CN105759065B - 血液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒 - Google Patents

血液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了血液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒，血液代谢标记物可用于制备用于诊断抑郁症的试剂或仪器，例如试剂盒，所述试剂盒，包含有：10mg/ml代谢标记物的标准纯品液,13C稳定同位素内标液，体积比1:1的甲醇‑水溶液，1根分析色谱柱和质量控制标准血清，所述试剂盒能够准确测定血液中的上述筛选的14种代谢标记物的含量，利用该试剂盒对抑郁症早期诊断的特异性达86.8％，敏感度达到96.8％，准确率达93.0％，使得抑郁症的诊断将不再完全依靠问卷量表进行主观判断，大大提高诊断准确性。

Description

血液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其是血液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒。
背景技术
抑郁症(Depression)又称为抑郁性障碍，是一种以抑郁心境为主要特点，伴随着精神萎靡，食欲减退和睡眠紊乱等的严重危险人类健康的精神疾病。抑郁症具有发病时间长、治愈困难和致残率和自杀率高等特点给个人、家庭和社会都带来了沉重的负担。目前全世界至少有3.2亿各类抑郁症患者，是世界第四大疾病。
抑郁症是一种复杂的精神疾病，其发病的具体机制尚不完全明确。抑郁症的发病与患者的饮食、睡眠和生活工作环境等都有密切的联系。因此，传统的基因和蛋白检测方法都不理想，特别是对于抑郁症的早期诊断。目前临床上，诊断抑郁症还局限于根据临床症状，通过抑郁症量表进行诊断为主。但是，这种方法诊断周期长，确诊困难，有得甚至需要2年才能确诊。因此开发快速、灵敏和准确的抑郁症预测和早期诊断方法，对于推动我国抑郁症的防治工作具有重要意义。
目前的研究表明，抑郁症可能是由于脑部代谢产物5-羟基色氨(Serotonin)缺乏引起的。而脑部的5-羟基色氨，大概70％是由小肠中的肠道菌代谢产生的。体内激素水平的降低也是引起抑郁症的重要原因。此外研究表明表明，细胞间通讯的减少是引发抑郁症的根本原因。而代谢产物正是细胞间进行交流的语言。细胞间减少了交流，外在的临床表现就是人的抑郁，抑郁症从本质上讲，是代谢紊乱失偿性疾病。因此某些血液中的代谢产物可能成为预测和诊断抑郁症的生物标记物。
新一代靶向代谢组学技术(Targeted metabolomics)是后基因时代发展起来的系统生物学新技术，其主要目的是检测生物体内所有代谢产物。代谢组学技术是读懂细胞间交流的语言的工具。新一代代谢组学技术的发展使高通量筛选和检测血液中的可用于诊断抑郁症的代谢标记物成为可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供血液代谢标记物的用途。
本发明所要解决的另一技术问题在于利用上述血液代谢标记物的用途而获得的一种抑郁症检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
血液代谢标记物在制备用于诊断抑郁症的试剂或仪器方面的用途，所述血液代谢标记物为：蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、5-羟基色胺、丙酰肉碱、戊二酰基肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇。
上述血液代谢标记物的用途，所述血液代谢标记物是由下述方法筛选得到的：
(1)分别选取抑郁症患者和健康对照组(每组至少10例)，取血样，从中提取代谢产物；
(2)通过代谢组学的方法，运用LC-MS/MS的方法对血液中的主要代谢产物的含量进行测定；
(3)所得的数据通过PLS-DA多重变量分析和VIP分析，找出两组之间具有显著性差异的代谢产物，作为备选代谢标记物；
(4)通过ROC曲线，进一步筛选确定出准确性和特异性都较高的代谢标记物组合。
一种抑郁症检测试剂盒，包含有：10mg/ml代谢标记物的标准纯品液,13C稳定同位素内标液，体积比1:1的甲醇-水溶液(代谢产物提取溶剂)，1根分析色谱柱和质量控制标准血清，其中，每1ml代谢标记物的标准纯品液配合使用100微升13C稳定同位素内标液，10ml甲醇-水溶液和100微升质量控制标准血清。
优选的，上述抑郁症检测试剂盒，所述代谢标记物包括蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、5-羟基色胺、丙酰肉碱、戊二酰基肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇。
上述抑郁症检测试剂盒，能够准确测定血液中的14种代谢标记物：蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、5-羟基色胺、丙酰肉碱、戊二酰基肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇，进而用于检测、诊断抑郁症。
上述抑郁症检测试剂盒的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)代谢标记物的标准纯品液的制备：取代谢产物标准品溶解于甲醇中，配制成10mg/ml的溶液，为代谢产物标准纯品液；
(2)13C稳定同位素内标液的制备：取13C稳定同位素内标提取物，准确称量，溶解于甲醇中，配成1mg/ml的溶液，为13C稳定同位素内标液；
(3)代谢产物提取溶剂的制备：将色谱纯级甲醇和水按照1:1体积比混合，为代谢产物提取溶剂；
(4)分析色谱柱：为常见色谱耗材(购自美国Phenomenex公司)，色谱柱填料和规格为：Luna NH2色谱柱，250mm×2mm；
(5)质量控制标准血清的获得：取正常人的血液，常温离心(800转/分)10分钟，将上清液转移到新的离心管中，取上清液90微升中加入5微升代谢产物标准纯品液(终浓度为0.5mg/ml)和5微升13C稳定同位素内标液(终浓度0.05mg/ml)，混合，为质量控制标准血清。
上述抑郁症检测试剂盒的应用方法，具体步骤如下：
(1)取抑郁症检测试剂盒中的甲醇-水溶液(代谢产物提取溶剂)和13C稳定同位素内标液，对干血斑上的代谢产物进行提取；
(2)基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法，对于干血斑代谢提取液中的14种代谢产物进行定量测定，将测得的14种代谢产物——蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、5-羟基色胺、丙酰肉碱、戊二酰基肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇的浓度，与其浓度正常值(0.02-7800微摩尔)比较，如果14种代谢产物中，蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、丙酰肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇显著增加(>正常值的1.2倍)，而5-羟基色胺和戊二酰基肉碱显著降低(<正常值的0.8倍)则判定为抑郁症。
优选的，上述抑郁症检测试剂盒的应用方法，所述步骤(2)中基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法，具体步骤为：
(1)通过自动进样器将代谢提取液注入Luna NH2色谱柱中(250mm×2mm,5μm，Phenomenex,CA,USA)，通过亲水作用色谱，对血样中的代谢产物进行分离，具体的色谱条件为：流动相A为95％水+20mM氢氧化铵(NH4OH)+15.3mM甲酸(HCOOH),pH 9.44；流动相B为100％的乙腈；流速为0.3ml/min，柱温为25℃；梯度洗脱条件为：0-3min，95％B；3.1-6min,80％B；6.1-10min，70％B；10-18min，2％B；18-21min，0％B，21-27min0％B；28-31min，100％B；31.1min，95％B；35min停止；
(2)将色谱分离的代谢产物导入三重四极杆质谱，采用正负离子快速切换的实时编程的多反应检测模式对代谢产物进行扫描和检测，正负离子切换速率设定为50ms，停留时间设定为2ms，负离子电压设定为-4500V，正离子电压设定为5500V，离子源温度设定为500℃，保护气(Curtain gas)设定为30psi，第一辅助气(Gas 1)设定为35psi，第二辅助气(Gas 2)设定为35psi。
本发明的有益效果是：
上述抑郁症检测试剂盒，首次提供了辅助预测和早期诊断抑郁症的血液代谢标记物，具有较高的准确性和诊断参考价值，能够准确测定血液中的上述筛选的14种代谢标记物的含量，利用该试剂盒对抑郁症早期诊断的特异性达86.8％，敏感度达到96.8％，准确率达93.0％，使得抑郁症的诊断将不再完全依靠问卷量表进行主观判断，而是通过患者血液中的代谢产物的含量变化这种客观指标检查，显著提高了诊断准确率，简化了诊断过程，具有巨大市场开发前景。
附图说明
图1是PLS-DA多重比较分析图，揭示了抑郁症患者和正常人之间的血液中代谢具有显著性差异。
图2是VIP分析图，提示可能区分抑郁症和正常人的血液代谢标记物。
图3是ROC曲线图，进一步筛选和确认14个用于诊断抑郁症的代谢产物标记物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1抑郁症诊断血液代谢标记物的筛选
1、血液中代谢组的提取
经供血者同意后，采用干血斑法采集正常人和临床上明确诊断为抑郁症的患者血液，每组至少10例。取干血斑，用纸片打孔器，取血样，加入90μl代谢产物提取液(甲醇-乙腈-水，40:40:20)和10μl稳定同位素内标物，涡旋混匀。在冰上静置10分钟。将混合液低温高速离心15分钟(16,000g，4℃)。离心后，取上清液50μl供血液中代谢组分析。
2、基于LC-MS/MS靶向代谢组学分析
通过自动进样器将10μl代谢提取液注入Luna NH2色谱柱中(250mm×2mm,5μm，Phenomenex,CA)，通过亲水作用色谱，对血样中的代谢产物进行分离。具体的色谱条件为：流动相A为95％水+20mM氢氧化铵(NH4OH)+15.3mM甲酸(HCOOH),pH 9.44；流动相B为100％的乙腈；流速为0.3ml/min，柱温为25℃。梯度洗脱条件为：0-3min，95％B；3.1-6min,80％B；6.1-10min，70％B；10-18min，2％B；18-21min，0％B，21-27min0％B；28-31min，100％B；31.1min，95％B；35min停止。
将色谱分离的代谢产物导入三重四极杆质谱，采用正负离子快速切换的实时编程的多反应检测模式对代谢产物进行扫描和检测。正负离子切换速率设定为50ms，停留时间设定为2ms，负离子电压设定为-4500V，正离子电压设定为5500V，离子源温度设定为500℃，保护气(Curtain gas)设定为30psi，辅助气1(Gas 1)设定为35psi，辅助气2(Gas 2)设定为35psi。
3、PLS-DA多重变量分析和可能的代谢标记物
通过Multiquant分析软件对所得色谱峰进行积分，所得的峰面积，进行log 2对数转化。通过内标化合物对各个样品进行归一化。利用PLS-DA分析，查看抑郁症病人和正常人之间的代谢差异。结果如图1表明，抑郁症患者和正常人的血液代谢存在显著差异。VIP分析，筛选出了20个在抑郁症患者和正常人血液的含量有显著性差异的代谢产物(p<0.05)(图2)。
4、ROC曲线分析
对通过VIP分析，筛选出的20个有显著性差异的代谢产物，进一步进行ROC曲线分析，判断其用于区分抑郁症和正常人的准确性和特异性。结果如图3表明，14个代谢产物(蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、5-羟基色胺、丙酰肉碱、戊二酰基肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇)的浓度差异，能够将正常人与抑郁症病人准确的区分开。曲线下峰面积(AUC)达到0.815(p＝0.001)。ROC曲线下面积越大(最大值为1)表明这些代谢产物对抑郁症和正常人的诊断区分度越大。
实施例2
一种抑郁症检测试剂盒，试剂盒中含有：代谢标记物的标准纯品液(10mg/ml,1毫升)；13C稳定同位素内标液(1mg/ml，100微升)；代谢产物提取溶剂(10ml)；分析色谱柱(1根)和质量控制标准血清(100微升)。
所述试剂盒的制备方法如下：
代谢标记物的标准纯品液：取代谢产物标准品粉末，准确称量10毫克，溶解于1毫升的甲醇中，制备成10mg/ml的代谢标记物纯品液。
13C稳定同位素内标液：取13C稳定同位素提取粉末，准确称量1毫克，溶解于1毫升甲醇中，制备成1mg/ml的13C稳定同位素内标液。
代谢产物提取溶剂：准确量取色谱纯甲醇5ml，加入5ml色谱纯水，混匀为代谢产物提取液。
分析色谱柱：为常用色谱耗材，购自于美国Phenomenex公司，柱材料和尺寸为色谱柱填料和规格为：Luna NH2色谱柱，250mm×2mm。
质量控制标准血清：取正常人的全血，常温离心(800转/分)10分钟，将上清液转移到新的血液收集管中。取上清液90微升中加入5微升代谢产物标准纯品液(终浓度为0.5mg/ml)和5微升13C稳定同位素内标液(终浓度0.05mg/ml)，混合，为质量控制标准血清。
实施例3
抑郁症检测试剂盒诊断抑郁症的临床实例
随机采取某门诊100名就诊的人员的血，收集到干血斑上，使用实施例2所述抑郁症检测试剂盒进行抑郁症诊断。
取抑郁症检测试剂盒中的代谢产物提取溶剂(甲醇-水溶液)和13C稳定同位素内标液，对干血斑上的代谢产物进行提取。基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法，对于干血斑代谢提取液中的实施例1筛选的14种代谢产物进行定量测定，具体步骤为：
(1)通过自动进样器将代谢提取液注入Luna NH2色谱柱中(250mm×2mm,5μm，Phenomenex,CA,USA)，通过亲水作用色谱，对血样中的代谢产物进行分离，具体的色谱条件为：流动相A为95％水+20mM氢氧化铵(NH4OH)+15.3mM甲酸(HCOOH),pH 9.44；流动相B为100％的乙腈；流速为0.3ml/min，柱温为25℃；梯度洗脱条件为：0-3min，95％B；3.1-6min,80％B；6.1-10min，70％B；10-18min，2％B；18-21min，0％B，21-27min0％B；28-31min，100％B；31.1min，95％B；35min停止；
(2)将色谱分离的代谢产物导入三重四极杆质谱，采用正负离子快速切换的实时编程的多反应检测模式对代谢产物进行扫描和检测，正负离子切换速率设定为50ms，停留时间设定为2ms，负离子电压设定为-4500V，正离子电压设定为5500V，离子源温度设定为500℃，保护气(Curtain gas)设定为30psi，第一辅助气(Gas 1)设定为35psi，第二辅助气(Gas 2)设定为35psi。
将测得的14种代谢产物的浓度，与其浓度正常值(0.02-7800微摩尔)比较，如果14种代谢产物中，蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、丙酰肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇显著增加(>正常值的1.2倍)，而5-羟基色胺和戊二酰基肉碱显著降低(<正常值的0.8倍)则判定为抑郁症。
本实验进行的同时，由专业医生对100名就诊的人员通过问卷调查量表进行抑郁症诊断，作为诊断的金标准，与试剂盒法进行比较，结果如表1所示。由表1计算代谢组学标记物试剂盒诊断抑郁症的准确度达93.0％，特异性为86.8％，敏感度为96.8％。
表1 代谢标记物试剂盒诊断抑郁症效果评估
上述参照实施例对该血液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.血液代谢标记物在制备用于诊断抑郁症的试剂方面的用途，其特征在于：所述血液代谢标记物为：蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、5-羟基色胺、丙酰肉碱、戊二酰基肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇。
2.根据权利要求1所述血液代谢标记物的用途,其特征在于:用于制备抑郁症检测试剂盒,所述抑郁症检测试剂盒包含有：10mg/ml代谢标记物的标准纯品液,13C稳定同位素内标液，体积比1:1的甲醇-水溶液，1根分析色谱柱和质量控制标准血清，其中，每1ml代谢标记物的标准纯品液配合使用100微升13C稳定同位素内标液，10ml甲醇-水溶液和100微升质量控制标准血清。
3.根据权利要求2所述血液代谢标记物的用途，其特征在于：所述代谢标记物包括蛋氨酸、烟酸、磷酸丝氨酸、乳酸、谷氨酸、次黄嘌呤、胆碱、色氨酸、5-羟基色胺、丙酰肉碱、戊二酰基肉碱、雌二醇、皮质甾醇和雌三醇。
4.根据权利要求2所述血液代谢标记物的用途，其特征在于：所述抑郁症检测试剂盒是由下述方法制备得到的：
(1)代谢标记物的标准纯品液的制备：取代谢产物标准品溶解于甲醇中，配制成10mg/ml的溶液，为代谢产物标准纯品液；
(2)13C稳定同位素内标液的制备：取13C稳定同位素内标提取物，准确称量，溶解于甲醇中，配成1mg/ml的溶液，为13C稳定同位素内标液；
(3)代谢产物提取溶剂的制备：将色谱纯级甲醇和水按照1:1体积比混合，为代谢产物提取溶剂；
(4)分析色谱柱：色谱柱填料和规格为：Luna NH2色谱柱，250mm×2mm；
(5)质量控制标准血清的获得：取正常人的血液，常温离心10分钟，将上清液转移到新的离心管中，取上清液90微升中加入5微升代谢产物标准纯品液和5微升13C稳定同位素内标液，混合，为质量控制标准血清。
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CN107917980A (zh) * 2017-11-14 2018-04-17 河南科技大学 鉴定榆树树龄的生物标志物、获取方法及其应用

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