CN108489955A - 一种基于hg-afs检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法 - Google Patents

一种基于hg-afs检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于HG‑AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，米粉样品的预处理步骤如下：(1)米粉的预处理：取米粉样品加入硝酸水溶液，混匀后超声，离心取上清液，再添加NaOH中和硝酸，得到米粉提取液；(2)检测前的预处理：(2a)取米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，待测；(2b)取米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，过硫酸钾水溶液，待测；(2c)取米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，加抗坏血酸水溶液，L‑半胱氨酸水溶液，待测；(2d)取米粉提取液，加入HCl溶液，加抗坏血酸水溶液，加硫脲水溶液，待测；将步骤(2)得到的4种待测样品通过HG‑AFS检测法，检测米粉中四种砷形态As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的含量。

Description

一种基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法
技术领域
本发明属于检测分析领域，具体涉及一种砷元素四种形态的非色谱分析测试技术。
背景技术
砷(As)具有较强的致癌、致畸、致突变效应，美国环境保护署(USEPA)将其列在有害物质排名的第I位[1]。近年来，伴随着社会经济的发展，我国耕地土壤砷污染日益严重。据2014年环境保护部和国土资源部公布的数据显示，全国土壤砷污染点位超标率达2.7％。水稻是世界上一半以上人口的主食，并且水稻是富集砷能力最强的农作物，稻米已成为我国居民从食品中摄入无机砷的主要来源[2]。砷可以分为无机砷和有机砷。无机砷(包括As(III)和As(V))的毒性较强，而有机砷(包括一甲基砷(MMA(V))、二甲基砷(DMA(V))和砷甜菜碱(AsB)等)毒性相对较小。稻米中的砷形态以无机砷和DMA(V)为主，偶尔会检测到少量的MMA(V)。由于目前我国食品安全国家标准——食品中污染物限量(GB-2762-2012)中以毒性较高的无机As作为限量标准，因此利用分析方法检测稻米中的砷形态对农产品质量安全具有十分重要的意义。
近20年来，同时检测食品中As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)这四种砷形态的分析技术得到了长足的发展。目前来说，利用液相色谱(HPLC)、离子色谱(IC)和排阻色谱(SEC)等与电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)或原子荧光光谱仪(AFS)联用对四种砷形态进行分析是常用检测手段[3]。然而，这些方法需要比较昂贵的仪器和繁琐的样品前处理方法。另外，利用色谱柱分离后检测耗时较长(每个样品10分钟左右)，而且当样品量较大时，长时间运行仪器对检测的稳定性和准确度是较大的挑战。因此，非色谱检测砷形态的方法被开发用于降低检测成本和增加样品检测通量[4]。
以往的非色谱检测砷形态的方法主要集中于利用成本较低的HG-AFS或HG-AAS装置，通过优化载流条件(包括介质酸的种类、浓度和pH等)、还原剂条件(KBH4/NaBH4浓度)和仪器参数(灯电流、负高压、载气流速和屏蔽气流速等)等检测条件，然后通过在四种不同的检测条件下测定混合砷信号值并建立对应的线性方程来实现对四种砷形态含量的计算，以达到避开色谱分离检测砷形态的目的，但此类检测方法往往检出限较高且对于含量较低的砷形态很难计算准确。此外，一些化学掩蔽剂如8-羟基喹啉、柠檬酸等被开发用于掩蔽特定砷形态如As(V)，然后通过检测溶液As(III)含量和总As含量，差减法计算出As(V)含量。但这些方法只能用于检测无机砷含量，且不能排除有机砷产生的氢化物对结果造成的干扰，也不能实现对有机砷形态进行定量测定。
参考文献：
[1]S.Sundaram，B.Rathinasabapathi，L.Q.Ma，B.P.Rosen，An arsenate-activated glutaredoxin from the arsenic hyperaccumulator fern Pteris vittataL.regulates intracellular arsenite，J.Biol.Chem.283(2008)6095-6101.
[2]赵方杰，水稻砷的吸收机理及阻控对策，植物生理学报50(2014)569-576.
[3]T.Narukawa，K.Inagaki，T.Kuroiwa，K.Chiba，The extraction andspeciation of arsenic in rice flour by HPLC-ICP-MS，Talanta 77(1)(2008)427-432.
[4]M.A.Vieira，P.Grinberg，C.R.R.Bobeda，M.N.M.Reyes，R.C.Campos，Non-chromatographic atomic spectrometric methods in speciation analysis：a review，Spectrochim.Acta B 64(6)(2009)459-476.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种载流和样品前处理优化方法，实现了HG-AFS方法用于4种As形态的选择性测定，可以同时灵敏、快速、准确、低成本的检测米粉中的四种砷形态。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，米粉样品的预处理步骤如下：
(1)米粉的预处理：取米粉样品加入硝酸水溶液，混匀后超声，离心取上清液，再添加NaOH中和硝酸，得到米粉提取液；
(2)检测前的预处理：
(2a)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，待测；
(2b)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，过硫酸钾水溶液，待测；
(2c)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，加抗坏血酸水溶液，L-半胱氨酸水溶液，待测；
(2d)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入HCl溶液，加抗坏血酸水溶液，加硫脲水溶液，待测；
将步骤(2)得到的4种待测样品通过HG-AFS检测法，检测米粉中四种砷形态As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA的含量。
步骤(1)米粉的预处理优选包括如下步骤：
(1a)取米粉样品0.5g，加入3mL的1％v/v硝酸水溶液，混匀后超声，离心取上清液；
(1b)取步骤(1a)离心后的沉淀替换步骤(1a)中的米粉样品，重复步骤(1a)2次；
(1c)合并3次上清液，过0.45μm的水系滤膜后，取5mL上清液，添加1.44mol L-1的NaOH 0.5mL，得到米粉提取液。
其中，步骤(1a)中，所述的超声，条件为温度80℃、超声波功率600W、超声频率50Hz、超声时间为10min。
步骤(2)检测前的预处理优选包括如下步骤：
(2a)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入柠檬酸水溶液，控制柠檬酸在待测样品中的浓度为0.06mol/L，待测；
(2b)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入柠檬酸水溶液和过硫酸钾水溶液，控制柠檬酸在待测样品中的浓度为0.06mol/L，控制过硫酸钾在待测样品中的浓度为0.04mol/L，待测；
(2c)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入柠檬酸水溶液、抗坏血酸水溶液和L-半胱氨酸水溶液，控制柠檬酸在待测样品中的浓度为0.06mol/L，控制抗坏血酸在待测样品中的浓度为0.5％m/v(0.5％m/v为0.5g/100mL，以下关于m/v的定义相同)，控制L-半胱氨酸在待测样品中的浓度为0.06％m/v，待测；
(2d)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入HCl溶液、抗坏血酸水溶液、硫脲水溶液，控制HCl在待测样品中的浓度为5％v/v，控制抗坏血酸在待测样品中的浓度为0.5％m/v，控制硫脲在待测样品中的浓度为0.5％m/v，待测。
其中，所述的HG-AFS检测法，检测参数为：激发光源是空心阴极灯HAF-2，激发波长为197.3nm，原子化器高度8mm，灯电流40mA，负高压270V，载气流量400mLmin-1，屏蔽气流量800mL min-1，延时时间0.5秒，读数时间15秒，测量方式为Std.curve，读数方式为Peakarea，样品注入量1.8mL，载流溶液中盐酸和柠檬酸钠浓度分别为1.2mol L-1和1.6mol L-1，还原剂中硼氢化钾和氢氧化钾浓度分别为2％m/v和0.5％m/v，载流流速为14.5mL min-1，还原剂流速为9.0mL min-1。
其中，所述的载流溶液配制方法如下：准确称取470.56g柠檬酸钠，加去离子水至800mL，加入100mL浓HCl后超声震荡直至柠檬酸钠固体完全溶解，去离子水定容至1L。
其中，所述的还原剂配制方法如下：准确称量KBH4固体10g、KOH固体2.5g，加去离子水400mL，超声震荡待固体完全溶解后，加5mL消泡剂后去离子水定容至500mL。其中，所述的消泡剂优选北京金索坤技术开发有限公司的SK-大庆5号消泡剂。
步骤(2a)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值之和；步骤(2b)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为DMA(V)的荧光信号值；步骤(2c)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值和As(V)荧光信号值之和；步骤(2d)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值和As(V)荧光信号值和MMA(V)荧光信号值之和；将上述4种样品的荧光信号值通过差减法计算得出As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)每一种的荧光信号值，并通过As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)各自的对应预处理步骤下的标准曲线计算出As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的含量。
现有技术中的问题主要和本发明的突出效果主要体现在：
1、现有技术中使用8-羟基喹啉或柠檬酸作为掩蔽剂掩蔽As(V)，但8-羟基喹啉有刺激性气味且其对As(V)的掩蔽效果不如柠檬酸。以往的研究中，柠檬酸常常作为HG-AFS的载流用于掩蔽As(V)，但是柠檬酸本身是一种弱酸，其电离氢离子的能力必然较强酸(如盐酸)弱，从而降低了As(III)氢化物发生效率，进而增加了As(III)的检出限。本发明通过在载流盐酸中添加柠檬酸钠来提供掩蔽As(V)的柠檬酸根(C6H5O7 3-)，而盐酸的电离又为砷的氢化物发生提供足够的H+，较以往的方法显著降低了As的检出限。此外，本发明的载流条件对MMA(V)也有较好的掩蔽效果。
2、现有非色谱技术测定砷形态往往存在以下2种情况：(1)通过掩蔽剂掩蔽As(V)，再通过检测总As含量和As(III)含量，差减法计算As(V)，回避了样品中存在有机砷及其干扰的情况。(2)不回避样品中有机砷，通过优化载流条件成功掩蔽掉As(V)、MMA(V)和DMA(V)三种砷信号，从而实现对As(III)的单独测定，但是检出限较高。本发明检测样品中的四种砷形态分以下4步骤：(1)通过优化HG-AFS的载流条件和待检测样品中柠檬酸浓度，成功实现了对As(V)和MMA(V)信号的掩蔽，从而获得As(III)和DMA(V)的混合荧光信号值；(2)通过优化样品前处理步骤，即向样品(介质酸为柠檬酸)中添加氧化剂(过硫酸钾)将As(III)氧化，实现DMA(V)的单独测定，差减法计算出As(III)的含量；(3)通过向样品(介质酸为柠檬酸)中添加混合还原剂(抗坏血酸+L-半胱氨酸)，检测As(III)+As(V)+DMA(V)的混合荧光信号值，差减法计算出As(V)的含量；(4)通过向样品(介质酸为盐酸)中添加混合还原剂(抗坏血酸+硫脲)，检测As(III)+As(V)+DMA(V)+MMA(V)的混合荧光信号值，差减法计算出MMA(V)的含量。
3、现有技术均是通过优化载流、还原剂和仪器条件，再通过4种检测条件下对应的线性方程实现对4种砷形态的计算。本发明使用优化后的载流条件，仅需通过4种不同的样品前处理手段即实现了对四种砷形态的检测，节约了平衡仪器和更换检测条件(包括仪器参数、载流和还原剂条件)后重新外标校正所需的时间，而且本发明较以往的方法更加灵活，可以选择性地测定4种砷形态中的特定一种或几种砷含量。
总的来说，本发明与现有技术相比有以下有益效果：
1、本发明所使用的前处理试剂均为环境友好型、没有刺激性气味，且不产生环境污染物；
2、本发明测定四种砷形态的非色谱方法简单(仅需4种不同的样品前处理步骤即可达成)、精确(提取方法回收率较好，加标回收率较高)、快速(每小时可分析19个样品的砷形态，一个样品形态分析全过程仅3min左右)、灵敏(检出限较低、重现性较好)；
3、本发明优化的方法所用试剂易获取且价格便宜，HG-AFS的运行成本也比较低，在大部分实验室的承受范围之内，本发明对合理评价农产品质量安全具有重要的意义，适合在普通实验室推广应用。
附图说明
图1为实施例1的流程示意图。
图2为载流条件及样品中介质酸浓度优化示意图。其中，(a)为不同pH条件对四种As形态荧光强度的影响，20μg L-1As标准溶液代表总As荧光强度，4种As形态浓度均为20μgL-1，As形态样品介质为去离子水；(b)As形态样品介质为0.03mol L-1柠檬酸，其他处理与(a)完全一致；(c)pH为4.6的载流中不同柠檬酸钠浓度对四种As形态荧光强度的影响，20μgL-1As标准溶液代表总As荧光强度，4种As形态浓度均为20μg L-1，As形态样品介质为0.03mol L-1柠檬酸；(d)样品介质柠檬酸浓度对四种As形态荧光强度的影响，4种As形态浓度均为20μg L-1。
图3为不同浓度过硫酸钾对4种As形态荧光信号值的影响，4种As形态浓度均为20μg L-1，As形态样品介质为0.06mol L-1柠檬酸。
图4为不同样品介质还原剂浓度组合(0.5％抗坏血酸+不同浓度的L-半胱氨酸)对4种As形态荧光强度的影响，4种As形态浓度均为20μg L-1，As形态样品介质为0.06mol L-1柠檬酸。
图5为四种前处理步骤下4种As形态的标准曲线。4种As形态浓度均为1、2、5、10和20μg L-1，As标准溶液代表总As荧光强度。(a)、(b)、(c)和(d)分别表示表2中样品预处理条件1、2、3和4。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的仪器主要有：AFS-8230氢化物发生-原子荧光光谱仪(HG-AFS)(北京吉天仪器有限公司)，配备AS-90自动进样器，具体的仪器条件及参数设置见表1。30L超声波清洗机(洁盟超声波清洗设备有限公司)。KDC-220HR高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。Millipore超纯水机(法国)。
以下实施例所使用的实验试剂有：砷标准溶液(1000mg L-1)购自上海材料研究所；四种砷形态标准溶液As(III)(1.011±0.016μmol g-1)、As(V)(0.233±0.005μmol g-1)、MMA(V)(0.335±0.011)和DMA(0.706±0.024)购自中国计量科学研究院。硝酸(GR，65-68％)和盐酸(GR，36-38％)购自南京化学试剂股份有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、硼氢化钾、过硫酸钾购自国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸、L-半胱氨酸、硫脲购自Sigma公司(美国)；SK-大庆5号消泡剂购自北京金索坤技术开发有限公司；高纯氩气(99.995％)购自南京特种气体厂有限公司。所有试剂均为分析纯或优级纯。米粉标准物质(NIST-SRM 1568b)购自美国国家标准技术局。
实施例1：
一种基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，如图1所示。
一、标准曲线的制作：
砷检测所用标准曲线通过如下方式得到：取1000mg L-1砷元素母液1mL于10mL容量瓶中，加去离子水定容至10mL，获得100mg L-1砷元素母液；取100mg L-1砷元素母液1mL于10mL容量瓶中，加去离子水定容至10mL，获得10mg L-1砷元素母液。按此方法将砷元素母液逐级稀释至100μg L-1。分别取100μg L-1的砷标准溶液0.1、0.2、0.5、1和2mL于10mL容量瓶，加0.5mL浓盐酸，加去离子水至8mL左右，加入1mL 5％m/v硫脲+5％m/v抗坏血酸混合溶液，去离子水定容至10mL，即配制成浓度梯度为1、2、5、10和20μg L-1的砷标准溶液，该溶液需室温放置30分钟以上以使As(V)完全还原为As(III)。
100μg L-1四种As形态标准溶液的储备液按照如下方式配制完成，置于4℃冰箱中备用，每周重新配制一次。
100μg L-1As(III)标准溶液的储备液通过如下方式得到：在万分之一天平上准确称取As(III)的标准溶液(1.011±0.016μmol g-1)0.0132g于10mL容量瓶，去离子水定容至10mL；
100μg L-1As(V)标准溶液的储备液通过如下方式得到：在万分之一天平上准确称取As(V)的标准溶液(0.233±0.005μmol g-1)0.0572g于10mL容量瓶，去离子水定容至10mL；
100μg L-1MMA(V)标准溶液的储备液通过如下方式得到：在万分之一天平上准确称取MMA(V)的标准溶液(0.335±0.011μmol g-1)0.0398g于10mL容量瓶，去离子水定容至10mL；
100μg L-1DMA(V)标准溶液的储备液通过如下方式得到：在万分之一天平上准确称取DMA(V)的标准溶液(0.706±0.024μmol g-1)0.0189g于10mL容量瓶，去离子水定容至10mL。
二、样品的预处理：
米粉样品的预处理包括如下步骤：
(1)米粉的预处理：
(1a)取米粉样品0.5g，加入3mL的1％v/v硝酸水溶液，混匀后超声(超声条件为温度80℃、超声波功率600W、超声频率50Hz、超声时间为10min)，离心取上清液；
(1b)取步骤(1a)离心后的沉淀替换步骤(1a)中的米粉样品，重复步骤(1a)2次；
(1c)合并3次上清液，过0.45μm的水系滤膜后，取5mL上清液，添加1.44mol L-1的NaOH 0.5mL，得到米粉提取液。
(2)检测前的预处理：
(2a)移液枪准确移取1mL米粉提取液，置于10mL塑料离心管中，加入1.5mol L-1柠檬酸溶液200μL，加3.8mL去离子水，待测；
(2b)移液枪准确移取1mL米粉提取液，置于10mL塑料离心管中，加入1.5mol L-1柠檬酸溶液200μL，加1mL 0.2mol L-1的过硫酸钾溶液，加2.8mL去离子水，待测；
(2c)移液枪准确移取1mL米粉提取液，置于10mL塑料离心管中，加入1.5mol L-1柠檬酸溶液200μL，加0.5mL 5％m/v抗坏血酸+0.6％m/v L-半胱氨酸混合溶液，加3.3mL去离子水，待测；
(2d)移液枪准确移取1mL米粉提取液，置于10mL塑料离心管中，加入50％v/vHCl溶液0.5mL，加0.5mL 5％m/v抗坏血酸+5％m/v硫脲混合溶液，加3mL去离子水，待测；
三、HG-AFS检测：
将步骤(2)得到的4种待测样品通过HG-AFS检测法，检测米粉中四种砷形态As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的含量。
步骤(2a)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值之和；步骤(2b)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为DMA(V)的荧光信号值；步骤(2c)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值和As(V)荧光信号值之和；步骤(2d)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值和As(V)荧光信号值和MMA(V)荧光信号值之和；将上述4种样品的荧光信号值通过差减法计算得出As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)每一种的荧光信号值，并通过As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)各自的对应预处理步骤下的标准曲线计算出As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的含量。
HG-AFS参数设置如表1所示。四种样品前处理步骤及对应步骤下不同As形态标准溶液的标准曲线如表2所示。
HG-AFS的载流溶液和还原剂溶液均现用现配。表1中载流溶液配制方法：准确称取470.56g柠檬酸钠于1L的锥形瓶中，加去离子水至800mL刻度，加入100mL浓HCl后超声震荡20min左右，直至柠檬酸钠固体完全溶解，转移至1L的容量瓶，去离子水定容。500mL还原剂配制方法：准确称量KBH4固体10g、KOH固体2.5g于500mL塑料烧杯中，加去离子水400mL左右，超声震荡1min待固体完全溶解后转入500mL的塑料容量瓶，加5mL消泡剂后去离子水定容。
表1实验条件及HG-AFS参数设置
表2四种样品前处理步骤下不同As形态标准溶液的标准曲线
注意：-代表不额外添加试剂；样品前处理步骤2～4均需在30℃水浴25分钟。
实施例2：实验条件的优化。
1、载流条件优化和样品介质酸浓度优化(样品预处理步骤2a)
本发明发现，在载流盐酸中加入柠檬酸钠调节载流溶液的pH值能显著影响四种砷的荧光信号值。如图2(a)，随着载流pH值增加，4种As的荧光信号值均逐渐下降；由图2(b)可知，在As形态样品中添加柠檬酸作为介质酸可以显著增强As(III)、DMA(V)和MMA(V)的荧光信号值，而As(V)的信号值则进一步受到抑制。由于本发明的目的是首先尽可能掩蔽掉四种砷形态中的MMA(V)和As(V)的荧光信号，在此基础上选择As(III)和DMA(V)信号强度最强的条件，综合考虑以上两点后，载流pH＝4.6被选择作为进一步优化的载流pH值。如图2(c)所示，当载流pH值固定为4.6，4种As形态的荧光信号均随着载流溶液中柠檬酸钠浓度的增加而增加，当载流溶液中柠檬酸钠浓度为1.6mol L-1时，As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的荧光信号值分别增加至总As荧光信号值的85％、1.4％、2％和40％。由于As(III)和DMA(V)的荧光信号值在该柠檬酸钠浓度下达到最大值，而As(V)和MMA(V)的荧光信号值与总As的荧光信号值相比可忽略不计，故选择1.6mol L-1柠檬酸钠溶液(盐酸调节pH至4.6)作为本发明的最优载流条件。
如图2(d)所示，As(V)、MMA(V)和DMA(V)的荧光信号值随着样品介质柠檬酸浓度的增加而增加，而As(III)的荧光信号值则随着介质柠檬酸浓度的增加先增加后略有下降。当样品介质柠檬酸浓度为0.06mol L-1时，As(III)的荧光信号最强(总As荧光信号值的95％)，DMA(V)的荧光信号值也达到总As荧光信号值的51％，而As(V)和MMA(V)的荧光信号值仅为总As荧光信号值的1.65％和2.44％，可忽略不计，故本发明最终选择0.06mol L-1的柠檬酸作为样品介质酸浓度。即：在优化后的样品预处理步骤2a条件下，检测到的As信号为As(III)+DMA(V)的混合荧光信号值。
2、样品预处理步骤2b优化
本步优化的目的是将样品中的As(III)氧化为As(V)，从而掩蔽As(III)的信号值，进而单独检测出DMA(V)的含量。本发明的预实验发现，当样品介质酸为0.06mol L-1柠檬酸时，高锰酸钾、过氧化氢、碘化钾和过硫酸钾均能将As(III)氧化为As(V)，但使用高锰酸钾和过氧化氢作为As(III)氧化剂检测样品时，对氢化物发生产生了很大的影响，仪器不稳定；而碘化钾在弱酸柠檬酸作介质酸时对As(III)的氧化效率较低，因此均不适合作为本发明的氧化剂。如图3所示，随着过硫酸钾浓度的增加，四种As荧光信号值均逐渐降低，样品中过硫酸钾浓度达到0.02mol L-1时，As(III)已被完全氧化。当过硫酸钾浓度进一步增加到0.04mol L-1时，DMA(V)的荧光信号值保持不变，而其他三种As信号值较总As信号值比较低，可忽略不计，因此被选为本发明的最佳As(III)氧化剂浓度。在本发明的最佳过硫酸钾浓度下，可根据表2步骤2b中的线性方程计算出样品中的实际DMA(V)含量。
另外，由于样品预处理步骤2a条件下，检测到的As信号为As(III)+DMA(V)的混合荧光信号值，而样品预处理步骤2b条件下，DMA(V)信号值为已知，差减法并根据表2步骤2a中的线性方程计算出样品中As(III)的实际含量。
3、样品预处理步骤2c优化
本发明步骤的目的是通过在样品中添加还原剂将As(V)还原为As(III)，而MMA(V)却不能被还原。本发明的预实验发现，只有当还原剂抗坏血酸和L-半胱氨酸组合作为样品的还原剂时才能达到以上目的。如图4所示，当样品中抗坏血酸浓度固定为0.5％时，随着样品中L-半胱氨酸浓度增加，As(V)和DMA(V)信号强度增加明显，而MMA(V)信号强度在L-半胱氨酸浓度0.02～0.06％范围内增加不显著，故最终选择0.5％抗坏血酸+0.06％L-半胱氨酸作为最佳的还原剂组合。在本发明的最优样品预处理步骤2c条件下，可以获得As(III)+As(V)+DMA(V)的混合荧光信号值，而在样品预处理步骤2a和步骤2b中As(III)和DMA(V)的含量为已知，根据表2中步骤2c中的线性方程可差减法计算出样品中As(V)的实际含量。
4、样品预处理步骤2d优化
本发明步骤的目的是通过一定的还原剂组合，将样品中的五价砷形态全部还原为三价，特别注意在该还原条件下，必须保证As(V)完全被还原，而MMA(V)的信号值要有显著的增强，确保能通过差减法计算出MMA(V)的含量。本发明的预实验发现，当还原剂为0.5％硫脲+0.5％抗坏血酸，样品介质为5％盐酸时，如图5(d)所示，20μg L-1的As(V)能完全被还原，而MMA(V)和DMA(V)的信号值均大于总As信号值的50％，被选定为本发明的最佳优化条件。在本发明的最优样品预处理步骤2d条件下，可获得As(III)+As(V)+DMA(V)+MMA(V)的混合荧光信号值，而在样品预处理步骤2a、步骤2b和步骤2c中As(III)、DMA(V)和As(V)的含量为已知，根据表2中步骤2d中的线性方程可差减法计算出样品中MMA(V)的实际含量。
样品中总As含量即为四种As形态含量的和。
实施例3：方法可行性验证
本发明通过提取米粉标准物质中的As形态，同时进行加标回收率实验。本发明根据4种优化后的样品前处理条件处理样品，通过HG-AFS对4种不同的前处理样品进行检测，最后按照表2中的线性方程进行计算，并与米粉标准物质中的As形态数据进行比对，以评价本方法的准确度。
米粉中砷形态提取方法如下：准确称量0.5g米粉标准物质(NIST-SRM 1568b)，于10mL的塑料离心管中，加入3mL的1％v/v硝酸，上下震荡混合均匀后置于80℃的超声波清洗机内水浴10min，同时进行超声(超声波功率600W、超声频率50Hz)处理，水浴结束后的样品于12000g离心2分钟，取出上清液于新的10mL离心管中，本步骤重复3次后即获得约9mL的提取液，提取液过0.45μm的水系滤膜后，取5mL米粉提取物添加1.44mol L-1的NaOH 0.5mL，用于中和提取液中1％的硝酸。
米粉样品按照表2中的4种样品前处理步骤进行处理后，置于4℃冰箱保存，一天内完成样品检测。
表3超声辅助硝酸提取米粉中As形态的提取效率及加标回收率
注意：a、b、c和d分别代表向米粉样品中添加0.1mg Kg-1的As(III)、As(V)、MMA(V)和DMAA(V)。米粉标准物质(NIST-SRM 1568b)中定值的总As、无机砷和DMA(V)含量分别为0.285±0.014mg kg-1、0.092±0.010mg kg-1和0.180±0.012mg kg-1。所有数据均以平均值±标准偏差(n＝3)表示。
如表3所示，在上述优化的条件下，通过表2中的线性方程计算出的米粉的提取效率较高(102±4.2％)。此外，计算出的DMA(V)含量(0.176±0.014mg kg-1)和无机砷含量(0.099±0.008mg kg-1)与标准值类似，说明在提取过程中砷形态没有明显的损失。As(III)和As(V)的加标回收率分别为105％和104％，说明提取过程中As(III)和As(V)没有明显的相互转化。此外，虽然该米粉标准品没有标明MMA(V)的含量数据，但是我们计算出的MMA(V)含量(0.015±0.001mg kg-1)与以往文献中报道的类似。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)中的规定，本发明计算出As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的检出限分别为0.12、0.26、0.57和0.23μg kg-1，优于以往的非色谱砷形态测定方法。通过连续测量7次20μg L-1的As标准溶液计算出标准偏差RSD值为0.53％，说明方法的重复性较好。

Claims (8)

1.一种基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，米粉样品的预处理步骤如下：
(1)米粉的预处理：取米粉样品加入硝酸水溶液，混匀后超声，离心取上清液，再添加NaOH中和硝酸，得到米粉提取液；
(2)检测前的预处理：
(2a)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，待测；
(2b)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，过硫酸钾水溶液，待测；
(2c)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入柠檬酸水溶液，加抗坏血酸水溶液，L-半胱氨酸水溶液，待测；
(2d)取步骤(1)得到的米粉提取液，加入HCl溶液，加抗坏血酸水溶液，加硫脲水溶液，待测；
将步骤(2)得到的4种待测样品通过HG-AFS检测法，检测米粉中四种砷形态As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的含量。
2.根据权利要求1所述的基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，步骤(1)米粉的预处理包括如下步骤：
(1a)取米粉样品0.5g，加入3mL的1％v/v硝酸水溶液，混匀后超声，离心取上清液；
(1b)取步骤(1a)离心后的沉淀替换步骤(1a)中的米粉样品，重复步骤(1a)2次；
(1c)合并3次上清液，过0.45μm的水系滤膜后，取5mL上清液，添加1.44molL-1的NaOH0.5mL，得到米粉提取液。
3.根据权利要求2所述的基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，步骤(1a)中，所述的超声，条件为温度80℃、超声波功率600W、超声频率50Hz、超声时间为10min。
4.根据权利要求1所述的基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，步骤(2)检测前的预处理包括如下步骤：
(2a)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入柠檬酸水溶液，控制柠檬酸在待测样品中的浓度为0.06mol/L，待测；
(2b)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入柠檬酸水溶液和过硫酸钾水溶液，控制柠檬酸在待测样品中的浓度为0.06mol/L，控制过硫酸钾在待测样品中的浓度为0.04mol/L，待测；
(2c)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入柠檬酸水溶液、抗坏血酸水溶液和L-半胱氨酸水溶液，控制柠檬酸在待测样品中的浓度为0.06mol/L，控制抗坏血酸在待测样品中的浓度为0.5％m/v，控制L-半胱氨酸在待测样品中的浓度为0.06％m/v，待测；
(2d)取步骤(1)得到的米粉提取液1mL，加入HCl溶液、抗坏血酸水溶液、硫脲水溶液，控制HCl在待测样品中的浓度为5％v/v，控制抗坏血酸在待测样品中的浓度为0.5％m/v，控制硫脲在待测样品中的浓度为0.5％m/v，待测。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，所述的HG-AFS检测法，检测参数为：激发光源是空心阴极灯HAF-2，激发波长为197.3nm，原子化器高度8mm，灯电流40mA，负高压270V，载气流量400mL min-1，屏蔽气流量800mL min-1，延时时间0.5秒，读数时间15秒，测量方式为Std.curve，读数方式为Peak area，样品注入量1.8mL，载流溶液中盐酸和柠檬酸钠浓度分别为1.2mol L-1和1.6molL-1，还原剂中硼氢化钾和氢氧化钾浓度分别为2％m/v和0.5％m/v，载流流速为14.5mL min-1，还原剂流速为9.0mL min-1。
6.根据权利要求5所述的基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，所述的载流溶液，配制方法如下：准确称取470.56g柠檬酸钠，加去离子水至800mL，加入100mL浓HCl后超声震荡直至柠檬酸钠固体完全溶解，去离子水定容至1L。
7.根据权利要求5所述的基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，所述的还原剂，配制方法如下：准确称量KBH4固体10g、KOH固体2.5g，加去离子水400mL，超声震荡待固体完全溶解后，加5mL消泡剂后去离子水定容至500mL。
8.根据权利要求1～4中任意一项所述的基于HG-AFS检测米粉中四种砷形态的非色谱检测方法，其特征在于，步骤(2a)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值之和；步骤(2b)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为DMA(V)的荧光信号值；步骤(2c)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值和As(V)荧光信号值之和；步骤(2d)得到的样品通过HG-AFS检测法得到荧光信号值为As(III)荧光信号值和DMA(V)荧光信号值和As(V)荧光信号值和MMA(V)荧光信号值之和；将上述4种样品的荧光信号值通过差减法计算得出As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)每一种的荧光信号值，并通过As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)各自的标准曲线计算出As(III)、As(V)、MMA(V)和DMA(V)的含量。
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