JPH09325149A - 結合アッセイに関する材料および方法 - Google Patents
結合アッセイに関する材料および方法Info
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- JPH09325149A JPH09325149A JP9024180A JP2418097A JPH09325149A JP H09325149 A JPH09325149 A JP H09325149A JP 9024180 A JP9024180 A JP 9024180A JP 2418097 A JP2418097 A JP 2418097A JP H09325149 A JPH09325149 A JP H09325149A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アッセイの作業レンジを広げ、かつ／また
は、所定のレンジ内でアッセイの精度を改善するため
に、アッセイを微調整する方法を提供する。 【解決手段】 アナライトに特異的な結合部位を備えた
結合試薬を用いた結合アッセイにおいて、固相上の結合
部位の密度を調節することを特徴とする。
は、所定のレンジ内でアッセイの精度を改善するため
に、アッセイを微調整する方法を提供する。 【解決手段】 アナライトに特異的な結合部位を備えた
結合試薬を用いた結合アッセイにおいて、固相上の結合
部位の密度を調節することを特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、結合アッセイに係
る材料および方法、特に、固相上の結合部位の密度を変
えることによってアナライトに特異的な結合部位を備え
た結合試薬を用いた結合アッセイを最適化する方法、最
適化方法に続いてアッセイキットを製造する方法、およ
びアッセイキットを用いたアナライトのアッセイを行う
方法に関する。
る材料および方法、特に、固相上の結合部位の密度を変
えることによってアナライトに特異的な結合部位を備え
た結合試薬を用いた結合アッセイを最適化する方法、最
適化方法に続いてアッセイキットを製造する方法、およ
びアッセイキットを用いたアナライトのアッセイを行う
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アナライトに特異的な結合部位を備えた
結合試薬と液体とを接触させ、結合試薬を分離し、か
つ、アナライトに占有された結合試薬の結合部位の比率
を示す値（フラクショナル・オキュパンシーと称する）
を測定することにより、液体サンプル中の薬剤またはホ
ルモン等のアナライトの濃度を測定することが知られて
いる。典型的に、液体サンプル中のアナライトの濃度
は、既知の濃度のアナライトを含む連続した標準液から
得られた値に、フラクショナル・オキュパンシーを比較
することによって決定することができる。これらの値
は、しばしば、アナライト濃度の変化に対してアッセイ
応答（例えば、ラベルされた現像試薬からのシグナル）
をプロットした、添加量応答曲線として図式的に示され
る。
結合試薬と液体とを接触させ、結合試薬を分離し、か
つ、アナライトに占有された結合試薬の結合部位の比率
を示す値（フラクショナル・オキュパンシーと称する）
を測定することにより、液体サンプル中の薬剤またはホ
ルモン等のアナライトの濃度を測定することが知られて
いる。典型的に、液体サンプル中のアナライトの濃度
は、既知の濃度のアナライトを含む連続した標準液から
得られた値に、フラクショナル・オキュパンシーを比較
することによって決定することができる。これらの値
は、しばしば、アナライト濃度の変化に対してアッセイ
応答（例えば、ラベルされた現像試薬からのシグナル）
をプロットした、添加量応答曲線として図式的に示され
る。
【０００３】アッセイを現像する際に、アッセイを最適
化すること、すなわち、臨床的レンジのホルモン濃度の
ように、有益な作業レンジにおいてアナライト濃度を最
高精度で測定できるアッセイ試薬の物理化学的特性およ
び濃度を選択することが慣例となっている。従来、アッ
セイの最適化は、アッセイで用いられる結合試薬または
ラベルされた現像試薬の量、もしくはアナライトに対す
る結合試薬の親和性等のパラメーターを変えることによ
って行われてきた。
化すること、すなわち、臨床的レンジのホルモン濃度の
ように、有益な作業レンジにおいてアナライト濃度を最
高精度で測定できるアッセイ試薬の物理化学的特性およ
び濃度を選択することが慣例となっている。従来、アッ
セイの最適化は、アッセイで用いられる結合試薬または
ラベルされた現像試薬の量、もしくはアナライトに対す
る結合試薬の親和性等のパラメーターを変えることによ
って行われてきた。
【０００４】イムノアッセイの分野では、競合イムノア
ッセイは、例えばBersonとYalowによって“研究および
診断の内分泌学的手法(Methods in Investigative and
Diagnostic Endocrinology)”（１９７３）、１１１〜
１１６頁に発表された設計原理に基づいて一般的に行わ
れていた。BersonとYalowは、競合イムノアッセイの性
能においては、結合試薬の量が、検出されるアナライト
の約３０〜５０％という低濃度を結合するように用いら
れれば、感度を最高にできると提案している。非競合的
イムノアッセイでは、液体サンプルの１００％に近いア
ナライトを結合するのに十分な結合試薬を用いることに
よって感度が最高になると、一般的に考えられている。
しかしながら、どちらの場合も、これらの広く認められ
た教訓に基づいて設計されたイムノアッセイでは、前記
の量の調査されるサンプル、および正確に調べられる
か、あるいは一定値であることが調べられる前記の量の
結合試薬を必要とする。
ッセイは、例えばBersonとYalowによって“研究および
診断の内分泌学的手法(Methods in Investigative and
Diagnostic Endocrinology)”（１９７３）、１１１〜
１１６頁に発表された設計原理に基づいて一般的に行わ
れていた。BersonとYalowは、競合イムノアッセイの性
能においては、結合試薬の量が、検出されるアナライト
の約３０〜５０％という低濃度を結合するように用いら
れれば、感度を最高にできると提案している。非競合的
イムノアッセイでは、液体サンプルの１００％に近いア
ナライトを結合するのに十分な結合試薬を用いることに
よって感度が最高になると、一般的に考えられている。
しかしながら、どちらの場合も、これらの広く認められ
た教訓に基づいて設計されたイムノアッセイでは、前記
の量の調査されるサンプル、および正確に調べられる
か、あるいは一定値であることが調べられる前記の量の
結合試薬を必要とする。
【０００５】最近では、このような傾向が変わり、サン
プル中の少しの割合のアナライトのみを結合する非常に
少量の結合試薬を用いて液体サンプル中のアナライト濃
度を測定するアッセイが発展してきた。ある場合では、
サンプル中の一つ以上のアナライトの決定が同時に行わ
れるように、一つ以上の小面積、すなわち“ミクロスポ
ット”状に結合試薬を固定する。この一つの例は、欧州
特許公開第０３０４２０２号公報であり、Ｖをサンプル
の体積、Ｋをアナライトに対する結合試薬の平衡定数と
して、固相支持体上の小面積に配された０．１Ｖ／Ｋモ
ル未満の結合試薬の量を用いて、用いられたサンプルの
体積および結合試薬の量と無関係にアッセイが得られる
ことを開示したものである。
プル中の少しの割合のアナライトのみを結合する非常に
少量の結合試薬を用いて液体サンプル中のアナライト濃
度を測定するアッセイが発展してきた。ある場合では、
サンプル中の一つ以上のアナライトの決定が同時に行わ
れるように、一つ以上の小面積、すなわち“ミクロスポ
ット”状に結合試薬を固定する。この一つの例は、欧州
特許公開第０３０４２０２号公報であり、Ｖをサンプル
の体積、Ｋをアナライトに対する結合試薬の平衡定数と
して、固相支持体上の小面積に配された０．１Ｖ／Ｋモ
ル未満の結合試薬の量を用いて、用いられたサンプルの
体積および結合試薬の量と無関係にアッセイが得られる
ことを開示したものである。
【０００６】国際特許出願第９３／０８４７２号公報
は、ミクロスポット状に、支持体上に高密度で少量の結
合試薬を固定化することによって結合アッセイの感度を
さらに改良する方法を開示している。このアッセイで
は、蛍光染料等のマーカーを含有する微小球を含む現像
試薬が、アナライトを含む液体サンプルと接触した後に
結合試薬を逆滴定するために用いられる。
は、ミクロスポット状に、支持体上に高密度で少量の結
合試薬を固定化することによって結合アッセイの感度を
さらに改良する方法を開示している。このアッセイで
は、蛍光染料等のマーカーを含有する微小球を含む現像
試薬が、アナライトを含む液体サンプルと接触した後に
結合試薬を逆滴定するために用いられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】概括的に、本発明は、
広いダイナミックもしくはリニアレンジ測定等の予め設
定された設計目標、あるいは高い分析感度、好ましくは
これらの両方に適するように結合アッセイを微調整する
方法に関する。これは、アナライトに特異的な結合部位
を備えた結合試薬を用いたアナライトのアッセイにおい
て、テストキャリアの固相上の結合部位密度を調節する
ことによって、添加量応答曲線および対応するアッセイ
の特徴を変更することができるという知見に基づくもの
である。
広いダイナミックもしくはリニアレンジ測定等の予め設
定された設計目標、あるいは高い分析感度、好ましくは
これらの両方に適するように結合アッセイを微調整する
方法に関する。これは、アナライトに特異的な結合部位
を備えた結合試薬を用いたアナライトのアッセイにおい
て、テストキャリアの固相上の結合部位密度を調節する
ことによって、添加量応答曲線および対応するアッセイ
の特徴を変更することができるという知見に基づくもの
である。
【０００８】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】従
って、一つの態様として、本願発明は、アナライトに特
異的な結合部位を備えた結合試薬を用いた結合アッセイ
を最適化する方法を提供するものであって、結合試薬は
固相に固定されているか、アッセイ中に固相に固定さ
れ、固相上の結合部位の密度を調節することを含む。異
なる密度の結合部位で得られた添加量応答曲線を調べる
ことができ、アッセイの特徴または特性が最適化される
密度を選択することができる。
って、一つの態様として、本願発明は、アナライトに特
異的な結合部位を備えた結合試薬を用いた結合アッセイ
を最適化する方法を提供するものであって、結合試薬は
固相に固定されているか、アッセイ中に固相に固定さ
れ、固相上の結合部位の密度を調節することを含む。異
なる密度の結合部位で得られた添加量応答曲線を調べる
ことができ、アッセイの特徴または特性が最適化される
密度を選択することができる。
【０００９】しかして、本願発明は、アナライトに特異
的な結合部位を備えた結合試薬を用いた結合アッセイを
最適化する方法を提供し、結合試薬は固相に固定されて
いるか、アッセイ中に固定され、この方法は、（ａ）固
体支持体上の所定密度の結合試薬に対する添加量応答曲
線を調べる工程、（ｂ）添加量応答曲線を変更するため
に固体支持体上の結合試薬の密度を調節する工程、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を任意に繰り返す工程、
および（ｄ）所望の形を備えた添加量応答曲線を提供す
る結合試薬の密度を選択する工程を含む。
的な結合部位を備えた結合試薬を用いた結合アッセイを
最適化する方法を提供し、結合試薬は固相に固定されて
いるか、アッセイ中に固定され、この方法は、（ａ）固
体支持体上の所定密度の結合試薬に対する添加量応答曲
線を調べる工程、（ｂ）添加量応答曲線を変更するため
に固体支持体上の結合試薬の密度を調節する工程、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を任意に繰り返す工程、
および（ｄ）所望の形を備えた添加量応答曲線を提供す
る結合試薬の密度を選択する工程を含む。
【００１０】上記方法では、工程（ａ）および（ｂ）
を、適切な結合部位密度、すなわち、所望の性能特性を
備えた密度が見つかるまで、繰り返すことができる。
を、適切な結合部位密度、すなわち、所望の性能特性を
備えた密度が見つかるまで、繰り返すことができる。
【００１１】本発明では、“最適化”とは、その作業レ
ンジの改良および／またはアナライト濃度の特定の作業
レンジ内における精度の改良、すなわち、アナライト濃
度の測定において生じた不規則なエラーの最小化等のア
ッセイの一つ以上の性能特性を改良するためにアッセイ
系を設計または開発する方法を指す。この方法は、アッ
セイの感度、すなわち低濃度のアナライトを調べるアッ
セイ系の能力であって、ゼロと区別できる最も低いアナ
ライト濃度で数字的に示される能力（“検出限度”）を
改良することを含んでもよい。上述したように、従来技
術では、アッセイの最適化は、アッセイで用いられる結
合試薬もしくはラベルされた現像試薬の量、あるいはア
ナライトへの結合試薬の親和性等のパラメーターを変更
することに依存していた。対照的に、本願発明は、アッ
セイ系を最適化するために、単独で、あるいは既知の最
適化技術と組み合わせて、固相上の結合部位の密度を変
える。
ンジの改良および／またはアナライト濃度の特定の作業
レンジ内における精度の改良、すなわち、アナライト濃
度の測定において生じた不規則なエラーの最小化等のア
ッセイの一つ以上の性能特性を改良するためにアッセイ
系を設計または開発する方法を指す。この方法は、アッ
セイの感度、すなわち低濃度のアナライトを調べるアッ
セイ系の能力であって、ゼロと区別できる最も低いアナ
ライト濃度で数字的に示される能力（“検出限度”）を
改良することを含んでもよい。上述したように、従来技
術では、アッセイの最適化は、アッセイで用いられる結
合試薬もしくはラベルされた現像試薬の量、あるいはア
ナライトへの結合試薬の親和性等のパラメーターを変更
することに依存していた。対照的に、本願発明は、アッ
セイ系を最適化するために、単独で、あるいは既知の最
適化技術と組み合わせて、固相上の結合部位の密度を変
える。
【００１２】さらなる態様では、本願発明は、上記最適
化方法に次いでアッセイキットを製造する方法を提供す
るもので、この方法は、固相上にアナライトに特異的な
結合部位を備えた結合試薬を固定化することを含み、こ
の結合試薬は、前記最適化方法を用いて決定された結合
部位の密度を提供するように固相上に固定化される。
化方法に次いでアッセイキットを製造する方法を提供す
るもので、この方法は、固相上にアナライトに特異的な
結合部位を備えた結合試薬を固定化することを含み、こ
の結合試薬は、前記最適化方法を用いて決定された結合
部位の密度を提供するように固相上に固定化される。
【００１３】さらなる態様では、本願発明は、上記最適
化方法の後にアッセイキットを製造する方法を提供し、
この方法は、アナライトに特異的な結合部位を備えた誘
導された結合試薬に結合し得る機能が付与された固相を
製造することを含み、この結合試薬は、前記最適化方法
を用いて決定した結合部位の密度を提供するようにアッ
セイの前もしくは最中に固相上に固定化される。
化方法の後にアッセイキットを製造する方法を提供し、
この方法は、アナライトに特異的な結合部位を備えた誘
導された結合試薬に結合し得る機能が付与された固相を
製造することを含み、この結合試薬は、前記最適化方法
を用いて決定した結合部位の密度を提供するようにアッ
セイの前もしくは最中に固相上に固定化される。
【００１４】さらなる態様では、本発明は、アッセイキ
ットの使用方法を提供し、この方法は、以下の工程、す
なわち、（ａ）結合部位のフラクションが、サンプル中
のアナライトに占有されるように固相を液体サンプルと
接触する工程、（ｂ）アナライトに占有された結合部位
のフラクションを示すシグナルの値を測定する工程、お
よび（ｃ）液体サンプル中のアナライトの濃度を決定す
るために、前記値を添加量応答曲線と比較する工程を含
む。
ットの使用方法を提供し、この方法は、以下の工程、す
なわち、（ａ）結合部位のフラクションが、サンプル中
のアナライトに占有されるように固相を液体サンプルと
接触する工程、（ｂ）アナライトに占有された結合部位
のフラクションを示すシグナルの値を測定する工程、お
よび（ｃ）液体サンプル中のアナライトの濃度を決定す
るために、前記値を添加量応答曲線と比較する工程を含
む。
【００１５】しかして、固相上の結合部位の密度を調節
することが、活性な固相部と、それに対応し、最初は可
溶性の結合パートナーとの間のリガンド−レセプター相
互作用に影響を与えることに気付いた。この結合では、
この固相部は、アッセイを行う前に固相キャリアに固定
された結合試薬、もしくは可溶性の結合試薬に結合し得
る捕獲試薬であってもよい。
することが、活性な固相部と、それに対応し、最初は可
溶性の結合パートナーとの間のリガンド−レセプター相
互作用に影響を与えることに気付いた。この結合では、
この固相部は、アッセイを行う前に固相キャリアに固定
された結合試薬、もしくは可溶性の結合試薬に結合し得
る捕獲試薬であってもよい。
【００１６】結合部位の密度は、結合試薬がアッセイを
行う前に固相に固定されるか、もしくは、例えば可溶性
結合試薬を捕獲することができる活性化された固相を用
いることによって、アッセイの最中に固相に固定化され
るかに依存して、多くの種々の方法で調節することがで
きる。後者の方法の一つの例は、アビジンで固相を被覆
することによって固相を活性化し、アナライトに対する
結合部位を備えた可溶性ビオチニル化結合試薬を用いる
ことであり、結合試薬は、ビオチン−アビジン相互作用
によって固相に捕獲される。あるいは、支持体に固定さ
れた相補的オリゴヌクレオチド配列によって捕獲される
オリゴヌクレオチドテイルを結合試薬に取り付けてもよ
い。国際特許出願第９５／２４６４９号公報参照。
行う前に固相に固定されるか、もしくは、例えば可溶性
結合試薬を捕獲することができる活性化された固相を用
いることによって、アッセイの最中に固相に固定化され
るかに依存して、多くの種々の方法で調節することがで
きる。後者の方法の一つの例は、アビジンで固相を被覆
することによって固相を活性化し、アナライトに対する
結合部位を備えた可溶性ビオチニル化結合試薬を用いる
ことであり、結合試薬は、ビオチン−アビジン相互作用
によって固相に捕獲される。あるいは、支持体に固定さ
れた相補的オリゴヌクレオチド配列によって捕獲される
オリゴヌクレオチドテイルを結合試薬に取り付けてもよ
い。国際特許出願第９５／２４６４９号公報参照。
【００１７】本発明では、固相上の“結合部位密度の調
節”とは、（ａ）固相に固定された結合試薬もしくは捕
獲試薬の密度を変えることによって直接的に固定化され
た結合部位を調節すること、および／または（ｂ）固相
に曝される可溶性の結合試薬もしくは捕獲試薬の濃度を
調節して、所定の時間に固定化される試薬の量を決定す
ること、および／または（ｃ）捕獲試薬または結合試薬
を固定することにあてられたインキュベーションの時間
を調節して、試薬の所定の体積当たりの固定量が用いら
れる場合に、固定化される試薬の分量を決定すること、
および／または（ｄ）試薬の全体、その機能フラグメン
ト、完全な分子もしくはそのフラグメントの重合集合体
等の試薬の価数を調節して結合部位の数を変えること、
の一つ以上を指す。
節”とは、（ａ）固相に固定された結合試薬もしくは捕
獲試薬の密度を変えることによって直接的に固定化され
た結合部位を調節すること、および／または（ｂ）固相
に曝される可溶性の結合試薬もしくは捕獲試薬の濃度を
調節して、所定の時間に固定化される試薬の量を決定す
ること、および／または（ｃ）捕獲試薬または結合試薬
を固定することにあてられたインキュベーションの時間
を調節して、試薬の所定の体積当たりの固定量が用いら
れる場合に、固定化される試薬の分量を決定すること、
および／または（ｄ）試薬の全体、その機能フラグメン
ト、完全な分子もしくはそのフラグメントの重合集合体
等の試薬の価数を調節して結合部位の数を変えること、
の一つ以上を指す。
【００１８】好ましくは、結合部位密度を調節する効果
は、アッセイの測定のダイナミックもしくはリニアレン
ジを変えること、および／または所定のレンジ内で感度
を改良することである。
は、アッセイの測定のダイナミックもしくはリニアレン
ジを変えること、および／または所定のレンジ内で感度
を改良することである。
【００１９】一つの好ましい方法では、結合部位密度
は、結合試薬もしくは捕獲試薬が支持体に固定化される
ときに調節される。慣例的に、この方法は、例えば調整
されたインクジェットプリンティングヘッドを用いて、
固相に結合試薬もしくは捕獲試薬を含む小滴をスプレー
し、試薬が固相表面に吸着されるように小滴を乾燥させ
ることによって行われる。結合試薬もしくは捕獲試薬の
密度は、小滴中の試薬濃度を変えることによって調節さ
れる。小滴中の試薬濃度を減少させた場合には、固相へ
の吸着を調節し、溶液中の試薬の安定化を助け、かつ／
または反応部位領域の飽和を確実にして、固相への非特
異的結合を低減するために、都合よく非反応性タンパク
質等の充填剤を溶液に添加する。
は、結合試薬もしくは捕獲試薬が支持体に固定化される
ときに調節される。慣例的に、この方法は、例えば調整
されたインクジェットプリンティングヘッドを用いて、
固相に結合試薬もしくは捕獲試薬を含む小滴をスプレー
し、試薬が固相表面に吸着されるように小滴を乾燥させ
ることによって行われる。結合試薬もしくは捕獲試薬の
密度は、小滴中の試薬濃度を変えることによって調節さ
れる。小滴中の試薬濃度を減少させた場合には、固相へ
の吸着を調節し、溶液中の試薬の安定化を助け、かつ／
または反応部位領域の飽和を確実にして、固相への非特
異的結合を低減するために、都合よく非反応性タンパク
質等の充填剤を溶液に添加する。
【００２０】例えば、種々のアッセイ特性を備えた複数
の反応部位を形成するために、種々の濃度の結合もしく
は捕獲試薬と固相とを接触させることにより、固相上の
種々の位置で異なるように、固相上の結合試薬もしくは
捕獲試薬の密度を任意に選択する。これによって、固相
を含むテストキャリアーを用いた所定のアナライトに決
定される作業レンジを広げることができる。かつ／また
は、上記方法は、異なるアナライトに特異的な結合部位
を備えた結合試薬が固相の別の位置に固定される固相を
構成するために用いることができる。
の反応部位を形成するために、種々の濃度の結合もしく
は捕獲試薬と固相とを接触させることにより、固相上の
種々の位置で異なるように、固相上の結合試薬もしくは
捕獲試薬の密度を任意に選択する。これによって、固相
を含むテストキャリアーを用いた所定のアナライトに決
定される作業レンジを広げることができる。かつ／また
は、上記方法は、異なるアナライトに特異的な結合部位
を備えた結合試薬が固相の別の位置に固定される固相を
構成するために用いることができる。
【００２１】本発明は、例えば、ミクロスポット等の一
つ以上の個々の反応部位の形態で固相上に固定される、
少量の結合が用いられるアッセイに特に利用できる。こ
のアッセイの形式は、多くのアナライトの濃度を同時に
測定するのに用いられ、かつ小型化できるので使用でき
る。
つ以上の個々の反応部位の形態で固相上に固定される、
少量の結合が用いられるアッセイに特に利用できる。こ
のアッセイの形式は、多くのアナライトの濃度を同時に
測定するのに用いられ、かつ小型化できるので使用でき
る。
【００２２】さらなる態様では、本発明は、上記方法の
いずれか一つによって得られる固体支持体を提供する。
いずれか一つによって得られる固体支持体を提供する。
【００２３】本発明では、結合試薬およびアナライトも
しくは捕獲試薬および結合試薬は、特定の方法で互いに
結合し得るあらゆる分子、すなわちリガンドとレセプタ
ーとして作用し得るあらゆる種とすることができる。
しくは捕獲試薬および結合試薬は、特定の方法で互いに
結合し得るあらゆる分子、すなわちリガンドとレセプタ
ーとして作用し得るあらゆる種とすることができる。
【００２４】典型的に、このようなリガンド−レセプタ
ー系の一方の部材は、高分子（レセプター等）であり、
かつ、他の部材は、ペプチド等の低分子量化合物、もし
くはハプテン等の２０００ダルトン未満の分子量の小さ
い有機化合物である。この種のリガンド−レセプター結
合対の例は、抗原と抗体、ホルモンとホルモンレセプタ
ー、およびビオチンと（ストレプト）アビジンである。
ー系の一方の部材は、高分子（レセプター等）であり、
かつ、他の部材は、ペプチド等の低分子量化合物、もし
くはハプテン等の２０００ダルトン未満の分子量の小さ
い有機化合物である。この種のリガンド−レセプター結
合対の例は、抗原と抗体、ホルモンとホルモンレセプタ
ー、およびビオチンと（ストレプト）アビジンである。
【００２５】あるいは、リガンド−レセプター系の両方
の化合物が高分子であってもよい。この種のリガンド−
レセプター相互作用の例は、ＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡと
ＲＮＡ、もしくはＤＮＡとＰＮＡのような合成物質間の
ハイブリダイゼーション反応である。糖とレクチンの相
互作用は、低分子化合物（例えばオリゴサッカリド）と
高分子化合物との相互作用から、二つの高分子化合物間
の相互作用（例えば、生きた細胞のグリコシル化された
外表面タンパク質へのレクチンまたはアグルチニンの結
合）のレンジにわたるものでもよい。
の化合物が高分子であってもよい。この種のリガンド−
レセプター相互作用の例は、ＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡと
ＲＮＡ、もしくはＤＮＡとＰＮＡのような合成物質間の
ハイブリダイゼーション反応である。糖とレクチンの相
互作用は、低分子化合物（例えばオリゴサッカリド）と
高分子化合物との相互作用から、二つの高分子化合物間
の相互作用（例えば、生きた細胞のグリコシル化された
外表面タンパク質へのレクチンまたはアグルチニンの結
合）のレンジにわたるものでもよい。
【００２６】あるいは、リガンド−レセプター系は、フ
ェニルボロン酸とサリチルヒドロキサム酸との特異的反
応等の、二つの低分子量物質の相互作用から構成されて
もよい。
ェニルボロン酸とサリチルヒドロキサム酸との特異的反
応等の、二つの低分子量物質の相互作用から構成されて
もよい。
【００２７】所定のアッセイを行う間に、結合試薬（レ
セプター）とアナライト（リガンド）との間の結合アッ
セイに多数の相互作用を生じることができる。これら
は、（ａ）固相上の捕獲試薬と結合試薬、（ｂ）結合試
薬とアナライト分子、（ｃ）アナライト分子と指示薬、
および（ｄ）指示薬と第二のシグナル試薬、の間の相互
作用を含んでもよい。
セプター）とアナライト（リガンド）との間の結合アッ
セイに多数の相互作用を生じることができる。これら
は、（ａ）固相上の捕獲試薬と結合試薬、（ｂ）結合試
薬とアナライト分子、（ｃ）アナライト分子と指示薬、
および（ｄ）指示薬と第二のシグナル試薬、の間の相互
作用を含んでもよい。
【００２８】発明のある実施態様では、特定の結合試薬
は、テストキャリアの固相、すなわちプラスチックもし
くはガラス表面上に物理的吸着によって直接固定されて
もよい。他の実施態様では、テストキャリアの表面を、
結合試薬と特異的に相互作用して結合することができる
捕獲試薬で被覆してもよく、捕獲試薬は、反応混合物中
に可溶化形態で導入され、続いてアッセイ工程の一部と
して固相に固定される。
は、テストキャリアの固相、すなわちプラスチックもし
くはガラス表面上に物理的吸着によって直接固定されて
もよい。他の実施態様では、テストキャリアの表面を、
結合試薬と特異的に相互作用して結合することができる
捕獲試薬で被覆してもよく、捕獲試薬は、反応混合物中
に可溶化形態で導入され、続いてアッセイ工程の一部と
して固相に固定される。
【００２９】
（実施例１）実験的に例証するために、全ｈＩｇＥのイ
ムノアッセイを選択した。方法の利点は上述したとおり
である。
ムノアッセイを選択した。方法の利点は上述したとおり
である。
【００３０】以下に例証されたアッセイは、一つもしく
はいくつかのスポット、すなわち小さな、空間的に隔離
された反応部位を備えた小型化された限定された試薬固
相を用いた。結合試薬と、ラベルとして用いられる蛍光
微小球（ラテックス・フルオロビーズ）を備えた指示薬
の両方に、モノクローナル抗体を用いた。指示抗体にラ
ベルを直接取り付けるか、指示抗体をジゴキシゲニル化
し、親和性を備えた純粋なポリクローナル抗ジゴキシゲ
ニンＩｇＧにラベルを接合してもよい。検出のために、
共焦点顕微鏡とＰＭＴ技術を利用したレーザースキャニ
ング装置を用いた。２つの反応ウェルを備えた小型化さ
れた黒色化ポリスチレンを、テストキャリアとして用い
た。
はいくつかのスポット、すなわち小さな、空間的に隔離
された反応部位を備えた小型化された限定された試薬固
相を用いた。結合試薬と、ラベルとして用いられる蛍光
微小球（ラテックス・フルオロビーズ）を備えた指示薬
の両方に、モノクローナル抗体を用いた。指示抗体にラ
ベルを直接取り付けるか、指示抗体をジゴキシゲニル化
し、親和性を備えた純粋なポリクローナル抗ジゴキシゲ
ニンＩｇＧにラベルを接合してもよい。検出のために、
共焦点顕微鏡とＰＭＴ技術を利用したレーザースキャニ
ング装置を用いた。２つの反応ウェルを備えた小型化さ
れた黒色化ポリスチレンを、テストキャリアとして用い
た。
【００３１】二つの異なる種類のミクロスポットが調査
された。最初に、噴射された誘導されていない抗体をテ
ストキャリアのプラスチック壁上に直接的に吸着させる
方法で５ｘ５スポットの並びを形成し、典型的なサンド
ウィッチ型アッセイの基盤を提供した。この場合、さら
に充填剤（すなわち、ダミータンパク質）を添加すると
否とによらず、噴射溶液中の特定の抗体の濃度を変える
ことによって、結合部位密度の調節を行った。このダミ
ータンパク質は、噴射装置の壁部に試薬が吸着すること
を妨げ、もしくは、溶液中の関心のある試薬を安定化す
る。
された。最初に、噴射された誘導されていない抗体をテ
ストキャリアのプラスチック壁上に直接的に吸着させる
方法で５ｘ５スポットの並びを形成し、典型的なサンド
ウィッチ型アッセイの基盤を提供した。この場合、さら
に充填剤（すなわち、ダミータンパク質）を添加すると
否とによらず、噴射溶液中の特定の抗体の濃度を変える
ことによって、結合部位密度の調節を行った。このダミ
ータンパク質は、噴射装置の壁部に試薬が吸着すること
を妨げ、もしくは、溶液中の関心のある試薬を安定化す
る。
【００３２】第二に、５ｘ５のスポットの並びを、後で
アッセイの間にビオチニル化抗体を固定するための反応
部位として作用する、熱処理したＢＳＡとストレプトア
ビジンの複合体を噴射することによって形成した。この
場合には、反応複合体の形成と複合体の固定が同時に起
こる。この形式のアッセイは、同時に遅延された固相型
アッセイと呼んでもよい。この場合、調節は、最初のイ
ンキュベーション工程で抗体の濃度を変えることによっ
て、もしくは、最初の工程のインキュベーション時間を
変えることによって行われた。さらに充填（ダミー）タ
ンパク質を添加すると否とによらず、再度このような操
作を行ってもよい。
アッセイの間にビオチニル化抗体を固定するための反応
部位として作用する、熱処理したＢＳＡとストレプトア
ビジンの複合体を噴射することによって形成した。この
場合には、反応複合体の形成と複合体の固定が同時に起
こる。この形式のアッセイは、同時に遅延された固相型
アッセイと呼んでもよい。この場合、調節は、最初のイ
ンキュベーション工程で抗体の濃度を変えることによっ
て、もしくは、最初の工程のインキュベーション時間を
変えることによって行われた。さらに充填（ダミー）タ
ンパク質を添加すると否とによらず、再度このような操
作を行ってもよい。
【００３３】異なる価数を備えた抗体もしくは抗体フラ
グメントの適用は、上記の両方の場合に適用でき、第二
のアプローチのこれらの研究の間に例証された。
グメントの適用は、上記の両方の場合に適用でき、第二
のアプローチのこれらの研究の間に例証された。
【００３４】用いられた用語の用語集 ｎ．ｄ．＝決定せず ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン Ｍａｂ＝モノクローナル抗体 Ｐａｂ＝ポリクローナル抗体 Ｆａｂ＝抗体の抗原結合フラグメント ｈＩｇＥ＝ヒトイムノグロブリンＥ ＜ｈＩｇＥ＞＝ｈＩｇＥに特異的に向けられた抗体 ＤＩＧ＝ジゴキシゲニン(digoxigenin) ＜ＤＩＧ＞＝ＤＩＧに特異的に向けられた抗体 ＡＶＧ＝複数回測定の平均値 ＳＤ＝複数回測定の平均値の標準偏差 ＬＤＤ＝最少検出可能量、すなわち分析感度 ＲＴ＝室温 Ｙ／Ｇ＝黄緑染料（分子プローブが所有する染料） λex＝蛍光染料の励起のためのピーク波長 λem＝蛍光染料から発せられるピーク波長
【００３５】（結果）直接吸着された抗体 テスト形式：５ｘ５スポットの直接吸着されたＭａｂ＜
ｈＩｇＥ＞Ｍ．３２３＋リン酸バッファーで１：２希釈
された、ウマ血清のミエローマＩｇＥ標準、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ 接合Ｍａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．７Ｈ８−ＣＯＯＨ−ラ
テックス（Ｙ／Ｇ）、０．０２５％固体、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） =＞ 測定（λex ４８５ｎｍ；λem ５３０ｎｍ）
ｈＩｇＥ＞Ｍ．３２３＋リン酸バッファーで１：２希釈
された、ウマ血清のミエローマＩｇＥ標準、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ 接合Ｍａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．７Ｈ８−ＣＯＯＨ−ラ
テックス（Ｙ／Ｇ）、０．０２５％固体、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） =＞ 測定（λex ４８５ｎｍ；λem ５３０ｎｍ）
【００３６】噴射溶液中の種々の濃度のＭａｂ＜ｈＩｇ
Ｅ＞Ｍ．３２３を用いて、任意蛍光単位(arbitrary flu
orescence units)（ＡＵ）で表される以下の添加量応答
を得た。
Ｅ＞Ｍ．３２３を用いて、任意蛍光単位(arbitrary flu
orescence units)（ＡＵ）で表される以下の添加量応答
を得た。
【表１】
【００３７】このデータからわかるように、１ｍｇ／ｍ
ｌのＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３２３を用いて、低いレン
ジの濃度で非常に敏感な（すなわち急勾配の）添加量応
答曲線が得られた。しかしながら、例えば成人（正常レ
ンジは１００Ｕ／ｍｌまで）と１０代（正常レンジは２
００Ｕ／ｍｌまで）のそれぞれに対してアレルギーと非
アレルギーとを区別するのに必要とされる中間および高
い側では、異なる標準をほとんど区別できなかった。し
かして、この曲線は最適であるとは明言できない。ま
た、この図は、噴射溶液中のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３
２３の濃度を０．１ｍｇ／ｍｌまで低減することが、助
けにならなかったことも示している。また、噴射溶液中
のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３２３を０．０１ｍｇ／ｍｌ
までさらに低減することによって、よりよいダイナミク
スがもたらされるが（標準Ｅ／Ｄ＝概算的にファクター
２、より高濃度を用いた実際に識別できないものと比
較）、シグナルレベルはかなり低くなり、より低い側で
は区別ができなくなる。さらに、充填剤が欠失すると、
一つのテストキャリアロットから他への再現性は、極め
て貧弱であった。
ｌのＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３２３を用いて、低いレン
ジの濃度で非常に敏感な（すなわち急勾配の）添加量応
答曲線が得られた。しかしながら、例えば成人（正常レ
ンジは１００Ｕ／ｍｌまで）と１０代（正常レンジは２
００Ｕ／ｍｌまで）のそれぞれに対してアレルギーと非
アレルギーとを区別するのに必要とされる中間および高
い側では、異なる標準をほとんど区別できなかった。し
かして、この曲線は最適であるとは明言できない。ま
た、この図は、噴射溶液中のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３
２３の濃度を０．１ｍｇ／ｍｌまで低減することが、助
けにならなかったことも示している。また、噴射溶液中
のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３２３を０．０１ｍｇ／ｍｌ
までさらに低減することによって、よりよいダイナミク
スがもたらされるが（標準Ｅ／Ｄ＝概算的にファクター
２、より高濃度を用いた実際に識別できないものと比
較）、シグナルレベルはかなり低くなり、より低い側で
は区別ができなくなる。さらに、充填剤が欠失すると、
一つのテストキャリアロットから他への再現性は、極め
て貧弱であった。
【００３８】これらの結果に続いて、０．０１−０．１
ｍｇ／ｍｌのレンジの噴射溶液中のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞
Ｍ．３２３の濃度を調べた。このレンジでは、１ｍｇ／
ｍｌの充填剤（ダミータンパク質）の存在下で、噴射溶
液中の０．０５ｍｇ／ｍｌのＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３
２３が最適であること、十分なシグナルレベルで臨床的
に関連のあるレンジの濃度全体にわたって良好に識別で
きる曲線、すなわち広いダイナミックレンジの測定に関
連する良好な分析感度を備えた曲線をもたらすことが解
った（図１および２を参照）。
ｍｇ／ｍｌのレンジの噴射溶液中のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞
Ｍ．３２３の濃度を調べた。このレンジでは、１ｍｇ／
ｍｌの充填剤（ダミータンパク質）の存在下で、噴射溶
液中の０．０５ｍｇ／ｍｌのＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３
２３が最適であること、十分なシグナルレベルで臨床的
に関連のあるレンジの濃度全体にわたって良好に識別で
きる曲線、すなわち広いダイナミックレンジの測定に関
連する良好な分析感度を備えた曲線をもたらすことが解
った（図１および２を参照）。
【００３９】
【表２】
【００４０】ストレプトアビジン被覆された反応部位に
おけるビオチニル化抗体の固定 テスト形式Ａ： ５ｘ５スポットの熱ＢＳＡストレプトアビジン接合体 ＋ リン酸バッファー中のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．７Ｈ
８（ＩｇＧ）ビオチニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）リン酸バッファーで１：２
希釈されたウマ血清のミエローマＩｇＥ標準、５０μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ ≧２μｇ／ｍｌ、５０μｌの、リン酸バッファー中
のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．０９０１８１３２−ジゴキシ
ゲニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ Ｐａｂ＜ＤＩＧ＞Ｓ（ＩｇＧ／ＩＳ）−ＣＯＯＨ−
ラテックス接合体（Ｙ／Ｇ）、０．０２５％固体、５０
μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） =＞ 測定（λex ４８５ｎｍ；λem ５３０ｎｍ）
おけるビオチニル化抗体の固定 テスト形式Ａ： ５ｘ５スポットの熱ＢＳＡストレプトアビジン接合体 ＋ リン酸バッファー中のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．７Ｈ
８（ＩｇＧ）ビオチニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）リン酸バッファーで１：２
希釈されたウマ血清のミエローマＩｇＥ標準、５０μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ ≧２μｇ／ｍｌ、５０μｌの、リン酸バッファー中
のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．０９０１８１３２−ジゴキシ
ゲニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ Ｐａｂ＜ＤＩＧ＞Ｓ（ＩｇＧ／ＩＳ）−ＣＯＯＨ−
ラテックス接合体（Ｙ／Ｇ）、０．０２５％固体、５０
μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） =＞ 測定（λex ４８５ｎｍ；λem ５３０ｎｍ）
【００４１】テスト形式Ｂ： ５ｘ５スポットの熱ＢＳＡストレプトアビジン接合体、 ＋リン酸バッファー中のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．３２３
（ＩｇＧ）−ビオチニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ リン酸バッファーで１：２希釈されたウマ血清のミ
エローマＩｇＥ標準、５０μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ ≧２μｇ／ｍｌ、５０μｌの、リン酸バッファー中
のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．７Ｈ８−ジゴキシゲニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ Ｐａｂ＜ＤＩＧ＞Ｓ（ＩｇＧ／ＩＳ）−ＣＯＯＨ−
ラテックス接合体（Ｙ／Ｇ）、０．０２５％固体、５０
μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） =＞ 測定（λex ４８５ｎｍ；λem ５３０ｎｍ）
（ＩｇＧ）−ビオチニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ リン酸バッファーで１：２希釈されたウマ血清のミ
エローマＩｇＥ標準、５０μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ ≧２μｇ／ｍｌ、５０μｌの、リン酸バッファー中
のＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ．７Ｈ８−ジゴキシゲニル化物 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） ＋ Ｐａｂ＜ＤＩＧ＞Ｓ（ＩｇＧ／ＩＳ）−ＣＯＯＨ−
ラテックス接合体（Ｙ／Ｇ）、０．０２５％固体、５０
μｌ =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離） =＞ 測定（λex ４８５ｎｍ；λem ５３０ｎｍ）
【００４２】ビオチニル化された全ＩｇＧの濃度の変化 テスト形式：０．０１−７．０μｇ／ｍｌのレンジでビ
オチニル化された固相抗体の種々の濃度を用いたこと以
外は、上述したとおりである。
オチニル化された固相抗体の種々の濃度を用いたこと以
外は、上述したとおりである。
【００４３】直接吸着では、限定されたダイナミックレ
ンジの測定に関して、スポットされたストレプトアビジ
ン固相と、ビオチニル化された抗体の固定とに最初に問
題が生じる。確かに、最初は、サンプル希釈して繰り返
し行われる試験の減少およびアレルギー反応の深刻さの
よりよい評価の両方に関して有利な、２０００Ｕ／ｍｌ
までの測定レンジの拡大がうまく行くとは思われなかっ
た。両方の形式（Ａ、Ｂ）で得られた典型的な結果（任
意蛍光単位、ＡＵで与えられたもの）は、以下の通りで
ある。
ンジの測定に関して、スポットされたストレプトアビジ
ン固相と、ビオチニル化された抗体の固定とに最初に問
題が生じる。確かに、最初は、サンプル希釈して繰り返
し行われる試験の減少およびアレルギー反応の深刻さの
よりよい評価の両方に関して有利な、２０００Ｕ／ｍｌ
までの測定レンジの拡大がうまく行くとは思われなかっ
た。両方の形式（Ａ、Ｂ）で得られた典型的な結果（任
意蛍光単位、ＡＵで与えられたもの）は、以下の通りで
ある。
【００４４】
【表３】
【００４５】最初に、１４５Ｕ／ｍｌのレベル以上で
は、我々が得た曲線は平らであり、測定レンジを頭打ち
にしている。
は、我々が得た曲線は平らであり、測定レンジを頭打ち
にしている。
【００４６】しかしながら、最適であることが判明した
０．０３μｇ／ｍｌの濃度に対する以下の表に示す通
り、決まったインキュベーション時間を維持しながら、
ビオチニル化捕獲抗体の濃度を希釈して結合部位密度を
調節することによって、添加量応答曲線のダイナミック
もしくはリニアレンジが実質的に広げられることを見出
した。
０．０３μｇ／ｍｌの濃度に対する以下の表に示す通
り、決まったインキュベーション時間を維持しながら、
ビオチニル化捕獲抗体の濃度を希釈して結合部位密度を
調節することによって、添加量応答曲線のダイナミック
もしくはリニアレンジが実質的に広げられることを見出
した。
【００４７】
【表４】
【００４８】ビオチニル化された全体のＩｇＧを用いた
インキュベーション時間の変化、ｃ＝一定 テスト形式：種々の反応物、すなわちビオチニル化固相
抗体、ジゴキシゲニル化指示抗体、および抗ジゴキシゲ
ニンラテックス接合体の反応に、種々のインキュベーシ
ョン時間（３−３９分／ＲＴ）を採用すること以外は、
上述の通りである。
インキュベーション時間の変化、ｃ＝一定 テスト形式：種々の反応物、すなわちビオチニル化固相
抗体、ジゴキシゲニル化指示抗体、および抗ジゴキシゲ
ニンラテックス接合体の反応に、種々のインキュベーシ
ョン時間（３−３９分／ＲＴ）を採用すること以外は、
上述の通りである。
【００４９】ここで、スタンダードＧ（２３００Ｕ／ｍ
ｌ）は、ビオチニル化固相抗体を０．０３μｇ／ｍｌ、
ジゴキシゲニル化指示抗体を２．０μｇ／ｍｌ、並びに
抗ジゴキシゲニンラテックス接合体を０．０２５％固形
分に、各反応物を決められた濃度に維持しながら、種々
の反応物に対する種々のインキュベーション時間の添加
量応答レベルへの影響を評価するためのサンプルとして
用いられた。
ｌ）は、ビオチニル化固相抗体を０．０３μｇ／ｍｌ、
ジゴキシゲニル化指示抗体を２．０μｇ／ｍｌ、並びに
抗ジゴキシゲニンラテックス接合体を０．０２５％固形
分に、各反応物を決められた濃度に維持しながら、種々
の反応物に対する種々のインキュベーション時間の添加
量応答レベルへの影響を評価するためのサンプルとして
用いられた。
【００５０】これらの実験の結果は、図５に例証されて
いる。これらの結果は、固相上の結合部位密度の変更、
すなわちインキュベーション時間を変えることにより結
合部位を備えた固定された反応物（Ｍａｂ＜ｈＩｇＥ＞
-ビオチン）の量を変えることによる調節が、添加量応
答を変更する最も効果的な手段であることを示してい
る。
いる。これらの結果は、固相上の結合部位密度の変更、
すなわちインキュベーション時間を変えることにより結
合部位を備えた固定された反応物（Ｍａｂ＜ｈＩｇＥ＞
-ビオチン）の量を変えることによる調節が、添加量応
答を変更する最も効果的な手段であることを示してい
る。
【００５１】結果的に、２０分のところを１０分のみの
インキュベーションにした場合には、反応物の体積当た
りの固定化量で、結合部位密度のさらなる希釈が用いら
れ、特に０−４５０Ｕ／ｍｌにおける直線性に顕著な変
化が生じ、標準濃度当たりの増加によって例証されてい
るように（標準Ｎ／標準Ｎ-１）、特に標準Ｄ／Ｃ、Ｅ
／Ｄ、およびＦ／Ｅのレンジにおける改善に注目すべき
である。
インキュベーションにした場合には、反応物の体積当た
りの固定化量で、結合部位密度のさらなる希釈が用いら
れ、特に０−４５０Ｕ／ｍｌにおける直線性に顕著な変
化が生じ、標準濃度当たりの増加によって例証されてい
るように（標準Ｎ／標準Ｎ-１）、特に標準Ｄ／Ｃ、Ｅ
／Ｄ、およびＦ／Ｅのレンジにおける改善に注目すべき
である。
【００５２】
【表５】
【００５３】この場合には、より低いシグナルレベルと
勾配の減少のために（リニアおよびダイナミック測定の
拡大されたレンジに有利になるように）、固相上の結合
部位密度の希釈を増すと、分析感度が減少してしまう。
勾配の減少のために（リニアおよびダイナミック測定の
拡大されたレンジに有利になるように）、固相上の結合
部位密度の希釈を増すと、分析感度が減少してしまう。
【００５４】しかしながら、良好な直線性と測定の広い
ダイナミックレンジを維持しながら、低減した感度を補
うため、すなわち、高い感度の目標を達成するために関
心の向けられた結合部位を備えた試薬の価数を調節する
ことができる。
ダイナミックレンジを維持しながら、低減した感度を補
うため、すなわち、高い感度の目標を達成するために関
心の向けられた結合部位を備えた試薬の価数を調節する
ことができる。
【００５５】種々の価数：全体のＩｇＧ−ビオチンをビ
オチニル化Ｆａｂ−フラグメントで置換 テスト形式：反応混合物中の同等の分子として、０．０
３μｇ／ｍｌのＩｇＧ（分子量 約１５００００ダルト
ン）の代わりに０．０１μｇ／ｍｌのＦａｂ（分子量
約５００００ダルトン）を用いるべきである。
オチニル化Ｆａｂ−フラグメントで置換 テスト形式：反応混合物中の同等の分子として、０．０
３μｇ／ｍｌのＩｇＧ（分子量 約１５００００ダルト
ン）の代わりに０．０１μｇ／ｍｌのＦａｂ（分子量
約５００００ダルトン）を用いるべきである。
【００５６】立体障害が増大する可能性から、特に立体
的に酷な微小球レベルと組み合わせた場合に、上述の目
的を達成するようにＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞（Ｆａｂ）の濃
度を増加させた。さらに、モノビオチニル化された一価
のＦａｂを用いて、結合部位を、最高レベルの純度と特
徴決定におけるアッセイに適用することができる。以下
の結果は、種々の濃度で得られた。
的に酷な微小球レベルと組み合わせた場合に、上述の目
的を達成するようにＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞（Ｆａｂ）の濃
度を増加させた。さらに、モノビオチニル化された一価
のＦａｂを用いて、結合部位を、最高レベルの純度と特
徴決定におけるアッセイに適用することができる。以下
の結果は、種々の濃度で得られた。
【００５７】
【表６】
【００５８】添加量応答曲線の変化は、二つの特定の点
の間の線形回帰から誘導された傾斜によって示される曲
線の勾配を示すデータを用いて以下に例証されている。
の間の線形回帰から誘導された傾斜によって示される曲
線の勾配を示すデータを用いて以下に例証されている。
【表７】
【００５９】しかして、０．１μｇ／ｍｌのＦａｂで、
標準曲線の下側で高い分析感度、および上側で良好なダ
イナミクスを示す曲線プロファイルが形成された。
標準曲線の下側で高い分析感度、および上側で良好なダ
イナミクスを示す曲線プロファイルが形成された。
【００６０】０．１μｇ／ｍｌのＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞７
Ｈ８（Ｆａｂ）-ビオチニル化物を用いた反復実験で
は、高い感度（０．０５Ｕ／ｍｌ）と測定の広いダイナ
ミックレンジ（濃度レベルでほぼ５ｘ１０4）の両方を
備えた、前記の好ましい曲線を再現することができた。
Ｈ８（Ｆａｂ）-ビオチニル化物を用いた反復実験で
は、高い感度（０．０５Ｕ／ｍｌ）と測定の広いダイナ
ミックレンジ（濃度レベルでほぼ５ｘ１０4）の両方を
備えた、前記の好ましい曲線を再現することができた。
【表８】
【００６１】熱ＢＳＡビオチンにスポットされたビオチ
ニル化抗体：ポリストレプトアビジン被覆 この種の固相は、特別な種類のストレプトアビジン層の
上に固定されたテスト特異的抗体（ビオチニル化物）の
小さいスポットを特徴とし、より簡単なテスト形式を提
供する（ストレプトアビジンスポットを用いた先の形式
の４工程に代わって３工程）。さらに、このアッセイ形
式は、テスト特異的個別反応部位により、多重アナライ
ト試験能力を提供する。
ニル化抗体：ポリストレプトアビジン被覆 この種の固相は、特別な種類のストレプトアビジン層の
上に固定されたテスト特異的抗体（ビオチニル化物）の
小さいスポットを特徴とし、より簡単なテスト形式を提
供する（ストレプトアビジンスポットを用いた先の形式
の４工程に代わって３工程）。さらに、このアッセイ形
式は、テスト特異的個別反応部位により、多重アナライ
ト試験能力を提供する。
【００６２】テスト形式：４ｘ４スポットの＜アナライ
ト＞抗体−ビオチン／０．５mg/ml ＢＳＡ−ビオチン
（＝充填タンパク質）＋サンプル（標準、リン酸バッフ
ァーに１：２希釈、５０μｌ） =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）＋リン酸バッファー中のＭ
ａｂ＜アナライト＞抗体−ジゴキシゲニン、≧１μｇ／
ｍｌ、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）接合Ｍａｂ＜ＤＩＧ＞Ｍ-
１９-１１（ＩｇＧ）-ＣＯＯＨ-ラテックス（Ｊｇ９
７）、０．０２５％固体、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）測定（λex ６３３ｎｍ；
λem ６６０ｎｍ）。
ト＞抗体−ビオチン／０．５mg/ml ＢＳＡ−ビオチン
（＝充填タンパク質）＋サンプル（標準、リン酸バッフ
ァーに１：２希釈、５０μｌ） =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）＋リン酸バッファー中のＭ
ａｂ＜アナライト＞抗体−ジゴキシゲニン、≧１μｇ／
ｍｌ、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）接合Ｍａｂ＜ＤＩＧ＞Ｍ-
１９-１１（ＩｇＧ）-ＣＯＯＨ-ラテックス（Ｊｇ９
７）、０．０２５％固体、５０μｌ。 =＞ 浸透させながら室温で２０分間インキュベート =＞ 洗浄（=ｂ／ｆ−分離）測定（λex ６３３ｎｍ；
λem ６６０ｎｍ）。
【００６３】（ａ）全ＩｇＥアッセイ ここで、固相抗体は、Ｍａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ- ７Ｈ８
（Ｆａｂ）-ビオチン、もしくはＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ
３２３-ビオチン（それぞれＩｇＧとＦａｂ）のいずれ
かである。標準は、ウマ血清マトリックス中のミエロー
マＩｇＥである。スポット溶液中の試薬濃度を変えて、
以下のデータ（任意蛍光単位で表示）を得た。
（Ｆａｂ）-ビオチン、もしくはＭａｂ＜ｈＩｇＥ＞Ｍ
３２３-ビオチン（それぞれＩｇＧとＦａｂ）のいずれ
かである。標準は、ウマ血清マトリックス中のミエロー
マＩｇＥである。スポット溶液中の試薬濃度を変えて、
以下のデータ（任意蛍光単位で表示）を得た。
【表９】
【００６４】
【表１０】
【００６５】
【表１１】
【００６６】実際には、標準Ｅ−Ｇのレンジにおけるダ
イナミクスと識別力は、１００μｇ／ｍｌのスポット溶
液の固相抗体を用いた場合には全く観察されなかった
が、１０μｇ／ｍｌを用いた場合には両方の基準が、非
常によくなっている。
イナミクスと識別力は、１００μｇ／ｍｌのスポット溶
液の固相抗体を用いた場合には全く観察されなかった
が、１０μｇ／ｍｌを用いた場合には両方の基準が、非
常によくなっている。
【００６７】しかして、上記結果は、この実施例におけ
る固相結合部位密度を調節することにより、より低い濃
度で優れた分析感度を維持しながら、より高い濃度での
アッセイ作業レンジが顕著に増大することを確認するも
のである。例えば、３０μｇ／ｍｌのＭａｂ＜ｈＩｇＥ
＞７Ｈ８（Ｆａｂ）-ビオチンを用いると、０−標準の
複数回の実験の平均より２ＳＤ高いことを基礎として、
Ａ−Ｂにおける線形回帰を用いて０．０１Ｕ／ｍｌ未満
のＬＤＤが得られ、その値は従来より一桁以上少ない。
添加量応答曲線の形における固相結合部位密度の変更効
果は、図６−８に例証されている。
る固相結合部位密度を調節することにより、より低い濃
度で優れた分析感度を維持しながら、より高い濃度での
アッセイ作業レンジが顕著に増大することを確認するも
のである。例えば、３０μｇ／ｍｌのＭａｂ＜ｈＩｇＥ
＞７Ｈ８（Ｆａｂ）-ビオチンを用いると、０−標準の
複数回の実験の平均より２ＳＤ高いことを基礎として、
Ａ−Ｂにおける線形回帰を用いて０．０１Ｕ／ｍｌ未満
のＬＤＤが得られ、その値は従来より一桁以上少ない。
添加量応答曲線の形における固相結合部位密度の変更効
果は、図６−８に例証されている。
【００６８】（ｂ）ＴＳＨアッセイ ここで、Ｍａｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ １．２０（Ｆａｂ’）2−
ビオチンは、固相抗体として用いられる。標準は、ＢＳ
Ａマトリックス中の異なる添加量のｈＴＳＨである。ス
ポット溶液中の試薬濃度を変えて、以下のデータ（任意
蛍光単位で表示）を得た。
ビオチンは、固相抗体として用いられる。標準は、ＢＳ
Ａマトリックス中の異なる添加量のｈＴＳＨである。ス
ポット溶液中の試薬濃度を変えて、以下のデータ（任意
蛍光単位で表示）を得た。
【表１２】
【００６９】しかして、この例は、テスト特異的固相結
合部位の希釈により、少しだけ特異的結合シグナルが犠
牲になる一方、標準の勾配が顕著に改善され、かつ非特
異的結合が顕著に低減されることを示す。
合部位の希釈により、少しだけ特異的結合シグナルが犠
牲になる一方、標準の勾配が顕著に改善され、かつ非特
異的結合が顕著に低減されることを示す。
【００７０】上記の例は、本願発明を例証するために与
えられているが、上記方法は、他の結合アッセイの最適
化にも、単独もしくは組み合わせて適用できる。
えられているが、上記方法は、他の結合アッセイの最適
化にも、単独もしくは組み合わせて適用できる。
【００７１】ここで言及した参照を、参照としてその全
体をここに取り込む。
体をここに取り込む。
【図１】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
【図２】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
【図３】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
【図４】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
【図５】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
【図６】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
【図７】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
【図８】実施例に記載されたアッセイで得られた添加量
応答曲線を示す。
応答曲線を示す。
Claims (20)
- 【請求項１】 アナライトに特異的な結合部位を備えた
結合試薬が用いられ、該結合試薬が固相に結合されてい
るか、もしくはアッセイ中に固相に固定され、固相上の
結合部位の密度を調節することを含むことを特徴とす
る、結合アッセイを最適化する方法。 - 【請求項２】 （ａ）固体支持体上のある一定の密度の
結合試薬に対する添加量応答曲線を調べる工程、（ｂ）
添加量応答曲線を変更するために固体支持体上の結合試
薬の密度を調節する工程、（ｃ）工程（ａ）および
（ｂ）を任意に繰り返す工程、および（ｄ）所望の形を
備えた添加量応答曲線を提供する結合試薬の密度を選択
する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 アッセイの作業レンジを広げ、かつ／ま
たは、所定のレンジ内でアッセイの精度を改善するため
にアッセイを最適化することを特徴とする、請求項１ま
たは２記載の方法。 - 【請求項４】 結合試薬を、直接吸着によって固相上に
固定化することを特徴とする、請求項１ないし３のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 固相が結合試薬を捕獲することができ、
結合試薬がアッセイを行う前に支持体に結合されるよう
に、固相を活性化し、結合試薬に機能を付与することを
特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項６】 固相が結合試薬を捕獲することができ、
結合試薬がアッセイ中に固体支持体上に結合されるよう
に、固相を活性化し、結合試薬に機能を付与することを
特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項７】 固相の全てもしくは一部をストレプトア
ビジンもしくはアビジンで被覆することによって固相を
活性化し、かつ結合試薬にビオチンを取り付けることに
よって結合試薬に機能を付与することを特徴とする、請
求項５または６記載の方法。 - 【請求項８】 固相の全てもしくは一部をビオチンで被
覆することによって固相を活性化し、かつ結合試薬にア
ビジンもしくはストレプトアビジンを取り付けることに
よって結合試薬に機能を付与することを特徴とする、請
求項５または６記載の方法。 - 【請求項９】 結合試薬を液体キャリア中の固相に添加
し、結合部位の密度を、液体キャリア中の結合試薬の濃
度を変えることによって調節することを特徴とする、請
求項１ないし５、７および８のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項１０】 結合試薬を含む小滴を固相上にスプレ
ーすることによって結合試薬を固定化し、結合試薬を含
む小滴の濃度および／または量を変えることによって固
相上の結合部位の密度を調節することを特徴とする、請
求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 小滴が、インクジェットプリンターを
用いて固相に適用されることを特徴とする、請求項９ま
たは１０記載の方法。 - 【請求項１２】 液体キャリアが、不活性な充填剤を含
むことを特徴とする、請求項９ないし１１のいずれか一
項に記載の方法。 - 【請求項１３】 固相上の結合部位の密度を、結合試薬
が固相に曝されるインキュベーション時間を変えること
によって調節することを特徴とする、請求項１ないし８
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 固相上の結合部位の密度を、結合試薬
の価数を変えることによって調節することを特徴とす
る、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１ないし４および９ないし１４
のいずれか一項に記載の最適化方法に次いでアッセイキ
ットを製造する方法であって、前記最適化方法を用いて
決定された結合部位の密度になるようにアナライトに特
異的な結合部位を備えた結合試薬を固相に固定化するこ
とを含むことを特徴とする、アッセイキットの製造方
法。 - 【請求項１６】 請求項１ないし３および５ないし１４
のいずれか一項に記載の最適化方法に次いでアッセイキ
ットを製造する方法であって、前記最適化方法を用いて
決定された結合部位の密度になるように、アッセイの前
もしくは最中にアナライトに特異的な結合部位を備えた
誘導された結合試薬が結合できる、機能が付与された固
相を製造することを含むことを特徴とする、アッセイキ
ットの製造方法。 - 【請求項１７】 固相上の隔離された複数の位置に、結
合試薬が固定されているか、もしくはアッセイ中に固定
されることを特徴とする、請求項１５または１６記載の
方法。 - 【請求項１８】 種々のアナライトに特異的な結合部位
を備えた結合試薬が、固相に固定されているか、もしく
はアッセイ中に固定されることを特徴とする、請求項１
７記載の方法。 - 【請求項１９】 所定のアナライトに対して種々の密度
の結合部位を提供する複数の位置に、結合試薬が固定さ
れているか、もしくはアッセイ中に固定されることを特
徴とする、請求項１７または１８記載の方法。 - 【請求項２０】 （ａ）結合部位のフラクションが、サ
ンプル中のアナライトに占有されるように固相を液体サ
ンプルと接触する工程、（ｂ）アナライトに占有された
結合部位のフラクションを示すシグナルの値を測定する
工程、および（ｃ）液体サンプル中のアナライトの濃度
を決定するために、前記測定値を添加量応答曲線と比較
する工程を含むことを特徴とする、請求項１５ないし１
９のいずれか一項に記載の方法で製造されたアッセイキ
ットを使用する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9602323.9A GB9602323D0 (en) | 1996-02-06 | 1996-02-06 | Materials and methods relating to binding assays |
| GB9602323.9 | 1996-02-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09325149A true JPH09325149A (ja) | 1997-12-16 |
Family
ID=10788158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9024180A Withdrawn JPH09325149A (ja) | 1996-02-06 | 1997-02-06 | 結合アッセイに関する材料および方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5830762A (ja) |
| EP (1) | EP0789242A2 (ja) |
| JP (1) | JPH09325149A (ja) |
| GB (1) | GB9602323D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001061353A1 (fr) * | 2000-02-21 | 2001-08-23 | Takara Bio Ltd. | Procede de detection d'une substance a analyser |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7167615B1 (en) | 1999-11-05 | 2007-01-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Resonant waveguide-grating filters and sensors and methods for making and using same |
| US6399295B1 (en) | 1999-12-17 | 2002-06-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Use of wicking agent to eliminate wash steps for optical diffraction-based biosensors |
| US20040058385A1 (en) * | 2000-11-17 | 2004-03-25 | Abel Andreas Peter | Kit and method for determining multiple analytes, with provisions for refrencing the density of immobilised recognition elements |
| FI20002623A (fi) * | 2000-11-30 | 2002-05-31 | Inno Trac Diagnostics Oy | Bioanalyyttinen määritysmenetelmä |
| US7214530B2 (en) | 2002-05-03 | 2007-05-08 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Biomolecule diagnostic devices and method for producing biomolecule diagnostic devices |
| US7771922B2 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-10 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Biomolecule diagnostic device |
| US20050163659A1 (en) * | 2002-05-13 | 2005-07-28 | Zeptosens Ag | Kit for assay development and serial analysis |
| US20040209294A1 (en) * | 2002-09-02 | 2004-10-21 | National Food Research Institute | Method to produce a receptor chip using biotinylated protein |
| US20050112703A1 (en) | 2003-11-21 | 2005-05-26 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Membrane-based lateral flow assay devices that utilize phosphorescent detection |
| US7439079B2 (en) * | 2005-04-29 | 2008-10-21 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Assay devices having detection capabilities within the hook effect region |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8803000D0 (en) * | 1988-02-10 | 1988-03-09 | Ekins Roger Philip | Determination of ambient concentrations of several analytes |
| ATE161964T1 (de) * | 1991-10-15 | 1998-01-15 | Multilyte Ltd | Bindungstest unter benutzung eines markierten reagens |
| DE4202850A1 (de) * | 1992-01-31 | 1993-08-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Analysenelement fuer immunoassays |
-
1996
- 1996-02-06 GB GBGB9602323.9A patent/GB9602323D0/en active Pending
-
1997
- 1997-02-05 EP EP97300716A patent/EP0789242A2/en not_active Withdrawn
- 1997-02-06 JP JP9024180A patent/JPH09325149A/ja not_active Withdrawn
- 1997-02-06 US US08/796,806 patent/US5830762A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001061353A1 (fr) * | 2000-02-21 | 2001-08-23 | Takara Bio Ltd. | Procede de detection d'une substance a analyser |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB9602323D0 (en) | 1996-04-03 |
| EP0789242A2 (en) | 1997-08-13 |
| US5830762A (en) | 1998-11-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20040406 |