201[M+H-85]⁺与哌啶环的中性丢失进行反向推导(201+85＝286)，从而推导其化学结构。其他代谢产物亦可依据此反向分子组装方法进行推导。

最终，应用上述方法，并与相应的空白组样品信号对比，共从给药大鼠生物样品中鉴定胡椒碱原形及代谢产物148个，其中在血浆中检测到57个，尿中检测到144个，粪便中检测到53个，从而全面地阐明了其在大鼠中的代谢产物。其中所述胡椒碱代谢产物的结构式见表1。在此基础上，为胡椒碱在大鼠体内可能的代谢途径进行全面分析提供了坚实的基础。

表1胡椒碱代谢产物的结构

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims

1.一种胡椒碱在动物体内代谢产物的检测方法，其包括如下步骤：

（1）样品制备步骤：将含有胡椒碱代谢产物的生物样品的清液上装有反相填料的固相萃取柱，依次采用水和甲醇作为洗脱剂进行洗脱，分别得到水洗脱液和甲醇洗脱液，并收集甲醇洗脱液；将所述甲醇洗脱液挥干，残渣用溶剂溶解，离心，得到样品溶液；所述的反相填料为C18；所述含有胡椒碱代谢产物的生物样品选自哺乳动物灌服胡椒碱后的血浆、尿液或粪便中的一种或多种；

（2）检测步骤：将所述样品溶液采用超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱法进行检测分析，检测条件包括：

色谱条件：色谱柱：反相色谱柱,所述的反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相A为0.1vol%甲酸水溶液, 流动相B为乙腈与甲醇体积比为3:1的有机溶剂；梯度洗脱条件：0→2 min，5vol% B；2→3 min，5→10vol% B；3→17 min，10→30vol% B；17→28 min，30→60vol% B；28→30 min，60→80vol% B；30→35 min，80vol% B；柱温为30℃；进样体积为2 µL；流速为300 µL/min；

质谱条件：电喷雾离子源负离子检测模式，毛细管电压30V，喷雾电压3.0kV，毛细管温度350℃，鞘气30arb，辅助气10arb；采用傅里叶变换进行全扫描和母离子列表扫描，一级分辨率为30 000，扫描范围m/z 100-1 000；二级质谱采用数据依赖扫描，扫描分辨率为15000，选取上一级丰度最高的至少一个离子峰进行碎片裂解，激活时间30ms，归一化碰撞能量：70%；数据采集系统为Xcalibur 2.1，得到总离子流色谱图;

所述检测方法还包括如下步骤：

（3）胡椒碱代谢产物的筛选步骤：应用高分辨提取离子流法和质量亏损过滤法从质谱检测数据中进行筛选，得到胡椒碱代谢产物的提取离子流色谱图；

（4）胡椒碱代谢产物的分子预测步骤：采用Xcalibur 2.1工作站分子式预测模块，对提取离子流色谱图中的母离子和碎片离子的分子式进行预测，相关参数设定为：C：10-25，H ：20-40，O ：0-15，S ：0-4，N ：0-4，Cl ：0-4，环和不饱和双键数：0-15，质量精度误差在5 ppm以内。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：

（5）胡椒碱代谢产物结构鉴定步骤：对胡椒碱代谢产物的质谱裂解碎片离子进行分析，确定其动态诊断离子和中性丢失，通过反向拼装，对胡椒碱代谢产物的结构进行鉴定。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述清液与所述固相萃取柱中的反相填料的重量比为1:2-10。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述水的用量为所述清液体积的 1-8 倍；所述甲醇的用量为所述清液体积的 1-5倍。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述甲醇洗脱液挥干的方法为N₂吹干；所述残渣用溶剂溶解的方法为涡旋震荡溶解；所述离心方法为8000-14000rpm下离心5-20min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述溶剂选自甲醇、乙腈、5-95vol%的乙腈水溶液、5-95vol%的甲醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述装有反相填料的固相萃取柱提前进行活化处理，所述活化处理方法为：首先采用甲醇进行活化，然后用水进行平衡。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述反相色谱柱选自如下型号的反相色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 ：1.7 µm，2.1×100 mm、ACQUITY UPLC BEHC18 ：1.7 µm，2.1×50 mm、ACQUITY UPLC T3 C18：1.8 µm，2.1×50 mm、 ACQUITY UPLC T3C18 ：1.8 µm，2.1×100 mm。