CN103145566B

CN103145566B - 一种莱克多巴胺人工抗原及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103145566B
Application number: CN201310078328.0A
Authority: CN
Inventors: 沈建忠; 王战辉; 史为民; 张素霞; 梁琦; 江海洋; 曹兴元; 丁双阳; 李建成
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: CN103145566A

Abstract

本发明公开了一种莱克多巴胺人工抗原及其制备方法与应用。该抗原是将莱克多巴胺半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原；所述莱克多巴胺半抗原其结构如式I所示。本发明所提供的莱克多巴胺人工抗原可用于莱克多巴胺特异性抗体的制备，以及用于莱克多巴胺药物残留的检测等领域；实验证明，将所述莱克多巴胺人工抗原免疫动物，可获得灵敏度高、特异性强的抗血清。

Description

一种莱克多巴胺人工抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种莱克多巴胺人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

莱克多巴胺是一种医药原料，具有广泛的生理效应，可用治疗充血性心力衰竭症的强心药，且常用于支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病的治疗。当其用量增加到临床用量的5-10倍时，可增加肌肉生长，减少脂肪蓄积，是良好的营养分配剂和生长促进剂。美国FDA在2000年批准，可以用于动物营养重新配剂，广泛地用于畜牧业和养殖业。可以同时提高动物的日增重，提高饲料利用率，提高动物的蛋白质含量。但是其在动物体内的残留一旦经食物链进入人体，会对食用者产生巨大危害，特别对心脏病、糖尿病、高血压、甲亢、青光眼、前列腺肥大等病人危害更大，甚至死亡，如瘦肉精（莱克多巴胺是“瘦肉精药物”中的一种）在上海曾经引发几百人的中毒事件；在台湾由于从美国进口的猪肉里含有瘦肉精，几乎挑起一场政治争端。目前我国禁止将β-激动剂等药物动物促生长剂使用。但长期以来，各种因非法使用β-激动剂而造成的中毒事件时有发生。为打击非法用药，保护消费者的健康与安全，迫切需要健全相关的检测方法。

目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在莱克多巴胺的残留检测中起着越来越重要的作用。

影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种莱克多巴胺人工抗原及其制备方法与应用。

本发明所提供的莱克多巴胺人工抗原是在莱克多巴胺半抗原的基础上构建所得的抗原。

所述莱克多巴胺半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式I所示。

式I

本发明的再一个目的是提供一种制备所述莱克多巴胺半抗原的方法。

本发明所提供的制备所述莱克多巴胺半抗原的方法，具体可包括如下步骤：将莱克多巴胺、N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、水合肼按照摩尔比为1：1：5的比例进行反应，获得所述化合物。

所述反应中，所述莱克多巴胺与所述N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺先在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，以三乙胺为催化剂进行反应，获得反应中间体；再将所述中间体与所述水合肼在乙醇中反应，获得所述克多巴胺半抗原。

更加具体的，所述莱克多巴胺半抗原的制备方法如下：向莱克多巴胺的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中边搅拌边加入N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺，莱克多巴胺和N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺摩尔比1：1，再加入三乙胺，100-110℃搅拌回流8-16h值反应完全；加少量水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠水洗有机相，干燥，旋干，薄层色谱纯化产物；产物纯化后溶于乙醇中，加水合肼（所述莱克多巴胺、所述N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、所述水合肼的摩尔比为1：1：5）室温水解24h，反应结束后直接干燥，旋干，得莱克多巴胺半抗原。

利用上述方法制备所述莱克多巴胺半抗原过程中所得到的结构如式II所示的中间体也属于本发明的保护范围。

式II

本发明的再一个目的是提供一种制备所述中间体的方法。

本发明所提供的制备所述中间体的方法，具体可包括如下步骤：将莱克多巴胺、N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺按照摩尔比为1：1的比例进行反应，获得所述化合物。

本发明的另一个目的是提供在所述莱克多巴胺半抗原的基础上构建得到的莱克多巴胺抗原。

本发明所提供的莱克多巴胺抗原，为将所述莱克多巴胺半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原；在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白。

所述莱克多巴胺抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述莱克多巴胺抗原的制备方法具体可包括如下步骤：将所述莱克多巴胺半抗原与载体蛋白（如牛血清白蛋白）通过酰胺键偶联，获得所述莱克多巴胺抗原；

其中，所述莱克多巴胺半抗原与所述牛血清白蛋白偶联的摩尔比为12：1。

在本发明的一个实施例中，所述莱克多巴胺抗原是采用活性酯法制备得到的，具体包括如下步骤：将所述牛血清白蛋白（BSA）、所述莱克多巴胺半抗原、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS）在磷酸钠缓冲溶液（pH7.4的0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液）中反应，获得所述莱克多巴胺抗原；其中所述牛血清白蛋白、所述莱克多巴胺半抗原、所述1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐（EDCI）、所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS）和所述磷酸钠缓冲溶液的配比为100mg：0.1mmol：10ml：20mg：10.86mg。

所述莱克多巴胺半抗原、或所述中间体、或所述莱克多巴胺抗原在制备莱克多巴胺抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

所述莱克多巴胺半抗原、或所述中间体、或所述莱克多巴胺抗原在莱克多巴胺定性或定量检测中的应用也属于本发明的保护范围。具体如莱克多巴胺药物残留检测。

本发明所提供的莱克多巴胺半抗原，以及所述莱克多巴胺抗原，合成方法简单，纯度高和产率高，对于莱克多巴胺抗体的制备，以及莱克多巴胺药物残留检测具有重大价值。

附图说明

图1为莱克多巴胺半抗原中间体的正离子质谱图。

图2为莱克多巴胺半抗原中间体的核磁共振氢谱图。

图3为莱克多巴胺半抗原的正离子质谱图。

图4为莱克多巴胺半抗原的核磁共振氢谱图。

图5为莱克多巴胺人工抗原的紫外光谱图。其中，1表示34μg/ml的BSA，2表示500μg/ml的莱克多巴胺（RAC），3表示1.5mg/ml的人工抗原。

图6为莱克多巴胺标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

莱克多巴胺：Sigma公司，货号34198。

N,N-二甲基甲酰胺：国药集团化学试剂有限公司，货号81007718。

N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺：Sigma公司，货号100919。

三乙胺：北京化学试剂公司，货号80134392。

乙酸乙酯：国药集团化学试剂有限公司，货号10009418。

氯化钠：国药集团化学试剂有限公司，货号10019318。

甲醇：国药集团化学试剂有限公司，货号10014118。

二氯甲烷：国药集团化学试剂有限公司，货号80047318。

水合肼：阿拉丁试剂(上海)有限公司，货号87006570。

牛血清白蛋白：Amresco公司，货号0332。

1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐（EDCI）：Alfa Aesar公司，货号A10807。

N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS）：sigma公司，货号56485。

新西兰大白兔：雌雄各半，体重约为2kg，购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂。

弗氏完全佐剂：sigma公司，货号：F5581。

弗氏不完全佐剂：sigma公司，货号F5506。

实施例1、莱克多巴胺半抗原的制备及结构鉴定

一、莱克多巴胺半抗原的制备

（1）莱克多巴胺半抗原中间体的获得

将莱克多巴胺溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，于单口瓶中搅拌，加入N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺，莱克多巴胺和N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺摩尔比1：1，

再加入三乙胺（作为催化剂），100-110℃搅拌回流8-16h，薄层色谱监控至反应完全

（薄层色谱上的条带数与反应之前条带数有所不同，且稳定后即反应完全），加少量水淬灭反应，乙酸乙酯（ETOAC），饱和氯化钠水洗有机相，干燥，旋干，薄层色谱纯化产物（固定相为硅胶，流动相为甲醇：二氯甲烷=3：50（体积比），产物的比移值R_f=0.3），获得莱克多巴胺半抗原中间体。

（2）莱克多巴胺半抗原的获得

将步骤（1）获得的莱克多巴胺半抗原中间体溶于乙醇中，加入水合肼（整个反应中，所述莱克多巴胺、所述N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺、所述水合肼的摩尔比为1：1：5）室温水解24h，反应结束后直接干燥，旋干，获得莱克多巴胺半抗原。

其反应方程式如下：

二、莱克多巴胺半抗原中间体以及莱克多巴胺半抗原的结构鉴定

1、莱克多巴胺半抗原中间体的结构鉴定

（1）质谱鉴定

质谱条件：电子源：ESI源，干燥气温度：350℃，喷雾器压力：15.00psi，干燥气流速：5.00l/min，锥孔电压：-40.9至-6.0Volt，扫描质量范围：100至800m/z，倍压器电压：1696Volt，倍增极电压：7.0Volt。

正离子质谱图如图1所示，MS（ESIsource，positive）：503.2（M+1），证明莱克多巴胺半抗原中间体的分子量为502.2。

（2）核磁鉴定

莱克多巴胺半抗原中间体的核磁共振氢谱图如图2所示：H¹NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:7.84(dd,4H),7.12(dd,2H),6.97(dd,2H),6.70～6.64(m,4H),4.48(dt,1H),3.66～3.62(m,2H),2.78(m,1H),2.75～2.40(m,6H),1.85～1.40(m,6H),1.10～1.00(dd,3H)。

因无油泵使其中含一定量没蒸干的乙酸乙酯（ETOAC）等深信导致1.3处有些杂峰，在2.0和4.1能找到ETOAC的对应峰，2.5处包了一定量的DMSO使得积分数偏大。因使用DMSO-d6和H₂O混合溶剂使得1.1处甲基和4.45处的次甲基产生了裂分。

将上述鉴定，得到所述莱克多巴胺半抗原中间体的结构式如式II所示。

式II

2、莱克多巴胺半抗原的结构鉴定

（1）质谱鉴定

质谱条件：电子源：ESI源，干燥气温度：350℃，喷雾器压力：15.00psi，干燥气流速：5.00l/min，锥孔电压：-34.7至-6.0Volt，扫描质量范围：100至800m/z，倍压器电压：1696Volt，倍增极电压：7.0Volt。

正离子质谱图如图3所示，MS（ESIsource，positive）：372.3（M+1），证明莱克多巴胺半抗原的分子量为372.3。

（2）核磁鉴定

莱克多巴胺半抗原的核磁共振氢谱图结果如图4所示：H¹NMR(300MHz,氘代甲醇)δ:8.16(dd,1H),7.59(dd,1H),7.02～6.95(m,3H),6.69-6.54(m,3H),4.37(dt,1H),2.80-2.71(m,3H),2.48-2.31(m,6H),1.70(dd,2H),1.52(dd,2H),1.19(s,2H),1.01～0.80(m,3H)。

由于用氘代甲醇作溶剂，它与分子中的羟基作用，所以5.0附近应该有苯酚基的2H（5.0（dd,2H））；2.0处应该有氨基的2H和羟基的1H(3H)。

将上述鉴定，得到所述莱克多巴胺半抗原的结构式如式I所示。

式I

实施例2、莱克多巴胺人工抗原的制备及结构鉴定

一、莱克多巴胺人工抗原的制备

（1）称取牛血清白蛋白（BSA）100mg，溶解于10ml pH7.4的0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液中，称为A液；

（2）称量0.1mmol实施例1制备所得结构式如式I所示的莱克多巴胺半抗原，溶解于A液中，称为B液；

（3）加入20mg1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二酰亚胺盐酸盐（EDCI）和10.86mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（Sulfo-NHS）到B液中，室温磁力搅拌反应2h，离心后取上清，4℃0.01M的PBS缓冲液中透析3天。每天更换透析液（0.01M的PBS缓冲液）2次，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：莱克多巴胺-牛血清白蛋白。供免疫用。

二、莱克多巴胺人工抗原的鉴定

将BSA、莱克多巴胺（RAC），以及步骤一所得人工抗原用0.01M PBS（溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl8.5g/L，KCl0.02g/L，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g/L，NaH₂PO₄·2H₂O0.593g/L。）分别配成浓度为34μg/ml、500μg/ml、1.5mg/ml的系列溶液，进行紫外（200-400nm）光谱扫描。

结果如图5所示，在220-240nm之间，BSA的最大吸收波长为235nm，莱克多巴胺（RAC）的最大吸收波长为229nm，而步骤一所得人工抗原免疫原莱克多巴胺-BSA（RAC-BSA）的最大吸收波长位移至BSA与RAC的最大吸收波长之间，为232nm。这说明莱克多巴胺半抗原与载体蛋白BSA成功偶联。

根据公式K=A/CL（A为最大吸收波长下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层厚度）计算BSA溶液、RAC溶液和RAC-BSA溶液的消光系数（K）。采用235nm（或229nm）对RAC-BSA溶液进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的BSA（或RAC）的消光系数反向计算其浓度，用浓度值除以分子量，得到BSA（或RAC）的摩尔浓度，进而计算RAC-BSA中BSA和RAC的偶联比。结果表明，莱克多巴胺人工抗原RAC-BSA中RAC与BSA的结合比为12：1（摩尔比）。

实施例3、莱克多巴胺人工抗原RAC-BSA免疫动物制备抗血清

一、动物免疫

用步骤实施例2获得的莱克多巴胺人工抗原RAC-BSA作为免疫原免疫新西兰大白兔，免疫剂量为1mg/kg体重/次，免疫方式为颈背部皮下多点注射。首免时将浓度为2mg/mL的免疫原（溶剂为PBS）与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，每间隔3～4周取相同剂量免疫原加等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后加强免疫一次，采用此方式共加免6次后，间隔3～4周再取相同剂量免疫原不加佐剂进行末次免疫。末次免疫7-10天后心脏采血，每只兔子可得血80mL左右，取完的血在4℃冰箱放置5～6小时，然后以5000rpm离心10min，分离血清。

二、抗血清效价测定

采用间接ELISA法测定步骤一所得血清的抗体效价，具体如下：

1）包被：在96孔酶标板中加入100μL的2μg/mL的RAC-BSA溶液（用包被缓冲液进行稀释），同时设置不包被抗原的对照，4℃包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。

包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na₂CO₃1.59g/L和NaHCO₃2.93g/L）。

2）封闭：加入150μL/孔的封闭液，在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。

封闭液：含有0.5％（体积百分含量）小牛血清、3％（3g/100ml）酪蛋白的磷酸盐缓冲液，pH7.4。

3）加待测样品：吸取不同稀释度的待测血清100μl，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

同时设置未经免疫的兔血清的对照；以PBS代替待检测样品的对照（阴性对照孔）。

4）加酶标二抗：取HRP标羊抗兔IgG抗体（Jackson ImmunoResearch公司，货号111-035-003），按体积比1：5000倍稀释后，100μl/孔，37℃孵育20至30min,洗涤4次，拍干。

5）显色：将20×TMB稀释至1×TMB，按100μl/孔加入，37℃显色15-30min。

6）终止：加入终止液（2M H₂SO₄）50μl/孔。

7）读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔（以PBS代替待测样品的对照）OD值的比值（P/N）大于2.1为限，作为判断为血清效价的临界点。

ELISA结果判定方法：以P/N>2.1的血清最大稀释倍数表示。

结果表明血清中的抗体效价为1：10000。

三、抗血清的灵敏度检测

采用间接竞争ELISA法测定步骤二制备的抗血清对抗原莱克多巴胺的最低检测线进行测定：

1）-2)同以上步骤二中1）和2）所述。

3）加待测样品：每孔加入50μl不同浓度的莱克多巴胺标准品（sigma公司，货号34198）溶液（用PBS缓冲液配制），浓度分别为0ng/mL、0.05ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、50ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL、50000ng/mL，其中零浓度为对照孔，每个浓度设置3个复孔。

4）吸取步骤二制备得到的抗血清原液（抗体效价为1：10000）50μl，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

5）-8）同以上步骤二中4）-7）所述。

将采用各个浓度的莱克多巴胺标准品溶液得到的吸光值（3个复孔的平均值，记作B）除以对照孔吸光值（B₀），再乘以100，得到百分吸光度值。以百分吸光度值为纵坐标，以各个标准品溶液中的莱克多巴胺浓度（ng/mL）作为横坐标绘制标准曲线，见图6。

对照图6，得到纵坐标数值等于50%对应的莱克多巴胺浓度（ng/mL），即IC₅₀值。步骤二制备所得抗血清检测莱克多巴胺的灵敏度（IC₅₀值）为20ng/mL。

最低检测限的测定方法：测定20份零标准品（浓度为0ng/mL的莱克多巴胺标准品），取测定平均值加2倍标准差为试剂盒的最低检测限。最低检测限（LOD）为3ng/mL。

四、抗血清特异性检测

抗血清的特异性是指它同特异性抗原莱克多巴胺结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应率作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性越好。

将特异性抗原莱克多巴胺及其它β-激动剂类药物（沙丁胺醇、克伦特罗、溴布特罗、盐酸异丙肾上腺素、四环素、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、恩诺沙星和土霉素）分别做系列稀释，分别与步骤二中获得的抗血清反应，制作标准曲线，并在曲线上找出各自50%抑制浓度（IC₅₀）（方法参照步骤三中相关所述），用下式计算所述抗血清对各类似物的交叉反应率。

结果如表1所示，从表1中可以看出，步骤二中获得的抗血清对各种类似物的交叉反应率均小于0.005%。这说明步骤二中获得的抗血清对莱克多巴胺具有极高的特异性，可有效的排除其它β-激动剂类药物的干扰，可专门用于莱克多巴胺的检测。

表1抗血清的特异性

药物名称	交叉反应率（%）	药物名称	交叉反应率（%）
				莱克多巴胺	100	沙丁胺醇	<0.001
克伦特罗	0.001	溴布特罗	<0.001
				盐酸异丙肾上腺素	0.001	四环素	<0.001

磺胺二甲嘧啶	<0.001	阿莫西林	<0.001
				恩诺沙星	<0.001	土霉素	<0.001

Claims

1.一种化合物，其结构如式I所示：

2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下步骤：向莱克多巴胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液中边搅拌边加入N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺，莱克多巴胺和N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺摩尔比1：1，再加入三乙胺，100-110℃搅拌回流8-16h至反应完全；加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠水洗有机相，干燥，旋干，薄层色谱纯化产物；产物纯化后溶于乙醇中，加水合肼室温水解24h，反应结束后直接干燥，旋干，得式I所示化合物；

所述莱克多巴胺、N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺和水合肼的摩尔比为1：1：5。

3.一种化合物，其结构如式II所示：

4.制备权利要求3所述化合物的方法，包括如下步骤：将莱克多巴胺、N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺按照摩尔比为1：1的比例进行反应，获得所述化合物。

5.莱克多巴胺抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。

6.根据权利要求5所述的莱克多巴胺抗原，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白。

7.权利要求5或6所述的莱克多巴胺抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述莱克多巴胺抗原；

所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白。

8.根据权利要求7所述的莱克多巴胺抗原的制备方法，其特征在于：权利要求1所述化合物与所述牛血清白蛋白偶联的摩尔比为12：1。

9.权利要求1所述化合物、或权利要求3所述化合物、或权利要求5或6所述莱克多巴胺抗原在制备莱克多巴胺抗体中的应用。

10.权利要求1所述化合物、或权利要求3所述化合物、或权利要求5或6所述莱克多巴胺抗原在莱克多巴胺定性或定量检测中的应用。