ES2227869T3 - Ensayo de proximidad por escintilacion. - Google Patents
Ensayo de proximidad por escintilacion.Info
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Abstract
Uso en el ensayo de proximidad por escintilación de una sustancia luminiscente que tiene una emisión máxima de 480 nm-900 nm y de un dispositivo de carga acoplada para detectar la radiación emitida por la sustancia luminiscente.
Description
Ensayo de proximidad por escintilación.
Esta invención se refiere a ensayos de proximidad
por escintilación, es decir, ensayos u otros experimentos que
implican el principio de proximidad por escintilación.
La tecnología actual de ensayos de proximidad por
escintilación (SPA) implica el uso de perlas escintilantes
fabricadas con silicato de itrio dopado con cerio
(Y_{2}SiO_{5}:Ce) (en lo sucesivo denominado simplemente
silicato de itrio o YSi) o poliviniltolueno (PVT) que contienen un
escintilante orgánico tal como PPO. Los ensayos se realizan en
tampones acuosos usando radioisótopos tales como ^{3}H,
^{125}I,^{14}C, ^{35}S o ^{33}P que emiten radiación de baja
energía, cuya energía se disipa fácilmente en un entorno acuoso.
Por ejemplo, los electrones emitidos por ^{3}H tienen una energía
media de solo 6 keV y tienen una longitud de trayectoria muy corta
(\sim1 \mum) en agua. Si una molécula marcada con uno de estos
isótopos se une a la superficie de la perla directamente o mediante
interacción con otra molécula acoplada previamente a la perla, la
radiación emitida activará al escintilante y producirá luz. La
cantidad de luz producida, que es proporcional a la cantidad de
moléculas marcadas unidas a las perlas, se puede medir de forma
conveniente con un contador de escintilación líquida (LS). Si la
molécula marcada no se une a la superficie de la perla, su energía
de radiación se absorbe en el disolvente acuoso que la rodea antes
de alcanzar la perla y no se produce luz. D esta forma, los
ligandos unidos dan una señal de escintilación pero los ligandos
libres no y se elimina la necesidad de una larga etapa de
separación característica de los ensayos de unión de radioligandos
convencionales. Las manipulaciones requeridas en los ensayos se
reducen a unas pocas etapas simples de pipeteo que generan una
mejor precisión y reproducibilidad. El uso de un ensayo SPA se
describe, por ejemplo, en Baum et al., Anal Biochem, 237,
129-134, 1996.
El documento PCT WO 91/08489 (Packard Instrument
Company Inc.) describe un soporte para usar en un radioinmunoensayo
de proximidad por escintilación, estando el soporte formado por un
material escintilante, teniendo unida a su superficie una
diversidad de ligandos tales como antígenos, anticuerpos, etc., que
pueden unirse de forma selectiva a un reactivo de interés.
Preferiblemente, los vehículos consisten en silicato de itrio
activado con una sal de cerio inorgánica tal como el óxido,
carbonato o cloruro.
El documento WO 94/26413 se refiere al estudio de
procesos celulares y bioquímicos en células vivas o en componentes
celulares. Se describen específicamente dispositivos y métodos para
el estudio de procesos celulares y bioquímicos que usan el principio
de proximidad por escintilación.
La simplicidad del formato de proximidad por
escintilación permite una automatización casi completa de los
ensayos usando procesadores robóticos de muestras y aparatos de
recuento de placas de microtitulación por escintilación. Por
consiguiente, la tecnología SPA puede tener un alto rendimiento, lo
que es particularmente valioso en el caso de ensayos de selección de
muestras o fármacos. Los ensayos SP se han realizado habitualmente
en placas de microtitulación de 96 pocillos que se cuentan de 6 en 6
pocillos cada vez en unos aparatos de recuento de escintilación en
placas de microtitulación especialmente diseñados. La búsqueda de
rendimientos cada vez mayores ha llevado a los fabricantes de estos
contadores a producir instrumentos que pueden contar 12 pocillos
cada vez, doblando de esta forma el rendimiento. También se ha
previsto la llegada de placas de 384 pocillos, aunque en la
actualidad solo se pueden contar de 12 en 12 pocillos cada vez.
Un problema asociado con los SPA es el de la
inactivación con color, causada por la presencia en el medio de
ensayo de compuestos coloreados que absorben la luz emitida por los
tipos de perlas SPA actuales. La inactivación con color atenúa la
señal, reduciendo por tanto la relación señal ruido y por tanto la
sensibilidad. Muchas de las muestras seleccionadas con ensayos SPA
son coloreadas y la mayoría de color amarillo o pardo y absorben luz
en la región azul del espectro visible. Las perlas SPA basadas en
PVT- y Y_{2}SiO_{5}:Ce emiten luz en la región azul (emisión
máxima normalmente en el intervalo de 350 nm-450
nm) y por tanto son susceptibles a este efecto.
Un sistema alternativo de detección adecuado para
usar en aplicaciones de obtención de imágenes de bajo a
ultra-bajo nivel en ciencias biológicas y biomédicas
es la Detección CCD (Charge Coupled Device) que se ha usado, por
ejemplo, en ensayos que implican detección por quimioluminiscencia,
bioluminiscencia y fluorescencia. Las aplicaciones incluyen
inmunoensayos (Hooper et al., J.Biolum.Chemilum., 9,
113-122, (1994)), y el análisis de ácidos nucleicos
marcados fluorescentes específicos por hibridación después de
separación electroforética de muestras de ácido nucleico (documento
EP 214713 de Astromed Ltd.). La obtención de imágenes con luz
ultra-baja usando tecnología CCD es cuantitativa y
rápida y la nueva generación de instrumentos de obtención de
imágenes que usan cámaras CCD como detectores pueden obtener la
imagen de toda una placa de una vez y por tanto tienen un gran
potencial para aumentar el rendimiento de muestras en comparación
con contadores de escintilación en placas de pocillos de
microtitulación. La obtención de imágenes de área, es decir, la
obtención simultánea de imágenes de todos los pocillos en una placa
con pocillos de microtitulación se considera particularmente
ventajosa cuando se usa junto con placas de alta densidad que
contienen 96, 384, 864 o más pocillos, ya que el tiempo que se
necesita para hacer las medidas se reduce de forma significativa en
comparación con técnicas de recuento de escintilación
convencionales.
La tecnología de obtención de imágenes, en
particular, obtención de imágenes de área, también se ha aplicado a
materiales marcados como alternativa a autoradiografía. Este enfoque
se ha usado más ampliamente en aplicaciones tales como el análisis
cuantitativo por electroforesis en 2D (Patterson, et al.,
Biotechniques, 15(6), 1076, (1993)) y localización
del receptor (Tang, et al., Biotechniques,
18(5), 886, (1995)). Una placa para obtención de
imágenes, recubierta con un agente sensible a la radiación (por
ejemplo, sulfuro de estroncio/samario/fluorobromuro de cerio o
bario/europio) se expone a una muestra marcada con isótopos y se
forma una imagen debido a la radiación incidente en el
recubrimiento de metal lantánido que recubre la placa. Después de
la exposición, la imagen se lee por medio de un lector de placas
para obtención de imágenes.
También se ha informado de la detección CCD de
cuentas SPA (Englert, D., Society for Biomolecular Screening,
Second Annual Conference, 14-17 octubre, (1996), p.
209-221) usando microesferas basadas en PVT. Sin
embargo, la cuenta de fotones de los pocillos SPA no fue
suficientemente sensible para obtener resultados utilizables debido
a la baja salida lumínica de las pelas, sub-óptima capacidad de
detección de señal del sistema así como a la inactivación con
muestras coloreadas. Para el recuento de escintilación
convencional, los instrumentos pueden calibrarse para tener en
cuenta la inactivación con color. Sin embargo, en el caso de
detección CCD usando perlas SPA convencionales y en condiciones de
ensayo convencionales, el número de fotones detectados por
desintegración fue insuficiente para permitir la determinación de
los niveles de inactivación y no fue posible corregir la
inactivación. Hasta la fecha no parece haber informes de ensayos de
trabajo en los que se haya obtenido detección y medida de la
muestra usando esta técnica.
La presente invención busca superar los problemas
dobles de baja sensibilidad de la actual detección CCD así como la
inactivación con color en la tecnología de perlas SPA convencional.
La invención proporciona el uso en un ensayo de proximidad por
escintilación de una sustancia luminiscente que tiene una emisión
máxima de 480 nm - 900 nm y de un dispositivo de carga acoplada para
detectar radiación emitida por la sustancia luminiscente.
Un ensayo de proximidad por escintilación es un
ensayo en el que se pone en contacto una superficie que tiene una
sustancia luminiscente con el cuerpo de un líquido que contiene un
radioisótopo. Parte del radioisótopo se inmoviliza adyacente a la
superficie; el resto del radioisótopo permanece disperso o disuelto
en el líquido. La trayectoria libre media de electrones u otras
partículas o radiación que se obtiene como resultado de
desintegraciones radioactivas del radioisótopo son pequeñas en
relación con las dimensiones del cuerpo del líquido, por lo cual la
parte de radioisótopo inmovilizada adyacente a la superficie puede
excitar la sustancia luminiscente de la superficie pero generalmente
esa parte del radioisótopo disperso o disuelto en el líquido está
demasiado lejos de la superficie para poder excitar la sustancia
luminiscente de la superficie.
La superficie puede ser masiva, como por ejemplo
una pared de un vaso o los pocillos de una placa de microtitulación
o multipocilllo; o particulada, por ejemplo con hilos o perlas. La
sustancia luminiscente puede estar presente en forma de
recubrimiento aplicado en una superficie preformada; o puede estar
disperso o constituir parte de la superficie.
El ensayo puede ser un ensayo químico o
bioquímico, por ejemplo un ensayo de competición tal como un
inmunoensayo o un ensayo inmunométrico. O el ensayo puede implicar
un estudio de células vivas que están unidas o se unen a la
superficie que contiene la sustancia luminiscente. En principio, es
adecuado cualquier sistema de ensayo en el que se reparte un
radioisótopo entre una fase sólida y una fase líquida para el método
de la invención.
Un radioisótopo puede estar presente en forma
libre o en forma combinada, por ejemplo, en forma de átomo o ión;
este puede se útil por ejemplo, cuando se desea medir la absorción
del radioisótopo en las células que se adhieren a la superficie que
contiene la sustancia luminiscente. O el radioisótopo puede usarse
para marcar un reactivo de ensayo; esto puede ser útil por ejemplo
cuando se hace que un reactivo marcado compita con un reactivo no
marcado por la unión a otro reactivo inmovilizado en la superficie
que contiene la sustancia luminiscente. Un ensayo de proximidad por
escintilación puede realizarse de forma cualitativa o cuantitativa.
Por ejemplo, pueden hacerse mediciones de forma estática, como
cuando el resultado de un ensayo de competición se determina después
de un tiempo fijo o en equilibrio. Alternativamente, puede
realizarse un ensayo de proximidad por escintilación en modo
dinámico, como cuando se controla la captación del radiomarcaje en
las células en tiempo real. El documento WO 94/26413 describe una
placa de microtitulación escintilante y métodos para estudiar
procesos celulares en tiempo real. La placa de microtitulación
escintilante la comercializa Amersham Lifescience con el nombre
comercial Cytostar-T^{TM}.
El fluido es generalmente un líquido acuoso o de
otro tipo. El radioisótopo es preferiblemente uno que emite
electrones que tiene una trayectoria libre media de hasta 2000
\mum en medio acuoso. Éstos incluyen isótopos usados habitualmente
en bioquímica tales como ^{3}H, ^{125}I, ^{14}C, ^{35}S,
^{45}Ca, ^{33}P y ^{32}P, pero no excluye el uso de otros
radioisótopos tales como ^{55}Fe, ^{86}Rb, ^{109}Cd y
^{51}Cr que también emiten electrones en este intervalo.
El ensayo de proximidad por escintilación se
realiza preferiblemente en los pocillos de una placa multipocillo,
por ejemplo, una placa de microtitulación. La sustancia
luminiscente puede proporcionarse en forma de perlas dispensadas en
los pocillos de tal placa. O la sustancia luminiscente puede
incorporarse en la misma placa, por incorporación directa en el
plástico de la placa o por recubrimiento junto con un agente
enlazante. Son ejemplos de tales agentes de unión el sulfato
cálcico, como el que se usa en la fabricación de placas tic y
plásticos de fusión baja tales como poliestireno o copolímeros de
\alpha-metilestireno y viniltolueno. Estos
dispositivos pueden tener 24, 96 ó 384 pocillos como en las placas
existentes o pueden tener densidades mayores tales como 864, 1536,
2400 3456 o de hecho cualquier número deseado. Pueden usarse para
realizar ensayos basados en células y ensayos de unión a ligando
junto con dispositivos para obtención de imágenes basados en cámaras
CCD. La sustancia luminiscente tiene preferiblemente un máximo de
emisión de 500 nm - 700 nm, es decir, en la región verde o amarilla
o roja del espectro. Las sustancias luminiscentes se estimulan con
electrones de baja energía o radiación resultante de
desintegraciones radioactivas del radioisótopo. Estas sustancias
luminiscentes tienen generalmente una mayor rendimiento lumínico que
las perlas SPA basadas en PBT o perlas de Y_{2}SiO_{5}:Ce y
permiten obtener imágenes satisfactorias en ensayos SPA. Además,
todos los pocillos de muestra de una placa de microtitulación con
pocillos pueden barrerse simultáneamente por medio de detección
CCD. La mayor longitud de onda de las emisiones verde o roja
reducen el problema de inactivación con color que está como mucho en
la región azul del espectro. Algunas sustancias luminiscentes están
disponibles en el mercado para aplicaciones industriales, por
ejemplo en tecnologías de tubos de rayos catódicos, sustancias
luminiscentes de lámparas y sustancias luminiscentes de rayos X.
Véase, por ejemplo, Blasse y Grabmaier, Luminescent Materials,
Springer-Verlag, Berlín, (1994) y la Patente de
Estados Unidos 5.435.937. La preparación de suspensiones con carga
estabilizada de pequeñas partículas de sustancia luminiscente (por
ejemplo, oxisulfuro de itrio-Eu^{3+}, oxisulfuro
de itrio-Tb^{3+}) y su unión a anticuerpos para
dar conjugados inmunoreactivos se ha descrito (Beverloo, et
al., Cytometry, 13, 561-570 (1992)). Los
conjugados de sustancia luminiscente se usaron en aplicaciones
inmunocitoquímicas para su unión a células, seguido de visualización
usando un microscopio fluorescente con excitación de luz UV. Sin
embargo, hasta el momento, no se ha descrito el uso de tales
sustancias luminiscentes en aplicaciones de conteo que implican
trazadores radioactivos, particularmente SPA.
Hay muchas sustancias luminiscentes adecuadas que
pueden usarse. Algunos consisten en un material hospedador dopado
con un activador. Son ejemplos de tales materiales hospedadores de
silicato de itrio, óxido de itrio, oxisulfuro de itrio, óxido de
galio aluminio itrio (YAG), granate de aluminio itrio, fluoruro de
itrio sodio (NaYF_{4}), fluoruro de lantano, oxisulfuro de
lantano, fluoruro de itrio (YF_{3}), galato de itrio, fluoruro de
gadolinio (GdF_{3}), fluoruro de itrio bario (BaYF_{5} o
BaY_{2}F_{8}), oxisulfuro de gadolinio, silicato de cinc,
sulfuro de cinc y vanadato de itrio. El activador es generalmente
un resto lantánido o actínido.
Otras sustancias luminiscentes son quelatos
orgánicos de restos lantánidos o actínidos. La emisión de luz se
puede mejorar combinando o mezclando el quelato de lantánido o
actínido con un potenciador de base Lewis tal como por ejemplo un
imidofosforano. En el documento EPA 556005 se describen ejemplos de
sustancias luminiscentes de este tipo. Pueden usarse
convenientemente en solución o dispersión en poliestireno u otro
polímero orgánico.
La identidad del resto lantánido o actínido
determina la longitud de onda de emisión de la sustancia
luminiscente. Los restos preferidos se seleccionan entre terbio,
europio, erbio, tulio, holmio, disprosio, samario, iterbio, lutecio,
gadolinio, uranio y uranilo UO_{2}, generalmente en forma de
iones +2 o +3.
Se hace referencia a las ilustraciones
adjuntas.
La figura 1 muestra la señal detectada con CCD de
partículas inorgánicas de sustancia luminiscente con perlas SPA de
PVT y partículas de silicato de itrio como comparación.
La figura 2 muestra la señal detectara con CCD de
perlas de quelato orgánico con perlas SPA de PVT para
comparación.
La figura 3 muestra el espectro de absorbancia de
los marcadores usados en el Ejemplo 2.
La figura 4 muestra el espectro de emisión de SPA
PVT, partículas de silicato de itrio, Y_{2}O_{3}:Eu y partículas
de YAG:Tb.
La figura 5 muestra la evaluación de partículas
inorgánicas de sustancia luminiscente recubiertas con estreptavidina
en un ensayo de proximidad por escintilación con transcripción
inversa detectadas con un sistema de obtención de imágenes por
CCD.
La figura 6 muestra la inhibición de la
transcriptasa inversa del VIH con ácido aurintricarboxílico, usando
perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina y obtención de
imágenes por CCD.
La figura 7 muestra la comparación de la señal
detectada por CCD; con perlas recubiertas por PST WGA y receptor
ChOA1/agonista PIA en el ensayo de receptor unido a proteína G
marcada con [^{35}S]GTPyS con la señal de recuento por
escintilación de perlas SPA recubiertas con PVT WGA.
La figura 8 muestra la inhibición de la unión de
[^{125}I]EGF a perlas de poliestireno recubiertas con WGA
usando obtención de imágenes por CCD.
La figura 9 muestra la comparación de relaciones
señal ruido obtenidas con perlas recubiertas con estreptavidina PST
y partículas de sustancia luminiscente recubiertas con
estreptavidina con obtención de imágenes por CCD y perlas SPA
recubiertas con estreptavidina PVT y recuento por escintilación.
La figura 10 muestra la comparación del uso de
microplacas con ALP-1 al 2% p/p y placas
Cytostar-T usadas para medir la captación de
[^{14}C] timidina en células proliferantes, usando un sistema de
obtención de imágenes CCD.
La figura 11 muestra la comparación del uso de
microplacas con ALP-1 al 2% p/p y placas
Cytostar-T usadas para medir la captación de
[^{14}C]metionina en células proliferantes, usando un
sistema de obtención de imágenes CCD.
Las sustancias luminiscentes inorgánicas
Y_{2}O_{3}:Eu, Y_{2}O_{2}S:Eu y YAG:Tb y perlas de quelatos
orgánicos preparadas con poliestireno que contiene
tris(2,2,6,6-tetrametil-3,5-heptanodionato)terbio
III-difenil-fosfonimido-trifenilfosforano
(en lo sucesivo denominado ALP-1) o
tris(naftoiltrifluoroacetonato)europio
III-(difenil-fosfonimido-trifenilfosforano)
1 ó 2 (en lo sucesivo denominado ALP-7 o
ALP-7-diphos respectivamente) se
recubrieron en superficie con estreptavidina y se compararon con
perlas SPA de poliviniltolueno (PVT) recubiertas con estreptavidina
y partículas de silicato de itrio recubiertas con estreptavidina en
un ensayo de unión de [^{3}H]biotina. El recubrimiento de
partículas con proteínas, tales como estreptavidina y otras especies
bioactivas de forma covalente o por adsorción física se realiza por
métodos convencionales que conocen los especialistas en la
técnica.
Las sustancias luminiscentes inorgánicas usadas
en los experimentos ejemplares son materiales conocidos y se han
obtenido en distribuidores comerciales en formas modificadas para
facilitar su uso en ensayos de proximidad por escintilación. Las
perlas de quelato orgánico se han preparado por métodos
tradicionales que conocen los especialistas en la técnica. Las
partículas usadas para este experimento ejemplifican la detección
por CCD de los distintos reactivos pero no son necesariamente
formulaciones óptimas de dichos reactivos. El aparato de obtención
de imágenes CCD usado en los siguientes ejemplos es un sistema
prototipo proporcionado por Molecular Devices Inc. e incorpora una
cámara CCD refrigerada por nitrógeno líquido, proporcionada por
Princeton Instruments Inc. Se espera que otros sistemas de obtención
de imágenes CCD alternativos en desarrollo den una respuesta
relativamente similar con los distintos tipos de partículas y
placas con una mayor sensibilidad. Para los ejemplos que emplean
placas de microtitulación con paredes blancas se usó un filtro de
paso banda apropiado para eliminar la fosforescencia de las
placas.
Se suspendieron partículas recubiertas con
estreptavidina y perlas SPA de PVT en solución salina con tampón
fosfato a pH 7,4 que contenía azida sódica al 0,01% p/v (en lo
sucesivo azida PBS) a 5 mg/ml. Se prepararon soluciones de
[^{3}H]biotina (Amersham TRK753) en azida PBS que contenían
5,1, 10,3 y 20,7 pmoles de biotina in 100 \mul. En los pocillos de
una microplaca negra se pipetearon muestras de 100 \mul de
suspensiones de partículas. Las suspensiones de partículas se
mezclaron mecánicamente para asegurar la homogeneidad de las
muestras. 100 \mul de cada una de las tres soluciones de
[^{3}H]biotina se añadieron a los pocillos que contenían
las distintas partículas. Después de las adiciones, la placa se
cerró herméticamente y después se incubó en un agitador de
microplacas durante 60 minutos a temperatura ambiente. La señal SPA
se detectó usando un sistema de obtención de imágenes con cámara
CCD. La unión no específica de [^{3}H]biotina a las
partículas se examinó midiendo la señal detectada en presencia de
un gran exceso de biotina no marcada. En todas las partículas
ensayadas la unión no específica de la [^{3}H]biotina fue
insignificante (no mayor del 3% y típicamente no mayor de 1% de la
señal en los pocillos de control).
Los resultados de las figuras 1 y 2 muestran la
señal generada usando tres niveles de [^{3}H]biotina unida
a 500 \mug de partículas de sustancia luminiscente recubiertas
con estreptavidina, partículas de poliestireno que contiene
quelatos orgánicos de europio y terbio y partículas SPA
convencionales.
Los datos del Ejemplo 1 demuestran que la señal
CCD generada con la unión de [^{3}H]biotina a
Y_{2}O_{2}S:Eu, Y_{2}O_{3}:Eu y YAG:Tb recubiertos con
estreptavidina fue al menos 10 veces mayor que la señal de SPA con
PVT. Las perlas de
poliestireno/ALP-7-diphos generan
aproximadamente 3 veces la señal de las perlas SPA de PVT.
La inactivación de la señal (cuentas) con
compuestos coloreados es un fenómeno bien conocido en el conteo por
escintilación convencional. El solapamiento espectral de las
emisiones de materiales escintilantes con el espectro de absorción
de los materiales coloreados es un prerrequisito para que esto se
aprecie. Se han escogido marcadores para cubrir el intervalo de
colores de muestra que se encuentra normalmente en ensayos de
selección por SPA (véase el espectro de absorción de marcador en la
figura 3 con el espectro de emisión de SPA de PVT, silicato de
itrio, Y_{2}O_{3}:Eu y YAG:Tb en la figura 4 como referencia).
Se montó un ensayo modelo para ilustrar una de las ventajas del uso
de partículas que emiten con una larga longitud de onda para la
detección de la señal, en presencia de compuestos coloreados con un
sistema de obtención de imágenes CCD.
Se usó un ensayo de unión de
[^{3}H]biotina para determinar el efecto de los compuestos
coloreados en el la señal generada usando partículas de sustancia
luminiscente Y_{2}O_{2}S:Eu, Y_{2}O_{3}:Eu y YAG:Tb en
comparación con perlas de silicato de itrio y SPA PVT.
Adicionalmente, la inactivación relativa de las perlas de
poliestireno con quelato orgánico se comparó con la de las perlas
SPA PVT.
Se suspendieron partículas de sustancia
luminiscente recubiertas con estreptavidina, perlas SPA de quelatos
orgánicos que contienen poliestireno, silicato de itrio y PVT en
azida PBS, a 5 mg/ml.
Se disolvió amarillo ácido (Sigma
A-4520) en azida PBS a 360 \mug/ml.
Se disolvió tartrazina (Sigma
T-0388) en azida PBS a 214 \mug/ml.
Se disolvió naranja de metilo (Sigma
M-3132) en azida PBS a 196 \mug/ml.
Se disolvió rojo neutro (Raymond and Lamb lote
5769) en azida PBS a 234 \mug/ml.
[^{3}H]Biotina (Amersham TRK753) se
diluyó en azida PBS a 107 nM.
Se pipetearon alícuotas de 100 \mul de cada
suspensión de perlas (500 \mug) en el número apropiado de
pocillos de microplacas negras seguido de 100 \mul de la solución
de [^{3}H] biotina. Las placas se incubaron durante
aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la
unión completa de biotina a las partículas. Se añadieron 10 \mul
de las 4 soluciones de marcador a los pocillos por cada una de las
partículas del ensayo con 10 \mul de tampón a los pocillos de
control. Las placas se incubaron en un agitador de microplacas
durante 60 minutos a temperatura ambiente. La señal SPA se detectó
usando el sistema de obtención de imágenes CCD.
Las concentraciones de los pocillos se fijaron a
niveles que dan una absorbancia en el intervalo de 0,3 a 0,5 en la
máxima longitud de onda de captación de cada marcador, al medirse en
un espectrofotómetro con una longitud de trayectoria de 1 cm.
Los resultados, mostrados en la Tabla 1, indican
que las partículas o perlas de quelato orgánico que contienen
europio no muestran inactivación de la señal con los marcadores
analizados en este experimento. Las perlas SPA de PVT y las
partículas de silicato de itrio, como las empleadas en los ensayos
SPA convencionales, muestran una notable inactivación de señal con
estos marcadores. Las partículas de sustancia luminiscente y perlas
de quelato orgánico que contienen terbio se inactivan en cierta
medida con el marcador neutral red. Esta última observación se
desprendería del solapamiento parcial del espectro de absorción de
rojo neutro con el espectro de emisión del terbio.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Este ejemplo demostró que los marcadores que
tienen un espectro de absorción que se solapa con el espectro de
emisión de los escintilantes de las perlas SPA de PVT o silicato de
itrio, pueden causar la inactivación de la luz emitida de dichas
especies cuando se excitan con un radiomarcador unido. La señal
detectada por CCD con partículas de sustancia luminiscente que
contenían europio o terbio o quelatos orgánicos de dichos materiales
incorporados en matrices poliméricas no se inactivaron de forma
significativa en presencia de estos marcadores.
Se preparó un experimento para comparar la
inactivación de la señal dependiente de la concentración de las
distintas partículas bajo investigación detectada con un dispositivo
de obtención de imágenes CCD y un contador por escintilación
convencional.
Se suspendieron partículas de sustancia
luminiscente recubiertas con estreptavidina, perlas
ALP-7-diphos (poliestireno), perlas
SPA de PVT y partículas de silicato de itrio en azida PBS a 10
mg/ml.
Se disolvió tartrazina (Sigma
T-0388) en azida PBS a 1070 \mug/ml. Se diluyó
[^{3}H]Biotina (Amersham TRK 753) en azida PBS a 103
nM.
Se pipetearon alícuotas de 100 \mul de
suspensiones de partículas en el número apropiado de pocillos de
placas de microtitulación. Se añadieron 100 \mul de la solución
madre de [^{3}H]biotina (10,3 pmoles) a cada pocillo. Las
placas se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos para
permitir la unión total de biotina a las partículas. La solución de
tartrazina (1, 2, 4 u 8 \mul) se pipeteó en los pocillos
apropiados de la placa, añadiendo azida PBS hasta un volumen final
de 208 \mul por pocillo. Se establecieron puntos de datos por
triplicado para contener 5,1, 10,2, 20,4 y 40,8 \mug/ml de
tartrazina respectivamente. Las placas se incubaron en un agitador
de microplacas durante 60 minutos a temperatura ambiente. La señal
SPA se detectó usando un sistema de obtención de imágenes CCD. La
placa se contó en un contador por escintilación Wallac
MicroBeta^{TM}.
Los resultados de este ejemplo se muestran en la
Tabla 2. Para las partículas de silicato de itrio se aprecia que se
observan altos niveles de inactivación de señal en la detección con
CCD (33-58%) y también en condiciones de recuento
SPA convencionales (54-82%). El nivel observado de
inactivación de señal está relacionado con la concentración de
tartrazina presente, observándose mayores niveles de inactivación
con mayores niveles de tartrazina añadida. La señal detectada con
CCD para partículas inorgánicas de sustancia luminiscente muestra
una inactivación significativa de la señal con el mayor nivel de
marcador usado (equivalente a aproximadamente una lectura de
absorbancia de 2 con un máximo de longitud de onda en un
espectrofotómetro con una longitud de trayectoria de 1 cm). La
inactivación de la señal detectada con CCD en perlas SPA de PVT
(2-15%) es menos pronunciada que la observada para
partículas de silicato de itrio pero todavía es significativa. El
conteo por escintilación convencional de perlas SPA PVT con los 4
niveles de tartrazina presentes muestran una inactivación de la
señal muy alta (37-87%) y ejemplifica la necesidad
de corrección de inactivación con color en ensayos SPA
convencionales. Las perlas
ALP-7-diphos de poliestireno no
muestran una inactivación significativa de la señal detectada con
CCD en este experimento (no mayor del 4%).
La corrección de la inactivación con color es
necesaria para realizar satisfactoriamente ensayos SPA usando perlas
SPA de PVT o partículas de silicato de itrio. Para sustancias
luminiscentes inorgánicas o perlas de quelato orgánicos que
contienen europio y terbio se observan niveles insignificantes de
inactivación. Por lo tanto, se evita la necesidad de corrección de
inactivación con color, si se emplea detección con CCD.
El ensayo SPA con enzima transcriptasa inversa
(Amersham NK 8972) es un sistema de ensayo homogéneo que usa un
sustrato enzimático con un oligonucleótido ADN/ARN tratado con
biotina que se captura en perlas SPA de PVT para la cuantificación.
En este ensayo se compararon partículas de Y_{2}O_{3}.Eu y
YAG:Tb recubiertas con estreptavidina con perlas SPA de PVT con
estreptavidina.
Se añadió cebador/molde biotinilado listo para
condensar a los pocillos de una microplaca negra. A esto le siguió
[^{3}H]TTP (Amersham TRK576) en una mezcla 75 nM de dATP,
dCTP, dGTP y TTP con tampón de Tris/HCl 50 mM pH 8,0, KCl 80 mM,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM y 0,05% p/v de Nonidet P40. Las
reacciones se iniciaron con adición de 0,075, 0,15 ó 0,3 unidades de
transcriptasa inversa de VIH (Amersham T3610Y). Las placas se
incubaron a 37ºC durante 30 minutos y se finalizó con la adición de
reactivo de parada. Se añadieron 0,5 mg de la sustancia
luminiscente recubierta con estreptavidina o perlas SPA de PVT
apropiadas y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante
10 minutos. La señal generada se detectó usando un sistema de
obtención de imágenes CCD.
Los resultados, ilustrados en la figura 5,
muestran que la incorporación de nucleótido radiomarcado era
dependiente de la cantidad de enzima transcriptasa inversa usada.
Los datos muestran que se observaron señales máximas de 3.200, 3.100
y 300 usando 0,3 unidades de transcriptasa inversa HIV en un ensayo
de 30 minutos con Y_{2}O_{3}:Eu y YAG:Tb y con perlas SPA de PVT
respectivamente.
Este ejemplo muestra que la señal CCD generada en
el sistema SPA con transcriptasa inversa fue al menos 10 veces mayor
usando Y_{2}O_{3}:Eu y YAG:Tb que con Perlas SPA de PVT.
El ensayo SPA con enzima transcriptasa inversa
(Amersham NK8972) es un sistema de ensayo homogéneo que usa un
sustrato enzimático con oligonucleótido ADN/ARN tratado con biotina
que se captura en perlas SPA de PVT para cuantificación. En este
ensayo, se usaron perlas de quelato orgánico recubiertas con
estreptavidina preparadas con poliestireno (PST) que contiene
europio y se determinó la inhibición de la transcriptasa inversa con
ácido aurintricarboxílico.
Se añadió cebador/molde biotinilado listo para
condensar a los pocillos de una microplaca blanca. A esto le siguió
[^{3}H]TTP (Amersham TRK576) en una mezcla 127 nM de dATP,
dCTP, dGTP y TTP con tampón de Tris/HCl pH 8,0, KCl 80 mM,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM y 0,05% p/v de Nonidet P40. Se añadió
ácido aut+rintricarboxílico en concentraciones entre 0,05 y 1 \muM
y las reacciones se iniciaron con adición de 0,05 unidades de
transcriptasa inversa HIV (Amersham T3610Y). Las placas se incubaron
a 37ºC durante 20 minutos y se finalizó con la adición de reactivo
de parada. Se añadieron 0,1 mg de perlas de PST recubiertas con
estreptavidina y las placas se incubaron durante una noche a
temperatura ambiente. La señal generada se detectó usando un sistema
de obtención de imágenes CCD.
Los resultados, ilustrados en la figura 6,
muestran la inhibición de la actividad transcriptasa inversa con
ácido aurintricarboxílico. Los datos muestran que puede conseguirse
una inhibición del 85% con 1 \muM de inhibidor y se determinó un
valor IC_{50} de 0,23 \muM. Esto es comparable al valor de 0,18
\muM determinado para el ensayo SPA.
Este ejemplo muestra que se pueden usar perlas de
poliestireno con europio y un inhibidor conocido de la transcriptasa
inversa para determinar valores IC_{50} en el ensayo SPA con
transcriptasa inversa con obtención de imágenes por CCD.
El ensayo con receptor unido a proteína G
GTP\gammaS (Amersham RPNQ0210) es un sistema de ensayo homogéneo
que usa perlas SPA de PVT recubiertas con aglutinina de germen del
trigo (WGA) para unirse al receptor. La actividad inducida con
agonista o inducida con agonista inverso de los receptores unidos a
proteínas de unión GTP (proteínas G) puede cuantificarse
directamente en presencia de [^{35}S] GTP\gammaS y GDP
añadidos. Por lo tanto, en este ensayo se compararon las perlas de
quelato orgánico recubiertas preparadas con poliestireno (PST) que
contiene europio con perlas SPA de PVT recubiertas con aglutinina de
germen del trigo (WGA).
3,75 \mug de receptor A1 de adenosina de rata
clonada (BioSignal BSR-MA1R), 0,375 mg de perlas
recubierta con WGA apropiadas, 10 \muM de agonista de
(-)-N^{6}-(2-fenilisopropiladenosina)
(PIA), 5 \muM de GDP, +/- 10 \muM de GTP\gammaS (para
determinar la unión no específica) y 0,2-0,4 nM de
[^{35}S]GTP\gammaS se añadieron a los pocillos de una
microplaca blanca en un volumen final de 50 \mul de tampón de
ensayo que comprendía HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM y
EDTA 1 mM pH 7,4. Las placas se incubaron a temperatura ambiente
durante 30 minutos y después se centrifugaron durante 10 minutos a
1200 rpm y 15ºC. La señal generada se detectó usando el Sistema de
obtención de imágenes CCD.
Los resultados, ilustrados en la figura 7,
muestran el contador de escintilación y las señales generadas en el
ensayo SPA de receptor unido a proteína G GTP\gammaS en presencia
y ausencia de agonista PIA usando perlas de obtención de imágenes de
PST recubiertas con WGA. Los datos muestran que se puede conseguir
una relación señal ruido similar en el ensayo con imágenes a la
obtenida en el ensayo SPA.
Este ejemplo muestra que las perlas de
poliestireno con europio pueden usarse con un radiomarcador de
[^{35}S] en un ensayo de receptor miniaturizado dando una relación
señal ruido comparable a la obtenida con SPA convencional.
La interacción de EGF (Amersham IM196) con el
receptor de EGF (EGF-R) expresada con la línea
celular humana A431 puede estudiarse usando SPA en un sistema de
ensayo homogéneo en el cual el receptor se captura en perlas SPA de
PVT recubiertas con WGA. En este ensayo, se usaron perlas de
quelatos orgánicos recubiertas con WGA preparadas con poliestireno
(PST) que contiene europio y se determinó la inhibición de la unión
a EGF.
Se unió 25 \mug de membrana A431 (preparación
casera) a 0,25 mg de perlas PST recubiertas con WGA durante 2 horas
a temperatura ambiente. Esto se traspasó a una microplaca blanca y
se añadió 400 pM de [^{125}I]EGF (Amersham IM196) en
tampón de ensayo compuesto por HEPES 20 mM pH 7,5. CaCl_{2} 2 mM,
0,1% (p/v) BSA fracción V, con EGF no marcado en concentraciones de
entre 0 y 100 nM. Las placas se incubaron a temperatura ambiente
durante 3 horas y la señal se detectó usando el sistema de
obtención de imágenes CCD.
Los resultados, ilustrados en la figura 8,
muestran la inhibición de la unión de EGF a perlas de PST
recubiertas con WGA. Con los datos, se determinó un valor IC_{50}
de 5 nM que es comparable al valor de 2 nM determinado para el
ensayo SPA.
Este ejemplo muestra que se pueden usar perlas de
poliestireno con europio y EGF no marcado para determinar valores
IC_{50} en el ensayo de unión de receptor [^{125}I]EGF
con obtención de imágenes por CCD.
El ensayo SPA con [^{33}P] con quinasa con
proteína activada por mitógeno (MAP) (Amersham RPNQ0220) es un
sistema de ensayo homogéneo que usa perlas SPA de PVT recubiertas
con estreptavidina para unirse al sustrato de proteína básica de
mielina tratada con biotina (bMBP) marcado con [^{33}P]. En este
ensayo, se compararon perlas de quelato orgánico recubiertas con
estreptavidina preparadas con poliestireno (PST) que contiene
europio y partículas de sustancia luminiscente inorgánica dopadas
con europio con perlas SPA de PVT recubiertas con
estreptavidina.
Se añadió tampón de reacción que contenía 50
pmoles de sustrato bMBP, 25 pmoles de ATP, 250 nmoles de MgCl_{2}
y MOPS 50 mM a los pocillos de una microplaca blanca. Después se
añadieron 0,1 \muCi de [^{33}P] ATP (BF1000) y enzima
ERK-1 de 0,01 \mug a 2 \mug. Las placas se
incubaron a 37ºC durante 30 minutos y la reacción se terminó por
adición de tampón de parada que contenía ATP 50 mM y 0,25 mg de cada
tipo de perla. Las placas se centrifugaron durante 10 minutos a 800
rpm y 15ºC. La señal generada se detectó usando el sistema de
obtención de imágenes CCD.
Los resultados, ilustrados en la figura 9,
muestran la relación señal ruido generada en el ensayo con enzima
quinasa MAP usando perlas PST recubiertas con estreptavidina y de
sustancia luminiscente y perlas SPA de PVT. Los datos muestran que
puede lograrse una relación señal ruido similar o mejor en el ensayo
de obtención de imágenes que la conseguida con el ensayo SPA.
Este ejemplo muestra que se pueden usar
partículas de sustancia luminiscente y perlas de poliestireno con
europio con radiomarcador [^{33}P] en un ensayo con enzima
miniaturizado para dar una relación señal ruido comparable o mejor
que la obtenida con SPA convencional.
Las microplacas de 96 pocillos que se fabricaron
para incorporar la ALP-1 en la base de la placa se
evaluaron en aplicaciones Cytostar-T. Las placas
ALP-1 al 2% p/p se compararon con placas
Cytostar-T en un ensayo de captación de
[^{14}C]timidina usando células adherentes.
Las células V-79 (ECACC Nº
86041102) se cultivaron de manera rutinaria a 37ºC en un incubador
humidificado con CO_{2} al 5% en DMEM (ICN/FLOW
12-332-54) suplementado con FBS al
10% (GIBCO/BRL 10099-117),
L-glutamina 2 mM (ICN/FLOW 16-801-49), 50 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina (ICN/FLOW 16-700-49). Para el subcultivo rutinario las células se pasaron con una dilución de 1:20 a 1:40.
L-glutamina 2 mM (ICN/FLOW 16-801-49), 50 IU/ml de penicilina y 200 \mug/ml de estreptomicina (ICN/FLOW 16-700-49). Para el subcultivo rutinario las células se pasaron con una dilución de 1:20 a 1:40.
Se sedimentaron células V-79 con
una concentración de 1 x 10^{4}/pocillo en placas
ALP-1 p/p al 2% y Cytostar-T y se
incubaron durante 24 horas a 37ºC con CO_{2} al 5%. Después de
esta incubación inicial se añadió 0,5 \muCi de
[^{14}C]timidina (Amersham CFA532) a las células. La
captación de timidina se siguió durante 24 horas contando las
placas a intervalos. Las placas se incubaron a 37ºC con CO_{2} al
5% cuando no estaban bajo recuento. La señal generada se contó
usando el sistema de obtención de imágenes CCD.
Los resultados de la figura 10 muestran que la
captación de [^{14}C]timidina en las células
V-79 era dependiente del periodo de incubación. Se
observaron señales de captación máxima de [^{14}C] de 5437 y 6953
para placas ALP-1 p/p al 2% y
Cytostar-T respectivamente después de 24 horas.
Los datos de este ejemplo muestran que la señal
CCD generada en un ensayo de captación de [^{14}C]timidina
usando una placa ALP-1 p/p al 2% fue comparable a la
de la placa Cytostar-T.
Las placas ALP-1 al 2% p/p se
compararon con placas Cytostar-T en un ensayo de
captación de [^{14}C]metionina. En este experimento se
usaron los procedimientos y condiciones del Ejemplo 9.
Se sedimentaron células V-79 con
una concentración de 5x10^{3}/pocillo en placas
ALP-1 p/p al 2% y Cytostar-T y se
incubaron durante 24 horas a 37ºC con CO_{2} al 5%. Después de
esta incubación inicial el medio se aspiró de los pocillos y las
monocapa celular se lavó una vez con la solución salina con tampón
fosfato, se añadieron a las células 200 \mul de DMEM desprovisto
de metionina (ICN/FLOW 16-422-49)
que contenía 0,5 \muCi de [^{14}C]metionina. La
captación de metionina se siguió durante 24 horas contando las
placas a intervalos. Las placas se incubaron a 37ºC con CO_{2} al
5% cuando no estaban bajo recuento. La señal generada se contó
usando el sistema de obtención de imágenes CCD.
Los resultados de la figura 11 muestran que la
captación de [^{14}C]metionina era dependiente del periodo
de incubación, observando señales de captación máxima de 15865 y
18455 para placas ALP-1 p/p al 2% y
Cytostar-T respectivamente después de 24 horas.
Los datos de este ejemplo muestran que la señal
CCD generada en un ensayo de captación de
[^{14}C]metionina usando una placa ALP-1
p/p al 2% fue comparable a la de la placa
Cytostar-T.
Claims (10)
1. Uso en el ensayo de proximidad por
escintilación de una sustancia luminiscente que tiene una emisión
máxima de 480 nm-900 nm y de un dispositivo de carga
acoplada para detectar la radiación emitida por la sustancia
luminiscente.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el ensayo de proximidad por escintilación se realiza en pocillos
de una placa multipocillo.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el
que el dispositivo de carga acoplada se usa para obtener imágenes de
forma simultánea de todos los pocillos de la placa multipocillo.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia luminiscente tiene
una emisión máxima de 500 nm-700 nm.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la sustancia luminiscente es un
material hospedados inorgánico dopado con un activador que es un
resto lantánido o actínido.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la sustancia luminiscente es un
quelato orgánico de un resto lantánido o actínido.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 5 o la
reivindicación 6 en el que el resto lantánido o actínido se
selecciona entre terbio, europio, erbio, tulio, holmio, disprosio,
samario, iterbio, lutecio, gadolinio, uranio y uranilo
UO^{3+}_{2}.
8. Un método para realizar un ensayo de
proximidad por escintilación, proporcionando una superficie sólida
que comprende una sustancia luminiscente en un medio fluido,
haciendo que un reactivo radiomarcado se divida en dos fracciones,
una unida a la superficie sólida y la otra en el medio fluido y
detectar la fracción de reactivo radiomarcado unida a la superficie
sólida,
caracterizado por usar una sustancia
luminiscente que tiene un máximo de emisión de 480
nm-900 nm y un dispositivo de carga acoplada para
detectar la radiación emitida por la sustancia luminiscente.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el
ensayo de proximidad por escintilación se realiza en pocillos de una
placa multipocillo y el dispositivo de carga acoplada se usa para
obtener imágenes de forma simultánea de todos los pocillos de la
placa multipocillo.
10. El método de la reivindicación 8 o la
reivindicación 9, en el que la sustancia luminiscente es un quelato
orgánico de europio o un material hospedador inorgánico dopado con
europio.
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Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6524786B1 (en) * | 1997-08-18 | 2003-02-25 | Amersham Plc | Scintillation proximity test |
| GB2342350A (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-12 | Univ Nottingham Trent | Solid supports containing oxazole scintillants |
| JP4282251B2 (ja) * | 2000-08-02 | 2009-06-17 | 富士フイルム株式会社 | 生化学解析用ユニットおよびそれを用いた生化学解析方法 |
| GB0027516D0 (en) * | 2000-11-10 | 2000-12-27 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Support and method for cell based assays |
| GB0107563D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | NO synthase assay particles and method |
| US7011814B2 (en) * | 2001-04-23 | 2006-03-14 | Sicel Technologies, Inc. | Systems, methods and devices for in vivo monitoring of a localized response via a radiolabeled analyte in a subject |
| KR100483314B1 (ko) * | 2002-03-23 | 2005-04-15 | 학교법인 인제학원 | 디지털 엑스레이 이미지 디텍터 |
| US7072628B2 (en) * | 2002-04-05 | 2006-07-04 | Qualcomm, Incorporated | Method and apparatus for determining receive diversity in mobile station |
| US7454006B2 (en) * | 2003-01-31 | 2008-11-18 | Qwest Communications International Inc. | Systems, methods and apparatus for providing a plurality of telecommunication services |
| GB0403913D0 (en) * | 2004-02-21 | 2004-03-24 | Amersham Biosciences Uk Ltd | P-glycoprotein assay |
| CN1280623C (zh) | 2004-07-16 | 2006-10-18 | 北京博奥生物芯片有限责任公司 | 一种用于荧光仪器校准测量的校准基片及其制备方法 |
| CA2618715C (en) * | 2005-08-11 | 2015-05-19 | Perkinelmer Las, Inc. | Assay particles and methods of use |
| EP1994407A4 (en) | 2005-12-30 | 2009-05-20 | Turun Yliopisto | METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION, LOAD OR SIZE UNIT OF A SUBSTANCE |
| DE102006031563A1 (de) * | 2006-06-27 | 2008-01-03 | Dieter Ebert | Lumineszenzstoff-Zusammensetzung |
| AU2015219097B2 (en) * | 2014-02-18 | 2021-02-11 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Substrate clearance assays for lysosomal enzymes |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4415808A (en) * | 1980-12-24 | 1983-11-15 | General Electric Company | Scintillation detector array employing zig-zag plates |
| GB8513538D0 (en) | 1985-05-29 | 1985-07-03 | Mackay C D | Electrophoresis |
| JPS6247555A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-03-02 | エフ．ホフマン ― ラ ロシュ アーゲー | シンチレ−シヨン近接定量法 |
| US4922092A (en) * | 1986-11-26 | 1990-05-01 | Image Research Limited | High sensitivity optical imaging apparatus |
| WO1991008489A1 (en) * | 1989-12-01 | 1991-06-13 | Packard Instrument Company, Inc. | Scintillation proximity radioimmunoassay using solid scintillator support body |
| EP0510753B1 (en) * | 1991-04-26 | 1996-10-23 | Agfa-Gevaert N.V. | Luminescent article with protective coating and manufacture |
| EP0688849B1 (en) * | 1992-02-14 | 2000-01-12 | Nycomed Amersham plc | Fluorescent compounds |
| DE69302192T2 (de) * | 1992-02-14 | 1996-11-14 | Amersham Int Plc | Fluoreszente Verbindungen |
| JPH0627023A (ja) * | 1992-07-07 | 1994-02-04 | Toto Ltd | 光バイオセンサー |
| US5698397A (en) * | 1995-06-07 | 1997-12-16 | Sri International | Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques |
| FI925064A (fi) * | 1992-11-09 | 1994-05-10 | Erkki Juhani Soini | Metod och apparatur foer bioaffinitetsbestaemningar |
| WO1994026413A1 (en) * | 1993-05-17 | 1994-11-24 | Amersham International Plc | Devices and methods for the measurement of cellular biochemical processes |
| JPH072955U (ja) * | 1993-06-17 | 1995-01-17 | アロカ株式会社 | マイクロプレート |
| US6319530B1 (en) * | 1993-07-07 | 2001-11-20 | Jack Guttman, Inc. | Method of photocopying an image onto an edible web for decorating iced baked goods |
| JPH07270426A (ja) * | 1994-03-31 | 1995-10-20 | Suzuki Motor Corp | 血液等の凝集データ収集装置 |
| US5961923A (en) * | 1995-04-25 | 1999-10-05 | Irori | Matrices with memories and uses thereof |
| ATE182355T1 (de) * | 1995-05-25 | 1999-08-15 | Amersham Int Plc | Fluoreszente verbindungen |
| JP3518940B2 (ja) * | 1996-01-09 | 2004-04-12 | オリンパス株式会社 | 免疫反応検査装置の性能管理方法および免疫反応検査装置用性能管理プレート |
| US6524786B1 (en) * | 1997-08-18 | 2003-02-25 | Amersham Plc | Scintillation proximity test |
| US6198577B1 (en) * | 1998-03-10 | 2001-03-06 | Glaxo Wellcome, Inc. | Doubly telecentric lens and imaging system for multiwell plates |
| US20020131990A1 (en) * | 2000-11-30 | 2002-09-19 | Barkalow David G. | Pullulan free edible film compositions and methods of making the same |
-
1998
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