DE10015448A1 - Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle an dazu affine zweite Moleküle - Google Patents

Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle an dazu affine zweite Moleküle

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DE10015448A1
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Hans Kosak
Juergen Krause
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    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle 16 an dazu affine zweite Moleküle 18 mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Vorsehen eines Gefäßes 10, in dem die zweiten Moleküle 18 an einer Wand immobilisiert sind, DOLLAR A b) Inkontaktbringen der zweiten Moleküle 18 mit einer die ersten Moleküle 16 enthaltenden Lösung, DOLLAR A c) Inkubieren des Gefäßes 10, so daß die ersten Moleküle 16 an die zweiten Moleküle 18 binden und sich an der Wand anreichern und DOLLAR A d) Detektieren der Konzentrationsänderung der ersten Moleküle 16 in der im Gefäß 10 enthaltenen Lösung mittels Strahlung, ohne Lösung aus dem Gefäß zu entnehmen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle an dazu affine zweite Moleküle sowie Vorrichtungen und einen Kit zur Durch­ führung des Verfahrens.
Bekannt sind Verfahren mit folgenden Schritten:
  • a) Inkontaktbringen von eine Markierungssubstanz aufweisen­ den ersten Molekülen mit dazu affinen, immobilisierten zweiten Molekülen in einem Bindungsansatz,
  • b) Inkubieren des Bindungsansatzes,
  • c) Detektieren einer Eigenschaft der Markierungssubstanz an denjenigen ersten Molekülen, die an zweite Moleküle ge­ bundenen sind.
Es ist möglich, solche Verfahren mittels homogener Testsyste­ me durchzuführen. Darunter werden Testsysteme verstanden, bei denen Schritt lit. c durchgeführt werden kann, ohne ungebun­ dene erste Moleküle aus dem Bindungsansatz zu entfernen. Fol­ gende Verfahren zur Durchführung des Schritts lit. c in homo­ genen Testsystemen sind bekannt:
  • - Detektieren einer Fluoreszenz-Polarisation. Die Markie­ rungssubstanz ist ein Fluorophor. Gemessen wird die Änderung der Fluoreszenz-Polarisation der Markierungssubstanz durch das Binden.
  • - Detektieren einer durch einen Energie-Transfer bedingten Änderung einer Fluoreszenz. Die Markierungssubstanz ist ent­ weder ein Fluoreszenz-Donor oder ein Fluoreszenz-Akzeptor. Durch das Binden verringert sich der Abstand der ersten Mole­ küle zu den zweiten Molekülen. Das ermöglicht einen Energie- Transfer zwischen der Markierungssubstanz und einem weiteren, in der Nähe der zweiten Moleküle angeordneten Fluoreszenz-Ak­ zeptor bzw. Fluoreszenz-Donor.
  • - Detektieren einer Änderung der Verweildauer der ersten Moleküle in einem vorgegebenen Volumen. Bei diesem auch als Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie bekannten Verfahren ist die Markierungssubstanz ein Fluorophor. Die Geschwindig­ keit der Molekularbewegung der ersten Moleküle verringert sich durch die Bindung an die zweiten Moleküle. Die Verweil­ dauer des Fluorophors in dem vorgegebenen Volumen erhöht sich.
Darüber hinaus gibt es homogene Testsysteme, bei denen das Binden unmarkierter erster Moleküle an zweite Moleküle indi­ rekt detektiert wird:
  • - Die zweiten Moleküle sind an Mikropartikeln immobili­ siert. An den zweiten Molekülen sind fluoreszierende dritte Moleküle spezifisch gebunden. Das Binden der ersten Moleküle an die zweiten Moleküle verdrängt die gebundenen dritten Mo­ leküle von den Bindungsstellen. Die dadurch bedingte Änderung der Fluoreszenz der Mikropartikel wird detektiert.
  • - Die zweiten Moleküle sind an einer Gefäßwand immobili­ siert, die einen Szintillator enthält. An die zweiten Molekü­ le sind dritte Moleküle spezifisch gebunden, die eine radio­ aktive Markierungssubstanz aufweisen. Die Markierungssubstanz verursacht eine meßbare Szintillation. Das Binden der ersten Moleküle an die zweiten Moleküle verdrängt die gebundenen dritten Moleküle von den Bindungsstellen. Die dadurch beding­ te Änderung der Szintillation wird gemessen.
Die bekannten homogenen Testsysteme sind technisch aufwendig und benötigen zum Teil gesundheitsgefährdende Substanzen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen. Insbesondere sollen Verfah­ ren, Vorrichtungen und ein Kit bereitgestellt werden, mit de­ nen einfach und kostengünstig ein hoher Probendurchsatz er­ zielbar ist. Nach dem Inkontaktbringen der zweiten Moleküle mit den ersten Molekülen soll kein weiterer Pipettier- oder Waschschritt erforderlich sein.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 2, 3, 28, 29, 32 und 34 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 4-27, 30, 31, 33 sowie 35-38.
Zur Lösung der Aufgabe ist ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle an dazu affine zweite Moleküle mit folgenden Schritten vorgesehen:
  • a) Vorsehen eines Gefäßes, in dem die zweiten Moleküle an einer Wand immobilisiert sind,
  • b) Inkontaktbringen der zweiten Moleküle mit einer die er­ sten Moleküle enthaltenden Lösung,
  • c) Inkubieren des Gefäßes, so daß die ersten Moleküle an die zweiten Moleküle binden und sich an der Wand anrei­ chern und
  • d) Detektieren der Konzentrationsänderung der ersten Mole­ küle in der im Gefäß enthaltenen Lösung mittels Strah­ lung, ohne Lösung aus dem Gefäß zu entnehmen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle an dazu affine zweite Moleküle mit folgenden Schritten:
  • a) Vorsehen eines Gefäßes, in dem die zweiten Moleküle an einer Wand immobilisiert sind,
  • b) Inkontaktbringen der zweiten Moleküle mit einer die er­ sten Moleküle enthaltenden Lösung, wobei dritte Moleküle mit einer Affinität zu den ersten Molekülen in der Lö­ sung oder in dem Gefäß enthalten sind,
  • c) Inkubieren des Gefäßes, so daß die ersten Moleküle an die zweiten und dritten Moleküle binden und sich an der Wand anreichern und
  • d) Detektieren der Konzentrationsänderung der dritten Mole­ küle in der im Gefäß enthaltenen Lösung mittels Strah­ lung, ohne Lösung aus dem Gefäß zu entnehmen.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle an dazu affine zweite Moleküle mit folgenden Schritten:
  • a) Vorsehen eines Gefäßes, in dem die zweiten Moleküle an einer Wand immobilisiert sind,
  • b) Inkontaktbringen der zweiten Moleküle mit einer die er­ sten Moleküle enthaltenden Lösung, wobei vierte Moleküle mit einer Affinität zu den zweiten Molekülen in der Lö­ sung oder in dem Gefäß enthalten sind,
  • c) Inkubieren des Gefäßes, so daß die ersten Moleküle an die zweiten Moleküle binden und die vierten Moleküle, zumindest teilweise, in Lösung gehen oder bleiben und
  • d) Detektieren der Konzentrationsänderung der vierten Mole­ küle in der im Gefäß enthaltenen Lösung mittels Strah­ lung, ohne Lösung aus dem Gefäß zu entnehmen.
Das Detektieren der Konzentration beim Schritt lit. d kann mittels elektromagnetischer Strahlung, wie Licht, oder mit­ tels Teilchenstrahlung, wie Neutronenstrahlung, erfolgen. Es findet im Gefäß vorzugsweise in einem Bereich statt, der mög­ lichst weit von der Wand entfernt ist. Das erhöht die Genau­ igkeit des Verfahrens. Die erfindungsgemäßen Verfahren haben den Vorteil, mit einem geringen Pipettieraufwand durchführbar zu sein. Sie sind einfach zu handhaben und kostengünstig. Sie erfordern einen geringen Bedarf an Material und Raum. Sie er­ möglichen einen hohen Probendurchsatz und sind gut zur Auto­ matisierung geeignet. Das wird insbesondere dadurch erreicht, daß nach dem Inkontaktbringen der zweiten Moleküle mit einer die ersten Moleküle enthaltenden Lösung keine weiteren mecha­ nischen Arbeitsschritte, insbesondere keine Trenn- und Wasch­ schritte, erforderlich sind. Durch die geringe Zahl der Ar­ beitsschritte ist die Gefahr der Verfälschung der Ergebnisse, insbesondere durch Pipettierfehler, gering. Das Verfahren kann gleichzeitig oder in kurzer Abfolge mit einer großen Zahl von Gefäßen und unterschiedlichen ersten, zweiten, drit­ ten und/oder vierten Molekülen durchgeführt werden. Das Ver­ fahren ist in idealer Weise für die Suche nach neuen pharma­ kologischen Wirkstoffen geeignet.
Bei einem Verfahren mit dritten oder vierten Molekülen ist es besonders vorteilhaft, wenn diese mit den zweiten Molekülen oder der Wand assoziiert sind. Auf diese Art und Weise ist es nicht erforderlich die dritten oder vierten Moleküle in einem Pipettierschritt der Lösung oder dem Gefäß hinzuzufügen.
Weiterhin ist es bei einem Verfahren mit vierten Molekülen vorteilhaft, wenn die Affinität der vierten Moleküle zu den zweiten Molekülen nicht oder nicht wesentlich größer ist als die Affinität der ersten Moleküle zu den zweiten Molekülen. Das erleichtert das Verdrängen der vierten Moleküle von deren Bindungsstellen an den zweiten Molekülen. Auch die Bindung der vierten Moleküle an die zweiten Moleküle wird leichter verhindert.
Vorteilhafterweise ist bei einem Verfahren mit vierten Mole­ külen die Anzahl der ersten Moleküle größer als die Anzahl der zweiten Moleküle und die Anzahl der zweiten Moleküle größer ist als die Anzahl der vierten Moleküle. Das bewirkt eine Kompetition der ersten Moleküle und der vierten Moleküle um die Bindungsstellen an den zweiten Molekülen. Die Konzen­ tration der vierten Moleküle wird stark durch die Konzentra­ tion der ersten Moleküle und deren Affinität zu den zweiten Molekülen beeinflußt.
Bei einem Verfahren ohne vierte Moleküle ist es bevorzugt, daß die Anzahl der zweiten Moleküle größer ist als die Anzahl der ersten Moleküle. Das führt zu einer schnellen und deutli­ chen Konzentrationsänderung der ersten Moleküle oder der er­ sten und dritten Moleküle in der im Gefäß enthaltenen Lösung. Bei einem Verfahren mit dritten Molekülen ist es vorteilhaft, wenn die Anzahl der ersten Moleküle nicht kleiner ist als die Anzahl der dritten Moleküle. Das verhindert, daß nach der Bindung der ersten Moleküle an die zweiten Moleküle in der Lösung dritte Moleküle verbleiben. In der Lösung verbleibende dritte Moleküle bewirken bei Schritt lit. d ein Hintergrund­ signal.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung wird zum Detektieren mit einem Lichtstrahl, insbesondere einer definierten Wellen­ länge, vorzugsweise einem Laserstrahl, in die Lösung einge­ strahlt. Der Lichtstrahl kann parallel zu der Wand einge­ strahlt werden. Er kann polarisiert sein. Zum Detektieren kann eine Fluoreszenz, eine Streuung eine Absorption oder ei­ ne optische Aktivität gemessen werden.
Vorteilhafterweise enthält die Lösung zusätzlich fünfte, als interne Marker dienende Moleküle, die keine spezifische Affi­ nität zu den ersten, zweiten, dritten oder vierten Molekülen aufweisen. Die fünften Moleküle können dazu eingesetzt wer­ den, eine Volumen- und damit eine Konzentrationsänderung durch Verdunsten von Wasser festzustellen. Weiterhin können die fünften Moleküle dazu dienen, das Maß unspezifischer Bin­ dungen zu ermitteln. Dabei zeigt eine Abnahme der Konzentra­ tion der fünften Moleküle eine unspezifische Bindung an die Wand und/oder die zweiten Moleküle an.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die ersten, dritten, vierten und/oder fünften Moleküle oder damit assozi­ ierende Bestandteile der Lösung fluoreszierend, lichtstreuend, lichtabsorbierend oder optisch aktiv. Damit assoziierte Bestandteile der Lösung können beispielsweise Antikörper sein, welche die ersten, dritten, vierten und/oder fünften Moleküle spezifische binden können.
Vorteilhafterweise erfolgt die Durchführung des Schritts lit. d durch mehrfaches oder kontinuierliches Bestimmen der Kon­ zentration der ersten, dritten oder vierten Moleküle während der Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere an deren Beginn und Ende. Das Bestimmen der Konzentration kann bei­ spielsweise durch Vergleichen der optischen Eigenschaften der Lösung mit denjenigen verschiedener Eichlösungen erfolgen.
Bevorzugt sind freie Bindungsstellen an der Wand des Gefäßes durch daran gebundene sechste Moleküle abgesättigt. Die sech­ sten Moleküle sollten ähnliche physikalisch/chemische Eigen­ schaften, wie Ladung, Molekülgröße usw., aufweisen, wie die zweiten Moleküle. Sie sollten jedoch keine Affinität zu den ersten Molekülen besitzen. Dadurch kann eine unspezifische Bindung an freie Bindungsstellen an der Wand des Gefäßes un­ terdrückt werden. Unspezifisch ist jede Bindung, die nicht an den spezifischen Bindungsstellen der zweiten Moleküle er­ folgt.
Vorteilhafterweise enthält die Lösung mindestens einen eine unspezifische Bindung inhibierenden Zusatz, insbesondere ein Detergenz, ein Protein, ein Proteingemisch oder ein Salz. Der Zusatz unterdrückt nicht die spezifische Bindung der ersten Moleküle an den spezifischen Bindungsstellen der zweiten Mo­ leküle. Er inhibiert unspezifische Bindungen der ersten, zweiten, dritten, vierten und fünften Moleküle untereinander und an der Wand des Gefäßes bzw. den dort gebundenen sechsten Molekülen. Als Detergenzien kommen z. B. Tween-20, Nonidet oder SDS in Betracht. Als Salze sind solche geeignet, die un­ spezifische Ionenbindungen unterdrücken. Proteine oder Pro­ teingemische können z. B. Magermilch, Rinderserumalbumin oder Casein sein.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung wird zur Ermittlung ei­ ner spezifischen Konzentrationsänderung von dem Betrag der Konzentrationsänderung gemäß Schritt lit. d der Betrag einer Konzentrationsänderung bei Durchführung des Verfahrens ohne zweite Moleküle abgezogen. Spezifisch ist eine Konzentrati­ onsänderung, die nur durch eine Bindung der ersten Moleküle an die zweiten Moleküle verursacht wird.
Bevorzugt sind die zweiten Moleküle an einer vorgegebenen Stelle ihrer Struktur immobilisiert. Das ermöglicht es, ein Immobilisieren der zweiten Moleküle an derjenigen Stelle ih­ rer Struktur zu vermeiden, die affin zu den zweiten bzw. vierten Molekülen ist. Ein solches Immobilisieren würde die Zugänglichkeit dieser Stellen für dazu affine erste bzw. vierte Moleküle einschränken. Vorteilhafterweise sind die zweiten Moleküle über Linker oder Spacer an der Wand gebun­ den. Das verbessert die Zugänglichkeit der zweiten Moleküle. Linker können das Immobilisieren von zweiten Molekülen, die sich direkt nur schlecht oder gar nicht immobilisieren las­ sen, verbessern oder ermöglichen.
Vorzugsweise ist das Gefäß als Kavität einer Mikrotiterplatte mit mindestens 96, insbesondere 384, Kavitäten ausgebildet. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung weist das Gefäß an der Ein- und/oder Austrittstelle des Lichtstrahls, vorzugsweise dem Boden des Gefäßes, im wesentlichen keine immobilisierten zweiten Moleküle auf. Das verhindert beim Schritt lit. d eine Störung des Detektierens durch erste, dritte oder vierte Mo­ leküle, die direkt oder indirekt an immobilisierte zweite Mo­ leküle an der Ein- und/oder Austrittsstelle des Lichtstrahls gebunden sind. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Gefäß eine an den Enden offene Kapillare ist. Unter einer Kapillare wird hier ein an beiden Seiten offenes Röhrchen mit einem In­ nendurchmesser von bis zu 2 Millimeter verstanden. Die Kapil­ lare kann von dem Lichtstrahl so durchstrahlt werden, daß dieser die Wand der Kapillare nicht bestrahlt. Eine Beein­ flussung des Detektierens durch gebundene erste, dritte oder vierte Moleküle ist ausgeschlossen. Vorzugsweise wird die Ka­ pillare mittels Kapillarkräften mit der Lösung gefüllt. Da­ durch ist die Aufnahme eines definierten Volumens gewährlei­ stet. Ein Pipettierschritt ist nicht erforderlich. Eine da­ durch bedingte Fehlerquelle ist ausgeschlossen.
Bevorzugt ist der Quotient aus der Fläche der Wand in mm2 und dem Volumen der Lösung in mm3 größer als 1 mm-1, vorzugsweise größer als 3 mm-1. Das Gefäß ist in diesem Fall länglich. Ein vorgegebenes Volumen kann mit einer großen Wandfläche mit im­ mobilisierten zweiten Molekülen in Kontakt gebracht werden. Gleichzeitig ist ein langer Weg des Lichtstrahls durch die Lösung gewährleistet. Die Empfindlichkeit des Verfahrens kann durch eine längliche Geometrie des Gefäßes erheblich gestei­ gert werden.
Die ersten, zweiten, dritten, vierten, fünften oder sechsten Moleküle können aus folgender Gruppe ausgewählt sein: Pepti­ de, Proteine, Nukleinsäuren, Zucker, Polymere, Botenstoffe, Zellen, Zellfragmente, Viren, deren Bestandteile oder Frag­ mente dieser Bestandteile, Kapside, deren Bestandteile oder Fragmente dieser Bestandteile und Hormone. Bei einer vorteil­ haften Ausgestaltung der Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren gleichzeitig oder in kurzer Abfolge an einer Anzahl von Gefäßen, insbesondere Kapillaren, durchgeführt.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchfüh­ rung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Sie weist mindestens ein Gefäß auf, wobei an einer Wand des Gefäßes die zweiten Moleküle immobilisiert sind, wobei die dritten oder vierten Moleküle mit der Wand oder den zweiten Molekülen assoziiert sind.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durch­ führung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Satz von, vorzugsweise mehr als 10, insbesondere mehr als 100, Ka­ pillaren, an deren Wänden die zweiten Moleküle immobilisiert sind. Dabei können sich die Kapillaren, zumindest teilweise, durch unterschiedliche zweite Moleküle unterscheiden. Vor­ zugsweise unterscheiden sich die Kapillaren mit unterschied­ lichen zweiten Molekülen zusätzlich, insbesondere durch deren Abmessungen oder Markierungen. Die Markierungen können aus weiteren Molekülen oder, insbesondere fuoreszierenden, Farb­ stoffen bestehen. Dadurch ist es möglich, Kapillaren zu iden­ tifizieren, an deren Wänden bestimmte zweite Moleküle immobi­ lisiert sind.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung zur Durch­ führung des Schritts lit. d, wobei in die Vorrichtung minde­ stens eine, insbesondere von einem Träger aufgenommene, Ka­ pillare einsetzbar ist, wobei die Kapillare von einem Licht­ strahl durchstrahlt wird, der nicht mit der Wand der Kapilla­ re in Kontakt kommt. Die Vorrichtung kann ein Mittel zum Er­ fassen von Merkmalen der Kapillaren, insbesondere deren Ab­ messungen oder daran angebrachte Markierungen, aufweisen.
Ferner betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei ein Satz von Kapillaren enthalten ist, an deren Wänden die zweiten Moleküle immobili­ siert sind. Die Kapillaren können sich, zumindest teilweise, durch unterschiedliche zweite Moleküle unterscheiden. Kapil­ laren mit unterschiedlichen zweiten Molekülen können sich zu­ sätzlich, insbesondere durch deren Abmessungen oder Markie­ rungen, unterscheiden. Der Kit kann ferner einen Träger ent­ halten, der mehrere Kapillaren aufnehmen kann. Vorzugsweise ist der Träger derart ausgebildet, daß er mit aufgenommenen Kapillaren zur Durchführung des Schritts lit. d in eine er­ findungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Schritts lit. d einsetzbar ist.
Nachfolgend wird die Erfindung durch die Zeichnung und anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1a, 1b eine schematische Darstellung des Durch­ strahlens eines eine Lösung enthaltenen Gefäßes mit ersten Molekülen und immobi­ lisierten zweiten Molekülen,
Fig. 2a, 2b, 2c eine schematische Darstellung des Durch­ strahlens eines eine Lösung enthaltenen Gefäßes mit zweiten, vierten und ersten oder fünften Molekülen,
Fig. 3a, 3b eine schematische Darstellung des Durch­ strahlens eines eine Lösung enthaltenen Gefäßes mit ersten, zweiten und dritten Molekülen und
Fig. 4 ein Diagramm des Zeitverlaufs der in Ver­ tiefungen eines 8-Well-Streifens detek­ tierten Fluoreszenz Fluoreszenz-markier­ ter Oligonukleotide.
Fig. 1a zeigt einen Ausschnitt aus einem Gefäß 10 mit einem ersten Ende 12 und einem zweiten Ende 14. In dem Gefäß 10 be­ findet sich eine Lösung, welche die ersten Moleküle 16 ent­ hält. An der Wand des Gefäßes 10 sind die dazu affinen zwei­ ten Moleküle 18 immobilisiert. Der in das Gefäß 10 an dem er­ sten Ende 12 eingestrahlte Lichtstrahl 20 wird durch eine Wechselwirkung mit den ersten Molekülen 16, beispielsweise durch Absorption, moduliert. Der am zweiten Ende 14 ausstrah­ lende Lichtstrahl 22 weist gegenüber dem eingestrahlten Lichtstrahl 20 veränderte Eigenschaften auf. Die Veränderung dieser Eigenschaften ist ein Maß für die Konzentration der ersten Moleküle 16 in der Lösung. Fig. 1b zeigt das in Fig. 1a dargestellte Gefäß 10 nach dem Inkubieren. Die ersten Mo­ leküle 16 sind an die zweiten Moleküle 18 gebunden. Der in das Gefäß 10 eingestrahlte Lichtstrahl 20 wird nicht durch Wechselwirkungen mit den ersten Molekülen 16 moduliert. Im Falle lichtabsorbierender erster Moleküle 16 ist der aus­ strahlende Lichtstrahl 22 nur durch die Lichtabsorption der Lösung, nicht aber wie in Fig. 1a durch die Lichtabsorption der ersten Moleküle 16 abgeschwächt.
In Fig. 2a ist ein Ausschnitt aus einem Gefäß 10 mit daran gebundenen zweiten Molekülen 18 dargestellt. Die in dem Gefäß 10 enthaltene Lösung enthält erste Moleküle 16 und vierte Mo­ leküle 24, die beide eine Affinität zu den zweiten Molekülen 18 aufweisen. Der eingestrahlte Lichtstrahl 20 wird hier durch eine Wechselwirkung mit den vierten Molekülen 24, nicht aber mit den ersten Molekülen 16 moduliert. Die Wechselwirkung kann dadurch bedingt sein, daß die vierten Moleküle 24 lichtabsorbierend sind. Der ausstrahlende Lichtstrahl 22 weist gegenüber dem einstrahlenden Lichtstrahl 20 veränderte Eigenschaften auf. Fig. 2b zeigt die Situation nach dem Inku­ bieren. Die ersten Moleküle 16 sind an die zweiten Moleküle 18 gebunden. Sie verhindern das Binden der vierten Moleküle 24 an die zweiten Moleküle 18. Die Konzentration der vierten Moleküle 24 in der Lösung ist unverändert. Die Eigenschaften des ausstrahlenden Lichtstrahls 22 sind gegenüber der in Fig. 2a dargestellten Situation nicht verändert. Das zeigt eine Bindung der ersten Moleküle 16 an die zweite Moleküle 18 an. Fig. 2c zeigt die Situation nach dem Inkubieren, wenn in der Lösung zuvor statt der ersten Moleküle 16 fünfte Moleküle 26 enthalten waren, die keine Affinität zu den zweiten Molekülen 18 aufweisen. Die vierten Moleküle 24 binden dann während des Inkubierens an die zweiten Moleküle 18. Nach dem Inkubieren wird der eingestrahlte Lichtstrahl 20 nicht durch eine Wech­ selwirkung mit den vierten Molekülen 24 moduliert. Im Falle lichtabsorbierender vierter Moleküle 24 ist die Intensität des ausstrahlenden Lichtstrahls 22 stärker als zu Beginn der Inkubation.
Fig. 3a zeigt einen Ausschnitt aus einem Gefäß 10. In dem Ge­ fäß 10 ist eine Lösung mit ersten Molekülen 16 und dazu affi­ nen dritten Molekülen 23 enthalten. An der Wand des Gefäßes 10 sind zweite Moleküle 18 immobilisiert. Sie weisen eine Af­ finität zu den ersten Molekülen 16 auf. Der in das Gefäß 10 an dem ersten Ende 12 eingestrahlte Lichtstrahl 20 wird durch eine Wechselwirkung mit den dritten Molekülen 23, beispiels­ weise durch Absorption, moduliert. Der ausstrahlende Licht­ strahl 22 weist gegenüber dem einstrahlenden Lichtstrahl 20 veränderte Eigenschaften auf. Fig. 3b zeigt die Situation nach dem Inkubieren. Die ersten Moleküle 16 sind an die zweiten Moleküle 18 und die dritten Moleküle 23 gebunden. Die Bindungsstellen der zweiten 18 und dritten Moleküle 23 an den ersten Molekülen 16 sind nicht identisch. Die dritten Molekü­ le 23 sind der Lösung entzogen. Der in das Gefäß 10 einge­ strahlte Lichtstrahl 20 wird nicht mehr durch Wechselwirkun­ gen mit den dritten Molekülen 23 moduliert.
Fig. 4 zeigt den Zeitverlauf der in Streptavidin-beschichte­ ten Vertiefungen eines 8-Well-Streifens (Boehringer Mannheim, Nr. 1664778) detektierten Fluoreszenz Fluoreszenz-markierter Oligonukleotide I. Eine Vertiefung I des 8-Well-Streifens ist mit einem am 5'-Terminus biotinylierten Oligonukleotid II der Sequenz 5'-TAA CAC AAC TGG TGT GCT CCT GGA-3' gemäß Sequenz­ protokoll Nr. 1 beschichtet worden. Dazu sind in die Vertie­ fung I 300 µl einer Puffer-Lösung I mit 167 nM des Oligonu­ kleotids II eingefüllt worden. Die Puffer-Lösung I besteht aus einer wässerigen Lösung von 10 mM TrisCL und 1 mM EDTA, pH 8,0. Eine Vertiefung II des 8-Well-Streifens ist nur mit 300 µl Puffer-Lösung I gefüllt worden. Nach einer Stunde In­ kubation bei 37°C sind die Puffer-Lösungen I aus den Vertie­ fungen I und II abgesaugt worden. Die Vertiefungen I und II sind 5 mal mit 320 µl der Puffer-Lösung I gewaschen worden. Anschließend sind in die Vertiefungen I und II je 300 µl ei­ ner Puffer-Lösung II mit 167 nM des am 5'-Terminus mit 5[6]- Carboxytetramethylrhodamin Fluoreszenz-markierten Oligonu­ kleotids I der Sequenz 5'-GAG CTA GGA CCT CTT CTG TCC AGG AGC ACA CCA GTT GTG TTA-3' gemäß Sequenzprotokoll Nr. 2 einge­ füllt worden. Die Puffer-Lösung II besteht aus einer wässeri­ gen Lösung von 150 mM NaCl, 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA und 0,2% Tween-20, pH 8,0. Bei einer Anregung mit 540 nm ist die Fluo­ reszenz in den Vertiefungen I und II bei 590 nm gemessen wor­ den. Das Messen erfolgte in 25 Sekunden-Intervallen bei Raum­ temperatur mittels eines Mikrotiterplattenphotometers. In Fig. 4 ist die Fluoreszenz in willkürlichen Einheiten darge­ stellt. Die dickere Linie zeigt die in Vertiefung I und die dünnere Linie die in Vertiefung II gemessene Fluoreszenz. Die Abnahme der Fluoreszenz in Vertiefung II zeigt die unspezifi­ sche Bindung des Oligonukleotids I an der Wand der Vertiefung II an. Die Differenz zwischen der Abnahme der Fluoreszenz in Vertiefung II und der Abnahme der Fluoreszenz in Vertiefung I zeigt die spezifische Bindung des Oligonukleotids I an das Oligonukleotid II an.
Bezugszeichenliste
10
Gefäß,
12
erstes Ende,
14
zweites Ende,
16
erste Moleküle,
18
zweite Moleküle,
20
eingestrahlter Lichtstrahl,
22
ausstrahlender Lichtstrahl,
23
dritte Moleküle
24
vierte Moleküle,
26
fünfte Moleküle
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (38)

1. Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle (16) an dazu affine zweite Moleküle (18) mit folgenden Schritten:
  • a) Vorsehen eines Gefäßes (10), in dem die zweiten Moleküle (18) an einer Wand immobilisiert sind,
  • b) Inkontaktbringen der zweiten Moleküle (18) mit einer die ersten Moleküle (16) enthaltenden Lösung,
  • c) Inkubieren des Gefäßes (10), so daß die ersten Moleküle (16) an die zweiten Moleküle (18) binden und sich an der Wand anreichern und
  • d) Detektieren der Konzentrationsänderung der ersten Mole­ küle (16) in der im Gefäß (10) enthaltenen Lösung mittels Strahlung, ohne Lösung aus dem Gefäß zu entnehmen.
2. Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle (16) an dazu affine zweite Moleküle (18) mit folgenden Schritten:
  • a) Vorsehen eines Gefäßes (10), in dem die zweiten Moleküle (18) an einer Wand immobilisiert sind,
  • b) Inkontaktbringen der zweiten Moleküle (18) mit einer die ersten Moleküle (16) enthaltenden Lösung, wobei dritte Mole­ küle (23) mit einer Affinität zu den ersten Molekülen (16) in der Lösung oder in dem Gefäß (10) enthalten sind,
  • c) Inkubieren des Gefäßes (10), so daß die ersten Moleküle (16) an die zweiten (18) und dritten Moleküle (23) binden und sich an der Wand anreichern und
  • d) Detektieren der Konzentrationsänderung der dritten Mole­ küle (23) in der im Gefäß (10) enthaltenen Lösung mittels Strahlung, ohne Lösung aus dem Gefäß zu entnehmen.
3. Verfahren zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Bindens erster Moleküle (16) an dazu affine zweite Moleküle (18) mit folgenden Schritten:
  • a) Vorsehen eines Gefäßes (10), in dem die zweiten Moleküle (18) an einer Wand immobilisiert sind,
  • b) Inkontaktbringen der zweiten Moleküle (18) mit einer die ersten Moleküle (16) enthaltenden Lösung, wobei vierte Mole­ küle (24) mit einer Affinität zu den zweiten Molekülen (18) in der Lösung oder in dem Gefäß (10) enthalten sind,
  • c) Inkubieren des Gefäßes (10), so daß die ersten Moleküle (16) an die zweiten Moleküle (18) binden und die vierten Mo­ leküle (24), zumindest teilweise, in Lösung gehen oder blei­ ben und
  • d) Detektieren der Konzentrationsänderung der vierten Mole­ küle (24) in der im Gefäß (10) enthaltenen Lösung mittels Strahlung, ohne Lösung aus dem Gefäß zu entnehmen.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die in dem Gefäß (10) enthaltenen dritten (23) oder vierten Moleküle (24) mit den zweiten Molekülen (18) oder der Wand assoziiert sind.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Affinität der vier­ ten Moleküle (24) zu den zweiten Molekülen (18) nicht oder nicht wesentlich größer ist als die Affinität der ersten Mo­ leküle (16) zu den zweiten Molekülen (18).
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3-5, wobei die An­ zahl der ersten Moleküle (16) größer ist als die Anzahl der zweiten Moleküle (18) und die Anzahl der zweiten Moleküle (18) größer ist als die Anzahl der vierten Moleküle (24).
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Anzahl der zweiten Moleküle (18) größer ist als die Anzahl der ersten Moleküle (16).
8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Anzahl der ersten Moleküle (16) nicht kleiner ist als die Anzahl der dritten Moleküle (23).
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Detektieren mit einem Lichtstrahl (20), insbesondere ei­ ner definierten Wellenlänge, vorzugsweise einem Laserstrahl, in die Lösung eingestrahlt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Lichtstrahl (20) parallel zu der Wand eingestrahlt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Lichtstrahl (20) polarisiert ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Detektieren eine Fluoreszenz, eine Streuung, eine Absorp­ tion oder eine optische Aktivität gemessen wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der Lösung zusätzlich fünfte, als interne Marker dienende Moleküle (26) enthalten sind, die keine spezifische Affinität zu den ersten (16), zweiten (18), dritten (23) oder vierten Molekülen (24) aufweisen.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ersten (16), dritten (23), vierten (24) und/oder fünften Moleküle (26) oder damit assoziierende Bestandteile der Lö­ sung fluoreszierend, lichtstreuend, lichtabsorbierend oder optisch aktiv sind.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Durchführung des Schritts lit. d durch mehrfaches oder kontinuierliches Bestimmen der Konzentration der ersten (16), dritten (23) oder vierten Moleküle (24) während der Durchfüh­ rung des Schritts lit. c, insbesondere an deren Beginn und Ende, erfolgt.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei freie Bindungsstellen an der Wand des Gefäßes (10) durch dar­ an gebundene sechste Moleküle abgesättigt sind.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lösung mindestens einen eine unspezifische Bindung inhi­ bierenden Zusatz, insbesondere ein Detergenz, ein Protein, ein Proteingemisch oder ein Salz, enthält.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Ermittlung einer spezifischen Konzentrationsänderung von dem Betrag der Konzentrationsänderung gemäß Schritt lit. d der Betrag einer Konzentrationsänderung bei Durchführung des Verfahrens ohne zweite Moleküle abgezogen wird.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweiten Moleküle (18) an einer vorgegebenen Stelle ihrer Struktur immobilisiert sind.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweiten Moleküle (18) über Linker oder Spacer an der Wand gebunden sind.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gefäß (10) als Kavität einer Mikrotiterplatte mit minde­ stens 96, insbesondere 384, Kavitäten ausgebildet ist.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gefäß (10) an der Ein- und/oder Austrittsstelle des Lichtstrahls (20, 22), vorzugsweise dem Boden des Gefäßes (10), im wesentlichen keine immobilisierten zweiten Moleküle (18) aufweist.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gefäß (10) eine an den Enden (12, 14) offene Kapillare ist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Kapillare mittels Kapillarkräften mit der Lösung gefüllt wird.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Quotient aus der Fläche der Wand in mm2 und dem Volumen der Lösung in mm3 größer als 1 mm-1, vorzugsweise größer als 3 mm-1, ist.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ersten (16), zweiten (18), dritten (23), vierten (24), fünften (26) oder sechsten Moleküle aus folgender Gruppe aus­ gewählt sind: Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Zucker, Poly­ mere, Botenstoffe, Zellen, Zellfragmente, Viren, deren Be­ standteile oder Fragmente dieser Bestandteile, Kapside, deren Bestandteile oder Fragmente dieser Bestandteile und Hormone.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren gleichzeitig oder in kurzer Abfolge an einer Anzahl von Gefäßen (10), insbesondere Kapillaren, durchge­ führt wird.
28. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-27 mit mindestens einem Gefäß (10), wobei an einer Wand des Gefäßes (10) die zweiten Moleküle (18) im­ mobilisiert sind, wobei die dritten (23) oder vierten Molekü­ le (24) mit der Wand oder den zweiten Molekülen (18) assozi­ iert sind.
29. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach An­ spruch 27 mit einem Satz von, vorzugsweise mehr als 10, ins­ besondere mehr als 100, Kapillaren, an deren Wänden die zwei­ ten Moleküle (18) immobilisiert sind.
30. Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei sich die Kapillaren, zumindest teilweise, durch unterschiedliche zweite Moleküle (18) unterscheiden.
31. Vorrichtung nach Anspruch 30, wobei sich die Kapillaren mit unterschiedlichen zweiten Molekülen (18) zusätzlich, ins­ besondere durch deren Abmessungen oder Markierungen, unter­ scheiden.
32. Vorrichtung zur Durchführung des Schritts lit. d in ei­ nem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-27, wobei in die Vorrichtung mindestens eine, insbesondere von einem Träger aufgenommene, Kapillare einsetzbar ist, wobei die Kapillare von einem Lichtstrahl (20, 22) durchstrahlt wird, der nicht mit der Wand der Kapillare in Kontakt kommt.
33. Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei die Vorrichtung ein Mittel zum Erfassen von Merkmalen der Kapillaren, insbesonde­ re deren Abmessungen oder daran angebrachte Markierungen, aufweist.
34. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der An­ sprüche 1-27, wobei ein Satz von Kapillaren enthalten ist, an deren Wänden die zweiten Moleküle (18) immobilisiert sind.
35. Kit nach Anspruch 34, wobei sich die Kapillaren, zumin­ dest teilweise, durch unterschiedliche zweite Moleküle (18) unterscheiden.
36. Kit nach Anspruch 35, wobei sich die Kapillaren mit un­ terschiedlichen zweiten Molekülen (18) zusätzlich, insbeson­ dere durch deren Abmessungen oder Markierungen, unterschei­ den.
37. Kit nach einem der Ansprüche 34-36, wobei darin ein Träger enthalten ist, der mehrere Kapillaren aufnehmen kann.
38. Kit nach Anspruch 37, wobei der Träger derart ausgebil­ det ist, daß er mit aufgenommenen Kapillaren zur Durchführung des Schritts lit. d in eine Vorrichtung gemäß Anspruch 32 oder 33 einsetzbar ist.
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