FR2784748A1 - Detection de reactions de polymerisation par polarisation de fluorescence - Google Patents

Abstract

Analyse de réactions de polymérisation par polarisation de fluorescence. L'invention concerne un procédé pour le suivi en simultané ou en point terminal de réactions de polymérisation en phase homogène. Le procédé est basée sur le principe d'un changement de degré de polarisation de fluorescence lorsqu'un composant fluorescent est intégré dans un polymère ou libéré d'un polymère, par exemple et de façon non limitative un polymère d'acides nucléiques. Ce procédé permet en particulier de suivre en phase homogène des réactions d'amplification génique utilisées pour le diagnostic biologique. Des trousses d'analyse sont inclues dans le procédé.

Description

Il s'agit de protéger un procédé original ayant pour finalité de détecter

et

de doser des produits de réactions de polymérisation en phase homogène.

Le procédé, faisant appel à des techniques lumineuses, peut être effectuée de façon qualitative et quantitative, en temps réel ou en point terminal. Ce procédé permet en particulier de suivre les réactions d'amplification génique au fur et à mesure de leur déroulement et donc de connaître immédiatement le résultat de celles-ci. Par exemple, il permet de suivre l'incorporation d'acides nucléiques modifiés dans les polymères synthétisés lors d'amplification géniques, en particulier en utilisant des acides nucléiques fluorescents, et en observant la modification de la

polarisation de fluorescence desdits acides nucléiques.

L'invention présente est applicable à la recherche en biologie moléculaire et dans le domaine du diagnostic médical, ainsi que dans tous les domaines des sciences de diagnostic, tels les sciences vétérinaires, agricoles, agro-alimentaires, alimentaires et d'expertises, o il est nécessaire de détecter les produits d'amplification génique. Elle est également applicable dans l'industrie, et à tout processus de

polymérisation utilisé industriellement.

Le procédé utilise la combinaison de la polarisation de fluorescence avec les principes et techniques de polymérisation utilisés par exemple en

biologie moléculaire.

L'amplification génique a pour caractéristique d'incorporer des acides nucléiques libres dans un polymère, formant une chaîne ADN ou ARN ou hybride selon les enzymes et les acides nucléiques présents dans le

milieu réactionnel.

Lorsqu'un acide nucléique modifié comporte un marqueur fluorescent, sa polarisation de fluorescence sera modifiée par son incorporation dans le produit d'amplification génique. En effet, la polarisation de fluorescence est fonction du degré de liberté de la molécule fluorescente, le degré de polarisation étant inversement proportionnel à la vitesse de rotation de la molécule émettrice. Le suivi de la polarisation de fluorescence d'acides nucléiques modifiés permet donc de suivre l'avancement de la réaction

d'amplification 'génique.

- 2- Dans J. Mol. Biol. ( 1971), 56, 341-361, K. Kleppe et coll. décrivent une technique pour l'amplification d'une séquence d'ADN recherchée. La procédure comprend la dénaturation d'un duplex d'ADN pour former des simples brins. L'étape de dénaturation est menée en présence d'un suffisamment large excès de deux amorces d'acides nucléiques qui, lors du refroidissement, hybridisent des réglons adjacent à la séquence d'ADN ciblée. Deux structures sont alors obtenues, chacune contenant la longueur complète du brin matrice, complexée avec l'amorce. Une polymérase d'ADN et une quantité suffisante de chaque déoxynucléoside triphosphate sont ajoutés de façon à obtenir deux molécules du duplex original. Les cycles de dénaturation, hybridation des amorces, et extension sont répétés jusqu'à l'obtention d'un nombre approprié de

copies de la séquence d'ADN désirée.

Cette technique est maintenant connue comme la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), décrite par exemple dans la licence européenne d'application: European Patent Application, Publication N 0O 201 184. Conçue par une équipe de Californiens travaillant au sein de CETUS CORPORATION (marque déposée), comprenant Kary MULLIS (lc théoricien) prix Nobel 1993 et Randall SAIKI (le biochimiste), la technologie PCR (Brevets EP O 201 184, EP O 200 362) a été vendue en

1 991 à ROCHE (marque déposée).

Cette technique repose sur deux. principes classiques. Un ADN bicaténaire chauffé à plus de 90 degrés Celsius se sépare en deux brins indépendants; le refroidissement progressif de cette molécule permet l'hybridation entre séquences strictement complémentaires; cette opération peut-être répétée un nombre indéfini de fois sans endommager l'ADN. Par ailleurs, les ADN polymérases sont des enzymes ayant la propriété de recopier un brin d'ADN à partir d'un fragment- complémentaire préalablement hybridé avec une amorce, le nouveau brin étant synthétisé

dans le sens 5'--> 3'.

La PCR utilise ces propriétés pour synthétiser de grandes quantités d'ADN, en obtenant la multiplication sélective d'un fragment d'ADN donné. - 3La condition essentielle à l'utilisation de la technique est la connaissance des 15 à 25 bases situées à chaque extrémité en 5' de la séquence à

amplifier (amorces ou "primers").

Tout se passe dans un seul tube, en trois étapes répétées 20 à 40 fois: dénaturation par chauffage à 90-96 degrés Celsius, hybridation des amorces à 40-74 degrés Celsius, extension par une polymérase

thermostable recopiant l'ADN cible.

Après n cycles, à partir d'un seul ADN cible, le nombre théoriques de copies obtenues est de 2". Les rendements seraient en général compris entre 60 et 85%, du moins pendant les 35 à 45 premiers cycles o la production reste de type exponentiel. Pour un rendement de 80%, le facteur d'amplification est supérieur au million après 30 cycles, et au milliard après 45 cycles. Dans certain systèmes [Chlamydia ROCHE

(marque déposée)], un rendement de 90% a pu être obtenu.

A titre d'exemple, une seule copie de 1000 pb (paires de bases) amplifiée dans ces conditions est à l'origine de 15 pg d'ADN après 30 cycles, 15 ng après 45 cycles. Une centaine de copies initiales donnent 1,5 mg d'ADN

après 45 cycles.

Le choix des amorces est bien entendu déterminant pour obtenir une bonne amplification puisque de leur spécificité vis-à-vis de l'ADN cible

dépend celle de l'amplification toute entière.

Des programmes informatiques sont actuellement disponibles pour

optimiser le choix des amorces à l'intérieur d'une séquence connue.

Obtenues grâce aux synthétiseurs d'oligonucléotides, les amorces peuvent être purifiées par divers moyens: CLHP en phase inverse, électrophorèse sur gel de polyacrylamide suivie d'électro-élution, passage sur colonne C 18, etc. La Taq polymérase actuellement disponible est extraite d'une archéobactérie thermophile, Thermus aquaticus I- [brevet CETUS CORPORATION (marque déposée)l, découverte dans des sources chaudes du parc national de Yellowstone aux Etats-Unis en 1969. La forme recombinante obtenue après clonage dans E. colt est également disponible. La Taq polymérase a une température optimale de fonctionnement de 72 degrés Celsius. A cette température, la vitesse de polymérisation varie de -4- à 150 bases par seconde, mals baisse rapidement avec la température (1,5 bases/seconde à 37 degrés Celsius, 0, 25 base/seconde à 22 degrés Celsius). Elle est extrêmement thermorésistante jusqu'à 90 ou 95 degrés

Celsius. Sa demi-vie à 92,5 degrés Celsius est encore de 130 minutes.

Elle diminue ensuite rapidement: 40 minutes à 95 degrés Celsius, 5 minutes à 97,5 degrés Celsius. Les protocoles d'utilisation devront tenir compte de cette caractéristique, en utilisant des dénaturations brèves à

degrés Celsius ou plus prolongées à 90 degrés Celsius.

Les sociétés CETUS CORPORATION (marque déposée) et HOFFMAN - LA ROCHE (marque déposée) possédant un brevet d'exclusivité portant sur les deux formes de l'enzyme (native et recombinante), d'autres firmes ont mis au point des polymérases thermostables extraites d'autres bactéries: Bst polymérase (Bacillus stearothermophilus), Tth (Thermus thermrnophilus), Vent DNA polymérase (Thermococcus littoralis), Pfu polymérase (Pyrococcusfurtosus), etc. Les thermocycleurs sont des bains-marie à sec programmables, qui permettent de réaliser les changements de température des cycles

d'amplification de manière automatique.

La préparation des échantillons comprend habituellement une phase de lyse destinée à libérer les acides nucléiques et une phase de purification de ces derniers. Aux techniques classiques (lyse par la protéinase K en présence de SDS, extraction au phénol-chloroforme, précipitation à l'éthanol en présence d'un agent entraînant) qui sont lourdes, coûteuses et de pratique délicate, tendent à de substituer des procédés rapides, tels ceux utilisant des fours à micro-ondes, certaines résines échangeuses d'ions, ou encore combinant le thiocyanate de guanidine et une matrice de silice fixant l'ADN. Dans certains cas (Legionella), une série de chocs

thermiques suffit.

Il est nécessaire de vérifier la spécificité de la séquence amplifiée.

Les moyens utilisables sont multiples mais de valeur variable.

La présente invention permet de vérifier simplement, rapidement, de

façon spécifique et en continue la qualité de l'amplification.

La taille du fragment obtenu peut être contrôlée actuellement avec des

techniques lourdes, qui sont longues et peu précises comme la co-

électrophorèse avec des marqueurs de poids moléculaire - différents. Le spectre de restriction par des enzymes peut également être analysé et comparé à celui attendu. La technique la plus employée reste l'hybridation moléculaire en Dot-Blot ou en Southern-Blot. Il est de plus en plus fréquemment fait appel à la PCR "nichée" o "emboîtée" (nested PCR), qui permet de vérifier la spécificité en utilisant un deuxième jeu

d'amorces situées à l'intérieur du fragment amplifié.

La très grande sensibilité du procédé expose évidemment à des faux positifs, par contamination des échantillons à étudier par les ADN recherchés, essentiellement par les produits de PCR d'une manipulation précédente, ou par carry-over. Pour minimiser ce risque, l'idéal serait de manipuler les tubes avant et après PCR dans des pièces différente, en utilisant des matériels différents. Plusieurs techniques de préventions des contaminations ont été proposées. La plus connue est l'utilisation

d'uracyl-N-glycosylase ou UNG [(procédé ROCHE(marque déposée)].

Malgré le développement de systèmes parfois très ingénieux, la

quantification de matériel génique divers, notamment des micro-

organismes présents dans les échantillons cliniques, n'a pas encore

trouvé de solution de portée générale.

La présente invention, issue de techniques d'immunoanalyse en phase homogène permet une recherche et une quantification directe sans

manipulation et sans séparation de l'échantillon à analyser.

Cette invention s'appliquant sans réservé' à tout procédé d'amplification

génique, il est important de faire une description succincte des

techniques d'amplification autres que la PCR de ROCHE (marque

déposée).

Le principe de la réaction LCR (Ligation Chain Reaction) est le suivant: deux oligonucléotides hybridant avec des fragments adjacents au sein de la séquence cible sont mis en présence de celle-ci. Une ligase permet

alors la réunion des deux fragments s'ils sont hybridés à leur cible.

Après dénaturation, le cycle peut recommencer et aboutit à la production linéaire de la séquence considérée. Si on utilise deux jeux d'oligonucléotides exactement complémentaires, les deux brins de la séquence cible servent de support à une ligation et les produits formés à chaque cycle peuvent s'hybrider avec les oligonucléotides

complémentaires. L'amplification devient alors exponentielle.

-6- Les ligases utilisables sont la T4 ADN ligase d'E. Coli et une ADN ligase thermostable permettant une utilisation automatisée sur un

thermocycleur (Epicentre Technologies).

Cette technique est d'utilisation simple et facilement adaptable à la bactériologie o les cibles moléculaires sont le plus souvent des ADN double brin. La LCR a été développée et brevetée par la firme américaine

ABBOTT (marque déposée).

Le procédé de Q-{ amplification utilise la très remarquable propriété de la Q-P réplicase [enzyme produite par un bactériophage et brevetée par la société GENE TRACK (marque déposée)] qui consiste à copier avec une grande efficacité une molécule d'ARN dite MDV (midi variant): si une séquence particulière a été incluse dans le MDV, elle sera copiée en même temps que celui-ci. Le déroulement de l'essai comprend: l'insertion d'une sonde spécifique dans l'ARN, l'hybridation avec la séquence complémentaire cible, l'action de la Q-{3 réplicase. La production de l'enzyme est impressionnante, pouvant atteindre un milliard de copies en minutes. Elle se déroule entièrement à 37 degrés Celsius et ne

nécessite donc pas dc thermocycleur.

Le problème essentiel de la technique est l'élimination des ADN non hybridés qui peuvent conduire à un bruit de fond gênant. Par ailleurs, elle est d'une sensibilité étonnante et semble se prêter assez bien à une quantification du nombre de cibles- présentes initialement par

l'appréciation de la cinétique de production de l'enzyme.

D'autres techniques d'amplification génique existent comme NASBA (marque déposée), 3 SR, SDA, etc. Elles ne sont que citées. En fait, la

présente invention s'applique à l'ensemble de ces techniques.

Les procédés actuellement disponibles pour détecter et analyser des séquences d'acides nucléiques comportent un nombre relativement large d'étapes et sont fastidieux à réaliser. De tels procédés maintenant bien connus sont décrits par exemple dans " Hybridisation " par B.D. Hames et S.J. Higgins (Eds) IRL Press 1985 et J.A. Matthews et coll., Analytical Biochemistry, 169, 1988, 1-25 (Academic Press). Classiquement l'ADN testé est dénaturé et lié à un support solide, par exemple de la nitrocellulose ou du nylon, puis incubé en présence d'une séquence sonde, complémentaire de la cible, et contenant un marqueur, par -7- exemple du 32p, ou une des deux parties d'une paire d'affinité, par

exemple de la biotine. Après incubation et lavage de la phase solide, celle-

ci est soumise à un processus de révélation, par exemple l'autoradiographie pour le 32P, ou dans le cas de la blotine, utilisant un conjugué avidine-enzyme, lavage puis addition d'un substrat de l'enzyme. Il existe également des systèmes sandwich utilisant deux séquences cibles complémentaires de la cible. Tous ces procédés et leurs variantes requièrent de nombreuses étapes de manipulations, incubations, lavages,

ce qui donne des processus laborieux et longs.

L'analyse des produits d'amplification génique se fait essentiellement par électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamlde associée ou non

avec un transfert sur membrane (Southern-dot ou Blot-dot) suivi d'une-

hybridation avec une sonde oligonucléotidique spécifique de la séquence

étudiée. L'exécution de ces différentes étapes prend de 8 à 24 heures.

Ces procédés d'analyse ne permettent pas la quantification ni du produit de réaction, ni du nombre de séquences présentes dans l'échantillon étudié. Pour cela, il est nécessaire de procéder à plusieurs amplifications

avec différentes dilutions de l'échantillon.

Un nouveau procédé d'analyse, l'électrophorèse capillaire associée avec la fluorescence induite par laser, permet la quantification du produit de la réaction tout en permettant de connaître sa taille et de le purifier. Ce procédé, relativement lourd, a pour inconvénient sa complexité, la nécessité d'un appareillage spécial et d'un coût Important, et la durée de l'analyse (30 minutes par échantillon). Il ne permet pas de suivre la

réaction au fur et à mesure.

Un autre procédé relativement récent est le "microtitre plate test" de Roche (marque déposée). Dans ce test, les primers possèdent une molécule de biotine à leur extrémité 5' (libre). Les produits de l'amplification sont donc marqués à leur extrémité 5' par une biotine. Ils sont retenus sur le fond des puits d'une microplaque par hybridation avec une oligosonde spécifique fixée. Après lavages et une réaction avidinebiotine classique, l'amplification est révélée par une couleur jaune. Ce test, bien qu'automatlsable pour la révélation, est relativement complexe. Le plus grand inconvénient vient de la nécessité de l'oligosonde -8fixée, qui ne peut donc être choisie par l'utilisateur mais est fournie déjà fixée par le producteur. Ce système ne permet la quantification du nombre de séquences présentes dans l'échantillon étudié que par dilution limite de l'échantillon, ce qui entraîne un coût élevé avec un nombre important d'amplifications. Il est aussi possible de doser le produit d'amplification par incorporation d'un nucléotide radioactif, précipitation de l'ADN double par TCA (acide trichloroacétique), dot et dosage de radioactivité, ou précipitation à l'éthanol de l'ADN db, et compteur de radiations. Ces procédés, peu précis quand à la quantité d'ADN db produite, ont été surtout utilisés

pour mesurer le taux d'incorporation, donc le marquage de l'ADN db.

Tous les procédés précédemment évoqués sont relativement longs et fastidieux et les procédés actuellement en développement, tels que quantification par compétition et immuno-PCR, restent, dans une

moindre mesure, laborieux.

Le procédé de l'invention présente fait appel à la technique de polarisation de fluorescence pour détecter, suivre, analyser, quantifier les

produits d'amplification.

Le principe de la polarisation de fluorescence est explicité dès à présent.

La lumière, du point de vue ondulatoire, est constituée de champs magnétiques et électriques qui oscillent lorsqu'ils sont propagés dans l'espace. L'énergie E de l'onde est donnée par: E = h c/X = hn o: h = Constante de Planck n = fréquence c = vitesse de la lumière X = longueur d'onde Lorsqu'une telle onde rencontre une molécule, elle est dispersée (par changements de directions) ou absorbée (transfert d'énergie). La probabilité de survenue de chacun de ces événements est une propriété

de la molécule considérée.

Si l'énergie électromagnétique de la lumière est absorbée, la molécule est

dite excitée ou dans un état excité.

L'absorption correspond à une "collision" d'un photon avec les électrons d'un atome ou d'une molécule qui entraîne la promotion d'un électron dans une orbitale inoccupée telle que l'énergie qui la sépare de l'état

fondamental représente Justement l'énergie du photon.

-9- On peut avec la lumière visible ou ultraviolette exciter électroniquement

une molécule.

Le système excité peut se relaxer par émission de lumière, soit par fluorescence, phénomène le plus classiquement observé, soit par phosphorescence. On peut également réaliser cette excitation par réaction chimique ou biochimique, on a alors une réaction chimio ou bioluminescente. Il est bien connu que l'émission de fluorescence de molécules organiques en solution correspond à une transition électronique S1-SO, o SI1 est le singlet à l'état excité et SO est le singlet à l'état de départ. La durée de vie

d'une telle transition permise est de l'ordre de la nanoseconde (1 ns = 10-

9s). La plupart des durées de vie mesurées expérimentalement se trouvent dans la zone de là 20 ns. C'est durant ce court intervalle de temps que les causes pouvant modifier la fluorescence agissent si elles doivent être efficaces. Par conséquent, il faut disposer de processus moléculaires ayant un taux intrinsèque de 108/s ou plus pour être efficace en fluorescence. t L'intensité de la lumière polarisée transmise par un polariseur dépend de l'orientation du polariseur: la transmission est maximale lorsque le plan de polarisation est parallèle à l'axe du polariseur, elle est nulle si le plan

de polarisation est perpendiculaire.

Lorsque les molécules sont excitées par une lumière polarisée verticalement, la probabilité d'absorption de ces dernières dépend de leur orientation par rapport à la verticale. Pendant leur durée de vie, ces molécules excitées peuvent ou non se réorienter. Selon la nature de la substance et la cohésion du milieu, on peut avoir une émission définie par deux paramètres: - le degré de polarisation p p = I - I_

II|I + I]1 -

- l'anisotropie r r= 111 - I Ill + 2 I I 1 1 et IL représentent les intensités de fluorescence mesurées en

polarisation verticale et horizontale.

La polarisation peut varier entre -1 et + 1. Elle est égale à zéro pour la lumière naturelle qui est non polarisée; autrement, elle est partiellement polarisée. -10- Polarisation en solution et orientation moléculaire: p0 = (3/2)cos20- (1/2) (l/p0) - (1/3) = (5/3) 12/(3cos2 X -1) (1/2) + (sin2 0/2) On peut à partir de ces formules démontrer que la polarisation de fluorescence varie en réalité entre 1/2 et - 1/3. La première valeur (1/2) correspond à une transition pure S1 -S0. Des valeurs de p proches de 0,45 ont été observées. Cependant des valeurs de polarisation négative

proches de 0,33 ont été aussi observées.

Plusieurs facteurs peuvent influencer le niveau de dépolarisation. On peut citer: - le mouvement de la molécule absorbante,

- le transfert d'énergie comme celui se produisant entre chromophores.

Si la molécule émettrice fait des rotations rapides comme par exemple le mouvement brownien, à tel point qu'il y a un changement substantiel dans son orientation durant la durée de vie de l'état excité, la polarisation sera très réduite. Ceci est un phénomène important et son amplitude est très influencée par la température, la viscosité du solvant, et la taille de

la molécule contenant l'émetteur.

Le second facteur, le transfert d'énergie entre chromophores identiques, résulte du fait que, quoique la résonance d'énergie de transfert ait lieu avec une forte probabilité entre molécules ayant des dipôles parallèles, il a également lieu même quand ils ne le sont pas, avec une dépolarisation qui en résulte. Parce que l'efficacité du transfert d'énergie décroît d'un facteur six avec la distance entre le donneur et l'accepteur, ce type de

dépolarisation est très dépendant de la concentration.

La polarisation intrinsèque po est celle qui pourrait être observée si l'absorbant était immobilisé et complètement éloigné de toute molécule (ainsi il n'y aurait aucun effet de mouvement moléculaire ou de transfert d'énergie). En pratique, il s'agit de la polarisation observée si le fluor est à concentration très basse dans un solvant de très forte viscosité. Il faut cependant noter que basse concentration peut signifier deux situations différentes: une faible concentration du complexe macromolécule-fluor ou

une grande séparation entre les fluors liés à une seule macromolécule.

Pour une forte viscosité et une concentration élevée, l'effet de l'énergie de transfert est détecté en premier lieu. En revanche, pour une faible -I-I viscosité et une concentration basse, c'est l'effet de mouvement moléculaire qui est détecté. Naturellement, ces effets sont utilisés pour

obtenir des informations que ne pouvaient fournir les autres techniques.

Les applications de la polarisation de fluorescence sont multiples. On peut citer en particulier: - la mesure de la liaison protéine-ligand. En effet, si un fluor est lié à une macromolécule et si cette dernière s'agrège ou se lie à une autre grosse molécule, la polarisation augmente due à la réduction de la mobilité de la structure.

- la mesure des constantes de dissociation et d'association des protéines.

- l'étude des transitions hélice-état désordonné.

- l'étude de la structure du complexe ADN-fluor.

L'acridine orange se lie fortement à l'ADN. Parce que ce complexe est un

mutagène efficace, l'étude de sa structure parait donc intéressante.

Lorsqu'il est lié à l'ADN, l'acridine orange devient inaccessible à certains traitements chimiques comme par exemple la diazotation, ce qui suggère qu'il se trouve quelque part enfoui à l'intérieur de la double hélice de l'ADN. Lié à l'ADN, l'acridlne orange fluoresce lorsqu'il est excité non seulement par des longueurs d'onde dans sa propre bande d'absorption mais aussi par la lumière absorbée par les bases de l'ADN, ce qui indique qu'il y a transfert d'énergie à partir de ces bases. Le rendement quantique de transfert est très élevé, ce qui semble suggérer que l'acridine orange (qui est une structure plane) se trouverait alors très proche des bases de I'ADN. La fluorescence de l'acridine orange est très fortement polarisée,

indiquant une forte réduction de sa mobilité.

Dans les dosages immunologiques, selon la nécessité ou non de séparer les réactants avant de faire les déterminations, on distingue deux grandes familles de techniques: les dosages homogènes et les dosages hétérogènes. Nous ne nous intéresserons qu'aux techniques homogènes qui ne requièrent pas de séparation préalable. Elles utilisent la compétition entre les molécules d'antigènes marquées par le fluorochrome et celles non marquées. On peut citer: - le quenching de fluorescence, l'exaltation de fluorescence, la polarisation de fluorescence, le transfert d'énergie, la coupure

enzymatique, l'utilisation de chélates de terres rares.

-12- Compte tenu de l'origine des echantillons (urine, plasma, sérum), il parait important de choisir des substances émissives dans des conditions o le milieu support n'est pas très perturbant. Il est également intéressant de disposer de molécules dont les maxima et le minima d'absorption et d'émission sont le plus séparé possible ( élimination des émissions

Raleygh, Tyndall et Raman).

Il est recommandé de prendre des marqueurs dont le rendement

quantique est élevé pour obtenir une sensibilité maximale.

Pour une molécule X de faible poids moléculaire (PM) marquée par une sonde fluorescente, le taux de polarisation de cette molécule est peu élevé. Quand X tourne sur elle-même (mouvement brownien), sa fluorescence est très dépolarisée. Si X est liée à un polymère (ADN), son mouvement est considérablement ralenti et donc le taux de polarisation

de fluorescence du complexe est augmenté.

Les marqueurs fluorescents ont été utilisés dans de nombreux essais pour des molécules biologiques. Une forme particulièrement utile d'essai fluorescent est celui utilisant la polarisation de fluorescence, décrit par

Dandliker et Feigen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 5, 299-304 (1961).

La compétition immunologique repose sur le principe suivant: la substance à doser dans un échantillon, pouvant être un antigène ou un haptène car la présente technique ne peut s'adresser qu'à des petites molécules, entre en compétition avec uneé substance identique marquée appelée traceur vis-à-vis d'un nombre limité de sites anticorps spécifiques. Si par exemple, la substance à doser est un médicament, c'est le médicament non marqué qui détermine la quantité de traceur qui

pourra se lier à l'anticorps spécifique.

Dans le dosage immunologique par polarisation de fluorescence, la fluorescéine est utilisée comme marqueur. La fluorescéine, fixée sur le traceur, excitée par une lumière polarisée rectiligne, émettra une fluorescence dont le degré de polarisation sera inversement proportionnel

à sa vitesse de rotation.

Si le traceur est libre (non lié à l'anticorps), sa vitesse de rotation est importante. Pendant la durée de vie de la fluorescence, l'orientation des molécules de traceur est devenue tout à fait aléatoire et la polarisation de

la fluorescence est voisine de zéro.

-13- Si le traceur se lie à la molécule d'anticorps, molécule de grandetaille, sa rotation est ralentie et, pendant la durée de vie de la fluorescence, les changements d'orientation resteront faibles. La polarisation sera donc élevée. Ainsi, la polarisation observée sera d'autant plus élevée que le traceur sera lié à l'anticorps (faible concentration du produit recherché). Elle sera faible lorsque le traceur sera libre en solution, indiquant une

concentration élevée du produit à doser.

Il s'agit donc d'une analyse directe, s'effectuant en phase homogène, c'est à dire sans séparation de la fraction liée ou de la fraction libre, sensible seulement au rapport "traceur lié/traceur libre" et indépendante des phénomènes qui entraînent des changements dans la concentration

absolue du traceur.

Depuis la mise sur le marché d'une instrumentation performante notamment avec le TDX (marque déposée) de la société ABBOTT (marque déposée), le dosage Immunologique par polarisation de fluorescence connaît un important développement, en particulier dans le domaine du dosage sérique des médicaments. La technique confère aux dosages une

grande sensibilité (0,2 [tg/L pour la digoxine).

L'automatisation totale de la technique, la stabilité des réactifs, ainsi que la fiabilité et la rapidité des réponses en font un outil parfaitement adapté

aux dosages immunologiques.

L'invention présente est basée sur le concept préalablement évoqué dans les dosages immunologiques en phase homogène utilisant la polarisation de fluorescence. Il s'agit de modifier et adapter ce principe pour suivre en direct ou en point terminal, les produits issus de techniques d'amplification, dont les amplifications géniques, notamment la PCR, et éventuellement rendre ces dernières quantitatives. L'échantillon de l'amplification peut être de nature biologique ou être lui-même le produit d'une ou de plusieurs amplifications précédentes, qu'elles que soient leur

nature.

Le procédé de l'invention permet l'analyse quantitative d'une ou de

plusieurs séquences géniques recherchées.

Le principe est le suivant: la détection d'une modification des caractéristiques d'un marqueur mis en présence soit d'une réaction d'amplification, soit des produits de cette amplification génique. La 14- caractéristique indicatrice d'amplification dans le cadre de cette invention sera préférentiellement la polarisation de fluorescence ou son degré de

polarisation de fluorescence.

L'invention porte sur tout procédé d'amplification ou de réplication génique (ADN, ARN, et autre) utilisant un nucléotide marqué par un fluorochrome ou tout autre molécule pouvant être impliqué dans une analyse qualitative ou quantitative de matériel génique en phase

homogène par polarisation de fluorescence.

Il doit être précisé que la polarisation de fluorescence comprend toutes les procédés analysant la polarisation de lumière, ou ondes lumineuses émises provenant d'un fluorophore quand il est excité par une lumière

polarisée. Ceci est mis en évidence, par exemple, dans un article de M.E.

Jolley (J. Analytical Toxicology, 5, 236-240 (1981).

Une substance fluorophore est ajoutée au milieu réactionnel d'amplification. Le degré de polarisation de sa fluorescence est observé avec un lecteur de polarisation de fluorescence et indique les changements de degré de liberté de cette substance. Ce degré de liberté sera fonction de l'avancement et/ou du résultat de la réaction d'amplification. Dans le cas du suivi d'une amplification génique, le fluorophore pourra être associé directement ou indirectement à un nucléotide. Il peut s'agit par exemple de la fluorescence ou de la polarisation de fluorescence d'un nucléotide modifié ou non, caractéristique se modifiant selon qu'il est libre ou incorporé dans une chaine de nucléotides. Cette amplification génique peut être de seconde ou troisième génération, c'est à dire que l'échantillon soumis à amplification peut lui-même être le résultat d'une

amplification antérieure.

A cet effet, on ajoutera au milieu réactionnel d'amplification génique, une ou des molécules fluorescentes. Cette addition, selon les versions du procédé de l'invention, pourra se faire avant, pendant ou après la réaction d'amplification génique. Le suivi du degré de polarisation de la fluorescence pourra se faire en utilisant un lecteur de polarisation de fluorescence couplé ou non, associé ou non avec un thermocycleur ou un

appareil de chauffage tel qu'un bain-marie.

- 15- Le degré de polarisation de fluorescence de la molécule marqueur devra varier de façon significative et sensible. S'il s'agit d'un acide nucléique couplé à de la fluorescéine, la liaison devra être une chaîne polycarbonée de longueur et de nature à lier étroitement la polarisation de fluorescence au degré de liberté de l'acide nucléique. Dans tous les cas d'amplification, cette invention porte sur l'utilisation d'un changement de polarisation de fluorescence d'un fluorophore comme indicateur de l'état d'amplification. La molécule fluorophore ou porteuse du fluorophore devra voir sa polarisation de fluorescence évoluer selon le degré de liberté de la molécule, en particulier lors du

changement d'état de cette molécule de l'état lié à l'état libre.

Lorsqu'il s'agit d'une molécule liée à un fluorophore, la liaison entre la molécule et le fluorophore devra être de nature à associer étroitement la polarisation de fluorescence du fluorophore avec le degré de liberté de la molécule. Cette liaison qui peut être constituée par une chaîne polycarbonée devra donc être suffisamment rigide. Cette chaîne

polycarbonée ne devra donc pas excéder plus de 6 atomes de carbone.

Les liaisons covalentes doubles auront la préférence. La même règle devra être respectée pour toute molécule couplée à un fluorophore, qu'elle que

soit sa nature.

La liaison entre la molécule et le fluorophore peut être covalente ou non covalente. En particulier, un couple d'affinité peut être utilisé pour associer directement ou indirectement le fluorophore à la molécule sensible à l'amplification, un des membres du couple d'affinité portant le fluorophore. Il peut s'agir de la paire d'affinité biotine - avidine, ou du

couple biotine-streptavidine.

Dans une première version, la molécule fluorescente ajoutée au milieu réactionnel interviendra directement dans la réaction d'amplification génique. Cette molécule pourra, par exemple, être un acide nucléique modifié par ajout d'un fluorochrome ou fluorophore au bout d'une chaine polycarbonée. Cet acide nucléique étant à l'état libre, sa fluorescence aura un degré de polarisation faible. Lorsqu'il sera intégré dans le produit d'amplification qui est un polymère d'acides nucléiques, sa liberté de mouvement sera fortement réduite. Sa fluorescence aura alors un degré - 16- de polarisation élevé, et ce d'autant plus que ce polymère sera hybridé

avec sa séquence matrice.

Dans une seconde version, la molécule fluorescente ajoutée au milieu réactionnel interviendra indirectement dans la réaction d'amplification génique. Cette molécule pourra, par exemple, être elle-même un polymère d'acides nucléiques dont certains seront fluorescents, ce polymère-sonde constituant une séquence complémentaire d'une partie de la séquence nucléique amplifiée. L'effet Taqman (marque déposée) de la Taq polymérase, lié à son activité d'exonucléase, conduira à l'hydrolyse de la sonde au cours de la synthèse du brin complémentaire. Le degré de polarisation de la fluorescence des nucléotides marqueurs changera

lorsque ces derniers seront libérés.

Dans une troisième version, un polymère-sonde d'acides nucléiques comportant des marqueurs fluorescents, complémentaire et spécifique d'une région de la séquence recherchée sera ajoutée au milieu d'amplification en point terminal. Après hybridation, ce polymère pourra être hydrolysé par un agent catalytique spécifique des doubles brins d'acides nucléiques qui peut être une enzyme désoxyribonucléase spécifique des ADN double brin, ou un agent chimique. Le degré de polarisation des fluorophores liés à des acides nucléiques liés au polymère-sonde diminuera lors de la libération de ces molécules marqueurs. Dans une autre version, la molécule fluorescente ajoutée au milieu réactionnel n'interviendra pas directement ni indirectement dans la réaction d'amplification génique, mais -verra son degré de liberté en solution se modifier en présence soit du produit de l'amplification, soit de

ses sous-produits.

Dans le cas d'amplification génique, la ou les molécules portant ou comprenant un fluorophore peuvent être des acides nucléiques de toutes natures, des analogues d'acides nucléiques, des dimères et polymères d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques. De tels

analogues incluent l'hypoxanthine, la 2,6-diaminopurine et la 8-

azaguanine. Il peut également s'agir de molécules nativement fluorescentes tels que des analogues d'acides nucléiques naturellement fluorescents.. Il peut - 17- également s'agir de molécules de nature protéique ou diverses, caractérisées par un changement de liberté au cours d'une amplification

ou en présence du résultat d'une amplification.

La modification rendant fluorescente la molécule marqueur peut être le couplage d'un marqueur fluorescent ou une modification de la structure

intrinsèque de la molécule, par exemple d'un acide nucléique.

La molécule fluorescence pourra être associée temporairement ou non à

une ou plusieurs macromolécules.

Plusieurs molécules fluorescentes de nature identique ou différente

peuvent être associées dans une même réaction d'amplification.

Le fluorophore peut être de la fluorescéinc ou de la rhodamine, d'usages plus courants, mals aussi n'importe quel fluorophore. Plusieurs amplifications simultanées peuvent être analysées avec un seul et même

fluorophore ou avec plusieurs fluorophores différents.

Les molécules équivalentes non fluorescentes peuvent être également

présentes dans le milieu réactionnel d'amplification.

Dans le cas d'une amplification génique, les molécules fluorescentes peuvent être des amorces, soumises à l'action d'une enzyme ou d'un agent chimique ou biochimique non impliqué dans la réaction d'amplification, et qui, par exemple occasionne l'hydrolyse d'une ou des

amorces en présence de produits ou sous-produits d'amplification.

L'invention est également applicable à des amplifications de nature autre que génique, par exemple protéique, qui impliquent une réaction de polymérisation. Un avantage particulier du procédé décrit dans la présente invention est qu'il s'effectue en phase homogène, donc dans une seule phase, par exemple en solution, et sans séparation de phase. Cela signifie que, en général, seule une modification de la c6mposition du milieu initial de réaction d'amplification génique est nécessaire, avec donc une économie de temps et de travail. Il peut s'agir de la modification de la composition en acides nucléiques, une partie de ceux- ci étant remplacés par leur analogue modifié et rendu fluorescent, ou de l'ajout d'un polymère d'acides nucléiques dont certains sont fluorescents, et qui constitue une séquence complémentaire d'une partie de la séquence nucléique

amplifiée.

- 18- L'invention peut s'étendre à d'autres systèmes en phase homogène, basés sur le même principe et utilisés en immuno-analyse comme par exemple

les analyses radio-immunologlques utilisant des isotopes radioactifs.

Voici deux modes d'application de l'invention auxquels cette dernière ne se limite en aucune façon.

Exemple 1:

On ajoute un dNTP couplé à la fluorescéine sous forme de traceur, par exemple le fluoro- 1 2-dUTP, dans le milieu réactionnel o se déroule

l'amplification ou la réplication, par exemple une PCR.

Dans ce système, la fluorescéine est utilisée comme marqueur. La fluorescéine, fixée sur le traceur, excitée par une lumière polarisée rectiligne, émettra une fluorescence dont le degré de polarisation sera

inversement proportionnel à sa vitesse de rotation.

Si le traceur est libre, c'est à dire non intégré dans les chaînes d'acides nucléiques ADN ou ARN, ou hybride), sa vitesse de rotation est importante. Pendant la durée de vie de la fluorescence, l'orientation des molécules de traceur est tout à fait aléatoire et la polarisation de la

fluorescence est voisine de zéro.

Si le traceur est intégré dans une chaîne d'acide nucléique tel que de l'ADN ou de 'ARN, donc une molécule de grande taille, sa rotation est ralentie, et, pendant la durée de vie de la fluorescence, les changements de rotation resteront faibles. La polarisation sera donc élevée. Ainsi, la polarisation observée sera d'autant plus élevée que le traceur sera intégré à la chaîne d'acide nucléique, indiquant une bonne amplification ou réplication. A ce niveau on s'aperçoit que ce procédé est rapide, automatisable, quantitatif, sensible, on peut cycle par cycle apprécier la quantité d'amplification, il se déroule en phase homogène sans préparation du matériel à analyser. A l'inverse la polarisation sera faible lorsque le traceur sera libre en solution indiquant une absence d'amplification ou une faible quantité de produit à amplifier ou à répliquer, une mauvaise spécificité des amorces ou un problème

technique lié aux techniques d'amplification ou de réplication.

Il s'agit donc d'un procédé direct, s'effectuant en phase homogène, sensible seulement au rapport "traceur lié/traceur libre" et indépendant -19- des phénomènes qui entraînent des changements dans la concentration

absolue du traceur.

Exemple 2:

Dans une seconde version de l'invention, on ajoute dans le mélange réactionnel, une oligosonde spécifique de la séquence nucléique amplifiée et comprenant des nucléotides couplées à la fluoresceine. L'effet Taqman (marque déposée) de la Taq polymérase, lié à son activité d'exonucléase, consiste dans l'hydrolyse de la sonde au cours de la synthèse du brin complémentaire. La polarisation de la fluoresceinc des nucléotides

marqués changera lorsque ces derniers seront libérés.

Il peut également s'agir d'une ou plusieurs amorces de polymérisation comprenant des molécules fluorescentes et caractérisées par le fait que le changement de degré de polarisation de fluorescence est occasionné par l'action d'une enzyme ou d'un agent chimique ou biochimique non impliqué dans la réaction de polymérisation, par exemple occasionnant

l'hydrolyse d'une ou des amorces après polymérisation.

Les applications majeures de ce procédé peuvent être, par exemple, le suivi de réactions ou la détection spécifique de produits d'amplification génique pour la recherche d'agents infectieux (HIV, etc. ), de modifications chromosomiques, de mutations géniques, tels que des cancers ou des

défauts congénitaux.

En particulier, elle est applicable à la détection de micro-organismes infectieux ou indicateurs d'infection ou de pollution, et à la détection de mutations géniques, de délétions et/ou réarrangements de gènes, responsables de prédispositions, maladies héréditaires, ainsi que de

pouvoir pathogène et résistances dans le cas d'agents pathogènes.

Le procédé de l'invention permet de développer des trousses d'analyses incluant le suivi ou la mise en évidence du résultat de l'amplification par polarisation de fluorescence. Il permet secondairement-de développer des trousses complémentaires à des trousses d'amplification, et dont le seul objectif est de permettre le suivi ou la détection du résultat de réactions d'amplification. Une application du procédé de la présente invention est la mise en évidence ou mesure d'acides nucléiques eux- mêmes générés comme partie d'un système de révélation de test, par exemple la séquence ARN -20- qui est générée par la Q-P réplicase, ainsi que décrit dans Nucleic Aclds Research, 14, 5591-5603, (1986) ou Biotechnology, 6, 1197-1202,

(October 1988).

Une application particulièrement avantageuse de cette invention est la mise en évidence et mesure de séquences d'ADN générées par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). D'autres applications avantageuses de la présente invention sont en relation avec les systèmes d'amplification/détection d'acides nucléiques basés sur la transcription de Siska Diagnostics Inc. (marque déposée), décrits dans le brevet PCT WO 88/10315, ainsi que le système d'amplification utilisant la ligase de

Biotechnlca International (EP-320308).

L'échantillon est généralement d'origine biologique, par exemple prélevé sur un homme, un animal ou une plante. Cet échantillon est soumis à une amplification génique spécifique d'une séquence indicatrice par exemple de pathologie. L'invention présente permet de savoir au cours même de l'amplification si celle-ci donne un résultat positif. Les procédés actuellement employés pour connaître le résultat d'une amplification

nécessitent plusieurs heures de travail.

Il suffit donc d'employer une des versions proposées du procédé de cette invention pour connaître immédiatement le résultat d'une amplification génique, ce qui est une simplification importante de la révélation de ce

type d'analyses.

-21 -

Claims (7)

REVENDICATIONS

1) Procédé pour l'analyse en phase homogène de réactions de polymérisation, notamment d'amplification génique, et permettant le suivi desdites réactions, caractérisée d'une part par le fait d'additionner au milieu réactionnel, avant, pendant ou après la polymérisation, une ou plusieurs molécules comprenant dans leur structure ou lié à celle-ci de façon covalente ou non covalente une substance ou composant chimique fluorescent, et dont le degré de liberté en solution se modifie au cours de la réaction de polymérisation ou en présence des produits de cette polymérisation, et caractérisée d'autre part par le fait d'utiliser la lecture de polarisation de fluorescence dans le but de détecter par une modification de la polarisation de fluorescence un changement de liberté de la molécule dans l'échantillon, indiquant soit la présence de

polymères, soit qu'une polymérisation se réalise.

2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les molécules comprenant dans leur structure, ou liée à celle-ci, une substance ou composant chimique fluorescent, peuvent être des acides nucléiques, des analogues d'acides nucléiques, de tels analogues Incluant l'hypoxanthine, la 2,6-diaminopurine et la 8-azaguanine, des molécules nativement fluorescentes, des dimnères et polymères d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques, dont la partie fluorescente est libérée

ou liée lors de ou par la réaction de polymérisation.

3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les molécules comprenant dans leur structure, ou liée à celle-cl, une substance ou composant chimique fluorescent, peuvent être des acides aminés. 4) Procédé selon la revendication I caractérisé en ce que les molécules comprenant dans leur structure ou liée à celle-cl une substance ou composant chimique fluorescent peuvent être des substances de nature protéique qui présentent une forte affinité et un

taux d'association élevé avec les produits d'une polymérisation.

) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le

fait qu'une ou plusieurs macromolécules sont liées à la molécule fluorescente. -22-

6) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en

ce qu'une substance (1), affine et spécifique, est incorporée dans le milieu réactionnel et mis en contact avec une macromolécule (2), fluorescente et incluant ou couplée avec la partie affine complémentaire et spécifique de la substance (1).

7) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en

cc que la molécule fluorescente incorporée dans le milieu de

polymérisation est en présence de son équivalente non fluorescente.

8) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en

ce que les molécules comprenant dans leur structure ou liée à celle-ci un composant fluorescent, peuvent être ajoutées dans le milieu réactionnel sous forme de ou intégrées dans un ou des polymères, et caractérisé par le fait que la polymérisation libère la ou les molécules fluorescentes ou

leur partie fluorescente.

9) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé

par le fait d'analyser ou détecter la polarisation de fluorescence de

plusieurs molécules fluorescentes différentes.

)Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé

en ce que l'on effectue une analyse quantitative d'une ou de plusieurs séquences nucléiques recherchées, plusieurs réactions de polymérisation étant effectuées simultanément et analysées soit avec un même fluorophore tel que la fluorescéine ou la rhodamine, soit avec plusieurs

fluorophores différents.

I I)Trousse d'analyse d'échantillons biologiques ou autres caractérisée en ce qu'elle utilise un procédé selon l'une des

revendications précédentes, et contenant un ou plusieurs éléments

fluorescents dont la polarisation de fluorescence se modifie du fait d'une polymérisation ayant lieu lors de l'analyse, notamment dans le cas

d'amplification génique.