CN109557298B - 一种多功能生物芯片的制备方法 - Google Patents

一种多功能生物芯片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多功能生物芯片的制备方法，包括如下步骤：步骤一：制作胶黏层，得到具有通孔的胶黏层；步骤二：将胶黏层固定在基底上；步骤三：通过胶黏层将AAO膜固定在基座上，且胶黏层通孔位置与AAO膜中心点重合；步骤四：在AAO膜上沉积金纳米颗粒；步骤五：在基底上取下带有金纳米颗粒的Au‑AAO膜；步骤六：在Au‑AAO膜带有金纳米颗粒的一侧滴加PEG缓冲溶液；步骤七：将滴加有PEG缓冲液的Au‑AAO膜避光保存后得到用于修饰生物分子后制成生物芯片的PEG‑Au‑AAO膜。本发明制备的生物芯片可在分离特定蛋白或细胞外囊泡的同时，对其进行快速的检测，简单高效；而且制备过程无有机化学试剂的使用，避免了对蛋白、细胞外囊泡的污染，可保存其生物活性，满足生物应用领域的使用要求。

Description

一种多功能生物芯片的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生产方法，更具体的说是涉及一种多功能生物芯片的制备方法。
背景技术
癌症是严重影响人类生活质量、威胁人类健康的疾病之一，如何有效地对癌症进行早期检测及治疗，依然是亟待解决的问题。传统的检测方法是基于细胞和组织的病理学检测，需要采用手术或穿刺的手段从患者身上获取相应的病变组织，不可避免地对患者造成一定的伤害。并且，某些癌症的早期症状不明显，极易错过最佳的治疗时间。近年来研究者发现，体液(如血液、唾液、腹腔液等)中的某些特定生物大分子和细胞外囊泡(如外泌体、微泡等)的动态变化能反映癌症的状态和发展，可用于癌症的早期诊断、预后判断及治疗效果的检测。但该方法的关键是开发一种有效可靠的分离、检测特定生物大分子和细胞外囊泡的方法。
分离肿瘤相关的特定生物大分子和细胞外囊泡的主要方法有离心法、沉淀法、透析法、过滤法、层析法和电泳法等。这些方法各具优点和特色，均可在一定程度上实现待测物的的分离。待测物分离后，还需额外的步骤对其进行转移、检测，以达到定性或者定量分析的目的。这些都不可避免地存在操作步骤繁琐、耗时长、产量低等问题。因而，本领域仍然需要开发一种简便可行的、可同时对体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中的特定生物大分子(蛋白质、多糖、糖蛋白)或者细胞外囊泡进行分离和检测的器件和方法。生物芯片在生物、化学、医学检测中广泛使用，利用生物芯片可以实现待检测的快速、高通量的检测。对生物芯片表面的结构、形貌和光学特性的改造，可提高对待测物的检测灵敏度和特异性，而现有技术中缺乏准确有效的方法对生物芯片表面的结构、形貌和光学特性进行有效的改造。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种简便可行的对生物芯片的结构、形貌和光学特性进行有效改造的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种多功能生物芯片的制备方法，包括如下步骤：
一种多功能生物芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：制作胶黏层，得到具有通孔的胶黏层；
步骤二：将胶黏层固定在基底上；
步骤三：通过胶黏层将AAO膜固定在基座上，且胶黏层通孔位置与AAO膜中心点重合；
步骤四：在AAO膜上沉积金纳米颗粒；
步骤五：在基底上取下带有金纳米颗粒的Au-AAO膜；
步骤六：在Au-AAO膜带有金纳米颗粒的一侧滴加PEG缓冲溶液；
步骤七：将滴加有PEG缓冲液的Au-AAO膜避光保存后得到用于修饰生物分子后制成生物芯片的PEG-Au-AAO膜。
作为本发明的进一步改进：
所述步骤六为在Au-AAO膜带有金纳米颗粒的一侧滴加PEG缓冲溶液，之后再取另一Au-AAO膜的将具有金纳米颗粒的一面覆盖在PEG缓冲溶液上，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体，并避光保存；
所述步骤七为避光保存后的复合体，用镊子分开，得到用于修饰生物分子后制成生物芯片的PEG-Au-AAO膜。
作为本发明的进一步改进：
所述步骤一中的胶粘层为双面胶。
作为本发明的进一步改进：
所述步骤一中通孔的打孔步骤为采用打孔器在双面胶上打孔，在双面胶上形成孔径为3～5mm的通孔。
作为本发明的进一步改进：
所述步骤三中所述沉积方式为电子束蒸镀，且蒸镀参数为电流100～200mA、电压为1～4V、样品转速为5～20rpm、沉积时间为5～60min。
作为本发明的进一步改进：
所述步骤二中的基底为硅片、载玻片、盖玻片、聚甲基丙烯酸酯薄膜、聚四氟乙烯薄膜和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜中的一种或多种。
作为本发明的进一步改进：
所述步骤五中的PEG缓冲液的体积为40～100μl。
作为本发明的进一步改进：
所述步骤五中避光保存的时间为2～4h。
作为本发明的进一步改进：
还包括有步骤八：将步骤七所获得的PEG-Au-AAO膜进行修饰。
作为本发明的进一步改进：所述步骤八中修饰方法为抗体的修饰、凝集素的修饰和/或糖链的修饰中的一种或多种。
本发明的有益效果，本发明创造性地提出了一种多功能生物芯片的制备方法。本发明方法制备的生物芯片中的金纳米颗粒具有类桑葚的仿生结构，具有更大的比表面积，可提供更多的活性位点，为后续蛋白、抗体、凝集素或糖链的修饰提供了有利条件。本发明制备的生物芯片可在分离特定蛋白或细胞外囊泡的同时，对其进行快速的检测，避免了后续其他繁琐的步骤，简单高效；而且制备过程无有机化学试剂的使用，避免了对蛋白、细胞外囊泡的污染，可保存其生物活性，满足生物应用领域的使用要求。本发明采用了多孔薄膜结构，采用离心或者真空手段，样本能通过薄膜结构，使得修饰上的分子能充分与样本中代测物接触结合，有利于提高分离效率，提高检测灵敏度和特异性，同时非特异结合的物质能被过滤，这也能有益地降低生物芯片的背景干扰。
作为本发明的关键，其中的PEG主要提供一种桥键的作用，用来连接生物分子和金纳米颗粒，另外本发明方法得到的金纳米颗粒具有类桑葚结构的仿生结构，与传统的金纳米颗粒相比，具有更大的比表面积，可提供更多的活性位点。而且，本发明的方法在保证较好的金纳米颗粒质量的前提下，可避免对金纳米颗粒的化学污染，满足材料化工和生物医用领域的使用要求。
附图说明：
图1为本发明金纳米颗粒的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围，本发明主要提供了以下6种实施方式。
实施例1
一种多功能生物芯片的制备方法，其步骤为：
1)采用打孔器在双面胶上进行打孔，获得具有3mm孔径的双面胶；
2)将步骤1)得到的具有3mm孔径的双面胶固定在聚甲基丙烯酸甲酯薄膜上，得到带有3mm孔径的双面胶的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜；
3)将单通道的孔径为50nm的AAO膜固定在步骤2)得到的带有3mm孔径的双面胶的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜上，得到带有孔径为50nm的AAO膜的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜，其中AAO膜的中心点与双面胶上小孔的中心点重合；
4)将步骤3)得到的带有孔径为50nm的AAO膜的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜上沉积50min的金，得到金纳米颗粒；
5)用镊子将孔径为50nm的AAO膜从步骤4)得到的聚甲基丙烯酸甲酯薄膜上取下，得到已沉积金纳米颗粒的AAO膜，即Au-AAO膜；
6)将步骤5)得到的Au-AAO膜的表面滴加80μl的PEG缓冲液，并在其上覆盖另一片相同的步骤5)得到的Au-AAO膜，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体；
7)将步骤6)得到的Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体避光保存3.5h；
8)将步骤7)避光保存后的复合体，用镊子分开，得到两片相同的经PEG修饰的Au-AAO膜，即PEG-Au-AAO膜；
9)将特定分子的抗体修饰于步骤8)得到的PEG-Au-AAO膜表面，制备得到用于分离和检测体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中特定分子的生物芯片，上述实施方式可有效的基于单通道的孔径为50nm的AAO膜制作出符合要求的生物芯片。
实施例2
一种多功能生物芯片的制备方法，其步骤为：
1)采用打孔器在双面胶上进行打孔，获得具有4mm孔径的双面胶；
2)将步骤1)得到的具有4mm孔径的双面胶固定在聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上，得到带有4mm孔径的双面胶的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜；
3)将双通道的孔径为20nm的AAO膜固定在步骤2)得到的带有4mm孔径的双面胶的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上，得到带有孔径为20nm的AAO膜的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜，其中AAO膜的中心点与双面胶上小孔的中心点重合；
4)将步骤3)得到的带有孔径为20nm的AAO膜的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上沉积60min的金，得到金纳米颗粒；
5)用镊子将孔径为20nm的AAO膜从步骤4)得到的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上取下，得到已沉积金纳米颗粒的AAO膜，即Au-AAO膜；
6)将步骤5)得到的Au-AAO膜的表面滴加100μl的PEG缓冲液，并在其上覆盖另一片相同的步骤5)得到的Au-AAO膜，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体；
7)将步骤6)得到的Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体避光保存4h；
8)将步骤7)避光保存后的复合体，用镊子分开，得到两片相同的经PEG修饰的Au-AAO膜，即PEG-Au-AAO膜；
9)将细胞外囊泡表面特征分子的抗体修饰于步骤8)得到的PEG-Au-AAO膜表面，制备得到用于分离和检测体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中细胞外囊泡(如外泌体)的生物芯片，上述实施方式可有效的基于双通道的孔径为20nm的AAO膜制作出符合要求的生物芯片。
实施例3
一种多功能生物芯片的制备方法，其步骤为：
1)采用打孔器在双面胶上进行打孔，获得具有5mm孔径的双面胶；
2)将步骤1)得到的具有5mm孔径的双面胶固定在硅片上，得到带有5mm孔径的双面胶的硅片；
3)将单通道的孔径为100nm的AAO膜固定在步骤2)得到的带有5mm孔径的双面胶的硅片上，得到带有孔径为100nm的AAO膜的硅片，其中AAO膜的中心点与双面胶上小孔的中心点重合；
4)将步骤3)得到的带有孔径为100nm的AAO膜的硅片上沉积30min的金，得到金纳米颗粒；
5)用镊子将孔径为100nm的AAO膜从步骤4)得到的硅片上取下，得到已沉积金纳米颗粒的AAO膜，即Au-AAO膜；
6)将步骤5)得到的Au-AAO膜的表面滴加60μl的PEG缓冲液，并在其上覆盖另一片相同的步骤5)得到的Au-AAO膜，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体；
7)将步骤6)得到的Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体避光保存3h；
8)将步骤7)避光保存后的复合体，用镊子分开，得到两片相同的经PEG修饰的Au-AAO膜，即PEG-Au-AAO膜；
9)将凝集素修饰于步骤8)得到的PEG-Au-AAO膜表面，制备得到用于分离和检测体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中多糖或者糖基化的生物芯片，上述实施方式可有效的基于单通道的孔径为100nm的AAO膜制作出符合要求的生物芯片。
实施例4
一种多功能生物芯片的制备方法，其步骤为：
1)采用打孔器在双面胶上进行打孔，获得具有3mm孔径的双面胶；
2)将步骤1)得到的具有3mm孔径的双面胶固定在载玻片上，得到带有3mm孔径的双面胶的载玻片；
3)将双通道的孔径为200nm的AAO膜固定在步骤2)得到的带有3mm孔径的双面胶的载玻片上，得到带有孔径为200nm的AAO膜的载玻片，其中AAO膜的中心点与双面胶上小孔的中心点重合；
4)将步骤3)得到的带有孔径为200nm的AAO膜的载玻片片上沉积10min的金，得到金纳米颗粒；
5)用镊子将孔径为200nm的AAO膜从步骤4)得到的载玻片上取下，得到已沉积金纳米颗粒的AAO膜，即Au-AAO膜；
6)将步骤5)得到的Au-AAO膜的表面滴加40μl的PEG缓冲液，并在其上覆盖另一片相同的步骤5)得到的Au-AAO膜，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体；
7)将步骤6)得到的Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体避光保存2h；
8)将步骤7)避光保存后的复合体，用镊子分开，得到两片相同的经PEG修饰的Au-AAO膜，即PEG-Au-AAO膜；
9)将多糖分子修饰于步骤8)得到的PEG-Au-AAO膜表面，制备得到用于分离和检测体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中与多糖分子相互作用蛋白的生物芯片，通过上述实施方式，可以有效的基于双通道的孔径为200nm的AAO膜的基础上制作出符合要求的生物芯片。
实施例5
一种多功能生物芯片的制备方法，其步骤为：
1)采用打孔器在双面胶上进行打孔，获得具有4mm孔径的双面胶；
2)将步骤1)得到的具有4mm孔径的双面胶固定在聚四氟乙烯薄膜上，得到带有4mm孔径的双面胶的聚四氟乙烯薄膜；
3)将单通道的孔径为200nm的AAO膜固定在步骤2)得到的带有4mm孔径的双面胶的聚四氟乙烯薄膜上，得到带有孔径为200nm的AAO膜的聚四氟乙烯薄膜，其中AAO膜的中心点与双面胶上小孔的中心点重合；
4)将步骤3)得到的带有孔径为200nm的AAO膜的聚四氟乙烯薄膜上沉积15min的金，得到金纳米颗粒；
5)用镊子将孔径为200nm的AAO膜从步骤4)得到的聚四氟乙烯薄膜上取下，得到已沉积金纳米颗粒的AAO膜，即Au-AAO膜；
6)将步骤5)得到的Au-AAO膜的表面滴加50μl的PEG缓冲液，并在其上覆盖另一片相同的步骤5)得到的Au-AAO膜，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体；
7)将步骤6)得到的Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体避光保存2.5h；
8)将步骤7)避光保存后的复合体，用镊子分开，得到两片相同的经PEG修饰的Au-AAO膜，即PEG-Au-AAO膜；
9)将细胞外囊泡表面特征分子的抗体修饰于步骤8)得到的PEG-Au-AAO膜表面，制备得到用于分离和检测体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中细胞外囊泡(如微泡)的生物芯片，通过上述实施方式，可以有效的基于单通道的孔径为200nm的AAO膜的基础上制作出符合规定的生物芯片。
实施例6
一种多功能生物芯片的制备方法，其步骤为：
1)采用打孔器在双面胶上进行打孔，获得具有5mm孔径的双面胶；
2)将步骤1)得到的具有5mm孔径的双面胶固定在盖玻片上，得到带有5mm孔径的双面胶的盖玻片；
3)将双通道的孔径为100nm的AAO膜固定在步骤2)得到的带有5mm孔径的双面胶的盖玻片上，得到带有孔径为100nm的AAO膜的盖玻片，其中AAO膜的中心点与双面胶上小孔的中心点重合；
4)将步骤3)得到的带有孔径为100nm的AAO膜的盖玻片上沉积5min的金，得到金纳米颗粒；
5)用镊子将孔径为100nm的AAO膜从步骤4)得到的盖玻片上取下，得到已沉积金纳米颗粒的AAO膜，即Au-AAO膜；
6)将步骤5)得到的Au-AAO膜的表面滴加80μl的PEG缓冲液，并在其上覆盖另一片相同的步骤5)得到的Au-AAO膜，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体；
7)将步骤6)得到的Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体避光保存3h；
8)将步骤7)避光保存后的复合体，用镊子分开，得到两片相同的经PEG修饰的Au-AAO膜，即PEG-Au-AAO膜；
9)将特定分子的抗体修饰于步骤8)得到的PEG-Au-AAO膜表面，制备得到用于分离和检测体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中特定分子的生物芯片，通过以上实施方式，就可以在基于双通道的孔径为100nm的AAO膜的基础上有效的制作出符合规定的生物芯片。
由此通过上述6个实施方式的设置，便可以有效的以不同规格的AAO膜为基础加工出符合条件的生物芯片，如此使得本方法的适用性大大增强，更加容易制作出可同时对体液(如血液、唾液、腹腔液等)、组织裂解液中的特定生物大分子(蛋白质、多糖、糖蛋白)或者细胞外囊泡进行分离和检测的生物芯片。
其中仅纳米颗粒沉积过程中，对金纳米颗粒进行扫描电镜扫描，扫描电镜选用Hitachi SU8010，测试电压为5～20kV。
具体扫描电镜图像如图1所示。
沉积方式为电子束蒸镀，且蒸镀参数为电流100～200mA、电压为1～4V、样品转速为5～20rpm。
在金纳米颗粒进行扫描电镜成像前先经过前处理，前处理步骤具体如下：
将已沉积金纳米颗粒的AAO膜置于NaOH水溶液中一定时间，得到金纳米颗粒的悬浮液；NaOH水溶液的摩尔浓度为0.1～1Mol/L。
得到的金纳米颗粒的悬浮液进行离心-去离子水清洗-离心，得到一定粒径的仿生结构的金纳米颗粒。
综上所述，创造性地提出了一种多功能生物芯片的制备方法。本发明方法制备的生物芯片中的金纳米颗粒具有类桑葚的仿生结构，具有更大的比表面积，可提供更多的活性位点，为后续蛋白、抗体、凝集素或糖链的修饰提供了有利条件。本发明制备的生物芯片可在分离特定蛋白或细胞外囊泡的同时，对其进行快速的检测，避免了后续其他繁琐的步骤，简单高效；而且制备过程无有机化学试剂的使用，避免了对蛋白、细胞外囊泡的污染，可保存其生物活性，满足生物应用领域的使用要求。本发明采用了多孔薄膜结构，采用离心或者真空手段，样本能通过薄膜结构，使得修饰上的生物分子能充分与样本中代测物接触结合，有利于提高分离效率，提高检测灵敏度和特异性，同时非特异结合的物质能被过滤，这也能有益地降低生物芯片的背景干扰，总体上讲，本发明的方法适用性强，较为简单，易于操作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种多功能生物芯片的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：制作胶黏层，得到具有通孔的胶黏层；
步骤二：将胶黏层固定在基底上；
步骤三：通过胶黏层将AAO膜固定在基座上，且胶黏层通孔位置与AAO膜中心点重合；
步骤四：在AAO膜上沉积金纳米颗粒；
步骤五：在基底上取下带有金纳米颗粒的Au-AAO膜；
步骤六：在Au-AAO膜带有金纳米颗粒的一侧滴加PEG缓冲溶液，所述PEG用于连接生物分子和金纳米颗粒；之后再取另一Au-AAO膜，将其具有金纳米颗粒的一面覆盖在PEG缓冲溶液上，得到Au-AAO膜/PEG/Au-AAO膜复合体，并避光保存；
步骤七：将步骤六避光保存后的复合体，用镊子分开，得到用于修饰生物分子后制成生物芯片的PEG-Au-AAO膜；
步骤八：将步骤七所获得的PEG-Au-AAO膜进行修饰；
所述步骤四中沉积方式为电子束蒸镀，且蒸镀参数为电流100～200mA、电压为1～4V、样品转速为5～20rpm、沉积时间为5～60min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一中的胶黏层为双面胶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤一中通孔的打孔步骤为采用打孔器在双面胶上打孔，在双面胶上形成孔径为3～5mm的通孔。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤二中的基底为硅片、载玻片、盖玻片、聚甲基丙烯酸酯薄膜、聚四氟乙烯薄膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤六中的PEG缓冲液的体积为40～100μl。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤六中避光保存的时间为2～4h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤八中修饰方法为抗体的修饰、凝集素的修饰、糖链的修饰中的一种或多种。
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