JP3391459B2 - 結合アッセイ - Google Patents
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は結合アッセイ、たとえば液体試料における
被分析物の濃度を測定することに関する。
被分析物の濃度を測定することに関する。
発明の背景
液体試料中の被分析物、たとえば薬物やホルモンの濃
度を、該液体と被分析物に対し特異的な結合部位を有す
る結合試薬とを接触させ、該試薬に結合している被分析
物を有する結合試薬を分離し、被分析物が占有している
結合試薬の結合部位の割合を表す数値（「小部分占有
（fractional occupancy）」という）を測定することに
よって測定することは既知である。一般的には、次に液
体試料中の被分析物の濃度を、該小部分占有と既知の濃
度の被分析物を含有している一連の標準溶液から得られ
た数値とを比較することによって決定することができ
る。
度を、該液体と被分析物に対し特異的な結合部位を有す
る結合試薬とを接触させ、該試薬に結合している被分析
物を有する結合試薬を分離し、被分析物が占有している
結合試薬の結合部位の割合を表す数値（「小部分占有
（fractional occupancy）」という）を測定することに
よって測定することは既知である。一般的には、次に液
体試料中の被分析物の濃度を、該小部分占有と既知の濃
度の被分析物を含有している一連の標準溶液から得られ
た数値とを比較することによって決定することができ
る。
従来は小部分占有の測定は通常、いわゆる競合的方法
または非競合的方法のいずれかを用いて、標識現像試薬
を（developing reagent）用いた逆滴定によって行なわ
れた。
または非競合的方法のいずれかを用いて、標識現像試薬
を（developing reagent）用いた逆滴定によって行なわ
れた。
競合的方法においては被分析物が結合した結合試薬
は、一般的には被分析物の標識化変形体である標識現像
試薬を用いて同時または連続的のいずれかで、逆滴定さ
れる。現像試薬は、濃度を測定される被分析物と、結合
試薬の結合部位を獲得するために競合するということが
できる。標識された被分析物により占有された小部分の
結合部位は、次いで上記のように液体試料中の被分析物
の濃度に関連づけることができる。
は、一般的には被分析物の標識化変形体である標識現像
試薬を用いて同時または連続的のいずれかで、逆滴定さ
れる。現像試薬は、濃度を測定される被分析物と、結合
試薬の結合部位を獲得するために競合するということが
できる。標識された被分析物により占有された小部分の
結合部位は、次いで上記のように液体試料中の被分析物
の濃度に関連づけることができる。
非競合的方法においては、被分析物が結合した結合試
薬を、結合された被分析物または結合試薬上の占有され
た結合部位のいずれかと結合できる標識現像試薬を用い
て逆滴定する。結合部位の小部分占有を、次いで、標識
現像試薬の存在を検出することによって測定し、競合ア
ッセイと同様に、上記のように液体試料中で被分析物の
濃度と関連づけることができる。
薬を、結合された被分析物または結合試薬上の占有され
た結合部位のいずれかと結合できる標識現像試薬を用い
て逆滴定する。結合部位の小部分占有を、次いで、標識
現像試薬の存在を検出することによって測定し、競合ア
ッセイと同様に、上記のように液体試料中で被分析物の
濃度と関連づけることができる。
競合的方法および非競合的方法の両者において、現像
試薬を検出できるように標識を用いて現像試薬を標識化
する。いろいろな標識、たとえば、放射性同位体、酵
素、化学発光標識および蛍光標識が過去に用いられた。
試薬を検出できるように標識を用いて現像試薬を標識化
する。いろいろな標識、たとえば、放射性同位体、酵
素、化学発光標識および蛍光標識が過去に用いられた。
免疫アッセイの分野においては、競合免疫アッセイを
一般にBersonおよびYalowによって、たとえば「調査お
よび診断の内分泌学における方法（Methods in Investi
gative and Diagnostic Endocrinology）」の第111〜11
6ページに発表された設計則にしたがって実行する。競
合免疫アッセイを行う際には、結合試薬を検出されるべ
き被分析物の約30から50％という低濃度と結合する量で
用いる場合に、最高の感度が達成される。非競合免疫ア
ッセイにおいては、最高の感度は、通常、液体試料中の
被分析物の100％近くまで結合するのに十分な結合試薬
を用いることによって達成されると考えられている。し
かしながら、両方の場合において、これらの広く受け入
れられた教示にそって設計された免疫アッセイにおいて
は、試料の容積を知る必要および用いられる結合試薬の
量を正確に知るか、結合試薬の量が一定であることを知
る必要がある。
一般にBersonおよびYalowによって、たとえば「調査お
よび診断の内分泌学における方法（Methods in Investi
gative and Diagnostic Endocrinology）」の第111〜11
6ページに発表された設計則にしたがって実行する。競
合免疫アッセイを行う際には、結合試薬を検出されるべ
き被分析物の約30から50％という低濃度と結合する量で
用いる場合に、最高の感度が達成される。非競合免疫ア
ッセイにおいては、最高の感度は、通常、液体試料中の
被分析物の100％近くまで結合するのに十分な結合試薬
を用いることによって達成されると考えられている。し
かしながら、両方の場合において、これらの広く受け入
れられた教示にそって設計された免疫アッセイにおいて
は、試料の容積を知る必要および用いられる結合試薬の
量を正確に知るか、結合試薬の量が一定であることを知
る必要がある。
国際特許出願第WO84/01031号において、私は液体試料
中の被分析物の濃度を、被分析物に特異的な結合部位を
有する少量の結合試薬と液体試料とを接触させることに
よって測定できることを開示した。この方法において
は、結合試薬の量が、液体試料中の被分析物の濃度に対
し、ほんの少ししか影響しないほど少量であるなら、被
分析物による結合試薬の結合部位の小部分占有は試料の
容積と実際上無関係であることが分った。
中の被分析物の濃度を、被分析物に特異的な結合部位を
有する少量の結合試薬と液体試料とを接触させることに
よって測定できることを開示した。この方法において
は、結合試薬の量が、液体試料中の被分析物の濃度に対
し、ほんの少ししか影響しないほど少量であるなら、被
分析物による結合試薬の結合部位の小部分占有は試料の
容積と実際上無関係であることが分った。
このアプローチは、WO84/01031号のアッセイの感受性
および容易さの開発を固体支持体の小さな区域（または
「ミクロスポット」）上に位置する0.1V/Kモル（Ｖは試
料の容積で、Ｋは被分析物についての結合試薬の平衡常
数である）よりも少ない量の結合試薬を用いることによ
って改良されることを開示するEP304,202号をさらに改
良する。
および容易さの開発を固体支持体の小さな区域（または
「ミクロスポット」）上に位置する0.1V/Kモル（Ｖは試
料の容積で、Ｋは被分析物についての結合試薬の平衡常
数である）よりも少ない量の結合試薬を用いることによ
って改良されることを開示するEP304,202号をさらに改
良する。
WO93/08472において、私は、小量の結合試薬をミクロ
スポットの形で高密度で支持体上に固定化することによ
って、結合アッセイの感度をさらに改良する方法を開示
した。このアッセイにおいては、標識、たとえば蛍光染
料を含有するミクロスフェア（microsphere）を含む現
像試薬を、結合試薬と被分析物を含有する液体試料とを
接触させた後に、結合試薬を逆滴定するのに用いる。ミ
クロスフェア（microsphere）は大量の蛍光染料を含む
ことができるので、小量の被分析物からのシグナルを増
幅でき、アッセイの感度は改良される。この増幅は高感
度アッセイを1mm2またはそれよりも小さい面積および10
00から100000分子／μm2の範囲の結合試薬の表面密度を
有するミクロスポットを用いてですら、実行することを
可能とする。
スポットの形で高密度で支持体上に固定化することによ
って、結合アッセイの感度をさらに改良する方法を開示
した。このアッセイにおいては、標識、たとえば蛍光染
料を含有するミクロスフェア（microsphere）を含む現
像試薬を、結合試薬と被分析物を含有する液体試料とを
接触させた後に、結合試薬を逆滴定するのに用いる。ミ
クロスフェア（microsphere）は大量の蛍光染料を含む
ことができるので、小量の被分析物からのシグナルを増
幅でき、アッセイの感度は改良される。この増幅は高感
度アッセイを1mm2またはそれよりも小さい面積および10
00から100000分子／μm2の範囲の結合試薬の表面密度を
有するミクロスポットを用いてですら、実行することを
可能とする。
発明の概要
この発明は、液体試料中の与えられた被分析物に対し
て特異的な結合部位を有する結合試薬を固体支持体上の
試験帯に固定化させ、結合試薬は試験帯において一連の
場所的に分離された位置に分割されており、被分析物の
濃度を該一連の位置からのシグナルを統合することによ
って得るものである結合アッセイを行うための方法、装
置および試験キットを提供する。
て特異的な結合部位を有する結合試薬を固体支持体上の
試験帯に固定化させ、結合試薬は試験帯において一連の
場所的に分離された位置に分割されており、被分析物の
濃度を該一連の位置からのシグナルを統合することによ
って得るものである結合アッセイを行うための方法、装
置および試験キットを提供する。
したがって、一面においてはこの発明は液体試料中の
被分析物の濃度を測定するための方法を提供し、その方
法は （ａ）固体支持体上の試験帯に被分析物に特異的な係合
部位を有する結合試薬を置き、該結合試薬を一連の場所
的に分離された位置に分割すること、 （ｂ）支持体と液体試料とを該各位置で結合試薬の小部
分が被分析物によって占有されるように接触させるこ
と、 （ｃ）被分析物によって占有された該小部分の結合部位
のシグナル表示の値を一連の個々の位置について測定
し、 （ｄ）一連の各位置について得られたシグナル値を統合
して、統合されたシグナルを供給し、 （ｅ）該統合されたシグナルを、既知の濃度の被分析物
を含有する一連の標準溶液から得られた対応する数値と
比較して液体試料中の被分析物の濃度を決定すること： を含んでなる。
被分析物の濃度を測定するための方法を提供し、その方
法は （ａ）固体支持体上の試験帯に被分析物に特異的な係合
部位を有する結合試薬を置き、該結合試薬を一連の場所
的に分離された位置に分割すること、 （ｂ）支持体と液体試料とを該各位置で結合試薬の小部
分が被分析物によって占有されるように接触させるこ
と、 （ｃ）被分析物によって占有された該小部分の結合部位
のシグナル表示の値を一連の個々の位置について測定
し、 （ｄ）一連の各位置について得られたシグナル値を統合
して、統合されたシグナルを供給し、 （ｅ）該統合されたシグナルを、既知の濃度の被分析物
を含有する一連の標準溶液から得られた対応する数値と
比較して液体試料中の被分析物の濃度を決定すること： を含んでなる。
したがって、この発明においては、試験帯における一
連の位置からのシグナル値を単一の被分析物の濃度を測
定するのに用いる。これは、被分析物の濃度の測定に１
個の位置から生ずるシグナルを用いるEP304202に記載さ
れたアプローチとは著しく異なっている。
連の位置からのシグナル値を単一の被分析物の濃度を測
定するのに用いる。これは、被分析物の濃度の測定に１
個の位置から生ずるシグナルを用いるEP304202に記載さ
れたアプローチとは著しく異なっている。
試験帯の一連の結合試薬の位置を、たとえば、共焦点
顕微鏡を用いて連続的に調べることができ、そして各位
置からのシグナル値を統合して統合されたシグナルを供
給することができる。代りに試験帯の結合試薬の一連の
位置を、たとえば荷電結合素子（Charge coupled devic
e,CCD）カメラを用いて同時に測定された各位置からの
シグナル値といっしょに調べることができる。
顕微鏡を用いて連続的に調べることができ、そして各位
置からのシグナル値を統合して統合されたシグナルを供
給することができる。代りに試験帯の結合試薬の一連の
位置を、たとえば荷電結合素子（Charge coupled devic
e,CCD）カメラを用いて同時に測定された各位置からの
シグナル値といっしょに調べることができる。
好ましくは、各位置で結合試薬によって占有されてい
る結合部位の小部分を表わすシグナルは、上記したよう
に競合的方法または非競合的方法で、標識を有する現像
試薬であって、占有されていない結合部位、結合された
被分析物または占有された結合部位と結合できる現像試
薬を用いて、結合試薬を逆滴定することによって測定さ
れる。現像試薬上の標識は放射性同位元素、酵素、化学
発光標識または蛍光標識であり得る。蛍光染料は検出の
ために適切な色の範囲（励起および発光波長）の蛍光を
提供するために選択することができるので蛍光染料標識
は特に好ましい。蛍光染料はクマリン、フルオロセイ
ン，ローダミンおよびテキサスレッド（Texas Red）を
含む。背景の蛍光が減衰した後に蛍光性シグナルの強度
を測定するのに時間分解（time−resolved）蛍光を用い
ることを可能とするので、長期の蛍光期間を有する蛍光
染料分子を用いることができる。都合のいいことに、標
識を現像試薬に付着しているラテックスミクロスフェア
の表面の中または上に導入することができる。これは現
像試薬によって作り出されるシグナルを増幅する、大量
の標識を現像試薬の各分子に結合させることを可能とす
る。
る結合部位の小部分を表わすシグナルは、上記したよう
に競合的方法または非競合的方法で、標識を有する現像
試薬であって、占有されていない結合部位、結合された
被分析物または占有された結合部位と結合できる現像試
薬を用いて、結合試薬を逆滴定することによって測定さ
れる。現像試薬上の標識は放射性同位元素、酵素、化学
発光標識または蛍光標識であり得る。蛍光染料は検出の
ために適切な色の範囲（励起および発光波長）の蛍光を
提供するために選択することができるので蛍光染料標識
は特に好ましい。蛍光染料はクマリン、フルオロセイ
ン，ローダミンおよびテキサスレッド（Texas Red）を
含む。背景の蛍光が減衰した後に蛍光性シグナルの強度
を測定するのに時間分解（time−resolved）蛍光を用い
ることを可能とするので、長期の蛍光期間を有する蛍光
染料分子を用いることができる。都合のいいことに、標
識を現像試薬に付着しているラテックスミクロスフェア
の表面の中または上に導入することができる。これは現
像試薬によって作り出されるシグナルを増幅する、大量
の標識を現像試薬の各分子に結合させることを可能とす
る。
好ましくは、該位置はミクロスポットであり、アッセ
イは各個々の被分析物について４〜40（またはそれより
多い）のミクロスポットを用いて行なわれ、各ミクロス
ポットは10000μm2よりも小さい面積を持ち、ミクロス
ポットは100〜1000μｍの距離でお互いに分離されてい
る。一連のものの内の位置はこの明細書の後記の関連の
あるところでは「ミニミクロスポット」という。
イは各個々の被分析物について４〜40（またはそれより
多い）のミクロスポットを用いて行なわれ、各ミクロス
ポットは10000μm2よりも小さい面積を持ち、ミクロス
ポットは100〜1000μｍの距離でお互いに分離されてい
る。一連のものの内の位置はこの明細書の後記の関連の
あるところでは「ミニミクロスポット」という。
この発明は、複数の被分析物の濃度を、各試験帯がそ
の中に液体試料中の与えられた被分析物に特異的な結合
部位を有する結合試薬である、試験帯に一連の場所的に
分離された位置に分割されている結合試薬の総量を固定
化されている、複数の試験帯に同時に供給することによ
って測定することも可能にする。
の中に液体試料中の与えられた被分析物に特異的な結合
部位を有する結合試薬である、試験帯に一連の場所的に
分離された位置に分割されている結合試薬の総量を固定
化されている、複数の試験帯に同時に供給することによ
って測定することも可能にする。
好ましくは、EP304,202にしたがって、与えられた被
分析物に特異的な結合試薬の総量は0.1V/Kモル（式中Ｖ
は試験帯に適用される試料の容積でＫは結合試薬に結合
する被分析物についての会合常数である）よりも少な
い。これはWO83/01031号に記載された「周囲の被分析物
（ambient analite）」条件が被分析物の濃度にかわら
ず満たされることを保証する。
分析物に特異的な結合試薬の総量は0.1V/Kモル（式中Ｖ
は試験帯に適用される試料の容積でＫは結合試薬に結合
する被分析物についての会合常数である）よりも少な
い。これはWO83/01031号に記載された「周囲の被分析物
（ambient analite）」条件が被分析物の濃度にかわら
ず満たされることを保証する。
支持体上に、ミクロスポットのような別々の位置に結
合試薬を固定化する１つの方法は、通常供給するスポッ
トが約80μｍの直径をもつ場合には、インク−ジェット
またはレーザープリンターで用いられる技術と類似の技
術を用いることができる。あるいは、もっと大きい位置
が必要なら、支持体上の位置に固定化される結合試薬の
量を調節するためにミクロピペットを用いることができ
る。
合試薬を固定化する１つの方法は、通常供給するスポッ
トが約80μｍの直径をもつ場合には、インク−ジェット
またはレーザープリンターで用いられる技術と類似の技
術を用いることができる。あるいは、もっと大きい位置
が必要なら、支持体上の位置に固定化される結合試薬の
量を調節するためにミクロピペットを用いることができ
る。
この発明はミクロスポットの面積を、5mm2から０のよ
うに、高い値から減少させるときに、ミクロスポットが
小さいけれども有限である面積、典型的には約0.1mm2に
達したときに、結合アッセイの感度（検出の下限によっ
て表わされる）は最高に達するという観察に基づく。さ
らにミクロスポットの面積を減少させることは結合アッ
セイの感度の減少をもたらす。しかしながら、任意の与
えられた面積のミクロスポットを、その総被覆面積がミ
ニミクロスポットで占められるように、複数のミニミク
ロスポットにしたがって、結合試薬の総量が同じままで
あるように細分化することにより、感度は増加する。
うに、高い値から減少させるときに、ミクロスポットが
小さいけれども有限である面積、典型的には約0.1mm2に
達したときに、結合アッセイの感度（検出の下限によっ
て表わされる）は最高に達するという観察に基づく。さ
らにミクロスポットの面積を減少させることは結合アッ
セイの感度の減少をもたらす。しかしながら、任意の与
えられた面積のミクロスポットを、その総被覆面積がミ
ニミクロスポットで占められるように、複数のミニミク
ロスポットにしたがって、結合試薬の総量が同じままで
あるように細分化することにより、感度は増加する。
さらに、各個々の分析物について一連のミクロスポッ
トを用いることは、ユーザーに任意の与えられたミクロ
スポットについて得られた数値が、一連の他のミクロス
ポットとの比較により誤りであるかどうかを決定するこ
とを可能とする。
トを用いることは、ユーザーに任意の与えられたミクロ
スポットについて得られた数値が、一連の他のミクロス
ポットとの比較により誤りであるかどうかを決定するこ
とを可能とする。
さらに別の面では、この発明は、液体試料中の１また
はそれより多くの濃度を測定するための装置であって、
各試験帯が液体試料中の与えられた被分析物に特異的な
結合部位を有する結合試薬の総量を試験帯中に固定化さ
せた、１つまたはそれよりも多い試験帯を有する固体支
持体を含み、該結合試薬は、該試験帯において一連の場
所的に分離された位置に分割され、与えられた分析物の
濃度が、一連の各位置からのシグナル値を統合すること
によって得られるものである装置を提供する。
はそれより多くの濃度を測定するための装置であって、
各試験帯が液体試料中の与えられた被分析物に特異的な
結合部位を有する結合試薬の総量を試験帯中に固定化さ
せた、１つまたはそれよりも多い試験帯を有する固体支
持体を含み、該結合試薬は、該試験帯において一連の場
所的に分離された位置に分割され、与えられた分析物の
濃度が、一連の各位置からのシグナル値を統合すること
によって得られるものである装置を提供する。
さらなる面においては、この発明は液体試料中の１ま
たはそれよりも多い被分析物の濃度を測定するためのキ
ットを提供し、該キットは、 （ａ）１つまたはそれよりも多い試験帯を有する固体支
持体を含み、各試験帯は液体試料中の与えられた被分析
物に特異的な結合部位を有する結合試薬の総量を試験帯
中に固定化させたものであって、該結合試薬は該試験帯
において一連の場所的に分離された位置に分割されてい
る装置、並びに （ｂ）与えられた被分析物によって占有された結合試薬
の結合部位の小部分を測定する１つまたはそれよりも多
い現像試薬であって、該現像試薬は標識を有しており、
結合された被分析物または結合試薬の占有されていない
もしくは占有された結合部位と結合できるものである現
像試薬を含み、 与えられた被分析物の濃度は一連の各位置の現像試薬
の標識からのシグナル値を統合することによって得られ
るものであるキットを提供する。
たはそれよりも多い被分析物の濃度を測定するためのキ
ットを提供し、該キットは、 （ａ）１つまたはそれよりも多い試験帯を有する固体支
持体を含み、各試験帯は液体試料中の与えられた被分析
物に特異的な結合部位を有する結合試薬の総量を試験帯
中に固定化させたものであって、該結合試薬は該試験帯
において一連の場所的に分離された位置に分割されてい
る装置、並びに （ｂ）与えられた被分析物によって占有された結合試薬
の結合部位の小部分を測定する１つまたはそれよりも多
い現像試薬であって、該現像試薬は標識を有しており、
結合された被分析物または結合試薬の占有されていない
もしくは占有された結合部位と結合できるものである現
像試薬を含み、 与えられた被分析物の濃度は一連の各位置の現像試薬
の標識からのシグナル値を統合することによって得られ
るものであるキットを提供する。
図面の簡単な説明
多数の対立する効果が結びついてこの結果を招くとい
う理由で、最高感度をもたらすミクロスポットの面積に
ついての予期せぬ観察が生じると考えられる。これらの
効果を添付図面を参照して説明する。
う理由で、最高感度をもたらすミクロスポットの面積に
ついての予期せぬ観察が生じると考えられる。これらの
効果を添付図面を参照して説明する。
図１は、結合アッセイの感度が一定の結合試薬密度で
ミクロスポットの面積に対して、一般的にどのように変
わるかを表わし、 図２は、ミクロスポットの面積が変化する際のシグナ
ル対ノイズにおける一般的な変化を表わし、 図３は、ミクロスポットの面積が変化するにつれて、
結合試薬に結合する被分析物に関する拡散抑制（diffus
ion constraints）が変化するかを表わし、 図４は、ミクロスポットの面積が変化するにつれ、シ
グナル測定におけるエラーがどのように変化するかを示
し、 図５は、この発明の一連のミクロスポットと従来技術
である１個のミクロスポットとの比較を示し、および 図６は、この発明の別の実施態様である、一連の線と
して固定化された結合試薬を示す。
ミクロスポットの面積に対して、一般的にどのように変
わるかを表わし、 図２は、ミクロスポットの面積が変化する際のシグナ
ル対ノイズにおける一般的な変化を表わし、 図３は、ミクロスポットの面積が変化するにつれて、
結合試薬に結合する被分析物に関する拡散抑制（diffus
ion constraints）が変化するかを表わし、 図４は、ミクロスポットの面積が変化するにつれ、シ
グナル測定におけるエラーがどのように変化するかを示
し、 図５は、この発明の一連のミクロスポットと従来技術
である１個のミクロスポットとの比較を示し、および 図６は、この発明の別の実施態様である、一連の線と
して固定化された結合試薬を示す。
詳細な説明
図１から４では、示された曲線の正確な形は、結合試
薬の物理化学的性質（すなわち会合および解離速度定
数）、ミクロスポットがさらされる被分析物含有溶液の
粘度、用いられた標識の特異的活性等を含む、多数のパ
ラメーターに依存するだろう。
薬の物理化学的性質（すなわち会合および解離速度定
数）、ミクロスポットがさらされる被分析物含有溶液の
粘度、用いられた標識の特異的活性等を含む、多数のパ
ラメーターに依存するだろう。
すべての図において、Ａ値は従来技術において一般的
に用いられたミクロスポットの面積（一般的には1mm2）
を意味する。すべての図において、結合試薬の密度は一
定に保たれている。
に用いられたミクロスポットの面積（一般的には1mm2）
を意味する。すべての図において、結合試薬の密度は一
定に保たれている。
図１は、ミクロスポットの面積が減少するときの実験
的に観察された感度の変化を示す。この発明の文脈で
は、感度は、ゼロシグナルを測定できるエラー（s.d）
によって与えられる検出の下限として定義される。図１
は、面積がＡ値から減少するにつれて、結合アッセイの
感度は最高に達し、次いでミクロスポットの面積がさら
にゼロに向って減少するにつれて低下する。
的に観察された感度の変化を示す。この発明の文脈で
は、感度は、ゼロシグナルを測定できるエラー（s.d）
によって与えられる検出の下限として定義される。図１
は、面積がＡ値から減少するにつれて、結合アッセイの
感度は最高に達し、次いでミクロスポットの面積がさら
にゼロに向って減少するにつれて低下する。
この観察をもたらすいくつかの対立する因子は図２か
ら４に記載されている。
ら４に記載されている。
図２は、平衡に達したと仮定して、ミクロスポットの
サイズがゼロに向って減少した時に、どのように結合試
薬の結合部位の占有の測定に伴われるノイズに対するシ
グナルの比が変化するかを示す。ミクロスポットの面積
がＡ値から減少する際に、結合試薬の結合部位の小部分
占有は、結合試薬の濃度が0.01/Kより低く下がると、平
坦域値に達する。したがって、被分析物による結合部位
の占有を測定するために用いられる現像試薬上の標識か
らの単位面積当りのシグナルも、平坦域に達するだろ
う。単位面積当りの背景のノイズはほとんど一定のまま
であるので、ノイズに対するシグナルの比も同様に、結
合試薬の濃度が0.01/Kより低く下がるときに、平坦値に
増加するだろう。
サイズがゼロに向って減少した時に、どのように結合試
薬の結合部位の占有の測定に伴われるノイズに対するシ
グナルの比が変化するかを示す。ミクロスポットの面積
がＡ値から減少する際に、結合試薬の結合部位の小部分
占有は、結合試薬の濃度が0.01/Kより低く下がると、平
坦域値に達する。したがって、被分析物による結合部位
の占有を測定するために用いられる現像試薬上の標識か
らの単位面積当りのシグナルも、平坦域に達するだろ
う。単位面積当りの背景のノイズはほとんど一定のまま
であるので、ノイズに対するシグナルの比も同様に、結
合試薬の濃度が0.01/Kより低く下がるときに、平坦値に
増加するだろう。
図３はミクロスポットの面積が減少するにつれてどの
ように拡散抑制が変化するかを示す。「拡散抑制」は、
被分析物が、結合試薬に向って移動し、そして結合試薬
に結合する速度を制限する。図３が示しているように、
拡散抑制はミクロスポットのサイズが減少するにつれて
減少する。すなわち、結合過程の反応速度論は、より小
さいミクロスポットに対してはより速いこと、該系にお
ける熱力学的平衡により小さいミクロスポットに対して
はより急速に到達することを意味する。
ように拡散抑制が変化するかを示す。「拡散抑制」は、
被分析物が、結合試薬に向って移動し、そして結合試薬
に結合する速度を制限する。図３が示しているように、
拡散抑制はミクロスポットのサイズが減少するにつれて
減少する。すなわち、結合過程の反応速度論は、より小
さいミクロスポットに対してはより速いこと、該系にお
ける熱力学的平衡により小さいミクロスポットに対して
はより急速に到達することを意味する。
分子レベルでは、この現象は次のように想像できる。
結合試薬を含有するミクロスポットが被分析物を含有す
る液体試量中に置かれた時、結合試薬は被分析物と結合
して、被分析物の局所的な濃度を全体としての液体試料
と比較して、枯渇させる。これは、熱力学的平衡に達す
るまでミクロスポット付近に確立された濃度勾配をもた
らす。この過程はより大きいミクロスポットに対しては
よりおそく、拡散抑制はほぼミクロスポットの半径に比
例することが分かった。結合試薬の結合部位の占有が平
衡値に達した時、液体試料中の被分析物の濃度は均一で
ある。しかしながら、ミクロスポットがより小さなサイ
ズの場合にはより急速に平衡に達し、このことは、より
小さいスポット上の結合部位の小部分占有は、より大き
いスポットの場合に平衡に達するのに必要ないかなるイ
ンキュベーション時間に対しても、より大きいことを意
味する。
結合試薬を含有するミクロスポットが被分析物を含有す
る液体試量中に置かれた時、結合試薬は被分析物と結合
して、被分析物の局所的な濃度を全体としての液体試料
と比較して、枯渇させる。これは、熱力学的平衡に達す
るまでミクロスポット付近に確立された濃度勾配をもた
らす。この過程はより大きいミクロスポットに対しては
よりおそく、拡散抑制はほぼミクロスポットの半径に比
例することが分かった。結合試薬の結合部位の占有が平
衡値に達した時、液体試料中の被分析物の濃度は均一で
ある。しかしながら、ミクロスポットがより小さなサイ
ズの場合にはより急速に平衡に達し、このことは、より
小さいスポット上の結合部位の小部分占有は、より大き
いスポットの場合に平衡に達するのに必要ないかなるイ
ンキュベーション時間に対しても、より大きいことを意
味する。
しかしながら、ミクロスポットの面積が減少するのと
同じように、結合試薬の量および現像試薬からのシグナ
ルのレベルも同様に減少する。このことは現像試薬上の
標識からのシグナルの測定における統計上のエラーの増
大をもたらし、エラーはミクロスポットの面積がゼロに
向かうにつれ無限大に向う（図４参照）。
同じように、結合試薬の量および現像試薬からのシグナ
ルのレベルも同様に減少する。このことは現像試薬上の
標識からのシグナルの測定における統計上のエラーの増
大をもたらし、エラーはミクロスポットの面積がゼロに
向かうにつれ無限大に向う（図４参照）。
ノイズに対するシグナルの比および拡散抑制の考察か
ら、ミクロスポットの面積が減少している時に結合アッ
セイの感度における増加を示すことを理解することがで
きる。しかしながら、これらの因子はミクロスポットの
面積が減少するときのシグナル測定の統計上のエラーの
増加とは反対である。これらの因子は、図１に示される
ミクロスポットの面積に対する感度に認められた変化を
作り出すのに結びつく。したがって、総合的な結果は、
ミクロスポットの面積がゼロに減少するにつれ、結合ア
ッセイは全体的に鈍感になるということである。
ら、ミクロスポットの面積が減少している時に結合アッ
セイの感度における増加を示すことを理解することがで
きる。しかしながら、これらの因子はミクロスポットの
面積が減少するときのシグナル測定の統計上のエラーの
増加とは反対である。これらの因子は、図１に示される
ミクロスポットの面積に対する感度に認められた変化を
作り出すのに結びつく。したがって、総合的な結果は、
ミクロスポットの面積がゼロに減少するにつれ、結合ア
ッセイは全体的に鈍感になるということである。
しかしながら、ゼロになるほど小量の結合試薬を含有
する、可能な限り小さいサイズのミクロスポットを用い
て、アッセイを実行するのに必要な時間を最小化するた
めに急速な反応速度論を有する、高感度の小型結合アッ
セイを開発することが望ましい。
する、可能な限り小さいサイズのミクロスポットを用い
て、アッセイを実行するのに必要な時間を最小化するた
めに急速な反応速度論を有する、高感度の小型結合アッ
セイを開発することが望ましい。
この発明は、上述した両立しない効果を最大限の利益
のために利用することによって、感度を改良し、そし
て、結合アッセイのインキュベーション時間を減少す
る。
のために利用することによって、感度を改良し、そし
て、結合アッセイのインキュベーション時間を減少す
る。
これは、結合試薬の全量を一連の「ミニ−ミクロスポ
ット」のような場所的に分離された位置に細分化するこ
とによって拡散抑制を減少させることおよび各位置にお
ける小部分占有をが示すシグナルを統合することによっ
て、一連のミニ−ミクロスポットを含んでなるミニ−ミ
クロスポットが占める全面積と面積が等しい単一のミク
ロスポットを用いることにより得られるものより、大き
い総合シグナルを得ることによりなされる。
ット」のような場所的に分離された位置に細分化するこ
とによって拡散抑制を減少させることおよび各位置にお
ける小部分占有をが示すシグナルを統合することによっ
て、一連のミニ−ミクロスポットを含んでなるミニ−ミ
クロスポットが占める全面積と面積が等しい単一のミク
ロスポットを用いることにより得られるものより、大き
い総合シグナルを得ることによりなされる。
これは、なかんずく、用いられる結合試薬の全体の量
を、反応速度論と統計上のエラーに関連するノイズに対
するシグナルとの間のバランスを感度が最高になるよう
にしなければならなかった先行技術よりもさらに小さく
することができることを意味する。したがって、この発
明は、結合試薬に結合する被分析物を測定するのに関連
するノイズに対するシグナル比を改良できると同時に一
連の各ミクロスポットに関連する拡散抑制を減少させ
る。その上、個々のミクロスポットにおける被分析物に
よって占有された結合部位から生ずるシグナルが統合さ
れたシグナルを供給するように一連のものにわたって統
合され、それにより、より大きなミクロスポットに認め
られるシグナル測定の利点を維持するので、ミクロスポ
ットのサイズが減少する時に先行技術に認められる統計
上のエラーは除去される。
を、反応速度論と統計上のエラーに関連するノイズに対
するシグナルとの間のバランスを感度が最高になるよう
にしなければならなかった先行技術よりもさらに小さく
することができることを意味する。したがって、この発
明は、結合試薬に結合する被分析物を測定するのに関連
するノイズに対するシグナル比を改良できると同時に一
連の各ミクロスポットに関連する拡散抑制を減少させ
る。その上、個々のミクロスポットにおける被分析物に
よって占有された結合部位から生ずるシグナルが統合さ
れたシグナルを供給するように一連のものにわたって統
合され、それにより、より大きなミクロスポットに認め
られるシグナル測定の利点を維持するので、ミクロスポ
ットのサイズが減少する時に先行技術に認められる統計
上のエラーは除去される。
図５は、先行技術の単一のミクロスポットを、どのよ
うに全体として等しい量の結合試薬を含有する一連の25
のミクロスポットに分割できるかを説明する。
うに全体として等しい量の結合試薬を含有する一連の25
のミクロスポットに分割できるかを説明する。
しかしながら、同じ利益を生ずるアッセイを提供する
結合試薬の他の配置または形状を想像することができ
る。たとえば、碁盤目を形成する線（陰をつけた区域を
参照）として固定化されている結合試薬を示す図６参
照。この形状はその上、統計上のエラーの増加および結
合試薬の量が減少するにつれて認められる関連する感度
の喪失を取り除くために結合試薬（たとえば抗体）によ
り被覆された全面積を維持すると同時に拡散抑制を減少
する効果を有する。
結合試薬の他の配置または形状を想像することができ
る。たとえば、碁盤目を形成する線（陰をつけた区域を
参照）として固定化されている結合試薬を示す図６参
照。この形状はその上、統計上のエラーの増加および結
合試薬の量が減少するにつれて認められる関連する感度
の喪失を取り除くために結合試薬（たとえば抗体）によ
り被覆された全面積を維持すると同時に拡散抑制を減少
する効果を有する。
一連のものを含む位置の中の結合試薬の量および分布
は、被分析物の拡散抑制、被分析物を含有する液体試料
の性質および粘度並びにインキュベーションの間に用い
られる実施要綱を含む多くの因子に依存する。しかしな
がら、ここに与えられたガイダンスがあれば、実質的に
またコンピューター造形によって、当業者は容易に任意
の与えられた結合アッセイについての最適の配置または
形状を決定し得る。
は、被分析物の拡散抑制、被分析物を含有する液体試料
の性質および粘度並びにインキュベーションの間に用い
られる実施要綱を含む多くの因子に依存する。しかしな
がら、ここに与えられたガイダンスがあれば、実質的に
またコンピューター造形によって、当業者は容易に任意
の与えられた結合アッセイについての最適の配置または
形状を決定し得る。
例
蛍光親水性ラテックス ミクロスフェアへの抗−TSHマ
ウスのモノクローナル抗体の複合 1. 2回蒸留した0.5ml中の10mgの蛍光親水性ラテックス
−ミクロスフェアに0.5mlの１％トゥイーン（Tween）20
を添加し、室温で15分間振とうし、TSE High SPin20遠
心分離機中で20,000rpmで８℃で10分間遠心分離した。
ウスのモノクローナル抗体の複合 1. 2回蒸留した0.5ml中の10mgの蛍光親水性ラテックス
−ミクロスフェアに0.5mlの１％トゥイーン（Tween）20
を添加し、室温で15分間振とうし、TSE High SPin20遠
心分離機中で20,000rpmで８℃で10分間遠心分離した。
2. ペレットを2mlの0.05M MES（２−〔Ｎ−モルホリ
ノ〕エタンスルホン酸（緩衝液pH6.1中に分散させ、遠
心分離した。
ノ〕エタンスルホン酸（緩衝液pH6.1中に分散させ、遠
心分離した。
3. 工程２を繰り返した。
4. ペレットを0.8mlのMES緩衝液に分散させた。
5. 100μｌの2mgの抗−TSHモノクローナル現像抗体をミ
クロスフェアに加え、室温で15分間振とうした。
クロスフェアに加え、室温で15分間振とうした。
6. 該混合物に100μｌの0.25％エチル−３（３−ジメチ
ルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩を加え、室温
で２時間振とうした。
ルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩を加え、室温
で２時間振とうした。
7. 該混合物に100μｌのMES緩衝液中の10mgのグリシン
を加え、さらに30分間振とうし、遠心分離した。
を加え、さらに30分間振とうし、遠心分離した。
8. ペレットを2mlの１％BSA中に分散させ、室温で１時
間振とうし、遠心分離した。
間振とうし、遠心分離した。
9. ペレットを2mlの１％BSAに分散させ、室温で１時間
振とうし、遠心分離した。
振とうし、遠心分離した。
10. ペレットを2mlの0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.4に分散さ
せ、遠心分離した。
せ、遠心分離した。
11. 工程10を２回繰り返した。
12. ペレットを2mlの0.1％のナトリウムアジドを含有す
る１％BSA中に分散させ、４℃で貯蔵した。
る１％BSA中に分散させ、４℃で貯蔵した。
サンドイッチ状TSHアッセイにおけるミクロ対ミニミ
クロ捕獲抗体ミクロスポットの速度論の比較 1.抗−TSH捕獲抗体ミクロスポット（直径1.1mm、面積10
6μm2）を16Dynatech black Micro Fluor Microtitreウ
ェルの各々の上に0.5μｌの200μg/mlの抗体溶液を置
き、該滴を直ちに吸引し、該ウェルを室温で30分間Pirc
eからSuper Blockでブロックし、0.1Mリン酸塩緩衝液で
pH7.4で洗浄することによって作った。
クロ捕獲抗体ミクロスポットの速度論の比較 1.抗−TSH捕獲抗体ミクロスポット（直径1.1mm、面積10
6μm2）を16Dynatech black Micro Fluor Microtitreウ
ェルの各々の上に0.5μｌの200μg/mlの抗体溶液を置
き、該滴を直ちに吸引し、該ウェルを室温で30分間Pirc
eからSuper Blockでブロックし、0.1Mリン酸塩緩衝液で
pH7.4で洗浄することによって作った。
2.ミニ−ミクロスポットを、ピエゾ電気インク−ジェッ
ト印刷ヘッドを用いて、1mg/mlの濃度の抗体溶液および
16ウェルのミクロ滴定ウェル（抗体総被覆面積＝106μm
2）につき一連の49（７×７）のミニ−ミクロスポット
について役100個（pl）の液滴を用いて作った。ウェル
をSuper Blockでブロックし、上記のリン酸液緩衝液で
洗浄した。ミクロスポットおよびミニ−ミクロスポット
の両方について被覆された抗体密度は２×104IgG/μm2
であると概算した。
ト印刷ヘッドを用いて、1mg/mlの濃度の抗体溶液および
16ウェルのミクロ滴定ウェル（抗体総被覆面積＝106μm
2）につき一連の49（７×７）のミニ−ミクロスポット
について役100個（pl）の液滴を用いて作った。ウェル
をSuper Blockでブロックし、上記のリン酸液緩衝液で
洗浄した。ミクロスポットおよびミニ−ミクロスポット
の両方について被覆された抗体密度は２×104IgG/μm2
であると概算した。
2. 1μU/mlのTSHを含有する200μｌのプラズマをすべて
のミクロ滴定ウェルに加え、室温で振とうした。30分、
60分、120分および18時間（１晩）で、ミクロスポット
およびミニ−ミクロスポットを含有する４つのウェルを
0.1％のTween20を含有するリン酸塩緩衝液で洗浄し、次
いでTris−HCl緩衝液（50μg/ml）中で室温で30分間親
水性ラテックスミクロスフェアと複合した200μｌの抗
−TSH現像（developing）抗体とインキュベートし、リ
ン酸塩−Tween20緩衝液で洗浄した。次にウェルをアル
ゴン／クリプトンレーザーを装備したレーザー走査共焦
点顕微鏡で走査した。
のミクロ滴定ウェルに加え、室温で振とうした。30分、
60分、120分および18時間（１晩）で、ミクロスポット
およびミニ−ミクロスポットを含有する４つのウェルを
0.1％のTween20を含有するリン酸塩緩衝液で洗浄し、次
いでTris−HCl緩衝液（50μg/ml）中で室温で30分間親
水性ラテックスミクロスフェアと複合した200μｌの抗
−TSH現像（developing）抗体とインキュベートし、リ
ン酸塩−Tween20緩衝液で洗浄した。次にウェルをアル
ゴン／クリプトンレーザーを装備したレーザー走査共焦
点顕微鏡で走査した。
結 果
結 論
著しく高い平均応答がミニ−ミクロスポット試料にお
いて30分と120分の間で観察されたが、１晩の対照は、
著しい差を示さなかった、このことはミニ−ミクロスポ
ットが被分析物と捕獲抗体との会合について早い速度を
有し、インキュベーション時間を減少するのに用いるこ
とができるのであろうことを示している。
いて30分と120分の間で観察されたが、１晩の対照は、
著しい差を示さなかった、このことはミニ−ミクロスポ
ットが被分析物と捕獲抗体との会合について早い速度を
有し、インキュベーション時間を減少するのに用いるこ
とができるのであろうことを示している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平３−94700（ＪＰ，Ａ)
特表 平３−503081（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/543 515
Claims (9)
- 【請求項１】液体試料中の被分析物の濃度を測定する方
法であって、 （ａ）被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬を
試験帯の固体支持体上に置き、該結合試薬は一連の場所
的に分離された位置に置かれており、 （ｂ）該支持体と液体試料とを被分析物に特異的な結合
試薬の小部分の結合部位が被分析物と特異的に結合する
ように接触させ、 （ｃ）被分析物によって占有された該小部分の結合部位
の表示値を一連の個々の場所的に分離された位置で測定
し、 （ｄ）一連の各位置で得られた値を統合して、総シグナ
ルを供給し、 （ｅ）該総シグナルと、既知の濃度の被分析物を含有す
る一連の標準溶液から得られた対応する値とを比較し
て、液体試料中の被分析物の濃度を測定することを含ん
でなる方法。 - 【請求項２】被分析物によって占有された結合試薬の小
部分の結合部位の表示値を測定する方法であって、 （ａ）被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬を
試験帯の固体支持体上に置き、該結合試薬は一連の場所
的に分離された位置に置かれており、 （ｂ）該支持体と液体試料とを被分析物に特異的な結合
試薬の小部分の結合部位が被分析物と特異的に結合する
ように接触させ、 （ｃ）被分析物によって占有された該小部分の結合部位
の表示値を一連の個々の場所的に分離された位置で測定
し、 （ｄ）一連の各位置で得られた値を統合して、総シグナ
ルを供給することを含んでなる方法。 - 【請求項３】さらに次の工程、 （ｅ）該総シグナルと、既知の濃度の被分析物を含有す
る一連の標準溶液から得られた対応する値とを比較し
て、液体試料中の被分析物の濃度を測定することを含ん
でなる請求項２の方法。 - 【請求項４】該被分析物によって占有された小部分の結
合部位を、その位置で、該支持体とシグナルを形成し得
るマーカーで標識された現像試薬とを接触させることに
より測定し、該標識された現像試薬は占有されていない
結合部位、結合された被分析物または占有された結合部
位と結合できるものである、請求項１〜３のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項５】該結合試薬が一連の４〜40の位置に固定さ
れている請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】該位置が約10000μm2の面積を有し、互い
に100〜1000μｍの距離により分離されている請求項１
〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】試験帯にある結合試薬の総量が0.1V/Kモル
（式中Ｖは液体試料の容積であり、Ｋは結合試薬に結合
する被分析物についての会合常数である）よりも少ない
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】複数の結合試薬であって、各結合試薬が与
えられた被分析物に特異的な結合部位を有する試薬を用
いて、液体試料中の複数の異なった被分析物の濃度を測
定する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】該結合試薬が抗原のための結合部位を有し
ている抗体または核酸被分析物に結合できるオリゴヌク
レオチドである請求項１〜８のいずれか１項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9326450.5 | 1993-12-24 | ||
| GB939326450A GB9326450D0 (en) | 1993-12-24 | 1993-12-24 | Binding assay |
| PCT/GB1994/002814 WO1995018377A1 (en) | 1993-12-24 | 1994-12-23 | Binding assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09510539A JPH09510539A (ja) | 1997-10-21 |
| JP3391459B2 true JP3391459B2 (ja) | 2003-03-31 |
Family
ID=10747224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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