JPS58140636A - 赤血球膜電位の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、安全簡単かつ迅速正確に、赤血球の膜電位を
測定する方法に関する。

赤血球の膜電位の測定は、例えば脳卒中の素因の検出等
疾病の診断や早期発見、或いは新生理油性物質のスクリ
ーニングを可能にすることと関連して重要であると考え
られるが、従来千〇測定は”ＣＩ”−，８６Ｒｈ十等の
ラジオアイソトープを用いる方法で行なわれていた。し
かし、ラジオアイソトープを用いる方法は危険で取扱い
が煩わしい。これに代わる方法として、脂溶性イオンに
選択的に応答する電極を用いて赤血球の膜電位を測定す
る方法が、特開昭３３−／／７９ｊ４号公報に開示され
ている。

しかし、この方法にもなお改良すべき点のあることが判
明した。その第１は、赤血球の同一サンプルで測定値に
バラツキの見られることがあり、その第一は、用いる脂
溶性−イオンの種類によっては〔例えばテトラフェニル
ホスホニウム（以後単にＴＰＰ＋と略称する）〕、測定
値に前述のラジオアイソトープ法によって測定される膜
電位値との偏倚（バイアス）が見られる。例えば″Ｃ１
−法測定の膜電位の−１０ｍＶに対し、ＴＰＰ＋法測定
の膜電位は−２０〜−３０ｍＶと出る如きである。

以上に鑑み、本発明者らは、特開昭１３−／１７ｔＪｔ
号公報に開示される方法の前記欠点を克服する為に鋭意
研究を重ねた結果、ヘモグロビン、赤血球細胞成分、血
漿成分の少なくとも１つを予め脂溶性イオンを溶解させ
た溶液に加えた後、被測定赤血球を加えることにより、
測定値のバラツキを減少することが一可能であり、かつ
、このようにして求められた赤血球膜電位に、赤血球内
の水の体積を考慮した補正及び脂溶性イオンの赤血球へ
の吸増量を考慮した補正を行なうことにより、バイアス
を消去し得て’Ｃ１−又Ｕ　”Ｒｈ＋を用いるラジオア
イソトープ法による値と同じ値の赤血球の膜電位を測定
することに成功し、本発明をなすに至った。

即ち、本発明は、脂溶性イオン′ｆ［解させた液に、赤
血球又は赤血球懸濁液を加えた際の、赤血球の存在に基
づく脂溶性イオンの濃度変化を、その脂溶性イオンを選
択的に応答する電極で検知し、その際の電極電位の変化
量△Ｅから、赤血球の膜電位を求める方法において、予
めヘモグロビン、赤血球細胞成分、血漿成分の少なくと
もｌ檀を脂溶性イオン溶解液に加えておくこと、及び該
方法により得られる膜電位に、赤血球内の水体積に基づ
く偏倚の補正と脂溶性イオンの赤血球への吸層量に基因
する偏倚の補正とを加えることにより、赤血球の正しい
膜電位を求めることを特徴とする赤血球膜電位の測定法
に関するものである。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明の被測定物である赤血球は、いかなる動物のいか
なる箇所から採血したものでも良いが、採血の際はヘパ
リン等の抗凝固剤を用い、溶血や凝固が起こらないよう
注意して、採血後なるべく短時間内に測定するのが望ま
しい。赤血球懸濁液としては、全血をそのまま使用して
もよいし、全面から通常の方法で採取又は及び洗浄した
赤血球標品を適当な生理的塩類溶液に懸濁させたものを
用いてもよい。

脂溶性イオンは陽イオンであっても陰イオンであっても
よい。脂溶性カチオンとしては一般弐Ｒ，Ｘ＋で示され
るダ級カチオンを用いることができる。ここでＲは炭化
水素基又はハロゲン化炭化水嵩基を、Ｘは窒素原子、リ
ン原子又はヒ素原子をそれぞれ表わす。このＲとしてメ
チル、エチル、プロピル、ブチル等のアルキル基、フェ
ニル、トリル等のアリール基、ベンジル等のアラルキル
基、シクロヘキシル等のシクロアルキル基及びそれらの
ハロゲン置換体、例えばクロロフェニル等が挙げられる
。上記の一般式、で示されるｊ級カチオンとしてはジベ
ンジルジメチルアンモニウムカチオン、ベンジルフェニ
ルジメチルアンモニウムカチオン、テトラフェニルホス
ホニウムカチオン、テトラフェニルアルセニウムカチオ
ン等を使用することができる。

脂溶性アニオンとしては一般式ＲＳ　Ｂ−で示されるホ
ウ素誘導体アニオン又はかご状ホウ素誘導体アニオンを
使用することができる。ここでＲ′は炭化水素基又はハ
ロゲン化炭化水嵩基を表わし、このＲ′としてはメチル
、エチル、プロピル、ブチル等のアルキル基、フェニル
、１ルイル等の了り−ル基、ベンジル等のアラルキル基
、シクロヘキシル等のシクロアルキル基及びそれらのハ
ロゲン置換体、例えばクロロフェニル等が挙げられる。

上記の一般式で示されるホウ素誘導体アニオンとしては
テトラフェニルホウ嵩イオン、テトラトルイルホウ素イ
オン、テトラ（ｐ−クロロフェニル）ホウ素イオン等を
使用することができる。前記かご状ホウ素誘導体アニオ
ンとして具体的にはフェニルジカルバウンデカボランア
ニオンやメチルレジ力ルバドデカ八イドロウンデカボラ
ンへニオンなどのメチル又はフェニル基で置侠されたジ
カルバウンデカボラン、ジカルバドデカボラン又はジヵ
ルバヘブタボランアニオンなどを使用することができる
。

脂溶性イオンを溶解させた液の作成に用いる溶媒は、脂
溶性イオンを所定量均一に溶解させるものであればどの
ようなものでもよいが、声イオン組成、浸過圧等を適当
に調整した塩類水浴液を用いることが望ましい。

脂溶性イオン電極は、懸濁液内にも存在する脂溶性イオ
ンに選択的に応答する電極であり、有機イオン電極と呼
ばれることもある。脂溶性イオン電極と１＃照電極との
間の電位差Ｅが、懸濁液中の−４ 脂溶性イオン濃度Ｃが、ｔＸ１０Ｍ〜１０　Ｍの範囲で
次のネルンストの式で表わされるような電極特性を持つ
ものならば、どのような脂溶性イオン電極を用いてもよ
い。

但し、αは電極に固有な定数、Ｔは電極に挿入している
液体の絶対温度、Ｒｋ′ｉ気体定数、Ｆはファラデ一定
数、２は脂溶性イオンの電荷数である。

脂溶性イオン電極は具体的には、例えばガラス或いはポ
リマーよりなる管の一端に脂溶性カチオンと脂溶性アニ
オンとの金合体を感応物質として封入した高分子層がは
りつけられ、その管の内部に目的とする脂溶性イオンを
所定濃度溶解させた水浴液、所謂基準液が入れられ、そ
の基準液内に市販の銀、塩化銀電極などの橡準竜極の一
端が封入されている。電極の高分子層側は懸濁液内に入
れられている。参照電極は市販の銀、塩化銀電極などを
用いることができる。

なお、以上の脂溶性イオン、その溶解液、脂溶性イオン
電極の詳細な内容は特開昭３１−／／７９！を号公報に
開示されている。

本発明において予め加えるヘモグロビンは如何なる動物
から採取したものでも良く、市販のウシヘモグロビンを
用いるのが便利である。脂溶性イオン溶液に溶解させる
ヘモグロビンの濃度は、０、ＩＩ９／ＷＬｔ以上にする
必ｇＩＦｉない。

赤血球細胞成分は、赤血球細胞を構成する物質を指すが
、実際には赤血球を通常の方法で溶血させたもの（以下
溶血液と呼ぶ）を用いるのが便利である。この脂溶性イ
オン溶液への添加割合は、脂溶性イオン溶液／−に対し
て、細胞のみの体積にして最大コーの赤血球中に含まれ
る赤血球細胞成分を加えれば良い。

血漿成分は、あらゆる動物の血漿中に含まれる成分を指
すが、実際には赤血球を得る為に採血した動物と同一種
の動物の血漿を用いるのが便利である。できれば赤血球
と同一個体の血漿を用いるのが好ましい。脂溶性イオン
溶液への血漿成分の添加割合は、脂溶性イオン溶液ｌ−
に対して、体積で最大ｉｏ−の血漿中に含まれる血漿成
分を限度としてよい。

以上の添加物質のうち、ヘモグロビン又ハ／及び赤血球
細胞成分は、赤血球又は赤血球懸濁液として洗浄した赤
血球サンプルを用いる場合に用い、血漿成分は全血を用
いる場合に用いると良い。

これらの物質を脂溶性イオン溶液に予め添加しておかな
いと、赤血球サンプル中に含まれているヘモグロビンや
赤血球細胞成分や血漿成分が、脂溶性イオン電極或いは
脂溶性イオンと相互作用を起こして、後述のΔＥを求め
る際のバラツキの原因となることが屡女あるが、これら
の予めの添加によりこのバラツキをなくすことができる
ようになった。前記各成分の添加割合はこのバラツキを
無くする為の必要最大量を示したものである。即ち、こ
れだけの量を入れておけば十分に０機能し、これ以上の
量を入れる必１’Ｕないことを意味する。

次に、ヘモグロビン、赤血球細胞成分、血漿成分等を添
加した脂溶性イオン溶液に、被測定赤血球又は赤血球懸
濁液を加え、その際の赤血球の存在に基づく脂溶性イオ
ン電極電位の変化量△Ｅを求め、△Ｅから赤血球の膜電
位ψ１を求め、偶に前記−要素からなる補正を加えて、
ラジオアイソトープ法による赤血球の膜電位ψとのバイ
アスを消去して、正しい膜電位を求めるやり方について
詳述する。

赤血球又は赤血球懸濁液を脂溶性イオンの調整液に加え
るやり方及び測定装置及びその操作は、特開昭１３−１
１７９３６号公報に記述されているものと同じで良く、
詳述は省略する。

被検サンプルの赤血球又は赤血球！Ｖ濁液の注入時に起
こる脂溶性イオン電極の電位の時間的変化の代表的パタ
ーンは第１図に示される。図において、Ｅ８はサンプル
注入前の電極電位であり、サンプル注入により電極電位
は通常急激に減少する。

Ｅｏはこの急激に減少する電極電位の変化量を示す。

これは赤血球サンプル中の液が脂溶性イオン溶液に注入
されることによって溶液中の脂溶性イオンが希釈されて
、その濃度が減少することによって起こる変化量である
。従って、サンプルが赤血球のみで希釈液を含まない場
合はＥｏ：０となる訳である。

この急激な電極電位の減少後、電極電位は緩やかに減少
し、その後定常状態に落ち層く。この緩やかな電極電位
の減少は、脂溶性イオンが赤血球にとりこまれることに
よってカ旨溶性イオン溶液中の脂溶性イオンの濃度が減
少することに対応している。又、最後の定常状１ｍは、
赤血球膜内外の脂溶性イオンの分布が、熱的平衡に達し
たことに対応している。この定常状態の１１極電位をを
とすると、赤血球の存在に基づく脂溶性イオン電極電位
の変化蓋△Ｅは、電極電位の変化曲線の変曲点の電極電
位とＥｆとの差（負値）である。

しかし、測定温度が舛かったり、赤血球膜や脂溶性イオ
ンの性質によって、脂溶性イオンの赤血球膜透過速度が
非常に大きい場合は、屡々この変曲点が明瞭でないこと
がある。そのような場合や、又変曲点が明瞭な場合でも
、次式によって機械的にΔＥを求めてもよい。

ΔＥ”Ｅｒ　　Ｅａ　　Ｅｏ　　　　　・・・・・・・
・・・（１）Ｅ′ｏは、次式で計算される電Ｉａ電位差
である。

但し、Ｆは７アラデ一足数、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温
度で表わした測定温度、Ｖｏは予めヘモグロビン、赤血
球細胞成分、血漿成分の少なくとも１つを加えておいた
脂溶性イオン溶液の体積、ｖ、ｒｘその後加える赤血球
又は赤血球懸濁液中の赤血球以外の液体の体積、βは脂
溶性イオンとヘモグロビン或いは赤血球細胞成分或いは
血漿成分との吸着効果を考慮した補正係数である。洗浄
した赤血球の膜電位を、ごく標準的な条件で測定する場
合は、β＝ｌとして殆んど間部ない。

即ち、△Ｅは希釈による電位変化Ｅ。を計算によって求
め、それを全電位変化（％−Ｅ８）から減することによ
って求めることができる。

本発明者らは、赤血球の膜電位会をΔＥから次式によっ
て求めた。その技術的根拠は、特開昭ｊ！−／／７９ｊ
４号公報に開示しである、ものと基本的に同一であり、
その詳細についての記述は割愛する。　　　′ＲＴ　　
　　　　　　　　　　　Ｆ ’ｆ−”’Ｔ””ξ−７ｎ（＊ｘｐ（，５△Ｅ）−／）
）　　−・−−−−−−−−・−（８１但し、　　ξ＝
Ｔ　　　　　　・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・（４）ここで、ｖ’ｕへマドクリット値か
ら求めた赤血球の体積、■は赤血球をＷＩＡ濁させた脂
溶性イオン溶液中の赤血球を除いた液体の体積である。

−万、既述のとおり赤血球の膜電位の測定法として従来
ラジオアイソトープを用いる方法がある。

その方法は例えば、Ｒｏｔｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｈ，、Ｔ
ｈｅ　ｍｅａｓｕｒｓｍｅｎｔａｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｄΔｐＨｉｎ　ｃｅｌｌ
ｓ、　ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ　ａｎｄｖｓｓｉｅｌａｓ
、　＆ｔｈｏｄｓ　ｌｎ　ｌｉ！ｎｚｙｙｎｏｌｏｇｙ
、　！！ｒ、　！１１７−３６９．　Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｓａｓ、　／９７９に記載されている。この方法を
用いて”Ｃ１−又は”Ｒｂ＋のラジオアイソトープを用
いて測定した赤血球の膜電位鉛　又はψ、ｂ　は、後に
その関連を明らかにする理由、即ち、Ｃ１−やＲｈ＋は
無機のイオンであり、ＴＰＰ＋のような脂溶性イオンと
は異なり、赤血球にとりこまれても赤血球細胞成分に吸
着されたりすることなく、赤血球内の水に溶解している
可能性が高いので、赤血球の真の膜電位（これをψ値で
表わす）であると考えるが、Ｉｉｌ記例えは、ＴＰＰ　
を用いて△Ｅから導いたｈ値はψ値とバイアスを有する
ことを見い出した。

本発明者らは、このバイアスの生ずる原因を追究し、そ
のバイアスを消去する補正方法を見い出し、広い範囲の
檀々の膜電位をとる赤血球について、脂溶性イオン（例
えばＴＰＰ＋）を用いた△Ｅの値から正確なψ値を得る
ことをｉＪ能ならしめたものである。

その補正はλつのものからなっており、その第１は、（
３）式におけるＶ′に対する補正である。結−的に言え
ば ？’×Ｑ≦９≦＝Ｖ　　　　　・・・・・・・・・・・
・（５）（５）式に示すように、７に係数０３９６を乗
じた値ｉｙｌを赤血球の体積として採用することである
。

この係数ｏ、ｔｑｔが出された理由は次のとおりである
。まず、本発明の脂溶性イオン溶液に対応するものとし
て、次の３種の緩衝液を用いて、赤血球の膜電位を広い
範囲にわたって人為的に変化させた。

■種々のｐＨ（ム２’ｌ〜９ｔ３）の緩衝液。

■種々のクエン酸濃度（θ〜ｒＱｆｍＭ　）の緩衝液（
ｐＨ’Ｚｌ。

■パリノマイシンｊ　Ｘ　／　０”Ｍ存在下で種々の鰐
濃度（／〜／　ｊ　ｊｍＭ　）の緩衝液（ｐＨｌ）。

これらの広い膜電位を示す赤血球懸濁液を用し１て、”
Ｈ−ＴＰＰ十を指標としたラジオアイソトープ法（以下
”Ｈ−ＴＰＰ十法と略称する）で膜電位ψｒを求め、１
ｉｉｆ１時に膜電位ψＬを求め、第２図に示す如きψぎ
−ψアの関係を得た。第２図において、○印は檎々の一
条件下での実開値、Ｘ印は櫨々のクエン酸濃度下での実
測値を示す。図中の直線はψ、＝帳の直線を示している
。第２図の結果は、実測値が６串橡においてゼロ点から
゛ある値（１０−ｊＯｍＶ）だ番すずれた同一勾配の直
線にのることを示してし）るように見える。

Ｍ３図は、次の（６）式にψＥの実測値を代入して求Ｒ
Ｔ　　　　ｙ ψ、′＝ψ６十下ｌｎ７　　　・・・・・・・・・・・
・（６）めたψ１′値と実測値ψアの関係をプロ゛ント
した図である。Ｑ印・Ｘ印の値は第一図のもσ〕と１司
じものに相当する。第３図は ψ１′＝ψＴ　　　　　　　・・・・・・・・・・・・
（７）であることを明らかに示している。そして、（６
）式のＶ′ハ赤血球サンプルのへマドクリット値から求
めた赤血球内の水の体積であるのに対し、Ｖは＊Ｈ−Ｈ
２０と１４Ｃ−蔗糖を用いたラジオアイソトープ法によ
って求めた赤血球内の水の体積である。

このように、赤血球内の水の体積として同一の値Ｖを採
用すればＴＰＰ＋を用いて測定した△Ｅからの膜電位値
も”Ｈ−ＴＰＰ＋法で測定した膜電位値と良く一致する
ことが見られる。

しかして、ｖｋｉラジオアイソトープ法によって求めら
れたものであるから、このｒ値の測定は元来ラジオアイ
ソトープ法を排除しようとする本発明の趣旨と反する。

しかし、幸いなことに、赤血球の体積はｐＨ等によって
影響されるが、標準の測定条件（生理的な塩濃度のｐＨ
７Ｉｌの緩衝液を、脂溶性イオン溶液として使用する場
合）で、多くのサンプルを用いて、ＶＳ％Ｆ’、偶、ψ
アを測定して検討した結果、標準の測定条件下では、次
の（７）式で十分代用できることが分った。

ＲＴ　　　　　　　　　・・・・・・・・・・・・（８
）ψｌ＝ψｉ　＋Ｆ　ｌｎ　０４９４ 脂溶性イオンを用いたψＬＳｍち△Ｅの測定値から、３
Ｈ−ＴＰＰ＋法によるψア値を導き出すことができた駅
である。

しかしながら、この”Ｈ−ＴＰＰ＋法で測定されたｈ値
も、”６Ｃ１−法又は”Ｒｂ＋法で測定されたψａ値又
はψｎ値（ψばとψＲｂは実質的に等しい。以下これを
単にψ値と言う。）とは、かなり異なっている。

このような差異の現われる理由は、脂溶性イオンである
ＴＰＰ＋は、赤血球にとりこまれると直ちに赤血球細胞
成分、特にヘモグルビンに吸着されるので、実際に赤血
球内の水に溶解している量よりも多量のＴＰＰ十がとり
こまれることになり、ψ１や央は見かけ上ψより深い膜
電位を与えるのではないかと思われる。これに対して、
既述のように、Ｃ１−やｂ十は無機イオンであり、赤血
球にとりこまれても赤血球細胞成分に吸着されたりする
ことなく、赤血球内の水に溶解している可能性が高いの
で、仰ｔやψｇ　Ｖｉ界血球の真の膜電位ψを表わして
いると考えられる。

本発明者らは、広い膜電位領域（−Ｌｔ＜ψ＜ｊ（ｍＶ
））にわたって、ψｄ又はψｂとψＴの値を測定してそ
の関係をプロットした結果、第ダ図の結果を得た。

図中Ｏ印は櫨々のｐＨ条件下での実測値を表わし、Ｘ印
は檀々のクエン酸濃度下での実測値を表わし、・印１ｄ
　／＜リノマイシン存在下檀々のに濃度下での実測値を
表わす。これらの実測値から導いた回帰曲線は、次のり
９）式（二次式）で表わされ、ψ＝　（７２／７×１０
”　）ψ、’　十１ｔｏｒψア＋ＩＩ２．／、ｔ・・曲
（９）幸いなことに、その相関係数は０９９３と極めて
高い０ 叙述により明らかなとおり、脂溶性イオン法（例えばＴ
ＰＰ＋法）によって△Ｅを求めれば、次の（３）式、（
７）式、（８）式、（９）式を連立して解くことにより
、ｔｐ、　＝　藍（／ａξ−ｔｎ（ｅｘｐ（−’−ΔＥ
）−／））−−−−−・・（３＋Ｆ　　　　　　　　Ｒ
Ｔ ψに′＝外　　　　　　　　　　　　　・・・・・・・
・・（７）ψ／＝偶十旦”ｌｎ　Ｏ，６９ｔ Ｆ　　　　　　　　　　　　　・・・・・・・・・（８
）ψ＝　（７２／７×１Ｏ−３）ψ／＋ｌぶｏｒへ＋４
’２．／ｊ・・・田・・・（９）赤血球の真の膜電位値
とみられるψ値が、高い正確度と精度をもって得られる
。又、△Ｅｕ（１）式と（２）式から機械的に求められ
る。

△Ｅ　＝　Ｅｒ　−Ｆ、、　　−Ｅ、、　　　　　　　
　　曲中・・・・・　（１）本明細書では記述を省略す
るが、特開昭ｊｊ−／／７９ｊ６号公報の第２図で示し
たような装置で、その演算器に式ｆｌ）、（２）、（８
）、（７）、（８）、（９）を記憶させて適当なデータ
を入力しておけば非常に簡単な操作で迅連にかつ高精度
で正しい赤血球の膜電位を測定することができる。

なお、本発明における（８）式及び（９）式の補正が必
要なのは、次のような理由によるものと思われる。

もともと（３）式は次の２つの仮定のも、とに導かれた
ものであり、 （１）　　熱的平衡状態での赤血球膜内外の液体の脂溶
性イオンの濃度（正確には活量）を各々（Ｌｌ　）ノ、
（Ｌ　Ｉ　）　ｍｔｔｔｉ”Ｍ−とすれば、赤血球の膜
電位ψは、次の所謂ネルンストの式で表わされる。

但し、２はイオンＱ負号も含めた電荷数である０ （２）　　赤血球中にとりこまれた脂溶性イオンはすべ
て赤血球中の液体に溶解する。

上の（１）の仮定は、次の理由から十分に成立すると考
えられる。

■　用いる脂溶性イオンは、生体内にはもともと存在し
ていないものであるから、電気化学的ポテンシャルに逆
らって能動輸送されるとは考え難い。

■）　脂溶性イオンを十分に薄い濃度で使用すれば、活
量は濃度で近似できる。

一方、（２）の仮定の根拠は不確実であり、この（２）
の仮定の不成立が前記の補正の必要な原因であると考え
る。

次に本発明を、実施例により更に具体的に説明して、そ
の効果を明らかにする。

実施例１ 脂溶性イオンとして’ｒｐｐ＋、赤血球懸濁液として全
血を用いた場合に、予め血漿を加えることが同一サンプ
ルのＥｆＥａ　の測定値のバラツキを減少する効果をも
つことを、実際のデータで示す。

全血サンプルは、９退会のラットの心臓からヘパリン採
血した。脂溶性イオン溶液として、ＮａＣ１／ｊＪｍＭ
、）リス／　７　ｍＭ　ｓ　ｐｉ（７，ｕ　）緩衝液（
以下ＮａＣ１−Ｔｒｉｍと略称する）に、ＴＰＰ十を１
０−ＢＭになるよう溶解させたものを用いた０それをダ
ー分取し容器の中に入れ、小さな電磁攪拌子で２０Ｏｒ
−の回転速度で攪拌し、画定温度は３７°Ｃに保った。

全血サンプルを注入する前に、予め同一個体から採取し
た血漿７５μノを加えた場合と、Ｎａｉｌ−Ｔｒｉｍを
７３μ！加えた場合とで、その後全血サンプルを注入し
た際の％−Ｅ、のバラツキの程度を比較した結果を第１
表に示す。バラツキの程度は標本−準偏差Ｃ１の平均値
に対する百分率で表わした０第　　　　／　　　　表 この第７表の結果は、予め脂溶性イオン溶液に血漿を加
えておくことが、全面サンプル注入時のＥｒ　−ｋ　　
の測定値のバラツキ、ひいてはΔＥの測定値のバラツキ
、赤血球の膜電位の測定値のバラツキを減少するのに顕
著な効果があることを示している。

実施例コ 本発明の方法で測定した赤血球の膜電位の値を用いて、
疾病の早期診断が可能になるかもしれないことについて
、実際のデータを用いて説明する。

赤血球は、生後６連合の脳卒中易発症高血圧ラット（以
下５ＩＲ−８Ｐ　と略称する）、脳卒中醋発症高血圧う
ツ）　（８ＨＲ−８Ｒ）、正常５７　）　（ＷＫＹ）各
系統６匹ずつ、腸管動脈よりヘパリン採血し、通常の方
法で洗浄調整して、赤血球ＷＩＡＩＩＩｉｌ液として使
用した。

、脂溶性イオン溶液としては、実施例１と全く同じもの
を使用した。この脂溶性イオン溶液ＩＩ−に予め０．７
艷の溶血液を加えておいた。溶血液としては、溶血用緩
衝液（トリス−ＨＣｌ　ＩｒｒＭ　ｐＨ７１１＞１０−
に上記の赤血球懸濁液ａｓ’ｍｌを注入した後の／！０
００９　、／　３分の遠心上澄を用いた０測定温度は３
７℃で、電磁攪拌子の回転速度＃１ｉｏｏｒ−である。

赤血球の膜電位は、式（１）、（２）、（＋１）、（４
）、（７）、（ｓ）、（９）を用いて求めた。その結果
を、＃！コ表に血圧のデータ及び赤血球中のヘモグロビ
ン濃度とともに示す。

葦はｔ検定の結果デｊ襲以上の信頼度、希辛は９１外以
上の信頼度で有意差があることを示している。

この第−表の結果から判るように、赤血球の膜電位は、
５ＨＲ−８Ｒが、他の２つの遺伝系統に比較して有意に
深い。赤血球内のヘモグロビン濃度は、５ＨＲ−８Ｒが
他の２系統に比較してむしろ低い傾向が見られることか
ら判断して、ＴＰＰ＋が赤血球中のヘモグロビンに吸着
されるという副次的な効果によってもたらされた差では
ないことを示している。

５ＨＲ−８Ｒと５ＨＲ−８Ｐの間には、血圧では有意な
差は認められないが、赤血球の膜電位では有意な差が認
められる。このように、血圧がまだ正常血圧の範囲内に
ある生後６週令のラットで、本発明の方法及び装置で、
脳卒中の遺伝素因が検出できる可能性が示されたことに
なり、まだ全く健康な時期に脳卒中の素因を検出して予
防できるようにしようという試みに、明るい希望を抱か
せるものである。

以上詳述したように一１本発明の方法によれば、従来の
方法と比較してラジオアイソトープのような危険で取扱
いが煩わしいものを用いることなく、赤血球の膜電位を
非常に簡単な操作で迅速に、かつ高精度で測定すること
ができる。確かに、赤血球膜電位の臨床医学的意味は、
まだ明確ではないが、それはこのような物ｆＩｊＡｍを
簡便に測定できる手段が、今までなかったことに起因し
ていると言うこともできよう。実施例コに示したように
、赤血球の膜電位を用いて、脳卒中等の高血圧性疾患の
予防につながるようなデータも出はじめており、集団検
診用装置として使用した場合は、特にその効果が大きい
と思われる。又、基礎的研究への応用は勿論、膜電位に
影響する新生理活性物質のスクリーニング等、興味ある
応用法は無限に広がっていると思われる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、脂溶性イオン溶液に、赤血球懸濁液である赤
血球サンプルを注入した時の脂溶性イオン電極の電位の
時間変化の代表的なパターンである０ 第２図は、（８）式の方法で求めた膜電位央と、”Ｈ−
ＴＰＰ＋法で求めた膜電位嚢の間の相関関係を示し・て
いる。実線はψア＝ψ、の直線である。 第３図は、（６）式の方法で求めた膜電位ψｌと、”Ｈ
−ＴＰＰ十法で求めた膜電位偶の間の相関関係を示して
いる。実！Ｉは偉＝４の直線である。 ＩＩＩ　４’　ｔｉｌｌ　Ｕ　、ＲＨ−ＴＰＰ”　法テ
求メタ膜［ｆｆｌ　９１’ｒ　ト％”ＣＩ−法で求めた
膜電位ψｄ或いは町Ｃ法で求めた膜電位ψＲｂの闇の相
関関係を示した図である。実１ＩＩ３Ｉは２次の回帰曲
線で（９）式で示される。 特許出願人　旭化成工業株式会社 代理人弁珈士　星　　　野　　　　　透第１図 吟１ｖｌ（介） 才２記 客 才３図 手続補正書（自発） 昭和５７年ｊ月ＩＯ日 特許庁長官　島田春樹　殿 １、事件の表示 昭和５７年　特　許　願第２μ０３３　　号２、発明の
名称　赤血球膜電位の測定法３、　補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ８、　　Ｍｉ正の内′＠（別紙のとおり）補　　正　　
の　　内　　容 明細書の記載を次のとおり補正する。 （１１４１ｒＦ請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）、第２頁１３行目「ことがあり」を「ことであり
」と訂正する。 （８）、ｊｌＪ頁／７行目「を選択的に」を「に選択的
に」と訂正する。 （４）ｊｌ１４１頁／４１行目「又は及び」を「又は／
及び」と訂正する。 （５）、ｊｉＡ頁／ｊ行目「−イオン」をｒｐＨ、イオ
／」と訂正する。 （６）ｊｌ１４頁／１行目１１液内にも」を「液中に」
と訂正する。 （））、第７頁り行目「電極に」を「電極を」と訂正す
る。 （８）、ＪＩＩ／ｘ頁コ行目（式（ｚ））ノ「−Ｂｆｆ
−」ヲ「虱」トＦ　　　　ＺＦ 訂正する。 （９）、第１コ頁ダ行目「、測定温度、鳩」を［測定湿
度、２は脂溶性イオンの電荷数（ＴＰＰ＋の場合は＋／
）、ｖｏＪと訂正する。 四　ｌｌ／ダ員を行目「（ａ）式」を「（４）式」と訂
正する。 ６Ｑ）、ｍ／ｊｊ１４行目「時に膜電位」ヲ「時＆：　
ＴＰＰ＋電偽な用いて膜電位」と訂正する。 −０纏／Ｓ頁／Ｓ行目（式（６））の「旦」を「川」Ｆ
　　　　ＺＦ と訂正する。 ％　　ＩＩｓ／！ｊ［４行目Ｆ　ＴＰＰ＋を用イテ」を
Ｆ　ＴＰＰ十電砺を用いて」と訂正する。 と訂正する。 （ロ）＄Ｉ／Ａ頁コ０行目「ＢＩＩｆＩｉ！ｉ性イオノ
」を「脂溶性イオン電極」と訂正する。 ｍ、　　ＩＩ／　ｔｘｉ行ｕ　ｒｎ−ｒｐｐ”法Ｊ　ｔ
ｔ　ｒアイソ）−プでラベルされた脂溶性イオンを用い
る方法」と訂正する。 一、帛／１頁１９行目ｒ　（−４’５＜ψ＜！ｆ（ｍＶ
））Ｊをｒ（−４１ｓ＜ψ＜４０（ｍＶ））Ｊ　とＵ正
ｔ６゜［、ＩＩ／　Ｅｌ／　０−／　７行目［脂溶性イ
オン法（例えばＴＰＰ＋法）」をｒ’ｒｐｐ”　’ｍ　
ｍ法」と訂正するＯ に）、第１Ｉ頁１３行目（式（３））の「撃」を１且」
ＺＦ と訂正する。 と訂正する。 と訂正する。 訂正する。 に）、第１９頁１７行目（下からダ行目）（式（７））
に）、第１９頁／を行目（下から３行目）の「負号Ｊを
「符号」と訂正する。 特許請求の範囲 （１）　　Ｉａｌｉ１ｍ性イオンを接解させた液に、赤
血球又は赤麿球懸濁濠な加えた際の、赤血球の存在に基
づく腫Ｉｌａイオンの鎖度変化を、その脂溶性イオン茎
選択的に応答する電極で検知し、その際の電極電位の変
化量ΔＥから、赤血球の膜電位を求める方法において、
予めヘモグロビン、赤血球細胞成分、自装成分の少なく
ともｌ植を脂溶性イオン溶ｓ′ＩＩＬに加えておくこと
、及び該方法により得られる膜電位に、赤血球内の水百
体槓に基づく偏倚の補正と１Ｉｊ１＃１性イオンの赤血
球への吸着量に基因する偏倚の軸止とを加えることによ
り、赤血球の正しい膜電位を求めることを％黴とする赤
血球膜電位の画定法。 特許出願人　旭化成工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）、脂溶性イオンを溶解させた液に、赤血球又は赤
   血球Ｍ４液を加えた際の、赤血球の存在に基づく脂溶性
   イオンの濃度変化を、その脂溶性イオンを選択的に応答
   する電極で検知し、その際の電極電位の変化量ΔＥから
   、赤血球の膜電位を求める方法において、予めヘモグロ
   ビン、赤血球細胞成分、血漿成分の少なくともｌ檀を脂
   溶性イオン溶解液に加えておくこと、及び該方法により
   得られる膜電位に、赤血球内の水体積に基づく偏倚の補
   正と脂溶性イオンの赤血球への＠層量に基因する偏倚の
   補正とを加えることにより、赤血球の正しい１１！電位
   を求めることを特徴とする赤血球膜電位の測定法。