CN112986142A - 一种小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,该方法是以反射干涉光谱(Reflectometric interference spectroscopy,RIfS)和二氧化硅胶体晶体(Silicacolloidal crystal,SCC)薄膜作为传感平台,用戊二醛(GTA)和3‑氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)将血清白蛋白共价固定在SCC薄膜上,加入不同浓度的小分子药物,并以SCC薄膜光学厚度作为参数评价药物与血清白蛋白的吸附和解离过程。本发明的检测方法不仅能检测药物与血清白蛋白的结合强度,还能够提供实时的曲线,观测药物结合和解离的整个过程,供结合和解离动力学分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,属于药物检测领域。
背景技术
小分子药物进入生物体后,通过血浆蛋白的贮存与运输才能到达受体部位产生药效。药物与血浆蛋白的结合是可逆的,结合型药物的药理活性暂时消失,结合物因分子变大不能通过毛细血管壁而暂时“储存”于血液中。药物与蛋白质的结合可以控制药物向受体释放,避免具有药理活性的游离药物浓度大幅度上升迅速代谢造成中毒反应。另外,不同药物对于血浆蛋白的亲和力的差异导致药物与血浆蛋白发生的置换现象在联合用药上也值得特别关注。药物与血浆蛋白结合的改变在临床上有重要意义,个体血浆蛋白的差异引起的体内药物-血浆蛋白结合的改变,有时会导致相应的药物代谢动力学参数的变化,以及导致药效或毒性变化。而白蛋白作为血液或者血浆中含量最高的蛋白质主要担负着这一任务。长期以来,出于药物安全性和有效性的考虑以及药代动力学等方面的评估,药物与血浆蛋白结合规律的研究引起了人们广泛的兴趣。因此研究药物与血清白蛋白的作用对于了解药物在生物体内的吸收、转运及代谢进程,阐明生物大分子与药物小分子相互作用的本质都具有特别重要的意义。
目前,检测药物和蛋白亲和力的方法有超滤,离心,亲和层析,透析,光谱和电泳等。反射干涉光谱(Reflectometric interference spectroscopy,RIfS)是有Gagulaz发明的一种低成本的非标记检测技术。目前已经应用于检测蛋白质,细胞及各种生物检测上。RIfS实时原位检测生物过程的原理为白光在基底层上下边界在的反射干涉现象,即法布里条纹,通过计算光谱的迁移来表示基底内的生物反应的过程。因此,基底的敏感性和对样品的适应性显得尤为重要。二氧化硅胶体晶体薄膜作为RIfS的基底之一,是由单分散二氧化硅胶体粒子组成的具有高表面积的三维阵列结构,相比于其他RIfS基底而言,二氧化硅的化学修饰(氨基化)更加简单容易操作,不需要像氧化铝那样高温处理。并且这种RIfS基底制作也更为容易,不需要特殊的仪器,可以批量化制作,基底具有很高的可重复性,内部三维贯通。相对于平面基底,球体具有更高的曲率,固定在其表面的功能蛋白侧向相互作用较少,减少蛋白质和蛋白质之间的反应对检测的影响。因此利用二氧化硅胶体晶体薄膜作为干涉敏感基底检测药物与白蛋白亲和力是一种很有前途的方法。
发明内容
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明目的是提供一种小分子药物与血清白蛋白亲和力的实时检测方法,并提供动力学数据。
技术方案:本发明所述一种小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,包括以下步骤:
(1)制备二氧化硅胶体晶体薄膜;
(2)将二氧化硅胶体晶体薄膜用APTES乙醇溶液浸泡,密封进行氨基化;
(3)组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合;
(4)利用蠕动泵向密闭反应池中注入PBS,待光谱仪显示基线稳定,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度;
(5)待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,利用蠕动泵向密闭反应池中注入GTA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的GTA溶液;
(6)利用蠕动泵向密闭反应池中注入血清蛋白的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的HSA溶液;
(7)利用蠕动泵向密闭反应池中注入乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的待光学厚度稳定,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度;
(8)待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,利用蠕动泵向密闭反应池中注入不同浓度的乙醇的小分子药物PBS溶液;对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度;其中,所述的小分子药物主要是指化学合成药物,通常分子量小于1000的有机化合物。作为优选,所述小分子药物为吲哚美欣、华法林、水杨酸或奎宁,所述不同小分子药物浓度为1~5mM。
(9)待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,利用蠕动泵向密闭反应池中注入乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度;
(10)根据动力学公式,将步骤(8)和步骤(9)步骤中二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度变化值带入动力学公式中计算得到药物的kon、koff和KD值。
进一步地,所有注入密闭反应池的液体流速均为0.05-0.2mL/min。
进一步地,步骤(1)中,所述制备二氧化硅胶体晶体薄膜包括以下步骤:
(A1)将玻璃载玻片浸泡在食人鱼溶液中备用;
(A2)将二氧化硅微球水溶液离心,清洗,加入无水乙醇,得到二氧化硅乙醇悬浮液;
(A3)将步骤(1)得到玻璃载玻片竖直放在步骤(2)得到二氧化硅乙醇悬浮液中,放置,得到二氧化硅胶体晶体薄膜玻璃载玻片。
进一步地,步骤(A3)中,所述二氧化硅乙醇悬浮液的浓度为1-2%,所述放置的时间为5-8天,放置环境的温度为25±0.5℃,湿度为10±2%。
进一步地,步骤(2)中,所述APTES乙醇溶液的浓度为0.5%-1.5%,密封时间为10-12h。
进一步地,步骤(3)中,所述组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合包括以下步骤:
(B1)在硅胶垫中间打孔,将其覆盖二氧化硅胶体晶体薄膜玻璃载玻片上形成一个反应池;
(B2)在反应池的上端再用玻璃载玻片压紧,形成一个玻璃载玻片-二氧化硅胶体晶体薄膜-硅胶垫-玻璃载玻片的密闭反应池;
(B3)将密闭反应池用定制的载物台固定在倒置显微镜上,并调节焦距至二氧化硅胶体晶体薄膜层;
(B4)将注射器针头插入密闭反应池侧面硅胶垫部分至针头部分到达硅胶垫中间的孔,针头另一端连接导管,并将导管连接到蠕动泵,使反应液体能够流动到硅胶垫中间的反应池内。重复操作再插入一个注射器针头,使反应后的液体能够流出。
进一步地,步骤(5)中,所述GTA的PBS溶液浓度为1%。
进一步地,步骤(6)中,所述HSA的PBS溶液浓度为0.5-1.5mg/mL,
进一步地,整个过程的光学厚度值可以用下列动力学公式进行计算动力学数据:
kobs=kon[A]+koff (2)
ΔoT(t)为随时间变化的光学厚度,[A]是药物的不同浓度,t为时间,OTGG是平衡时光学厚度,kobs观测结合速率常数(随分析物A浓度变化),kon是结合速率常数,koff是解离速率常数,KD是平衡常数。
具体计算方式:根据公式(1)得到kobs的数值,首先需要通过将公式(1)取自然对数ln转化为线性方程:即可以y-ax+b形式进行线性最小二乘拟合,得到参数a和b,再经简单处理,可得这是关键的中间参数,每一个浓度都对应一个kobs,需要进行编号。然后再将kobs数据代入方程(2),以药物的不同浓度[A]为自变量进行线性最小二乘拟合,得到斜率与截距,即kon与koff,从而在公式(3)中计算得到平衡解离常数KD。
工作原理:当小分子药物与HSA结合或解离时,折射率会发生相应的变化从而引起光学厚度的变化。再利用极值法对反射干涉光谱进行拟合,即可获得实时的小分子药物与HSA结合或解离信息。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有以下显著优点:
(1)本方法不仅能够检测小分子药物与血清白蛋白结合的强度,还能够检测其结合的快慢。
(2)本方法能够观测到药物与血清白蛋白结合和解离的整个过程,而不是传统方法那样检测和制作样品中留有时间间隔,这可能会丢失一些有意义的数据。
(3)本方法能够提供实时的曲线,能够实时检测小分子药物与血清白蛋白的结合情况,通过分析提供更多的动力学数据,获得小分子药物与血清白蛋白结合的强弱,快慢等。这些动力学数据在分析药物与血浆蛋白结合的时候是至关重要的,能够对药物的起效时间等提供参考数据。
附图说明
图1是二氧化硅胶体晶薄膜正面和剖面扫描电镜图;其中,A是二氧化硅胶体晶薄膜正面图,B是二氧化硅胶体晶薄膜剖面图。
图2是HSA二氧化硅胶体晶薄膜结合以及吲哚美欣与HSA结合和解离的光学厚度的变化图;其中,阴影方框内为吲哚美欣与HSA结合和解离时光学厚度的变化。
图3是不同浓度吲哚美欣与HSA结合和解离的光学厚度的变化图。
图4是不同药物与HSA结合引起最高的光学厚度的变化与浓度的线性图。
具体实施方式
以下各实施例中,二氧化硅微球水溶液购自日产化工,二氧化硅微球的直径为190nm,光纤光谱仪为复享FX2000型光谱仪,食人鱼溶液是质量浓度为98%的浓硫酸与质量浓度为40%的双氧水按体积比7:3配制而成。其他无特殊说明,涉及的药品与试剂均为普通市售产品。
实施例1
吲哚美欣与HSA亲和力的检测方法,包括以下步骤:
1、制备二氧化硅胶体晶体薄膜:
A1、将玻璃载玻片浸泡在食人鱼溶液中,进行处理备用;
A2、将二氧化硅微球水溶液离心清洗,弃去上清,加入无水乙醇作为溶剂,将二氧化硅微球浸泡在无水乙醇中,形成质量浓度为1%的二氧化硅乙醇悬浮液;
A3、将处理好的玻璃载玻片竖直放在二氧化硅乙醇悬浮液中,放置7天后即可形成二氧化硅胶体晶体薄膜,放置环境的温度为25±0.5℃,湿度为10±2%。
如图1中A所示,正面图电镜照片下二氧化硅微球排列紧密,并无杂乱无规则的排列结构。如图1中B所示,剖面图电镜照片下,二氧化硅微球紧密堆积,成典型的胶体晶体结构,可以看出,此方法可以成功的制备二氧化硅胶体晶薄膜。
2、将二氧化硅胶体晶体薄膜用1%的APTES乙醇溶液浸泡,密封过夜进行氨基化。
3、组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合:
B1、在硅胶垫中间打孔,孔径为3mm,将其覆盖在步骤A3长有二氧化硅胶体晶体薄膜的玻璃载玻片上形成一个反应池;
B2、反应池的上端再用玻璃载玻片压紧,形成一个玻璃载玻片-二氧化硅胶体晶体薄膜-硅胶垫-玻璃载玻片的密闭反应池(硅胶垫中间开孔部位);
B3、将密闭反应池用定制的载物台固定在倒置显微镜上,并调节焦距至二氧化硅胶体晶体薄膜层;
B4、将注射器针头插入密闭反应池侧面硅胶垫部分至针对部分到达硅胶垫中间的孔,针头另一端连接导管,并将导管连接到蠕动泵,使反应液体能够流动到硅胶垫中间的孔内,重复操作再插入一个注射器针头,使反应后的液体能够流出。
4、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速向密闭反应池中通入PBS溶液,待光谱仪基线稳定,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,谱线拟合方法为极值法,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,可以实时得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
5、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1%GTA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,谱线拟合方法为极值法,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明GTA与ATPES成功反应,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的GTA溶液。
6、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1mg/mL HSA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,谱线拟合方法为极值法,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高(如图2戊二醛阶段所示),证明HSA成功固定在GTA修饰的二氧化硅胶体晶体薄膜上,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的HSA溶液。
7、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,用以消除药物溶液中的乙醇对反应的影响,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,谱线拟合方法为极值法,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,通入5%乙醇的PBS溶液之后光学厚度逐渐升高并稳定(如图2中5%乙醇的PBS溶液阶段所示),实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
8、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1、2、3、4和5mM的5%乙醇的吲哚美欣PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高(如图2小分子药物阶段所示),证明吲哚美欣成功结合在HSA分子上。
吲哚美欣与HSA结合引起最高的光学厚度的变化,如图3和图4所示,5mM吲哚美欣引起最高的光学厚度的变化20.5±1.5nm,相关系数为0.997,并随浓度的下降,光学厚度的最大变化值也随之降低。
9、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度逐渐下降(如图2最后部分的5%乙醇的PBS溶液阶段所示),证明吲哚美欣已经从HSA分子解离下来。吲哚美欣与HSA分子结合解离过程如图2灰色阴影方框内所示,当5%乙醇的PBS溶液流入反应池后,光学厚度逐渐下降,证明5%乙醇的PBS溶液可以使结合在HSA上的吲哚美欣发生解离,吲哚美欣的最低检测限为0.131±0.004mM,比文献报道的阳极氧化铝的基地0.41±0.03mM低了三倍左右(AnalyticalChemistry,2016,88,5971)。
10、根据动力学公式kobs=kon[A]+koff和其中,ΔOT(t)为随时间变化的光学厚度,[A]是药物的不同浓度,t为时间,OTGG是平衡时光学厚度,kobs观测结合速率常数(随分析物A浓度变化),kon是结合速率常数,koff是解离速率常数,KD是平衡常数,将步骤8和步骤9中的光学厚度变化值带入公式中计算得到吲哚美欣的kon、koff和KD值,吲哚美欣药物与HSA结合的动力学数据如表1所示。
实施例2
华法林与HSA亲和力的检测方法同实施例1,包括以下步骤:
1、制备二氧化硅胶体晶体薄膜:
A1、将玻璃载玻片浸泡在食人鱼溶液中,进行处理备用;
A2、将二氧化硅微球水溶液离心清洗,弃去上清,加入无水乙醇作为溶剂,将二氧化硅微球浸泡在无水乙醇中,形成质量浓度为1%的二氧化硅乙醇悬浮液;
A3、将处理好的玻璃载玻片竖直放在二氧化硅乙醇悬浮液中,放置7天后即可形成二氧化硅胶体晶体薄膜,放置环境的温度为25±0.5℃,湿度为10±2%。
2、将二氧化硅胶体晶体薄膜用1%的APTES乙醇溶液浸泡,密封过夜进行氨基化。
3、组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合:
B1、在硅胶垫中间打孔,孔径为3mm,将其覆盖在步骤A3长有二氧化硅胶体晶体薄膜的玻璃载玻片上形成一个反应池;
B2、反应池的上端再用玻璃载玻片压紧,形成一个玻璃载玻片-二氧化硅胶体晶体薄膜-硅胶垫-玻璃载玻片的密闭反应池(硅胶垫中间开孔部位);
B3、将密闭反应池用定制的载物台固定在倒置显微镜上,并调节焦距至二氧化硅胶体晶体薄膜层;
B4、将注射器针头插入密闭反应池侧面硅胶垫部分至针对部分到达硅胶垫中间的孔,针头另一端连接导管,并将导管连接到蠕动泵,使反应液体能够流动到硅胶垫中间的孔内。重复操作再插入一个注射器针头,使反应后的液体能够流出。
4、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速向密闭反应池中通入PBS,稳定基线,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
5、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1%GTA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明GTA与ATPES成功反应,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的GTA溶液;
6、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1mg/mL HSA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明HSA成功固定在GTA修饰的二氧化硅胶体晶体薄膜上,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的HSA溶液。
7、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,用以消除药物溶液中的乙醇对反应的影响,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,通入5%乙醇的PBS溶液之后光学厚度逐渐升高并稳定,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
8、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1、2、3、4和5mM的5%乙醇的华法林PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明华法林成功结合在HSA分子上;华法林药物与HSA结合的动力学,如图4所示,5mM华法林引起最高的光学厚度的变化9.6±0.65nm,相关系数为0.994,并随浓度的下降,光学厚度的最大变化值也随之降低。
9、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度下降,证明华法林已经从HSA分子解离下来。
10、根据动力学公式kobs=kon[A]+koff和其中,ΔOT(t)为随时间变化的光学厚度,[A]是药物的不同浓度,t为时间,OTGG是平衡时光学厚度,kobs观测结合速率常数(随分析物A浓度变化),kon是结合速率常数,koff是解离速率常数,KD是平衡常数,将步骤8和步骤9中的光学厚度变化值带入公式中计算得到华法林的kon、koff和KD值,如表1所示。
实施例3
水杨酸与HSA亲和力的检测方法同实施例1,包括以下步骤:
1、制备二氧化硅胶体晶体薄膜:
A1、将玻璃载玻片浸泡在食人鱼溶液中,进行处理备用;
A2、将二氧化硅微球水溶液离心清洗,弃去上清,加入无水乙醇作为溶剂,将二氧化硅微球浸泡在无水乙醇中,形成质量浓度为1%的二氧化硅乙醇悬浮液;
A3、将处理好的玻璃载玻片竖直放在二氧化硅乙醇悬浮液中,放置7天后即可形成二氧化硅胶体晶体薄膜,放置环境的温度为25±0.5℃,湿度为10±2%。
2、将二氧化硅胶体晶体薄膜用1%的APTES乙醇溶液浸泡,密封过夜进行氨基化。
3、组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合:
B1、在硅胶垫中间打孔,孔径为3mm,将其覆盖在步骤A3长有二氧化硅胶体晶体薄膜的玻璃载玻片上形成一个反应池;
B2、反应池的上端再用玻璃载玻片压紧,形成一个玻璃载玻片-二氧化硅胶体晶体薄膜-硅胶垫-玻璃载玻片的密闭反应池(硅胶垫中间开孔部位);
B3、将密闭反应池用定制的载物台固定在倒置显微镜上,并调节焦距至二氧化硅胶体晶体薄膜层;
B4、将注射器针头插入密闭反应池侧面硅胶垫部分至针对部分到达硅胶垫中间的孔,针头另一端连接导管,并将导管连接到蠕动泵,使反应液体能够流动到硅胶垫中间的孔内。重复操作再插入一个注射器针头,使反应后的液体能够流出。
4、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速向密闭反应池中通入PBS,稳定基线,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
5、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1%GTA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明GTA与ATPES成功反应,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的GTA溶液。
6、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1mg/mL HSA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明HSA成功固定在GTA修饰的二氧化硅胶体晶体薄膜上,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的HSA溶液。
7、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,用以消除药物溶液中的乙醇对反应的影响,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,通入5%乙醇的PBS溶液之后光学厚度逐渐升高并稳定,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
8、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1、2、3、4和5mM的5%乙醇的水杨酸PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明水杨酸成功结合在HSA分子上;水杨酸药物与HSA结合的动力学如图4所示,5mM水杨酸引起最高的光学厚度的变化3.9±0.43nm,相关系数为0.989,并随浓度的下降,光学厚度的最大变化值也随之降低。
9、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度下降,证明水杨酸已经从HSA分子解离下来。
10、根据动力学公式kobs=kon[A]+koff和其中,ΔOT(t)为随时间变化的光学厚度,[A]是药物的不同浓度,t为时间,OTGG是平衡时光学厚度,kobs观测结合速率常数(随分析物A浓度变化),kon是结合速率常数,koff是解离速率常数,KD是平衡常数,将步骤8和步骤9中的光学厚度变化值带入公式中计算得到水杨酸的kon、koff和KD值,如表1所示。
实施例4
奎宁与HSA亲和力的检测方法同实施例1,包括以下步骤:
1、制备二氧化硅胶体晶体薄膜:
A1、将玻璃载玻片浸泡在食人鱼溶液中,进行处理备用;
A2、将二氧化硅微球水溶液离心清洗,弃去上清,加入无水乙醇作为溶剂,将二氧化硅微球浸泡在无水乙醇中,形成质量浓度为1%的二氧化硅乙醇悬浮液;
A3、将处理好的玻璃载玻片竖直放在二氧化硅乙醇悬浮液中,放置7天后即可形成二氧化硅胶体晶体薄膜,放置环境的温度为25±0.5℃,湿度为10±2%;
2、将二氧化硅胶体晶体薄膜用1%的APTES乙醇溶液浸泡,密封过夜进行氨基化。
3、组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合:
B1、在硅胶垫中间打孔,孔径为3mm,将其覆盖在步骤A3长有二氧化硅胶体晶体薄膜的玻璃载玻片上形成一个反应池;
B2、反应池的上端再用玻璃载玻片压紧,形成一个玻璃载玻片-二氧化硅胶体晶体薄膜-硅胶垫-玻璃载玻片的密闭反应池(硅胶垫中间开孔部位);
B3、将密闭反应池用定制的载物台固定在倒置显微镜上,并调节焦距至二氧化硅胶体晶体薄膜层;
B4、将注射器针头插入密闭反应池侧面硅胶垫部分至针对部分到达硅胶垫中间的孔,针头另一端连接导管,并将导管连接到蠕动泵,使反应液体能够流动到硅胶垫中间的孔内。重复操作再插入一个注射器针头,使反应后的液体能够流出。
4、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速向密闭反应池中通入PBS,稳定基线,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
5、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1%GTA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明GTA与ATPES成功反应,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的GTA溶液。
6、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1mg/mL HSA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明HSA成功固定在GTA修饰的二氧化硅胶体晶体薄膜上,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的HSA溶液。
7、利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,用以消除药物溶液中的乙醇对反应的影响,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,通入5%乙醇的PBS溶液之后光学厚度逐渐升高并稳定,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度。
8、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入1、2、3、4和5mM的5%乙醇的奎宁PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度升高,证明奎宁成功结合在HSA分子上;奎宁药物与HSA结合的动力学如图4所示,5mM奎宁引起最高的光学厚度的变化1.9±0.21nm,相关系数为0.990,并随浓度的下降,光学厚度的最大变化值也随之降低。
9、待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度稳定,利用蠕动泵通过步骤B4的导管以0.1mL/min的流速通入5%乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,实时获得二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度,二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度下降,证明奎宁已经从HSA分子解离下来。
10、根据动力学公式kobs=kon[A]+koff和其中,ΔOT(t)为随时间变化的光学厚度,[A]是药物的不同浓度,t为时间,OTGG是平衡时光学厚度,kobs观测结合速率常数(随分析物A浓度变化),kon是结合速率常数,koff是解离速率常数,KD是平衡常数,将步骤8和步骤9中的光学厚度变化值带入公式中计算得到奎宁的kon、koff和KD值,奎宁药物与HSA结合的动力学数据如表1所示。
表1实施例1-实施例4中的药物与HSA结合的动力学数据
结合速率常数k<sub>on</sub> | 解离速率常数k<sub>off</sub> | 平衡常数K<sub>D</sub> | |
吲哚美欣 | 0.0022mM<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup> | 0.0052s<sup>-1</sup> | 2.3636mM<sup>-1</sup> |
华法林 | 0.0016mM<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup> | 0.0097s<sup>-1</sup> | 6.1233mM<sup>-1</sup> |
水杨酸 | 0.0009mM<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup> | 0.0122s<sup>-1</sup> | 13.5613mM<sup>-1</sup> |
奎宁 | 0.0004mM<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup> | 0.0779s<sup>-1</sup> | 19.4872mM<sup>-1</sup> |
结论:kon结合速率常数,代表分子间结合时的快慢,kon越大代表达到最大光学厚度时间越短;koff解离速率常数,代表分子间解离时的快慢,koff越大代表最大光学厚度下降的速率越慢;KD平衡常数,化合物对靶标的亲和力大小,值越小亲和力越强。由此可见,四种药物与HSA亲和力大小分别为吲哚美欣>华法林>水杨酸>奎宁。四种药物与HSA结合由快到慢分别为吲哚美欣>华法林>水杨酸>奎宁。四种药物与HSA解离由快到慢分别为吲哚美欣>华法林>水杨酸>奎宁。
Claims (10)
1.一种小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备二氧化硅胶体晶体薄膜;
(2)将二氧化硅胶体晶体薄膜用APTES乙醇溶液浸泡,密封进行氨基化;
(3)组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合;
(4)利用蠕动泵向密闭反应池中注入PBS溶液,待光谱仪显示基线稳定,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度1;
(5)待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度1稳定时,利用蠕动泵向密闭反应池中注入GTA的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度2,待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度2稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的GTA溶液;
(6)利用蠕动泵向密闭反应池中注入血清白蛋白的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度3,待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度3稳定时,再通入PBS溶液,冲走多余的和未结合的血清白蛋白的溶液;
(7)利用蠕动泵向密闭反应池中注入乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度4;
(8)待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度4稳定时,利用蠕动泵向密闭反应池中注入不同浓度的乙醇的小分子药物的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度5;
(9)待二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度5稳定时,利用蠕动泵向密闭反应池中注入乙醇的PBS溶液,对选定反射干涉光谱波段进行谱线拟合,经过计算得到二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度6;
(10)根据动力学公式,将步骤(8)和步骤(9)步骤中二氧化硅胶体晶体薄膜的光学厚度变化值带入动力学公式中计算得到药物的kon、koff和KD值。
2.根据权利要求1所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(4)~(9)中所有注入密闭反应池的液体流速均为0.05-0.2mL/min。
3.根据权利要求1所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(8)中,所述小分子药物为吲哚美欣、华法林、水杨酸或奎宁,所述小分子药物浓度为1~5mM。
4.根据权利要求1所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述制备二氧化硅胶体晶体薄膜包括以下步骤:
(A1)将玻璃载玻片浸泡在食人鱼溶液中备用;
(A2)将二氧化硅微球水溶液离心,清洗,加入无水乙醇,得到二氧化硅乙醇悬浮液;
(A3)将步骤(1)得到玻璃载玻片竖直放在步骤(2)得到二氧化硅乙醇悬浮液中,放置,得到二氧化硅胶体晶体薄膜玻璃载玻片。
5.根据权利要求4所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(A3)中,所述二氧化硅乙醇悬浮液的浓度为1-2%,所述放置的时间为5-8天,放置环境的温度为25±0.5℃,湿度为10±2%。
6.根据权利要求1所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(2)中,所述APTES乙醇溶液的浓度为0.5%~1.5%,密封时间为10~12h。
7.根据权利要求1所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(3)中,所述组装密闭反应池并与显微镜和光谱仪组成的RIfS系统耦合包括以下步骤:
(B1)在硅胶垫中间打孔,将其覆盖二氧化硅胶体晶体薄膜玻璃载玻片上形成一个反应池;
(B2)在反应池的上端再用玻璃载玻片压紧,形成一个玻璃载玻片-二氧化硅胶体晶体薄膜-硅胶垫-玻璃载玻片的密闭反应池;
(B3)将密闭反应池用定制的载物台固定在倒置显微镜上,并调节焦距至二氧化硅胶体晶体薄膜层;
(B4)将注射器针头插入密闭反应池侧面硅胶垫部分至针头部分到达硅胶垫中间的孔,针头另一端连接导管,并将导管连接到蠕动泵,使反应液体能够流动到硅胶垫中间的反应池内。重复操作再插入一个注射器针头,使反应后的液体能够流出。
9.根据权利要求1所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(5)中,所述GTA的PBS溶液浓度为1~2%。
10.根据权利要求1所述的小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法,其特征在于,步骤(6)中,所述HSA的PBS溶液浓度为0.5-1.5mg/mL。
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CN202110175247.7A CN112986142A (zh) | 2021-02-09 | 2021-02-09 | 一种小分子药物与血清白蛋白亲和力的检测方法 |
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Citations (5)
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---|---|---|---|---|
CN107354134A (zh) * | 2016-05-09 | 2017-11-17 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 纳米棒阵列的靶细胞捕获基底及其制备方法和应用 |
CN107505309A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-12-22 | 长春理工大学 | 检测环境中甾体类激素的光学生物传感器的制备方法及应用 |
CN108344714A (zh) * | 2018-01-16 | 2018-07-31 | 东南大学 | 基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪及其进行生物分子检测的方法 |
CN110501337A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-26 | 东南大学 | 一种有序多孔纳米干涉薄膜中液晶排列取向的测试方法 |
CN110812340A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-02-21 | 西北农林科技大学 | 一种脲酶驱动人血清蛋白纳米粒子及其制备方法 |
-
2021
- 2021-02-09 CN CN202110175247.7A patent/CN112986142A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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李义臣等: "二氧化硅/聚甲基丙烯酸甲酯光子晶体在涤纶织物上的结构生色", 《纺织学报》 * |
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