DE10308814A1

DE10308814A1 - Bioanalytisches Verfahren auf Grundlage der Messung der Abklingzeit der Phosphoreszenz

Info

Publication number: DE10308814A1
Application number: DE2003108814
Authority: DE
Inventors: Otto S. Wolfbeis; Axel Dürkop
Original assignee: Chromeon GmbH
Current assignee: Chromeon GmbH
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-09-09
Also published as: EP1639348A1; WO2004077034A1

Abstract

Die Wechselwirkung zwischen einem Liganden und einem Rezeptor kann über eine Änderung der Abklingzeit der Lumineszenz eines Markers nachgewiesen werden. Dabei wirkt sich nachteilig aus, dass die Eigenlumineszenz des biologischen Untersuchungsmaterials bzw. der eingesetzten Komponenten, insbesondere der Mikrotiterplatten, einen nicht unwesentlichen Untergrundbeitrag zur Lumineszenz liefert. Um dieses Problem zu lösen, wird zum einen vorgeschlagen, dass man Markerfarbstoffe verwendet, die eine Abklingzeit Ð von > 50 ns besitzen, und zum anderen, dass die Messung zeitaufgelöst vorgenommen wird. Diese besteht darin, dass die zu untersuchende Probe einem kurzen Puls von Licht ausgesetzt wird, und dass die Abklingzeit Ð erst nach Ablauf einer kurzen Verzögerungszeit (t¶1¶) bestimmt wird, während der die sehr kurzlebige (< 10 ns) Hintergrundlumineszenz abklingt, sodass nach der Verzögerungszeit die Lumineszenz des Markers sehr selektiv gemessen werden kann. Die Änderung der Abklingzeit erlaubt vor allem den qualitativen Nachweis des Eintretens einer Wechselwirkung zwischen einem beliebigen Rezeptor und einem beliebigen Liganden (z. B. zwischen Antigen und Antikörper, zwischen zwei Strängen eines Polynukleotides, zwischen natürlichen Rezeptoren und synthetischen Liganden und dergleichen). Sie kann aber auch zur quantitativen Bestimmung eines der beiden wechselwirkenden Partner herangezogen werden.

Description

Fluoreszenz und Phosphoreszenz (allgemein: Lumineszenzmethoden) werden in der Bioanalytik eingesetzt, um Wechselwirkungen zwischen zwei Reaktionspartnern nachzuweisen.
Wechselwirkungen treten beispielsweise auf, wenn

(a) ein Antigen mit einem Antikörper reagiert, was zu Zwecken der Immunanalytik und -diagnostik eingesetzt werden kann;
(b) ein Oligonucleotid mit seinem Gegenstrang eine Doppelhelix bildet, was zu Zwecken der Genanalytik und -diagnose eingesetzt werden kann;
(c) ein Rezeptor einen Liganden bindet, was pharmakologischen Studien über Wirkungsorte und Bindungsaffinitäten erlaubt, und
(d) im Drug-Screening, wenn ein so genanntes Prodrug an einen Rezeptor oder ein Enzym bindet, was zu Zwecken der schnellen Identifikation von potentiellen Medikamenten, unter anderem im high-throughput screening, eingesetzt werden kann.

Diese und andere Wechselwirkungen werden auch oft unter dem Begriff (bio)molekulare Affinität subsummiert.
Die erwähnten Lumineszenzmethoden werden deshalb gerne verwendet, weil sie

– eine hohe Empfindlichkeit besitzen (die der von radioanalytischen Verfahren nahe kommt),
– von den Nachteilen des Umganges mit radioanalytischen Materialien frei sind, und
– instrumentell vergleichsweise einfach durchzuführen sind.

In praktisch allen Fällen geht man dabei so vor, dass man den einen der beiden Reaktionspartner der molekularen Wechselwirkung mit einem fluoreszenten Marker ("Label") markiert, dessen Fluoreszenz-Intensität, -abklingzeit oder -polarisation sich als Folge der molekularen Wechselwirkung messbar ändert. In einem anderen Verfahren werden sogar beide Reaktionspartner markiert, und es kommt zum so genannten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), dessen Messung einige Vorteile aufweist, deren Durchführung aber mit einem erheblichen Mehraufwand hinsichtlich der Markierung verbunden ist.
Die Messung Fluoreszenz-Intensität, -abklingzeit oder -polarisation leidet allerdings unter dem gravierenden Nachteil, dass praktisch jegliche Untergrundfluoreszenz ebenfalls miterfasst wird. Zahlreiche Biomoleküle besitzen nämlich eine Eigenfluoreszenz, die von der des Markers oft schwer zu differenzieren ist. Auch die (häufig verwendeten) Mikrotiterplatten aus Plastik fluoreszieren stark. Beide Fluoreszenzen bilden ein Untergrundsignal unbekannter Größe. Dies hat zur Folge, dass die gemessene Änderung der Fluoreszenz-Intensität, -abklingzeit oder -polarisation nicht nur die Anwesenheit (oder Konzentration) eines Antikörpers, eines DNA-Gegenstrangs, eines Liganden oder eines Prodrugs widerspiegelt, sondern durch einen unbekannten Fluoreszenzuntergrund verfälscht wird.
Im hier beschriebenen Verfahren wird dieses Problem dadurch gelöst, dass man ein zeitauflösendes Messverfahren einsetzt. Die Fluoreszenz vieler Marker klingt – ebenso wie die des Untergrundes – im Nanosekundenbereich ab (typischerweise 1–100 ns). Als Abklingzeit bezeichnet man jene Zeit, nach der die Lumineszenzintensität eines Luminophores (F_t) auf den Bruchteil 1/e der anfänglichen Fluoreszenzintensität (F₀) gefallen ist; es gilt im einfachsten Fall die Beziehung F_t = F₀·e^t/τ. Gängige Verfahren (z.B. die Pulsfluorometrie oder die Phasenfluorometrie) können aber nicht zwischen Untergrundfluoreszenz und analytischem Signal unterscheiden. Erfindungsgemäß wird dies dadurch gelöst, dass man einen Marker verwendet, dessen Abklingzeit viel länger ist als die des Untergrundes, mindestens aber 50 ns, das man bei der Messung eine Verzögerungszeit vorsieht, die bis zu 200% der natürlichen Abklingzeit τ betragen kann, und dass man an Stelle der Messung der Intensität, Abklingzeit oder Polarisation die Änderung der Abklingzeit des Markers als Folge der Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung als analytische Information heranzieht.
Der konkrete und erfindungsgemäße Vorgang besteht darin, dass man

(1) einen der beiden Bindungspartner mit einem Marker markiert, der eine Lumineszenzabklingzeit zwischen 50 ns und 10 s besitzt,
(2) den Bindungspartner eine molekulare Wechselwirkung mit seinem Gegenstück eingehen lässt,
(3) das Produkt dieser molekularen Wechselwirkung mit einem Puls von Licht (300–1000 nm) bestrahlt,
(4) danach eine Verzögerungsphase von bis zu 50% der Abklingzeit des Luminophores vorsieht,
(5) danach die Abklingcharakteristik des Luminophores ermittelt, und
(6) aus der so ermittelten Änderung der Abklingcharakteristik das Eintreten einer Wechselwirkung nachweist, bzw. an Hand vorab ermittelter quantitativer Beziehungen zwischen Änderung der Abklingzeit und der Konzentration eines der Reaktionspartners auf dessen Anwesenheit schließt bzw. Konzentration berechnet.

1 veranschaulicht diesen Vorgang. Das biologische System wird nach der Wechselwirkung zur Lumineszenz angeregt. Nach Abschalten des Anregungslichtes wird bis zur Zeit t₁ gewartet, wonach der Untergrund (grau dargestellt) abgeklungen ist. Danach wird der Photodetektor geöffnet und die Abklingzeit nach einer beliebigen Methode gemessen, z. B. nach der in der Abb. angeführten rapidlifetime-detection-Methode durch Ermittlung der Flächen A₁ und A₂, die über die angegebene Gleichung in definierter Beziehung zur Abklingzeit r stehen. Diese Abklingzeit ist eine direktes Maß dafür, ob eine biomolekulare Wechselwirkung eingetreten ist oder nicht. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die Abklingkurve nach der eingetretenen Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor nicht eingetragen.
Im Folgenden wird ein typisches experimentelles Ergebnis. Humanserumalbumin (HSA) wurde in an sich bekannter Weise mit dem Fluoreszenzmarker Ruthenium-tris-bipyridyl (RuDCC) markiert (siehe den Artikel: Polarization Immunoassays Using Reactive Ruthenium Metal-Ligand Complexes as Luminescent Labels, A. Dürkop, F. Lehmann, O. S. Wolfbeis, Anal. Bioanal. Chem. 372 (2002) 688–694). Die Abklingzeit des HSA wurde als Funktion der zugegebenen Menge an Antikörper (anti-HSA) ermittelt. Es stellt sich heraus, dass die Abklingzeit aus zwei Komponenten besteht. Die eine (ca. 100 ns) ist analytisch nützlich, die andere (ca. 17 ns) bleibt konstant und ist somit ohne Aussagekraft. Die folgende Tabelle gibt die Messwerte wieder: Tabelle 1. Änderungen der Abklingzeit bei der Wechselwirkung eines mit SSDC-Rutheniummarkiertem HSA mit unmarkiertem Anti-HSA (bei 20°C).
Die Daten sind in 2 graphisch dargestellt. Man erkennt daraus, dass

(a) die eingetretene Wechselwirkung zwischen Antigen (HSA) und dem Antikörper sich in einer Änderung der Abklingzeit äußert und somit über deren Messung nachweisbar ist;
(b) die gemessene Abklingzeit mit der Konzentration an Antikörper korreliert;
(c) die Änderung der Abklingzeit ca. 130 ns beträgt, was messtechnisch viel leichter erfassbar ist als es z.B. Änderungen sind, die im Sub-Nanosekundenbereich liegen.

Claims

Verfahren zum Nachweis einer biomolekularen Wechselwirkung zwischen natürlichen oder synthetischen Molekülen, zwischen Rezeptoren und Liganden, oder Rezeptoren und potentiellen Medikamenten bzw. deren Vorstufen, dadurch gekennzeichnet, dass a. zumindest eine der beiden betroffenen Wechselwirkungspartner bzw. Bindungspartner mit einem phosphoreszenten Marker markiert wird, der eine Lumineszenzabklingzeit zwischen 50 ns und 1 s besitzt, b. der so markierte Bindungspartner mit seinem potentiellen Wechselwirkungspartner in molekularen Kontakt gebracht wird, c. das System kurz mit Licht der Wellenlänge zwischen 300 und 1000 nm bestrahlt wird, d. nach dem Abschalten des Lichtpulses eine Verzögerungsphase von bis zu 200% der natürlichen Abklingzeit des Luminophores vorgesehen wird, während der eine störende Untergrundfluoreszenz abklingen kann; e. die Abklingzeit des Luminophores nach einer bekannten Methoden ermittelt wird, und f. über eine eingetretene Änderung der Abklingzeit eine molekulare Wechselwirkung der Bindungspartner nachgewiesen wird bzw. an Hand vorab erstellter quantitativer Beziehungen zwischen der Änderung der Abklingzeit und der Konzentration eines Reaktionspartners dessen Konzentration quantitativ ermittelt wird.
Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass der Marker kovalent an einen Bindungspartner gebunden vorliegt.
Verfahren nach (1) und (2), dadurch gekennzeichnet, dass der phosphoreszente Marker ein Metall-Ligandenkomplex ist.
Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass einer der Bindungspartner ein Protein, ein Antikörper, ein Antigen, oder ein proteinartiger Rezeptor ist.
Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Bindungspartner ein natürliches oder synthetisches Nucleinsäureoligomer ist.
Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Bindungspartner ein natürlicher oder synthetischer Ligand oder ein Prodrug ist.
Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass einer der Bindungspartner mit einen phosphoreszierenden Marker nicht-kovalent markiert vorliegt.
Verfahren nach (7), dadurch gekennzeichnet, dass der phosphoreszierende Marker ein so genannter General Protein Stain ist.
Verfahren nach (7), dadurch gekennzeichnet, dass der phosphoreszente Marker eine so genannter DNA- oder RNA-Interkalator ist.
Verfahren nach (1), dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Wechselwirkung mit Hilfe der erfindunggemäßen Methode unter Verwendung von Mikrotiterplatten erfolgt.