CN108918696B

CN108918696B - 一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法及质量控制方法

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Publication number: CN108918696B
Application number: CN201810456371.9A
Authority: CN
Inventors: 林琳; 范龙; 于旭华; 丘小惠; 张靖; 吴蕾; 陈远彬; 梁紫尧
Original assignee: Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2018-05-14
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-05-14
Also published as: CN108918696A

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体公开了一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法及质量控制方法。所述方法包含如下步骤：(1)制备供试品溶液；(2)将供试品溶液采用高效液相色谱仪或液质联用仪分析，得到的分析图谱即所述的健脾益肺方指纹图谱。其中色谱条件为：高效液相色谱仪选用超高压液相系统；色谱柱选用C18色谱柱；采用DAD检测器；流速为150～250μL/min；柱温为10～30℃；进样体积为1～5μL；以含0.05～0.2体积％甲酸的水为流动性A，乙腈为流动性B，采用梯度洗脱。本发明首次建立了健脾益肺方的指纹图谱，所述的指纹图谱可以全面的体现健脾益肺方中的有效成分的特征峰；采用该方法建立的指纹图谱可以用来准确鉴别健脾益肺方的质量。

Description

一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法及质量控制方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法及质量控制方法。

背景技术

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种具有气流阻塞特征的肺部疾病，与慢性支气管炎和(或)肺气肿密切相关，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。慢性阻塞性肺病是一个危害健康的全球性疾病，是我国城乡居民死亡的第三病因，并且给社会带来了巨大的经济负担。基于此，发明人所在的课题组研究出了健脾益肺方用于治疗慢性阻塞性肺病。所述健脾益肺方的重量份原料配比如下：柴胡10～20份，黄芪40～60份，熟党参40～60份，白术20～30份，燀桃仁10～20份，锁阳20～30份，广升麻10～20份，黄荆子20～30份。最优选配方为柴胡16份，黄芪50份，熟党参50份，白术25份，燀桃仁16份，锁阳25份，广升麻16份，黄荆子25份。

但是，健脾益肺方成分复杂，如大规模应用亟需建立内在的质量评估方法，以保证方子效果的稳定可靠。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，采用高效液相色谱仪或液质联用仪主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。因此，建立健脾益肺方指纹图谱用于控制健脾益肺方的质量具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中缺少对健脾益肺方的质量控制方法，提供一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法及质量控制方法。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法，其包含如下步骤：

(1)制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液采用高效液相色谱仪或液质联用仪分析，得到的分析图谱即所述的健脾益肺方指纹图谱。

优选地，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：

(1)按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡10～20份，黄芪40～60份，熟党参40～60份，白术20～30份，燀桃仁10～20份，锁阳20～30份，广升麻10～20份，黄荆子20～30份；

(2)将健脾益肺方加水提取1～3次，将提取液合并、浓缩后得浓缩液；每次提取时间为1～3h，每次提取水的用量与健脾益肺方的用量比为6～12mL:1g；浓缩后浓缩液的体积与健脾益肺方的质量比为：1～2mL:1g；

(3)将步骤(3)所述的浓缩液过滤即得所述的供试品溶液。

进一步优选地，供试品溶液制备步骤的步骤(1)中按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡15～20份，黄芪50～60份，熟党参50～60份，白术25～30份，燀桃仁15～20份，锁阳25～30份，广升麻15～20份，黄荆子25～30份。

最优选地，供试品溶液制备步骤的步骤(1)中按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡16份，黄芪50份，熟党参50份，白术25份，燀桃仁16份，锁阳25份，广升麻16份，黄荆子25份。

最优选地，供试品溶液制备步骤的步骤(2)中将健脾益肺方加水提取2次，将提取液合并、浓缩后得浓缩液；每次提取时间为2h，每次提取水的用量与健脾益肺方的用量比为10mL:1g；浓缩后浓缩液的体积与健脾益肺方的质量比为：1～1.5mL:1g。

最优选地，供试品溶液制备步骤的步骤(2)中所述的加水提取具体方法为加水后进行煎煮提取。

供试品溶液通过上述制备方法，能够最大程度的将健脾益肺方的有效成分提取出来，以供后续的分析。

优选地，高效液相色谱仪或液质联用仪分析中高效液相色谱仪分析的色谱条件为：

高效液相色谱仪选用超高压液相系统；色谱柱选用C18色谱柱；采用DAD检测器；流速为150～250μL/min；柱温为10～30℃；进样体积为1～5μL；以含0.05～0.2体积％甲酸的水为流动性A，乙腈为流动性B，采用梯度洗脱；

洗脱条件为：0～5min，流动性B的体积分数变化为5％～25％；5～28min，流动性B的体积分数变化为25％～60％；28～38min，流动性B的体积分数变化为60％～90％；38～42min，流动性B的体积分数变化为90％。

最优选地，高效液相色谱仪或液质联用仪分析中高效液相色谱仪分析的色谱条件为：

C18色谱柱的型号为100mm×2.1mm,1.7μm；DAD检测器的检测波长为214，254或280nm；流速为200μL/min；柱温为25℃；进样体积为3μL；以含0.1体积％甲酸的水为流动性A，乙腈为流动性B。

发明人通过大量的实验研究表明，采用上述色谱方法，能够将供试品溶液中的有效成分都洗脱出来，并保证了各有效成分之间具有很好的分离度，保证了指纹图谱易于辨识。

优选地，液质联用仪分析中质谱仪选用高分辨多级质谱仪，采用正离子模式或/和负离子模式采集；

所述负离子模式具体条件为：鞘气为35单位，辅助气为9单位，喷雾电压为3.8kV，毛细管温度为350℃，管透镜电压为-86V，毛细管电压为-35V，一级质谱采用FT进行全扫描，质量扫描范围：m/z 150～1 300，分辨率为30 000，二级质谱采用FT扫描，分辨率为15 000；

所述正离子模式具体条件为：鞘气为20单位，辅助气为5单位，喷雾电压为4.2kV，毛细管温度为350℃，管透镜电压为+86V，毛细管电压为+35V，一级质谱采用FT进行全扫描，质量扫描范围：m/z 150～1 300，分辨率为30 000，二级质谱采用FT扫描，分辨率为15 000。

本发明一种健脾益肺方的质量控制方法，其包含如下步骤：

(1)将待测试的健脾益肺方按权利要求1～9任一项所述的建立方法建立待测试的健脾益肺方指纹图谱；

(2)将待测试的健脾益肺方指纹图谱与按权利要求1～9任一项所述的建立方法建立的标准指纹图谱进行比较；判断待测试的健脾益肺方的质量是否合格。

有益效果：本发明采用该方法首次建立了健脾益肺方的指纹图谱，所述的指纹图谱可以全面的体现健脾益肺方中的有效成分的特征峰，该方法离度良好、灵敏度高，可用于复方药材的定性分析，采用该方法建立的指纹图谱可以用来准确鉴别健脾益肺方的质量。

附图说明

图1为健脾益肺方LC-MS图(健脾益肺方的标准指纹图谱)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1健脾益肺方指纹图谱的建立

1、制备供试品溶液；具体方法如下：

(1)按如下重量称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡16g，黄芪50g，熟党

参50g，白术25g，燀桃仁16g，锁阳25g，广升麻16g，黄荆子25g；

(2)将健脾益肺方每次加10倍用量(质量体积比)的水煎煮提取2次，每次煎煮2h，将提取液合并、浓缩至200mL后得浓缩液；

(3)将步骤(3)所述的浓缩液用0.45μm微孔滤膜过滤即得所述的供试品溶液。

表1各个药材批号及生产厂家

来源：黄荆子由江西江中中药饮片厂生产提供，其他饮片均为康美药业生产，购置广东省中医院药房。

2、将供试品溶液采用高效液相色谱仪或液质联用仪分析，得到的分析图谱(如图1所述的健脾益肺方LC-MS图)即所述的健脾益肺方指纹图谱；

高效液相色谱仪或液质联用仪分析中高效液相色谱仪分析的色谱条件为：

高效液相色谱仪选用Thermo fisher Accela超高压液相系统；色谱柱选用菲罗门Kinetex C₁₈(100mm×2.1mm,1.7μm)色谱柱；采用DAD检测器；流速为150～250μL/min；柱温为10～30℃；进样体积为1～5μL；DAD检测器的检测波长为214，254或280nm；流速为200μL/min；柱温为25℃；进样体积为3μL；以含0.1体积％甲酸的水为流动性A，乙腈为流动性B；

液质联用仪分析中质谱仪选用高分辨多级质谱仪，采用正离子模式或/和负离子模式采集；

所述负离子模式具体条件为：鞘气为35单位，辅助气为9单位，喷雾电压为3.8kV，毛细管温度为350℃，管透镜电压为-86V，毛细管电压为-35V，一级质谱采用FT进行全扫描，质量扫描范围：m/z 150～1300，分辨率为30000，二级质谱采用FT扫描，分辨率为15000；

所述正离子模式具体条件为：鞘气为20单位，辅助气为5单位，喷雾电压为4.2kV，毛细管温度为350℃，管透镜电压为+86V，毛细管电压为+35V，一级质谱采用FT进行全扫描，质量扫描范围：m/z 150～1300，分辨率为30000，二级质谱采用FT扫描，分辨率为15000。

通过图1中LC-MS图，采用负离子模式，一级质谱形成[M+HCOO]-、[M-H]-等主要离子峰。通过与对照品的保留时间、质谱数据对比，初步鉴定主要化学成分，见表2。

表2健脾益肺方LC-MS图主要化学成分峰及植源物来

*为与对照品进行了LC-MS比对，确定的结构。

实施例2方法学考察

重复性实验

按实施例1的方法平行制备供试品溶液6份，按实施例1的色谱条件进行测定，结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于5％，相对峰面积的RSD均小于2％，采用国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件计算指纹图谱的相似度,分别为0.995、0.997、0.994、0.993、0.996，说明该方法的重复性良好。

稳定性实验

按实施例1的方法平行制备供试品溶液，室温下放置，分别在0，2，4，12，24时，按实施例1的色谱条件进行测定，各色谱峰的相对保留时间的RSD小于2％；相对峰面积的RSD小于5％，采用国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件计算指纹图谱的相似度,分别为0.995、0.987、0.994、0.996、0.995、0.996，表明供试品溶液在24小时内稳定。

精密度实验

按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件进行测定，连续进样6次，各色谱峰的相对峰面积的RSD小于2.0％，相对保留时间RSD小于2.0％，采用国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件计算指纹图谱的相似度,分别为0.996、0.994、0.997、0.993、0.996、0.9961，表明仪器精密度良好。

实施例3健脾益肺方的质量控制方法

待测健脾益肺方组成：柴胡16g，黄芪5g，熟党参50g，白术25g，燀桃仁16g，锁阳25g，广升麻16g，黄荆子10g；

标准健脾益肺方组成：柴胡16g，黄芪50g，熟党参50g，白术25g，燀桃仁16g，锁阳25g，广升麻16g，黄荆子25g；

待测健脾益肺方与标准的健脾益肺方的差别在于黄芪和黄荆子的含量降低了。

采用该指纹图谱评价是否可以判断待测健脾益肺方的质量是否合格。

(1)按实施例1所述的指纹图谱的建立方法，建立待测健脾益肺方的指纹图谱；

(2)将待测健脾益肺方的指纹图谱与按实施例1方法建立得到的健脾益肺方标准指纹图谱进行比较；若通过国家药监局颁布的指纹图谱相似度评价软件测得二者相似度大于等于0.9，则质量合格；若二者相似度小于0.9，则质量不合格。

结果测得待测健脾益肺方的指纹图谱与健脾益肺方标准指纹图谱的相似度为0.685，说明待测健脾益肺方质量不合格。

Claims

1.一种健脾益肺方指纹图谱的建立方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）制备供试品溶液；

（2）将供试品溶液采用高效液相色谱仪分析，得到的分析图谱即所述的健脾益肺方指纹图谱；

所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：

○1按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡10~20份，黄芪40~60份，熟党参40~60份，白术20~30份，燀桃仁10~20份，锁阳20~30份，广升麻10~20份，黄荆子20~30份；

○2将健脾益肺方加水提取1~3次，将提取液合并、浓缩后得浓缩液；每次提取时间为1~3h，每次提取水的用量与健脾益肺方的用量比为6~12mL:1g；浓缩后浓缩液的体积与健脾益肺方的质量比为：1~2mL:1g；

○3将步骤○2所述的浓缩液过滤即得所述的供试品溶液；

高效液相色谱仪分析的色谱条件为：

高效液相色谱仪选用超高压液相系统；色谱柱选用C18色谱柱；采用DAD 检测器；流速为150~250 μL/min；柱温为10~30℃；进样体积为1~5μL；以含0.05~0.2体积 %甲酸的水为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱；

洗脱条件为：0～5 min，流动相B的体积分数变化为5%～25%；5～28min，流动相B的体积分数变化为25%～60%；28～38min，流动相B的体积分数变化为60%～90%；38～42min，流动相B的体积分数变化为90%。

2.根据权利要求1所述的健脾益肺方指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤○1中按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡15~20份，黄芪50~60份，熟党参50~60份，白术25~30份，燀桃仁15~20份，锁阳25~30份，广升麻15~20份，黄荆子25~30份。

3.根据权利要求2所述的健脾益肺方指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤○1中按如下重量份称取中药原料，得健脾益肺方：柴胡16份，黄芪50份，熟党参50份，白术25份，燀桃仁16份，锁阳25份，广升麻16份，黄荆子25份。

4.根据权利要求1所述的健脾益肺方指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤○2中将健脾益肺方加水提取2次，将提取液合并、浓缩后得浓缩液；每次提取时间为2h，每次提取水的用量与健脾益肺方的用量比为10mL:1g；浓缩后浓缩液的体积与健脾益肺方的质量比为：1~1.5mL:1g。

5.根据权利要求1所述的健脾益肺方指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤○2中所述的加水提取具体方法为加水后进行煎煮提取。

6.根据权利要求1所述的健脾益肺方指纹图谱的建立方法，其特征在于，高效液相色谱仪分析的色谱条件为：

C18色谱柱的型号为100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm；DAD 检测器的检测波长为214，254或280nm；流速为200 μL/min；柱温为25℃；进样体积为3μL；以含0.1体积%甲酸的水为流动相A，乙腈为流动相B。