EP1639348A1 - Bioanalytisches verfahren auf grundlage der messung der abklingzeit der phosphoreszenz - Google Patents

Bioanalytisches verfahren auf grundlage der messung der abklingzeit der phosphoreszenz

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EP1639348A1
EP1639348A1 EP04715275A EP04715275A EP1639348A1 EP 1639348 A1 EP1639348 A1 EP 1639348A1 EP 04715275 A EP04715275 A EP 04715275A EP 04715275 A EP04715275 A EP 04715275A EP 1639348 A1 EP1639348 A1 EP 1639348A1
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EP
European Patent Office
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interaction
decay time
luminophore
partners
partner
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04715275A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Otto S. Wolfbeis
Axel Dürkop
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chromeon GmbH
Original Assignee
Chromeon GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Chromeon GmbH filed Critical Chromeon GmbH
Publication of EP1639348A1 publication Critical patent/EP1639348A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of interactions between two or more molecules based on the measurement of the decay time of the luminescence, in particular the phosphorescence of a luminophore attached to at least one of the molecules.
  • Fluorescence and phosphorescence are used in bioanalytics to demonstrate interactions between two reaction partners. Interactions occur, for example, when a) an antigen reacts with an antibody, which is for the purpose of
  • Immunoanalysis and diagnostics can be used; b) an oligonucleotide with its counter strand a double helix. forms what can be used for the purposes of genetic analysis and diagnosis; c) a receptor binds a ligand, which is pharmacological
  • Receptor or an enzyme binds, which can be used for the purpose of quick identification of potential drugs, including in high-throughput screening.
  • the luminescence methods mentioned are often used because they * have a high sensitivity (close to that of radioanalytical methods), * are free from the disadvantages of handling radioanalytical materials, and
  • the procedure is to mark one of the two reaction partners of the molecular interaction with a fluorescent marker (“label”), the fluorescence intensity, decay time, or polarization of which is the result of the molecular interaction measurably changes.
  • label a fluorescent marker
  • both reaction partners are even marked, and so-called fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs, the measurement of which has some advantages, but the implementation of which involves considerable additional effort in terms of the marking.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a method for detecting an interaction between two or more molecules which is characterized in that a) at least one of the interaction partners with a luminophore is marked, which has a luminescence decay time of at least 50 ns, b) the marked interaction partner is brought into contact with its potential interaction partner, c) the system is irradiated with light with wavelengths between 300 and 1000 nm, d) after the end of the light irradiation Delay phase is provided, e) the decay time of the luminophore is determined and f) via a determined change in the decay time as a result of
  • a marker is used whose decay time is sometimes longer than that of the background, but at least 50 ns, that a delay time is provided for the measurement, which can be up to 200% of the natural decay time ⁇ , and that instead of the measurement the intensity, decay time or polarization uses the change in the decay time of the marker as a result of the ligand-receptor interaction as analytical information.
  • interactions between molecules can be encompassed, which allows both qualitative and quantitative detection of an analyte to be determined, as well as statements about the type of binding and kinetics of binding.
  • the interaction between two or more molecules detected according to the invention is, in particular, biomolecular interactions. Both natural and synthetic molecules can be used as interaction partners.
  • the method according to the invention is suitable, for example, in particular for the detection of interactions between receptors and ligands or receptors and potential medicaments or their precursors and particularly preferably for the detection of interactions between antigen and antibody, (oligo) nucleotide and (oligo) nucleotide and Polypeptide and ligand, in particular non-peptide small molecule with a molecular weight of ⁇ 1000 Da.
  • At least one of the interaction partners is labeled with a luminophore.
  • the luminophore is a fluorescent or / and phosphorescent, preferably a phosphorescent marker.
  • the decay time of the luminophore is preferably at least 50 ns, more preferably at least 100 ns, and can preferably be up to 1 second, more preferably up to 1 ⁇ s.
  • Luminescence decay time is understood here to mean the decay time which the luminophore has bound to the one interaction partner without the interaction partner entering into an interaction with another molecule.
  • the marked interaction partner is then brought into contact with its potential interaction partner, in particular into molecular contact. If the potential interaction partner is present in the sample, an interaction can be formed between these two interaction partners.
  • the decay time of the luminophore changes due to the formation of the interaction, which is used in the present invention for analysis purposes.
  • the system is irradiated with light, in particular with light with wavelengths between 300 and 1000 nm.
  • the irradiation can take place monochromatically, for example by means of a laser. It is also possible to radiate light with a broad wavelength spectrum, for example using an incandescent lamp.
  • the irradiation is particularly preferably carried out for a predetermined period of time and even more preferably briefly, for example for ⁇ 1 s, more preferably ⁇ 100 ⁇ s, even more preferably ⁇ 10 ⁇ s, most preferably ⁇ 1 ⁇ s and even more preferably for ⁇ 100 ns.
  • a delay phase is provided according to the invention. During this delay phase, disturbing background fluorescence can subside.
  • the delay phase is particularly preferably at least 10 ns, more preferably at least 30 ns and even more preferably at least 50 ns.
  • the delay phase is further adjusted so that it is preferably up to a maximum of 200% of the luminescence decay time, more preferably up to 50% of the luminescence decay time.
  • the decay time of the luminophore is determined, which can be done according to known methods.
  • the method according to the invention relates to a method for the detection of a biomolecular interaction between natural or synthetic molecules, between receptors and ligands or receptors and potential medicaments or their precursors, which is characterized in that a) at least one of the two the interaction partner or binding partner concerned is marked with a phosphorescent marker which has a luminescence decay time between 50 ns and 1 s, b) the binding partner marked in this way is brought into molecular contact with its potential interaction partner, c) the system is briefly exposed to light of the wavelength between 300 and 1000 nm is irradiated, d) after switching off the light pulse, a delay phase of up to 200% of the natural decay time of the luminophore is provided, during which a disturbing background fluorescence can
  • the luminophore or fluorescent or phosphorescent marker can be bound covalently or non-covalently to one of the binding partners.
  • Suitable phosphorescent markers are, for example, metal-ligand complexes, general protein stains, DNA or RNA intercalators and other compounds which have luminescence.
  • a particularly preferred embodiment of the invention is that (1) one of the two binding partners is marked with a marker which has a luminescence decay time between 50 ns and 10 s,
  • the interaction between a ligand and a receptor can be demonstrated by changing the decay time of the luminescence of a marker.
  • the disadvantage here is that the intrinsic luminescence of the biological test material or the components used, in particular the microtiter plates, makes a not insignificant background contribution to luminescence.
  • marker dyes are used which have a decay time ⁇ of> 50 ns and on the other hand that the
  • the time resolution consists in that the sample to be examined is exposed to a short pulse of light and that the decay time ⁇ is only determined after a short delay time (ti) during which the very short-lived ( ⁇ 10 ns) background luminescence decays, so that after the delay time, the luminescence of the marker can be measured very selectively.
  • the change in the decay time allows above all the qualitative detection of the occurrence of an interaction between any receptor and any ligand (for example between antigen and antibody, between two strands of a polynucleotide, between natural receptors and syn- synthetic ligands and the like). However, it can also be used for the quantitative determination of one of the two interacting partners.
  • FIG. 1 illustrates the invention.
  • the biological system is stimulated to luminescence after the interaction. After switching off the excitation light, wait until time ti, after which the background (shown in gray) has subsided. Then the photodetector is opened and the decay time is measured by any method, for example by the rapid lifetime detection method shown in the figures by determining the areas At and A 2 , which are related to the decay time ⁇ via the given equation , This decay time is a direct measure of whether a biomolecular interaction has occurred or not. For reasons of clarity, the decay curve after the interaction between ligand and receptor has not been entered.
  • FIG. 2 shows a life time assay of HSA marked with 55 DC ruthenium and unlabeled anti-HSA.
  • HSA Human serum albumin
  • RuDCC ruthenium-tris-bipyridyl
  • the decay time of the HSA was determined as a function of the amount of antibody (anti-HSA) added. It turns out that the cooldown is made up of two components. One (approx. 100 ns) is analytically useful, the other (approx. 17 ns) remains constant and is therefore not meaningful.
  • Table 1 Changes in cooldown in the interaction of 55DC ruthenium-labeled HSA with unlabeled anti-HSA (at 20 ° C).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen zwei der mehr Molekülen auf Grundlage der Messung der Änderung der Abklingzeit der Lumineszenz, insbesondere der Phosphoreszenz eines an mindestens eines der Moleküle angebrachten Lumino­phors. Zumindest ein Wechselwirkungspartner wird mit einem Luminophor mit einer Abklingzeit von mindestens 50 ns markiert. Nach dem Abschalten des Lichtpulses ist eine Verzögerungsphase vorgesehen, während der eine störende Untergrundfluoreszenz abklingen kann.

Description

Bioanalytisches Verfahren auf Grundlage der Messung der Abklingzeit der Phosphoreszenz
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr Molekülen auf Grundlage der Messung der Abklingzeit der Lumineszenz, insbesondere der Phosphoreszenz eines an mindestens eines der Moleküle angebrachten Lumino- phors.
Fluoreszenz und Phosphoreszenz (allgemein: Lumineszenzmethoden) werden in der Bioanalytik eingesetzt, um Wechselwirkungen zwischen zwei Reaktionspartnern nachzuweisen. Wechselwirkungen treten beispielsweise auf, wenn a) ein Antigen mit einem Antikörper reagiert, was zu Zwecken der
Immunanalytik und -diagnostik eingesetzt werden kann; b) ein Oligonukleotid mit seinem Gegenstrang eine Doppelhelix. bildet, was zu Zwecken der Genanalytik und -diagnose eingesetzt werden kann; c) ein Rezeptor einen Liganden bindet, was pharmakologischen
Studien über Wirkungsorte und Bindungsaffinitäten erlaubt, und d) im Drug-Screening, wenn ein so genanntes Prodrug an einen
Rezeptor oder ein Enzym bindet, was zu Zwecken der schnellen Identifikation von potenziellen Medikamenten, unter anderem im high-troughput screening, eingesetzt werden kann.
Diese und andere Wechselwirkungen werden auch oft unter dem Begriff (bio)molekulare Affinität subsummiert.
Die erwähnten Lumineszenzmethoden werden deshalb gerne verwendet, weil sie * eine hohe Empfindlichkeit besitzen (die der von radioanalytischen Verfahren nahe kommt), * von den Nachteilen des Umganges mit radioanalytischen Materialien frei sind, und
* instrumentell vergleichsweise einfach durchzuführen sind.
In praktisch allen Fällen geht man dabei so vor, dass man den einen der beiden Reaktionspartner der molekularen Wechselwirkung mit einem fluo- reszenten Marker ("Label") markiert, dessen Fluoreszenzintensität, -abkling- zeit, oder -Polarisation sich als Folge der molekularen Wechselwirkung messbar ändert. In einem anderen Verfahren werden sogar beide Re- aktionspartner markiert, und es kommt zum sogenannten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), dessen Messung einige Vorteile aufweist, deren Durchführung aber mit einem erheblichen Mehraufwand hinsichtlich der Markierung verbunden ist.
Die Messung Fluoreszenzintensität, -abklmgzeit oder -Polarisation leidet allerdings unter dem gravierenden Nachteil, dass praktisch jegliche Untergrundfluoreszenz ebenfalls miterfasst wird. Zahlreiche Biomoleküle besitzen nämlich eine Eigenfluoreszenz, die von der des Markers oft schwer zu differenzieren ist. Auch die (häufig verwendeten) Mikrotiterplatten aus Plastik fluoreszieren stark. Beide Fluoresenzen bilden ein Untergrundsignal unbekannter Größe. Dies hat zur Folge, dass die gemessene Änderung der Fluoreszenzintensität, -abklingzeit oder -polarisation nicht nur die Anwesenheit (oder Konzentration) eines Antikörpers, eines DNA-Gegenstrangs, eines Liganden oder eines Prodrugs wiederspiegelt, sondern durch einen unbe- kannten Fluoreszenzuntergrund verfälscht wird.
Eine Aufgabe der Erfindung bestand deshalb darin, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem das Untergrundsignal weitestgehend ausgeschalten wird.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Molekülen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass a) zumindest einer der Wechselwirkungspartner mit einem Luminophor markiert wird, der eine Lumineszenzabklingzeit von mindestens 50 ns besitzt, b) der markierte Wechselwirkungspartner mit seinem potenziellen Wechselwirkungspartner in Kontakt gebracht wird, c) das System mit Licht mit Wellenlängen zwischen 300 und 1000 nm bestrahlt wird, d) nach dem Ende der Lichteinstrahlung eine Verzögerungsphase vorgesehen wird, e) die Abklingzeit des Luminophors bestimmt wird und f) über eine festgestellte Änderung der Abklingzeit als Folge einer
Wechselwirkung zwischen den zwei oder mehr Molekülen eine Wechselwirkung zwischen den zwei oder mehr Molekülen nachgewiesen wird.
Im hier beschriebenen Verfahren werden diese Probleme des Standes der Technik dadurch gelöst, dass man ein zeitauflösendes Messverfahren einsetzt. Die Fluoreszenz vieler Marker klingt - ebenso wie die des Untergrunds - im Nanosekundenbereich ab (typischerweise 1 - 100 ns). Als Abklingzeit bezeichnet man jene Zeit, nach der die Lumineszenzintensität eines Luminophors (Ft) auf den Bruchteil 1/e der anfänglichen Fluo- resenzintensität (F0) gefallen ist; es gilt im einfachsten Fall die Beziehung Ft = F0-e",'τ. Gängige Verfahren (z.B. die Pulsfluorometrie oder die Phasenfluo- rometrie) können aber nicht zwischen Untergrundfluoreszenz und analy- tischem Signal unterscheiden. Erfindungsgemäß wird di es dadurch gelöst, dass man einen Marker verwendet, dessen Abklingzeit vi ei l länger ist als die des Untergrundes, mindestens aber 50 ns, das man bei der Messung eine Verzögerungszeit vorsieht, die bis zu 200 % der natürlichen Abklingzeit τ betragen kann, und dass man anstelle der Messung der Intensität, Abklingzeit oder Polarisation die Änderung der Abklingzeit des Markers als Folge der Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung als analytische Information heranzieht.
Erfindungsgemäß wird also die durch Bestimmung der Abklingzeit eines mit einem Luminophor markierten Wechselwirkungspartners und durch die Be- stimmung der Abklingzeit bei erfolgter Wechselwirkung zwischen diesem markierten Wechselwirkungspartner und einem oder mehreren weiteren Wechselwirkungspartnern eine Änderung festgestellt, die dann als analytische Kenngröße verwendet wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Wechselwirkungen zwischen Molekülen umfasst werden, was sowohl einen qualitativen als auch einen quantitativen Nachweis eines zu bestimmenden Analyten erlaubt als auch Aussagen über Bindungsart sowie Bindungskinetik.
Bei der erfindungsgemäß nachgewiesenen Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Molekülen handelt es sich insbesondere um biomolekulare Wechselwirkungen. Als Wechselwirkungspartner können dabei sowohl natürliche als auch synthetische Moleküle Verwendung finden. Das erfindungs- gemäße Verfahren eignet sich beispielsweise insbesondere zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden oder Rezeptoren und potenziellen Medikamenten bzw. deren Vorstufen und besonders bevorzugt zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Antigen und Antikörper, (Oligo)-Nukleotid und (Oligo)-Nukleotid sowie Polypeptid und Ligand, insbesondere nichl-peptidisches kleines Molekül mit einem Molekulargewicht von < 1000 Da.
Erfindungsgemäß wird zumindest einer der Wechselwirkungspartner mit einem Luminophor markiert. Bei dem Luminophor handelt es sich um einen fluoreszenten oder/und phosphoreszenten, bevorzugt um einen phosphoreszenten Marker. Die Abklingzeit des Luminophors beträgt vorzugsweise mindestens 50 ns, mehr bevorzugt mindestens 100 ns und kann vorzugsweise bis zu 1 Sekunde, mehr bevorzugt bis zu 1 μs betragen. Unter Lumineszenzabklingzeit wird hier die Abklingzeit verstanden, die der Lumino- phor gebunden an den einen Wechselwirkungspartner aufweist, ohne dass der Wechselwirkungspartner eine Wechselwirkung mit einem weiteren Molekül eingeht. Der markierte Wechselwirkungspartner wird dann mit seinem potenziellen Wechselwirkungspartner in Kontakt, insbesondere in molekularen Kontakt gebracht. Dabei kann, falls der potenzielle Wechselwirkungspartners in der Probe vorhanden ist, eine Wechselwirkung zwischen diesen beiden Wechselwirkungspartnern ausgebildet werden. Durch die Ausbildung der Wechselwirkung ändert sich die Abklingzeit des Luminophors, was in der vorliegenden Erfindung zu Analysezwecken genutzt wird.
Zur Anregung der Lumineszenz wird das System mit Licht bestrahlt, ins- besondere mit Licht mit Wellenlängen zwischen 300 und 1000 nm. Die Einstrahlung kann dabei monochromatisch, beispielsweise mittels eines Lasers erfolgen. Es ist auch möglich, Licht mit einem breiten Wellenlängenspektrum einzustrahlen, beispielsweise mittels einer Glühlampe. Besonders bevorzugt erfolgt die Einstrahlung für eine vorbestimmte Zeitdauer und noch mehr bevorzugt kurz, beispielsweise für < 1 s, mehr bevorzugt < 100 μs, noch mehr bevorzugt < 10 μs, am meisten bevorzugt < 1 μs und noch mehr bevorzugt für < 100 ns. Nach dem Ende der Lichteinstrahlung, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gleichgesetzt wird mit dem Abschalten des Lichtpulses, wird erfindungsgemäß eine Verzögerungsphase vorgese- hen. Während dieser Verzögerungsphase kann störende Untergrundfluo- reszenz abklingen. Besonders bevorzugt beträgt die Verzögerungsphase mindestens 10 ns, mehr bevorzugt mindestens 30 ns und noch mehr bevorzugt mindestens 50 ns. Die Verzögerungsphase wird weiterhin so eingestellt, dass sie vorzugsweise bis zu maximal 200 % der Lumineszenzabkling- zeit, mehr bevorzugt bis zu 50 % der Lumineszenzabklingzeit beträgt. Nach der Verzögerungsphase wird die Abklingzeit des Luminophors ermittelt, was nach bekannten Methoden erfolgen kann. Über eine festgestellte Änderung der Abklingzeit als Folge einer Wechselwirkung zwischen den zwei oder mehr Molekülen kann dann erfindungsgemäß das Vorliegen eines Wechsel- Wirkungspartners qualitativ oder/und quantitativ bestimmt werden bzw. Wirkungsart und Bindeaffinität der Wechselwirkungspartner festgestellt werden. ln einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zum Nachweis einer biomolekularen Wechselwirkung zwischen natürlichen oder synthetischen Molekülen, zwischen Rezeptoren und Liganden oder Rezeptoren und potenziellen Medi- kamenten bzw. deren Vorstufen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass a) zumindest einer der beiden betroffenen Wechselwirkungspartner bzw. Bindungspartner mit einem phosphoreszenten Marker markiert wird, der eine Lumineszenzabklingzeit zwischen 50 ns und 1 s besitzt, b) der so markierte Bindungspartner mit seinem potenziellen Wechsel- Wirkungspartner in molekularen Kontakt gebracht wird, c) das System kurz mit Licht der Wellenlänge zwischen 300 und 1000 nm bestrahlt wird, d) nach dem Abschalten des Lichtpulses eine Verzögerungsphase von bis zu 200 % der natürlichen Abklingzeit des Luminophors vorgesehen wird, während der eine störende Untergrundfluoreszenz abklingen kann, e) die Abklingzeit des Luminophors nach einer bekannten Methode ermittelt wird, und f) über eine eingetretene Änderung der Abklingzeit eine moleku- lare Wechselwirkung der Bindungspartner nachgewiesen wird bzw. anhand vorab erstellter quantitativer Beziehungen zwischen der Änderung der Abklingzeit und der Konzentration eines Reaktionspartners dessen Konzentration quantitativ ermittelt wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann der Luminophor oder fluoreszierende bzw. phosphoreszierende Marker kovalent oder nicht-kovalent an einen der Bindungspartner gebunden vorliegen. Geeignete phospho- reszente Marker sind beispielsweise Metall-Ligandenkomplexe, General Protein Stains, DNA- oder RNA-Interkalatoren sowie andere Verbindungen, welche eine Lumineszenz aufweisen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass man (1) einen der beiden Bindungspartner mit einem Marker markiert, der eine Lumineszenzabklingzeit zwischen 50 ns und 10 s besitzt,
(2) den Bindungspartner eine molekulare Wechselwirkung mit seinem Gegenstück eingehen lässt, (3) das Produkt dieser molekularen Wechselwirkung mit einem Puls von Licht (300 bis 1000 nm) bestrahlt,
(4) danach eine Verzögerungsphase von bis zu 50 % der Abklingzeit des Luminophors vorsieht,
(5) danach die Abklingcharakteristik des Luminophors ermittelt, und (6) aus der so ermittelten Änderung der Abklingcharakteristik das
Eintreten der Wechselwirkung nachweist, bzw. anhand vorab ermittelter quantitativer Beziehungen zwischen Änderung der Abklingzeit und der Konzentration eines der Reaktionspartners auf dessen Anwesenheit schließt bzw. Konzentration berechnet.
Die Wechselwirkung zwischen einem Liganden und einem Rezeptor kann über eine Änderung der Abklingzeit der Lumineszenz eines Markers nachgewiesen werden. Dabei wirkt sich nachteilig aus, dass die Eigenlumineszenz des biologischen Untersuchungsmaterials bzw. der eingesetzten Komponenten, insbesondere der Mikrotiterplatten, einen nicht unwesentlichen Untergrundbeitrag zur Lumineszenz liefert. Um dieses Problem zu lösen, wird zum einen vorgeschlagen, dass man Markerfarbstoffe verwendet, die eine Abklingzeit τ von > 50 ns besitzen und zum anderen, dass die
Messung zeitaufgelöst vorgenommen wird. Die Zeitauflösung besteht darin, dass die zu untersuchende Probe einem kurzen Puls von Licht ausgesetzt wird, und dass die Abklingzeit τ erst nach Ablauf einer kurzen Verzögerungszeit (ti) bestimmt wird, während der die sehr kurzlebige (< 10 ns) Hintergrundlumineszenz abklingt, sodass nach der Verzögerungszeit die Lumineszenz des Markers sehr selektiv gemessen werden kann. Die Änderung der Abklingzeit erlaubt vor allem den qualitativen Nachweis des Eintretens einer Wechselwirkung zwischen einem beliebigen Rezeptor und einem beliebigen Liganden (z.B. zwischen Antigen und Antikörper, zwischen zwei Strängen eines Polynukleotids, zwischen natürlichen Rezeptoren und syn- thetischen Liganden und dgl.). Sie kann aber auch zur quantitativen Bestimmung eines der beiden wechselwirkenden Partner herangezogen werden.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die folgenden Bei- spiele weiter erläutert.
Figur 1 veranschaulicht die Erfindung. Das biologische System wird nach der Wechselwirkung zur Lumineszenz angeregt. Nach Abschalten des Anregungslichtes wird bis zur Zeit ti gewartet, wonach der Untergrund (grau dargestellt) abgeklungen ist. Danach wir dder Fotodetektor geöffnet und die Abklingzeit nach einer beliebigen Methode gemessen, z.B. nach der in der Figuren angeführten rapid-lifetime-detection-Mei ode durch Ermittlung der Flachen At und A2, die über die angegebene Gleichung in definierter Beziehung zur Abklingzeit τ stehen. Diese Abklingzeit ist ein direktes Maß da- für, ob eine biomolekulare Wechselwirkung eingetreten ist oder nicht. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die Abklingkurve nach der eingetretenen Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor nicht eingetragen.
Figur 2 zeigt einen Lifetimeassay von mit 55 DC-Ruthenium mar- kiertem HSA und unmarkiertem Anti-HSA.
Beispiel 1
Im Folgenden wird ein typisches experimentelles Ergebnis dargestellt. Humanserumalbumin (HSA) wurde in an sich bekannter Weise mit dem Fluo- reszenzmarker Ruthenium-tris-bipyridyl (RuDCC) markiert (siehe den Artikel: Polarization Immunoassays Using Reactive Ruthenium Metal-Ligand Complexes as Luminescent Labels, A. Dürkop, F. Lehmann, O.S. Wolfbeis, Anal. Bioanal. Chem. 372 (2002) 688-694). Die Abklingzeit des HSA wurde als Funktion der zugegebenen Menge an Antikörper (anti-HSA) ermittelt. Es stellt sich heraus, dass die Abklingzeit aus zwei Komponenten besteht. Die eine (ca. 100 ns) ist analytisch nützlich, die andere (ca. 17 ns) bleibt konstant und ist somit ohne Aussagekraft. Die folgende Tabelle gibt die Messwerte wieder: Tabelle 1. Änderungen der Abklingzeit bei der Wechselwirkung eines mit 55DC-Ruthenium-markiertem HSA mit unmarkiertem Anti-HSA (bei 20 °C).
Die Daten sind in Figur 2 grafisch dargestellt. Man erkennt daraus, dass
(a) die eingetretene Wechselwirkung zwischen Antigen (USA) und dem Antikörper sich in einer Änderung der Abklingzeit äußert und somit über deren Messung nachweisbar ist;
(b) die gemessene Abklingzeit mit der Konzentration an Antikörper korreliert;
(c) die Änderung der Abklingzeit ca. 130 ns beträgt, was messtechnisch viel leichter erfassbar ist als es z.B. Änderungen sind, die im Sub- Nanosekundenbereich liegen.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Molekülen, dadurch gekennzeichnet, dass a) zumindest einer der Wechselwirkungspartner mit einem Luminophor markiert wird, der eine Lumineszenzabklingzeit von mindestens 50 ns besitzt, b) der markierte Wechselwirkungspartner mit seinem potenziellen Wechselwirkungspartner in Kontakt gebracht wird, c) das System mit Licht mit Wellenlängen zwischen 300 und 1000 nm bestrahlt wird, d) nach dem Ende der Lichteinstrahlung eine Verzögerungsphase vorgesehen wird, e) die Abklingzeit des Luminophors bestimmt wird und f) über eine festgestellte Änderung der Abklingzeit als Folge einer Wechselwirkung zwischen den zwei oder mehr Molekülen eine Wechselwirkung zwischen den zwei oder mehr Molekülen nachgewiesen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass durch die festgestellte Änderung der Abklingzeit mindestens eines der Moleküle qualitativ oder/und quantitativ bestimmt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) zumindest einer der Wechselwirkungspartner mit einem fluoreszenten oder/und phosphoreszenten Luminophor markiert wird, der eine Lumineszenzabklingzeit zwischen 50 ns und 1 s besitzt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) das System für eine Zeitdauer von < 1 Sekunde, insbesondere < 10 μs mit Licht bestrahlt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verzögerungsphase mindestens 10 ns, insbesondere mindestens 20 ns und bis zu 200 % der Abklingzeit der Luminophors, ins- besondere bis zu 50 % der Abklingzeit des Luminophors beträgt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine quantitative Bestimmung eines der Wechselwirkungspartner anhand vorhab erstellter quantitativer Beziehungen zwischen der
Änderung der Abklingzeit und der Konzentration dieses Wechselwirkungspartners durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Nachweis einer biomolekularen Wechselwirkung zwischen natürlichen oder synthetischen Molekülen, zwischen Rezeptoren und Liganden oder Rezeptoren und potenziellen Medikamenten bzw. deren Vorstufen, dadurch gekennzeichnet, dass a) zumindest einer der beiden betroffenen Wechselwirkungspartner bzw. Bindungspartner mit einem phosphoreszenten Marker markiert wird, der eine Lumineszenzabklingzeit zwischen 50 ns und 1 s besitzt, b) der so markierte Bindungspartner mit seinem potenziellen Wechselwirkungspartner in molekularen Kontakt gebracht wird, c) das System kurz mit Licht der Wellenlänge zwischen 300 und 1000 nm bestrahlt wird, d) nach dem Abschalten des Lichtpulses eine Verzögerungsphase von bis zu 200 % der natürlichen Abklingzeit des Luminophors vorgesehen wird, während der eine störende Untergrundfluoreszenz abklingen kann, e) die Abklingzeit des Luminophors nach einer bekannten Methode ermittelt wird, und f) über eine eingetretene Änderung der Abklingzeit eine molekulare Wechselwirkung der Bindungspartner nachgewiesen wird bzw. anhand vorab erstellter quantitativer Beziehungen zwischen der Änderung der Abklingzeit und der Konzentration eines Reaktionspartners dessen Konzentration quantitativ ermittelt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker kovalent an einen Bindungspartner gebunden vorliegt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der phosphoreszente Marker ein Metall-Ligandenkomplex ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, daεäurch gekennzeichnet, dass einer der bindungspartner ein Protein, ein Antikörper, ein Antigen oder ein proteinartiger Rezeptor ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Bindungspartner ein natürliches oder synthetisches Nukleinsäureoligomer ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Bindungspartner ein natürlicher oder synthetischer Ligand oder ein Prodrug ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass einer der Bindungspartner mit einen phosphoreszierenden Marker nicht-kovalent markiert vorliegt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der phosphoreszierende Marker ein so genannter General Protein Stain ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der phosphoreszente Marker ein so genannter DNA- oder RNA- Interkalator ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Wechselwirkung mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode unter Verwendung von Mikrotiterplatten erfolgt.
EP04715275A 2003-02-27 2004-02-27 Bioanalytisches verfahren auf grundlage der messung der abklingzeit der phosphoreszenz Withdrawn EP1639348A1 (de)

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