DE69330834T2

DE69330834T2 - Quantitative detektierung von makromolekülen mit hilfe von fluoreszierenden oligonukleotiden

Info

Publication number: DE69330834T2
Application number: DE69330834T
Authority: DE
Inventors: Catherine A. Royer
Original assignee: RP TECHNOLOGIES Inc
Current assignee: RP TECHNOLOGIES Inc
Priority date: 1992-11-23
Filing date: 1993-11-23
Publication date: 2002-06-13
Anticipated expiration: 2013-11-24
Also published as: WO1994012665A1; DE69330834D1; US5445935A; US5756292A; US6326142B1; EP0672191A1; JP2004069713A; JPH08505285A; EP0672191B1; JP2004004128A; EP0672191A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus einem markierten Makromolekül, um das Binden des markierten Makromoleküls an ein zweites Makromolekül zu bewerten. Somit ist die Erfindung gerichtet auf analytische Verfahren zum Bestimmen eines solchen Bindens in einer quantitativen Art und Weise. Die Erfindung ist auch auf eine Vorrichtung zum Durchführen von Bindungsanalysen unter Verwendung der Messung von Fluoreszenzpolarisation gerichtet.

Beschreibung der verwandten Technik

Die Verwendung markierter Oligonukleotide als Sonden bei der makromolekularen Analyse ist eine wichtige Technik in der Molekularbiologie. Oligonukleotide wurden mit Radioisotopen, Enzymen oder fluoreszierenden Molekülen markiert. Aufgrund der relativ geringen Molekulargewichte von Oligonukleotiden und der gewöhnlichen Verfügbarkeit des Instrumentariums für deren automatisierte Synthese werden Oligonukleotide häufig bei Blot- Hybridisierungsverfahren oder bei Gel-Retardierungsassays zur Detektion und qualitativen Beurteilung von Makromolekülen verwendet, mit denen sie assoziieren können. Diese Makromoleküle können entweder Proteine, RNA-Moleküle oder DNA-Moleküle sein.
Bei einem üblichen Blot-Hybridisierungsverfahren wird das Ziel-Makromolekül durch Elektrophorese in einer Gelmatrix, gewöhnlich Agarose oder Polyacrylamid, abgetrennt. Es wird dann derart zu einer Membran überführt, dass seine relative räumliche Positionierung innerhalb der Gelmatrix gewahrt und es sicher an der Membran befestigt wird. Alternativ kann das Makromolekül ohne vorherige Elektrolyse an der Membran befestigt werden. Die Gegenwart des Makromoleküls auf der Membran wird festgestellt, indem ein markiertes Oligonukleotid daran gebunden und der Komplex Autoradiographie unterworfen wird, oder, wenn das Oligonukleotid mit Radioisotop markiert ist, mittels einer Szintillationszählung.
Bei einem üblichen Gel-Retardierungsassay wird ein Oligonukleotid, das mit einem Radioisotop oder einer anderen detektierbaren Komponente markiert wurde, einer Elektrophorese in einer Gelmatrix, gewöhnlich aus Agarose oder Acrylamid, unter nichtdenaturierenden Bedingungen unterworfen. Das markierte Oligonukleotid wird ferner mit einem Protein, das an das Oligonukleotid binden kann, in Verbindung gebracht und das Gemisch wird zum Vergleich mit dem nicht-assoziierten Oligonukleotid auf einem Gel, gewöhnlich in einer benachbarten Bahn, einer Elektrophorese unterworfen. Aufgrund seines höheren Molekulargewichts und seiner geringeren negativen Ladung wird das Protein im Gel eine geringere Beweglichkeit als das nicht-assoziierte Oligonukleotid zeigen. Wenn das Oligonukleotid mit dem Protein einen stabilen Komplex bildet, wird es ebenfalls eine geringere Beweglichkeit als die des nicht-assoziierten Oligonukleotids zeigen. Der Beweglichkeitsvergleich der Oligonukleotidbeweglichkeit in Gegenwart und bei Abwesenheit des Proteins gestattet eine qualitative Bestimmung, ob sich zwischen den zwei Makromolekülen ein Komplex bildet. Diese grundlegenden Verfahren werden für eine sehr große Vielfalt von Bestimmungen in der genetischen Grundlagenforschung, in der Gentechnik, in der Medizin und bei der landwirtschaftlichen Untersuchung verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren und Quantifizieren der Komplexierung zwischen Nukleinsäuren und Proteinen oder anderen Makromolekülen, welches die Messung der Polarisation der Fluoreszenz eines kovalent an ein Oligonukleotid gekoppelten, nicht zugehörigen Fluorophors umfasst. Das Oligonukleotid kann ein Oligodesoxyribonukleotid, ein Oligoribonukleotid oder ein Copolymer aus beiden sein. Die Nukleotidbasen können, wie auch die Kette des Grundgerüsts, derivatisiert sein. Das Oligonukleotid kann einzel-, doppel- oder dreifachsträngig sein. Die Länge des Oligonukleotids wird durch den durchgeführten spezifischen Versuch bestimmt, ist aber vorzugsweise weniger als 40 Bausteine lang, eher bevorzugt weniger als 25 Bausteine lang und am meisten bevorzugt 8-10 Bausteine lang.
Das Fluorophor wird unter Verwendung üblicher automatisierter DNA- Synthesetechniken und fluoreszenzmarkierter Amino-Linkerverbindungen (z.B. jene von Clontech, Inc., La Jolla, CA, erhältlichen) an jeder beliebigen Stelle in das Oligonukleotid eingebaut. Als andere Möglichkeit können nicht-markierte Amino-Linkerverbindungen eingebaut und anschließend mit der fluoreszierenden Verbindung markiert werden. Eine Vielfalt von Fluorophoren kann verwendet werden, einschließlich Fluoreszein, Eosin, Cumarin und Dansylderivaten. Die schnelle Drehung um die kurze Achse des Oligonukleotids führt zu einem geringen Wert der Fluoreszenzpolarisation der kovalent an das Oligonukleotid gekoppelten Sonde. Dieser Wert wird erhalten, indem das fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid mit der geeigneten Wellenlänge linearpolarisierten Anregungslichts angeregt wird und die Emission von in den zur Polarisationsebene des Anregungslichts parallelen und senkrechten Ebenen polarisiertem Licht überwacht wird. Die Fluoreszenzpolarisation wird berechnet als:
p = (III - IL)/(III + IL)
wo III die Intensität des in einer zur Polarisationsebene des Anregungslichts parallelen Ebene polarisierten emittierten Lichts ist und IL die Intensität des in einer zur Polarisationsebene des Anregungslichts senkrechten Ebene polarisierten emittierten Lichts ist.
Die Anisotropie der Emission ist
2/3[1/(1/p - 1/3)]
Dieser Wert ist analog zur Polarisation, trotzdem linear in bezug auf die Gesamtfluoreszenzemissionsintensität.
Fluoreszenzpolarisation ist die Grundlage für eine Reihe von patentierten Assays zur klinischen Detektion von Drogen, Steroiden und anderen Antigenen (U.S. Patente 4,269,511; 4,516,856; 4,585,862; 4,668,640; 4,784,961; 4,902,630; 4,952,691; 5,066,426; europäische Patentanmeldung EP-A - 0 194 472). Obwohl es eine Anzahl von Unterschieden gibt, sind alle diese Assays angewiesen auf die Beobachtung einer großen Änderung in der Fluoreszenzpolarisation von Fluoreszein zufolge einer Änderung seiner Wechselwirkung mit spezifischen oder unspezifischen Antikörpern, wenn die interessierende Droge in der Probenlösung vorhanden ist. Wenn die Anwesenheit der Droge zum Beispiel zur Dissoziation des Fluoreszein-Antikörper-Komplexes führt, dann wird die Fluoreszenzpolarisation eine starke Abnahme zeigen. Die Empfindlichkeit dieser Assays beträgt weniger als 10 pM. Urios und Cittanova (15) beschreiben die Verwendung fluoreszenzmarkierter Fab-Fragmente von Antikörpern zur Durchführung von Fluoreszenzpolarisationsmessungen. Die Empfindlichkeit ihres Assays beträgt 2,5 uM. Über die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonde wurde von Murakami et al. (17) berichtet. Die von ihnen angegebene Sensitivität betrug 100 nanomolar. Giedroc et al. (16) verwendeten Fluoreszenzanisotropie zur Beurteilung der Anwesenheit einzelsträngiger DNA-Moleküle. Deren Assays wurden bei Oligonukleotidkonzentrationen von 2 bis 8 uM durchgeführt.
Die US 4 516 856 beschreibt solch eine Polarisationsvorrichtung, bei welcher polarisiertes Licht auf eine Probe gestrahlt wird. Emittiertes Licht aus dieser fluoreszierenden Probe wird hintereinander in zwei senkrechten Ebenen polarisiert und mittels eines Photomultipliers gemessen. Durch einen Strahlteiler wird ein Teil des einfallenden Lichts auf einen Referenzdetektor zurückgeworfen. Ein anderes Beispiel für eine derartige Polarisationsvorrichtung wird in der DE 32 08 919 A1 gezeigt, bei der zwei Lichtstrahlen mit senkrechten Polarisationsebenen nacheinander durch eine Probe hindurchgehen und mittels zweier Detektionsvorrichtungen auf der gegenüberliegenden Seite der Probe detektiert werden. Die EP 0 382 433 A2 stellt ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Fluoreszenzpolarisation bereit. Die Fluoreszenz einer fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure wird zuerst gemessen, gefolgt von deren Hybridisierung mit einer komplementären Nukleinsäure und einer zweiten Messung.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, mittels welchem das Aneinanderbinden von zwei Makromolekülen in der Lösungsphase durch Messen der Polarisation der Fluoreszenzemission aus einer Sondenkomponente detektiert werden kann. Vorzugsweise ist die Sonde an einem Makromolekül befestigt und das Binden wird durch eine Zunahme der Fluoreszenzpolarisation direkt bestimmt. Ein zweites Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Vorrichtung, die geeignet ist, die Fluoreszenzpolarisationsmessungen mit sehr hoher Empfindlichkeit durchzuführen, um solche Messungen quantitativ an sehr kleinen Proben durchführen zu können. In bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtung kann die Detektion der Polarisation der Fluoreszenzemission von so wenig wie einem Femtomol an Fluorophor detektiert werden.
Ein drittes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Diagnoseverfahren zur Verfügung zu stellen, die auf der Messung des Bindens eines Polynukleotids an ein zweites Polynukleotid, oder alternativ an ein Protein, beruhen, und zwar mittels Quantifizierung der Polarisation der Emission aus einem Fluorophor, das an einem der Polynukleotide kovalent befestigt ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1A zeigt die Titration eines fluoreszenzmarkierten doppelsträngigen Oligodesoxynukleotids, enthaltend eine Trp-Operator-Sequenz, mit einem gereinigten Tryptophan-Repressorprotein. Die Pufferbedingungen waren 10 mM Phosphat, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerol, pH 7,6 in Gegenwart von 0,4 mM L-Tryptophan. Das Gesamtprobenvolumen betrug 700 ul. Die Konzentration des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids betrug 200 pM. Die Fluoreszenzanisotropie ist als Funktion des Logarithmus der als Monomer ausgedrückten Proteinkonzentration aufgetragen. Die Linien durch die Punkte stellen die nicht-lineare Analyse der Daten nach einem Modell dar, bei dem ein Monomer/Dimer-Gleichgewicht mit dem Dimer-DNA-Bindungsgleichgewicht gekoppelt ist.
Die Fig. 1C und 1D zeigen die freien Energiediagramme für ein einfaches Bindungsschema und das Protein-Protein- und Protein-DNA-gekoppelte Wechselwirkungsschema. Die Daten wurden unter Verwendung dieser beiden Modelle, wie in den Fig. 1A und 1B gezeigt, angepasst.
Fig. 2. Graphische Darstellung von X² (Ordinate) gegen die freie Energie in kcal (Abszisse) für das in Fig. 1C angegebene thermodynamische Modell.
Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit des Profils des Bindens des Trp-Repressors an ein synthetisches, eine Trp-Operatorsequenz enthaltendes Oligonukleotid von der Konzentration des Oligonukleotids. Die Stöchiometrie des gebildeten Komplexes ist eine subtile Funktion der absoluten und relativen Konzentrationen an Protein und Oligonukleotid. So wird ein primäres Plateau erreicht, das bei geringeren DNA-Konzentrationen deutlicher ist, gefolgt von einem weiteren Anstieg der Anisotropie bei Bildung von Komplexen höherer Ordnung. Die DNA-Konzentrationen betrugen 200 pM, 1 nM und 20 nM.
Fig. 4 zeigt die Abhängigkeit des Bindens des Trp-Repressorproteins an das Operatoroligonukleotid von der Tryptophankonzentration. Offene Kreise stellen das Binden von Protein an 1 nM Oligonukleotid in Gegenwart von 4,0 mM Tryptophan dar, offene Dreiecke zeigen das Binden in der Gegenwart von 0,4 mM Tryptophan, offene Rauten 40 uM Tryptophan und die geschlossenen Kreise bezeichnen das Bindungsprofil in Abwesenheit des Tryptophan-Mitrepressors.
Fig. 5. Draufsichtzeichnung eines hochempfindlichen T-Format-Polarisationsfluorometers auf Lampenbasis.
Fig. 6. Draufsichtzeichnung eines hochempfindlichen T-Format-Polarisationsfluorometers auf Laserbasis.
Fig. 7. Draufsichtzeichnung eines hochempfindlichen L-Format-Polarisationsfluorometers auf Lampenbasis.
Fig. 8. Draufsichtzeichnung eines hochempfindlichen L-Format-Polarisationsfluorometers auf Lampenbasis.
Fig. 9. Detailzeichnung eines faseroptischen, hochempfindlichen T-Format- Polarisationsfluorometers auf Lampenbasis in Draufsicht, die insbesondere die Einzelheit des Probenabteils und die Anordnung des Filmpolarisators zeigt.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung definiert Verfahren, mittels welcher die Verbindung zwischen einem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid und einem anderen Makromolekül, wie z.B. einem Protein oder einer Nukleinsäure, rasch, genau und mit hoher Empfindlichkeit in Lösung gemessen werden kann. Vor allem betrifft diese Erfindung die Detektion der Komplexbildung (d. h. die Bildung eines stabilen, spezifischen, nichtkovalenten Verbands) zwischen dem Oligonukleotid und dem Zielmakromolekül, jedes in sehr geringer Konzentration, durch die Messung der Fluoreszenzpolarisation einer nicht zugehörigen fluoreszierenden Sonde, die mit dem Oligonukleotid kovalent gekoppelt ist. Die Fluoreszenzpolarisationsdetektion beruht auf dem Anstieg der Rotationskorrelationszeit der kovalent mit dem Oligonukleotid verbundenen Sonde als Folge der Größenzunahme des taumelnden Partikels, wenn das Protein oder ein anderes Makromolekül mit ihm komplexiert wird, verglichen mit der Rotationskorrelationszeit des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids in Abwesenheit wechselwirkender Makromoleküle. Bei Verwendung des geeigneten Instrumentariums können Fluoreszenzpolarisationsmessungen sehr schnell durchgeführt werden, gewöhnlich auf den Auftrag oder 5-10 Minuten. Im Gegensatz dazu benötigt eine Blot-Hybridisierungs- oder Gel-Retardierungsanalyse, wie oben beschrieben, einen vollen Tag - und sehr oft länger -, zur Fertigstellung. Alternative Verwendungen von Fluoreszenzpolarisationsmessungen bei der Makromolekularanalyse wurden beschrieben (15-17). Diese Verfahren liefern jedoch keine ausreichende Empfindlichkeit, um sie bei praktischen Anwendungen nützlich zu machen. Biologische Makromoleküle werden häufig in äußerst kleinen Mengen aufgefunden und verlangen analytische Empfindlichkeiten unterhalb von nanomolekularen Niveaus. Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren erlaubt die Durchführung von Messungen auf picomolarem Niveau - durchaus im verlangten Bereich und mindestens um das 10.000-fache empfindlicher als anderswo berichtet. Alternative Verfahren der Makromolekülanalyse sind zum größten Teil qualitativ und deshalb ungenau. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung sorgt für hochgenaue quantitative Messungen.
Hohe Empfindlichkeit und damit ein für eine genaue quantitative Analyse von niedrigen Konzentrationen wechselwirkender Moleküle notwendiger hoher Störabstand wird erzielt bei Verwendung einer ILC 300 Watt Xenon-Bogenampe/ISA Monochromator- Anregungsquelle, die durch ein rechteckig bis kreisförmig geschmolzenes, faseroptisches Oriel-Siliziumdioxid-Kabel mit dem Probenabteil gekoppelt ist. Am Probenhalter in einem gekreuzten T-Format bei der Emission und mit paralleler Ausrichtung bei der Anregung angebrachte Filmpolarisatoren erlauben eine Detektion bis zur 10 picomolar-Grenze. Es wird erwartet, dass die Verwendung einer Laser-Anregungsquelle zu einer 10- bis 100-fachen Zunahme der Empfindlichkeit, also einiges in den subpicomolaren Probenkonzentrationsbereich hinein, führt, da die Fluoreszenz proportional der Anregungsquellenintensität ist.
Mehrere andere Ausführungsformen der Vorrichtung können verwendet werden. Das T-Format, das feste Polarisationselemente, wie in den Fig. 5 und 6 dargestellt, verwendet, kann auf ein L-Format geändert werden, das einen drehbaren Emissionspolarisator verwendet. Die Verwendung eines Laser-Beleuchtungsmittels beseitigt die Notwendigkeit des Anregungspolarisatorelements (da Laserlicht von Natur aus linearpolarisiert ist) und der Linsen zur Fokussierung des Anregungslichts. Die Verwendung eines auf mehrere Wellenlängen einstellbaren Lasers, zum Beispiel eines Farblasers, stellt eine Vorrichtung mit einer größeren Flexibilität bezüglich der Anzahl von Verbindungen zur Verfügung, die als Fluoreszenzmarker beim erfindungsgemäßen Assay verwendet werden können.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen der Polarisation von Fluoreszenzemission, welche mittels Bezugnahme auf die Zeichnungsfiguren 5 und 6 verstanden werden kann und welche umfasst:
Einen Kasten zum Ausschluss von Licht, enthaltend ein Beleuchtungsmittel (1) zum Beleuchten einer Probenkammer (7) durch eine Kollimationslinse (3) und eine Anregungsfokussierlinse (4) zum Sammeln und Fokussieren des Lichts auf die Probenkammer, und weiter durch ein erstes Polarisationsmittel zum Linearpolarisieren des Lichts von dem Beleuchtungsmittel (6), wobei die Linsen und das erste Polarisationsmittel in einer Linie angebracht sind, die das Beleuchtungsmittel und die Probenkammer miteinander verbindet, und weiter die Probenkammer zwischen zwei zusätzlichen Polarisationsmittel (8 und 8a) angebracht ist, wobei die Polarisationsmittel so angebracht sind, dass die Linie zwischen ihnen und einschließlich der Probenkammer senkrecht zu dem Lichtweg von dem Beleuchtungsmittel zu der Probenkammer verläuft, wobei die Polarisationsmittel so angebracht sind, dass die Polarisationsebene des zweiten der Polarisationsmittel parallel zu der Polarisationsebene des ersten Polarisationsmittel verläuft und auch so, dass die Polarisationsebene des zweiten Polarisationsmittels senkrecht zu der Polarisationsebene des dritten der Polarisationsmittel verläuft, und in dem Kasten auch Detektionsmittel (12 und 12a) zum Sammeln und Quantifizieren der Menge an Licht, das durch die Polarisationsmittel von der Probenkammer zu den Detektionsmitteln hindurchgeht, angeordnet sind. Zwischen den Emissionspolarisatoren und den Detektionsmitteln sind Emissionsfilter (9, 9a) zum selektiven Hindurchlassen von Licht eines schmalen Wellenlängenbereichs von den Emissionspolarisatoren zu den Detektionsmitteln und auch Emissionslinsen (10, 10a) zum Fokussieren des von der Probenkammer zu den Detektionsmitteln austretenden Lichts angeordnet. Blenden (11, 11a) können auch zwischen den Emissionslinsen und Detektionsmitteln zur Kontrolle des Lichteintritts in die Detektionsmittel und zwischen dem Beleuchtungsmittel und dem Probenabteil (11b in Fig. 6) angeordnet sein, um den Lichteintritt in das Probenabteil zu kontrollieren. Eingeschlossen in einem getrennten Abteil (13) sind zusätzliche Komponenten der Vorrichtung, einschließlich Motoren zum Antreiben der Blenden und des Monochromators (wenn er enthalten ist) und elektronischer Vorrichtungen zum Sammeln und Verarbeitung der Daten.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen der Polarisation von Fluoreszenzemission, welche mittels Bezugnahme auf die Zeichnungsfiguren 7 und 8 verstanden werden kann und welche umfasst:
Einen Kasten zum Ausschluss von Licht, enthaltend ein Beleuchtungsmittel (1) zum Beleuchten einer Probenkammer (6) durch eine Anregungslinse (3) zum Fokussieren des Anregungslichts auf die Probenkammer und weiter durch ein Anregungsfilter (4), wobei das Anregungsfilter nur einen schmalen Lichtwellenlängenbereich durchlässt, und schließlich durch ein festes Mittel zum Linearpolarisieren von Licht, das auf die Probenkammer (5) scheint, so dass jedes der Elemente 3 und 4 und 5 in dem Lichtweg von dem Beleuchtungsmittel zur Probenkammer angebracht ist, wobei die Probenkammer mit bezug auf ein drehbares Polarisationsmittel (8), das Licht linearpolarisiert, welches durch das drehbare Linearpolarisierungsmittel hindurchgeht, so angebracht ist, das ein Weg von dem Beleuchtungsmittel durch die Probenkammer zu dem drehbaren Polarisationsmittel am Scheitel einen rechten Winkel mit der Probenkammer bildet, und in dem Kasten auch ein Emissionsfilter (7) untergebracht ist, das zwischen der Probenkammer und dem drehbaren Linearpolarisierungsmittel angeordnet ist, wobei das Emissionsfilter es nur einem schmalen Lichtwellenlängenbereich erlaubt hindurchzugehen, und in dem Kasten weiter Detektionsmittel (11) zum Sammeln und Quantifizieren der Menge an Licht, das von der Probenkammer zum Detektionsmittel durch das drehbare Polarisationsmittel hindurchgeht, angebracht sind. Gegebenenfalls ist zwischen der Lichtquelle und der Anregungslinse ein Monochromator (2) angeordnet, damit bestimmte ausgewählte Lichtwellenlängen auf die Probenkammer gerichtet werden. Zwischen dem Emissionspolarisator und dem Detektionsmittel sind eine Emissionslinse (9) zum Fokussieren des aus der Probenkammer austretenden Lichts auf das Detektionsmittel und auch eine Emissionsblende (10) zum Kontrollieren des Lichteintritts in das Detektionsmittel angeordnet. Gegebenenfalls ist zwischen dem Beleuchtungsmittel und dem Probenabteil eine Anregungsblende (13 in Fig. 8) zur Kontrolle des Lichteintritts in das Probenabteil angeordnet. Andere Komponenten der Maschine sind getrennt enthalten (12), einschließlich Motoren zum Drehen des Emissionspolarisators, elektronischer Vorrichtungen und Motoren zum Kontrollieren der Blende und des Monochromators und elektronischer Vorrichtungen zur Datenverarbeitung.
Mittels Bezugnahme auf die Fig. 6 und 8 ist es leicht begreiflich, dass ein Anregungspolarisator nicht erforderlich ist, wenn die Lichtquelle ein Laser ist, da Laserlicht inhärent polarisiert ist. Gleichermaßen macht die Natur des Laserlichts die Anregungskollimations- und -fokussierlinsen unnötig.
Der Fluoreszenzmarker kann mittels jeder der vielen gemeinhin auf diesem Fachgebiet bekannten Techniken kovalent an ein Makromolekül gebunden werden. Oligonukleotidsonden können entweder entlang ihres Grundgerüsts, an einer Stelle in den organischen Basen oder an beiden Enden markiert werden. Das Markieren eines Endes von Oligonukleotiden mit dem Fluorophor kann ausgeführt werden, indem ein N- Hydroxysuccinimidester des Fluorophors an eine 5'-Aminogruppe des Oligonukleotids chemisch gekoppelt wird, welche während der Synthese des Oligonukleotids erzeugt wird, oder indem bei der Synthese des Oligonukleotids ein Phosphoramidit-Reagens verwendet wird, welches mit dem Fluorophor derivatisiert wurde. Ein Oligonukleotid kann auch am 3'- Ende markiert werden, indem es unter Verwendung einer terminalen Transferase mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden versehen wird.
Es wird damit gerechnet, dass die Erfindung bei der Analyse von Proteinen, Oligonukleotiden, DNA, RNA und anderen Makromolekülen, seien sie biologisch oder synthetisch, nützlich sein wird. Da die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Technik in der Lösungsphase durchgeführt wird, ist sie besonders zum Bestimmen jener Lösungsparameter nützlich, welche die Komplexbildung zwischen Polynukleotiden und anderen Makromolekülen fördern oder stören, zum Beispiel pH, Salzkonzentration oder das Vorhandensein von Cofaktoren. Die Empfindlichkeit der gegenwärtig beschriebenen Technik ist derart, dass eine Komplexbildung bei Konzentrationen der Makromoleküle von weniger als 1 uM analysiert werden kann. Die Prüfung kann bei Makromolekül- Konzentrationen von 1 nM leicht durchgeführt werden und kann bei Konzentrationen, die von 10 bis 100 pM reichen, ausgeführt werden.
Es können Oligonukleotide, die mit einer breiten Auswahl von Fluorophoren markiert wurden, welche Fluoreszein, Eosin und Cumarin einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind, als Sonden verwendet werden. Die Identität des Fluorophors bestimmt nicht die Erfindung. Die vorliegende Erfindung umfasst jede Bestimmung der Anwesenheit, Art oder Menge eines Makromoleküls oder jede Bestimmung spezifischer zwischenmolekularer chemischer Parameter oder Konstanten, bei der eine Messung der Fluoreszenzpolarisation eines fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids angewandt wird.
Nachdem die Erfindung so beschrieben wurde, werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung in den untenstehenden Beispielen dargelegt. Diese Beispiele sollen für die Erfindung nur beispielhaft sein, ohne deren Umfang zu beschränken.

Beispiel 1: Verwendung von Fluoreszenzanisotropiemessungen zur Prüfung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen.

Die Fluoreszenzpolarisation eines fluoreszenzmodifizierten Oligonukleotids wurde zur Untersuchung des Komplexes zwischen einem Oligonukleotid und einem Protein verwendet.
Dies war der Fall für die Untersuchung der Wechselwirkung eines Klenow-Fragments mit einem mit 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonamid markierten Primer (12). Allerdings war es das Ziel dieser Untersuchungen, eine spezifische strukturelle Information über den Komplex zu gewinnen. Aufgrund der Wahl des Fluorophors und des bei der Untersuchung verwendeten Instrumentariums betrug die Empfindlichkeit dieses Assay ungefähr 10 uM, also 100.000 mal weniger empfindlich als die Erfassungsgrenze der vorliegenden Erfindung. Tatsächlich konnten die Autoren in jenen Untersuchungen die Stärke der Wechselwirkung zwischen dem Protein und dem Oligonukleotid nicht verlässlich quantifizieren, weil die für die Erfassung erforderlichen Konzentrationen mindestens 10.000 mal größer waren als der Wert der Dissoziationskonstante zwischen den Spezies.
Die Polarisation der Fluoreszenz von 7-Dimethylamino-3-(4'-maleimidylphenyl)-4- methylcumarin, welches kovalent an ein die lac-Promotorsequenz enthaltendes, doppelsträngiges 32-Basenpaar-Oligodesoxynukleotid gebunden war, wurde zur Überwachung der Bildung eines Komplex zwischen dem cAMP-Rezeptorprotein und der lac-Promotorsequenz verwendet (13). Die Konzentrationsgrenze der Erfassung in diesem bestimmten Assay (10 nM) war mehrere Größenordnungen über der Wechselwirkungsenergie. Sie ist auch 1000-fach größer als die Empfindlichkeit des in dieser Erfindung beschriebenen Assay, der Analyte bei picomolaren Konzentrationen bestimmen kann.
Die Methodik der vorliegenden Erfindung beruht auf der Beobachtung von Änderungen in der Anisotropie oder Fluoreszenzpolarisation einer an ein einzel- oder doppelsträngiges Oligonukleotid gebundenen, fluoreszierenden Sonde nach deren Wechselwirkung mit einem Protein oder einem anderen Makromolekül. In der ersten Reihe von Versuchen zur Überwachung von Protein-DNA-Wechselwirkungen war das Oligodesoxyribonukleotid ein 25-mer, welches am 5'-Ende des Sinn-Strangs mit Fluoreszein, unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Phosphoramidit-Reagens bei der automatisierten DNA-Synthese, markiert wurde. Das Oligodesoxyribonukleotid wurde kommerziell erhalten. Die Sequenz des Sinn-Strangs war wie folgt (F = Fluoreszein):
5'-F-CTTGCACTAGTTAACTAGTCAGCAA-3'
Die zentrale CTAGAATTCTAG-Sequenz ist die spezifische Operator-Bindungsstelle des Tryptophan-Repressorproteins, welches in Gegenwart seines Corepressors Tryptophan mit hoher Affinität (0,5 nM, wie durch Gel-Retardierungsassays bestimmt, Carey, 1988) an die Zielsequenz bindet. Somit ist das bei diesen Untersuchungen verwendete Protein der Tryptophan-Repressor, der unter Verwendung des Verfahrens von Paluh und Yanofsky (9), mit Modifikationen von Chou et al. (10), überexprimiert und gereinigt wurde.
Der Antisinn-Strang des doppelsträngigen Oligodesoxyribonukleotid war unmarkiert. Die beiden Stränge wurden durch Auflösung in 500 mM KCl, 10 mM Phosphat, 0,1 mM EDTA, pH 7,0 zu Endkonzentrationen nahe 10-100 uM reassoziiert. Äquimolare Gemische, wie aufgrund der optischen Dichte bei 260 nm und der Sequenz der Stränge geschätzt, wurden hergestellt und 10 Minuten lang auf 85ºC erhitzt und langsam bei Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Das fluoreszenzmarkierte doppelsträngige Oligodesoxyribonukleotid wurde auf seine Endkonzentration, gewöhnlich 0,2 nM, in einem Gesamtvolumen von 700 ul verdünnt, direkt in eine geschmolzene Siliziumdioxid-Küvette mit reduziertem Volumen, nämlich 1,2 ml. Der für die Verdünnung verwendete Assay-Puffer, 10 mM Kaliumphosphat, 0,1 mM EDTA, pH 7,6 enthielt auch 10% Glycerol und in einigen Fällen 0,4 mM L-Tryptophan. Nach der Verdünnung sank die KCl-Konzentration auf einiges unter 1 mM ab. Die Lösung wurde 5 Minuten lang vor jeder Polarisationsmessung ausgleichen gelassen.
Die Fluoreszenzpolarisation oder Anisotropie wurde im L-Format unter Verwendung eines automatisierten ISS KOALATM -Fluorometer oder im T-Format unter Verwendung unserer ursprünglichen Probenhalter- und Polarisator-Anordnung für die Bestimmungen ultrahoher Empfindlichkeit gemessen. Das Anregungslicht wurde auf 488 nm eingestellt und die Emission wurde durch einen langen Y520 Durchgangsfilter von Hoya optics überwacht. Die Hintergrundfluoreszenz vom Puffer, die bei Konzentrationen unterhalb von 10 nM nicht vernachlässigbar ist, wurde durch aufeinanderfolgende Messung der parallelen und senkrechten Komponenten der Probe und des Puffers in einer angepassten Küvette abgezogen.

Empfindlichkeit und Genauigkeit der Messungen

Der Assay wurde durch sequentielle Zugabe des Proteins in äußerst kleinen Aliquoten (2 ul) durchgeführt, um die Gesamtkonzentration des Oligodesoxyribonukleotids nach der Volumenänderung nicht um mehr als 10% zu verringern. Die graphischen Darstellungen in den Fig. 1A und 1B zeigen, dass nach der sequentiellen Zugabe des Proteins zu der das fluoreszenzmarkierte Oligodesoxyribonukleotid und 0,4 mM L- Tryptophan enthaltenden Lösung die Anisotropie der Fluoreszenz in einer sigmoidalen Art ansteigt, wenn sie gegen den Logarithmus der Konzentration des als Dimer ausgedrückten Proteins aufgetragen wird. Jede Messung wurde 4 mal wiederholt und von den Ergebnissen der Durchschnitt ermittelt. Der Fehler bei jeder Messung betrug +/-0,002 Polarisationseinheiten. Es ist erkennbar, dass sogar, wenn nur 10% des Oligodesoxyribonukleotids, das heißt 20 pM, vom Protein gebunden sind, die Änderung des Anisotropiewerts ein gutes Stück über dem Fehler bei den Messungen liegt.
Wir zeigen in Fig. 1 A, dass subnanomolare Mengen an Oligodesoxyribonukleotid detektiert werden können und dessen Bindung an Protein eine Signaländerung erzeugt, die um das 15-fache größer als der Messfehler ist.

Beispiel 2: Verwendung von Fluoreszenzanisotropiemessungen zur Beurteilung von thermodynamischen Modellen der Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkung.

Diese Daten wurden nach zwei thermodynamischen Modellen analysiert, die in Fig. 1C und 1D dargestellt sind. Das erste (1C) ist ein einfaches Protein-DNA-Bindungsmodell, wo die einzigen Spezies das freie Protein, die freie DNA und der Protein-DNA-Komplex sind. Im zweiten Modell (Fig. 1D) ist das Protein-DNA-Bindungsgleichgewicht mit einem Monomer-Dimer-Gleichgewicht überlagert. Die Übereinstimmungen der Daten unter Verwendung dieser beiden Modelle und des numerischen Gleichgewichtsanalyseprogramms, BIOEQS, (20) werden in den Fig. 1A und 1B gezeigt. Es stellte sich heraus, dass die Dissoziationskonstante für die Tryptophan-Repressordimer-DNA-Wechselwirkung, wie unter Verwendung des einfachen Bindungsmodells erhalten, 0,83 nM betrug. Die Übereinstimmung der Daten unter Verwendung des Modells der verbundenen Gleichgewichte ergab eine Dimer-DNA-Dissoziationskonstante von 0,23 nM und eine Dimer-Monomer-Dissoziationskonstante von 3,5 nM. Die Qualität der Daten ist ausreichend, um das einfache Bindungsmodell auszuschließen; die Übereinstimmung ist von einer viel höheren Qualität als im Fall der verbundenen Gleichgewichte (vgl. Fig. 1A und 1B). Eine gründliche Vertrauenskoeffizient-Untersuchung zeigt eine steile X²-Senke für die Dimer- DNA-Affinität, mit 67%-Grenzen bei +/-0,3 kcal (Fig. 2). Somit kann nicht nur die Komplexbildung bei niedrigen Konzentrationen detektiert werden, sondern die Qualität der Daten ist auch ausreichend, dass die Affinität aus der Übereinstimmung der Daten bestimmt werden und die effiziente Beurteilung alternativer thermodynamischer Modelle durchgeführt werden kann.

Beispiel 3: Verwendung von Fluoreszenzanisotropiemessungen bei der Analyse von Mehrkomponentensystemen in Lösung.

Der Effekt der Änderung der DNA-Oligonukleotid-Konzentration und des Titrierens des Proteins bis zu den in vivo gefundenen Konzentrationen (nahe 1 mM) wird in Fig. 3 gezeigt. Es ist erkennbar, dass Komplexe höheren Molekulargewichts und somit höherer Anisotropie bei diesen höheren Konzentrationen an Protein und DNA begünstigt werden. Da dies ein auf Lösung basierender Assay ist, können die Konzentrationen jeder beliebigen Komponente leicht variiert werden. So kann man in Fig. 4 den Effekt des Weglassens des L-Tryptophans vom Assay-Puffer sehen. Bei Verwendung von 20 nM Oligodesoxyribonukleotid wird ein Binden nur bei Proteinkonzentrationen über ungefähr 1 uM im Repressorproteindimer in Abwesenheit des Tryptophan-Corepressors beobachtet.
Wir haben so gezeigt, dass diese Assays verwendet werden können, um die Effekte spezifischer Liganden oder anderer Chemikalien auf die Komplexbildung zwischen Proteinen und Nukleinsäuren quantitativ zu untersuchen.
Die in den Fig. 1 bis 4 gezeigten Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass die Polarisation oder Anisotropie der Fluoreszenz von fluoreszenzmarkierten Oligodesoxyribonukleotiden verwendet werden kann, um mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit die Wechselwirkung des Oligodesoxyribonukleotids mit Proteinen und anderen großen biologischen Molekülen zu detektieren. Das Fluoreszenzsignal von Fluoreszein wurde bei Konzentrationen so gering wie 10 pM in einem Gesamtvolumen von 500 ul detektiert. Ein Femtomol eines bestimmten DNA-Bindungsproteins wird bei Verwendung von 10 Femtomol der fluoreszenzmarkierten Zielsequenz leicht detektiert, vorausgesetzt, die Bindung von 10% des Oligonukleotids führt zu einer Signaländerung, die genau gemessen werden kann. Eine hohe Empfindlichkeit und Datenqualität liefern ein Mittel für die Detektion von Komplexbildung und auch für die äußerst genaue Bestimmung der energetischen Stärke der Wechselwirkung sowie für die Unterscheidung zwischen thermodynamischen Bindungsmodellen. Der Assay ist ziemlich schnell, er braucht lediglich 5-10 Minuten pro Punkt. Er basiert auf einer Lösung, so dass die Effekte von kleineren Liganden und Chemikalien, von pH, Salz, Temperatur und anderen Lösungsbedingungen leicht abgeschätzt werden können. Zum Beispiel würde es ungefähr 10 Minuten erfordern, um festzustellen, ob ein roher Zellextrakt oder ein in vitro-Translationsassay einen Proteinfaktor enthält, der die Fähigkeit besitzt, an eine bestimmte DNA-Sequenz zu binden. Eine vollständige Titrationskurve und ihre Analyse erfordern ungefähr 45 Minuten. Seine Verwendungsfreundlichkeit, auf Lösung basierende Natur und Schnelligkeit machen diesen Assay zu einer bedeutenden Verbesserung gegenüber Verfahren, die auf Elektrophorese oder Filterbindung beruhen. Dieser Assay kann in weitem Umfang bei der Untersuchung von Transcriptionsfaktoren und in der Rolle von Drogen oder anderen kleinen Molekülen bei der Regulierung genetischer Expression angewandt werden. Zusätzliche Anwendungen umfassen klinisch orientierte Tests zur Prüfung der Funktion von Transcriptionsfaktoren oder anderer DNA-Bindungsproteine.

Beispiel 4: Verwendung von Fluoreszenzanisotropiemessungen zur Prüfung von Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren.

Das Binden eines einzelsträngigen Oligonukleotids an ein anderes komplementäres, einzelsträngiges DNA- oder RNA-Oligonukleotid kann ebenfalls unter Verwendung dieser Methodik detektiert werden. Die Demonstration signifikanter Änderungen in der Fluoreszenzanisotropie wurde unter Verwendung des 5'-fluoreszenzmarkierten, selbstkomplementären 20-mer Oligodesoxyribonukleotids,
5'-F-CGAACTAGTTAACTAGTACG-3'
(F bedeutet Fluoreszein) durchgeführt. Die Anisotropieänderung tritt auf nach Konversion des denaturierten einzelsträngigen Oligodesoxyribonukleotids in die doppelsträngige Form durch Bildung eines doppelsträngigen Komplexes mit sich selbst. Es wurden drei Versuche durchgeführt. In jedem wurden zwei Proben verglichen. Jede der beiden Proben enthielt markiertes Oligodesoxyribonukleotid in 500 ul 10 mM KPO&sub4;, 0,1 mM EDTA, pH 7,6 bei einer Konzentration von 50 nM. Eine der beiden Proben (hoch in Salz) enthielt zusätzlich 1 M KCl. Die Probe hoch in Salz wurde auf 95ºC erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Erhitzen und Kühlen bei hohem Salzgehalt führt zu einer Umwandlung des größtenteils einzelsträngigen Oligodesoxyribonukleotids in die doppelsträngige Form. Diese Formänderung sollte zu einer verringerten Brownschen Molekularbewegung mit einer daraus folgenden Anisotropiezunahme führen. Fluoreszenzanisotropiemessungen wurden mit jedem Probenpaar durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Messungen, angeführt in Tabelle I, zeigen eine Zunahme der Fluoreszenzanisotropie von mindestens dem 20-fachen des Messfehlers nach Bildung des doppelsträngigen Komplexes. Tabelle I DETEKTION VON OLIGONUKLEOTIDHYBRIDISIERUNG IN LÖSUNG
Die Änderung wäre viel größer gewesen, wenn das Oligonukleotid 8-10 Basen lang gewesen wäre oder wenn die Zielsequenz eine einzelsträngige Plasmid-DNA gewesen wäre, wie es auch typischerweise bei Hybridisierungsassays verwendet wird. Somit liegt die Detektion der Bildung des doppelsträngigen 20-mer einiges unterhalb des Größendifferentials, das typischerweise betroffen ist, wenn ein kleines Oligonukleotid an ein großes einzelsträngiges DNA-Molekül bindet.
Der auf der Messung von Nukleinsäurewechselwirkungen beruhende Assay hat Anwendung bei der genetischen Kartierung und bei der klinischen Bestimmung der Existenz spezifischer Mutationen. Er kann auch bei der Beurteilung von Translationshemmung durch Antisinn-DNA/RNA-Nukleinsäuren verwendet werden, einer Technik mit potentiellen Anwendungen in der klinischen Diagnostik, Therapie oder anderen biomedizinischen Gebieten. Die hier beschriebenen Fluoreszenzanisotropiemessungen basieren vollständig auf Lösung (d. h. erfordern keinen festen Träger), ein Merkmal, das die Automation des Assay vereinfachen wird. Abschließend stellt diese Erfindung einen schnellen, genauen, reproduzierbaren, einfachen quantitativen Assay für die Wechselwirkungen von Nukleinsäuren mit anderen Makromolekülen dar.

Beispiel 6: Klinischer Assay für die Funktion eines DNA-Bindungsproteins in einer Gewebebiopsie

Von dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass es in einem klinischen Rahmen Verwendung findet. Der Östrogenrezeptor ist ein DNA-Bindungsprotein, dessen Fehlfunktion in die Ätiologie von Brustkrebs verwickelt wurde. Hier beschrieben ist ein Verfahren, das zur Prüfung auf funktionale Östrogenrezeptoren in Biopsien von Brustgewebe angewandt werden kann.
Ein Zellextrakt wird aus dem Biopsiegewebe mittels sanfter Homogenisierung und Zentrifugation, wie von Flanagan et al. (19) beschrieben, hergestellt. Ein doppelsträngiges Oligodesoxyribonukleotid, welches ein Consensus-Östrogenantwortelement (ERE) bildet, kann durch automatisierte Synthese eines Oligonukleotidpaars präpariert werden. Eine bevorzugte Sequenz für den Sinn-Strang ist
5'-F-GGTCACTGTGACC-3'
wobei das Fluorophor (F) durch Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Phosphoramidit- Linkers im letzten Nukleotidadditionsschritt der Synthese eingebaut wird. Dieses Oligonukleotid ist selbst-komplementär. Die Reassoziation des Oligonukleotid in Lösung liefert ein doppelsträngiges Oligonukleotid (*ERE), das an jedem 5'-Ende mit einem Fluorophor markiert ist.
Der Puffer für die Durchführung der Fluoreszenzpolarisationsmessungen ist 10% Glycerol, 80 mM KCl, pH 7,9, enthaltend 0,2 mM EDTA. Messungen werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Vorbereitende Messungen werden von der Fluoreszenzintensität des Zellextrakts, der kein ERE-Oligonukleotid enthält, durchgeführt (Hintergrund). Diese Werte werden von den Messungen abgezogen, die zur Bestimmung der Emissionspolarisation jener Proben, die Zellextrakt enthalten, verwendet werden. Einleitende Messungen werden auch von der Fluoreszenzpolarisation des *ERE-Oligodesoxyribonukleotids in einer vom Zellextrakt freien Lösung durchgeführt. Dann werden Aliquote des Zellextrakts mit 1 pM des *ERE- Oligodesoxyribonukleotids vermischt und die Fluoreszenzpolarisation wird erneut gemessen. Ein Vergleich der in Gegenwart von Zellextrakt erhaltenen Polarisationswerte mit dem Wert des freien *ERE liefert ein Maß für die Bindungsfunktion des in der Probe vorhandenen Östrogenrezeptors.
Als Kontrollversuch sollten Ergebnisse unter Verwendung einer Zellextraktprobe, die aus Zellen hergestellt wurde, die bekanntermaßen einen funktionalen Östrogenrezeptor enthalten, erzielt und mit den Ergebnissen von dem Extrakt verglichen werden, der aus der klinischen Probe hergestellt wurde.
Um den Versuch äußerst deutlich zu beschreiben, wird in Tabelle II ein Beispiel für Probenformulierungen zur Verfügung gestellt. Tabelle II PROBENFORMULIERUNGEN ZUR BINDUNGSBESTIMMUNG VON ERE AN ÖSTROGENREZEPTOREN IN EINER KLINISCHEN PROBE
Um die Menge an Östrogenrezeptor in der Probe zu quantifizieren, kann der Zellextrakt mit verschiedenen Mengen an markiertem *ERE titriert und das Ergebnis mit einer Standardkurve verglichen werden, die unter Verwendung bekannter Mengen an gereinigtem Östrogenrezeptor und *ERE erhalten wurde.

Beispiel 7: Klinischer Assay für eine spezifische Punktmutation in einem Gen durch Hybridisierung eines Oligonukleotids mit mRNA aus einer Gewebebiopsie

Es wurde herausgefunden, dass spezifische Mutationen im Cholesterinrezeptorgen zu Hypercholesterinämie führen, einem Zustand, der aufgrund einer arteriellen Erkrankung zum frühen Tod des Patienten führt, wenn keine Maßnahmen zur Kontrolle der Cholesterinspiegel im Kreislauf ergriffen werden. Es ist damit zu rechnen, dass eine Früherkennung des Zustands mittels neonataler oder pränataler genetischer Untersuchung und somit ein frühes Eingreifen eine bessere Prognose für die leidenden Individuen liefern würde. Dementsprechend ist in diesem Beispiel ein Verfahren zum Detektieren von Mutationen im Cholesterinrezeptorgen durch die Prüfung von mRNA auf die Bindung an Oligonukleotidsonden beschrieben. Dieses Verfahren kann selbstverständlich auf die Detektion anderer Mutationen verallgemeinert werden.
Am 5'-Ende mittels fachbekannter Verfahren markierte Oligonukleotide mit 8-10 Basen werden gestaltet, um zu jenen Abschnitten des mRNA-Transkripts des Wildtyp- Cholesterinrezeptorgens komplementär zu sein, von denen zuvor nachgewiesen wurde, dass sie in Patienten mit familiengebundener Hypercholesterinämie mutiert sind. Jedes Oligonukleotid wird gestaltet, um durch Variation seiner Länge und GC-Gehalts eine ähnliche Abnahme von Tm (Schmelztemperatur einer Duplex zwischen dem Oligo und einem hybridisierten Komplementärstrang) nach dem Binden an eine mit Ausnahme eines einzigen fehlgepaarten Basenpaars gänzlich komplementäre Sequenz zu liefern. Ein Versuch wird durchgeführt, um die Temperatur zu bestimmen, bei der die Wildtyp-mRNA mit jedem Oligonukleotid zum größten Teil hybridisiert bleibt, eine mRNA jedoch, die von einer Leberbiopsie einer Liste von Patienten erhalten wurde, bei denen die Mutationen vorhanden sind, von denen festgestellt wurde, dass sie Hypercholesterinämie verursachen, wird mit dem zur Wildtypsequenz im mutierten Bereich komplementären Oligonukleotid nicht hybridisiert.
100 mg Gewebe ergeben ungefähr 1 umol einer spezifischen 1-Kilobase-mRNA. In einem Volumen von 1 ml würde dies 1 nM spezifischer mRNA entsprechen. Für eine 1 : 1- Hybridisierung würde 1 nM fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid verwendet werden. Diese Probengröße liefert ein leicht detektiertes Signal; somit könnten kleinere Proben verwendet werden. Die Fluoreszenzpolarisation des Oligonukleotids allein, vermischt mit Wildtyp- mRNA bei 1 nM und vermischt mit mRNA von der klinischen Probe bei ungefähr 1 nM wird jeweils bei der Temperatur bestimmt, die beim Eingangsversuch gefunden wurde, um für die maximale Differenz in der Bindung des Oligonukleotids an die Wildtyp- und die mutante mRNA-Sequenz zu sorgen. Es würde festgestellt werden, dass ein die Wildtyp- mRNA enthaltendes Gewebe eine größere Polarisation zeigen würde als jene, die für das Oligonukleotid allein festgestellt wurde, während ein die mutante mRNA enthaltendes Gewebe eine Polarisation zeigen würde, die jener des Oligonukleotids allein gleich wäre.
Als Kontrollversuch wird die Fluoreszenzemission der mRNA-Präparation in Abwesenheit eines markierten Oligonukleotids in jeder Emissionspolarisationsebene bestimmt. Diese Hintergrundwerte werden von jeder in den Hybridisierungsversuchen durchgeführten Messung abgezogen.

Beispiel 8: Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenzpolarisationsmessungen mit hoher Empfindlichkeit

Das in Fig. 5 gezeigte Diagramm zeigt Modifikationen, die an einem ISS KoalaTM- Fluorometer durchgeführt wurden, um eine Vorrichtung mit der für die Ausführung der vorliegenden Erfindung erforderlichen Empfindlichkeit zu erzeugen. Die Modifikationen umfassen (1) das Verringern des Lichtwegs von 30 cm auf 20 cm; (2) das Positionieren der Emissionslinse innerhalb eines 1 cm-Abstands vom Probenhalter; und (3) das Ersetzen des Glan Thompson-Polarisators mit direkt am Probenhalter angebrachten UV-Klasse- Filmpolarisatoren. Diese Verbesserungen erhöhen die Empfindlichkeit der Vorrichtung auf dramatische Weise. Bei den Versuchen, die zur Demonstration der durch diese Modifikationen erzielten Empfindlichkeitszunahme durchgeführt wurden, wurde ein fluoreszenzmarkiertes 25-mer Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz verwendet.
5'-F-ATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAA-3'
Wie in Tabelle III gezeigt ist, konnten wir Oligonukleotide bei einer Konzentration von 9 pM in 500 ul eher bei Verwendung einer Xenon-Bogenlampe als Anregungsquelle als der in der Zeichnung angedeuteten Argonionenquelle detektieren. Dies stellt eine 10-fache Empfindlichkeitszunahme verglichen mit dem nicht-modifizierten Gerät dar. Angesichts der Tatsache, dass wir eine 10%-Änderung in der Polarisation detektieren können, können wir also 0,9 pM an Protein oder Nukleinsäure oder synthetischem Polymer in Lösung detektieren. Dieser Empfindlichkeitsgrad entspricht 450 Attomol an Makromolekül.

Tabelle III

EMPFINDLICHKEITGRENZE-PRÜFUNG UNTER VERWENDUNG VON MODIFIZIERTEM FLUOROMETER UND PROBENZELLE

Lösung Intensität (Zählungen)

9 pM F-25-mer 1967,8 +/- 1,2
Pufferhintergrund 243,9 +/- 0,4
Die Empfindlichkeit des modifizierten Geräts könnte durch zwei weitere Modifikationen verbessert werden. (1) Das Miteinbeziehen eines Anregungsfilters mit scharfem Durchlassbereich würde die Empfindlichkeit um einen Faktor 10 erhöhen. (2) Die Substitution einer Argonionen-Laserlichtquelle durch die im hier berichteten Test verwendete Xenon-Bogenlampe würde die Empfindlichkeit aufgrund der gesteigerten Intensität des Anregungsstrahls und seiner monochromatischen und polarisierten Natur um ein weiteres 100-faches erhöhen. Da wir durch den Hintergrund beschränkt sind und die Monochromatoren im ursprünglichen ISS-Gerät in der Streulichtausscheidung nicht gut sind, resultiert der größte Teil der Hintergrundintensität aus gestreutem Anregungslicht. Bei einem Laser gibt es nur ein 488 nm-Licht und somit wird kein Streulicht von anderen Wellenlängen in die Probe eintreten. Zweitens ist Laserlicht linearpolarisiert, wodurch die Notwendigkeit eines Anregungspolarisators beseitigt wird. Schließlich ist die Fluoreszenzpolarisation direkt proportional der Anregungsquellenintensität, und ein Laser, sogar ein kleiner, würde mehr Leistung liefern als die Xenon-Bogenlampe. Im modifizierten Entwurf erhöht eine Verdünnung mit gleichzeitiger Zunahme des Verstärkungsfaktors nicht die Empfindlichkeit, weil die Verwendung einer Anregungsquelle in Form einer Lampe die Erfassungshöhe eher durch den Hintergrund als durch Störungen begrenzt sein lässt. Somit ist eine weitere Faktor 10-Zunahme der Empfindlichkeit erreichbar, wenn das Anregungsstreulicht eliminiert werden kann.

LITERATURVERWEISE

Die folgenden Referenzen sind in der Offenbarung zitiert: US-Patente

Andere Referenzen

9. Paluh, J.L. und Yanofsky, C. (1983) Nucl. Acids Res. 14, 7851-60
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18. P.M. Flanagan et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7659-7663.
20. C.A. Royer et al. (1990) Anal. Biochem. 191: 287-294

Claims

1. Verfahren zum Messen des Bindens eines Polynukleotids an ein Makromolekül zur Bildung eines nichtkovalenten Komplexes, umfassend:

i) Markieren des Polynukleotids mit einem Fluoreszenzmarker;

ii) Erhalten einer ersten Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus dem Marker;

iii) Kontaktieren des markierten Polynukleotids mit dem Makromolekül unter für das Binden des markierten Polynukleotids an das Makromolekül günstigen Bedingungen;

iv) Erhalten einer zweiten Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus dem Marker unter den für die Bindung günstigen Bedingungen; und

v) Vergleichen der ersten Messung mit der zweiten Messung, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen der Polarisation durchgeführt werden entweder durch gleichzeitiges Messen der Polarisation der Fluoreszenzemission in zwei senkrecht ausgerichteten Polarisationsebenen durch zwei Polarisationsmittel, deren Polarisationsebenen senkrecht ausgerichtet sind;

oder durch aufeinanderfolgendes Messen der Polarisation der Fluoreszenzemission in zwei senkrecht ausgerichteten Polarisationsebenen durch ein Polarisationsmittel, dessen Polarisationsebene drehbar ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Marker Fluoreszein ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ein einsträngiges Oligodosoxyribonulrotid mit einer Länge von weniger als oder gleich 40 Basen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ein doppelsträngiges Oligodesoxyribonukleotid mit einer Länge von weniger als oder gleich 40 Basenpaaren ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Makromolekül ein Protein ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Makromolekül ein zweites Polynukleotid ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid in einer Konzentration von weniger als oder gleich 1 Nanomolar vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Makromolekül in einer Konzentration von weniger als oder gleich 1 Nanomolar vorhanden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, zum Diagnostizieren einer Abweichung der Menge oder Art eines DNA- Bindungsproteins, wobei das Polynukleotid ein Oligonukleotid ist, dessen Nukleotidsequenz durch ein DNA- Bindungsprotein erkannt wird, wobei das Oligonukleotid entweder doppelsträngig oder einsträngig ist, das Makromolekül das DNA-Bindungsprotein ist und das Verfahren folgendes umfaßt:

i) Fluoreszenzmarkieren des Oligonukleotids,

ii) Erhalten einer Probe, enthaltend das zu testende DNA-Bindungsprotein;

iii) Erhalten einer ersten Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus dem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid;

iv) Kontaktieren des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids mit der Probe unter für das Binden des fluoreszenzmarkierten Polynukleotids an das DNA- Bindungsprotein günstigen Bedingungen,

v) Erhalten einer zweiten Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus dem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid unter den für die Bindung günstigen Bedingungen; und

vi) Vergleichen der zweiten Messung mit der ersten Messung.

10. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend,

vii) Zugeben eines zweiten Aliquots von nichtmarkiertem Polynukleotid, das dieselbe Nukleotidsequenz wie das markierte Polynukleotid aufweist;

viii) Erhalten einer dritten Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus dem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid unter den für die Bindung günstigen Bedingungen; und

vi) Vergleichen dieser Messung mit der ersten und zweiten Messung.

11. Verfahren zum Diagnostizieren einer genetischen Mutation, umfassend:

i) Erhalten einer DNA-Probe von einem Patienten;

ii) Erhalten einer ersten Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus einem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid;

iii) Kontaktieren des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids mit der DNA unter für das Binden des fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids an die DNA günstigen Bedingungen;

iv) Erhalten einer zweiten Messung der Polarisation der Fluoreszenzemission aus dem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid unter den für das Binden günstigen Bedingungen; und

v) Vergleichen der zweiten Messung mit der ersten Messung,

dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen der Polarisation durchgeführt werden entweder durch gleichzeitiges Messen der Polarisation der Fluoreszenzemission in zwei senkrecht ausgerichteten Polarisationsebenen durch zwei Polarisationsmittel, deren Polarisationsebenen senkrecht ausgerichtet sind;

12. Vorrichtung zum Messen der Polarisation von Fluoreszenzemission, umfassend:

einen Kasten zum Ausschluß von Licht, enthaltend ein Beleuchtungsmittel zum Beleuchten einer Probenkammer durch eine Kollimationslinse und eine Fokussierlinse und weiter durch ein erstes Polarisationsmittel zum Linearpolarisieren des Lichts von dem Beleuchtungsmittel, wobei die Linsen und das erste Polarisationsmittel in einer Linie angebracht sind, die das Beleuchtungsmittel und die Probenkammer miteinander verbindet, und weiter die Probenkammer zwischen zwei zusätzlichen Polarisationsmitteln angebracht ist, wobei die Polarisationsmittel so angeordnet sind, dass die Linie zwischen ihnen und einschließlich der Probenkammer senkrecht zu dem Lichtweg von dem Beleuchtungsmittel zu der Probenkammer verläuft, wobei die Polarisationsmittel so angebracht sind, dass die Polarisierungsebene des zweiten der Polarisationsmittel parallel zu der Polarisationsebene des ersten Polarisationsmittels verläuft und auch so, dass die Ebene des Polarisationsmittels und so, dass die Polarisationsebene des zweiten Polarisationsmittels senkrecht zu der Polarisationsebene des dritten der Polarisationsmittel verläuft und in dem Kasten auch ein Detektionsmittel zum Sammeln und Quantifizieren der Menge an Licht, das durch die Polarisationsmittel von der Probenkammer zum Detektionsmittel hindurchgeht, angeordnet ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das Beleuchtungsmittel eine Xenon-Bogenlampe ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Kollimationslinse und die Fokussierlinse durch ein faseroptisches Kabel ersetzt sind.

15. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das Beleuchtungsmittel ein Laser ist und jeweils die Kollimationslinse, die Fokussierlinse und das erste Polarisationsmittel nicht vorhanden sind.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei der Laser ein einstellbarer Farbstofflaser oder ein Festkörperlaser ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 15, wobei jedes der Polarisationsmittel ein Polarisator von der Qualität eines UV-Films ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Länge des Lichtwegs von dem Beleuchtungsmittel zu dem Detektionsmittel 20 Zentimeter oder weniger beträgt.

19. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das Licht von dem Beleuchtungsmittel mit einer Glasfaser zu der Probenkammer geführt wird.

20. Vorrichtung zum Messen der Polarisation von Fluoreszenzemission, umfassend:

einen Kasten zum Ausschluß von Licht, enthaltend ein Beleuchtungsmittel zum Beleuchten einer Probenkammer durch eine Anregungslinse und weiter durch ein Anregungsfilter, wobei das Anregungsfilter nur einen schmalen Lichtwellenlängenbereich durchläßt, und weiter durch ein festes Mittel zum Linearpolarisieren von Licht, das auf die Probenkammer scheint, so dass jedes dieser Elemente in dem Lichtweg von dem Beleuchtungsmittel zur Probenkammer angebracht ist, wobei die Probenkammer mit bezug auf ein drehbares Polarisationsmittel, das Licht linearpolarisiort, das durch das drehbare Linearpolarisationsmittel hindurchgeht, so angebracht ist, so dass ein Weg von dem Beleuchtungsmittel durch die Probenkammer zu dem drehbaren Polarisationsmittel am Scheitel einen rechten Winkel mit der Probenkammer bildet und in dem Kasten auch ein Emissionfilter untergebracht ist, das zwischen der Probenkammer und dem drehbaren Linearpolarisationsmittel angeordnet ist, wobei das Emissionsfilter es nur einem schmalen Lichtwellenlängenbereich erlaubt hindurchzugehen, und in dem Kasten weiter Detektionsmittel zum Sammeln und Quantifizieren der Menge an Licht, das von der Probenkammer zum Detektionsmittel durch das drehbare Polarisationsmittel hindurchgeht, angebracht sind.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei das Beleuchtungsmittel ein Laser ist und jeweils die Anregungslinse, das Anregungsfilter und das feste Polarisationsmittel nicht vorhanden sind.