JP2646731B2

JP2646731B2 - 生化学分析方法

Info

Publication number: JP2646731B2
Application number: JP4969989A
Authority: JP
Inventors: 順一松本
Original assignee: Shimazu Seisakusho KK
Current assignee: Shimazu Seisakusho KK
Priority date: 1989-02-28
Filing date: 1989-02-28
Publication date: 1997-08-27
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: JPH02227639A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、生化学分析方法に関する。さら詳しく
は、ことに血清、血漿、尿、リンパ液等の多成分を含む
生化学試料中の所定成分を定量するのに有用な分析方法
に関する。

（ロ）従来の技術従来から上記のごとき生化学試料中の所定成分の分析
方法として、試料液中に１種又は２種以上の所定の反応
試薬を混合して反応させ、この反応によって生じる試料
液の光学濃度値（吸光度値、蛍光光度値等）の変化や反
応途中の変化率に基づいて所定成分を定量する方法が、
いわゆるエンドポイント法やレート法として知られてお
り、各種自動生化学分析装置に適用されている。

そして、これらの具体的な分析において、上記光学濃
度値の変化や変化率の測定は、別に測定される反応試薬
ブランク液（試料成分未含有で同じ反応試薬を含有する
溶液）の光学濃度値Abをベースラインとして行われ、か
つ適性な定量を行う点から、ある一定の光学濃度値Ａ
（光学濃度限界値）までの光学濃度の範囲内で画一的に
行われている。

例えば、レート法においては、反応開始後から反応が
飽和する迄の反応途中に光学濃度が経時的に複数測定さ
れこれら一連の実測光学濃度と時間の関係から光学濃度
変化率が求められ、定量が行われる。そして、この変化
率を求める光学濃度限界値Ａは、例えば酵素を用いる反
応試薬ではその基質の量等で規制される反応飽和の前の
光学濃度値付近とされていた。

従って、上記光学濃度限界値Ａを超えた部分について
の実測光学濃度値は変化率の測定用データの対象から外
されこれにより定量誤差の発生が極力防止されていた。

一方、エンドポイント法においては、反応終了状態の
光学濃度と前記試薬ブランクの光学濃度Abとの差に基づ
いて定量が行われるが、レート法の場合と同様に、所定
時間後の光学濃度が光学濃度限界値Ａを超えた場合に
は、定量が不適と判定されて再検が行われ、これにより
定量の信頼性が確保されていた。

（ハ）発明が解決しようとする課題しかしながら、上記光学濃度限界値Ａを用いるいずれ
の分析法においても、試料中に共存しうる光学的な干渉
成分、例えばビリルビン、ヘモグロビン、濁り成分等の
影響が問題となっていた。

すなわち、測定成分濃度自体が定量精度の点で適性な
範囲内であっても、これら干渉成分による光学濃度のベ
ースラインの増加をもたらし、例えばレート法の場合に
は定量のための変化率算出に供しうる限界値Ａ内の実測
光学濃度値のデータ数が減少して定量精度の低下を招い
たり、エンドポイント法の場合には、定量に不適と判定
されて希釈した後の再検が必要となる、という問題があ
った。

かかる干渉成分により定量操作の煩雑化や定量精度の
低下等の悪影響を防止すべく、従来から種々の提案がな
されている。例えば、特開昭57−82753号公報は、試料
と希釈液（生理的食塩水や第１試薬）の吸光度を測定し
て容量補正をし、反応スタート後得られる吸光度から差
し引く方法を提案している。また特開昭56−108941号、
同56−104238号、同56−104239号、同54−63785号は試
料と希釈液（生理的食塩水や他試薬の第１試薬）を加え
て、特定の波長で測定し干渉成分を計算し、測定すべき
波長での吸光度を計算し補正する方法を提案している。

しかしながら、上記前者の方法においては、別途希釈
液が必要であり、かつ液量の補正が必要となり、さらに
うすまりの影響を考慮する必要があるので試薬濃度を高
める必要があるという不都合があった。また、一試薬系
のものには適用ができなかった。

一方、上記後者の方法においては、装置的に別チャン
ネルが必要であるので、処理能力が低下し、かつ吸光度
の補正が必要となるなどの問題があった。

この発明は、かかる状況下なされたものであり、こと
に干渉成分の独立した測定を行うことなく、容量補正等
を行うことなく、簡便に干渉成分による悪影響を防止し
つつ所定成分の定量を行うことができる生化学分析方法
を提供するものである。

（ニ）課題を解決するための手段かくしてこの発明によれば、試料液に所定の反応試薬
を混合して反応させ、その光学濃度を経時的に測定した
後、得られた一連の実測光学濃度値における所定の光学
濃度限界値Ａの範囲内での光学濃度の変化又は変化率を
算出しこの算出値に基づいて上記試料液中の所定成分を
定量することからなり、上記反応開始後の光学濃度変動領域における複数の実
測光学濃度値とその反応時間との関係から反応時間ｔと
光学濃度値Y_tを変数とする回帰式を最小自乗法で求め、
この回帰式に基づいて反応開始時（ｔ＝０）での光学濃
度値Y₀を求め、この光学濃度値Y₀と反応試薬ブランク液
の光学濃度Abとの差ΔＡによって上記一連の実測光学濃
度値又は光学濃度限界値Ａを補正した後に上記光学濃度
の変化又は変化率の算出を行うことを特徴とする生化学
分析方法が提供される。

この発明は、経時的に測定された一連の実測光学濃度
値を用いて光学濃度限界値Ａ範囲内で光学濃度変化又は
変化率を算出するに当り、この実測光学濃度値を特定の
方法で補正することを最も特徴とするものである。

かかる補正は以下のようにして行われる。

すなわち、まず光学濃度変動領域の複数の実測光学濃
度値とその反応時間との関係から回帰式が最小自乗法で
求められ、得られた回帰式から反応開始時、すなわち反
応時間ｔ＝０での光学濃度が算出される。ここで反応開
始時とは、２試薬系の反応試薬を用いる場合には、第２
反応試薬添加時を１試薬系の反応試薬を用いる場合に
は、その反応試薬添加時をいう。

回帰式は、一次回帰でもよく二次、三次等の多次元回
帰でもよく、各々の目的成分についての反応途中の光学
濃度変動領域のプロフィールに最も近似したものが適し
ている。通常の生化学分析項目については二次回帰式
（Ｙ＝at²＋bt＋ｃ）又は三次回帰式（Ｙ＝at³＋bt²＋c
t＋ｄ）を用いるのが適している。

上記回帰式を決定するための複数の測定点（Yt,t）
は、反応開始後から反応終了後の間の変動領域の任意の
点に設定できる。ただし、反応終了直前は実際には変曲
点が存在しうるため、測定点とするのは適さない。従っ
て、測定点は、通常反応開始直後から、反応終了時迄の
光学濃度の変動範囲における変動が90％に到達した時点
と反応開始時点間で複数設定するのが適しており、経験
的に設定されてもよい。

この発明においては、このようにして得られたｔ＝０
での光学濃度値Y₀とベースラインとなる反応試薬ブラン
ク液の光学濃度値Abとの差ΔＡを干渉成分についての推
定光学濃度値として一連の実測光学濃度値が補正され
る。光学濃度の変化に対して正の方向に光学濃度干渉が
生じた場合には、各実測値をΔＡ値分減少させる補正が
なされ、負の方向に干渉が生じた場合には、ΔＡ値を増
加する補正が行われる。この発明の効果はとくに光学濃
度の干渉成分による増加する場合に発揮される。なお、
かかる補正は、限界値Ａとの関係で相対的に行われても
よいため、この限界値Ａを補正してもよい。

（ホ）作用レート法の場合、被測定成分が比較的高濃度のときに
は、第２図の実測値ラインに示すごとく、時間t₄の時点
で光学濃度限界値Ａを超えると、変化率の算出にはt₁〜
t₄までの光学濃度データしか供しえないことになって定
量の精度が低下する。かかる場合、この発明の方法にお
いては、回帰式から導かれるｔ＝０の光学濃度値T₀とベ
ースラインとなる反応試薬ブランク液の光学濃度値Abと
の差ΔＡの分だけ各実測光学濃度値が減算される。これ
によりt₅の時点の光学濃度値も限界値Ａの範囲内とな
り、変化率の算出にt₁〜t₅のデータを用いることができ
るため、定量精度が向上する。なお変化率の算出には、
通常一次回帰による最小自乗法が用いられる。

一方、エンドポイント法の場合、被測定成分が比較的
高濃度の場合には、第３図の実測値に示すように、反応
が終了する迄に光学濃度が限界値Ａを超えると、再検が
必要となるが、この発明の方法によれば、同様にΔＡの
分だけ各実測光学濃度値が減算される。これにより反応
が終了した時点（図中のプラトー域）の光学濃度値も限
界値Ａの範囲内となって、再検することなく、定量する
ことが可能となる。

そして、逆に光学濃度限界値を補正しても同様な効果
が得られることとなる。

（ヘ）実施例第１図は、この発明の方法の実施に用いる生化学自動
分析装置の一例の構成説明図である。第１図において１
は試料分注ポンプ、２は試料分注ノズル、３は試料分注
ノズル移動機構、4,5はそれぞれ標準試料容器および標
準試料、６は試料用ターンテーブル、7,8はそれぞれ試
料容器および試料、９は反応ディスク、10,（10′,1
0″）は反応セル、11は第１試薬分注ポンプ、12は第１
試薬分注ノズル、13は第１試薬分注ノズル移動機構、14
は試薬庫、15,16はそれぞれ第１試薬容器および第１試
薬、17は分光器、18は分光器移動機構、19は制御および
データ処理コンピュータ、20は第２試薬分注ポンプ、21
は第２試薬分注ノズル、22は第２試薬分注ノズル移動機
構、23,24はそれぞれ第２試薬容器および第２試薬、25
は洗浄ポンプ、26は洗浄ノズル上下機構、27は洗浄ノズ
ルである。かかる装置において、試料分注ポンプ１と連
結されている試料分注ノズル２が試料分注ノズル移動機
構３によって移動し、標準試料容器４から一定量の標準
試料５を吸引し、続いて試料用ターンテーブル６にセッ
トされた試料容器７から一定量の試料８を吸引し、反応
ディスク９に配置されている反応セル10の中に試料８お
よび標準試料５を分注する。反応ディスク９が回転して
反応セル10が１ステップ進んだところで、第１試薬分注
ポンプ11と連結されている第１試薬分注ノズル12が第１
試薬分注ノズル移動機構13によって移動し、試薬庫14内
にセットされている第１試薬容器15から一定量の第１試
薬16お吸引し、続いて反応セル10′のところに移動して
反応セル10′内に分注する。このとき、一試薬系の反応
試薬を用いる項目の反応セルについて、分光器17が分光
器移動機構18により反応ディスク９と同じ軸の回りに往
復回転しながら、吸光度（Yt）を順次経時的に測定しな
がら制御およびデータ処理コンピュータ19に記憶する。

次いて反応セル10が反応セル10″の位置にきたところ
で第２試薬分注ポンプ20と連結した第２試薬分注ノズル
21が第２試薬分注ノズル移動機構22に上がって移動し、
試薬庫14内にセットされている第２試薬容器23から一定
量の第２試薬24を吸引し、続いて反応セル10″のところ
に移動して２試薬系の反応試薬を用いる項目の反応セル
10″内に分注する。第２試薬添加後に反応セル10″が洗
浄ポンプ25に連結され、洗浄ノズル上下機構26により上
下する洗浄ノズル27の位置に進むまでの間も前記のごと
き各位置での吸光度Y_tが測定されコンビュータ19に記憶
されている。そして、制御およびデータ処理コンビュー
タ19は、各部の動作を同期制御すると同時に、１試薬系
の項目については第１試薬分注後（反応開始後）からの
吸光度データY_tの時間変化に基づいて、２試薬系の項目
については第２試薬分注後（反応開始後）の吸光度デー
タY_tの時間変化に基づいて、その吸光度の変動領域の回
帰式を求めかつこれに基づいてｔ＝０での推定吸光値Y₀
を算出し、次いで各々このY₀と反応試薬ブランク液の吸
光度Abとの差ΔＡを算出し、このΔＡで各々上記吸光度
データYtを補正し、この補正されたデータに基づいて、
各々所定の限界吸光度Ａの範囲内でレート測定又はエン
ドポイント測定を行い、各測定成分の定量値を換算測定
する。

以下、実際に実施した際のデータについて説明する。

アポ蛋白の測定アポＢを130mg/dl（測定至適範囲）含有する試料に、
ヘモグロビン（干渉成分;Hb）の希釈系列を添加し、ヘ
モグロビンの濃度が0,100,200,300,400,500mg/dlになる
ように調製したものについて測定を行った。反応試薬と
しては、２試薬系のアポＢ反応試薬アポＢオート（第一
化学（株）製）を用いた。

各吸光度の測定結果を第４図に示した。

この結果に示されるように、ヘモグロビンはアポＢの
測定時に吸光度のプラスの干渉成分となるため、その量
に応じて、各実測吸光度値が増加していることが判る。
そして、前記生化学分析装置においては、アポＢの測定
時はエンドポイント法で行われ、かつその吸光度限界値
Ａは0.18Absとされているため、Hbを300mg/dl以上含有
する試料液については濃度算出は行われず、再検が必要
となって従来装置ではその旨表示されることとなる。

この発明においては、まず各々得られた吸光度変化の
うち、吸光度変動領域における測定周期１〜６の範囲内
の吸光度と時間の関係から最小自乗法によって二次回帰
式（ｙ＝at²＋bt＋ｃ）を算出し、この式から各々ｔ＝
０における吸光度値Y₀が求められる。この結果は以下の
通りであった。

次いで、上記Y₀値から別に測定された反応試薬ブラン
ク値（ベースライン）28.3mAbsを減算することにより、
ΔＡが求められた。

そして各実測吸光度から各々上記ΔＡを減算すること
により各々の実測吸光度が補正された。この補正後の実
測吸光度はいずれも前記吸光度限界値0.18Absの範囲内
であるため、いずれの試料液についてもエンドポイント
測定が可能となり、ことに従来法では測定できず再検が
必要であったHbが300mg/dl以上の試料液についての定量
も可能となる。そして、かかる方法によれば、ヘモグロ
ビン濃度の何如を問わず、アポＢの定量値はほぼ一定で
あって充分な定量精度が得られていることも確認され
た。

（ト）発明の効果この発明によれば、干渉成分の独立した測定や容量補
正等を行うことなく簡便に干渉成分の悪影響を排除して
所定成分の定量を行うことができ、ことにエンドポイン
ト法においては再検の煩雑さを減少でき、レート法にお
いては測定精度をより向上することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の生化学分析方法を実施する装置を
例示する構成説明図、第２図及び第３図は、この発明の
方法の原理説明図、第４図は同じく実施例で得られた吸
光度と時間の関係を示すグラフ図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料液に所定の反応試薬を混合して反応さ
せ、その光学濃度を経時的に測定した後、得られた一連
の実測光学濃度値における所定の光学濃度限界値Ａの範
囲内での光学濃度の変化又は変化率を算出しこの算出値
に基づいて上記試料液中の所定成分を定量することから
なり、上記反応開始後の光学濃度変動領域における複数の実測
光学濃度値とその反応時間との関係から反応時間ｔと光
学濃度値Y_tを変数とする回帰式を最小自乗法で求め、こ
の回帰式に基づいて反応開始時（ｔ＝０）での光学濃度
値Y₀を求め、この光学濃度値Y₀と反応試薬ブランク液の
光学濃度Abとの差ΔＡによって上記一連の実測光学濃度
値又は光学濃度限界値Ａを補正した後に上記光学濃度の
変化又は変化率の算出を行うことを特徴とする生化学分
析方法。