JPH09512899A - 結合アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は液体試料中の被分析物６の濃度の測定を、被分析物６と結合できる結合試薬２並びに、第１の現像試薬８は結合試薬２の占有されていない結合部位と結合でき、標識10を有するものであり、第２の現像試薬12は結合された被分析物または占有された結合部位と結合でき、第１の標識とは異なる、第２の標識14を有しているものである、第１および第２の現像試薬８，12を用いて測定する方法およびキットに関する。被分析物の濃度は、第１および第２の現像試薬８，12上の標識からのシグナルを測定することによって測定される。このようにしてこの方法は、従来の競合的方法および非競合的方法を結合して、好ましくはアッセイの実用範囲および／または感度を広げる。

Description

【発明の詳細な説明】 結合アッセイ 発明の分野 この発明は結合アッセイ、たとえば液体試料における被分析物の濃度を測定す ることに関する。 発明の背景 液体試料中の被分析物、たとえば薬物やホルモンの濃度を、該液体と、被分析 物に対し特異的な結合部位を有する結合試薬とを接触させ、該試薬に結合してい る被分析物を有する結合試薬を分離し、被分析物が占有している結合試薬の結合 部位の割合を表わす数値（「小部分占有（fractional occupancy）」という）を 測定することによって測定することは既知である。一般的には、次に液体試料中 の被分析物の濃度を、該小部分占有と既知の濃度の被分析物を含有している一連 の標準溶液から得られた数値とを比較することによって決定することができる。 従来は小部分占有の測定は通常、いわゆる競合的方法または非競合的方法のい ずれかを用いて、標識現像試薬を（developing reagent）用いた逆滴定によって 行われた。 競合的方法においては被分析物が結合した結合試薬は、一般的には被分析物の 標識化変形体である標識現像試薬を用いて同時または連続的のいずれかで、逆滴 定される。現像試薬は、濃度を測定される被分析物と、結合試薬の結合部位を獲 得するために競合するということができる。標識された被分析物により占有され た小部分の結合部位は、次いで上記のように被分析物の濃度に関連づけることが できる。 非競合的方法においては、被分析物が結合した結合試薬を結合された被分析物 または結合試薬上の占有された結合部位のいずれかと結合できる標識現像試薬を 用いて逆滴定する。結合部位の小部分占有を、次いで標識現像試薬の存在を検出 することによって測定し、競合アッセイと同様に、上記のように液体試料中で被 分析物の濃度と関連づけることができる。 競合的方法および非競合的方法の両者において、現像試薬を検出できるように 標識を用いて現像試薬を標識化する。いろいろな標識、たとえば、放射性同位体 、酵素、化学発光標識および蛍光標識が過去に用いられた。 免疫アッセイの分野においては、競合アッセイを一般にBersonおよびYalow に よって、たとえば「調査および診断の内分泌学における方法（Methods in Inves tigative and Diagnostic Endocrinology）」の第111 〜116 ページに発表され た設計則にしたがって実行する。競合免疫アッセイを行う際には、結合試薬を検 出されるべき被分析物の約30から50％という低濃度と結合する量で用いる場合に 、最高の感度が達成される。非競合免疫アッセイにおいては、最高の感度は通常 、液体試料中の被分析物の100 ％近くまで結合するのに十分な結合試薬を用いる ことによって達成されると考えられている。しかしながら、両方の場合において 、これらの広く受け入れられた教示にそって設計された免疫アッセイにおいては 、試料の容積を知る必要および用いられる結合試薬の量を正確に知るか、結合試 薬の量が一定であることを知る必要がある。 国際特許出願第WO84/01031 号において、私は液体試料中の被分析物の濃度を 、被分析物に特異的な結合部位を有する少量の結合試薬と液体試料とを接触させ ることによって測定できることを開示し た。この方法においては、結合試薬の量が液体試料中の被分析物の濃度に対し、 ほんの少ししか影響しないほど少量であるなら、被分析物による結合試薬の結合 部位の小部分占有は試料の容積と実際上無関係であることが分った。 このアプローチは、WO84／01031 号のアッセイの感受性および容易さの開発を 固体支持体の小さな区域（または「ミクロスポット」）上に位置する0.1 Ｖ／Ｋ モル（Ｖは試料の容積で、Ｋは被分析物についての結合試薬の平衡常数である） よりも少ない量の結合試薬を用いることによって改良することを開示するEP304, 202 号をさらに改良するものである。 これらの両方の参照文献においては、被分析物による結合試薬の小部分占有を 上述したように、競合的技術または非競合的技術のいずれかを用いて測定する。 より大なる感度を有するか、より広い実用範囲にわたってもまた、正確に被分 析物の濃度を測定できる結合アッセイを開発することに継続するニーズがある。 発明の概要 この発明は、 （ａ）液体試料を被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬と、結合部位 の小部分が被分析物によって占有されるように接触させ、 （ｂ）第１および第２の現像試薬を用いて結合試薬を逆滴定し、ここで、第１ の現像試薬は占有されていない結合部位に結合でき、第１の標識を有するもので あり、第２の現像試薬は結合された被分析物または占有された結合部位に結合で き、第１の標識とは異なる第２の標識を有しているものであり、 （ｃ）第１および第２の標識によって生じたシグナルを測定して、被分析物に よって占有された結合部位の部分を表わす数値を供給し、 （ｄ）該数値を既知の濃度の被分析物を含有する一連の標準溶液から得られる 対応する数値と比較して、液体試料中の被分析物の濃度を得る： ことを含んでなる液体試料中の被分析物の濃度を測定する方法を提供する。 したがって、この発明は従来技術の競合的または非競合的な方法を兼ね備えた 被分析物の濃度を測定する方法を提供する。この発明は、むしろアッセイが所望 の精確さの結果を提供できる実用範囲を広げるという利点を有している。これに ついては下記でさらに説明する。 都合のいいことには、第１および第２の標識は、放射性同位元素、酵素、化学 発光標識または蛍光標識である。蛍光染料標識を用いることは、検出のために適 切な色の範囲（励起および発光波長）の蛍光を供給するために蛍光染料を選択す ることができるので、特に好ましい。蛍光染料はクマリン、フルオレセイン、ロ ーダミンおよびテキサスレッド（Teras Red）を含む。背景の蛍光が減衰した後 に蛍光性シグナルの強度を測定するのに時間分解（time-resolved）蛍光を用い ることを可能とするので、長期の蛍光時間を有する蛍光染料分子を用いることが できる。蛍光標識または他の標識を含有するか、表面にそれらを坦持するラテッ クス ミクロスフェア（microsphere）もこの発明の文脈に用い得る。標識から のシグナルをレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて測定することができる。 一般的には、結合試薬は抗原に対して結合部位を有する抗体である。あるいは 結合試薬は標的核酸分子に、たとえば標的核酸分子に 相補的配列を持つことにより、結合することができるオリゴヌクレオチドであっ てもよい。 好ましくは、液体試料の容積を知る必要がないので、WO84／01031 号の「周囲 の被分析物（ambient analyte）」の技術に従って小量の結合試薬を用いる。上 述したように、結合試薬の量は、液体試料中の被分析物の周囲濃度を著しく乱さ ないように十分に小量であるべきである。５％よりも少ない被分析物に結合する 量の結合試薬を用いることが好ましい。しかしながら、もっと少量の、たとえば ２％または１％の被分析物と結合する、結合試薬を用いることは、さらに被分析 物の周囲濃度への妨害を減少させ、被分析物濃度の測定におけるエラーを最小限 度にするのに役立つ。 さらに都合よく、0.1 Ｖ／Ｋ（EP304,204 号に記載したように、Ｖは試験帯に 適用する試料の容積であり、Ｋは結合試薬に結合する被分析物の会合常数である ）よりも大きくない濃度の結合試薬を用いると、この条件が被分析物の濃度にか かわらず満たされることを保証する。 この発明の一つの態様では、与えられた被分析物に特異的な結合部位をそれぞ れ有する多数の異なった結合試薬を用いて、多数の異なった被分析物の濃度を同 時に測定することができる。この場合好ましくは結合試薬は支持体上の別々の位 置に、たとえばミクロスポットとして固定化される。 この態様では、多数の異なった試薬、すなわち、担体上のそれらの位置によっ て別々に区別される異なった結合試薬を含有する別々の位置を逆滴定するのに同 じ第１の現像試薬および第２の現像試薬を用いることができる。したがって、検 出するのに単に二つの種類の標識が必要であるという利点とともに共通の一対の 現像試薬を用いることが可能である。 さらに、特定の被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬を、一連のその 被分析物の濃度の繰り返しの測定を一度にできるように、支持体上の多数の位置 に固定化することができる。 好ましくは、特に急速な測定が必要なときおよび／または試料の容積が１mlま たはそれよりも小さいオーダーであるとき、位置は１mm²の面積を有するミクロ スポットである。さらに結合試薬は好ましくは感度を最大にするようにミクロス ポット内で高表面密度で存在すべきである。 この発明は上記の方法による液体試料中の被分析物の濃度を測定するためのキ ットも含んでおり、該キットは、 （ａ）被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬である、結合試薬を付着 させた固体基体、 （ｂ）第１の現像試薬および第２の現像試薬を含んでなる逆滴定試薬を含んで なり、ここで、第１の現像試薬は占有されていない結合部位に結合でき第１の標 識を有するものであり、第２の現像試薬は結合された被分析物または占有された 結合部位に結合でき、第１の標識とは異なる第２の標識を有するものである。 図面の簡単な説明 では、この発明をさらに添付図面を参照しながら例として記載する。 図１は、通常、アッセイの精度プロフィールと呼ばれる、アッセイにおけるそ の実用範囲へのエラーに関するグラフを示し、 図２は、従来技術の競合アッセイを示し、 図３は、従来技術の非競合アッセイを示し、 図４は、この発明によるアッセイの例を示し、 図５は、第１の現像試薬が結合部位の占有されていない結合試薬 と反応することによって発するシグナルおよび第２の現像試薬を占有されていな い結合部位と反応することによって発するシグナルを観察することにより得られ た応答曲線を示し、並びに、 図６は、競合および非競合のデータの別々の分析により得られた精度プロフィ ールと、データが割合Ry、すなわち、両現像試薬により発せられたシグナルの割 合に依存して組み合わされたときに得られたプロフィールとの比較を示す。 詳細な説明 図１はその実用範囲にわたってアッセイの精度がどのように変わるかを図解し ている。この図はアッセイの精度プロフィール、すなわち、被分析物の濃度に対 しプロットされた被分析物の濃度測定におけるエラー（CV）に関する曲線を表わ す。アッセイの実用範囲は、その濃度範囲内では、アッセイの結果が受容できる 精度（一般的には10％より良い）である被分析物の濃度範囲（ＸとＹの間）を含 む。アッセイの感度は、被分析物測定のCVが100 ％を越えるよりは低い被分析物 の濃度として表わされる。 しかしながら、アッセイの実用範囲および検出の下限を定義するために用いら れるCV値は個々の選択の問題であり、そして、図１に描かれた一般的なコンセプ トが広く容認されているにもかかわらず、この分野においては、これらの値に関 して一般的に受け入れられた慣習はない。 高感度アッセイは、非常に低い被分析物濃度を高精度で、測定するために、す なわち、非常に低い検出限界をもたらすために暗黙のうちに設計されている。ア ッセイの効果的な感度は、一般に検出限界と密接に関係している値である、実用 範囲の下限によっても表わされる。アッセイの感度を増加することは、検出の下 限および実用 範囲（Ｘ）の下限の両方を下げることを含む。しかしながら、アッセイの感度の 増加は、また、実用範囲の上限（Ｙ）を下げるという同時に発生する所望しない 効果をもつことは、通常経験することである。言い換えると、高感度のために設 計されたアッセイは一般に、高被分析物濃度の正確な測定には適さない。 図２から４では、結合試薬２を支持体４上に固定化した。結合試薬は被分析物 ６に特異的な結合部位を有している。結合試薬２と被分析物６を含有する液体試 料とを接触させた後、被分析物６のいくらかは結合試薬２の結合部位に結合する 。 図２において、標識10を坦持する現像試薬８は被分析物６によって占有されて いない結合試薬２の結合部位に結合する。現像試薬８による結合試薬２の結合部 位の小部分占有を標識10を検出することによって測定する。これは液体試料中の 被分析物６の濃度を、既知の濃度の被分析物６を含有する一連の標準溶液を用い て得られた結果と、標識10からのシグナルとを比較することによって確かめるこ とを可能にする。 図３は結合試薬の結合部位に結合する被分析物６を標識14を坦持する現像試薬 12を用いて逆滴定することによって検出する非競合アッセイを示す。結合試薬２ は被分析物６または結合試薬の占有された結合部位に結合し得る。被分析物によ る結合部位の小部分占有は次いで標識14を検出することによって測定する。図２ に示されている競合アッセイの場合のように、標識14からのシグナルは、一連の 既知の濃度の溶液を用いて得られた結果と照合することによって、液体試料中の 被分析物６の濃度と関係づけることができる。 図４は、この発明に従って行われたアッセイを示す。結合試薬２を被分析物６ と接触させた後に、結合部位の一部分は被分析物６によって占有される。次いで 結合試薬２を第１および第２の標識10， 14を用いて標識された、第１および第２の現像試薬８，12を用いて逆滴定する。 標識10，14はたとえば蛍光標識の場合には、異なった頻度および／または異なっ た蛍光減衰時をもった発色団を選択することによって区別できるシグナルを与え るように選択される。 この発明の方法は、従来の競合的アッセイまたは非競合的アッセイにまさるい くつかの重要な利点を有する。 第１に、二つの現像試薬を用いることは、提供された結合アッセイを用いるこ とができる実用範囲を広げることを見い出した。これは低い被分析物濃度では、 標識14を坦持する非競合的現像試薬12の量および標識14の検出能か結合アッセイ の実用範囲の下限のかぎとなる決定要因であるからである。言い換えると、非常 に低い被分析物濃度は現像試薬12を用いて行われた標識14により生じたシグナル の測定によって卓越した精度で測定されるが、現像試薬８を用いて行われた標識 10により生じたシグナルの重要性はより低い。 反対に、高い被分析物濃度では、標識10を坦持する競合的現像試薬の量および 標識10の検出能は結合アッセイの実用範囲の上限を決定するのに非常に重要であ る。言い換えると、高い被分析物濃度は現像試薬８を用いて行われた標識10によ って生じたシグナルの観察により、卓越した精度で測定されるが、現像試薬12を 用いて標識14により生じたシグナルの重要性はより低い。 したがって、固体の支持体上の結合試薬に特異的に結合した両方の標識によっ て生じた特異的なシグナルを測定することにより、そして測定された特異的なシ グナルに反する背景のシグナル（たとえば、固体の支持体上に非特異的に結合し た現像試薬８および12によって生じた）を最小限にまで減らすことによって、実 用範囲の下限を最低限まで小さくし、そして上限を最高限まで高くすることがで き、それによってアッセイ系の実用範囲、すなわち、受容できる精 度で測定できる被分析物の濃度の範囲を拡張する。 他の利点は、それらが測定される異なった効率を考慮に入れて適切に調整した 時、二つの標識によって発せられたシグナルの合計が、系に存在する結合試薬の 総量の測定値を提供する時に生じる。従来技術においては、結合試薬の総量を知 っていることまたはそれが一定であることが、しばしばアッセイの実行における 必要条件である。以前には表面に均一の密度で、一定量の結合試薬（たとえば抗 体）を固定化するのにかなりの困難性が見い出されたが、占有された部位と占有 されない部位の測定値をもたらすことによって、この方法はこの問題を克服し、 結合部位の総数を測定することを可能にする。 しかしながら、少量の結合試薬（たとえば試料中の５％よりも少ない被分析物 と結合する）を用いてこの発明にしたがって行われるアッセイにおいて、二つの 標識からのシグナルの比は被分析物濃度にのみ依存することが分かった。この観 察の根拠は、このような状況の下では結合部位の小部分占有（Ｆ）は周囲の被分 析物の濃度にのみ依存するという国際特許出願WO84／01031 号に開示された発見 である。 したがって、与えられた被分析物濃度Ｙに対して、結合部位の総数をＸとする と、Ｆ_yＸ部位が占有され、（１−Ｆ_Y）Ｘ部位が占有されていないものとなる。 占有された部位により生じたシグナルの測定効率をε₁、占有されていない部位 により生じたシグナルのそれをε₂とすると、占有された部位および占有されて いない部位から生じたシグナルの比（Ｒ_Y）は、ε₁Ｆ_Y／ε₂（１−Ｆ_Y）またはC F_Y／１−Ｆ_Y（ここでＣ＝ε₁／ε₂＝一定）である。Ｆ_Yは周囲の被分析物濃度に のみ依存し、Ｃは不知の試料および標準の両方に対し一定であるから、Ryの測定 はＸの正確な値にかかわりな く、Ｙの測定値をもたらす。 それにもかかわらず、比Ｒ_Yを応答変数として用いることは義務となっていな いし、ある状況下、たとえはミクロスポットに位置する結合試薬の量の変化が低 い時には、該量が本質的に一定であることを条件に含むことは、本当に不利であ るかもしれない。このような状況では、競合アッセイおよび非競合アッセイのデ ータを別々に処理するのが好ましいだろう。この発明による競合アッセイおよび 非競合アッセイの両方を組み合わせることの主要な利点はそれによってそこなわ れない。 この発明の方法は、用いられた結合試薬の量が大きい場合、たとえば液体試料 中に存在する被分析物の総量の５％より多くが結合する場合にもより広い適応性 がある。この場合には二つの標識からのシグナルの比は、被分析物濃度および結 合試薬の量の両方に依存する。しかしながら、結合試薬の量は二つの標識からの シグナルの合計から測定できるので、二つのシグナルの比から試料中の被分析物 濃度を得るために簡単な補正をすることができる。 したがって、この発明の方法は、固定化された結合試薬の量の変化は容易に補 正できるので、一定量の結合試薬が異なった支持体上に固定化されたことを知る 必要性をさけることもできる。 これらの状況においては、試料容積Ｖがわかっているか一定であるかのいずれ かでなければならない。 占有された結合試薬の結合部位に向かう現像試薬に印をつけた標識によって発 せられたシグナルをSoで与え、 占有されていない結合試薬結合部位に向かう現像試薬に印をつけた標識により 発せられたシグナルをSuで与えよう。 そして、占有された部位および占有されていない部位へのそれぞれのシグナル に関係する定数をそれぞれε_oおよびε_uと、 そして、Ｋ＝被分析物と結合試薬の間の反応を支配する有効な平衡定数としよ う。 そこで、試料中の被分析物濃度をＹで与えると、 Ｙ＝（Ｓ_o／ε_o）〔ε_u／（KS_u）＋１／Ｖ〕 Ｖが既知と仮定すると、この式は二つの未知の常数ε_oおよびε_u／Ｋを含んで いる。シグナルＳ_oおよびＳ_uを一連の既知の被分析物濃度について測定すること によって、これらの常数を決定でき、そして、未知である被分析物濃度をＳ_oお よびＳ_uの相当する測定から推定することができる。 周囲の被分析物の状態の下では、項１／Ｖは無視でき、Ｓ_o／Ｓ_uは周囲の被分 析物濃度に比例する。 例 試薬： １．蛍光親水性ラテックス ミクロスフェア、直径0.227μｍ（（Ex642 nm、E m653 nm）、Boehringer Mannheim から入手。 ２．フッ化球体硫酸塩（Sulfate Fluo Spheres）直径0.1 μｍ（Ex490 nm、Em 515 nm）、Molecular Probesから入手。 ３．グリシン、トウイーン(Tween)20、MES（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンス ルホン酸）、無水オルトリン酸水素ジナトリウム、オルトリン酸ジ水素ナトリウ ム、エチル−３（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩、RIA 級 ウシ血清アルブミン、トリツマ（Trizma）およびナトリウムアジド、Sigma から 入手。 ４．甲状腺刺激ホルモン(TSH)、NIH USA から入手。 ５．抗−TSH モノクローナル捕獲および現像抗体、Boehringer Mannheim から 入手。 蛍光親水性ラテックス ミクロスフェアへの抗−TSH マウスのモノクローナル 抗体の複合 １．２回蒸留した水0.5 mlの中の10mgの蛍光親水性ラテックスシクロスフェア に0.5 mlの１％トウイーン20を添加し、室温で15分間振とうし、TSE High SPin2 0 遠心分離機中で20,000rpmで８℃で10分間遠心分離した。 ２．ペレットを２mlの0.05M MES（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸 ）緩衝液pH6.1 中に分散させ、遠心分離した。 ３．工程２を繰り返した。 ４．ペレットを0.8 mlのMES 緩衝液に分散させた。 ５．100 μｌの２mgの抗−TSH モノクローナル現像抗体をミクロスフェアに加 え、室温で15分間振とうした。 ６．該混合物に100 μｌの0.25％エチル−３（３−ジメチルアミノ）プロピル カルボジイミド塩酸塩を加え、室温で２時間振とうした。 ７．該混合物に100 μｌのMES 緩衝液中の10mgのグリシンを加え、さらに30分 間振とうし、遠心分離した。 ８．ペレットを２mlの１％BSA 中に分散させ、室温で１時間振とうし、遠心分 離した。 ９．ペレットを２mlの１％BSA に分散させ、室温で１時間振とうし、遠心分離 した。 10．ペレットを２mlの0.1Mリン酸塩緩衝液pH7.4 中に分散させ、遠心分離した 。 11．工程10を２回繰り返した。 12．ペレットを２mlの0.1 ％のナトリウムアジドを含有する１％BSA 中に分散 させ、４℃で貯蔵した。 黄色／緑色フッ化球体硫酸塩へのTSH の吸着 １．50μｌの50mgのTSH を350 μｌの0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4中の４mgの フッ化球体硫酸塩に加え、室温で１晩振とうした。 ２．該調製物を、MSE High-Spin20 遠心分離機中で、８℃で15分間、20,000rp m で遠心分離した。 ３．ペレットを２mlの１％BSA に分散させ、１時間振とうし、遠心分離した。 ４．ペレットを２mlの0.5 ％トウイーン20中に分散させ、30分間振とうさせ、 遠心分離した。 ５．ペレットを２mlのリン酸塩緩衝液に分散させ、遠心分離した。 ６．工程４を２回繰返した。 ７．ペレットを0.1 ％ナトリウムアミドを含有する１％BSA 中に分散させ、４ ℃で貯蔵した。 組み合わされた競合または非競合ミクロスポット サンドイッチTSH アッセイ １．各黒のDynatech Micro Fluorミクロ滴定ウエル上に0.1Mリン酸塩緩衝液pH 7.4 中、濃度200 μｇ／mlで抗体の一滴が0.5 μｌの滴を置くことによって、捕 獲抗−TSH 抗体ミクロスポットを作った。滴を直ちに吸引した。 ２．ウエルを１％のBSA であふれさせ、１時間振とうし、リン酸塩緩衝液で洗 浄した。 ３．二重のウエルに200 μｌのTSH 標準液（0，0.01，0.03，0.1，0.3，1.0， 3.0，10，30，75，150 および300μＵ／mlを加え、これらを２時間振とうし、0. 05％トウイーン20を含有するリン酸塩緩衝液で洗浄した。 ４．占有された抗体結合部位を測定するために50μｇ／mlの抗−TSH 現像抗体 が複合した親水性ミクロスフェアの200μｌを全ウエルに加え、これらを１時間 振とうし、リン酸塩−トウイーン20緩衝液で洗浄した。 ５．占有されていない抗体結合部位を測定するために50μｇ／mlのTSH −複合 ミクロスフェア硫酸塩の200 μｌを全ウエルに加え、これらを１時間振とうし、 リン酸塩−トウイーン20緩衝液で洗浄し、レーザー走査共焦点顕微鏡で走査した 。 図５は第２の現像試薬（標準化抗体）と占有された「センサー」抗体結合部位 とを反応させ、第１の現像試薬(標準化TSH)を占有されてない結合部位と反応さ せることによって発せられたシグナルを観察することによって得られた応答曲線 を描く。第１および第２の標識からのシグナルは組み合わさって、被分析物濃度 に対してプロットされた、比Ｒ_Yを与える。したがって、図５は、被分析物濃度 に対するＲ_Yの変化は被分析物濃度の広い範囲にわたって滑らか、すなわち、ア ッセイの実用範囲は従来技術の競合的方法または非競合的方法よりも大きいこと を示す。 図６は、競合的および非競合的データの別々の統計上の分析によって得られた 精度プロフィールと上述したように、データが応答変数としての比Ｒ_Yを信頼し て組み合わされたときに得られたプロフィールの比較を示す。 非競合アッセイ（ＡからＣ）および競合アッセイ（ＤからＥ）の両方の実用範 囲は、Ｂから1000μＵ／mlより上まで広がる組み合わされたアッセイの実用範囲 よりも制限されていることに注意せよ。 このグラフも、ある状況下では、比Ｒ_Yに頼ることを不利にする現象も説明し ている。しかしながら、これらの状況においてデータを異なった方法で処理する ことが可能である。この現象（該比を信頼して該範囲のある部分にわたって得ら れた精度は、別々にデータを処理することにより得られたものと比較して低い） は、比における統計上のエラーは、特に、ミクロスポットにおける結合試薬の量 が一定であれば、個々の測定の１つにおけるそれよりも大きいとい う事実から生じる。この状況下では、低被分析物濃度の試料は非競合的データを 信頼して、高被分析物濃度のものは競合的データを信頼して測定することができ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体試料中の被分析物の濃度を測定する方法であって、 （ａ）液体試料を被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬と、結合部位 の小部分が被分析物によって占有されるように接触させ、 （ｂ）第１および第２の現像試薬を用いて結合試薬を逆滴定し、ここで、第１ の現像試薬は占有されていない結合部位に結合でき、第１の標識を有するもので あり、第２の現像試薬は結合された被分析物または占有された結合部位に結合で き、第１の標識とは異なる第２の標識を有しているものであり、 （ｃ）第１および第２の標識によって生じたシグナルを測定して、被分析物に よって占有された結合部位の部分の表わす数値を供級し、 （ｄ）該数値を既知の濃度の被分析物を含有する一連の標準溶液から得られる 対応する数値と比較して、液体試料中の被分析物の濃度を得る： ことを含んで成る方法。 ２．試料中の被分析物の周囲の濃度が著しく乱されないように少量の結合試薬 を用いる請求項１に記載の方法。 ３．少量の結合試薬が0.1 Ｖ／Ｋモル以下であり、Ｖは液体試料の容積であっ て、Ｋは結合試薬に結合する被分析物についての会合常数である請求項２に記載 の方法。 ４．各結合試薬が与えられた被分析物に対して特異的な結合部位を有している 多数の結合試薬を用いて、液体試料中の多数の異なった被分析物の濃度を測定す る上記請求項のいずれか１項に記載の方法。 ５．結合試薬が支持体上の別々の位置に固定化されている上記請求項のいずれ か１項に記載の方法。 ６．多数の結合試薬のためのアッセイにおいて、多数の異なった結合試薬を、 支持体上のそれらの位置によって別々に区別された異なった結合試薬を含有する 別々の位置を滴定するのに、同じ第１および第２の現像試薬を用いる請求項５に 記載の方法。 ７．特定の被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬が、その被分析物の 一連の濃度測定値が得られるように、支持体上の多数の別々の位置に固定化され る上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。 ８．別々の位置がミクロスポットである請求項５から７のいずれか１項に記載 の方法。 ９．ミクロスポットの面積が１mm²より小さい請求項８に記載の方法。 10．結合試薬が抗原に対する結合部位を有する抗体であるか、核酸被分析物に 結合し得るオリゴヌクレオチドである上記請求項のいずれか１項に記載の方法。 11．上記請求項のいずれか１項に記載の方法による液体試料中の被分析物の濃 度を測定するためのキットであって、 （ａ）被分析物に特異的な結合部位を有する結合試薬である結合試薬を付着さ せた固体支持体、 （ｂ）第１の現像試薬は占有されていない結合部位に結合でき、 第１の標識を有するものであり、第２の現像試薬は結合された被分析物または 占有された結合部位に結合でき、第１の標識とは異なる第２の標識を有している ものである、第１および第２の現像試薬を含んでなる滴定試薬： を含んでなるキット。