CN107607647A - 胆碱和肉碱的分离方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胆碱和肉碱的分离方法及其应用。本发明采用高效液相色谱法对胆碱和肉碱进行分离；所述的高效液相色谱法中的色谱柱为氨基色谱柱；所述的高效液相色谱法中的流动相为缓冲溶液和极性有机溶剂；所述缓冲溶液为含有10mmol/L的甲酸铵水溶液。该分离方法操作简单，可以将两种生物碱完全分离，峰形好，且不受其他有机杂质干扰，灵敏度高、简单快速。
Description
技术领域
本发明涉及胆碱和肉碱的分离方法及其应用。
背景技术
生物碱是一类具有生理活性的物质，是许多药用植物的重要有效成分之一。一些生物碱因其具有抗肿瘤、抗癌、低毒、低成本的特点,最近已经成为人们研究的焦点。利用现代分离技术把生物碱从天然产物中分离出来并对其进行纯化,对于开发其药用价值,以满足天然药物和天然保健品日益高涨的社会需求,促进中药走向世界,提高天然产物的经济和社会效益均具有非常重要的意义。
生物碱在植物体内含量极少，但具有较强的生理活性，许多生物碱是治病良药，但是由于各种生物碱的碱性不同，给分离纯化工作带来很多困难。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于为了克服现有技术中胆碱和肉碱分离困难，存在峰形差、灵敏度低、重复性差或分析时间长等问题，从而提供了一种胆碱和肉碱的分离方法及其应用。该分离方法操作简单，可以将两种生物碱完全分离，峰形好，且不受其他有机杂质干扰，灵敏度高、简单快速。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的。
本发明提供了一种胆碱和肉碱的分离方法，其包含以下步骤：采用高效液相色谱法对胆碱和肉碱进行分离，即可；
所述的高效液相色谱法中的色谱柱为氨基色谱柱，例如以化学稳定的、三键键合的酰胺基键合相的氨基色谱柱，再例如XBridge Amide柱；
所述的高效液相色谱法中的流动相为缓冲溶液和极性有机溶剂；所述缓冲溶液为含有10mmol/L的甲酸铵水溶液。
本发明中，所述的高效液相色谱法可采用梯度洗脱，所述梯度洗脱时所述缓冲溶液和所述极性有机溶剂的体积比可为10:90～45:55。
本发明中，所述梯度洗脱中，所述流动相比例随时间的变化范围可如表1所示：
表1
本发明中，所述极性有机溶剂可选自乙腈、甲醇和乙醇中的一种或多种，例如乙腈。
本发明中，所述胆碱和肉碱的样品一般配制为溶液形式；所述溶液中的溶剂可选自水和/或醇类溶剂；所述醇类溶剂可选自甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇中的一种或多种，例如甲醇；
本发明中，所述的流动相的流速可参考领域HPLC检测分析时的常规流速，例如0.5～1.5mL/min，再例如0.6mL/min。
本发明中，所述高效液相色谱法的进样量可参考本领域HPLC检测分析的常规进样量，例如1uL～5uL，再例如2uL。
本发明中，所述色谱柱的填料颗粒度可为2.7μm～5μm；例如3.5μm；所述色谱柱的长度可为100mm～250mm，优选250mm。
本发明中，所述色谱柱的柱温可为25～60℃，例如35℃。
本发明中，所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪可采用本领域的常规高效液相色谱仪，例如Thermo scientific Dionex UltiMate 3000液相色谱仪。
本发明还提供了一种所述分离方法在胆碱和肉碱的分析检测中的应用，其包含以下步骤：将所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪与检测器联用，对胆碱和肉碱进行分析检测，即可。
所述应用中，所述检测器可为质谱检测器。
所述质谱检测器可为三合一组合型高分辨质谱仪，例如Thermo Scientific的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪。
所述质谱检测器中的离子源可采用ESI离子源。
本发明还提供了一种所述分离方法在胆碱和肉碱含量测定中的应用。
所述胆碱和肉碱含量测定的方法可参考本领域常规的含量测试方法。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明提供的分离方法操作简单，可以将胆碱和肉碱完全分离，峰形好，且不受其他有机杂质干扰，灵敏度高、简单快速。
(2)本发明提供的分离方法除了可以对胆碱和肉碱进行分离之外，其还可用于胆碱和肉碱的分析检测，还可以进一步用于胆碱和肉碱的含量测定。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
1、供试品的制备
取胆碱和肉碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含10μg的溶液，即得。
2、色谱条件和方法
液相色谱仪：Dionex UltiMate 3000液相色谱仪(Thermo Scientific)
色谱柱：XBridge Amide(4.6mm×250mm，3.5μm)
流动相：以乙腈和缓冲溶液(含10mmol/L的甲酸铵水溶液)分别为流动相A和B。
| 时间(min) | 流动相B(％，v/v) |
| 0～10 | 10→15 |
| 10.01～30.00 | 15→25 |
| 30.01～40.00 | 25→45 |
柱温：35℃；
流速：0.6mL/min；
进样量：2μL；
检测条件：
质谱仪：三合一组合型高分辨质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos,ThermoScientific)
采用ESI离子源，正离子模式采集数据，电压3.8KV/2.8KV，Sheath Gas35Arb,AuxGas 10Arb,Ion Transfer Tube Temp 350℃,Vaporizer Temp 350℃，一级全扫范围m/z70–700，Orbitrap采集数据，分辨率120K，auto gain control(AGC)：100000，采用HCD方式裂解，能量30％，Orbitrap采集二级数据，分辨率30K，采用“Top Speed”算法进行数据依赖扫描，动态排除时间为6s。
数据采集和处理使用Xcalibur 4.0软件。
3、检测结果：
肉碱的保留时间为35.59min，胆碱的分离时间为26.108min；分离度大于2.0，峰形良好，不拖尾，不前伸。
对比实施例1
与实施例1不同的是，当色谱柱替换为普通C18柱(Agilent poroshell120SB-C182.7μm，3.0×75mm)，流动相：以乙腈和缓冲人也(含10mmol/L甲酸铵的水溶液)分别为流动相A和B。同时采用以下梯度洗脱方式：
| 时间(min) | 流动相A(％，v/v) |
| 0～20.00 | 5～50 |
其他操作均参考实施例1中的操作方式，肉碱与胆碱得不到基线分离，且在色谱柱上保留较差，保留时间均在1分钟以内。
Claims (10)
1.一种胆碱和肉碱的分离方法，其特征在于，包含以下步骤：采用高效液相色谱法对胆碱和肉碱进行分离，即可；
所述的高效液相色谱法中的色谱柱为氨基色谱柱；
所述的高效液相色谱法中的流动相为缓冲溶液和极性有机溶剂；所述缓冲溶液为含有10mmol/L的甲酸铵水溶液。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述氨基色谱柱是以化学稳定的、三键键合的酰胺基键合相的氨基色谱柱，例如XBridge Amide柱。
3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法采用梯度洗脱，所述梯度洗脱时所述缓冲溶液和所述极性有机溶剂的体积比为10:90～45:55。
4.如权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，所述流动相比例随时间的变化范围如表1所示：
表1
5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述极性有机溶剂选自乙腈、甲醇和乙醇中的一种或多种，例如乙腈。
6.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述胆碱和肉碱样品配制为溶液形式；所述溶液中的溶剂选自水和/或醇类溶剂；例如，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇中的一种或多种，再例如甲醇。
7.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的流动相的流速为0.5～1.5mL/min，例如0.6mL/min；
和/或，所述高效液相色谱法的进样量为1uL～5uL，例如2uL；
和/或，所述色谱柱的填料颗粒度为2.7μm～5μm，例如3.5μm；
和/或，所述色谱柱的长度为100mm～250mm，例如250mm；
和/或，所述色谱柱的柱温为25～60℃，例如35℃；
和/或，所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪为Thermo scientific DionexUltiMate 3000液相色谱仪。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的分离方法在胆碱和肉碱的分析检测中的应用，其特征在于，包含以下步骤：将所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪与检测器联用，对胆碱和肉碱进行分析检测，即可。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测器为质谱检测器，例如三合一组合型高分辨质谱仪，再例如Thermo Scientific的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪。
10.一种如权利要求1～8任一项所述的分离方法在胆碱和肉碱含量测定中的应用。
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| US20120308501A1 (en) * | 2009-12-23 | 2012-12-06 | Colgate-Palmolive Company | Aqueous antiperspirant/deodorant composition |
| CN105759065A (zh) * | 2016-02-26 | 2016-07-13 | 天津桑尼匹克生物科技有限公司 | 血液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒 |
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2017
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