JP3672991B2 - イムノアッセイにおける検量方法及び患者体液の試験方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、乾式スライド試験要素を用いた妨害因子(特にヘモグロビン)の影響を受けやすいイムノアッセイの検量及び試験方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
通常、イムノアッセイは速度検定として行われる、すなわち、時間経過による変化の割合、例えば色素濃度の増加速度又は低下速度として測定される。この色素による化学的方法は、例えば、酵素を利用してロイコ色素を触媒反応により着色色素へ変換する方法とすることができる。このためによく用いられる種類の酵素はオキシダーゼ、好ましくはペルオキシダーゼ(又はPOD)である。該ペルオキシダーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼ(以降、HRPと称する)であることが最も好ましい。
イムノアッセイには、過剰量のPODを使用することができる他のアッセイとは異なり、限られた量のPODを測定する方法がある。(過剰量によればPODに類似する又はこれと反応する妨害因子(interferent) に対する感受性は比較的低下することは当然である。)通常、イムノアッセイは「競争法」又は「サンドイッチ法」のいずれかで行われる。「競争法」では、測定すべき標的アナライトの標識化類似体を、該標的アナライト又は標的アナライト類似体のいずれかと反応しうる一定量の適当な固定化抗体に対し、該アナライトと競争するように配する。該類似体上の標識は、「遊離した」形でも、また複合化された(すなわち、反応した)形でも、いずれにおいても適宜検出することができる。そうすると、その信号の大きさによって、試験した試料中の標的アナライトの量がわかる。
【0003】
別のイムノアッセイ様式である「サンドイッチ」イムノアッセイ又はイムノメトリックアッセイでは、標的アナライトを、該標的アナライトの異なるエピトープ部位に結合する2種以上のレセプター分子、例えば抗体、と接触させる。レセプター分子の一方を適当に標識化しておき、もう一方を固体支持体に固定化しておくか又はそれに固定化できるようにしておくことが典型的である。標的アナライトの量は、標的アナライトと2種のレセプターとの間で結合された複合体の量に直接比例する。
これらのアッセイのいずれの場合も、HRPを使用する場合にはこれが「標識」の一部となる。このため、イムノアッセイでは、過剰量のHRPを存在させることにより妨害因子の存在による変化を克服することはできない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
当該技術分野では、このようなペルオキシダーゼによる化学的方法は、イムノアッセイに採用した場合、ヘモグロビンのような物質によって妨害を受けることが知られている。すなわち、ヘモグロビンがいくらかでも存在すると、多かれ少なかれ偏り(bias)の原因となる。液体によるイムノアッセイでは、通常この偏りを希釈によって補正する。しかしながら、スライド試験要素を用いる場合には、このような希釈による補正を利用することができない。その理由は、手順を複雑にし、誤差を追加し、また元来低濃度の特定のアナライトの濃度をさらに低下させるからである。血液試料中にはヘモグロビンが未知量で存在する場合が多く、このようなイムノアッセイにおいてヘモグロビンによる予想できない偏りを何とか補正することが、長年にわたる課題であった。確かに、ヘモグロビンの(もしあれば)存在量を最初に確認しておけば補正は可能であるが、この確認をイムノアッセイの実施前に行いたいと思う実験者はほとんどいない。
【0005】
【課題を解決するための手段】
我々は、ヘモグロビンによる妨害の特性をいくつか発見し、このおかげで上記の問題を解決することができた。すなわち、我々が発見した点は、(1)一定濃度のヘモグロビンのような妨害因子の影響速度、すなわち偏り効果が、アナライトの濃度に依存して変動する点と、(2)特定量の標的アナライトと一定量の、例えば250mg/dlの妨害因子、例えばヘモグロビンとによって発生する信号の変化速度が、同量の標的アナライトと零量の妨害因子(ヘモグロビン)とによって発生する信号の速度変化よりも迅速に、時間と共に低下する点である。後者の意味するところは、我々は、任意量のすべてのイムノアッセイのアナライトについて、ヘモグロビンによる偏りが零又は最小定常状態になる、後に定義する時間の交差点(cross-over point)が存在することを発見したということである。とりわけ、本発明を成すに至ったものは後者の交差時間である。
【0006】
より具体的には、本発明の一態様によると、基質と所定の限定された量で存在するペルオキシダーゼとを含み検出可能な濃度変化を異なる速度で生ぜしめる検出試薬を含有する乾式試験要素を用いてイムノアッセイを実施する場合に特定の妨害因子によって引き起こされる偏りを減少させる方法が提供される。本発明の方法は、
(a)既知量の特定の妨害因子と既知量の標的アナライトを含む少なくとも1種の液体と接触した該標的アナライトに対する第一組の試験要素が生ぜしめる濃度変化の速度が、既知量の標的アナライトを含むが妨害因子は無視できる量でしか存在しない液体と接触した、前記第一組の試験要素と実質的に同等である第二組の試験要素が生ぜしめる濃度変化の速度と、交差するか又は差が最小になる時間を確定することによって、標的アナライトのイムノアッセイを検量する工程と、
(b)工程(a)で確定した交差時間に対応する時間において、前記第一組又は第二組の試験要素のうちの選ばれた要素と接触する該試料によって引き起こされる該選ばれた要素における変化速度を読み取ることによって、患者試料の未知量の標的アナライトの検定を実施する工程とを含む。
【0007】
別の態様によると、西洋ワサビペルオキシダーゼと基質を用いて経時変化する色素濃度を生ぜしめるイムノアッセイにおいて標的アナライトを試験するための検量値におけるヘモグロビンによる偏りを減少させる検量方法が提供される。この方法は、
(a)同組成の複数のスライド試験要素の一部を用いて複数の時間について、予め選定した異なる2種の既知量の標的アナライトと零量のヘモグロビンとを含む少なくとも2種の液体によって得られる色素濃度の変化速度を確定する工程と、
(b)同組成のさらに別のスライド試験要素を用いて複数の時間について、前記少なくとも2種の液体のいずれにも同等に予め選定した無視できない量のヘモグロビンを加えた少なくとも2種の液体によって得られる色素濃度の変化速度を確定する工程と、
(c)前記無視できない量のヘモグロビンを含有する前記少なくとも2種の液体についての変化速度が、対応するヘモグロビンを含まない2種の液体についての変化速度と交差する又は差が最小になる時間点を求めることにより、偏りが最も少ない交差時間を得る工程と、
(d)前記少なくとも2種の液体の一方について、これに対応する初期の変化速度を示す後の試料液の試験のための最適読取り時間として、前記交差時間を選定する工程とを含む。
【0008】
本発明のさらに別の態様によると、西洋ワサビペルオキシダーゼとロイコ色素を用いて経時変化する色素濃度を生ぜしめるイムノアッセイにおいて患者体液を標的アナライトについて試験するためのヘモグロビンによる偏りを減少する方法が提供される。この方法は、
(a)上記した検量方法により算出された最適読取り時間として定めた少なくとも一つの交差時間点を有する分析装置において、特定の患者体液の未知量のアナライトについて濃度の経時変化の速度を確定する工程と、
(b)前記定めた交差時間のいずれよりも以前に固定した時間点を初期読取り時間として選定する工程と、
(c)工程(a)で確定した値から工程(b)で選定した時間点に対する初期速度を確定する工程と、
(d)工程(c)で確定した初期速度に対して、該初期速度に対応する最適交差読取り時間を確定する工程と、
(e)工程(a)で測定した速度から、前記最適読取り時間における患者試料の変化速度を確定する工程とを含む。
【0009】
以下の議論は特定の好ましい実施態様に関するものであり、x量の標的アナライトと無視できない量のヘモグロビンとを含む第一の液体と、前記x量の標的アナライトと零量のヘモグロビンとを含む第二の液体とについて、交差時間を確定するものである。さらに、本発明は、ヘモグロビン以外の妨害因子については、或いは第二の液体が無視できる量の(本明細書中では0〜50mg/dlを意味する)ヘモグロビンを有し且つ、これら2種の液体がそれらの速度が正確に同等になる時間には到達しない場合には、有用である。このように、本明細書中の用語「交差」とは、それぞれ2種の液体を有するスライド試験要素の変化速度が実質的に同等である場合、又はそれらが偏りが最小である最小差定常状態に最初に到達した場合の、極低濃度の標的アナライトに対して特に起こりうる状態を意味する。
【0010】
さらに、好ましい実施態様によるアッセイは、特定のイムノアッセイに対する色素濃度の変化速度が特に好ましいアナライトについて示したように経時低下し、且つその最適読取り時間値が、ヘモグロビン濃度が既知の3種の検量液体から得られた二つより多い、すなわち三つの交差点を用いて決定される連続した多項式曲線として示されることを特徴とする。さらに、本発明は、アナライトの種類とは無関係に、また最適読取り時間が、検量体の二つより多い交差点又は二つだけから得られたそれぞれ多項式関数又は線形関数として計算されたグラフプロット又は参照用テーブルであるかには関係なく、イムノアッセイ化学法がPODを使用して色素濃度を生ぜしめる限り、サンドイッチ法及び競争法のイムノアッセイに有用である。
【0011】
こうして、本発明は、ヘモグロビンによる偏りを補正した特に好ましいイムノアナライト、すなわちフェニトイン及びジゴキシンについて記載する。他の妨害因子による偏りについては、その妨害因子(以降、「特定の妨害因子」と称する)によって、その無視できる量と無視できない量との両方で試験した場合に変化速度測定値の本明細書で定義する交差時間点が得られるならば、同様に減少させることができる。このような妨害因子の別の例として、ゲンチシン酸、アスコルビン酸、ジピロン、等の還元性試薬が含まれる。
フェニトイン及びジゴキシンのアッセイに好適なスライド試験要素には、下記のものが含まれる。
【0012】
ジゴキシンを検出するためのスライド試験要素
ジゴキシンを検出するための要素を、従前はイーストマン・コダック社に属していたクリニカル・ダイアグノスティックス・ディビジョンから商品名「Ektachem」(登録商標)で市販されているスライド試験要素の常用の手順と一般構造を採用し、但し以下の塗布組成によって作製した。以下に詳細に記載するグラビア及びレセプターコーティングは、多孔質展開コーティング中に拡散し、乾式多孔質展開層の境界付近に別の区域を形成した。
要素の構造:( )内は乾燥被覆量(g/m2 )
【0013】
〔グラビアコーティング〕
ジゴキシン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(6×10-6)
牛血清アルブミン(2.15×10-4)
3’,5’−ジクロロ−4’−ヒドロキシアセトアニリド(9.95×10-3)
3−(N−モルフォリノ)−プロパンスルホン酸緩衝剤(pH7)(4.50×10-3)
TRITON(商品名)X−100非イオン性界面活性剤(4.30×10-3)
ポリアクリルアミド(1.08×10-3)
4,5−ジヒドロキシ−3−(6,8−ジスルホ−2−ナフチルアゾ)−2,7−ナフタレンジスルホン酸ナトリウム(5.38×10-2)
【0014】
〔展開層〕
ポリ(ビニルトルエン−コ−メタクリル酸)(重量比98:2)ビーズ(平均粒径30μm)(130)
ポリ(アクリル酸メチル−コ−2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−2−アセトアセトキシエチルメタクリレート)(重量比90:4:6)(2.583)
N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸緩衝剤(pH7)(0.219)
ジメドン(0.45)
4,5−ビス(4−ジメチルアミノフェニル)−2−(3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシフェニル)−イミダゾール系ロイコ色素(0.2)
3’,5’−ジクロロ−4’−ヒドロキシアセトアニリド(0.22)
牛血清アルブミン(1.0)
マンニトール(1.0)
硫酸バナジル(0.04)
グリセロール(2.0)
ポリ〔スチレン−コ−p−(2−クロロエチル−スルホニルメチル)スチレン(重量比95:5)ビーズ(平均粒径0.5μm)に共有結合させた抗ジゴキシンモノクローナル抗体(0.015)
【0015】
〔試薬層コーティング〕
硬膜ゼラチン(10.15)
N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸緩衝剤(pH7)(4.58)
TRITON(商品名)X−100非イオン界面活性剤(0.02)
3’,5’−ジクロロ−4’−ヒドロキシアセトアニリド(0.44)
〔ポリ(エチレンテレフタレート)支持体〕
【0016】
ジフェニルヒダントイン(フェニトイン)を検出するためのスライド試験要素
上記のジゴキシン用要素と類似した、但しジフェニルヒダントインの検出に適した試薬を有する要素を作製した。これらの要素は常用の方法と装置により塗布し、以下の基本的塗布組成と構造を有するものとした。
要素の構造:( )内は乾燥被覆量(g/m2 )
【0017】
〔グラビアコーティング〕
ジフェニルヒダントイン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(6×10-6)
牛血清アルブミン(2.15×10-4)
3’,5’−ジクロロ−4’−ヒドロキシアセトアニリド(9.95×10-3)
3−(N−モルフォリノ)−プロパンスルホン酸緩衝剤(pH7)(4.50×10-3)
TRITON(商品名)X−100非イオン性界面活性剤(4.30×10-3)
ポリアクリルアミド(1.08×10-3)
4,5−ジヒドロキシ−3−(6,8−ジスルホ−2−ナフチルアゾ)−2,7−ナフタレンジスルホン酸ナトリウム(5.38×10-2)
【0018】
〔展開層〕
ポリ(ビニルトルエン−コ−メタクリル酸)(重量比98:2)ビーズ(平均粒径30μm)(130)
ポリ(アクリル酸メチル−コ−2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−2−アセトアセトキシエチルメタクリレート)(重量比90:4:6)(2.583)
N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸緩衝剤(pH7)(0.219)
Olin界面活性剤10G非イオン界面活性剤(0.238)
ジメドン(0.45)
3’,5’−ジクロロ−4’−ヒドロキシアセトアニリド(0.22)
牛血清アルブミン(1.0)
マンニトール(1.0)
硫酸バナジル(0.04)
グリセロール(2.0)
【0019】
〔レセプター層〕
ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−コ−2−ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−N,N’−メチレンビスアクリルアミド)(重量比85:10:5)(0,5)
4,5−ビス(4−ジメチルアミノフェニル)−2−(3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシフェニル)−イミダゾール系ロイコ色素(0.2)
N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸緩衝剤(pH7)(0.1)
TRITON(商品名)X−100非イオン界面活性剤(0.02)
TETRONIC(商品名)T908非イオン界面活性剤(0.02)
Olin界面活性剤10G非イオン界面活性剤(0.01)
ジメドン(0.05)
ポリ〔スチレン−コ−p−(2−クロロエチル−スルホニルメチル)スチレン(重量比95:5)ビーズ(平均粒径1.0μm)に共有結合させた抗ジフェニルヒダントインモノクローナル抗体(0.015)
【0020】
〔試薬層〕
硬膜ゼラチン(10.15)
N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸緩衝剤(pH7)(4.58)
TRITON(商品名)X−100非イオン界面活性剤(0.02)
3’,5’−ジクロロ−4’−ヒドロキシアセトアニリド(0.44)
〔ポリ(エチレンテレフタレート)支持体〕
【0021】
従来技術
ここで図1を参照するが、従来技術(ほとんどが溶液アッセイである)では、曲線10A対曲線10B、又は曲線20A対曲線20Bに示されるように、ヘモグロビン妨害因子の存在によって「正」の偏りが発生していることがわかる。(曲線20Aと10Aとの違いは、曲線20Aは、曲線10Aのアナライト存在量の2倍のアナライトが存在した場合の速度のプロットである点のみである。)しかしながら、これらの曲線はT=T1 まで追跡されているだけであり、その間の曲線10Aと曲線10Bは本質的に相互平行であり、また曲線20Aと曲線20Bも本質的に相互平行である(競争アッセイにおいて)。
【0022】
本発明
我々は、ジゴキシンやフェニトインを標的としたような、乾式スライド試験要素を用いたある種のペルオキシダーゼを利用した標的イムノアッセイについて、速度の実験を時間T>T1 まで行うと、対をなした曲線が交差時間T2 又はT3 (但し、T2 及びT3 >T1 )に向かって集中することがわかった。例えば、図2では、曲線10A’は時間T2 において曲線10B’の速度と実質的に等しくなり、また曲線20A’は時間T3 において曲線20B’の速度と実質的に等しくなる。(これらの場合、「交差」は実質的に等しい点となるが、本明細書中既に記載したように、「交差」は定常状態の差が最小である時点であってもよい。)図1の場合と同様、曲線10A’と曲線20A’には、明確に定められた量、例えば250mg/dLのヘモグロビン妨害因子がそれぞれに存在しており、一方、曲線10B’と曲線20B’にはまったく存在していない。曲線20A’と曲線20B’は、曲線10A’と曲線10B’のアナライト量の2倍のアナライト量を示すものである。
【0023】
この図2の交差現象は、もちろん、この特定濃度、例えば曲線10A’及び曲線10B’の1倍量の標的アナライトについては、ヘモグロビンによる偏りが最小となる点であって、未知試料の速度を読み取るべき最適な時点である。もちろん、アナライト濃度もヘモグロビンの量も前もってはわからないので、本発明の残りの手順は、読取りの「最適」時間が、標的アナライトの正確な量に対する交差時間と正確には同じにならない場合にこれに近づくように選定する手順である。こうして、ヘモグロビン由来の偏りが最小限に抑えられる。
【0024】
次に図3を参照しながら、本発明の検量部分を説明する。検量は、常用の手法に従い、同じ標的免疫アナライト用、例えばジゴキシン用のすべて実質的に同等な一組のスライド試験要素を用意し、そして分析装置で、濃度の異なる(C1 、C2 及びC3 )標的免疫アナライトを含む二つ又は三つの検量液を試験し、前記試験要素組の一部を用いてそれらの経時変化の速度を求める。この試験により図3の曲線30B、40B及び50Bがそれぞれ得られる。これらの液体は無視できる量、例えば、零量のヘモグロビンを含むものである。
【0025】
本発明の一態様によると、その検量手順には、この他に、同じ分析装置で前記組合せのスライド試験要素の他方を用い、濃度C1 、C2 及びC3 をそれぞれ有し且つ無視できない量、例えば250mg/dLのヘモグロビンを含む検量液を使用して、曲線30A、40A及び50Aを確定する工程が加わる。(便宜上、このヘモグロビンの無視できない量はこれらのさらに別の検量液のすべてについて同量としているが、必ずしもその必要はない。すなわち、あるものを250mg/dLとし、別のものを200mg/dLとしてもよい。)後に説明する「最適」交差点のプロット60は、この場合垂直ではないので、少なくとも2組の速度曲線、すなわち、30A、30Bと40A、40Bの両組、又は30A、30Bと50A、50Bの両組、又は40A、40Bと50A、50Bの両組、を確定することが好ましい。図3に示したように曲線60が線形にならない場合を考慮して、3組すべての曲線又はデータ点を確定することが最も好ましい。(直線は、このような曲線が2組だけあれば適切に規定できる。)
【0026】
曲線30A、30Bと40A、40Bと50A、50Bについてデータ点を確定したならば、次の工程は、それぞれの曲線組がその交差時間に到達する時間点を求めることである。図3では、それらは、ある組の中で変化速度(点P2 、P3 及びP4 で示す)が実質的に等しくなる時点であって、それぞれ時間T2 、T3 及びT4 である。これらの時間は、試料液中の特定の濃度の免疫アナライトに対する、このような濃度が既知であるか又は概算できた場合の、各々の最適読取り時間である。すなわち、本発明は、これらの交差点のうち対応するアナライト濃度の交差点を一つだけ選ぶことにより、別のアナライト濃度において用いられる読取り時間とは無関係に、実施することができる。
【0027】
最も好ましくは、交差点の試験を二つや三つだけで行うのではなく、これらの点の間やその外側で、例えばさらに初期の時間において外挿を行い、図3の曲線60を作成することである。すなわち、次の工程は、C1 、C2 及びC3 以外のアナライト濃度について対応する交差時間点を算出することである。これは、もちろん、点P2 、P3 及びP4 に最もよく適合する曲線を得ることにより、その他の交差点を内挿することによって行われる。一般に、このような曲線は、多項式:(最適読取り)時間=A0 +A1 ・速度+A2 ・(速度)2 〔但し、A0 、A1 、A2 は定数である。〕によって特徴付けられる。データ点が、例えばP2 とP3 、P2 とP4 又はP3 とP4 のように二つしかない場合には、この曲線は式:時間=A0 +A1 ・速度の直線になる。曲線60は、その形状に係わらず、定められた交差時間点を表し、これによって、濃度及びヘモグロビン含有量が未知である患者試料を後に試験するための最適読取り時間の一覧表を作成することができる。
【0028】
本発明の別の態様によると、図4に示した曲線60を用いて、このような患者試料の試験が行われる。
前記の同じスライド試験要素の組の別のものを使用し、患者試料を付着させ、検量時と同じ種類の分析装置で変化速度を検出する。少なくとも時間T(初期)から時間T(最終)にかけて、曲線S(「試料」用)で表される広範囲のデータ点の組を確定する。読取り時間の初期範囲に含まれる(例、最初の30秒間の平均)固定時間T(初期)において、その試料について対応する変化速度R(初期)を確定する。そのR(初期)の値から、曲線60上の対応する最適読取り時間T(最適読取り)を選定する(矢印100)。次いで、その最適読取り時間に対応する曲線S上の点から、その最適時間における「最終の」変化速度を確定し(矢印200)、その後、常套手法により(検量表から)濃度値へ変換する。
【0029】
別法として、T(初期)を、これをすべてのアッセイを通して使用する場合には、曲線60によって包含される時間の中で決めてもよい。
ヘモグロビンによる偏りを最小限に抑えるものが読取り時間であることが、図3中の点線曲線S’としてプロットした仮想例からわかる。実際にそのアナライト濃度を、曲線40Bに近い位置にあるC2 と仮定する。時間T(初期)において、初期速度を確定する(矢印300)。これにより、曲線60上で最適読取り時間T(最適)が得られ、次いで曲線S’から矢印302で示したように最終速度R(最終)が得られる。しかしながら、この値は、ヘモグロビンによる偏りが皆無である最終速度ではない。というのは、偏りが零の最終速度の読みは、R(最終)より上にあるR(最適)であるからである。R(最適)は、もちろん、曲線Sが曲線40Bと交差する実際の交差点PS に対応する値である。にもかかわらず、このR(最終)の値は、曲線S’から選定されうる他の大部分の読み、例えばT(不良)における読みよりも、はるかにR(最適)に近い値となる。
【0030】
ある特定の標的免疫アナライトに対する最適読取り時間曲線60が垂直又は実質的に垂直である場合には、そのアナライトのすべてのアッセイに用いるための一つの交差点を同定するために確定すべき必要な曲線組は一つだけである。この状態を図5に示す。これにはまた、一対の曲線が交わらずに最小差定常状態ΔRが確立された交差状態をも示されている。このように、この仮想ケースでは、濃度CX のアナライトと200又は5mg/dLのヘモグロビンを含む検量液についてプロットすることにより、速度が実質的に等しくなる交差点を時間T1 に有するそれぞれ曲線70Aと曲線70Bを作成している。別の組の検量液を濃度CX の5倍濃度においてプロットし、曲線80Aと曲線80B(曲線80Aは、無視できない量である180mg/dLのヘモグロビンを含む液体についてのものである)を作成している。次いで、交差時間点を、最小差定常状態ΔRが最初に得られた時間T2 に確定する。これにより、ほぼ垂直である最適読取り時間の曲線(直線)60’が得られる。こうすると、以降は、患者試料液のこの特定のイムノアッセイのすべての試験に対する最適読取り時間として使用するために、二つの読取り時間T1 又はT2 のいずれか一方が選定される。(その場合、曲線60’上の他方の時間点は無視される。)曲線60’がまったく垂直である場合には、このように最適読取り時間を一つだけ選定する方法を採用することが最適であることはもちろんである。しかしながら、標的免疫アナライトの通常の濃度範囲にわたりT2 −T1 の変動が10秒以内にある場合には、この方法は有用な近似法となる。
【0031】
【実施例】
以下の実施例では、上記のジゴキシン及びフェニトイン用スライド試験要素を使用し、従前はイーストマン・コダック社に属していたクリニカル・ダイアグノスティックス・ディビジョンから市販されている「Ektachem E−250」分析装置で、後記量のアナライトと零量又は後記量のヘモグロビンとにより得られた検量液を用いて試験した。
【0032】
実施例1:フェニトイン
この実施例では、以下の配合組成の検量液を使用した。
液体1
1%ポリビニルピロリドン(PVP)マトリックスに、2.0μg/Lのフェニトインを添加し、これを二部に分けて、一方はヘモグロビンを含ませず、他方には250mg/dLのヘモグロビンを加えて、一対の液体を形成した。
液体2
1%PVPマトリックスに、12.0μg/Lのフェニトインを添加した。これを二部に分けて、一方はヘモグロビンを含ませず、他方には250mg/dLのヘモグロビンを加えて、一対の液体を形成した。
液体3
1%PVPマトリックスに、40μg/Lのフェニトインを添加した。これを二部に分けて、一方はヘモグロビンを含ませず、他方には250mg/dLのヘモグロビンを加えて、一対の液体を形成した。
【0033】
図6は、3組の検量液によって得られる最適読取り時間の検量プロットとその曲線60’であり、それぞれ曲線30A”、30B”;40A”、40B”;及び50A”、50B”で示した。すなわち、曲線30A”及び30B”は液体1に対し、曲線40A”及び40B”は液体2に対し、そして曲線50A”及び50B”は液体2に対するものである。各組において、A曲線は250mg/dLのヘモグロビンを含む適当な液体を表し、またB曲線はヘモグロビン存在量が零である適当な液体を表す。(図6及び図7では、反応開始時間はT=0秒の0.3分前とした。)各検量液に添加されたフェニトインの量はプロット上に記載されている。次いで、時間0.5分における初期速度Ri を検出した場合(例、Ri =0.07)に、曲線60”を最適読取り時間値として使用した。これにより、次いで、約0.88分のT(最適)が得られ、その後これを用いて曲線S”から実際の試料についてR(最終)速度の読み0.063を読み取る。このR(最終)をフェニトイン濃度計算値約7.9μg/mLに変換する。
(曲線60”は、数学的には以下のように表現できる:
A T(最適)=2.41−20.625(初期速度)
ここで、T(最適)=すべての変化速度の読みに対して得られた読取り時間、また初期速度は、例えば0.5分時に初期値として早期に得られた読みである。)
図6の有用性は検量体のみの使用で説明することもできる。最初に、すべての読みを、通常のように、定められた時間、例えば1分時に任意に行った場合の結果を考える。その場合の結果を以下に示す。
【0034】
【表1】
【0035】
表1における偏りは、交差時間に関して、読取り時間の1分が、液体1の場合は遅すぎであり、液体2と液体3の場合には早すぎであることからきており、検量体ではなく実際の試料であった場合には未知の何かが存在することはもちろんである。
しかしながら、上記の方程式Aを使用し、曲線の最初のデータ点を「初期速度R(初期)」として使用する場合には、表2に示したように偏りのはるかに改善された結果が得られる。
【0036】
【表2】
【0037】
別法として、フェニトインアッセイを次の実施例に記載した方法で検量し、検定することはできるが、範囲の両端が最適化されていないので明らかに最適ではない。
実施例2
同様の検量曲線(図7)を、ジゴキシン用試験要素とジゴキシンを含む検量液とを使用して、実施例1と同様の方法で作成した。
【0038】
こうして、曲線30A’”及び30B’”は、アナライトを1ng/mLのジゴキシンとしたことを除いて、実施例1に記載したように調製した液体1を表すものである。曲線40A’”及び40B’”は、アナライトを2ng/mLのジゴキシンとしたことを除いて、実施例1に記載したように調製した液体2を表すものである。曲線50A’”及び50B’”は、アナライトを4ng/mLのジゴキシンとしたことを除いて、実施例1に記載したように調製した液体3を表すものである。図6の場合と同様、A曲線は250mg/dLのヘモグロビンを含む適当な液体を表し、またB曲線はヘモグロビン存在量が零である適当な液体を表す。
【0039】
最適読取り時間曲線60’”を図示したようにプロットした。この曲線は、すべてのジゴキシンアッセイに対して単一の最適時間点を選定することを正当化するに十分な垂直性を示す。こうして、すべての濃度のジゴキシンについて、反応開始から0.7分時点のT(最適)を使用して実験を行うと成功した。
〔曲線60’”は、以下の数学式を有する:
B T(最適)=0.719−2.75(初期速度)〕
さらに説明するものとして、図7の検量体を、任意の読取り時間0.5分を用いて「未知量」として取り扱った。これらの結果を以下の表3に示す。
【0040】
【表3】
【0041】
(液体3の偏りが零であることは、液体3の交差時間と0.5分とが偶然に一致したためである。)
他方で、方程式Bを、「初期速度」として各曲線の第一のデータ点と共に使用すると、以下の表4のような結果になり、偏りが表3の場合よりも改善される。
【0042】
【表4】
【0043】
【発明の効果】
本発明の有利な技術的特徴は、POD検出法により速度イムノアッセイを行うことができると同時に、ある種の妨害因子が存在すると通常発生する偏りが減少する点である。
【図面の簡単な説明】
【図1】従来技術による、ヘモグロビンを含む場合と含まない場合の特定濃度の免疫アナライトについて時間に対して濃度変化の速度をプロットしたグラフである。
【図2】本発明による、ヘモグロビンを含む場合と含まない場合の特定濃度の免疫アナライトについて時間に対して濃度変化の速度をプロットしたグラフである。
【図3】本発明の検量法を説明する、図2に類似した時間に対して濃度変化の速度をプロットしたグラフである。
【図4】図3の最適読取り時間曲線を利用して未知濃度の患者試料を検定する方法を説明する、図3に類似したグラフである。
【図5】別の実施態様を説明する、図3に類似したグラフである。
【図6】フェニトインについての実施例を説明する、図3に類似したグラフである。
【図7】ジゴキシンについての実施例を説明する、図3に類似したグラフである。
Claims (3)
- 基質と所定の限定された量で存在するペルオキシダーゼとを含み検出可能な濃度変化を異なる速度で生ぜしめる検出試薬を含有する乾式試験要素を用いてイムノアッセイを実施する場合に特定の妨害因子によって引き起こされる偏りを減少させる方法であって、
(a)既知量の特定の妨害因子と既知量の標的アナライトを含む少なくとも1種の液体と接触した該標的アナライトに対する第一組の試験要素が生ぜしめる濃度変化の速度が、既知量の標的アナライトを含むが妨害因子は無視できる量でしか存在しない液体と接触した、前記第一組の試験要素と実質的に同等である第二組の試験要素が生ぜしめる濃度変化の速度と、実質的に同等となる時間又はそれらが最小差定常状態に到達する時間(以下「交差時間」という。)、を確定することによって、標的アナライトのイムノアッセイを検量する工程と、
(b)工程(a)で確定した交差時間に対応する時間において、前記第一組又は第二組の試験要素のうちの選ばれた要素と接触する該試料によって引き起こされる該選ばれた要素における変化速度を読み取ることによって、患者試料の未知量の標的アナライトの検定を実施する工程とを含む方法。 - 西洋ワサビペルオキシダーゼと基質を用いて経時変化する色素濃度を生ぜしめるイムノアッセイにおいて標的アナライトを試験するための検量値におけるヘモグロビンによる偏りを減少させる検量方法であって、
(a)同組成の複数のスライド試験要素の一部を用いて複数の時間について、予め選定した異なる2種の既知量の標的アナライトと零量のヘモグロビンとを含む少なくとも2種の液体によって得られる色素濃度の変化速度を確定する工程と、
(b)同組成のさらに別のスライド試験要素を用いて複数の時間について、前記少なくとも2種の液体のいずれにも同等に予め選定した無視できない量のヘモグロビンを加えた少なくとも2種の液体によって得られる色素濃度の変化速度を確定する工程と、
(c)非零量のヘモグロビンを含有する前記少なくとも2種の液体についての変化速度が、対応するヘモグロビンを含まない2種の液体についての変化速度と、実質的に同等となる時間又はそれらが最小差定常状態に到達する時間(以下「交差時間」という。)における交差点を求めることにより、偏りが最も少ない交差時間を得る工程と、
(d)前記少なくとも2種の液体の一方について、これに対応する初期の変化速度を示す後の試料液の試験のための最適読取り時間として、前記交差時間を選定する工程とを含む検量方法。 - 西洋ワサビペルオキシダーゼとロイコ色素を用いて経時変化する色素濃度を生ぜしめるイムノアッセイにおいて患者体液を標的アナライトについて試験するための方法であって、
(a)請求項2に記載の検量方法により算出された最適読取り時間として定めた少なくとも一つの交差時間点を有する分析装置において、特定の患者体液の未知量のアナライトについて濃度の経時変化の速度を確定する工程と、
(b)前記定めた交差時間のいずれよりも以前に固定した時間点を初期読取り時間として選定する工程と、
(c)工程(a)で確定した値から工程(b)で選定した時間点に対する初期速度を確定する工程と、
(d)工程(c)で確定した初期速度に対して、該初期速度に対応する最適交差読取り時間を確定する工程と、
(e)工程(a)で測定した速度から、前記最適読取り時間における患者試料の変化速度を確定する工程とを含む方法。
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