JPWO2011074373A1 - 表面プラズモン増強蛍光測定装置及びチップ構造体 - Google Patents

Abstract

アナライトの量に依存せずに反応場の全領域で捕捉されるアナライトの量を均一化させることを目的とする。そのためのチップ構造体及び当該チップ構造体を用いた表面プラズモン増強蛍光測定装置は、一方側に励起光が照射される金属薄膜と、前記金属薄膜の他方側に形成され、検体液の抗原と特異的に反応する抗体を固定した反応場と、検体液を送液する前記反応場を流路中に備えた流路と、を有し、前記反応場を、前記流路の流線方向に直交する幅方向の長さが、流線方向の長さよりも長くする。

Description

本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置及びチップ構造体に関する。

従来より、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザ光（励起光）が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、光源より照射したレーザ光（励起光）が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出する方法である。

近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置の開発が進められており、例えば特許文献１や特許文献２などにその技術開示がなされている。

このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図５に示したように基本的な構造において、誘電体部材１０６の表面に金属薄膜１０２、更にその表面に反応場１０４が設けられたチップ構造体１０８を備えている。

そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２で反射した金属薄膜反射光ｂ２を受光する受光手段１１６が備えられている。

一方、チップ構造体１０８の反応場１０４側には、後述する反応場１０４で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。また反応場１０４と光検出手段１２０との間には、蛍光ｂ３を効率よく集光するための集光部材１２２と、蛍光ｂ３以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光のみを選択するフィルタ１２４が設けられている。

そして、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０の使用においては、あらかじめ金属薄膜１０２の表面上には検出対象のＤＮＡ等のアナライトに含まれる抗原に特異的に結合する１次抗体があらかじめ固定された反応場１０４を形成している。そして反応場１０４を底面としてその上方には流路１４３が形成されており流路１４３に、アナライト及び当該アナライトに特異的に結合する２次抗体を溶媒に溶かした液体を順に送液して、２次抗体を反応場１０４で捕捉させる。アナライトとともに捕捉される２次抗体は蛍光物質で標識されている。捕捉された反応場１０４に光源１１２より誘電体部材１０６内に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が特定の角度（共鳴角）θ１で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生じさせる。なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光ｂ２の光量減少という現象が生ずる。

受光手段１１６及び光源１１２とは対となって金属薄膜１０２の照射領域を中心として回動し、金属薄膜１０２への入射角度を変更することができる。入射角度を変化させ、その際の受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ１を得ることができる。

そして、この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜１０２上の反応場１０４の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大することとなる。

この増大した蛍光ｂ３を、集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。

このように、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察可能とする高感度計測センサである。

特許第３２９４６０５号公報 特開２００８−１０２１１７号公報

反応場１０４はアナライト等を溶かした液体を送液する流路の底面全部に設けている場合がある。反応場１０４上を送液するアナライトは、流路の上流側から捕捉されるため下流側にいくにつれて捕捉された量だけアナライトの量が減少することになる。

特に、アナライトの量が微量の場合には、図６のグラフに示すように上流側から下流側にかけて反応場１０４に捕捉されるアナライト及び蛍光標識の量に分布が生じることになる。このような場合には、励起光を照射する領域により、光検出手段１２０で受光するシグナルにばらつきが生じる。特に、アナライトの量が極微量であれば上流側で全てが捕捉されてしまい、励起光照射による観察がしづらくなる。また励起光の照射領域を反応場よりも大きくし、反応場全体を捉える方法も考えられるが、バックグラウンドシグナルや流路部材からの散乱光ノイズなどが増大し、極微量のアナライトからのシグナルが埋もれてしまう懸念がある。

本願発明はこのような問題に鑑み、アナライトの量に依存せずに反応場の全領域で捕捉されるアナライトの量を均一化させることが可能な、チップ構造体及び表面プラズモン増強蛍光測定装置を提供することを目的とする。

上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。

１．表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
前記チップ構造体は少なくとも、
一方側に励起光が照射される金属薄膜と、
前記金属薄膜の他方側に形成され、検体液の抗原と特異的に反応する抗体を固定した反応場と、
検体液を送液する前記反応場を流路中に備えた流路と、
を有し、
前記反応場は、前記流路の流線方向に直交する幅方向の長さｘの流線方向の長さｙに対する比率（ｘ／ｙ）が１よりも小さいことを特徴とするチップ構造体。

２．前記流路の反応場以外の壁面は、前記抗原が吸着しない吸着防止効果がある非特異吸着防止剤が固定されていることを特徴とする前記１に記載のチップ構造体。

３．金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応場の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
前記反応場を流路中に備え、検体液及び蛍光物質を送液する流路を有し、
前記反応場は、検体液の抗原と特異的に反応する抗体が固定されており、前記流路の流線方向に直交する幅方向の長さｘの流線方向の長さｙに対する比率（ｘ／ｙ）が１よりも小さいことを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。

４．前記流路の反応場以外の壁面は、前記抗原が吸着しない吸着防止効果がある非特異吸着防止剤が固定されていることを特徴とする前記３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。

本願発明によれば、反応場は、前記流路の流線方向に直交する幅方向の長さｘの流線方向の長さｙに対する比率（ｘ／ｙ）を１よりも小さくすることでアナライトの量に依存せずに反応場の全領域で捕捉されるアナライトの量を均一化させることが可能となる。

実施形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。 図２（ａ）は、チップ構造体１０８の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図であり、図２（ｃ）は図２（ｂ）の拡大図である。 反応場１０４の変形例を示す模式図である。 本実施形態に示す反応場１０４を備えたチップ構造体の製造工程を説明する模式図である。 従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。 反応場の各位置におけるアナライトの反応量を示すグラフである。

以下、本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。

図１、図２は、実施形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。

表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を金属薄膜に照射して粗密波（表面プラズモン）を生じさせて励起された蛍光物質が生ずる蛍光を正確に検出し、検出感度を上げても超高精度に蛍光検出を行うことを可能とするものである。

［表面プラズモン増強蛍光測定装置１０、及び検体検出方法］
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図１に示したように、まず金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の一方側面に形成された反応場１０４と、他方側面に形成された誘電体部材１０６と、を有するチップ構造体１０８を備えている。

そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２に反射した金属薄膜反射光ｂ２を受光する受光手段１１６を備えている。

ここで光源１１２から照射される励起光ｂ１としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜１０００ｎｍのガスレーザまたは固体レーザ、波長３８５〜８００ｎｍの半導体レーザが好適である。

一方、チップ構造体１０８の反応場１０４側には、反応場１０４で生じた蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。

光検出手段１２０としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。

不図示の制御手段は、ＣＰＵやメモリを備えており、メモリに記憶されているプログラムを実行することにより、光源１１２、受光手段１１６、光検出手段１２０等の各装置を制御する。

なお、チップ構造体１０８の反応場１０４と光検出手段１２０との間には、光を効率よく集光するための集光部材１２２と、光の内で蛍光ｂ３とは異なる波長の光の透過を低減して蛍光ｂ３を選択的に透過するように形成されたフィルタ１２４が設けられている。

集光部材１２２としては、光検出手段１２０に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。

一方、フィルタ１２４としては、光学フィルタ、カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。

そして、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０を用いた検体検出方法では、反応場１０４に接する側の金属薄膜１０２表面上には一次抗体を結合させたＳＡＭ膜（Self-Assembled Monolayer：「自己組織化単分子膜」ともいう）や高分子材料が設けられている。一次抗体はＳＡＭ膜や高分子材料の一方の端部に結合されており、ＳＡＭ膜や高分子材料の他方の端部は、直接若しくは間接に金属薄膜１０２表面に固定されている。高分子材料は複数種類が介在していてもよい。ＳＡＭ膜としては例えばＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（polyethylene glycol、以下「ＰＥＧ」と記す。）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは使用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。また、一次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接金基板上に固定化し、その上に一次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。

送液工程では、このようにして構成した反応場１０４に標的物質としてのアナライトの抗原を含む溶液（以下、検体液ともいう）と、二次抗体を含む試薬液の送液を行う。固定化した一次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対しさらに蛍光物質で標識した二次抗体を含む試薬液を作用させることで捕捉された抗原を標識している。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから一次抗体を作用させてもよい。

蛍光物質で標識されたアナライトの検出を行う検出工程においては、アナライトが捕捉された反応場１０４に光源１１２より誘電体部材１０６に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が金属薄膜１０２に対して特定の入射角度（共鳴角θ１）で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。

なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ良い。

そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１０２上の反応場１０４で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大し、この蛍光ｂ３を集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。

なお、チップ構造体１０８の金属薄膜１０２の材質としては、好ましくは金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。

このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１０２に好適である。

また、金属薄膜１０２の形成方法としては、例えばスパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法、蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。

さらに金属薄膜１０２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。

電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。

金属薄膜１０２の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１０２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。

図２（ａ）は、チップ構造体１０８の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図であり、図２（ｃ）は図２（ｂ）の拡大図である。反応場１０４はこれらの図に示すように樹脂基板１４２に設けられた流路１４３の経路中の下層側であって金属薄膜１０２の表層に設けられている。溝部を設けた樹脂基板１４２の上部には、ポリオレフィン類等の材料から構成された蓋１４１が接合されている。蓋１４１で覆われた当該溝部が流路１４３となり、流路１４３には蛍光物質が標識された二次抗体等が含まれる試薬液や、アナライトが含まれる検体液が不図示のポンプにより送液される。

検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。

さらに蛍光物質としては、所定の励起光ｂ１を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光ｂ３を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光ｂ３とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。

また、誘電体部材１０６としては、高屈折率の６０度プリズムを用いることができる。材料としては光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）または二酸化チタン（ＴｉＯ_２）を含むことが好ましい。

さらに、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、光源１１２から金属薄膜１０２に照射される励起光ｂ１による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θ１）を調整するため、角度可変部（図示せず）を有している。

ここで、角度可変部（図示せず）は制御手段により制御され、共鳴角スキャン工程においては角度可変部のサーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段１１６と光源１１２とを同期して、照射領域を中心として回動し、４５〜８５°の範囲で角度変更を可能としている。また分解能は０．０１°以上であることが好ましい。

流路１４３の大きさとしては例えば、流路１４３の流線方向（Ｘ方向）に直交する幅方向（Ｙ方向）の長さは１ｍｍ〜３ｍｍ、高さ（Ｚ方向）は５０μｍ〜５００μｍである。流路１４３の両端の開口１４４ａ、１４４ｂの大きさは流路１４３の幅と同等のφ１ｍｍ〜φ３ｍｍである。同図の例では、開口１４４ａから導入された検体液は、流路１４３（及び反応場１０４）を経由して開口１４４ｂから排出される。

反応場１０４のＸ方向の長さｘは数百μｍ〜２ｍｍで、Ｙ方向の長さは流路１４３の幅と同等の１ｍｍ〜３ｍｍである。そして反応場１０４の形状は、流線方向に直交する幅方向の長さｙと流線方向の長さｘとの関係はｙ＞ｘの条件を満たし、縦長の短冊形状となるようにしている。

また反応場１０４における励起光ｂ１の照射エリアｂａとの関係を、図２（ｃ）に示す。照射エリアｂａは、金属薄膜１０２の表面では略円形となっているが、これは金属薄膜１０２に照射する励起光ｂ１のビーム形状を予め整形しているためである。照射エリアｂａは、反応場１０４の内側を照射するように位置や、形状の設定を行っている。更に、流路１４３の反応場１０４以外の領域には、その表面に吸着防止効果のある非特異吸着防止剤を固定化している。非特異吸着防止剤としては例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ＭＰＣポリマー、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられる。

本実施形態では、反応場１０４を流路１４３の全面にもうけるのではなくその一部に設けている、そして反応場１０４の形状がｙ＞ｘの関係を満たすような形状としている。このことにより、反応場１０４の全面に渡って、略均一に抗原（及びこれに付与させた蛍光標識）を捕捉させることができるので、光検出手段１２０で得られるシグナルが励起光ｂ１を照射する領域によりばらつく問題を防ぐことが可能となる。

［反応場１０４の形状］
図３は、反応場１０４の変形例を示す模式図である。図１、図２に示した反応場１０４は矩形状のものであるがこれに限られず、図３に示す形状であってもよい。図３（ａ）は、反応場１０４の形状が平行四辺形の例である。この場合の長さｘは図示のようにＸ方向における反応場１０４の最上流端部（図３（ａ）の底辺の左端部）から最下流端部（同図の上辺の右端部）までの長さである。

図３（ｂ）は、反応場１０４の形状が楕円形状の例である。この場合の長さｘは図示のようにＸ方向における反応場１０４の最上流端部から最下流端部までの長さである。長さｙも同様に、Ｙ方向における反応場１０４の上端部と下端部の長さである。図３（ａ）、図３（ｂ）であっても反応場１０４を流路１４３の全面にもうけるのではなくその一部に設けており、そして長さｘの長さｙに対する比率（以下、単に「比率（ｘ／ｙ）」という）が１よりも小さいので図２等に示す実施形態と同様の効果を得ることが可能となる。

図３（ｃ）は、一の流路１４３に独立に複数の反応場１０４を設けた例である。それぞれの反応場１０４は、独立に励起光ｂ１を照射させて、独立のシグナルを得るものである。それぞれの反応場１０４は、それぞれの比率（ｘ／ｙ）が１よりも小さいので、前述の実施形態と同様の効果を得ることが可能となる。

図４は、本実施形態に示す反応場１０４を備えたチップ構造体の製造工程を説明する模式図である。図４（ａ）は、第１の工程であり、誘電体部材１０６の表面に金属薄膜１０２をスパッタリング法、蒸着法等により形成する。

図４（ｂ）に示す第２の工程では、金属薄膜１０２の表面に、非特異吸着防止剤を固定化した非特異吸着防止層１０３を設けている。非特異吸着防止剤としては前述のようにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ＭＰＣポリマー、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などがある。

図４（ｃ）に示す第３の工程では、一次抗体を結合させたＳＡＭ膜や高分子材料を、基材上に短冊状に設ける。当該、一次抗体が反応場１０４として機能する。

図４（ｄ）に示す第４の工程では、樹脂基板１４２を基材上に接合させる。同図に示す例では、３本の互いに略平行な溝部を設けた樹脂基板１４２を接合させており、それぞれの溝部は、独立した流路１４３として機能する。図４（ｄ）に示すように、流路１４３の底面には、短冊状の反応場１０４と非特異吸着防止層１０３が露出している。

図４（ｅ）に示す第５の工程では、樹脂基板１４２の上面に、蓋１４１を接合させる。蓋１４１は、樹脂基板１４２の溝部の端部位置に対応した液体を送液するための開口が設けられている。

次に、本願実施形態に係るチップ構造体１０８及びプラズモン増強蛍光測定装置１０における実施例について説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、ここで使用している装置名、使用する材料、使用材料の濃度、使用量、ならびに処理時間、処理温度などの数値的条件、処理方法などは、本発明の範囲内の好適例にすぎない。

［プラズモン励起センサの作製］
屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ １０）の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは約５０ｎｍであった。

このようにして得られた基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍｍｏｌ／Ｌ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜にＳＡＭ（Self Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）を形成した。

基板を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。

［１次抗体の固相化］
［比較例１］
ＳＡＭの表面に、幅２ｍｍ、長さ５ｍｍの貫通孔を有するＰＤＭＳシートを流路シートとして配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする）、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。まず、超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μｌ／ｍｉｎで循環させた。続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍｍｏｌ／Ｌとを含むＰＢＳを５ｍｌ送液し、２０分間循環送液させた後に、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、（株）日本医学臨床検査研究所製）、１０μｇ／ｍｌ、２００μｌを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。最後に質量１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、流路底面全面にｙ＝２ｍｍ、ｘ＝５ｍｍの反応場１０４を有するプラズマ励起センサを作製した。

［比較例２］
ＳＡＭの表面に、２ｍｍ幅の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。比較例１と同様の手順で抗体を固定化した後、流路シートと該プラズモン励起センサを分離し、抗体固相化エリアと直交する形で、幅２ｍｍ、長さ５ｍｍの貫通孔を有するＰＤＭＳシートを流路シートとして再度配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。最後に質量１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行い、流路中にｙ＝２ｍｍ、ｘ＝２ｍｍの大きさの反応場１０４を有するプラズマ励起センサを作製した。

［実施例］
ＳＡＭの表面に、１ｍｍ、１．５ｍｍ、１．８ｍｍ、２．５ｍｍ幅の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。比較例１と同様の手順で抗体を固定化した後、流路シートと該プラズモン励起センサを分離し、抗体固相化エリアと直交する形で、幅１．５ｍｍ／２ｍｍ／３ｍｍ、長さ５ｍｍの貫通孔を有するＰＤＭＳシートを流路シートとして再度配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。最後に質量１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行い、流路中に長さＸが１〜５ｍｍ、長さｙが１．５〜３ｍｍの範囲で縦横比の水準を変えた複数種類の大きさの反応場１０４を有するプラズモン励起センサを作製した（後述の表１参照）。

［アッセイ法の実施］
工程（ｉ）：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍｌ含むＰＢＳを２００μｌ添加し、２５分間循環させた。

洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として２０分間送液させることによって洗浄した。ここでブランクの蛍光を、光源としてＬＤレーザを用いて、波長６３５ｎｍのレーザ光を、光学フィルタ：（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、プリズム：（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎ〕＝１．７２））を通して、流路に固定されているプラズモン励起センサに照射し、カットフィルタ（シグマ光機（株））、集光レンズとして２０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）を用いてＣＣＤイメージセンサ（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。

工程（ii）：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を標識したαフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍｌ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を２．５μｇ／ｍｌ含むＰＢＳを２００μｌ添加し、２０分間循環させた。

洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。

工程（iii）：洗浄開始から１０分後のＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。

［反応分布の評価］
表１は、図１、図２に示す矩形状の反応場１０４において、反応場１０４のサイズと送液する検体液中の抗原量との関係を示したものである。表中に示した各反応場に対して、照射面上で約０．５×０．５ｍｍになるように成形した励起光を照射し、反応場の上流端４点と下流端４点、計８点の蛍光シグナルを測定し、反応分布について評価した。表１に示すように、縦横比（ｘのｙに対する比率＝ｘ／ｙ）の範囲としては１．０未満（ｙ＞ｘ）が好ましく、より好ましくは０．８未満である。縦横比が１．０未満であれば変動係数ＣＶ（＝標準偏差／平均値）は小さくなり、同０．８未満であれば更に変動係数ＣＶは小さくなっている。つまり反応場１０４のシグナルのばらつきは少なく、反応場１０４全域において均一に抗原が捕捉されていることがわかる。

１０ プラズモン増強蛍光測定装置
１０８ チップ構造体
１０２ 金属薄膜
１０３ 非特異吸着防止層
１０４ 反応場
１０６ 誘電体部材
１１２ 光源
ｂ１ 励起光
ｂ２ 金属薄膜反射光
ｂ３ 蛍光
ｂａ 照射エリア
１１６ 受光手段
１２０ 光検出手段
１２２ 集光部材
１２４ フィルタ
１４１ 蓋
１４２ 樹脂基板
１４３ 流路

Claims (4)

1. 表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるチップ構造体であって、
   前記チップ構造体は少なくとも、
   一方側に励起光が照射される金属薄膜と、
   前記金属薄膜の他方側に形成され、検体液の抗原と特異的に反応する抗体を固定した反応場と、
   検体液を送液する前記反応場を流路中に備えた流路と、
   を有し、
   前記反応場は、前記流路の流線方向に直交する幅方向の長さｘの流線方向の長さｙに対する比率（ｘ／ｙ）が１よりも小さいことを特徴とするチップ構造体。
2. 前記流路の反応場以外の壁面は、前記抗原が吸着しない吸着防止効果がある非特異吸着防止剤が固定されていることを特徴とする請求項１に記載のチップ構造体。
3. 金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応場の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
   前記反応場を流路中に備え、検体液及び蛍光物質を送液する流路を有し、
   前記反応場は、検体液の抗原と特異的に反応する抗体が固定されており、前記流路の流線方向に直交する幅方向の長さｘの流線方向の長さｙに対する比率（ｘ／ｙ）が１よりも小さいことを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
4. 前記流路の反応場以外の壁面は、前記抗原が吸着しない吸着防止効果がある非特異吸着防止剤が固定されていることを特徴とする請求項３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。