CN103558184A

CN103558184A - 一种基于多孔硅非标记实时在线检测霍乱毒素的方法

Info

Publication number: CN103558184A
Application number: CN201310446443.9A
Authority: CN
Inventors: 李建林; 李玮; 徐坤; 曹斌; 孙越; 徐杰; 蒋云坤; 郑铁松
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2013-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-09-26
Also published as: CN103558184B

Abstract

本发明涉及一种基于多孔硅非标记实时在线检测霍乱毒素的方法。该方法利用多孔硅为传感基底，在多孔硅表面修饰疏水基团后，通过疏水性相互作用固定脂质体和单唾液酸神经节苷脂，当样品中含有霍乱毒素时，单唾液酸神经节苷脂(GM1)特异的结合毒素分子，利用多孔硅的反射干涉光谱，经过傅里叶红外转化后，实时非标记检测多孔硅有效薄膜的厚度变化，对霍乱毒素进行定量和定性检测。该方法可以对霍乱毒素实时在线检测，最低检测限为1nM，该传感基底可以重复使用。

Description

一种基于多孔硅非标记实时在线检测霍乱毒素的方法

技术领域

本发明设计食品中的霍乱毒素快速、低成本、非标记实时在线检测技术方法。具体通过对多孔硅表面进行疏水性修饰，通过疏水性相互作用将脂质体和单唾液酸神经节苷脂固定于硅片的表面，利用多孔硅的反射干涉光谱，经过傅里叶红外转化后，实时非标记检测多孔硅有效薄膜的厚度变化，来检测食品中的霍乱毒素。

背景技术

霍乱毒素是由霍乱弧菌产生的一种细胞内毒素。一般它由具有催化功能A亚基和具有识别功能的5个B亚基组成。人和畜如果食了被霍乱毒素污染的食物或饲料，会引起中毒，甚至死亡等严重的后果。对霍乱毒素的快速定量检测对保障食品安全具有重要的意义。其次，霍乱毒素和其受体单唾液酸神经节苷脂的结合动力学是研究许多疾病发生的原理，药物作用机理，炎症发生的机理等中重要的生物模型。然而，直接监控霍乱毒素和其受体单唾液酸神经节苷脂相互作用的技术，还受到很大的限制和挑战。尤其是膜结合蛋白，纯化和分离这些活性蛋白，会使其失去活性，因此，开发直接检测霍乱毒素和其受体单唾液酸神经节苷脂相互作用的监控技术方法具有重要意义。

目前，几个技术和方法用于霍乱毒素和其受体单唾液酸神经节苷脂相互作用研究：主要包括蛋白质或脂质体的标记技术，非标记技术和人工膜技术。虽然，荧光标记蛋白或脂质体技术能够提供敏感检测限，但是，探针的修饰和信号的检测非常麻烦和费时。在云母，硅片，玻璃等界面上构建人工磷脂单层或双层膜技术也被用于检测霍乱毒素和其受体单唾液酸神经节苷脂相互作用。传统的生物膜模型是在平面上支撑磷脂双层的形成。这些生物膜通常应用原子力学显微镜和荧光显微镜进行控制和观察。但是，原子力学显微镜常常受到针尖-基底的相互作用影响很难在短时范围内测量薄膜特性的变化。光学非标记技术包括表面等离子共振技术，压电晶体共振技术，椭圆偏振技术，光学干涉技术等也被用于它们研究。但是，大部这些技术涉及到复杂的光路系统，温度控制系统或者金属增强表面层。

电化学刻蚀的多孔硅光学反射干涉系统已经被证实是一个灵敏，简单，方便的非标记技术，在生物传感，药物输送和疾病诊断等方面具有广阔的应用前景。它具有巨大的表面积，纳米孔径可控制备，表面容易修饰和生物分子兼容性良好等优点。我们应用多孔硅作为磷脂支撑表面，构建了人工单层薄膜，进行非标记实时高灵敏在线检测霍乱毒素。这一技术方法为研究霍乱毒素和其受体单唾液酸神经节苷脂相互作用提供了新的方法。

发明内容

本发明目的在于开发一种高灵敏度、低成本、实时在线检测食品中霍乱毒素新技术，以替代传统检测的方法。

本发明的原理如图1所示，该方法利用多孔硅为传感基底，在多孔硅表面修饰疏水基团后，通过疏水性相互作用固定脂质体和单唾液酸神经节苷脂形成恒定光学厚度的多孔硅薄膜；当样品中含有霍乱毒素时，单唾液酸神经节苷脂特异的结合毒素分子，从而引起多孔硅光学反射干涉光谱的红移（多孔硅薄膜光学厚度改变），根据薄膜的光学厚度是否发生红移以及红移的量进而对霍乱毒素进行定量和定性检测。该方法可以对霍乱毒素实时在线检测，最低检测限为1nM，该传感基底可以重复使用。

本发明所用多孔硅，是通过电化学刻蚀技术制备。脂质体微球和单唾液酸神经节苷脂通过挤压是采用脂质体挤压器，检测信号通过多孔硅反射干涉光谱仪获取。

本发明所述的一种基于多孔硅非标记实时在线检测霍乱毒素的方法，是利用多孔硅为传感基底，在多孔硅表面修饰疏水基团后，通过疏水性相互作用固定脂质体和单唾液酸神经节苷脂，形成恒定光学厚度的多孔硅薄膜；加入样品后对多孔硅薄膜的光学厚度进行监控，根据薄膜的光学厚度是否发生红移以及红移的量对样品中的霍乱毒素进行定性和定量检测；该方法用于非诊断目的。

上述方法具体包括以下步骤：

（1）电化学法制备多孔硅；

（2）多孔硅的的修饰：通过1H，1H，2H-全氟-1-癸烯在140℃，氮气保护下进行硅表面疏水性修饰；

（3）用磷脂挤压器制备脂质体-单唾液酸神经节苷脂纳米混合物，

（4）脂质体和单唾液酸神经节苷脂(GM1)的固定：通过疏水性相互作用在经步骤（2）修饰的多孔硅表面固定脂质体-单唾液酸神经节苷脂；并通过光纤光谱仪监控固定过程中多孔硅薄膜光学厚度的随时间变化，直到薄膜光学厚度达到恒定；

（5）用磷酸盐缓冲液，洗涤多余的脂质体和单唾液酸神经节苷脂；

（6）检测：将样品通过步骤（4）中已固定了脂质体和单唾液酸神经节苷脂的多孔硅，并监控多孔硅薄膜光学厚度的随时间变化，直到薄膜光学厚度达到恒定；将监控结果与步骤（4）得到的恒定薄膜光学厚度比较，对样品中霍乱毒素进行定性和（或）定量。

步骤（1）中所述电化学法的条件为：刻蚀液采用氢佛酸：无水乙醇，体积比为3:1；电流敏度为486mA/cm²，刻蚀时间为10s。

步骤（3）中单唾液酸神经节苷脂和脂质体微球摩尔比例为1:40，挤压通过50nm孔径的聚碳酸酯薄膜21次。

本发明采用热化学方法在多孔硅表面修饰全氟-1-癸烯疏水性基团，通过疏水性相互作用将脂质体体和单唾液酸神经节苷脂固定于硅片的表面，利用多孔硅的反射干涉光谱，经过傅里叶红外转化后，实时非标记检测多孔硅有效薄膜的厚度变化，来检测食品中的霍乱毒素。检测灵敏度达到1nM，检测时间5小时，可以实时在线对霍乱毒素进行检测，本发明也可以使用其他细胞膜基受体和配体的在线非标记监控和相互作用的研究。

附图说明

图1基于多孔硅在线检测霍乱毒素原理图；

图2修饰全氟-1-癸烯疏水性基团多孔硅的光学特性；

图3修饰全氟-1-癸烯疏水性基团多孔硅的光学稳定性；

图4在线检测脂质体微球在疏水性多孔硅的固定和形成(a，薄膜有效光学厚度随时间的变化b)，傅里叶转化后峰的振幅随时间的变化；

图5霍乱毒素的非标记在线检测；

图6在线非标记检测霍乱毒素特异性检测1，(a，整个在线过程中薄膜有效光学厚度随时间的变化b)，磷酸盐缓冲液洗涤后，加入霍乱毒素，再用磷酸盐缓冲液洗涤后薄膜有效光学厚度的变化；

图7在线非标记检测霍乱毒素特异性检测2，(c，整个在线过程中薄膜有效光学厚度随时间的变化d)，磷酸盐缓冲液洗涤后，加入牛血清蛋白，再用磷酸盐缓冲液洗涤后薄膜有效光学厚度的变化；;

图8在线非标记检测不同浓度霍乱毒素响应图。

具体实施方式

本发明所用霍乱毒素B亚甲基标准品，牛血清蛋白，1H，1H，2H-全氟-1-癸烯，单唾液酸神经节苷脂，购自于Sigma公司。大豆磷脂购自Avanti Polar Lipids公司。硅片(0.0008-0.0012Ω-cm，(100)，硼参杂)购自于Siltronix公司。磷酸盐缓冲米诺购于上海生工有限公司。

本发明所用的仪器主要有：

NJ320脉冲刻蚀仪，厦门纳精分析仪器有限公司

控温马福炉，南京大学仪器厂

臭氧发生器广州环伟环保科技有限公司

Y型光纤，海洋光学公司

钨灯光源，海洋光学公司

USB-2000光纤光谱仪，海洋光学公司

LSP01-1A微流注射泵河北保定兰格恒流泵有限公司

avanti脂质体挤压器，Avanti Polar Lipids公司

QL-866漩涡混合仪海门麒麟医用仪器厂

SW-CJ-2净化工作台苏州净化仪器有限公司

QL-866漩涡混合仪海门麒麟医用仪器厂

实施例1薄膜的疏水性和稳定性验证

（1）首先，将硅片通过电化学刻蚀法制备多孔硅，刻蚀液为氢佛酸：无水乙醇（体积比为3:1），电流敏度为486mA/cm2，刻蚀时间为10s。

（2）通过1H，1H，2H-全氟-1-癸烯在140℃，氮气保护下进行硅表面疏水性修饰2小时。得经疏水性修饰的硅片。

（3）经疏水性修饰的硅片被固定于通过聚碳酸酯流式槽底部，Y型光纤垂直于流式槽表面，反射干涉光谱通过光纤获得，每6秒记录一个数据，通过OigorPro软件傅里叶转换为一个反射峰光谱，以时间为横坐标轴，反射光谱强度为纵坐标，绘制在线检测多孔硅薄膜厚度。

（4）薄膜的疏水特性：通过微流泵将PH7.4的磷酸盐缓冲液循环输送在聚碳酸酯流式槽，流速每秒0.7mL/min，5分钟后，切断缓冲液的供应，2-3分钟后继续供应，连续监控薄膜光学厚度的变化，见图2。

（5）薄膜的稳定性：通过微流泵将PH7.4的磷酸盐缓冲液循环输送在聚碳酸酯流式槽，流速每秒0.7mL/min，连续240分钟，连续监控薄膜光学厚度的变化，以时间为横坐标，光学厚度的变化为纵坐标绘制随时间变化，薄膜光学厚度的变化，见图3。

薄膜的疏水性和稳定性得到验证。

实施例2

步骤（1）-（3）同实施例1，

（4）用脂质体挤压器制备脂质体-单唾液酸神经节苷脂纳米混合物；单唾液酸神经节苷脂和脂质体微球摩尔比例为1:40，挤压通过50nm孔径的聚碳酸酯薄膜21次。

（5）脂质体和单唾液酸神经节苷脂的固定。通过疏水性相互作用在多孔硅表面固定脂质体-单唾液酸神经节苷脂。具体是流式槽先经过去离子水洗涤15-20分钟，再经过pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤5分钟，接着，0.1mg/mL的脂质体和单唾液酸神经节苷脂混合液通过流式槽，直到薄膜光学厚度达到一个稳定值，见图4。

（6）霍乱毒素的非标记在线检测：通过pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤5分钟试样（含霍乱毒素溶液）后，1nM霍乱毒素溶液的磷酸盐溶液经过微流泵循环在流式槽中，直到薄膜的光学厚度达到一个稳定值，见图5。随着时间的进行，薄膜的光学厚度增加，经过一段时间后，薄膜厚度达到稳定的数值。

按照步骤（6）分别将含有不同浓度霍乱毒素溶液的磷酸盐溶液经过微流泵循环在流式槽中，直到薄膜的光学厚度达到一个稳定值，以时间为横坐标，引起的薄膜光学厚度变化为纵坐标绘制实时检测霍乱毒素的监控曲线见图8。。由图8可见，随着时间的进行，不同霍乱毒素分子会引起薄膜光学厚度的变化，在5-6小时后各浓度引起的光学厚度变化趋于恒定，反应结束，光学厚度的变化量和霍乱毒素有一定的数学关系，从而，可以进行定量检测霍乱毒素。

实施例3：特异性检测

特异性检测1：与实施例2基本相同，不同之处在于将不含单唾液酸神经节苷脂的脂质体微球按照固定于经疏水性修饰的硅片（多孔硅薄膜），再按照（6）进行检测，试样中含20nM霍乱毒素，见图6。由图6可见，20nM霍乱毒素引入后，薄膜的光学厚度没有发生红移，这是由于薄膜表面没有霍乱毒素的受体，霍乱毒素没有结合到薄膜的表面而引起薄膜折射率的改变。

特异性检测2：与实施例2基本相同，不同之处在于试样为含有20nM牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（不含霍乱毒素）经过微流泵循环在流式槽中，监控薄膜光学厚度的变化，见图7。由图7可见，20nM牛血清白蛋白引入后，薄膜的光学厚度也没有发生红移，这是由于牛血清白蛋白没有和薄膜表面的霍乱毒素的受体反应而引起薄膜折射率的改变。

Claims

1.一种基于多孔硅非标记实时在线检测霍乱毒素的方法，其特征在于该方法利用多孔硅为传感基底，在多孔硅表面修饰疏水基团后，通过疏水性相互作用固定脂质体和单唾液酸神经节苷脂，形成恒定光学厚度的多孔硅薄膜；加入样品后对多孔硅薄膜的光学厚度进行监控，根据薄膜的光学厚度是否发生红移以及红移的量对样品中的霍乱毒素进行定性和定量检测；该方法用于非诊断目的。

2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

（1）电化学法制备多孔硅；

（6）检测：将样品通过步骤（4）中已固定了脂质体和单唾液酸神经节苷脂的多孔硅，并监控多孔硅薄膜光学厚度的随时间变化，直到薄膜光学厚度达到恒定；将监控结果与步骤（4）得到的恒定薄膜光学厚度比较，对样品中霍乱毒素进行定性和/或/定量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述电化学法的条件为：刻蚀液采用氢佛酸：无水乙醇，体积比为3:1；电流敏度为486mA/cm²，刻蚀时间为10s。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在步骤（3）中单唾液酸神经节苷脂和脂质体摩尔比例为1:40，挤压通过50nm孔径的聚碳酸酯薄膜21次。