CN107022023A - 一种6‑苄氨基腺嘌呤人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种6‑苄氨基腺嘌呤人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以6‑氯嘌呤和4‑（氨甲基）苯甲酸取代得到含羧基的产物6‑BA即为半抗原。采用碳二亚胺法将半抗原6‑BA与载体蛋白BSA偶联，用紫外法表征，并测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了6‑苄氨基腺嘌呤人工抗原6‑BA‑BSA，合成步骤简单、安全、有效，完全可用于免疫分析中，为以后的研究提供了必需的人工抗原。
Description
技术领域
本发明涉及一种6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）是一种人工合成的植物生长激素，主要作为促长剂和保鲜剂使用，能够促进与调节植物生长发育以及蔬菜、水果的保鲜和储存。6-BA是第一个人工合成的细胞分裂素，主要成份是嘌呤类生物碱和一些无机物，在细胞分裂素中具有较高活性。6-BA作为植物促长剂和果蔬保鲜剂的主要成分，已在国内外进入应用阶段。作为植物促长剂使用，可以提高种子发芽率，促进幼苗生长，最终提高产率，常被用于促进豆芽的生长，提高烟叶的产量等。在作物生长过程中，6-BA能够起到将氨基酸生长素、无机盐等向植物的茎、根等部位输运的作用，改善其生长。另外6-BA还能够通过抑制植物内的叶绿素、核酸、蛋白质分解、抑制呼吸等方式对作物防衰保鲜，因此6-BA适用于各种绿叶蔬菜（如青椒、黄瓜、豆角等）贮藏前使用。
6-苄氨基腺嘌呤已被广泛应用于农业、果树栽培和园艺等领域。因此 6-BA 在市售水果和蔬菜中一般都有一定的残留，而人体摄入6-BA过多会刺激食道、胃黏膜，造成食道、胃黏膜损伤，出现恶心、呕吐等现象。国家标准 GB2760-1996 将6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)作为允许使用的食品添加剂，同时也规定了其最高允许使用限量（0.01 g/kg）和最高允许残留量（0.20 mg/kg）。然而，目前一方面国内外至今尚未建立6-苄氨基腺嘌呤进出口产品质量的检测标准及其测定方法，这给6-BA的生产使用和进出口贸易以及食品卫生监督与监测工作带来很大的阻碍；另一方面食品中6-BA残留量的检测方法也没有国家标准。这给6-苄氨基腺嘌呤食品添加剂生产使用和进出口贸易以及食品卫生监测工作带来很大的困难。为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对6-BA的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对6-苄氨基腺嘌呤的高特异性单克隆单体。
发明内容
本发明的目的是提供一种6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的合成方法，所制备的产品用于6-苄氨基腺嘌呤免疫分析方法研究，为今后的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案，一种6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的合成方法，其由6-氯嘌呤和4-（氨甲基）苯甲酸取代得到具有羧基的产物，即半抗原6-BA，用碳二亚胺法将半抗原6-BA与载体蛋白偶联，即得到6-苄氨基腺嘌呤人工抗原。
1、6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的制备步骤为：
（1）半抗原6-BA的合成：
合成路线如下：
化合物2到化合物6-BA是纯化的过程；
称取化合物1 6-氯嘌呤2.00 g（12.9 mmol）和三乙胺 2.60 g（25.6 mmol），溶解于20mL的叔丁醇中。在N2的保护下，向该溶液中加入4-（氨甲基）苯甲酸1.96 g （12.9 mmol），回流72h。冷却至室温，过滤，获得2.10 g 黄色固体，即化合物2；
称取化合物2 1.70 g (6.32 mmol)，加入20 mL甲醇溶解。在0℃条件下，向该溶解液中逐滴加入二氯亚砜0.85 mL（11.7 mmol），然后加热至室温，搅拌过夜。将反应液减压浓缩，并通过硅胶柱纯化，最终获得白色固体108 mg （6.3%），即化合物3；
用3mL 6M HCl 溶液溶解300mg化合物3（1.05 mmol），在80℃条件下搅拌过夜，减压浓缩除去溶剂，获得白色固体140 mg（49.3%），即半抗原6-BA。
（2）完全抗原6-BA-BSA的制备：采用碳二亚胺法将步骤（1）获得的半抗原6-BA与牛血清白蛋白（BSA）偶联，得到偶联物完全抗原6-BA-BSA。
2、所述完全抗原6-BA-BSA的制备方法如下：
a、称取步骤（1）获得的半抗原6-BA 2.5mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3mg，溶解于300 μLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5.5mg，用100 μL DMF充分溶解后，加入到上述6-BA溶液中，室温搅拌反应6-8 h，称为A液；取10 mg BSA（6-BA与牛血清白蛋白（BSA）摩尔比为60︰1），用2mL 0.01M硼酸盐缓冲溶液（BB, pH=8.6）溶解，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；即得偶联物6-BA-BSA混合液。
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物6-BA-BSA混合液放入透析袋，并用0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS, pH=7.2）透析3天，每天换3次透析液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原6-BA-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
3、6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的鉴定
（1）采用核磁共振和液质联用方法鉴定半抗原。
（2）采用紫外法鉴定人工抗原的偶联效果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子的摩尔浓度与蛋白的摩尔浓度的比确定偶联比的。
偶联比=偶联物中小分子的摩尔浓度/偶联物中蛋白的摩尔浓度
本发明的有益效果：本发明成功合成了6-苄氨基腺嘌呤的人工抗原6-BA-BSA，合成步骤简单、安全、有效，完全可用于免疫分析中，为以后的研究提供了必需的人工抗原。
附图说明
图1是半抗原6-BA的NMR鉴定图。
图2是半抗原6-BA的LC鉴定图。
图3是半抗原6-BA的MS鉴定图。
图4 是6-BA-BSA人工抗原的免疫原紫外鉴定图。
具体实施方式
实施例1 半抗原6-BA的合成
称取化合物1 6-氯嘌呤2.00 g（12.9 mmol）和三乙胺 2.60 g（25.6 mmol），溶解于20mL的叔丁醇中。在N2的保护下，向该溶液中加入4-（氨甲基）苯甲酸1.96 g （12.9 mmol），回流72h。冷却至室温，过滤，获得2.10 g 黄色固体，即化合物2。
称取化合物2 1.70 g (6.32 mmol)，加入20 mL甲醇溶解。在0℃条件下，向该溶解液中逐滴加入二氯亚砜0.85 mL（11.7 mmol），然后加热至室温，搅拌过夜。将反应液减压浓缩，并通过硅胶柱纯化，最终获得白色固体108 mg （6.3%），即化合物3。
用3mL 6M HCl 溶解化合物3 300mg（1.05 mmol），在80℃条件下搅拌过夜，减压浓缩除去溶剂，获得白色固体140 mg（49.3%），即半抗原6-BA。
实施例2完全抗原6-BA-BSA制备方法如下：
a、称取实施例1获得的半抗原6-BA 2.5mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3mg，溶解于300 μLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5.5mg，用100 μL DMF充分溶解后，加入到上述6-BA溶液中，室温搅拌反应6～8 h，称为A液；取10 mg BSA（6-BA与牛血清白蛋白BSA摩尔比为60︰1），用2mL 0.01M硼酸盐缓冲溶液（BB, pH=8.6）溶解，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；即得偶联物6-BA-BSA混合液。然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原6-BA-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物6-BA-BSA混合液放入透析袋，并用0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS, pH=7.2）透析3天，每天换三次透析液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原6-BA-BSA。
实施例3 6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的鉴定
（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。
（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。
6-BA-BSA免疫原的紫外鉴定图如图4所示；
6-BA扫紫外时的浓度为25 μg/mL，其分子量为269.249 g/mol，计算其摩尔浓度为9.285×10-5 mol/mL。6-BA在特征峰269 nm处的吸光值A1= 0.13476，可以得到ε=A1 /9.285×10-5=1451。
6-BA-BSA免疫原偶联物在269 nm处的吸光值A2= 0.34977，BSA在该波长下吸光值A3=0.26178，则偶联物中6-BA的摩尔浓度为（A2-A3）/ε=6.064×10-5mol/mL，即为6.064×10-5mol/mL×269.249g/mol×10-3=16.33 μg/mL。
BSA的分子量为67000g/mol，扫紫外的浓度为500μg/mL，由此可计算偶联物中BSA的浓度为500μg/mL－16.33μg/mL=483.67μg/mL，其摩尔浓度为483.67μg/mL×10-3 /67000g/mol=7.22×10-6 mol/mL。
偶联比=6.064×10-5 mol/mL / 7.22×10-6 mol/mL=8.4。
Claims (2)
1.一种6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的合成方法，其特征在于采用由6-氯嘌呤和4-（氨甲基）苯甲酸取代得到的产物作为半抗原，以下简称为6-BA，再用碳二亚胺法将半抗原6-BA与载体蛋白偶联，即得到6-苄氨基腺嘌呤的人工抗原；步骤为：
（1）半抗原6-BA的合成：
合成路线如下：
称取化合物1 6-氯嘌呤2.00 g和三乙胺 2.60 g，溶解于20 mL的叔丁醇中，在N2的保护下，向该溶液中加入4-（氨甲基）苯甲酸1.96g，回流72h；冷却至室温，过滤，获得2.10 g 黄色固体，即化合物2；
称取化合物2 1.70 g，加入20 mL甲醇溶解，在0℃条件下，向该溶解液中逐滴加入二氯亚砜0.85 mL，然后加热至室温，搅拌过夜；将反应液减压浓缩，并通过硅胶柱纯化，最终获得白色固体108 mg，即化合物3；
用3mL 6M HCl 溶液溶解300mg化合物3，在80℃条件下搅拌过夜，减压浓缩除去溶剂，获得白色固体140 mg，即半抗原6-BA；
（2）完全抗原6-BA-BSA的制备：采用碳二亚胺法将步骤（1）获得的半抗原6-BA与牛血清白蛋白BSA偶联，得到偶联物完全抗原6-BA-BSA。
2.如权利要求1所述6-苄氨基腺嘌呤人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）所述完全抗原6-BA-BSA的制备方法如下：
a、称取半抗原6-BA 2.5mg， N-羟基琥珀酰亚胺NHS 3mg，溶解于300 μL N,N-二甲基甲酰胺DMF中，室温搅拌反应10min；再称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC5.5mg，用100 μL DMF充分溶解后，加入到上述6-BA溶液中，室温搅拌反应6～8 h，称为A液；以6-BA与牛血清白蛋白BSA摩尔比为60︰1计，取10 mg BSA，用pH=8.6、2mL 0.01M硼酸盐缓冲溶液BB溶解，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；即得偶联物6-BA-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物6-BA-BSA混合液放入透析袋，并用pH=7.2、0.01M磷酸盐缓冲溶液PBS透析3天，每天换3次透析液，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原6-BA-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
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