CN108344714A - 基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪及其进行生物分子检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，该生物检测仪包括检测池、设置在检测池中的传感单元和用于检测传感单元反射干涉光谱的光纤光谱仪，传感单元为具有三维有序纳米孔的多孔薄膜，纳米孔隙的直径为20nm～500nm。本发明还公开使用上述生物检测仪进行生物分子检测的方法。当待测物质吸附到作为传感单元的有序多孔薄膜的孔隙表面后，将改变反射干涉光的频谱分布，导致谱线偏移，这种谱线偏移即可以用来定量或定性分析样本中物质的浓度、附着速率、相互作用、几何尺寸的变化等。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪及其进行生物分子检测的方法。
背景技术
生物传感器(biosensor)是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，是由固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)、适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感器具有接受器与转换器的功能。生物传感器的应用涉及许多方面，其中很主要的一个应用是用于研究生物分子之间的相互作用。生物分子之间的相互作用(Biomolecular Interaction Analysis,BIA)是生命存在的基础，而这些与分子结构密切相关的分子之间的相互作用也是理解与研究生物体系的重要信息，使用生物传感器技术可以得到生物分子相互作用的一些基本信息，比如动力学特性、亲和力和结合位点等。
目前，标记分析是生物医学领域的一个很经典的不可缺少的研究手段。以酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)等为代表的标记免疫分析技术已成为医学检验、免疫学及生物化学等领域的常规分析技术。标记方法有其优越性，它具有较高的灵敏度和较低的背景噪声，并能进行痕量分析。但是，上述检测分析技术并非完美无缺。传统标记免疫分析技术的不足之处如前期烦琐的标记流程、第二抗体的引入增加检测体系的复杂度和放射性物质对环境的影响等等。另外，在用酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测高剂量抗原样品时，其剂量反应曲线呈向下弯落的趋势，在高剂量水平反而出现假低值，也即典型的高剂量钩镰效应(HD-HOOK效应)。“HD-HOOK效应”在临床检验上危害严重，可导致假阴性误诊。第二抗体的引入被证实是诱发HD-HOOK效应的重要因素。面对标记免疫分析技术出现的种种问题，解决办法除选择新的固相基底材料和优选最佳的固定化方法改善其检测灵敏度、线性范围以及精密度等外，另一条有效途径则是从根本上改变分析模式。在新的分析体系中不使用第二抗体和标记物，也即用非标记分析技术替代标记分析技术。其中，发展原位、瞬时、高灵敏以及高精密基于新原理、新方法的分析技术显得尤为重要。
通过复合光的反射干涉光谱(Reflectometric Interference Spectroscopy，RIfS)检测分子在薄膜表面的结合是近年来新发展起来的一种新技术，此类分析技术能够实现对生物分子相互作用的实时分析，研究生物分子相互作用的动力学。Gauglitz等在1993年建立了一套基于RIfS的检测装置，包括光源、二极管阵列光谱仪、光纤和传感单元等(G.Gauglitz,A.Brecht,W.Nahm,“Chemical and biochemical sensors based oninterferometry at thin(multi-)layers.Sensor&Actuators B,1993,11,21-27.)。他们设计了基于高分子膨胀层的光干涉型气体传感器可非常灵敏地检测空气中有害气体的含量(A.Hierlemann,J.Seemann,G.Gauglitz et al.,“Chiral discrimination usingpiezoelectric and optical gas sensors”,Nature,1997,577,577～580.)。此后发展起来的用于生物检测的干涉光谱仪的敏感元件都是平面的干涉层。但是这种平面的干涉层的缺点是显而易见的：首先，这种涂层的造价昂贵，使得检测成本高昂；其次，平面干涉层的比表面积有限，能够捕获的生物分子量有限，因此检测灵敏度往往达不到要求；最后，此类干涉层的干涉光谱的振幅也是很有限的，信噪比低，这也会在一定程度上降低检测的灵敏度。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种灵敏的、能够实时分析生物分子之间的相互作用的基于薄膜干涉效应的生物检测仪。
技术方案：本发明提供一种基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，包括检测池、设置在检测池中的传感单元和用于检测传感单元反射干涉光谱的光纤光谱仪，传感单元为具有三维有序纳米孔的有序多孔薄膜，有序多孔薄膜中的纳米孔直径为20nm～500nm。
本发明的生物检测仪中，有序多孔薄膜既可以作为反应池又可以作为干涉薄膜；同时，由于有序多孔薄膜内含相互贯通的纳米孔，比表面积比不含三维有序纳米孔的平面的干涉薄膜大很多，因此可以捕获更多的待测分子，从而提高检测的灵敏度，另外本生物检测仪的干涉效果好，信噪比高。
本发明作为传感单元的有序多孔薄膜可使用有现有的制备有序多孔薄膜的方法进行制备，优选地，可使用垂直沉积法制备胶体晶模板，在此基础上利用模板法制备具有三维有序纳米孔的有序多孔薄膜；有序多孔薄膜的材料可根据待测样品的类型、性质进行选择，常用的有序多孔薄膜材料包括但不限于二氧化硅、聚苯乙烯、掺杂BTO/ITO纳米粒子的聚苯乙烯、环氧树脂、掺杂BTO/ITO纳米粒子的环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或掺杂BTO/ITO纳米粒子的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。
上述光纤光谱仪为本领域已知的光纤光谱仪；具体地，光纤光谱仪包括宽频光源、Y型光纤束、反射探头、入射狭缝、光栅和探测器；优选地，宽频光源波长为400nm～1200nm。光在生物检测仪中的传播路径为光源→Y型光纤束→样品→反射探头→Y型光纤束→接口→入射狭缝→准直镜(平行光)→光栅→聚焦镜→探测器(光电转换)，探测器将光信号转换为电信号后传输至软件控制系统。
反射探头既可设置在作为传感单元的有序多孔薄膜上方，又可设置在作为传感单元的有序多孔薄膜下方，从有序多孔薄膜的两面均可以检测到有序多孔薄膜的反射干涉谱；优选地，将反射探头设置在作为传感单元的有序多孔薄膜的下方，此时，有序多孔薄膜上层以及有序多孔薄膜内部作为反应池，检测过程中的操作均在有序多孔薄膜上方进行，相互之间没有干扰，便于操作，且待测液体浑浊时也不会对检测结果造成干扰。
生物检测仪还包括用于控制检测池内液体流动的流动注入系统、用于控制检测池内温度的温度控制系统和用于控制光纤光谱仪并分析传感单元反射干涉光谱获得传感单元光学厚度的软件控制系统。
流动注入系统可选择现有的任意可将待测样品溶液注入到检测池中的设备，如蠕动泵；控制系统可选择任意可控制光纤光谱仪并通过分析反射干涉光谱获得传感单元光学厚度的软件控制系统；控制系统分析反射干涉光谱获得传感单元光学厚度变化的方法包括以下步骤：
1)获取传感单元的反射干涉光谱；
2)根据步骤1)获取的反射干涉光谱，使用单峰拟合或多峰拟合方法获得所述传感单元光学厚度随时间的变化曲线。
本发明另一方面提供使用上述生物检测仪进行生物分子检测的方法，包括以下步骤：
1)对有序多孔薄膜进行修饰，使有序多孔薄膜能够吸附待测生物分子；当待测样品为单纯样本，即待测样品中仅含待测生物分子时，上述修饰可以是任意能使待测生物分子附着到有序多孔薄膜上的修饰方式，例如疏水处理等；当待测样品为含多种成分的复杂样本时，上述修饰是指在使有序多孔薄膜能够特异性吸附待测生物分子的过程；
2)向检测池中注入待测样品的溶液，检测有序多孔薄膜光学厚度随时间的变化曲线；
3)根据步骤2)检测得到的所述有序多孔薄膜光学厚度随时间的变化曲线对待测生物分子进行定性或定量分析。
步骤1)中待测样品中使用的分散介质可根据具体要研究的生物分子类型进行选择，如水、有机溶剂或缓冲溶液等。
步骤2)中，向检测池中注入待测样品溶液可以是将待测样品溶液一次性注入到检测池中，也可以是使用蠕动泵等装置将待测样品溶液以恒定速度注入到检测池中；检测有序多孔薄膜光学厚度随时间的变化曲线的方法包括以下步骤：
1)获得传感单元的反射干涉光谱；
2)根据步骤1)获得的反射干涉光谱，使用单峰拟合或多峰拟合方法获得传感单元光学厚度随时间的变化曲线。
步骤3)中，对待测生物分子进行定性或定量分析包括分析待测样品溶液中生物分子的浓度、生物分子附着速率、生物分子相互作用或生物分子几何尺寸的变化。
为了获得准确的检测结果，在检测有序多孔薄膜光学厚度随时间的变化曲线前，还可包括建立模厚测定模型和检测所述生物检测仪光学厚度响应基线的步骤；建立模厚测定模型包括对生物检测仪进行背景扫描、参考扫描以及选择获得光学厚度的拟合方法(单峰拟合或多峰拟合)。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明使用具有三维有序纳米孔的有序多孔薄膜作为生物检测仪传感单元，有序多孔薄膜内含相互贯通的孔隙，其比表面积比平面的干涉薄膜大很多，因此可以捕获更多的检测分子，从而提高检测的灵敏度；有序多孔薄膜既可以作为反应池又可以作为干涉薄膜，其干涉效果很好，信噪比高，干涉光谱高度可重复，批次之间的差异很小，有非常好的商业化前景；当待测物质吸附到薄膜的孔隙表面后，将改变反射干涉光的频谱分布，这种谱线偏移即可以用来实时定量或定性分析样本中物质的浓度、附着速率、几何尺寸的变化等。
2、现有生物传感器大多采用共价方法将抗体或寡核苷酸链通过桥接分子固定到亲水聚合物(如羧甲基葡聚糖，聚乙二醇)表面，制备步骤多，制备过程繁琐，本发明中作为传感单元的有序多孔薄膜材料具有良好的疏水性，可用物理吸附的方法制备生物敏感层，通过合理的固定蛋白与封闭蛋白的引入，在简化敏感层制备和降低成本的同时也抑制非特异性吸附。
附图说明
图1是生物检测仪的整体结构简图；
图2是使用生物检测仪检测透明有序多孔薄膜光学厚度的原理图，其中，图2(A)为光干涉产生原理示意图，图2(B)为一个典型的被cos(1/λ)调制的反射干涉谱，薄膜光学厚度的变化可以通过检测Δλextremum计算出来；
图3是模板法制备有序多孔薄膜的原理示意图；
图4(A)是用于修饰传感片的反应池的分解示意图；图4(B)是用于修饰传感片的反应池在与图4(A)相反方向的分解示意图；
图5(A)是不同浓度的乙肝表面抗原与作为传感单元的有序多孔薄膜特异性结合引起的薄膜相对光学厚度随时间变化的曲线及拟合曲线，图5(B)是乙肝表面抗原相对光学厚度变化的初速度(即薄膜光学厚度开始变化时的变化速度)随浓度的变化曲线；
图6是控制系统实时将获取到的反射干涉光谱转化为有序多孔薄膜光学厚度的流程；
图7是多个连续波峰对应的波数与相对阶数之间的关系曲线；
图8是戊二醛(Glutaraldehyde，GA)与人类血清中的IgG之间的共价偶联作用导致的有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度随时间的变化曲线；
图9是葡球菌蛋白A(SPA)与人类血清中的IgG之间的相互作用导致的有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度随时间的变化曲线。
具体实施方式
在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种生物检测仪，如图1所示，该生物检测仪包括检测池1、设置在检测池1中的传感单元2和用于检测传感单元2反射干涉光谱的光纤光谱仪3和控制系统4。传感单元2为具有三维有序纳米孔的有序多孔薄膜。
有序多孔薄膜的孔隙直径和使用的材料可具体根据待测样品的种类进行选择，例如，有序多孔薄膜可以为具有三维有序纳米孔的二氧化硅胶体晶薄膜，或者为通过模板法制备的具有三维有序纳米孔聚苯乙烯或环氧树脂有序多孔薄膜。二氧化硅胶体晶薄膜可以通过本领域已知的方法制备，例如，使用垂直沉积法制备胶体晶模板；上述模板法可以是使用垂直沉积法制备的胶体晶模板二氧化硅胶体晶薄膜作为模板，在二氧化硅胶体晶模板的间隙里填充薄膜材料的溶液，通过溶剂蒸发的方法使薄膜材料成型，成型后将薄膜与玻璃基底分离，接着通过氢氟酸腐蚀处理去除二氧化硅模板，形成有序多孔纳米结构薄膜(如图3所示)。薄膜材料可根据待测样品的类型、性质进行选择，常用的有序多孔薄膜材料包括但不限于聚苯乙烯、环氧树脂。
光纤光谱仪3用于检测、记录检测过程中反射干涉光谱的变化，其可以为本领域已知的可用于检测反射干涉光谱的光纤光谱仪。
优选地，光纤光谱仪3包括宽频光源5、Y型光纤束6、反射探头7、接口8、入射狭缝9、准直镜10、光栅11、聚焦镜12和探测器13。优选地，宽频光源波长为400nm～1200nm；Y型光纤束6由7根直径200微米的硅石(Silica)光纤丝组成，周围六根光纤作为照明，中间一根收集反射光，其与宽频光源5以及入射狭缝9的接口均采用标准SMA905接头；连接器，用于固定光纤、狭缝、滤波片的相对位置，采用标准SMA905接口；入射狭缝9用于控制进入光谱仪的光通量，也可以通过选择不同孔径的光栅来控制光通量；光栅11可根据具体需求选择；探测器13采用CCD探测器。在生物检测仪中，光的传播方向依次为：宽频光源5→Y型光纤束6→传感单元2→反射探头7→Y型光纤束6→接口8→入射狭缝9→准直镜10(平行光)→光栅11→聚焦镜12→探测器13，探测器13将光信号转换为电信号后传输至控制系统4。另外，图1中，14为废液瓶，15为蠕动泵，16为样品瓶。
软件控制系统可选择任意可控制光纤光谱仪并通过分析反射干涉光谱获得传感单元光学厚度的软件控制系统；软件控制系统分析反射干涉光谱获得传感单元光学厚度变化的方法包括以下步骤：
1)获取传感单元的反射干涉光谱；
2)根据步骤1)获取的反射干涉光谱，使用单峰拟合或多峰拟合方法获得所述传感单元光学厚度。
重复步骤1)和步骤2)可实时绘制传感单元光学厚度随时间的变化曲线。
本发明利用光干涉检测透明薄膜光学厚度的原理如图2(A)所示。光在薄膜的两个界面上被部分反射。根据入射角、波长、薄膜的物理厚度及折射率的不同，部分反射束叠加产生独特的干涉谱―反射率的极大值和极小值随波长改变而交替分布。透明薄膜的光学厚度定义为薄膜折射率n和实际厚度d的乘积。图2(B)显示了一个典型的被COS(1/λ)调制的反射谱。在垂直入射情况下，光在待测有序多孔纳米薄膜的两个界面上被部分反射，可得到下列公式：
R1和R2分别为待测有序多孔纳米薄膜两个界面(界面1和界面2)上的反射率或反射强度，df为待测有序多孔纳米薄膜的厚度，nf为有序多孔纳米薄膜的平均折射率，λ为入射光的波长，R(λ)为入射光波长为λ时在有序多孔纳米薄膜中多次反射的光在界面1呈现出的总体反射率或反射强度，该总体反射率或反射强度是在有序多孔纳米薄膜中多次反射的光在界面1相干叠加后呈现出来的反射率或反射强度。
R(λ)的极大值出现在式2处：
2nfdf＝λm式2
其中，m为极大值的绝对干涉阶数，m＝0,1,2…。如果入射光的波长已知，则薄膜的光学厚度可以利用式2(极大值或极小值的分布)计算出来。有序多孔薄膜的孔隙内的生物分子结合，如抗原-抗体相互作用和DNA杂交反应等，会引起薄膜整体折射率发生变化，从而引起薄膜光学厚度的变化，导致反射干涉谱的偏移(Δλextremum)。而通过检测Δλextremum可计算薄膜光学厚度的变化。薄膜光学厚度的变化与其表面及内部孔隙中所结合的生物分子的量成正比，可实现生物分子相互作用的非标记检测。
本发明的控制系统能够控制光纤光谱仪并实时将获取到的反射干涉光谱转化为有序多孔薄膜光学厚度，从而反映反射干涉光谱薄膜光学厚度的变化。控制系统可采用本领域已知的方式控制光纤光谱仪并实时将获取到的反射干涉光谱转化为有序多孔薄膜光学厚度。优选地，控制系统实时将获取到的反射干涉光谱转化为有序多孔薄膜光学厚度的流程如附图6所示。
对于多峰拟合法，根据式2可以得知：
根据式3可知，波数与绝对阶数成正比。但是，一般来说，一个峰值的绝对干涉阶数是很难获得的，因此，将式3进行变形可以得到：
其中为相对阶数，它与绝对阶数之间相差一个常数m0。由式4可知，波数与相对阶数同样成正比，且斜率为因此通过获得多个连续波峰对应的波长值，线性回归后，对斜率取倒数再除以2即可以获得薄膜的光学厚度，不需要知道峰值的绝对阶数(如附图7)。
对于单峰拟合法，其原理就是假设一个波峰或波谷的绝对阶数不会发生变化，通过追踪波长变化来实时计算光学厚度。根据式2，已知某个波峰值λ1和与之对应的绝对阶数m1，就可以计算出光学厚度：
绝对阶数可m1以通过下式计算出来：
其中为光学厚度的估计值(初始值)。这个估计值在本发明所述的软件系统里是通过进行一次多峰拟合后获得的。
在本发明的生物检测仪检测过程中，生物分子相互作用可以用下面的关系式来表示：
这里A为被分析物，B为修饰在作为传感单元的具有三维有序纳米孔的有序多孔薄膜表面的配体。假设相互作用为拟一级反应，则待测样品注入时AB复合物形成的速率为：
其中，Ka为结合速率常数，Kd为解离速率常数。由此可以推导出仪器响应值Γ对时间t的关系为(推导过程略)：
其中，Γeq为A与B结合达到动态平衡时的仪器响应值(即Ka＝Kd时)，C为被分析物A的浓度，并在分析过程中保持不变。同样，对于复合物AB的解离过程，A的浓度C为零，t0是解离反应开始的时间，解离过程中仪器响应值Γ对时间的关系简化为
总体上看，在流动池中，被分析物－配体的反应的速度受到两个因素的限制：
①被分析物扩散到传感片表面的速度，主要受流速和被分析物浓度和粘度的影响，另外温度、pH值、离子强度也有微小影响－称质量传递限制；
②被分析物和配体亲和常数，这是反应对的内在的性质，受温度、pH值、离子强度的影响较大－称相互作用限制；
相应的有两种极端情况：
①当样品溶液流速很高或被分析物浓度很大时(或表面配体的密度较低)，结合反应只受相互作用限制的，用来进行相互作用动力学检测，可以用拟一级反应动力学公式对结果进行非线性拟合；
②反之，当样品溶液流速很慢或被分析物浓度很低时(或表面配体的密度很大)，结合反应只受质量传递限制，反应速度主要取决于被分析物的浓度。利用这个原理，可以进行被分析物的浓度检测。对结合曲线进行非线性拟合，得到结合动力学曲线的初始反应速度，利用一系列标准浓度的被分析物的初始反应速度作出标准曲线，即可用于测定未知浓度的被分析物溶液的浓度。
反射探头既可设置在作为传感单元的有序多孔薄膜上方，又可设置在作为传感单元的有序多孔薄膜下方，从有序多孔薄膜的两面均可以检测到有序多孔薄膜的反射干涉谱；优选地，将反射探头设置在作为传感单元的有序多孔薄膜的下方，此时，有序多孔薄膜上层以及有序多孔薄膜内部作为反应池，检测过程中的操作均在有序多孔薄膜上方进行，相互之间没有干扰，便于操作，且待测液体浑浊时也不会对检测结果造成干扰。
生物检测仪还包括用于控制检测池内液体流动的流动注入系统、用于控制检测池内温度的温度控制系统和用于控制光纤光谱仪并分析传感单元反射干涉光谱获得传感单元光学厚度的软件控制系统。流动注入系统可选择现有的任意可将待测样品溶液注入到检测池中的设备，如蠕动泵15。流动注入系统及温度控制系统作为检测池内液体流动和温度的控制单元，将传感单元固定在检测池内；流动注入及温度控制系统的引入可以为生物检测提供很好的反应条件。
利用上述生物检测仪分析样本中物质的浓度、附着速率、几何尺寸的变化等包括以下操作步骤：
(1)对于单纯样本：
①将多孔膜固定在检测池内，注入不含样品的空白溶液，使其浸透多孔膜并充满检测池；
②仪器初始化及膜厚测定模型的建立(进行背景扫描、参考扫描以及选择获得光学厚度的拟合方法(单峰拟合或多峰拟合))；
③保持空白溶液以一定的速度流动，记录整个检测仪的光学厚度响应基线(持续10min左右)；
④对多孔膜进行一定的修饰(包括物理修饰、化学修饰和生物修饰)，使其能够吸附待测物质；
⑤注入一定量的样本溶液，记录薄膜光学厚度随时间的变化曲线；
⑥光学厚度稳定一段时间后注入空白溶液清洗整个体系，洗掉未结合的样品。根据所得薄膜光学厚度随时间的变化曲线来分析样本物质的浓度、附着速率等参数。
(2)对于复杂样品：
①将多孔膜固定在检测池内，注入不含样品的空白溶液，使其浸透多孔膜并充满检测池；
②仪器初始化及膜厚测定模型的建立(进行背景扫描、参考扫描以及选择获得光学厚度的拟合方法(单峰拟合或多峰拟合))；
③保持空白溶液以一定的速度流动，记录整个检测仪的光学厚度响应基线(持续10min左右)；
④根据生物反应等原理，对薄膜进行一定的修饰，使其能够特异地结合待测物质，降低薄膜的非特异性吸附；
⑤注入一定量的样本溶液，记录薄膜光学厚度随时间的变化曲线；
⑥光学厚度稳定一段时间后注入空白溶液清洗整个体系，洗掉未结合的样品
⑦如有必要，可以选择另一种不能够与被检测物质特异反应的物质证实第⑥步中光学厚度的变化确实是因待测物质的结合导致。
根据所得薄膜光学厚度随时间的变化曲线来分析样本物质的浓度、附着速率等参数。
实施例1
利用本发明的生物检测仪检测溶液中的乙肝表面抗原(HBsAg)的浓度，其中传感单元为具有三维有序纳米孔的有序多孔聚苯乙烯薄膜，孔隙大小为200nm。具体步骤如下：
1)对传感单元进行修饰(抗体的包被)：
取内径约7mm的聚四氟乙烯反应池17，用橡皮圈18封边，利用小号文具夹将聚四氟乙烯反应池17、橡皮圈18、传感片19和载玻片20加压固定在一起，如附图4所示。传感片3为有序多孔聚苯乙烯薄膜。向上述聚四氟乙烯反应池中注入200μl包被液，包被液为Anti-HBs单克隆抗体溶解在0.05M的pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CB缓冲液)中得到的溶液，其中Anti-HBs单克隆抗体的浓度为5μg/ml。将注入包被液后的反应池放置在湿盒中4℃过夜，然后从湿盒中取出反应池后弃去包被液，分别用含0.02％Tween-20的50mM pH 7.4的PBS缓冲液(洗涤缓冲液)和去离子水各洗涤有序多孔聚苯乙烯薄膜5次。再向反应池中注入1％牛血清白蛋白，在37℃封闭1小时后弃去封闭液，分别用含0.02％Tween-20的50mM pH 7.4的PBS缓冲液(洗涤缓冲液)和去离子水各洗涤5次，即得到修饰好的传感单元。将修饰好的传感片固定于检测池上。
2)标准曲线的绘制：用PBS缓冲液(pH 7.4，0.05M)配制一系列不同浓度的乙肝表面抗原(HBsAg)溶液，HBsAg溶液中HBsAg浓度分别为1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml。将配制好的不同浓度的乙肝表面抗原(HBsAg)溶液分别以400μl/min的流速注入检测池，作为实验组。另外，作为对照组，向检测池中注入1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液(PBS 7.4缓冲液配制)。分别记录各实验组和对照组的作为传感单元的有序多孔聚苯乙烯薄膜光学厚度随HBsAg溶液注入到检测池中时间变化的曲线，待有序多孔聚苯乙烯薄膜光学厚度稳定后，用PBS缓冲液进行洗脱。
将检测到的各条有序多孔聚苯乙烯薄膜光学厚度的增加值随HBsAg溶液注入到检测池中时间变化的曲线的起始上升点开始360s以内的部分分离出来，对其进行非线性拟合，得到各个浓度的结合曲线最合适的拟合公式均为指数增长模型(参见说明书附图5(A))，其公式为：
y(t)＝A(1-e-kt)
初速度为y’(t)在t＝0时的值，即y’(0)＝A*k。表1列出了测得的不同浓度的HBsAg溶液曲线拟合结果中各自的A，k，A*k，SE(标准误差)和CC(相关系数)值。根据表中的K*A数据对HBsAg浓度作图可以得到检测标准曲线图(参见说明书附图5(B))。
表1
3)检测待测HBsAg溶液浓度：称取0.0851g的HBsAg，PBS定容至100ml，得浓度为851ng/ml的HBsAg待测溶液。将此待测HBsAg溶液以400μl/min的流速注入流动池，记录曲线，待平衡后用PBS缓冲液进行洗脱。将所得结合曲线的自起始上升点开始的360s的部分分离出来，对其进行非线性拟合，根据拟合的数据中初速度A*k的具体数值对应步骤2)绘制的标准曲线图获得待测溶液的具体浓度，本实施例中测得的具体待测液浓度为850ng/ml，与实际浓度851ng/ml非常接近，相对误差仅为0.12％。
实施例2
利用本发明的生物检测仪观察戊二醛(Glutaraldehyde，GA)与人类血清中的IgG(即抗体)之间的共价偶联作用，其中传感单元为具有三维有序纳米孔的有序多孔聚苯乙烯薄膜，孔隙大小为200nm。具体步骤如下：
1)将具有三维有序纳米孔的有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片固定于检测池内，向检测池内注入一定量的无水乙醇使其充满检测池；将pH为7.4浓度为0.05M的PBS缓冲液以200μl/min的速度注入检测池，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度随时间变化曲线直至稳定；
2)配制戊二醛溶液(戊二醛溶液由pH 5.0，0.05M的PBS缓冲液配制而成，戊二醛溶液中戊二醛浓度为200mM)，将戊二醛溶液在200μl/min的流速下注入检测池，待有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化曲线稳定后，向检测池中注入与步骤1)相同的PBS缓冲液进行清洗，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化直至再次稳定；
3)向检测池中注入抗体(抗体溶液由pH 7.4，0.05M的PBS缓冲液配制而成，抗体溶液中抗体浓度为5μg/ml)，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化曲线至稳定；然后注入与步骤1)相同的PBS溶液再次清洗，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化直至再次稳定；
4)结果分析：步骤1)～3)中有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度随时间的变化曲线见附图8。如图8所示，从戊二醛的结合曲线上看，将戊二醛溶液注入检测池后，有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片的光学厚度开始有20nm的增长，达到抗体分子吸附的水平，但是戊二醛的分子量较小(为100.12)，远远不如抗体的分子量(150kDa)，何以能产生如此大的信号？这可能因为戊二醛在水溶液中会发生自身聚合而形成较大颗粒，而且颗粒结构紧密，折射率比相对松散的抗体分子要大，因此光学厚度会发生明显增长。戊二醛的结合曲线的另一特点是，当注入戊二醛溶液时，首先有一迅速的厚度增长，而后出现持续的上升，推测可能首先是戊二醛颗粒的吸附，而后是表面上的戊二醛颗粒与溶液中的戊二醛继续发生聚合，导致厚度持续增长。在接下来的洗脱过程中，结合曲线发生明显下降，最终稳定在12nm的水平，说明高浓度、短时间的戊二醛修饰有许多松散的结合，容易被洗脱下来。接下来，将抗体溶液注入检测池后，有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片通过戊二醛修饰的表面与抗体(5μg/ml)相互作用，使光学厚度曲线呈持续上升趋势，光学厚度上升速度大约为38pm/s，相互作用在30min内产生了约14nm的光学厚度增长。之后通过PBS溶液再次清洗并未发现有明显的曲线下降，可由此推断抗体的共价偶联是比较牢固的。
实施例3
利用本发明的生物检测仪观察葡球菌蛋白A(SPA)与人类血清中的IgG(抗体)之间的相互作用，其中传感单元为具有三维有序纳米孔的有序多孔聚苯乙烯薄膜，孔隙大小为200nm。具体步骤如下：
1)将具有三维有序纳米孔的有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片固定于检测池内，向检测池内注入一定量的无水乙醇使其充满检测池；将pH为7.4浓度为0.05M的PBS缓冲液以200μl/min的速度注入检测池，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度随时间变化曲线直至稳定；
2)将SPA溶液(SPA溶液由pH 9.6，0.05M的CB缓冲液配制而成，SPA溶液中SPA浓度为5μg/ml)在200μl/min的流速下注入检测池，待有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化曲线稳定后注入与步骤1)相同的PBS溶液清洗，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化直至再次稳定；
3)注入抗体溶液(抗体溶液由pH 7.4，0.05M的PBS缓冲液配制而成，抗体溶液中抗体浓度为5μg/ml)，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化曲线至稳定；注入与步骤1)相同的PBS溶液再次清洗，记录有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度变化直至再次稳定；
4)结果分析：上述光学厚度随时间的变化曲线见附图9。SPA可以通过疏水作用物理吸附到有序多孔聚苯乙烯薄膜表面，初始的SPA的吸附导致了有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片15nm的光学厚度增长，之后的PBS洗涤只引起了光学厚度1.4nm的下降，说明SPA与薄膜之间的疏水作用还是比较牢固的。接下来，加入抗体分子后，有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度缓慢上升，厚度上升速率约为20pm/s，较实施例2中戊二醛交联的结合速度更慢，SPA与抗体之间的结合接近平衡(对应光学厚度基本不再发生变化)时，有序多孔聚苯乙烯薄膜传感片光学厚度增长量约为15nm。PBS洗涤没有造成明显的抗体解离，说明SPA与抗体之间的结合也是比较牢固的。
实施例虽未穷尽通过生物检测仪可进行分析的所有生物参数，但是本领域技术人员可以预见的是，通过使用生物检测仪检测样品导致的传感单元光学厚度变化，在已公开的上述实施例基础上，仅结合自身的专业尝试即能分析其它生物参数的方法而不需要付出创造性劳动。此处由于篇幅有限，仅列举代表性的实施方式。
Claims (10)
1.一种基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，所述生物检测仪包括检测池、设置在所述检测池中的传感单元和用于检测所述传感单元反射干涉光谱的光纤光谱仪，其特征在于，所述传感单元为具有三维有序纳米孔的有序多孔薄膜，所述纳米孔的直径为20nm～500nm。
2.根据权利要求1所述的基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，其特征在于，所述有序多孔薄膜中的纳米孔相互贯通，所述有序多孔薄膜材料为二氧化硅、聚苯乙烯、掺杂BTO/ITO纳米粒子的聚苯乙烯、环氧树脂、掺杂BTO/ITO纳米粒子的环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯、掺杂BTO/ITO纳米粒子的聚甲基丙烯酸甲酯。
3.根据权利要求1所述的基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，其特征在于，所述光纤光谱仪包括宽频光源、Y型光纤束、反射探头、入射狭缝、光栅和探测器，所述宽频光源波长为400nm～1200nm。
4.根据权利要求3所述的基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，其特征在于，所述反射探头设置在所述传感单元上方或下方。
5.根据权利要求1所述的基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，其特征在于，所述生物检测仪还包括用于控制检测池内液体流动的流动注入系统、用于控制检测池内温度的温度控制系统和用于控制光纤光谱仪并分析反射干涉光谱获得所述传感单元光学厚度的控制系统。
6.根据权利要求5所述的基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，其特征在于，所述流动注入系统包括蠕动泵。
7.根据权利要求5所述的基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪，其特征在于，所述控制系统分析反射干涉光谱获得所述传感单元光学厚度变化的方法包括以下步骤：
1)获得所述传感单元的反射干涉光谱；
2)根据步骤1)获得的反射干涉光谱，使用单峰拟合或多峰拟合方法获得所述传感单元光学厚度随时间的变化曲线。
8.一种使用权利要求1～7中任意一项所述的基于有序多孔纳米结构薄膜干涉效应的生物检测仪进行生物分子检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)对所述有序多孔薄膜进行修饰，使所述有序多孔薄膜能够吸附待测生物分子；当待测样品为复杂样本时，所述修饰是指使所述有序多孔薄膜能够特异性吸附所述待测生物分子的过程；
2)向检测池中注入待测样品溶液，检测所述有序多孔薄膜光学厚度随时间的变化曲线；
3)根据步骤2)检测得到的所述有序多孔薄膜光学厚度随时间的变化曲线对待测生物分子进行定性或定量分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述对待测生物分子进行定性或定量分析包括分析待测样品溶液中生物分子的浓度、生物分子附着速率、生物分子相互作用或生物分子几何尺寸的变化。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述检测所述有序多孔薄膜光学厚度随时间的变化曲线的方法包括以下步骤：
1)获得所述传感单元的反射干涉光谱；
2)根据步骤1)获得的反射干涉光谱，使用单峰拟合或多峰拟合方法获得所述传感单元光学厚度。
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