CN107796748A - 一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测方法，具体的本发明采用同位素金属浓度比值标记抗体的新型编码方式，利用不同比例的金属，构建新的标签组合，从而以较少金属标签个数扩展质谱流式细胞仪检测通道，开发出一种比现有技术更高效的Barcoding技术。

Description

一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地本发明涉及生物检验或检测，使用细胞Barcoding技术在单细胞质谱流式术前对细胞进行预标记，并能在质谱流式术 后解析每个细胞所属族群的方法。

背景技术

质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)是利用质谱原理对单细胞进行多参数 检测的流式技术。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的 高分辨能力，是流式细胞技术一个新的发展方向。它可以对复杂的样品进行精细的 免疫分型和信号通路分析；对免疫细胞进行自动分群，并对免疫细胞的功能多态性 进行细致分析；可以对癌症组织进行精细的亚群分析，帮助研究者找到与临床预后 密切相关的细胞亚群；可以深入探讨当前技术下所区分出的干细胞群体的异质性， 对于以后干细胞治疗等领域具有重要的指导意义。

机体免疫细胞族群的分化是指对于个体不同的疾病发生时，机体内的各类免 疫细胞因个体差异和病原体差异引起的数量和形态功能的变化，从而形成不同的免 疫细胞亚群的现象。随着现代医学检测技术和免疫学的日新月异的发展，免疫细胞 族群的分析研究能够得到更多对于个体疾病发病机制相关信息，这也将会对疾病的 个体化治疗提供大量的更精准的数据支持。

使用该技术，能实现同时对单个细胞多种蛋白DNA和mRNA标记物的精确测量， 但质谱流式细胞仪的检测效率仍远不能满足实际临床的高通量检测；同时，在标记 过程中，需要对每一个样本的抗体进行单独地标记，操作比较繁琐；并且，检测时 仪器检测信号漂移和检测前批次间的样品的预处理以及标记效率的差异对实验产 生的干扰也不可避免。

因此，本领域技术人员致力于开发新的高效率、高精度、操作简便、结果 重现性好的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测方法。

本发明的第一方面，提供了一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测方法， 所述方法包括步骤：

1)配制不同浓度的金属标记物溶液

提供多种金属标记物，将每种金属标记物分别配制为不同浓度的金属标记 物溶液；

2)配制Barcoding试剂组

所述Barcoding试剂组包含多种Barcoding试剂，其中，每种Barcoding 试剂包括多种金属标记物溶液，且各Barcoding试剂中所含的金属标记物种类 和/或金属标记物浓度比不同；

3)标记样本

使用步骤2)获得的Barcoding试剂组中的各Barcoding试剂，分别标记 不同的待检细胞样本；

4)样本检测

将各细胞样本混合，使用质谱流式细胞仪检测混合样本中的所有细胞；

5)样本解析

结合质谱流式细胞仪得到的所有细胞的结果分析，根据不同细胞样本标记 的Barcoding试剂特征，将全部的细胞解析为独立的待检细胞样本。

进一步地，所述金属标记物为同位素金属标记物，优选地为镧系金属。

进一步地，步骤1)中所述多种金属标记物为至少2种金属标记物，优选 地如3、4、5、6、7、8、9、10种。

进一步地，步骤1)中所述金属标记物包括但不限于¹⁶⁶Er、¹⁶⁹Tm和¹⁷³Yb。

进一步地，步骤1)中，先用各所述金属标记物标记多聚物，获得螯合特 定金属的多聚体；然后使用所述螯合特定金属的多聚体标记抗体，获得标记抗 体；最后将各标记抗体分别配制为不同浓度，从而获得所述不同浓度的金属标 记物溶液。

进一步地，步骤1)中，所述不同浓度包括至少2个(如3、4、5、或6 个)浓度梯度，且各浓度梯度相差2至100倍，优选地为5至20倍，如10倍。

进一步地，步骤2)中，还包括采用其它标记标记待检测细胞中的其它蛋 白。

本发明的第二方面，提供了一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测试剂 盒，所述试剂盒执行本发明第一方面所述的方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的Barcoding流程图；

图2基于Cytobank的解析Debarcoding步骤，示例1；

图3基于Cytobank的解析Debarcoding步骤，示例2；

图4 19个样本的免疫细胞三维分布图；

图5A-5C 19个样本的免疫细胞二维分布图。

具体实施方式

本发明采用同位素金属浓度比值标记抗体的新型编码方式，利用不同比例的 金属，构建新的标签组合，从而以较少金属标签个数扩展质谱流式细胞仪检测通道， 开发出一种比现有技术更高效的Barcoding技术，具体检测原理参见图1。

流式细胞术(Flow Cytometry,FC)是通过荧光标记的抗体和细胞抗原特异 性结合对单个细胞进行多参数分析的有效工具。传统的流式细胞仪是基于荧光的检 测系统，由于荧光光谱的重叠带来的误差，一些高端的流式细胞仪也只能够同时测 量10个荧光信号，在用于研究单细胞水平上的功能和特征时，受到限制。对于更 好的标签和检测系统的需求使得质谱流式细胞仪应运而生。质谱流式采用负载金属 元素的聚合物和抗体共价偶联，用于标记细胞表面和内部蛋白，通过雾化装置将细 胞逐个送入ICP-TOF质谱装置中进行检测，依据质谱检测出的金属元素信号实现对 蛋白的定性和定量分析。质谱流式将传统的荧光流式和质谱技术结合，继承了传统 流式细胞仪高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。相比于传统的流式， 其采用镧系金属标记，解决了传统流式存在的自体光和通道间光谱重叠的问题，并 且由于金属同位素种类繁多，可以实现几十个参数的同时测量，在单细胞水平上对 细胞的特点和功能进行精细分析。其强大的数据获取能力与现代信息生物学的分析 手段紧密结合，对生物学多个领域的研究具有重大的推动作用。

编码(Barcoding)技术可以做到对质谱流式细胞仪检测效率极大的提高，其 原理是使用不同的组合标签分别预标记不同的样本，将预标记后的所有样本混合 后，再进行其他抗体的标记和信号检测。该方法可以降低由于不同样本细胞在抗体 染色过程中标记效率和仪器信号漂移引起的误差，减少抗体消耗，缩短检测时间， 同时极大提高检测的效率。

比如，通过任选取Pd金属的六种同位素中三种同位素为组合标记物，使用组 合标记物对不同细胞样本进行标记，实现6种同位素标记20个样本的高效编码， 大大提高了原来6种同位素标记6个样本的效率。同时，该方法能够有效地去除在 血液细胞样品预处理过程中产生的二聚体和三聚体，从而优化实验结果，但是该方 法仍然存在一些问题：1、使用6种同位素金属只能同时标记20个样本，在临床的 实际应用该方法的效率仍很低；2、检测通道的利用率较低，作为标记的六种Pd 同位素金属仅作为Barcoding标签作用，而不能反映细胞本身的蛋白、RNA和细胞 因子的表达水平；3、成本较高，被用于标记的六种同位素金属中的¹⁰²Pd稀缺，分 离纯化成本较高，使整个试剂盒的成本价无法降到合理可接受范围；4、该 Barcoding的方法在标记细胞过程中，需要使用Barcoding Perm Buffer对细胞进 行破膜处理，致使在检测过程中会对细胞部分表面蛋白的信号产生影响，影响实验 的准确性。

本发明的Barcoding技术在解决上述问题前提下，可以做到对质谱流式细 胞仪检测效率极大的提高，即使用不同的组合标签分别标记不同组别细胞，然 后将它们混合作为单个多重样品进行处理和测量。该方法可以降低不同样本细 胞在抗体染色过程中产生的误差，减少抗体消耗，同时提高检测效率和仪器灵 敏度，缩短检测时间。

以下以采用三种不同金属为例说明本发明的优选技术方案。

例如，采用三种不同金属(¹⁶⁶Er、¹⁶⁹Tm和¹⁷³Yb)对所有免疫细胞表面都稳 定表达的CD45进行标记，将三种金属标记物以不同浓度配比对血液样本进行 编码的方法，开发出一种用于质谱流式细胞仪的高通量的Barcoding技术。

相比于以6种同位素标记20个样本的编码方式，本发明首次提出浓度比 概念，作为新型标记方法的理论依据。使用1种抗体(抗CD45抗体)，3种金 属标签(¹⁶⁶Er、¹⁶⁹Tm和¹⁷³Yb)，3种浓度的不同配比(详见表1)，即可以标记 19个样本，极大提高Barcoding效率。

本发明的方法，操作步骤如下：

1)分别配制三种浓度的金属标记物溶液；

2)将不同浓度的三种金属标记物溶液混合配制成含不同金属比例的 Barcoding试剂组(详见表1)；

3)使用Barcoding试剂组标记19个不同的血液样本；

4)将19个细胞样本混合于一支试管中，标记其他待检测蛋白标记物；

5)使用质谱流式细胞仪检测混合样本中的所有细胞；

6)根据不同样本标记的Barcoding金属比例组合，结合质谱流式细胞仪 得到的所有细胞的结果分析，将全部的细胞解析Debarcoding为19个独立的 原始实验样本，并进行后续的数据分析。

相比于现有的技术，本发明具有如下优点：

1、金属标记的效率高，使用三种重金属标记19个样本；

2、成本更低，使用总计16.5微升的抗CD45抗体和相应镧系重金属即可 以完成19个样本的标记，成本远低于目前市场上的Barcoding试剂盒；

3、标记更方便，该Barcoding的方法在标记细胞过程中，不需要对细胞 进行破膜处理；

4、准确性更高，因为标记过程中不需要细胞破膜处理，因此检测过程中 不会对细胞部分表面蛋白的检测产生任何影响，提高实验的准确性；

5、Debarcoding解析过程更方便，该方法的解析过程可以在质谱流式细胞 术数据处理网站(如www.cytobank.org)上完成(图3和图4)，不需要额外 的处理软件；

6、实现三维细胞族群分布图(图5)，减少Barcoding的实验误差。在质 谱流式细胞仪传统数据分析中，由于只利用了两个通道的分析，所构建的细胞 族群分布图为二维层面，在本发明中采用多种金属同位素标签，提出新的 Barcoding技术，构建三维细胞族群分布图，直观清晰展现细胞分群；

7、极大提高同时可以Barcoding的样本数，本实验的Barcoding原理与 传统6选3的Barcoding原理相互不冲突，意味着两种Barcoding方式可以结 合使用，这将进一步提高标记的效率。

将本发明提出的Barcoding方法，套用在传统的MCB方法中，即将MCB方 法和同位素金属浓度比值相结合，那么对于6种金属标签，从中选取3个金属 标记出来，每组标签设置3组浓度比，则最多可以标记C₆ ³*(3³-8)＝380个样品， 在保证使用MCB方法有效降低质谱流式细胞仪检测中细胞粘黏的问题的前提 下，提高了近19倍。

8、由于标记金属可以使用所有的镧系金属，因此在大于六种金属的 Barcoding，远远高于6选3的效率。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方 法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄 培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用 的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

该Barcoding试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

表1 Barcoding试剂盒配比方案

1)取三种重金属氯化物溶液5μL，标记polymer(多聚物)，得到螯合 三种特定金属的多聚体；

2)使用金属标签后的多聚体分别标记三支同浓度的抗CD45抗体溶液，使 用超微量分光光度计Nanodrop仪器检测标记后的三支抗体的浓度，将三支标 记后的抗体用antibody stabilization buffer(抗体稳定稀释液)稀释为相 同浓度；

3)将三种标记后的抗体分别取1μL分别溶于10μL和100μL的Cell Staning Buffer溶液(细胞染色缓冲液，CSB)中，稀释为原浓度1％和10％的 抗体溶液，配出浓度分别为原抗体溶液1％、10％和100％质量分数的三种梯度抗 体溶液；

4)分别取配得的1％、10％、100％的抗体溶液1μL以表1中的比例关系溶 于终体积100μL的细胞染色缓冲液中，配制19种含不同金属比例的组合抗体 溶液于0.5mL的EP管中，标记1-19号，制得Barcoding试剂盒(图2)。

该发明Barcoding样本方法，包括以下步骤：

1)对于19个用PFA固定、冻存的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclearcel l，PBMC)样本，在冰上或者冷水中融化后，震荡涡旋重悬细 胞，转入流式管中，加入2mLCSB溶液，500g离心5min；

2)小心吸尽19支流式管中的上清液体，加入1mLCSB溶液重悬细胞，用 移液枪吸取10μL细胞溶液，使用细胞计数板在显微镜下计数。使用CSB溶液 稀释转移19支PBMC样品溶液到新的流式管，控制每个样本总细胞量一样(不 低于1×10^6个细胞)，600g离心5min；

3)小心吸尽19支流式管中的上清液体，加入50μL蛋白封闭液(Block Solution)(5μLFc ReceptorBlocking溶液+50μL CSB溶液)重悬，常温放 置10min；

4)分别用移液枪取50μL试剂盒中19个组合抗体溶液于预处理好的19 支PBMC细胞样本，(同时可以标记其他细胞表面和胞内抗体)混匀后，常温 放置30min；

5)加入2mLCSB溶液，常温离心5min，小心吸尽19支流式管中的上清液 体；

6)重复步骤9)一次；

7)加入100μL不含Ca²⁺，Mg²⁺的磷酸盐缓冲液溶液(Phosphate BufferedSolution,PBS)，震荡涡旋5s，使细胞沉淀充分悬起；

8)握住流式管管口，一边震荡涡旋，一边逐滴加入1mL Cel lintercalation 溶液(在fix andpermbuffer里加入终浓度为125nM的Ir或者500nM的Rh)， 尽可能减少细胞多聚体的出现；

9)将样品置于室温1h或者冰箱4℃过夜。(在4℃最多可以存放48h)；

10)加入2mLCSB溶液，终止标记DNA反应，800g离心5min，小心吸尽19 支流式管中的上清液体；

11)用2mL水重悬，800g离心5min，小心吸尽19支流式管中的上清液体；

12)重复步骤15)两次；

13)加入1mL含有10％EQbeads的水重悬，将样本置于冰上，即可上质谱 流式细胞仪检测。

该发明Debarcoding样本方法，包括以下步骤：

1)得到质谱流式细胞仪数据后，将数据上传Cytobank网站 (www.cytobank.org)进行数据处理；

2)使用网站上的画门(Gating)功能，横纵坐标选取到标记的三种金属 中的任意两种金属(如¹⁶⁶Er和¹⁶⁹Tm两种金属)，得到如图3和图4的第一级 细胞分布图(¹⁶⁶Er_CD45-¹⁶⁹Tm_CD45)，使用Gating圈出5个分布不同的细胞 群(从上至下分别代表横纵坐标比例1:100，1:10，1:1，10:1和100:1五个 群)，并命名为1，2，3，4，5；

3)在当前细胞族群(Active Population)中分别选取1，2，3，4，5号 群，将更换横纵坐标中任一个金属标签为第一次Gating时未选择的金属标签(¹⁷³Yb)，得到如图3和图4的第二级细胞分布图(¹⁶⁶Er_CD45-¹⁷³Yb_CD45)， 使用Gating圈出分布不同的细胞群，标记为1-1，1-2，1-3；2-1，2-2，2-3， 2-4；3-1，3-2，3-3，3-4，3-5；4-1，4-2，4-3，4-4；5-1，5-2，5-3共计 19个细胞群，分别对应表1中的1-19号群；

4)将19个群(Populations)导出即完成解析(Debarcoding)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

1)配制不同浓度的金属标记物溶液

提供多种金属标记物，将每种金属标记物分别配制为不同浓度的金属标记物溶液；

2)配制Barcoding试剂组

所述Barcoding试剂组包含多种Barcoding试剂，其中，每种Barcoding试剂包括多种金属标记物溶液，且各Barcoding试剂中所含的金属标记物种类和/或金属标记物浓度比不同；

3)标记样本

使用步骤2)获得的Barcoding试剂组中的各Barcoding试剂，分别标记不同的待检细胞样本；

4)样本检测

将各细胞样本混合，使用质谱流式细胞仪检测混合样本中的所有细胞；

5)样本解析

结合质谱流式细胞仪得到的所有细胞的结果分析，根据不同细胞样本标记的Barcoding试剂特征，将全部的细胞解析为独立的待检细胞样本。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属标记物为同位素金属标记物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述多种金属标记物为至少2种金属标记物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述金属标记物包括但不限于¹⁶⁶Er、¹⁶⁹Tm和¹⁷³Yb。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，先用各所述金属标记物标记多聚物，获得螯合特定金属的多聚体；然后使用所述螯合特定金属的多聚体标记抗体，获得标记抗体；最后将各标记抗体分别配制为不同浓度，从而获得所述不同浓度的金属标记物溶液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述不同浓度包括至少3个浓度梯度，且各浓度梯度相差2至100倍。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，还包括采用其它标记标记待检测细胞中的其它蛋白。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金属标记物为镧系金属。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述不同浓度包括至少3个浓度梯度，且各浓度梯度相差5至20倍，优选地为10倍。

10.一种用于单细胞质谱流式细胞术的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒执行权利要求1所述的方法。