WO2002053776A1 - Detection d'amplifications geniques utilisant fluorescence a polarisation - Google Patents

Detection d'amplifications geniques utilisant fluorescence a polarisation Download PDF

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WO2002053776A1
WO2002053776A1 PCT/FR2000/003758 FR0003758W WO02053776A1 WO 2002053776 A1 WO2002053776 A1 WO 2002053776A1 FR 0003758 W FR0003758 W FR 0003758W WO 02053776 A1 WO02053776 A1 WO 02053776A1
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amplification
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Joël LESSER
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Revelgenics
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    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Definitions

  • the process using light techniques, can be carried out qualitatively and quantitatively, in real time or at a terminal point.
  • This process makes it possible in particular to follow the gene amplification reactions as they occur and therefore to know immediately the result of these. For example, it makes it possible to follow the incorporation of modified nucleic acids into the polymers synthesized during gene amplifications, in particular by using fluorescent nucleic acids, and by observing the modification of the fluorescence polarization of said nucleic acids.
  • the present invention is applicable to research in molecular biology and in the field of medical diagnostics, as well as in all fields of diagnostic sciences, such as veterinary, agricultural, agrifood, food and expertise sciences, where it is necessary. detect gene amplification products. It is also applicable in industry, and to any polymerization process used industrially.
  • the method uses the combination of fluorescence polarization with the principles and techniques of polymerization used for example in molecular biology.
  • the characteristic of gene amplification is to incorporate free nucleic acids into a polymer, forming a DNA or RNA chain or hybrid according to the enzymes and the nucleic acids present in the reaction medium.
  • a modified nucleic acid contains. a fluorescent marker
  • its fluorescence polarization will be modified by its incorporation into the gene amplification product.
  • the fluorescence polarization is a function of the degree of freedom of the fluorescent molecule, the degree of polarization being inversely proportional to the speed of rotation of the emitting molecule.
  • Monitoring the fluorescence polarization of modified nucleic acids therefore makes it possible to follow the progress of the gene amplification reaction.
  • J. Mol. Biol. (l-974 ⁇ r -ii, -341-364, -, -Kleppe-et- -oll.- describe a technique for the amplification of a DNA sequence sought.
  • the procedure includes denaturing a DNA duplex to form single strands.
  • the denaturation step is carried out in the presence of a sufficiently large excess of two nucleic acid primers.
  • These primers or primers are oligonucleotides, chains composed of 5 to 15 nucleotides.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the essential condition for using the technique is knowledge of the 15 to 25 bases located at each 5 'end of the sequence to be amplified. This knowledge is necessary to define the nucleotide composition of the primers or "primers", which by hybridizing will allow the start of the amplification.
  • the theoretical number of copies obtained is 2 n .
  • the yields would generally be between 60 and 85%, at least during the first 35 to 45 cycles when production remains of the exponential type. For an efficiency of 80%, the amplification factor is greater than a million after 30 cycles, and a billion after 45 cycles. In some systems [Chlamydia ROCHE (registered trademark)], a yield of 90% could be obtained.
  • a single copy of 1000 bp (base pairs) amplified under these conditions is the source of 15 pg of DNA after 30 cycles, 15 ng after 45 cycles. A hundred initial copies give 1.5 mg of DNA after 45 cycles.
  • primers are of course decisive for obtaining good amplification since their specificity vis-à-vis the target DNA depends on that of the amplification.
  • primers can be purified by various means: reverse phase HPLC, electrophoresis on polyacrylamide gel followed by electroelution, passage through a Cl 8 column, etc.
  • the Taq polymerase currently available is extracted from a thermophilic archeobacterium, Thermus aquaticus [CETUS CORPORATION patent (registered trademark)], discovered in hot springs in Yellowstone National Park in the United States in 1969. The recombinant form obtained after cloning in E coli is also available.
  • Taq polymerase has an optimal operating temperature of 72 degrees Celsius.
  • CETUS CORPORATION registered trademark
  • HOFFMAN - LA ROCHE registered trademark
  • thermostable polymerases extracted other bacteria: Bst polymerase (Bacillus stearothermoph us), Tth (Thermus thermophilus), Vent DNA polymerase (Thermococcus littoralis), Pfu polymerase (Pyrococcus fiiriosus), etc.
  • Thermocyclers are programmable dry water baths that allow temperature changes in amplification cycles to be performed automatically.
  • the preparation of the samples usually includes a lysis phase intended to release the nucleic acids and a purification phase thereof.
  • Conventional techniques lysis by proteinase K in the presence of SDS, extraction with phenol-chloroform, precipitation with ethanol in the presence of an entraining agent
  • rapid methods such as those using microwave ovens, certain ion exchange resins or even combining guanidine thiocyanate and a DNA-binding silica matrix.
  • Legionella a series of thermal shocks is sufficient. It is necessary to verify the specificity of the amplified sequence.
  • the means that can be used are multiple but of variable value.
  • the size of the fragment obtained can currently be controlled with cumbersome techniques, which are long and imprecise, such as co-electrophoresis with markers of different molecular weight.
  • the restriction spectrum by enzymes can also be analyzed and compared to that expected.
  • the most widely used technique remains molecular hybridization in Dot-Blot or Southern-Blot. More and more frequently, "nested" or “nested” PCR is used, which makes it possible to verify the specificity using a second set of primers located inside the amplified fragment.
  • the present invention resulting from homogeneous phase immunoanalysis techniques, allows direct research and quantification without manipulation and without separation of the sample to be analyzed.
  • the principle of the LCR (Ligation Chain Reaction) reaction is as follows: two oligonucleotides hybridizing with adjacent fragments within the target sequence are brought into contact with it. A ligase then allows the union of the two fragments if they are hybrid to their target. After denaturation, the cycle can start again and leads to the linear production of the sequence considered. If two sets of exactly complementary oligonucleotides are used, the two strands of the target sequence serve as support for a ligation and the products formed in each cycle can hybridize with the complementary oligonucleotides. The amplification then becomes exponential.
  • the ligases that can be used are T4 DNA ligase from E. Coli and a thermostable DNA ligase allowing automated use on a thermocycler (Epicenter Technologies).
  • the Q- ⁇ amplification process uses the very remarkable property of Q- ⁇ replicase [enzyme produced by a bacteriophage and patented by the company GENE TRACK (registered trademark)] which consists in copying with great efficiency a so-called RNA molecule MDV (midi variant): if a particular sequence has been included in the MDV, it will be copied at the same time as it.
  • the progress of the test includes: the insertion of a specific probe into RNA, hybridization with the target complementary sequence, the action of Q- ⁇ replicase.
  • the production of the enzyme is impressive, reaching a billion copies in 15 minutes. It takes place entirely at 37 degrees Celsius and therefore does not require a thermal cycler.
  • the main problem of the technique is the elimination of non-hybrid DNA which can lead to annoying background noise.
  • it is surprisingly sensitive and seems to lend itself fairly well to quantifying the number of targets initially present by assessing the kinetics of enzyme production.
  • Other gene amplification techniques exist such as NASBA (registered trademark), 3 SR, SDA, etc. They are only cited. In fact, the present invention applies to all of these techniques.
  • the methods currently available for detecting and analyzing 'nucleic acid sequences include a relatively large number of steps and are tedious to perform.
  • the analysis of gene amplification products is essentially carried out by electrophoresis in agarose or polyacrylamide gel, whether or not associated with a membrane transfer (Southern-dot or Blot-dot) followed by hybridization with an oKgonucleotide probe specific for the sequence studied. These steps take 8 to 24 hours to complete. These analysis methods do not allow the quantification of either the reaction product or the number of sequences present in the sample studied. For this, it is necessary to carry out several amplifications with different dilutions of the sample.
  • a new analysis method, capillary electrophoresis associated with laser-induced fluorescence allows the quantification of the reaction product while allowing to know its size and to purify it. This relatively cumbersome process has the disadvantage of its complexity, the need for special equipment and a high cost, and the duration of the analysis (30 minutes per sample). It does not allow to follow the reaction progressively.
  • the method of the present invention uses the fluorescence polarization technique to detect, follow, analyze, quantify the amplification products.
  • a disadvantage of using fluorescent primers with polarization reading is that different primers are required for different target sequences, resulting in costs and difficulties in standardization.
  • the use of fluorescent oligoprobes involves an additional step: hybridization. This step, which has the same sensitivity limitation as the use of primers, can only be done after the end of the amplification and therefore does not allow quantitative monitoring simultaneously.
  • the present invention has the essential difference of requiring only isolated nucleotides or two or three at the most, and not oligonucleotides, macromolecules composed of particular nucleotide sequences.
  • the fluorescent molecular units necessary in this process can be used whatever the sequence sought.
  • the present invention also has the essential difference of using only changes in fluorescence polarization linked to the creation or destruction of covalent fixation.
  • the advantage of covalent fixation is to bring greater changes in polarization, more easily detectable, but also incomparably more stable than non-covalent fixation. It may be the creation of a covalent bond fixing a fluorescent nucleotide or the hydrolysis of such a bond, releasing a fluorescent nucleotide. It absolutely does not use hybridization, a phenomenon of non-covalent fixation with one or more specific gene sequences. The method does not allow the revelation of a single gene amplification but the revelation of any gene amplification.
  • the molecule is said to be excited or in an excited state.
  • the absorption corresponds to a "collision" of a photon with the electrons of an atom or a molecule which involves the promotion of an electron in an unoccupied orbital such as the energy which separates it from the ground state precisely represents the energy of the photon.
  • One can with visible or ultraviolet light electronically excite a molecule.
  • the excited system can relax by light emission, either by fluorescence, the most conventionally observed phenomenon, or by phosphorescence.
  • the intensity of the polarized light transmitted by a polarizer depends on the orientation of the polarizer: the transmission is maximum when the plane of polarization is parallel to the axis of the polarizer, it is zero if the plane of polarization is perpendicular.
  • the probability of their absorption depends on their orientation relative to the vertical. During their lifetime, these excited molecules may or may not redirect. Depending on the nature of the substance and the cohesion of the medium, one can have an emission defined by two parameters:
  • 111 and II represent the fluorescence intensities measured in vertical and horizontal polarization.
  • the polarization can vary between - 1 and + 1. It is equal to zero for natural light which is non-polarized; otherwise, it is partially polarized.
  • the emitting molecule rotates rapidly, such as the Brownian motion, to the point that there is a substantial change in its orientation during the lifetime of the excited state, the polarization will be greatly reduced. This is an important phenomenon and its magnitude is very influenced by the temperature, the viscosity of the solvent, and the size of the molecule containing the emitter.
  • the second factor the energy transfer between identical chromophores, results from the fact that, although the transfer energy resonance takes place with a high probability between molecules having parallel dipoles, it also takes place even when they are not. , with a resulting depolarization. Because the efficiency of energy transfer decreases by a factor of six with the distance between the donor and the acceptor, this type of depolarization is very dependent on the concentration.
  • the intrinsic polarization po is that which could be observed if the absorbent were immobilized and completely removed from any molecule (thus there would be no effect of molecular movement or transfer of energy). In practice, this is the polarization observed if the fluorine is at a very low concentration in a solvent of very high viscosity.
  • low concentration can mean two different situations: a low concentration of the macromolecule-fluorine complex or a large separation between the fluorines linked to a single macromolecule.
  • a low concentration of the macromolecule-fluorine complex For high viscosity and high concentration, the effect of transfer energy is detected first.
  • a low viscosity and a low concentration it is the effect of molecular movement which is detected.
  • these effects are used to obtain information that other techniques could not provide.
  • the applications of fluorescence polarization are multiple. Mention may in particular be made of: - the measurement of the protein-ligand bond. In fact, if a fluorine is linked to a macromolecule and if the latter aggregates or binds to another large molecule, the polarization increases due to the reduction in the mobility of the structure.
  • Fluorescent markers have been used in numerous assays for biological molecules.
  • a particularly useful form of fluorescent assay is that using fluorescence polarization, described by Dandliker and Feigen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 5, 299-304 (1961).
  • the immunological competition is based on the following principle: the substance to be assayed in a sample, which can be an antigen or a hapten because the present technique can only be used for small molecules, competes with an identical marked substance called a tracer vis-à-vis a limited number of specific antibody sites. If, for example, the substance to be measured is a drug, it is the unlabeled drug that determines the amount of tracer that can bind to the specific antibody.
  • fluorescein is used as a marker.
  • the fluorescein fixed on the tracer, excited by a rectilinear polarized light, will emit a fluorescence whose degree of polarization will be inversely proportional to its speed of rotation. If the tracer is free (not linked to the antibody), its speed of rotation is important.
  • the orientation of the tracer molecules has become completely random and the polarization of the fluorescence is close to zero.
  • the tracer binds to the antibody molecule, a large molecule, its rotation is slowed down and, during the lifetime of the fluorescence, the changes in orientation will remain slight.
  • the polarization will therefore be high.
  • the polarization observed will be all the higher as the tracer is linked to the antibody (low concentration of the sought product). It will be low when the tracer is free in solution, indicating a high concentration of the product to be dosed.
  • the immunoassay by fluorescence polarization has experienced significant development, in particular in the field of serum dosage of drugs. .
  • the technique gives dosages a high sensitivity (0.2 ⁇ g / L for digoxin).
  • the total automation of the technique, the stability of the reagents, as well as the reliability and the speed of the responses make it a tool perfectly suited to immunoassays.
  • the present invention is based on the concept previously mentioned in immunoassays in homogeneous phase using fluorescence polarization. It is a question of modifying and adapting this principle to follow live or at a terminal point, the products resulting from amplification techniques, including gene amplifications, in particular PCR, and possibly make these latter quantitative.
  • the amplification sample may be of a biological nature or may itself be the product of one or more previous amplifications, whatever their nature.
  • the method of the invention allows the quantitative analysis of one or more gene sequences sought.
  • the present invention makes it possible to simply, quickly, specifically and continuously check the quality of the amplification.
  • the present invention resulting from homogeneous phase immunoanalysis techniques, allows direct research and quantification without manipulation and without separation of the sample to be analyzed.
  • the principle is as follows: the detection of a modification of the characteristics of a marker brought into contact with either an amplification reaction or the products of this gene amplification.
  • the amplification indicator characteristic in the context of this invention will preferably be the fluorescence polarization or its degree of fluorescence polarization.
  • the invention relates to any method of gene amplification or replication (DNA, RNA, and the like) using a nucleotide labeled with a fluorochrome or any other molecule which can be involved in a qualitative or quantitative analysis of gene material in homogeneous phase by polarization. fluorescence.
  • the fluorescence polarization includes all the methods analyzing the polarization of light or light waves emitted from a fluorophore when it is excited by polarized light. This is highlighted, for example, in an article by M.E. Jolley (J. Analytical Toxicology, 5, 236-240 (1981).
  • a fluorophore substance is added to the amplification reaction medium.
  • the degree of polarization of its fluorescence is observed with a fluorescence polarization reader and indicates the changes in the degree of freedom of this substance. This degree of freedom will depend on the progress and / or the result of the amplification reaction.
  • the fluorophore may be associated directly or indirectly with a nucleotide. It may, for example, be the fluorescence or the fluorescence polarization of a modified or unmodified nucleotide, a characteristic which changes depending on whether it is free or incorporated in a nucleotide chain.
  • This gene amplification can be second or third generation, that is to say that the sample subjected to amplification can itself be the result of a previous amplification.
  • one or more fluorescent molecules will be added to the reaction medium for gene amplification.
  • This addition depending on the versions of the method of the invention can be done before, during or after the gene amplification reaction.
  • the degree of fluorescence polarization can be monitored by using a fluorescence polarization reader coupled or not, associated or not with a thermal cycler or a heating device such as a water bath.
  • the degree of fluorescence polarization of the marker molecule should vary significantly and significantly. If it is a nucleic acid coupled to fluorescein, the bond must be a poly carbon chain of length and such as to closely bind the fluorescence polarization to the degree of freedom of the nucleic acid.
  • this invention relates to the use of a change in fluorescence polarization of a fluorophore as an indicator of the state of amplification.
  • the fluorophore molecule or carrier of the fluorophore will have to see its fluorescence polarization evolve according to the degree of freedom of the molecule, in particular during the change of state of this molecule from the state linked to the free state.
  • the bond between the molecule and the fluorophore must be such as to closely associate the fluorescence polarization of the fluorophore with the degree of freedom of the molecule.
  • This link which can be constituted by a poly carbon chain will therefore have to be sufficiently rigid. This poly carbon chain should therefore not exceed more than 6 carbon atoms. Double covalent bonds will be preferred. The same rule must be observed for any molecule coupled to a fluorophore, whatever its nature.
  • the bond between the molecule and the fluorophore can be covalent or non-covalent.
  • an affinity couple can be used to directly or indirectly associate the fluorophore with the molecule sensitive to amplification, one of the members of the affinity couple carrying the fluorophore. It can be the biotin-avidin affinity pair or the biotin-streptavidin pair.
  • the fluorescent molecule added to the reaction medium will intervene directly in the gene amplification reaction.
  • This molecule could, for example, be a nucleic acid modified by adding a fluorochrome or fluorophore at the end of a poly carbon chain. This nucleic acid being in the free state, its fluorescence will have a low degree of polarization.
  • the amplification product which is a polymer of nucleic acids, its freedom of movement will be greatly reduced. Its fluorescence will then have a high degree of polarization, all the more so since this polymer will be hybrid with its matrix sequence.
  • the fluorescent molecule added to the reaction medium will intervene indirectly in the gene amplification reaction.
  • This molecule may, for example, itself be a polymer of nucleic acids, some of which will be fluorescent, this polymer-probe constituting a sequence complementary to part of the amplified nucleic sequence.
  • the Taqman (registered trademark) effect of Taq polymerase, linked to its exonuclease activity, will lead to the hydrolysis of the probe during the synthesis of the complementary strand.
  • the degree of polarization of the fluorescence of the marker nucleotides will change when the latter are released.
  • a nucleic acid probe polymer comprising fluorescent markers, complementary and specific to a region of the sought sequence will be added to the endpoint amplification medium. After hybridization, this polymer may be hydrolyzed by a catalytic agent specific for double strands of nucleic acids which may be a deoxyribonuclease enzyme specific for double strand DNA or a chemical agent. The degree of polarization of fluorophores linked to nucleic acids linked to the probe polymer will decrease when these marker molecules are released.
  • the fluorescent molecule added to the reaction medium will not intervene directly or indirectly in the gene amplification reaction, but will see its degree of freedom in solution change in the presence of either the amplification product or its by-products.
  • the molecule or molecules bearing or comprising a fluorophore may be nucleic acids of all kinds, nucleic acid analogs, dimers and polymers of nucleic acids or nucleic acid analogs.
  • Such analogs include Tiypoxanthin, 2,6-diaminopurine and 8-azaguanine.
  • They can also be natively fluorescent molecules such as analogs of naturally fluorescent nucleic acids.
  • They can also be molecules of protein or other nature, characterized by a change in freedom during an amplification or in presence of the result of an amplification.
  • the modification which makes the marker molecule fluoresce can be the coupling of a fluorescent marker or a modification of the intrinsic structure of the molecule, for example of a nucleic acid.
  • the fluorescence molecule may be temporarily or not associated with one or more macromolecules.
  • the fluorophore can be fluorescein or rhodamine, for more common uses, but also any fluorophore.
  • Several simultaneous amplifications can be analyzed with a single fluorophore or with several different fluorophores.
  • Equivalent non-fluorescent molecules can also be present in the amplification reaction medium.
  • a particular advantage of the process described in the present invention is that it is carried out in a homogeneous phase, therefore in a single phase, for example in solution, and without phase separation.
  • the invention can be extended to other systems in homogeneous phase, based on the same principle and used in immuno-analysis such as for example radio-immunological analyzes using radioactive isotopes.
  • Example 1 Example 1:
  • fluorescein is used as a marker.
  • the tracer is free, that is to say not integrated into the DNA, RNA or hybrid nucleic acid chains, its speed of rotation is important. During the lifetime of the fluorescence, the orientation of the tracer molecules is completely random and the polarization of the fluorescence is close to zero. If the tracer is integrated into a nucleic acid chain such as DNA or RNA, therefore a large molecule, its rotation is slowed down, and, during the lifetime of the fluorescence, the changes in rotation will remain low. The polarization will therefore be high. Thus, the polarization observed will be all the higher the more the tracer is integrated into the nucleic acid chain, indicating good amplification or replication.
  • Example 2 The PCR amplifications were carried out by a GeneAmp PCR System 2400 thermocycler (Perkin-Elmer). The DNA matrix, vector pQE30, and the primers, Type III / IV and reverse sequencing, are marketed by Qiagen. Plasmid DNA was linearized with Xhol, and purified. The size of the amplification fragment is 172 bp.
  • the initial fluorescent PCR program was based on the recommendations of Molecular Probes, in order to promote the incorporation of fluorescent oligonucleotides. In particular, it has a particularly long elongation phase at 72 ° C (4 minutes).
  • the fluorescent nucleotide was ChromaTide TM Alexa Fluor 488-5-dUTP from Molecular Probes with a spectrum close to that of fluorescein.
  • the control without PCR gives an anisotropy of 34.3 mA, while an anisotropy of 57.6 mA is measured for a PCR in the presence of 2 nM of dUTP-Alexa 488, ie a difference of 68%.
  • Example 3 In another version of the invention, an oligoprobe specific for the amplified nucleic sequence and comprising nucleotides coupled to fluorescein is added to the reaction mixture.
  • the Taqman (registered trademark) effect of Taq polymerase, linked to its exonuclease activity, consists in the hydrolysis of the probe during the synthesis of the complementary strand.
  • the fluorescein polarization of the labeled nucleotides will change when they are released.
  • polymerization primers comprising fluorescent molecules and characterized in that the change in degree of fluorescence polarization is caused by the action of an enzyme or of a chemical or biochemical agent not involved in the polymerization reaction, for example causing the hydrolysis of one or more primers after polymerization.
  • the major applications of this process can be, for example, the monitoring of reactions or the specific detection of gene amplification products for the search for infectious agents (HIV, etc.), chromosomal modifications, gene mutations, such as cancers or birth defects.
  • the method of the invention makes it possible to develop test kits including monitoring or highlighting the result of ramification by fluorescence polarization. Secondly, it makes it possible to develop kits which are complementary to amplification kits, and whose sole objective is to allow the monitoring or detection of the result of amplification reactions.
  • An application of the method of the present invention is the detection or measurement of nucleic acids themselves generated as part of a test revealing system, for example the RNA sequence which is generated by Q- ⁇ replicase, as well as described in Nucleic Acids Research, 14, 5591-5603, (1986) or Biotechnology, 6, 1197-1202, (October 1988).
  • a particularly advantageous application of this invention is the detection and measurement of DNA sequences generated by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Other advantageous applications of the present invention are related to the nucleic acid amplification / detection systems based on the transcription of Siska Diagnostics Inc. (registered trademark), described in PCT patent WO 88/10315, as well as the amplification system using the ligase from Biotechnica International (EP-320308).
  • the sample is generally of biological origin, for example taken from a man, an animal or a plant.
  • This sample is subject to a specific genetic amplification of an indicator sequence, for example of pathology.
  • the present invention makes it possible to know during the amplification itself whether the latter gives a positive result.
  • the methods currently used to know the result of an amplification require several hours of work.

Abstract

Analyse de réactions de polymérisation par polarisation de fluorescence. L'invention concerne un procédé pour le suivi en simultané ou en point terminal de réactions de polymérisation en phase homogène. Le procédé est basée sur le principe d'un changement de degré de polarisation de fluorescence lorsqu'un composant fluorescent est intégré dans un polymère ou libéré d'un polymère, par exemple et de façon non limitative un polymère d'acides nucléiques.Ce procédé permet en particulier de suivre en phase homogène des réactions d'amplification génique utilisées pour le diagnostic biologique. Des trousses d'analyse sont inclues dans le procédé.Un exemple d'utilisation de nucléotide fluorescent pour la détection de réactions d'amplification génique est détaillé.

Description

DETECTION D ' AMPLIFICATIONS GENIQUES UTILISANT FLUORESCENCE A POLARISATION
Il s'agit de protéger un procédé original ayant pour finalité de détecter et de doser des produits de réactions de polymérisation en phase homogène. Le procédé, faisant appel à des techniques lumineuses, peut être effectué de façon qualitative et quantitative, en temps réel ou en point terminal. Ce procédé permet en particulier de suivre les réactions d'amplification génique au fur et à mesure de leur déroulement et donc de connaître immédiatement le résultat de celles-ci. Par exemple, il permet de suivre l'incorporation d'acides nucléiques modifiés dans les polymères synthétisés lors d'amplifications géniques, en particulier en utilisant des acides nucléiques fluorescents, et en observant la modification de la polarisation de fluorescence desdits acides nucléiques. L'invention présente est applicable à la recherche en biologie moléculaire et dans le domaine du diagnostic médical, ainsi que dans tous les domaines des sciences de diagnostic, tels les sciences vétérinaires, agricoles, agroalimentaires, alimentaires et d'expertises, où il est nécessaire de détecter les produits d'amplification génique. Elle est également applicable dans l'industrie, et à tout processus de polymérisation utilisé industriellement.
Le procédé utilise la combinaison de la polarisation de fluorescence avec les principes et techniques de polymérisation utilisés par exemple en biologie moléculaire. L'amplification génique a pour caractéristique d'incorporer des acides nucléiques libres dans un polymère, formant une chaîne ADN ou ARN ou hybride selon les enzymes et les acides nucléiques présents dans le milieu réactionnel.
Lorsqu'un acide nucléique modifié comporte. un marqueur fluorescent, sa polarisation de fluorescence sera modifiée par son incorporation dans le produit d'amplification génique. En effet, la polarisation de fluorescence est fonction du degré de liberté de la molécule fluorescente, le degré de polarisation étant inversement proportionnel à la vitesse de rotation de la molécule émettrice. Le suivi de la polarisation de fluorescence d'acides nucléiques modifiés permet donc de suivre l'avancement de la réaction d'amplification génique.
Dans J. Mol. Biol. (l-974}r-ii,-341-364, - , -Kleppe-et- -oll.- décrivent une- technique pour l'amplification d'une séquence d'ADN recherchée. La procédure comprend la dénaturation d'un duplex d'ADN pour former des simples brins. L'étape de dénaturation est menée en présence d'un suffisamment large excès de deux amorces d'acides nucléiques. Ces amorces ou primers sont des oligonucléotides, chaînes composées de 5 à 15 nucléotides. Ces macromolécules, lors du refroidissement, hybrident des régions adjacent à la séquence d'ADN ciblée. Deux structures sont alors obtenues, chacune contenant la longueur complète du brin matrice, complexée avec l'amorce. Une polymérase d'ADN et une quantité suffisante de chaque déoxynucléoside triphosphate sont ajoutés de façon à obtenir deux molécules du duplex original. Les cycles de dénaturation, hybridation des amorces, et extension sont répétés jusqu'à l'obtention d'un nombre approprié de copies de la séquence d'ADN désirée. Cette technique est maintenant connue comme la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), décrite par exemple dans la licence européenne d'application: European Patent Application, Publication N°0 201 184. Conçue par une équipe de Californiens travaillant au sein de CETUS CORPORATION (marque déposée), comprenant Kary MULLIS (le théoricien) prix Nobel 1993 et Randall SAIKI (le biochimiste), la technologie PCR (Brevets EP 0 201 184, EP 0 200 362) a été vendue en 1991 à ROCHE (marque déposée).
Cette technique repose sur deux principes classiques. Un ADN bi caténaire chauffé à plus de 90 degrés Celsius se sépare en deux brins indépendants; le refroidissement progressif de cette molécule permet rhybridation entre séquences strictement complémentaires; cette opération peut-être répétée un nombre indéfini de fois sans endommager l'ADN. Par ailleurs, les ADN polymérascs sont des enzymes ayant la propriété de recopier un brin d'ADN à partir d'un fragment complémentaire préalablement hybride avec une amorce, le nouveau brin étant synthétisé dans le sens 5'— > 3'. La PCR utilise ces propriétés pour synthétiser de grandes quantités d'ADN, en obtenant la multiplication sélective d'un fragment d'ADN donné.
La condition essentielle à l'utilisation de la technique est la connaissance des 15 à 25 bases situées à chaque extrémité en 5' de la séquence à amplifier. Cette connaissance est nécessaire pour définir la composition en nucléotides des amorces ou "primers", qui en sTiybridant vont permettre le démarrage de l'amplification.
Tout se passe dans un seul tube, en trois étapes répétées 20 à 40 fois: dénaturation par chauffage à 90-96 degrés Celsius, hybridation des amorces à 40-74 degrés Celsius, extension par une polymérase thermostable recopiant l'ADN cible.
Après n cycles, à partir d'un seul ADN cible, le nombre théoriques de copies obtenues est de 2n. Les rendements seraient en général compris entre 60 et 85%, du moins pendant les 35 à 45 premiers cycles où la production reste de type exponentiel. Pour un rendement de 80%, le facteur d'amplification est supérieur au million après 30 cycles, et au milliard après 45 cycles. Dans certain systèmes [Chlamydia ROCHE (marque déposée)], un rendement de 90% a pu être obtenu. A titre d'exemple, une seule copie de 1000 pb (paires de bases) amplifiée dans ces conditions est à l'origine de 15 pg d'ADN après 30 cycles, 15 ng après 45 cycles. Une centaine de copies initiales donnent 1,5 mg d'ADN après 45 cycles.
Le choix des amorces est bien entendu déterminant pour obtenir une bonne amplification puisque de leur spécificité vis-à-vis de l'ADN cible dépend celle de l'amplification.
Des programmes informatiques sont actuellement disponibles pour optimiser le choix des amorces à l'intérieur d'une séquence connue. Obtenues grâce aux synthétiseurs d'oligonucléotides, les amorces peuvent être purifiées par divers moyens: CLHP en phase inverse, électrophorèse sur gel de polyacrylamide suivie d'électro-élution, passage sur colonne Cl 8, etc. La Taq polymérase actuellement disponible est extraite d'une archéobactérie thermophile, Thermus aquaticus [brevet CETUS CORPORATION (marque déposée)], découverte dans des sources chaudes du parc national de Yellowstone aux Etats-Unis en 1969. La forme recombinante obtenue après clonage dans E. coli est également disponible.
La Taq polymérase a une température optimale de fonctionnement de 72 degrés Celsius. Les sociétés CETUS CORPORATION (marque déposée) et HOFFMAN - LA ROCHE (marque déposée) possédant un brevet d'exclusivité portant sur les deux formes de l'enzyme (native et recombinante), d'autres firmes ont mis au point des polymérases thermostables extraites d'autres bactéries: Bst polymérase (Bacillus stearothermoph us), Tth (Thermus thermophilus), Vent DNA polymérase (Thermococcus littoralis), Pfu polymérase (Pyrococcus fiiriosus), etc. Les thermocycleurs sont des bains-marie à sec programmables, qui permettent de réaliser les changements de température des cycles d'amplification de manière automatique.
La préparation des échantillons comprend habituellement une phase de lyse destinée à libérer les acides nucléiques et une phase de purification de ces derniers. Aux techniques classiques (lyse par la protéinase K en présence de SDS, extraction au phénol-chloroforme, précipitation à l'éthanol en présence d'un agent entraînant) qui sont lourdes, coûteuses et de pratique délicate, tendent à se substituer des procédés rapides, tels ceux utilisant des fours à micro-ondes, certaines résines échangeuses d'ions ou encore combinant le thiocyanate de guanidine et une matrice de silice fixant l'ADN. Dans certains cas (Legionella), une série de chocs thermiques suffit. Il est nécessaire de vérifier la spécificité de la séquence amplifiée. Les moyens utilisables sont multiples mais de valeur variable. La taille du fragment obtenu peut être contrôlée actuellement avec des techniques lourdes, qui sont longues et peu précises comme la co- électrophorèse avec des marqueurs de poids moléculaire différents. Le spectre de restriction par des enzymes peut également être analysé et comparé à celui attendu. La technique la plus employée reste l'hybridation moléculaire en Dot-Blot ou en Southern-Blot. Il est de plus en plus fréquemment fait appel à la PCR "nichée" où "emboîtée" (nested PCR), qui permet de vérifier la spécificité en utilisant un deuxième jeu d'amorces situées à l'intérieur du fragment amplifié.
La très grande sensibilité du procédé expose évidemment à des faux positifs, par contamination des échantillons à étudier par les ADN recherchés, essentiellement par les produits de PCR d'une manipulation précédente ou par carry-over. Pour minimiser ce risque, l'idéal serait de manipuler les tubes avant et après PCR dans des pièces différente, en utilisant des matériels différents. Plusieurs techniques de préventions des contaminations ont été proposées. La plus connue est l'utilisation d'uracyl-N-glycosylase ou UNG (procédé ROCHE, marque déposée). Malgré le développement de systèmes parfois très ingénieux, la quantification de matériel génique divers, notamment des microorganismes présents dans les échantillons cliniques, n'a pas encore trouvé de solution de portée générale.
La présente invention, issue de techniques d'immuno analyse en phase homogène permet une recherche et une quantification directe sans manipulation et sans séparation de l'échantillon à analyser.
Cette invention s'appliquant sans réserve à tout procédé d'amplification génique, il est important de faire une description succincte des techniques d'amplification autres que la PCR de ROCHE (marque déposée). Le principe de la réaction LCR (Ligation Chain Reaction) est le suivant: deux oligonucléotides hybridant avec des fragments adjacents au sein de la séquence cible sont mis en présence de celle-ci. Une ligase permet alors la réunion des deux fragments s'ils sont hybrides à leur cible. Après dénaturation, le cycle peut recommencer et aboutit à la production linéaire de la séquence considérée. Si on utilise deux jeux d'oligonucléotides exactement complémentaires, les deux brins de la séquence cible servent de support à une ligation et les produits formés à chaque cycle peuvent s'hybrider avec les oligonucléotides complémentaires. L'amplification devient alors exponentielle. Les ligases utilisables sont la T4 ADN ligase d'E. Coli et une ADN ligase thermostable permettant une utilisation automatisée sur un thermocycleur (Epicentre Technologies).
Cette technique est d'utilisation simple et facilement adaptable à la bactériologie où les cibles moléculaires sont le plus souvent des ADN double brin. La LCR a été développée et brevetée par la firme américaine ABBOTT (marque déposée) .
Le procédé de Q-β amplification utilise la très remarquable propriété de la Q-β réplicase [enzyme produite par un bactériophage et brevetée par la société GENE TRACK (marque déposée)] qui consiste à copier avec une grande efficacité une molécule d'ARN dite MDV (midi variant): si une séquence particulière a été incluse dans le MDV, elle sera copiée en même temps que celui-ci. Le déroulement de l'essai comprend: l'insertion d'une sonde spécifique dans l'ARN, l'hybridation avec la séquence complémentaire cible, l'action de la Q-β réplicase. La production de l'enzyme est impressionnante, pouvant atteindre un milliard de copies en 15 minutes. Elle se déroule entièrement à 37 degrés Celsius et ne nécessite donc pas de thermocycleur.
Le problème essentiel de la technique est l'élimination des ADN non hybrides qui peuvent conduire à un bruit de fond gênant. Par ailleurs, elle est d'une sensibilité étonnante et semble se prêter assez bien à une quantification du nombre de cibles présentes initialement par l'appréciation de la cinétique de production de l'enzyme. D'autres techniques d'amplification génique existent comme NASBA (marque déposée), 3 SR, SDA, etc. Elles ne sont que citées. En fait, la présente invention s'applique à l'ensemble de ces techniques. Les procédés actuellement disponibles pour détecter et analyser des ' séquences d'acides nucléiques comportent un nombre relativement large d'étapes et sont fastidieux à réaliser. De tels procédés maintenant bien connus sont décrits par exemple dans « Hybridisation » par B.D. Hames et S.J. Higgins (Eds) IRL Press 1985 et J.A. Matthe s et coll., Analytical Biochemistry, 169, 1988, 1-25 (Académie Press). Classiquement l'ADN testé est dénaturé et lié à un support solide, par exemple de la nitrocellulose ou du nylon, puis incubé en présence d'une séquence sonde, complémentaire de la cible, et contenant un marqueur, par exemple du 32P ou une des deux parties d'une paire d'affinité, par exemple de la biotine. Après incubation et lavage de la phase solide, celle- ci est soumise à un processus de révélation, par exemple l'autoradiographie pour le 32P ou dans le cas de la biotine, utilisant un conjugué avidine-enzyme, lavage puis addition d'un substrat de l'enzyme. Il existe également des systèmes sandwich utilisant deux séquences cibles complémentaires de la cible. Tous ces procédés et leurs variantes requièrent de nombreuses étapes de manipulations, incubations, lavages, ce qui donne des processus laborieux et longs.
L'analyse des produits d'amplification génique se fait essentiellement par électrophorêse en gel d'agarose ou de polyacrylamide associée ou non avec un transfert sur membrane (Southern-dot ou Blot-dot) suivi d'une hybridation avec une sonde oKgonucléotidique spécifique de la séquence étudiée. L'exécution de ces différentes étapes prend de 8 à 24 heures. Ces procédés d'analyse ne permettent pas la quantification ni du produit de réaction, ni du nombre de séquences présentes dans l'échantillon étudié. Pour cela, il est nécessaire de procéder à plusieurs amplifications avec différentes dilutions de l'échantillon. Un nouveau procédé d'analyse, l'électrophorèse capillaire associée avec la fluorescence induite par laser, permet la quantification du produit de la réaction tout en permettant de connaître sa taille et de le purifier. Ce procédé, relativement lourd, a pour inconvénient sa complexité, la nécessité d'un appareillage spécial et d'un coût important, et la durée de l'analyse (30 minutes par échantillon). Il ne permet pas de suivre la réaction au fur et à mesure.
Un autre procédé relativement récent est le "microtitre plate test" de Roche (marque déposée). Dans ce test, les primers possèdent une molécule de biotine à leur extrémité 5' (libre). Les produits de l'amplification sont donc marqués à leur extrémité 5' par une biotine. Ils sont retenus sur le fond des puits d'une micro plaque par hybridation avec une oligosonde spécifique fixée. Après lavages et une réaction avidine-biotine classique, l'amplification est révélée par une couleur jaune. Ce test, bien qu'automatisable pour la révélation, est relativement complexe. Le plus grand inconvénient vient de la nécessité de l'oligosonde fixée, qui ne peut donc être choisie par l'utilisateur mais est fournie déjà fixée par le producteur. Ce système ne permet la quantification du nombre de séquences présentes dans l'échantillon étudié que par dilution limite de l'échantillon, ce qui entraîne un coût élevé avec un nombre important d'amplifications.
Il est aussi possible de doser le produit d'amplification par incorporation d'un nucleotide radioactif, précipitation de l'ADN double par TCA (acide trichloracétique), dot et dosage de radioactivité ou précipitation à l'éthanol de l'ADN db, et compteur de radiations. Ces procédés, peu précis quant à la quantité d'ADN db produite, ont été surtout utilisés pour mesurer le taux d'incorporation, donc le marquage de l'ADN db. Tous les procédés précédemment évoqués sont relativement longs et fastidieux et les procédés actuellement en développement, tels que quantification par compétition et immuno-PCR, restent, dans une moindre mesure, laborieux. Le procédé de l'invention présente fait appel à la technique de polarisation de fluorescence pour détecter, suivre, analyser, quantifier les produits d'amplification.
Parmi les nombreux brevets concernant des nucléotides fluorescents particuliers, nous ne citerons à titre d'exemple que les suivants: US 5 328 824, US 5 449 767, US 4 707 440, US 4 952 685, US 5 002 885, US 5 013 831, DK 164 407 8, US 5 047 519, US 5 151 507 et US 5 608 063. Plusieurs brevets décrivent l'utilisation de la polarisation de fluorescence pour suivre l'hybridation d'oligonucléotides, oligosondes et amorces, à des produits d'amplification génique ou leur utilisation pour le démarrage des réactions de polymérisation. On peut citer les brevets US 5 445 935, EP 0 382 433, US 5 109 124, WO 98 04738, EP 0774 516. Tous les procédés décrits dans ces brevets font appels à des oligonucléotides, macromolécules composées d'un nombre suffisant de nucléotides pour définir une séquence spécifique et complémentaire de la séquence génomique cible. Ce nombre est généralement compris entre 5 et 20. Ces procédés utilisent tous le phénomène de l'hybridation, fixation non covalente de deux séquences géniques complémentaires. Elles ont donc l'intérêt d'apporter une certaine spécificité puisqu'elles font toutes appel à l'hybridation avec une partie de la séquence cible complémentaire. Cette spécificité, dans le cas d'utilisation d'amorces, est cependant la même que celle de la réaction d'amplification génique elle- même. D'autre part, toute dégradation des amorces et oligosondes, par exemple du fait de l'activité exonucléase de la Taq polymérase, augmente le bruit de fond, diminuant la sensibilité et la spécificité.
Leur sensibilité est limitée par le fait qu'une seule macromolécule peut se fixer par brin d'ADN amplifié. Cette macromolécule n'a qu'un nombre limité de sites de fixation de molécules fluorescentes, ce qui restreint la sensibilité. Le changement de polarisation de fluorescence dépend en grande partie de la qualité de l'hybridation avec la séquence cible. Il va donc être très variable en fonction non seulement de l'oligonucléotide mais aussi de la séquence cible.
Un inconvénient de l'utilisation d'amorces fluorescentes avec lecture de polarisation est qu'il faut des amorces différentes pour des séquences cibles différentes, entraînant des coûts et des difficultés de standardisation .
L'utilisation d'oligosondes fluorescentes implique une étape supplémentaire: l'hybridation. Cette étape qui a la même limitation de sensibilité que l'utilisation d'amorces, ne peut se faire qu'après la fin de l'amplification et ne permet donc pas un suivi quantitatif en simultané.
La présente invention présente la différence essentielle de ne requérir que des nucléotides isolés ou par deux ou trois au maximum, et non des oligonucléotides, macromolécules composées de séquences particulières de nucléotides. Les unités moléculaires fluorescentes nécessaires dans ce procédé peuvent être utilisées quelle que soit la séquence recherchée.
La présente invention présente également la différence essentielle de ne faire appel qu'aux changements de polarisation de fluorescence liés à la création ou la destruction de fixation covalente. La fixation covalente a pour intérêt d'apporter de plus grands changements de polarisation, plus facilement détectable, mais aussi incomparablement plus stables que la fixation non covalente. Il peut s'agir de la création d'une liaison covalente fixant un nucleotide fluorescent ou de l'hydrolyse d'une telle liaison, libérant un nucleotide fluorescent. Elle ne fait absolument pas appel à l'hybridation, phénomène de fixation non covalente avec une ou des séquences géniques particulières. Le procédé ne permet pas la révélation d'une amplification génique unique mais la révélation de toute amplification génique.
Le principe de la polarisation de fluorescence est explicité dès à présent. La lumière, du point de. vue ondulatoire, est constituée de champs magnétiques et électriques qui oscillent lorsqu'ils sont propagés dans l'espace. L'énergie E de l'onde est donnée par: E = h c/λ ≈ hn où: h = Constante de Planck n = fréquence c = vitesse de la lumière λ = longueur d'onde
Lorsqu'une telle onde rencontre, une molécule, elle est dispersée (par changements de directions) ou absorbée (transfert d'énergie). La probabilité de survenue de chacun de ces événements est une propriété de la molécule considérée.
Si l'énergie électromagnétique de la lumière est absorbée, la molécule est dite excitée ou dans un état excité. L'absorption correspond à une "collision" d'un photon avec les électrons d'un atome ou d'une molécule qui entraîne la promotion d'un électron dans une orbitale inoccupée telle que l'énergie qui la sépare de l'état fondamental représente justement l'énergie du photon. On peut avec la lumière visible ou ultraviolette exciter électroniquement une molécule. Le système excité peut se relaxer par émission de lumière, soit par fluorescence, phénomène le plus classiquement observé, soit par phosphorescence. On peut également réaliser cette excitation par réaction chimique ou biochimique, on a alors une réaction chimio ou bioluminescente. II est bien connu que l'émission de fluorescence de molécules organiques en solution correspond à une transition électronique S1-S0, où SI est le singlet à l'état excité et SO est le singlet à l'état de départ. La durée de vie d'une telle transition permise est de l'ordre de la nanoseconde (1 ns = 10- 9s). La plupart des durées de vie mesurées expérimentalement se trouvent dans la zone de là 20 ns. C'est durant ce court intervalle de temps que les causes pouvant modifier la fluorescence agissent si elles doivent être efficaces. Par conséquent, il faut disposer de processus moléculaires ayant un taux intrinsèque de 108/s ou plus pour être efficace en fluorescence. L'intensité de la lumière polarisée transmise par un polariseur dépend de l'orientation du polariseur: la transmission est maximale lorsque le plan de polarisation est parallèle à l'axe du polariseur, elle est nulle si le plan de polarisation est perpendiculaire.
Lorsque les molécules sont excitées par une lumière polarisée verticalement, la probabilité d'absorption de ces dernières dépend de leur orientation par rapport à la verticale. Pendant leur durée de vie, ces molécules excitées peuvent ou non se réorienter. Selon la nature de la substance et la cohésion du milieu, on peut avoir une émission définie par deux paramètres:
- le degré de polarisation p p = 1 11 - Il I II + 11
- l'anisotropie r r = 111 — Il
111 + 2 11
111 et II représentent les intensités de fluorescence mesurées en polarisation verticale et horizontale. La polarisation peut varier entre - 1 et + 1. Elle est égale à zéro pour la lumière naturelle qui est non polarisée; autrement, elle est partiellement polarisée.
Polarisation en solution et orientation moléculaire: pQ = (3/2. cos2θ - . l /2. (1/pO) - (1/3) = (5/3) | 2/(3 cos2 λ -1) I (l/2) + (sin2 θ/2)
On peut à partir de ces formules démontrer que la polarisation de fluorescence varie en réalité entre 1/2 et - 1/3. La première valeur (1/2) correspond à une transition pure S1-S0. Des valeurs de p proches de 0,45 ont été observées. Cependant des valeurs de polarisation négative proches de 0,33 ont été aussi observées.
Plusieurs facteurs peuvent influencer le niveau de dépolarisation. On peut citer:
- le mouvement de la molécule absorbante,
- le transfert d'énergie comme celui se produisant entre chromophores. Si la molécule émettrice fait des rotations rapides comme par exemple le mouvement brownien, à tel point qu'il y a un changement substantiel dans son orientation durant la durée de vie de l'état excité, la polarisation sera très réduite. Ceci est un phénomène important et son amplitude est très influencée par la température, la viscosité du solvant, et la taille de la molécule contenant l'émetteur.
Le second facteur, le transfert d'énergie entre chromophores identiques, résulte du fait que, quoique la résonance d'énergie de transfert ait lieu avec une forte probabilité entre molécules ayant des dipôles parallèles, il a également lieu même quand ils ne le sont pas, avec une dépolarisation qui en résulte. Parce que l'efficacité du transfert d'énergie décroît d'un facteur six avec la distance entre le donneur et l'accepteur, ce type de dépolarisation est très dépendant de la concentration. La polarisation intrinsèque po est celle qui pourrait être observée si l'absorbant était immobilisé et complètement éloigné de toute molécule (ainsi il n'y aurait aucun effet de mouvement moléculaire ou de transfert d'énergie). En pratique, il s'agit de la polarisation observée si le fluor est à concentration très basse dans un solvant de très forte viscosité. Il faut cependant noter que basse concentration peut signifier deux situations différentes: une faible concentration du complexe macromolécule-fluor ou une grande séparation entre les fluors liés à une seule macromolécule. Pour une forte viscosité et une concentration élevée, l'effet de l'énergie de transfert est détecté en premier lieu. En revanche, pour une faible viscosité et une concentration basse, c'est l'effet de mouvement moléculaire qui est détecté. Naturellement, ces effets sont utilisés pour obtenir des informations que ne pouvaient fournir les autres techniques. Les applications de la polarisation de fluorescence sont multiples. On peut citer en particulier: - la mesure de la liaison protéine-ligand. En effet, si un fluor est lié à une macromolécule et si cette dernière s'agrège ou se lie à une autre grosse molécule, la polarisation augmente due à la réduction de la mobilité de la structure.
- la mesure des constantes de dissociation et d'association des protéines. - l'étude des transitions hélice-état désordonné.
- l'étude de la structure du complexe ADN-fluor. L'acridine orange se lie fortement à l'ADN. Parce que ce complexe est un mutagène efficace, l'étude de sa structure parait donc intéressante. Lorsqu'il est lié à l'ADN, l'acridine orange devient inaccessible à certains traitements chimiques comme par exemple la diazotation, ce qui suggère qu'il se trouve quelque part enfoui à l'intérieur de la double hélice de l'ADN. Lié à l'ADN, l'acridine orange fluoresce lorsqu'il est excité non seulement par des longueurs d'onde dans sa propre bande d'absorption mais aussi par la lumière absorbée par les bases de l'ADN, ce qui indique qu'il y a transfert d'énergie à partir de ces bases. Le rendement quantique de transfert est très élevé, ce qui semble suggérer que l'acridine orange (qui est une structure plane) se trouverait alors très proche des bases de l'ADN. La fluorescence de l'acridine orange est très fortement polarisée, indiquant une forte réduction de sa mobilité. Dans les dosages immunologiques, selon la nécessité ou non de séparer les réactants avant de faire les déterrninations, on distingue deux grandes familles de techniques: les dosages homogènes et les dosages hétérogènes. Nous ne nous intéresserons qu'aux techniques homogènes qui ne requièrent pas de séparation préalable. Elles utilisent la compétition entre les molécules d'antigènes marquées par le fluorochrome et celles non marquées. On peut citer:
- le quenching de fluorescence, l'exaltation de fluorescence, la polarisation de fluorescence, le transfert d'énergie, la coupure enzymatique, l'utilisation de chélates de terres rares. Compte tenu de l'origine des échantillons (urine, plasma, sérum), il parait important de choisir des substances émissives dans des conditions où le milieu support n'est pas très perturbant. Il est également intéressant de disposer de molécules dont les maxima et les minima d'absorption et d'émission sont le plus séparé possible (élimination des émissions Raleygh, Tyndall et Raman). II est recommandé de prendre des marqueurs dont le rendement quantique est élevé pour obtenir une sensibilité maximale. Pour une molécule X de faible poids moléculaire (PM) marquée par une sonde fluorescente, le taux de polarisation de cette molécule est peu élevé. Quand X tourne sur elle-même (mouvement brownien), sa fluorescence est très dépolarisée. Si X est liée à un polymère (ADN), son mouvement est considérablement ralenti et donc le taux de polarisation de fluorescence du complexe est augmenté.
Les marqueurs fluorescents ont été utilisés dans de nombreux essais pour des molécules biologiques. Une forme particulièrement utile d'essai fluorescent est celui utilisant la polarisation de fluorescence, décrit par Dandliker et Feigen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 5, 299-304 (1961). La compétition immunologique repose sur le principe suivant: la substance à doser dans un échantillon, pouvant être un antigène ou un haptène car la présente technique ne peut s'adresser qu'à des petites molécules, entre en compétition avec une substance identique marquée appelée traceur vis-à-vis d'un nombre limité de sites anticorps spécifiques. Si par exemple, la substance à doser est un médicament, c'est le médicament non marqué qui déterrnine la quantité de traceur qui pourra se lier à l'anticorps spécifique. Dans le dosage immunologique par polarisation de fluorescence, la fluorescéine est utilisée comme marqueur. La fluorescéine, fixée sur le traceur, excitée par une lumière polarisée rectiligne, émettra une fluorescence dont le degré de polarisation sera inversement proportionnel à sa vitesse de rotation. Si le traceur est libre (non lié à l'anticorps), sa vitesse de rotation est importante. Pendant la durée de vie de la fluorescence, l'orientation des molécules de traceur est devenue tout à fait aléatoire et la polarisation de la fluorescence est voisine de zéro.
Si le traceur se lie à la molécule d'anticorps, molécule de grande taille, sa rotation est ralentie et, pendant la durée de vie de la fluorescence, les changements d'orientation resteront faibles. La polarisation sera donc élevée. Ainsi, la polarisation observée sera d'autant plus élevée que le traceur sera lié à l'anticorps (faible concentration du produit recherché). Elle sera faible lorsque le traceur sera libre en solution, indiquant une concentration élevée du produit à doser.
Il s'agit donc d'une analyse directe, s'effectuant en phase homogène, c'est à dire sans séparation de la fraction liée ou de la fraction libre, sensible seulement au rapport "traceur lié/traceur libre" et indépendante des phénomènes qui entraînent des changements dans la concentration absolue du traceur.
Depuis la mise sur le marché d'une instrumentation performante notamment avec le TDX (marque déposée) de la société ABBOTT (marque déposée), le dosage immunologique par polarisation de fluorescence connaît un important développement, en particulier dans le domaine du dosage sérique des médicaments. La technique confère aux dosages une grande sensibilité (0,2 μg/L pour la digoxine). L'automatisation totale de la technique, la stabilité des réactifs, ainsi que la fiabilité et la rapidité des réponses en font un outil parfaitement adapté aux dosages immunologiques.
L'invention présente est basée sur le concept préalablement évoqué dans les dosages immunologiques en phase homogène utilisant la polarisation de fluorescence. Il s'agit de modifier et adapter ce principe pour suivre en direct ou en point terminal, les produits issus de techniques d'amplification, dont les amplifications géniques, notamment la PCR, et éventuellement rendre ces dernières quantitatives. L'échantillon de l'amplification peut être de nature biologique ou être lui-même le produit d'une ou de plusieurs amplifications précédentes, qu'elle que soit leur nature.
Le procédé de l'invention permet l'analyse quantitative d'une ou de plusieurs séquences géniques recherchées.
La présente invention permet de vérifier simplement, rapidement, de façon spécifique et en continue la qualité de l'amplification. La présente invention, issue de techniques d'immuno analyse en phase homogène permet une recherche et une quantification directe sans manipulation et sans séparation de l'échantillon à analyser. Le principe est le suivant: la détection d'une modification des caractéristiques d'un marqueur mis en présence soit d'une réaction d'amplification, soit des produits de cette amplification génique. La caractéristique indicatrice d'amplification dans le cadre de cette invention sera préférentiellement la polarisation de fluorescence ou son degré de polarisation de fluorescence.
L'invention porte sur tout procédé d'amplification ou de réplication génique (ADN, ARN, et autre) utilisant un nucleotide marqué par un fluorochrome ou toute autre molécule pouvant être impliquée dans une analyse qualitative ou quantitative de matériel génique en phase homogène par polarisation de fluorescence.
Il doit être précisé que la polarisation de fluorescence comprend tous les procédés analysant la polarisation de lumière ou ondes lumineuses émises provenant d'un fluorophore quand il est excité par une lumière polarisée. Ceci est mis en évidence, par exemple, dans un article de M.E. Jolley (J. Analytical Toxicology, 5, 236-240 (1981).
Une substance fluorophore est ajoutée au rnilieu réactionnel d'amplification. Le degré de polarisation de sa fluorescence est observé avec un lecteur de polarisation de fluorescence et indique les changements de degré de liberté de cette substance. Ce degré de liberté sera fonction de l'avancement et/ou du résultat de la réaction d'amplification.
Dans le cas du suivi d'une amplification génique, le fluorophore pourra être associé directement ou indirectement à un nucleotide. Il peut s'agit par exemple de la fluorescence ou de la polarisation de fluorescence d'un nucleotide modifié ou non, caractéristique se modifiant selon qu'il est libre ou incorporé dans une chaîne de nucléotides. Cette amplification génique peut être de seconde ou troisième génération, c'est à dire que l'échantillon soumis à amplification peut lui-même être le résultat d'une amplification antérieure.
A cet effet, on ajoutera au milieu réactionnel d'amplification génique, une ou des molécules fluorescentes. Cette addition, selon les versions du procédé de l'invention, pourra se faire avant, pendant ou après la réaction d'amplification génique. Le suivi du degré de polarisation de la fluorescence pourra se faire en utilisant un lecteur de polarisation de fluorescence couplé ou non, associé ou non avec un thermocycleur ou un appareil de chauffage tel qu'un bain-marie.
Le degré de polarisation de fluorescence de la molécule marqueur devra varier de façon significative et sensible. S'il s'agit d'un acide nucléique couplé à de la fluorescéine, la liaison devra être une chaîne poly carbonée de longueur et de nature à lier étroitement la polarisation de fluorescence au degré de liberté de l'acide nucléique.
Dans tous les cas d'amplification, cette invention porte sur l'utilisation d'un changement de polarisation de fluorescence d'un fluorophore comme indicateur de l'état d'amplification. La molécule fluorophore ou porteuse du fluorophore devra voir sa polarisation de fluorescence évoluer selon le degré de liberté de la molécule, en particulier lors du changement d'état de cette molécule de l'état lié à l'état libre. Lorsqu'il s'agit d'une molécule liée à un fluorophore, la liaison entre la molécule et le fluorophore devra être de nature à associer étroitement la polarisation de fluorescence du fluorophore avec le degré de liberté de la molécule. Cette liaison qui peut être constituée par une chaîne poly carbonée devra donc être suffisamment rigide. Cette chaîne poly carbonée ne devra donc pas excéder plus de 6 atomes de carbone. Les liaisons covalentes doubles auront la préférence. La même règle devra être respectée pour toute molécule couplée à un fluorophore, qu'elle que soit sa nature.
La liaison entre la molécule et le fluorophore peut être covalente ou non covalente. En particulier, un couple d'affinité peut être utilisé pour associer directement ou indirectement le fluorophore à la molécule sensible à l'amplification, un des membres du couple d'affinité portant le fluorophore. Il peut s'agir de la paire d'affinité biotine - avidine ou du couple biotine-streptavidine. Dans une première version, la molécule fluorescente ajoutée au milieu réactionnel interviendra directement dans la réaction d'amplification génique. Cette molécule pourra, par exemple, être un acide nucléique modifié par ajout d'un fluorochrome ou fluorophore au bout d'une chaîne poly carbonée. Cet acide nucléique étant à l'état libre, sa fluorescence aura un degré de polarisation faible. Lorsqu'il sera intégré dans le produit d'amplification qui est un polymère d'acides nucléiques, sa liberté de mouvement sera fortement réduite. Sa fluorescence aura alors un degré de polarisation élevé, et ce d'autant plus que ce polymère sera hybride avec sa séquence matrice.
Dans une seconde version, la molécule fluorescente ajoutée au milieu réactionnel interviendra indirectement dans la réaction d'amplification génique. Cette molécule pourra, par exemple, être elle-même un polymère d'acides nucléiques dont certains seront fluorescents, ce polymère-sonde constituant une séquence complémentaire d'une partie de la séquence nucléique amplifiée. L'effet Taqman (marque déposée) de la Taq polymérase, lié à son activité d'exonucléase, conduira à l'hydrolyse de la sonde au cours de la synthèse du brin complémentaire. Le degré de polarisation de la fluorescence des nucléotides marqueurs changera lorsque ces derniers seront libérés.
Dans une troisième version, un polymère-sonde d'acides nucléiques comportant des marqueurs fluorescents, complémentaire et spécifique d'une région de la séquence recherchée sera ajoutée au milieu d'amplification en point terminal. Après hybridation, ce polymère pourra être hydrolyse par un agent catalytique spécifique des doubles brins d'acides nucléiques qui peut être une enzyme désoxyribonucléase spécifique des ADN double brin ou un agent chimique. Le degré de polarisation des fluorophores liés à des acides nucléiques liés au polymère-sonde diminuera lors de la libération de ces molécules marqueurs.
Dans une autre version, la molécule fluorescente ajoutée au milieu réactionnel n'interviendra pas directement ni indirectement dans la réaction d'amplification génique, mais verra son degré de liberté en solution se modifier en présence soit du produit de l'amplification, soit de ses sous-produits.
Dans le cas d'amplification génique, la ou les molécules portant ou comprenant un fluorophore peuvent être des acides nucléiques de toutes natures, des analogues d'acides nucléiques, des dimères et polymères d'acides nucléiques ou d'analogues d'acides nucléiques. De tels analogues incluent lTiypoxanthine, la 2,6-diaminopurine et la 8- azaguanine. II peut également s'agir de molécules nativement fluorescentes tels que des analogues d'acides nucléiques naturellement fluorescents.. Il peut également s'agir de molécules de nature protéique ou autre, caractérisées par un changement de liberté au cours d'une amplification ou en présence du résultat d'une amplification. La modification rendant fluorescente la molécule marqueur peut être le couplage d'un marqueur fluorescent ou une modification de la structure intrinsèque de la molécule, par exemple d'un acide nucléique. La molécule fluorescence pourra être associée temporairement ou non à une ou plusieurs macromolécules. Plusieurs molécules fluorescentes de nature identique ou différente peuvent être associées dans une même réaction d'amplification. Le fluorophore peut être de la fluorescéine ou de la rhodamine, d'usages plus courants, mais aussi n'importe quel fluorophore. Plusieurs amplifications simultanées peuvent être analysées avec un seul et même fluorophore ou avec plusieurs fluorophores différents.
Les molécules équivalentes non fluorescentes peuvent être également présentes dans le milieu réactionnel d'amplification.
Dans le cas d'une amplification génique, les molécules fluorescentes peuvent être des amorces, soumises à l'action d'une enzyme ou d'un agent chimique ou biochimique non impliqué dans la réaction d'amplification, et qui, par exemple occasionnent l'hydrolyse d'une ou des amorces en présence de produits ou sous-produits d'amplification. L'invention est également applicable à des amplifications de nature autre que génique, par exemple protéique, qui impliquent une réaction de polymérisation .
Un avantage particulier du procédé décrit dans la présente invention est qu'il s'effectue en phase homogène, donc dans une seule phase, par exemple en solution, et sans séparation de phase. Cela signifie que, en général, seule une modification de la composition du milieu initial de réaction d'amplification génique est nécessaire, avec donc une économie de temps et de travail. Il peut s'agir de la modification de la composition en acides nucléiques, une partie de ceux-ci étant remplacés par leur analogue modifié et rendu fluorescent ou de l'ajout d'un polymère d'acides nucléiques dont certains sont fluorescents, et qui constitue une séquence complémentaire d'une partie de la séquence nucléique amplifiée. L'invention peut s'étendre à d'autres systèmes en phase homogène, basés sur le même principe et utilisés en immuno-analyse comme par exemple les analyses radio-immunologiques utilisant des isotopes radioactifs. Voici deux modes d'application de l'invention auxquels cette dernière ne se limite en aucune façon. Exemple 1:
On ajoute un dNTP couplé à la fluorescéine sous forme de traceur, par exemple le fluoro-12-dUTP, dans le milieu réactionnel où se déroule l'amplification ou la réplication, par exemple une PCR. Dans ce système, la fluorescéine est utilisée comme marqueur. La fluorescéine, fixée sur le traceur, excitée par une lumière polarisée rectiligne, émettra une fluorescence dont le degré de polarisation sera inversement proportionnel à sa vitesse de rotation.
Si le traceur est libre, c'est à dire non intégré dans les chaînes d'acides nucléiques ADN, ARN ou hybride, sa vitesse de rotation est importante. Pendant la durée de vie de la fluorescence, l'orientation des molécules de traceur est tout à fait aléatoire et la polarisation de la fluorescence est voisine de zéro. Si le traceur est intégré dans une chaîne d'acide nucléique tel que de l'ADN ou de l'ARN, donc une molécule de grande taille, sa rotation est ralentie, et, pendant la durée de vie de la fluorescence, les changements de rotation resteront faibles. La polarisation sera donc élevée. Ainsi, la polarisation observée sera d'autant plus élevée que le traceur sera intégré à la chaîne d'acide nucléique, indiquant une bonne amplification ou réplication. A ce niveau on s'aperçoit que ce procédé est rapide, automatisable, quantitatif, sensible, on peut cycle par cycle apprécier la quantité d'amplification, il se déroule en phase homogène sans préparation du matériel à analyser. A l'inverse la polarisation sera faible lorsque le traceur sera libre en solution indiquant une absence d'amplification ou une faible quantité de produit à amplifier ou à répliquer, une mauvaise spécificité des amorces ou un problème technique lié aux techniques d'amplification ou de réplication. II s'agit donc d'un procédé direct, s'effectuant en phase homogène, sensible seulement au rapport "traceur lié/traceur libre" et indépendant des phénomènes qui entraînent des changements dans la concentration absolue du traceur. Exemple 2: Les amplifications PCR ont été effectuées par un thermocycleur GeneAmp PCR System 2400 (Perkin-Elmer). La matrice ADN, vecteur pQE30, et les amorces, Type III/IV et reverse sequencing, sont commercialisées par Qiagen. L'ADN plasmidique a été linéarisé avec Xhol, et purifié. La taille du fragment d'amplification est de 172 bp. Le programme PCR fluorescent de départ était basé sur les recommandations de Molecular Probes, afin de favoriser l'incorporation d'oligonucléotides fluorescents. Il présente notamment une phase d'élongation à 72°C particulièrement longue (4 minutes). Dénaturation initiale: 94°C - 5 minutes, suivie de 30 cycles: dénaturation 94°C - 30 secondes, hybridation 55°C - 30 secondes, élongation 72°C - 4 minutes, élongation terminale 72°C - 10 minutes. 30 cycles ont été effectués. Composition du milieu réactionnel: les amplifications PCR ont été effectuées avec la Taq polymérase Gibco Life-technology utilisée en routine. Seules les concentrations finales de dNTPs et les ratios dUTP/dNTPS ont été sujets à variations: 20mM Tris-HCl (pH 8.4), 50mM KC1, 1.5mM MgC , 0.5 unité de Taq polymérase, 80ng de chacune des amorces, 4ng d'ADN cible dans 40 μl.
Les PCR ont été réalisés avec une concentration en dATP, dCTP, dGTP, dTTP, fixé à 2 μM.
Le nucleotide fluorescent était le ChromaTide ™ Alexa Fluor 488-5-dUTP de Molecular Probes présentant un spectre proche de celui de fluorescéine.
Les mesures d'anisotropie ont été réalisées sur 10 μl de mélange réactionnel de PCR dilués dans 175 μl de tampon Tris HC1 lOmM pH 7.5,
EDTA 1 mM, Glycérol 10%, DTT ImM. Les mesures d'anisotropie de fluorescence ont été effectuées directement sur le produit de PCR, dilué dans le tampon de mesure afin d'obtenir un volume (160 μL) et une intensité (50 en Range3) compatible à l'appareil de mesure Beacon 2000.
Dans une première expérience, différentes concentrations en dUTP-Alexa 488 ont été testées : 200 nM, 20 nM, 2nM.
Les résultats sont regroupés dans le tableau I et le graphe A.
On note un écart significatif entre l'anisotropie de la solution avant PCR et la solution en sortie de PCR seulement lorsque la concentration initiale en dUTP fluorescents est de 2nM, concentration correspondant à 1/ 1000 de la concentration en dTTP.
Le témoin sans PCR donne une anisotropie de 34,3 mA, alors que l'on mesure une anisotropie de 57,6 mA pour une PCR en présence de 2nM de dUTP- Alexa 488, soit une différence de 68%.
Afin de vérifier la reproductibilité de ce résultat et tester d'autres concentrations en dUTP fluorescents, de nouvelles PCR ont été réalisées avec des concentrations en dUTP-alexa 488 de 0,4 nM ; 2 nM ; 8 nm.
Les résultats sont regroupés dans le tableau II et le graphe B. En abaissant fortement la concentration du mélange PCR en dUTP fluorescent, nous avons pu noter une augmentation significative d'anisotropie par mesures directes sur le produit PCR. Le témoin sans PCR donne une anisotropie de 34,4 mA, alors que l'on mesure une anisotropie de 61,3 mA pour une PCR en présence de 2nM de dUTP-Alexa 488, soit une différence de 78%.
La migration sur gel d'agarose du produit PCR à permis de montrer l'absence (ou du moins l'indétectabilité sous éclairage ultraviolet) de dUTP fluorescents libres. Ces résultats montrent donc que même à faible concentration en dUTP fluorescents (0,4 nM) et faible ratio dUTP/dTTP (1/ 1000) le dUTP-alexa 488 s'incorpore bien à l'ADN amplifié tout en restant détectable pour des mesures d'anisotropie de fluorescence. Ces résultats mettent également en évidence le fait que le nucleotide fluorescent doive être présent en faible concentration, très inférieure à celle du nucleotide homologue non fluorescent. Il doit également présenter une affinité pour la Taq polymérase utilisée sans doute supérieure à celle de son homologue non fluorescent. Exemple 3: Dans une autre version de l'invention, on ajoute dans le mélange réactionnel, une oligosonde spécifique de la séquence nucléique amplifiée et comprenant des nucléotides couplés à la fluorescéine. L'effet Taqman (marque déposée) de la Taq polymérase, lié à son activité d'exonucléase, consiste dans l'hydrolyse de la sonde au cours de la synthèse du brin complémentaire. La polarisation de la fluorescéine des nucléotides marqués changera lorsque ces derniers seront libérés. Il peut également s'agir d'une ou plusieurs amorces de polymérisation comprenant des molécules fluorescentes et caractérisées par le fait que le changement de degré de polarisation de fluorescence est occasionné par l'action d'une enzyme ou d'un agent chimique ou biochimique non impliqué dans la réaction de polymérisation, par exemple occasionnant l'hydrolyse d'une ou des amorces après polymérisation. Les applications majeures de ce procédé peuvent être, par exemple, le suivi de réactions ou la détection spécifique de produits d'amplification génique pour la recherche d'agents infectieux (HIV, etc.), de modifications chromosomiques, de mutations géniques, tels que des cancers ou des défauts congénitaux.
En particulier, elle est applicable à la détection de micro-organismes infectieux ou indicateurs d'infection ou de pollution, et à la détection de mutations géniques, de délétions et/ou réarrangements de gènes, responsables de prédispositions, maladies héréditaires, ainsi que de pouvoir pathogène et résistances dans le cas d'agents pathogènes.
Le procédé de l'invention permet de développer des trousses d'analyses incluant le suivi ou la mise en évidence du résultat de ramplification par polarisation de fluorescence. Il permet secondairement de développer des trousses complémentaires à des trousses d'amplification, et dont le seul objectif est de permettre le suivi ou la détection du résultat de réactions d'amplification.
Une application du procédé de la présente invention est la mise en évidence ou mesure d'acides nucléiques eux-mêmes générés comme partie d'un système de révélation de test, par exemple la séquence ARN qui est générée par la Q-β réplicase, ainsi que décrit dans Nucleic Acids Research, 14, 5591-5603, (1986) ou Biotechnology, 6, 1197-1202, (October 1988).
Une application particulièrement avantageuse de cette invention est la mise en évidence et mesure de séquences d'ADN générées par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). D'autres applications avantageuses de la présente invention sont en relation avec les systèmes d'amplification/détection d'acides nucléiques basés sur la transcription de Siska Diagnostics Inc. (marque déposée), décrits dans le brevet PCT WO 88/ 10315, ainsi que le système d'amplification utilisant la ligase de Biotechnica International (EP-320308).
L'échantillon est généralement d'origine biologique, par exemple prélevé sur un homme, un animal ou une plante. Cet échantillon est soumis à une amplification génique spécifique d'une séquence indicatrice par exemple de pathologie. L'invention présente permet de savoir au cours même de l'amplification si celle-ci donne un résultat positif. Les procédés actuellement employés pour connaître le résultat d'une amplification nécessitent plusieurs heures de travail.
Il suffit donc d'employer une des versions proposées du procédé de cette invention pour connaître immédiatement le résultat d'une amplification génique, ce qui est une simplification importante de la révélation de ce type d'analyses.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour l'analyse en phase homogène de réactions de polymérisation, notamment d'amplification génique, et permettant le suivi desdites réactions, caractérisée par l'utilisation de la lecture de la polarisation de fluorescence comme indicateur de la création ou de la rupture de liaison covalente entre une molécule fluorescente et une autre molécule ou une macromolécule.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisée d'une part par le fait de s'appliquer aux réactions de polymérisation se faisant par établissement de liaisons covalentes, et caractérisée d'autre part par le fait d'ajouter au milieu réactionnel, avant, pendant ou après la polymérisation, une ou plusieurs molécules fluorescentes, de poids moléculaire inférieur à 4000, dont le degré de liberté en solution se modifie au cours de la réaction de polymérisation lors de la création ou la rupture de liaison covalente entre ces unités moléculaires fluorescentes et d'autres molécules ou des macromolécules, et par le fait d'utiliser la lecture de polarisation de fluorescence dans le but de détecter par sa modification un changement de liberté de la molécule dans l'échantillon.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que les molécules comprenant dans leur structure ou liée à celle-ci, une substance ou composant chimique fluorescent, peuvent être des unités nucléotidiques, des nucléosides, des nucléotides tels que l'adénosine, la cytidine, la guanosine, la thymidine et l'uridine, des analogues de nucléotides, de tels analogues incluant l'hypoxanthine, la 2,6- diaminopurine et la 8-azaguanine, des molécules nativement fluorescentes, des dimères de nucléotides ou d'analogues de nucléotides ou nucléosides, des acides aminés, des sucres, des lipides, à l'exception des oligonucléotides et polynucléotides, et dont la partie fluorescente est libérée ou liée de façon covalente lors de la polymérisation. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'une ou plusieurs macromolécules sont associées de façon non covalente à l'unité moléculaire fluorescente avant sa fixation covalente.
5) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une substance (1), affine et spécifique, est incorporée dans le milieu réactionnel et mis en contact avec une molécule (2), à l'exception des macromolécules, la molécule (2) étant fluorescente et associée avec la partie affine complémentaire de la substance (1).
6) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la molécule fluorescente incorporée dans le milieu de polymérisation est en présence de son équivalente non fluorescente, la concentration de la molécule fluorescente étant inférieure à celle de son équivalente non fluorescente.
7) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration totale de la molécule fluorescente et de son homologue non fluorescente est égale ou voisine de la concentration minimale permettant la réalisation de la réaction de polymérisation.
8) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les unités moléculaires fluorescentes peuvent être ajoutées dans le milieu réactionnel liées de façon covalente à une ou plusieurs autres unités moléculaires, et caractérisé par le fait que la polymérisation libère la ou les unités moléculaires fluorescentes ou leur partie fluorescente en rompant leur liaison covalente avec toute autre molécule.
9) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé par le fait d'analyser ou détecter la polarisation de fluorescence de plusieurs molécules de faible poids moléculaire, fluorescentes et différentes.
10) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on effectue une analyse quantitative d'une ou de plusieurs séquences nucléiques recherchées, plusieurs réactions de polymérisation étant effectuées simultanément et analysées soit avec un même fluorophore tel que la fluorescéine ou la rhodamine, soit avec plusieurs fluorophores différents. l l)Trousse d'analyse d'échantillons biologiques ou autres caractérisée en ce qu'elle utilise un procédé selon l'une des revendications précédentes, et contenant un ou plusieurs éléments fluorescents selon l'une des revendications précédentes, dont la polarisation de fluorescence se modifie du fait d'une polymérisation ayant lieu lors de l'analyse, notamment dans le cas d'amplification génique.
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