WO2005062027A1

WO2005062027A1 - 有害物質の評価方法、及び有害物質の評価用キット

Info

Publication number: WO2005062027A1
Application number: PCT/JP2004/018844
Authority: WO
Inventors: Masakazu Katsumata; Hiroshi Tsuchiya; Takashi Koike; Masataka Nishikawa
Original assignee: Hamamatsu Photonics K.K.
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2005-07-07
Also published as: EP1698885A1; CN102435589B; CN1898552A; EP3425373A1; US9448170B2; JPWO2005062027A1; CN102435589A; EP1698885A4; US20070224659A1; JP4699214B2; CN1898552B

Abstract

　この生物生育阻害要因の評価方法は、水溶液サンプルに光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製し、試験計測溶液を放置し、試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第１のステップと、生物生育阻害要因が存在しない標準サンプルに、光合成サンプルを混合して標準計測溶液を調製し、標準計測溶液を放置し、標準計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第２のステップと、第１のステップ及び第２のステップでそれぞれ計測された遅延蛍光の光量に基づいて評価値を算出し、評価値の比較値を求めることにより生物生育阻害要因を評価する第３のステップと、を備える。これにより、短時間で幅広い阻害要因の分析を行うことが可能な生物生育阻害要因の評価方法が実現される。

Description

明細書

有害物質の評価方法、及び有害物質の評価用キット

技術分野

[0001] 本発明は、有害物質の評価方法、及び有害物質の評価用キットに関するものである。

背景技術

[0002] 従来から、環境中に存在する未知化学物質の生物に対する影響を評価する方法として、細菌、藻類、ミジンコ、魚類等の生物個体に対する生育阻害を検査する生物学的な毒性検査「バイオアツセィ」が用いられている。バイオアツセィは、未知物質や想定外の物質による影響、化学物質の相互作用、及び環境による影響等の生物学的な影響を総合的に検出可能な点で、既存の物理化学的方法である、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、原子吸光計測法、ェンザィムィムノアッセィ等と相補関係にある。

[0003] このバイオアツセィにおいては、多量の個体を統計的に処理可能な、かつライフサイタルの短い細菌、藻類などの単細胞生物、また小形甲殻類 (ミジンコ）、及び小形魚類などの、比較的に高等な生物機能を有しつつ化学物質等の影響を受けやすい小形水生生物等が用いられている。バイオアツセィの具体的手法としては、日本国環境省の指針において規定されている藻類増殖阻害試験による生体影響評価が挙げられる。藻類増殖阻害試験は、藻類に対する被験物質の様々な毒性を評価する方法である。

[0004] また、その他の手法として、発光バクテリアの発光計測により呼吸阻害を計測する方法が考案されている。また、非特許文献 1には、藻類からのクロロフィル蛍光を用いた光合成阻害性の計測方法が記載されている。また、非特許文献 2、 3にも、遅延蛍光を用いた計測方法についての記載がある。

非特午文献 1： Ulrich bchreiber et al.， New type of dual-channel PAM chlorophyll fluorometer for highly sensitive water toxicity biotests", Photosynthesis Research 74, p.317-330 (2002) 非特言午文献 2 : Werner Schmidt and Horst Senger, "Long-term delayed luminescence in Scenedesmus obliquus. II. Influence of exogeneous factors， Biochimica et Biophysica Acta 891， p.22-27 (1987)

非特許文献 3 : Joacnim Burger and Werner Schmidt, "Long term delayed

luminescence: A possible fast and convenient assay for nutrition deficiencies and environmental pollution damages in plants， Plant and Soil 109， p.79 - 83 (1988) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] し力しながら、上述した藻類増殖阻害試験による生体影響評価方法においては、生物の増殖能を試験対象とするため操作が煩雑となるとともに、試験結果を得るまで 24時間一 72時間という長時間を要する。これに対して、上記非特許文献 1等に記載の計測方法においては、試験時間の短縮化は一部実現されているが未だ充分ではなレ、。カロえて、いずれの評価方法においても未知化学物質等の幅広い有害物質の定性的及び定量的な分析を実現するには至っていない。また、非特許文献 2、 3に記載の計測方法においても、有害物質の定性的及び定量的な分析の具体的な方法にっレ、ての検討は充分にはなされてレ、なレ、。

[0006] そこで、本発明は力かる課題に鑑みて為されたものであり、短時間でかつ幅広い有害物質の分析を行うことが可能な有害物質の評価方法、及び有害物質の評価用キットを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] このような目的を達成するために、本発明による有害物質の評価方法は、試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質（a toxic substance)を評価する有害物質の評価方法であって、（1)水溶液サンプルに光合成機能を有する光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製し、試験計測溶液を所定の放置時間放置し、試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第 1のステップと、 (2)比較サンプノレに光合成サンプルを混合して調製された比較計測溶液を所定の放置時間放置し、比較計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測した比較計測結果を用意する第 2のステップと、 (3)第 1のステップ及び第 2のステップでそれぞれ取得された遅延蛍光の光量に基づいて評価値を算出し、評価値の比較値を求めることにより、水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する第 3のステップとを備え、（4)評価値は、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点における経過時間であることを特徴とする。

[0008] あるいは、本発明による有害物質の評価方法は、試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する有害物質の評価方法であって、（1)水溶液サンプルに光合成機能を有する光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製し、試験計測溶液を所定の放置時間放置し、試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第 1のステップと、（2)比較サンプルに光合成サンプルを混合して調製された比較計測溶液を所定の放置時間放置し、比較計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測した比較計測結果を用意する第 2のステップと、 (3)第 1のステップ及び第 2のステップでそれぞれ取得された遅延蛍光の光量に基づいて評価値を算出し、評価値の比較値を求めることにより、水溶液サンプノレ中に存在する有害物質を評価する第 3のステップとを備え、（4)評価値は、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化であり、比較値は、時間的変化の差をとつた値であることを特徴とする。

[0009] このような有害物質の評価方法では、評価対象の水溶液サンプルに混合された光合成サンプルから発せられる遅延蛍光の光量の時間的変化と、水溶液サンプルに対する比較対象として用意された比較サンプルを含む比較計測溶液中の光合成サンプルから発せられる遅延蛍光の光量の時間的変化とを比較して得られる特徴から、複数の有害物質を同時に、かつ精度良く定性、定量することができる。また、遅延蛍光の光量を計測して評価することにより、計測時間を全体的に短縮化することができる。

[0010] また、上記した評価方法のうちで第 1の評価方法では、評価値は、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点における経過時間であることとしている。この場合、遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点は有害物質となる化学物質種などに応じて変化するため、その特徴点における経過時間を評価することで、より的確に各種有害物質を定性及び定量することができる。

[0011] また、第 2の評価方法では、評価値は、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化であり、比較値は、時間的変化の差をとつた値であることとしてレ、る。こうすれば、遅延蛍光量の時間的変化における変化の集中する時間や、変曲点といった特徴を得ることができ、有害物質となる化学物質種などの特定が容易に為される。

[0012] また、上記した第 2の評価方法では、第 1のステップまたは第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化が特徴点を有し、第 3のステップにおいて、一の特徴点と、計測始点または他の特徴点との間の所定範囲について遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値を比較値として有害物質を評価する方法を用レ、ることができる。また、遅延蛍光の光量の時間的変化に特徴点がない場合には、その全体または所定範囲について遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値を比較値とすること力 Sできる。

[0013] あるいは、第 3のステップにおいて、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値について、さらに第 1のステップまたは第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化との比をとつた値を比較値として有害物質を評価する方法を用いることができる。

[0014] ここで、第 2のステップで用いられる比較サンプル、及び比較計測結果については、様々なものを用いて良レ、。例えば、第 2のステップにおいて、比較サンプルとして比較対象となる標準サンプノレを用い、標準サンプルに光合成サンプノレを混合して比較計測溶液である標準計測溶液を調製し、標準計測溶液を所定の放置時間放置し、標準計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測して、比較計測結果を取得する方法を用いることができる。この場合、標準サンプノレとしては、有害物質が実質的に存在しないサンプノレを用いることが好ましい。

[0015] あるいは、第 2のステップにおいて、比較サンプノレとして他の水溶液サンプルを用レ、、他の水溶液サンプノレに光合成サンプルを混合して調製された比較計測溶液である他の試験計測溶液について取得された計測結果を比較計測結果として用意する方法を用いること力 Sできる。この場合、比較計測結果としては、例えば、前回の計測結果を用いることができる。

[0016] また、第 2のステップでの比較計測結果の取得については、第 1のステップと同様に、比較計測溶液に対して遅延蛍光の光量の計測を行うことによって比較計測結果を用意する方法を用いることができる。あるいは、第 2のステップにおいて、比較計測結果として、比較計測溶液についてあらかじめ取得された計測結果を比較計測結果として用意する方法を用いても良い。このような場合、あらかじめ取得した比較計測結果をメモリ等に記憶しておき、必要に応じてデータを読み出して用いることが好ましい

[0017] またさらに、第 1のステップ及び第 2のステップにおいては、計測毎に光条件を変化させて、試験計測溶液及び比較計測溶液を所定の放置時間放置し、第 3のステップにおいては、光条件に応じた比較値の変化を評価することも好ましい。かかる方法とすれば、光条件の遅延蛍光特性に対する影響が有害物質毎に異なるので、放置時の光条件の変化に応じた比較値を評価することにより、水溶液サンプル中の有害物質の判別が更に容易となる。

[0018] さらにまた、試験計測溶液中及び比較計測溶液中における光合成サンプルの密度は、遅延蛍光の光量と比例関係を有する密度の範囲であることも好ましい。この場合、例えば、吸光度等を測定して光合成サンプルの密度を計測した後、この密度に基づいて遅延蛍光の光量を補正することにより、より精度の高い有害物質の評価が実現される。

[0019] 力 Qえて、第 1のステップ及び第 2のステップにおいては、遅延蛍光の光量を計測する前に、試験計測溶液及び比較計測溶液を均一化させることも好ましレ、。このようにすれば、計測中において計測溶液中の光合成サンプノレが均一に分布されるので、さらに誤差の少ない有害物質の評価が可能となる。

[0020] また、水溶液サンプノレに混合される光合成サンプルについては、耐塩性藻類、耐アルカリ性藻類、及び耐酸性藻類からなる群から選択される少なくとも一種からなる光合成サンプノレを用いることが好ましい。このような光合成サンプルとしては、例えばスピルリナ（Spirulina)が挙げられる。 [0021] 本発明による他の有害物質の評価方法は、試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する有害物質の評価方法であって、（_a)水溶液サンプルに光合成機能を有する光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製する調製ステップと、（b)試験計測溶液を所定の放置時間放置する放置ステップと、（c)試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する計測ステツプと、（d)計測ステップで取得された遅延蛍光の光量に基づいて、水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する評価ステップと、（e)計測ステップの前に、試験計測溶液に対して所定の待機時間での暗中待機を行う暗中待機ステップ、または試験計測溶液に対して予備的な光照射及び所定の待機時間での暗中待機を行う予備照射ステップのいずれか一方を含む順化ステップとを備えることを特徴とする。

[0022] このような有害物質の評価方法では、評価対象の水溶液サンプルに混合された光合成サンプルから発せられる遅延蛍光の光量の時間的変化において得られる特徴から、複数の有害物質を同時に、かつ精度良く定性、定量することができる。また、遅延蛍光の光量を計測して評価することにより、計測時間を全体的に短縮化することができる。また、計測ステップの前に試験計測溶液に対して順化ステップを行うことにより、遅延蛍光の計測、及びその計測結果による有害物質の評価の精度を向上することができる。

[0023] このように、計測ステップの前に順化ステップを実施する場合、暗中待機ステップにおいて、所定の待機時間は 30秒以上 1時間以下の時間であることが好ましい。また、予備照射ステップにおける予備的な光照射の時間及び暗中待機の時間の比が、計測ステップにおける光の照射の時間及び暗中待機の時間の比と等しいことが好ましレ、。

[0024] そして、このような評価のために、試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価するための有害物質の評価用キットであって、水溶液サンプルに混合される光合成サンプルと、水溶液サンプノレの塩濃度及び pHを調整するための混合塩類と、光合成サンプルと混合塩類とを、水溶液サンプルに分離して混合させる混合手段と、を備える有害物質の評価用キットが提供される。また、評価用キットは、光合成サンプルの分布密度を均一化するための安定化剤を備えることが好ましい。このような安定化剤としては、例えば、比重調整剤、増粘剤が挙げられる。

発明の効果

[0025] 本発明の有害物質の評価方法によれば、短時間でかつ幅広い有害物質の分析を行うことができる。

図面の簡単な説明

[0026] [図 1]図 1は、遅延蛍光計測装置の一実施形態を示す図である。

[図 2]図 2は、図 1の遅延蛍光計測装置を部分的に示すブロック図である。

[図 3]図 3は、本発明の実施形態にかかる生物生育阻害要因の評価方法の手順を示すフローチャートである。

[図 4]図 4は、遅延蛍光の光量を測定する際の遅延蛍光計測装置 1の動作を示すフローチャートである。

[図 5]図 5は、遅延蛍光の光量の時間的変化の一例を示す図である。

[図 6]図 6の（a)は、波長 665nmの吸光度と遅延蛍光量との関係の一例を示すグラフ、

(b)は、波長 750nmの吸光度と遅延蛍光量との関係の一例を示すグラフである。

[図 7]図 7は、吸光度に対する比較値 VCP1の変化を示すグラフである。

[図 8]図 8の（a)は、光強度を変化させた場合の評価値 CP1を示すグラフ、（b)は、光強度を変化させた場合の評価値 CP2を示すグラフ、（c)は、光強度を変化させた場合の評価値 TP2を示すグラフである。

[図 9]図 9の（a)は、光波長を変化させた場合の評価値 CP1を示すグラフ、（b)は、光波長を変化させた場合の評価値 CP2を示すグラフ、（c)は、光波長を変化させた場合の評価値 TP2を示すグラフである。

[図 10]図 10の（a)は、アトラジン濃度に対する比較値 VCP1の変化を示すグラフ、 (b )は、アトラジン濃度に対する比較値 VCP2の変化を示すグラフ、（c)は、アトラジン濃度に対する比較値 VTP2の変化を示すグラフである。

[図 11]図 11は、アトラジン濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。

[図 12]図 12の（a)は、 DCMU濃度に対する比較値 VCP1の変化を示すグラフ、 (b) は、 DCMU濃度に対する比較値 VCP2の変化を示すグラフ、（c)は、 DCMU濃度に対する比較値 VTP2の変化を示すグラフである。 [図 13]図 13は、 DCMU濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。

園 14]図 14の（a)は、パラコート濃度に対する比較値 VCP1の変化を示すグラフ、 (b )は、パラコート濃度に対する比較値 VCP2の変化を示すグラフ、 (c)は、パラコート濃度に対する比較値 VTP2の変化を示すグラフである。

園 15]図 15は、パラコート濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。園 16]図 16の（a)は、無機水銀濃度に対する比較値 VCP1の変化を示すグラフ、 (b )は、無機水銀濃度に対する比較値 VCP2の変化を示すグラフ、（c)は、無機水銀濃度に対する比較値 VTP2の変化を示すグラフである。

園 17]図 17は、無機水銀濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。園 18]図 18の（a)は、遊離シアン濃度に対する比較値 VCP1の変化を示すグラフ、 ( b)は、遊離シアン濃度に対する比較値 VCP2の変化を示すグラフ、（c)は、遊離シァン濃度に対する比較値 VTP2の変化を示すグラフである。

園 19]図 19は、遊離シアン濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。

[図 20]図 20の（a)は、 TPN濃度に対する比較値 VCP1の変化を示すグラフ、（b)は、 TPN濃度に対する比較値 VCP2の変化を示すグラフ、（c)は、 TPN濃度に対する比較値 VTP2の変化を示すグラフである。

園 21]図 21は、 TPN濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。

園 22]図 22の（a)は、異種の生物生育阻害要因を含む各試験計測溶液の比較値 VCP1を示すグラフ、（b)は、異種の生物生育阻害要因を含む各試験計測溶液の比較値 VCP2を示すグラフ、（c)は、異種の生物生育阻害要因を含む各試験計測溶液の比較値 VTP2を示すグラフである。

園 23]図 23の（a)は、同種の生物生育阻害要因を含む各試験計測溶液の比較値 VCP1を示すグラフ、（b)は、同種の生物生育阻害要因を含む各試験計測溶液の比較値 VCP2を示すグラフ、（c)は、同種の生物生育阻害要因を含む各試験計測溶液の比較値 VTP2を示すグラフである。

[図 24]図 24は、本発明の一実施形態にかかる生物生育阻害要因の評価用キットを用いて遅延蛍光の計測を行う際の手順を示す図である。

園 25]図 25は、本発明の他の実施形態に力、かる生物生育阻害要因の評価用キットを用いて遅延蛍光の計測を行う際の手順を示す図である。

園 26]図 26は、本発明の他の実施形態にかかる生物生育阻害要因の評価方法の手順を示すフローチャートである。

園 27]図 27の（a)は、放置時の様々な光条件に対する TPNに関する比較値を示すグラフ、（b)は、放置時の様々な光条件に対する無機水銀に関する比較値を示すダラフである。

園 28]図 28の（a)は、実施例 1において算出された比較値 VCP1を示すグラフ、 (b) は、実施例 1において算出された比較値 VCP2を示すグラフ、（c)は、実施例 1において算出された比較値 VTP2を示すグラフである。

園 29]図 29は、実施例 2において算出された比較値 VCP1を示すグラフである。

[図 30]図 30は、高塩性培地及び低塩性培地を用いて水溶液サンプルを調整した場合の調整例を示す表である。

園 31]図 31は、溶液の均一化なし、及び増粘剤添加の条件での放置時間に対する遅延蛍光量の変化を示すグラフである。

園 32]図 32は、有害物質の連続的な評価方法の一例を示す模式図である。

[図 33]図 33は、有害物質の連続的な評価方法の他の例を示す模式図である。

[図 34]図 34は、遅延蛍光の光量の時間的変化の例を示す図である。

園 35]図 35は、遅延蛍光減衰カーブに特徴点が存在する場合の Curve値の算出方法の例について示す図である。

[図 36]図 36は、遅延蛍光減衰カーブに特徴点が存在しない場合の Curve値の算出方法の例について示す図である。

[図 37]図 37は、シマジン濃度及びジクロロフヱノール濃度を変化させた場合の Curve 値を示すグラフである。

[図 38]図 38は、シマジン濃度及びジクロロフヱノール濃度を変化させた場合の VCurve値を示すグラフである。

園 39]図 39は、遅延蛍光の計測回数による評価値 CP1の変化を示すグラフである。

[図 40]図 40は、遅延蛍光の計測を 3回行った結果における計測精度を示す表である符号の説明

[0027] 1…遅延蛍光計測装置、 10…光源、 12…第 1測定部、 12a…第 1光センサ、 12b …散乱光量算出部、 14…測定部、 14a…第 2光センサ、 14b…遅延蛍光量算出部、 16…解析部、 18…制御部、 20…筐体、 22…本体部、 24…蓋部、 26…導入口、 28 ■· -設置、 30· · ·フイノレタ、 32· · ·集光光学系、 34· · ·シャツタ、 36， 44· · ·ケープノレ、 38 …算出部、 40…記憶部、 42…表示部、 50…採液容器、 52…水溶液サンプル、 54 …調整溶液、 56…濃縮化光合成サンプル、 58…試験計測溶液、 60…採液容器。発明を実施するための最良の形態

[0028] 本発明の実施形態について図面を参照して説明する。なお、各図において、同一要素には同一符号を付して重複する説明を省略する。

[0029] (遅延蛍光計測装置）

まず、本発明による有害物質の評価方法を実施するための遅延蛍光計測装置について説明する。図 1は、遅延蛍光計測装置の一実施形態を示す図であり、図 2は、遅延蛍光計測装置を部分的に示すブロック図である。

[0030] 遅延蛍光計測装置 1は、光源 10、第 1測定部 12、第 2測定部 14、解析部 16および制御部 18を備えてレ、る。光源 10は、測定対象の溶液に所定波長の測定光を照射するものであって、その波長は、 280nm 800nmである。ここで、光源 10は、単色光源であっても、複数の光源を組み合せた光源であってもよい。光源 10の発光は、所定時間連続してもよいし、任意のパターンでノ^レス点灯させてもよい。また、同一または異なる波長特性を有する複数の光源を順番に発光させたり、複数の光源を同時に発光させたりしてもよい。

[0031] 第 1測定部 12は、測定光に対する溶液の吸光度または散乱光の光量を測定するものであり、溶液に照射された測定光の透過光または散乱光を検知する第 1光センサ 1 2aと、第 1光センサ 12aが検知して出力する信号に基づいて吸光度または散乱光の光量を算出する吸光度または散乱光量算出部 12bとを有している。

[0032] 第 2測定部 14は、測定光が照射されたことによって光合成サンプル (詳細は、後述する。）から生じる遅延蛍光の光量を測定するものであり、遅延蛍光を検知する第 2光センサ 14aと、第 2光センサ 14aが検知して出力する信号に基づいて遅延蛍光の光量を算出する遅延蛍光量算出部 14bとを有している。ここで、遅延蛍光は以下のようにして生じる。つまり、光合成機能を有する生物反応において、同化色素（光合成色素）に吸収された光エネルギーが、電子伝達経路により化学的エネルギーとして生物反応中に伝達される。その伝達過程で、化学エネルギーの一部が逆反応を起こし、光合成色素がその化学エネルギーにより再励起される。このようにして再励起された光合成色素から蛍光発光が生じる。なお、遅延蛍光は遅延発光と呼ばれることもあり、以下総称して遅延蛍光とする。

[0033] 光源 10、第 1測定部 12および第 2測定部 14は、遮光性を有する筐体 20に収容されている。筐体 20は、それ自体が光を遮断する遮光部材で形成されてもよぐ光を遮断する塗料等を塗布した部材で形成されてもょレヽ。

[0034] 筐体 20は、本体部 22と蓋部 24とを有している。本体部 22は、その一端側に導入口 26が形成されている。導入口 26は、筐体 20内に光合成サンプルを含む溶液を入れるために形成されており、蓋部 24により閉塞されるようになっている。

[0035] また、筐体 20内には、溶液を入れた容器（図示せず）を設置可能な設置部 28が光源 10と第 1測定部 12との中間付近に設けられている。設置部 28は、例えば、容器固定用の固定爪を有し、この固定爪で容器を固定するようになっている。

[0036] 筐体 20内の設置部 28と第 2測定部 14との間には、フィルタ 30、集光光学系 32およびシャツタ 34が設けられている。フィルタ 30は、筐体 20の内壁面に接するように設けられ遅延蛍光を透過するものである。集光光学系 32は、微弱な遅延蛍光を集光するものである。シャツタ 34は、開閉自在にされており、閉じているときは遅延蛍光を遮断するようになっている。

[0037] 解析部 16は、第 1ケーブル 36を介して第 1測定部 12と第 2測定部 14とに接続されており、算出部 38、記憶部 40および表示部 42を有している。算出部 38は、第 1測定部 12により測定された吸光度または散乱光の光量、および第 2測定部 14により測定された遅延蛍光の光量に基づいて、後述する演算方法に従って、溶液中に存在する有害物質に相関する比較値を求める。記憶部 40は、算出部 38により求められた比較値を順次記憶するものである。表示部 42は、記憶部 40に順次記憶された複数の比較値を表示又は図示するものである。 [0038] 制御部 18は、第 2ケーブル 44を介して解析部 16に接続されている。すなわち、制御部 18は、第 2ケーブル 44および第 1ケーブル 36を介して、第 1測定部 12および第 2測定部 14に接続されていることとなる。また、制御部 18は、蓋部 24の開閉、光源 1 0の発光や発光の停止およびシャツタ 34の開閉を制御する制御信号を送信する。

[0039] (有害物質の評価方法）

次いで、本発明による有害物質の評価方法について詳細に説明する。図 3は、有害物質としての生物生育阻害要因の評価方法の手順を示すフローチャートである。この評価方法は、試験対象の水溶液サンプノレ中に存在する生物生育阻害要因を評価するためのものである。ここで、生物生育阻害要因とは、細菌、藻類、ミジンコ、魚類等の生物個体に対して生育阻害作用や毒性等の悪影響を与える要因のことである。

[0040] まず、キュベット等の容器内において試験対象となる水溶液サンプノレと調整溶液とを混合する (ステップ S01)。

[0041] 水溶液サンプルとしては、湖沼河川や井戸水など天然の水源から直接採取した水、土壌や汚泥など固形物から一般的な抽出手法によって得られる抽出成分を含む水溶液、野菜等農薬が散布された物体の表面を洗い流した水溶液、ガス成分を液体に吸収させることにより得られる水溶液、植物や動物など (野菜や食肉など)から一般的な抽出手法によって得られる抽出成分を含む水溶液、及び植物や動物から採取された組織液、血液、乳汁、糞尿などの排泄物から一般的な抽出手法によって得られる抽出成分を含む水溶液などが利用できる。また、上記水溶液サンプルは、予め溶媒抽出や固相抽出などによる分画処理により、水溶性物質、疎水性物質等の特性の異なる成分に分離または濃縮したものを用いることができる。

[0042] 調整溶液は、水溶液サンプルの塩濃度、 pHを調整するための各種塩類を含む溶液である。光合成サンプノレを用いた遅延蛍光計測に用いる計測溶液を調製する場合、水溶液サンプノレは未知の水溶液であり、その塩濃度、 pHなどが多様である場合が多い。なお、塩濃度、 pHが適切な範囲に無い場合は光合成サンプルの光合成機能に影響を与えることが知られている。そこで、調整溶液は、計測溶液の塩濃度、 pH を調整するために用いられる。さらに、高感度な計測を行うためには、キュベット中の計測溶液における光合成サンプルの分布密度が均一で偏りがなレ、こと、計測中に沈殿物や浮上物が生じないことが好ましい。このために、調整溶液は、計測溶液における光合成サンプルの分布密度に偏りが発生しないよう均一化するための安定化剤を含有することが好ましい。例えば、計測溶液にある程度の粘性を持たせたり、比重を光合成サンプノレと一致させたりすることにより均一化が可能である。

[0043] 調整溶液の溶質としては、例えば、水溶液サンプルの塩濃度、 pHを光合成サンプルに適した条件に調整する混合塩類、光合成サンプルの計測溶液における分布密度を均一化する安定化剤、及び光合成反応に最低限必要な栄養塩類などが挙げられる。また、調整溶液に含まれる安定化剤としては、計測中の光合成サンプノレの空間的安定化に必要な比重調整剤や、ゲル化剤 (増粘剤)などを用いることが可能である。このような比重調整剤を用いることにより、計測溶液の比重が光合成サンプルとほぼ一致するように調整される。また、この安定化剤は、調整溶液に代えて、後述する光合成サンプルに含ませておいても良い。

[0044] 次に、キュベット等の容器内にぉレ、て、調整溶液によって調整された水溶液サンプルに光合成サンプルが混入され、試験計測溶液として調製される（ステップ S02、調製ステップ)。この場合、試験計測溶液中の光合成サンプノレが均一の濃度となるように混合される。

[0045] 光合成サンプルとは、光合成機能を有するものであって、遅延蛍光を発光可能なものであればよぐ例えば藻類又は植物性プランクトン、シァノバクテリア、光合成細菌、植物体や葉や又はその細片、カルスなどの植物性培養細胞、植物から抽出された光合成小器官やチラコイド膜、さらには人工的に合成された光合成様機能を持つ膜 •タンパク複合体などが挙げられる。好適には、例えば、藍藻類である Spi li_na、緑藻類である Selenastrumや、黄色藻類である Isochrysis、また、ホウレンソゥなど力、ら抽出されたチラコイド膜などが利用できる。

[0046] 上記のようにして調製された試験計測溶液を所定の光条件のもとで所定の放置時間放置する（ステップ S03、放置ステップ)。光条件とは、放置時において試験計測溶液に照射される光の波長、光量、合成光である場合の各成分の波長及び光量というような環境条件のことをレ、うものとする。 [0047] そして、以下のようにして、試験計測溶液から発せられる遅延蛍光の光量を計測して、遅延蛍光の光量の時間的変化を測定する（ステップ S04、計測ステップ)。

[0048] 図 4は、遅延蛍光の光量を測定する際の遅延蛍光計測装置 1の動作を示すフローチャートである。なお、筐体 20内の設置部 28には、試験計測溶液を入れた容器が設置されているものとする。

[0049] まず、制御部 18は、光源 10を発光させる制御信号を送信する。これにより、光源 1 0は発光する (ステップ S401)。この発光は、光合成サンプルを計測光に順応させるための予備的な光照射を試験計測溶液に対して行った後、遅延蛍光を生じさせるための光照射を所定の照射時間行う。光源 10が発光すると、第 1測定部 12は試験計測溶液の吸光度または散乱光の光量を測定する (ステップ S402)。測定後、第 1測定部 12は、吸光度または散乱光の光量に関する情報を算出部 38に送信する。その後、制御部 18は光源 10の発光を停止させる制御信号を送信する。これにより、光源 10は発光を停止する（ステップ S403)。なお、上記した吸光度または散乱光の光量の測定は、予備的な光照射の際に行っても良い。

[0050] 発光停止後、制御部 18はシャツタ 34を開動作させる制御信号を送信する。これにより、シャツタ 34は開動作する（ステップ S404)。シャツタ 34が開動作すると、第 2測定部 14は遅延蛍光の光量を測定する (ステップ S405)。測定後、第 2測定部 14は、所定の計測時間における遅延蛍光の光量の時間的変化に関する情報を算出部 38 に送信する。その後、制御部 18は、シャツタ 34を閉動作させる制御信号を送信する。これにより、シャツタ 34は閉動作する（ステップ S406)。

[0051] ここまでの処理で試験計測溶液に関する遅延蛍光量の計測（第 1のステップ）が完了する。

[0052] 次に、図 3に戻って、ステップ S01と同一の条件で、キュベット等の別の容器内におレ、て標準サンプルと調整溶液とを混合する（ステップ S05)。ここで、標準サンプルは、生物生育阻害要因といった有害物質が存在しないことが既知の溶液であり、例えば、滅菌蒸留水や純水等の不純物、菌類が取り除かれた水が用いられる。

[0053] そして、ステップ S02と同一の条件で、キュベット等の容器内において調整溶液によって調整された標準サンプノレに光合成サンプルが混入され、標準計測溶液として調製される（ステップ S06)。以下、ステップ S03— S04と同様にして、標準計測溶液の遅延蛍光量の計測が行われる（ステップ S07—ステップ S08、以上、第 2のステツプ)。

[0054] なお、上述した遅延蛍光量の計測 (ステップ S401 S406)は、計測精度を上げるために、試験計測溶液又は標準計測溶液にっレ、て複数回繰り返し行って、その平均値を算出するようにしても良レ、。

[0055] 試験計測溶液及び標準計測溶液の遅延蛍光量の時間的変化、及びそれぞれの測定時の吸光度 (又は散乱光の光量)が計測されると、算出部 38は、それらの遅延蛍光量の時間的変化に基づいて、生物生育阻害要因に相関する比較値を求める（ステップ S09)。

[0056] 図 5は、標準的測定条件下の遅延蛍光の光量の時間的変化の例を示す図である。

ここで標準的測定条件とは、以下の通りである。まず、光合成サンプルとして、光強度 50 /i mol/m²/s、波長 665nmの赤色単色光下で一般的な方法で育成された藍藻類である Spirulina platensis,標準サンプルとして、 1.8mlの滅菌蒸留水を用意する。次に、 4倍濃度の標準的な藍藻培養用混合塩類と、 pH及び塩濃度を調整するための混合塩類とを含む 0.6mlの調整溶液を標準サンプルに添加する。次いで、 665nmの吸光度に換算して、 OD=0.1程度で均一である Spirulina platensisと、ゲル化剤として 0.5重量％の寒天とを含む 0.6mlの光合成サンプノレを混合して、 3mlの計測溶液を調製する。

[0057] その後、光強度 1.5 μ mol/ m²/sの白色蛍光灯下で 15分程度放置する。そして、遅延蛍光計測装置 1を用いて、光合成サンプルを計測光条件に順応させるための予備的な光照射として 665nm、 0.8mWん m²の光を 2秒照射後に、 60秒間暗黒下で待機させる。その後、再度 665nm、 0.8mWん m²の励起光を 2秒照射後に、時間分解能 0.1秒で 60秒間の遅延蛍光の光量を計測する。上記 60秒間の計測を 3回実行して、その平均値から遅延蛍光の光量の時間的変化が得られる。なお、水溶液サンプルについても同様である。

[0058] 図 5に示されるように、得られる遅延蛍光減衰カーブ（遅延蛍光の光量の時間的変ィ匕）は、光照射終了後から続く減衰カーブの頂点である第 1ピーク (P1)と、光照射終了後 25— 35秒近辺に現れる第二ピーク（P2)を有する。また、第 1ピーク（P1)と第 2ピーク（P2)の間における PIの近傍には、変曲点（C1)が現れる。これら Pl、 P2、及び CI (特徴点）は生物生育阻害要因の種類により特徴的な変化を示す。この特徴点の変ィ匕は、光合成サンプルの生物生育阻害要因に対する感受性の変化からもたらされる。また、この特徴点としては、上記 3つの点には限られず、 P1と P2の間の極小点や、遅延蛍光減衰カーブにおけるその他の変曲点を用いることもできる。

[0059] ここで、算出部 38は、試験計測溶液及び標準計測溶液の遅延蛍光減衰カーブ中の特徴点を検出し、その特徴点を評価する評価値を算出する。この評価値としては、 P1における遅延蛍光量 CP1、 P2における遅延蛍光量 CP2、及び P2における光照射終了後の経過時間 TP2が用いられる。また、変曲点 C1を評価するための評価値としては、試験計測溶液及び標準計測溶液の遅延蛍光の光量の時間的変化の値を用いる。

[0060] そして、算出部 38は、それぞれの計測溶液の測定時の吸光度（又は散乱光の光量 )に基づいて遅延蛍光の光量又は評価値を補正することも行う。この補正は、計測溶液中の光合成サンプルの濃度差により生ずる測定誤差を補正するためのものである。この測定誤差は、特に光合成サンプルの極微量変化領域を評価する場合に、設置部 28での光合成サンプルの配置、あるいは設置部 28自身の配置などで光照射量、光路が変化することにより生ずる。この補正には、吸光度 (又は散乱光の光量)を基にして計測された細胞密度を用いることが有効である。

[0061] 上記補正を精度良く行うためには、試験計測溶液中及び標準計測溶液中における光合成サンプノレの密度は、それぞれに関する遅延蛍光の光量と比例関係を有する密度の範囲であることが好ましい。つまり、計測溶液中の光合成サンプル密度がある値以下では、吸光度（又は散乱光の光量）と、遅延蛍光の光量とは、光合成サンプル密度と高い相関を示す。この密度の上限値は、光合成サンプノレの特性毎に適宜設定される。

[0062] 図 6において、グラフ（a)は、波長 665nmの吸光度（OD665)と遅延蛍光量 CP1との関係の一例、グラフ（b)は、波長 750nmの吸光度（OD750)と遅延蛍光量 CP1との関係の一例を示す。図 6の例によれば、吸光度と遅延蛍光量 CP1は、吸光度（OD) =0.5 付近まで高い相関がある。しかし、 OD=0.5以上では、光合成サンプノレ自体の自己吸収により遅延蛍光量が見かけ上減少している事がわかる。従って、この場合、吸光度力 S〇D=0.5以下の範囲内であれば、それを元に遅延蛍光量の補正が高精度に為され得る。

[0063] 次いで、算出部 38は、評価値から水溶液サンプノレ中の生物生育阻害要因による影響を顕在化させるための比較値を算出する。比較値の例としては、試験計測溶液及び標準計測溶液から得られた CP1、 CP2、 TP2の比をとつて得られた VCP1値、 VCP2値、 VTP2値、試験計測溶液及び標準計測溶液から得られた遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつて得られた Curve値が用いられる。これら比較値を評価することで光合成サンプノレの生物生育阻害要因に対する感受性が適切に評価される。

[0064] なお、以下本明細書において、 CP1は、光照射終了後 0.1秒から 0.5秒までの遅延蛍光量積算量 [counts]、 TP2は、第 2ピーク（又は類似の変曲点）の現れる光照射終了後経過時間 [sec]、 CP2は、第 2ピーク（又は類似の変曲点）の現れる時刻 ± 0.5秒の遅延蛍光量積算量 [counts] , Curve値は、 C1を含む第 1ピークと第二ピークとの間の遅延蛍光減衰カーブの、試験計測溶液と標準計測溶液との差 [counts]、 VCP1値、 VCP2値、 VTP2値は、それぞれ CP1、 CP2、 TP2の、標準計測溶液に対する試験計測溶液の比として算出されるものとする。これらの評価値及び比較値の具体的な算出方法については、必要に応じて適宜選択して良い。

[0065] また、このように算出された比較値により高感度で生物生育阻害要因を検出するためには、上述した遅延蛍光の光量と比例関係を有する光合成サンプル密度の範囲内であっても、光合成サンプノレは十分に低密度であることが好ましい。

[0066] 図 7には、波長 665nmの吸光度に対する VCP1値の変化を示す。この VCP1値は、濃度 O. lppbの DCMUを含む水溶液サンプル、及び光合成サンプル Spirulina platensisを混合した計測溶液を対象に計測を行った結果得られたものである。また、標準計測溶液を計測対象にした場合、吸光度 0.5以下において吸光度と遅延蛍光の光量とが高い相関を示した。

[0067] 図 7により示されるように、光合成サンプル密度が OD=0.はり高くなるに従レ、、 VCP1 値（％)が低下する。一方では遅延蛍光の光量と光合成サンプル密度の相関は、吸光度 0.5付近まで保たれている。このことから、遅延蛍光の光量が自己吸収により減衰しない光合成サンプル密度の範囲においても、光合成サンプル密度が比較的高い場合、生物生育阻害要因の検出感度が低下することがわかる。光合成サンプルへの生物生育阻害性は、水溶液サンプル中の化学物質が光合成サンプル中に浸透吸収されて、特定の標的生体分子と直接もしくは間接的に相互作用することにより発生する。このため、極低濃度の化学物質に対して、過剰の光合成サンプル（=標的生体分子)が存在する場合には影響が低下する結果となる。

[0068] 図 3に戻って、比較値が求められると、記憶部 40は比較値を記憶し (ステップ S10) 、表示部 42は記憶された比較値を表示する (ステップ Sl l)。ここでの表示は、例えば、記憶された比較値をグラフ表示等することによって行われる。また、以前記憶された他の水溶液サンプルに関する比較値と対比できるように並べて表示等することも好ましい。最後に、表示された比較値を既知物質の比較値と対比して解析することにより、水溶液サンプノレにおける生物生育阻害要因の定性 ·定量が行われる (ステップ S 12、以上、第 3のステップ、評価ステップ)。ステップ S12における解析 ·評価方法の詳細については後に詳述する。

[0069] なお、ステップ S03における計測溶液の放置時の光条件は、安定して高感度計測を行うために所定の条件に制御することが好ましい。また、光合成サンプルを明所から喑所に移動した場合などには、光合成サンプルが経時的に徐々にその環境に適応してレ、くために、測定前から光合成サンプノレを一定の光条件で保存してぉレ、たり、光合成サンプノレを置く光環境を変化させた後、所定時間経過後に遅延蛍光の計測を行うとより好適である。

[0070] 図 8には、光合成サンプノレとして Spimlina platensisを使用した場合に、計測溶液放置時の光強度を様々変化させた場合の評価値の一例を示す。図 8において、グラフ（ a)は、光強度を変化させた場合の CP1、グラフ（b)は、光強度を変化させた場合の CP2、グラフ（c)は、光強度を変化させた場合の TP2を示す。図 8に示すように、測定前に強光下での明所においた計測溶液では、 CP1が他の光強度に比して大きぐ弱光にぉレ、た計測溶液では、 CP2が他の光強度に比して大きぐ暗黒にぉレ、た計測溶液では、 TP2が他の光強度に比して大きくなつている。このように、光合成サンプルから発せられる遅延蛍光は、放置状態での光強度により変化し、その結果、遅延蛍光減衰カーブの計測 ·評価結果に影響する事がわかる。このような理由から、計測溶液の放置時の光条件を所定の条件に制御することは、遅延蛍光減衰カーブ中の極大点、極小点、変曲点などの特徴点を再現性良く安定して測定 ·評価するために重要である。

[0071] また、計測溶液に混合される光合成サンプルは、再現性の良レ、計測結果を得るために所定の培養条件で育成したものを用いることが好ましい。このような所定の培養条件としては、一定の光環境下 (例えば、照射波長、照射強度）であることが好ましい。また、単色光源で育成したものを低温下にて暗黒もしくは所定の光照射強度（例えば、光強度 1 μ mol/m²/_S)で保存して、増殖が抑制された培養条件であることがより好ましい。

[0072] 図 9には、異なる光環境で育成された光合成サンプル Spirulina platensisを使用した場合の評価値を示す。図 9において、グラフ (a)は、培養条件 (光波長)を変化させた場合の CP1、グラフ（b)は、光波長を変化させた場合の CP2、グラフ（c)は、光波長を変化させた場合の TP2を示す。図 9に示すように、遅延蛍光減衰カーブは光環境により変化することから、得られる評価値も変動する。このような理由から、所定の培養条件で光合成サンプノレを育成することは、規格化された高感度計測を行うために重要である。

[0073] (既存物質の計測）

以下、上述した標準的測定条件下において、生物生育阻害要因となる既存化学物質を含む水溶液サンプルについての遅延蛍光計測の解析結果を示す。

[0074] 図 10及び図 11は、アトラジンを様々な濃度で含む水溶液サンプノレを対象に算出された比較値を示すグラフである。図 10において、グラフ（a)は、アトラジン濃度に対する VCP1値の変化を示すグラフ、グラフ（b)は、アトラジン濃度に対する VCP2値の変化を示すグラフ、グラフ（c)は、アトラジン濃度に対する VTP2値の変化を示すグラフである。また、図 11は、アトラジン濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。アトラジンは光合成を阻害する疎水性除草剤として利用されていたが、 20 x g/l程度の低濃度で力エル等に催奇形作用をしめす内分泌撹乱作用が認められ、規制の対象になつている化学物質である。なお、図中に表記されているアトラジン濃度は、最終的に合計 3mlに調整された試験計測溶液中での濃度である。

[0075] 図 10に示すように、アトラジン濃度の増加に応じて、 VCP1値が増大する一方、

VCP2値が減少することがわかる。また、アトラジン濃度の増加に応じて、 VTP2値は若干減少する。また、図 11により、 Curve値は高濃度になるにつれて、励起後時間 1秒付近でプラス側に、励起後時間 3— 4秒付近ではマイナス側に変化してレ、くことが判明した。

[0076] また、図 12及び図 13は、 DCMU (ジゥロン）を様々な濃度で含む水溶液サンプルを対象に算出された比較値を示すグラフである。図 12において、グラフ（a)は、 DCMU 濃度に対する VCP1値の変化を示すグラフ、グラフ（b)は、 DCMU濃度に対する VC P2値の変化を示すグラフ、グラフ（c)は、 DCMU濃度に対する VTP2値の変化を示すグラフである。また、図 13は、 DCMU濃度を変化させた場合の Curve値を示すダラフである。 DCMU (ジゥロン）はアトラジンと同様に、光合成を阻害する除草剤として幅広く利用されてきたが、生物への悪影響が指摘されており、規制の対象となっている。なお、図中に表記されている DCMU濃度は、最終的に合計 3mlに調整された試験計測溶液中での濃度である。

[0077] 図 12に示すように、 DCMU濃度の増加に応じて、 VCP1値が増大する一方、 VCP2 値が減少することがわかる。また、 DCMU濃度の増加に応じて、 VTP2値はほとんど変化しない。また、図 13により、 Curve値は高濃度になるにつれて、励起後時間 1秒付近でプラス側に、励起後時間 3— 5秒付近ではマイナス側に変化してレ、くことが判明した。

[0078] また、図 14及び図 15は、パラコートを様々な濃度で含む水溶液サンプルを対象に算出された比較値を示すグラフである。図 14において、グラフ（a)は、パラコート濃度に対する VCP1値の変化を示すグラフ、グラフ（b)は、パラコート濃度に対する VCP2 値の変化を示すグラフ、グラフ（c)は、ノコート濃度に対する VTP2値の変化を示すグラフである。また、図 15は、パラコート濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。パラコートは細胞中に取り込まれた後に、生体反応の電子伝達を撹乱したり、活性酸素を発生することにより細胞に障害を起こすとされており、除草剤として利用されている。なお、図中に表記されているパラコート濃度は、最終的に合計 3ml に調整された試験計測溶液中での濃度である。

[0079] 図 14に示すように、パラコート濃度の増加に応じて、 VCP2値及び VTP2値が減少するが、高濃度でその減少が鈍くなる。また、パラコート濃度の増加に応じて、 VCP1値は低濃度において若干減少する。また、図 15により、 Curve値は、高濃度になるにつれて励起後時間 1一 4秒付近でマイナス側に変化することが判明した。

[0080] また、図 16及び図 17は、無機水銀を様々な濃度で含む水溶液サンプルを対象に算出された比較値を示すグラフである。図 16において、グラフ（a)は、無機水銀濃度に対する VCP1値の変化を示すグラフ、グラフ（b)は、無機水銀濃度に対する VCP2 値の変化を示すグラフ、グラフ（c)は、無機水銀濃度に対する VTP2値の変化を示すグラフである。また、図 17は、無機水銀濃度を変化させた場合の Curve値を示すダラフである。無機水銀は、光合成サンプルだけでなく一般的な細胞にも毒性を示す物質である。なお、図中に表記されている無機水銀濃度は、塩化水銀溶液として調製し、最終的に合計 3mlに調整された試験計測溶液中での水銀イオン濃度換算での濃度である。

[0081] 図 16に示すように、無機水銀濃度の増加に応じて、 VTP2値が増加する一方、

VCP2値は減少する。また、無機水銀濃度の増加に応じて、 VCP1値は、低濃度においてはあまり変化しないが、高濃度においては増加する。また、図 17により、 Curve値は、高濃度になるにつれて経過時間 1一 2秒付近で時間分布がプラス側に変化することが判明した。

[0082] また、図 18及び図 19は、遊離シアンを様々な濃度で含む水溶液サンプルを対象に算出された比較値を示すグラフである。図 18において、グラフ（a)は、遊離シアン濃度に対する VCP1値の変化を示すグラフ、グラフ（b)は、遊離シアン濃度に対する VCP2値の変化を示すグラフ、グラフ（c)は、遊離シアン濃度に対する VTP2値の変化を示すグラフである。また、図 19は、遊離シアン濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。遊離シアンは、光合成サンプルだけでなく一般的な細胞にも毒性を示す。なお図中に表記されている遊離シアン濃度は、シアンィ匕カリウム溶液として調整し、最終的に合計 3mlに調整された試験計測溶液中でのシアン化イオン換算の濃度である。 [0083] 図 18に示すように、遊離シアン濃度の増加に応じて、 VTP2値及び VCP2値は、低濃度においてはほとんど変化しないが、高濃度において減少する。また、有機シアン濃度の増加に応じて、 VCP1値は、ほとんど変化しない。また、図 19により、 Curve値は、高濃度になるにつれてプラス側に変化し、その変化は、励起後時間 2 4秒付近に集中することが判明した。

[0084] また、図 20及び図 21は、 TPNを様々な濃度で含む水溶液サンプノレを対象に算出された比較値を示すグラフである。図 20において、グラフ（a)は、 TPN濃度に対する VCP1値の変化を示すグラフ、グラフ（b)は、 TPN濃度に対する VCP2値の変化を示すグラフ、グラフ（c)は、 TPN濃度に対する VTP2値の変化を示すグラフである。また、図 21は、 TPN濃度を変化させた場合の Curve値を示すグラフである。 TPNは殺菌作用を示す農薬等に含まれる成分で、細胞のエネルギーである ATP生産に関わる酵素を失活させる、光合成ではなく呼吸代謝に作用する化学物質である。なお、図中に表記されている TPN濃度は、 TPNのみを主剤として含む殺菌剤を希釈して用い、最終的に合計 3mlに調整された試験計測溶液中での TPN濃度換算の濃度である。

[0085] 図 20に示すように、 TPN濃度の増加に応じて、 VCP1値及び VTP2値は増加する一方、 VCP2値は減少する。また、図 21により、 Curve値は高濃度になるにつれて、励起後時間 1秒付近でプラス側に変化し、励起後時間 3— 5秒付近でマイナス側に変化することが判明した。

[0086] TPNは野菜における残留農薬の規制対象になつている殺菌剤の主要なもので、法定の規制濃度は lppmとなっている。また、 TPNを主剤とする主要な市販殺菌剤における散布濃度は 400ppmである。本法における検出感度は、散布濃度の 10000分の 1 程度の濃度で検出可能であり、野菜の表面から水溶液サンプルを得ることにより規制基準以下の TPNも十分に検出できることを示している。

[0087] (生物生育阻害要因の解析 '評価）

実際の水溶液サンプルの計測においては、その中に複数の生物生育阻害要因が同時に存在することがあり得る。生物生育阻害要因の評価方法により得られた遅延蛍光減衰カーブは、各種生育阻害要因による影響が時間的に分離されており、生物生育阻害要因に対して相加的に現れる。そのため、複数の生物生育阻害要因が存在した場合には、それぞれを別個に推定することが可能であると同時に、それら変化を積算して評価することも可能である。このように、生物生育阻害要因の定性的な評価と定量的な評価とが同時に行われる。

[0088] 水溶液サンプル中に異種の生物生育阻害要因が存在している場合、例えば、

DCMUと無機水銀が存在している場合、本実施形態において用いている比較値の中での主たる変化の現れる比較値は、例えば、 DCMUでは VCP1値、無機水銀では VCP2値及び VTP2値となっている。このように、遅延蛍光減衰カーブ中に変化が現れる比較値が異なる生物生育阻害要因を同時に含む場合、全体の比較値の変化は相加的に現れる。

[0089] 図 22は、生物生育阻害要因としての DCMUを濃度 O. lppbで含有する試験計測溶液「DCMU」と、生物生育阻害要因としての水銀イオンを濃度 20ppbで含有する試験計測溶液「Hg2+」と、 DCMUを濃度 O. lppb及び水銀イオンを濃度 20ppbで含有する試験計測溶液「DCMU + Hg」とのそれぞれから得られた比較値 VCP1値、 VCP2値、及び VTP2値を示している。図 22において、グラフ（a)は、各試験計測溶液の VCP1値を示すグラフ、グラフ（b)は、各試験計測溶液の VCP2値を示すグラフ、グラフ（c)は、各試験計測溶液の VTP2値を示すグラフである。

[0090] 図 22のグラフ（a)で示されるように、 VCP1値では、主な変化の現れる評価値が VCP1値である「DCMU」では 116.0、 DCMUと水銀イオンを含む「DCMU+Hg」では、 129.6、水銀イオンのみを含む「Hg2+」では、 104.1となっており、 DCMUを含む場合には VCP1値の変化が大きいことがわかる。また、図 22のグラフ（b)で示されるように、 VCP2値では、主な変化の現れる比較値力 SVCP2値である「Hg2+」では 59.9、 DCMUと水銀イオンを含む「DCMU+Hg」では、 44.9、 DCMUのみを含む「DCMU」では、 88.0となっており、水銀イオンを含む場合には、 CP2の変化が大きいことがわかる。また、図 22のグラフ（c)で示されるように、 VTP2値では、主な変化の現れる比較値力 VTP2値である「Hg2+」では 144.9、 DCMUと水銀イオンを含む「DCMU+Hg」では、 149.9、 DCMUのみを含む「DCMU」では、 100.0となっており、水銀イオンを含む場合には、 TP2の変化が大きレ、ことがわかる。

[0091] 以上の結果から、 DCMUと水銀イオンを含む「DCMU+Hg」では、 DCMUでの主な変化の現れる VCP1値と水銀イオンでの主な変化の現れる比較値 VCP2値及び VTP2値に変化が現れており、 DCMUと水銀イオンとを同時に含有している事が同時に計測可能であることがわかる。

[0092] 一方、水溶液サンプル中に同種の生物生育阻害要因が存在している場合、例えば、アトラジンと DCMUとが存在している場合、本実施形態において用いている比較値の中での主たる変化の現れる比較値は、ともに VCP1値となっている。このように、遅延蛍光減衰カーブ中に変化が現れる比較値が同じ生物生育阻害要因を同時に含む場合、全体の比較値の変化は相加的に現れる。

[0093] 図 23は、生物生育阻害要因としてのアトラジンを濃度 0.2ppbで含有する試験計測溶液「アトラジン」と、生物生育阻害要因としての DCMUを濃度 O. lppbで含有する試験計測溶液「DCMU」と、 DCMUを濃度 O. lppb及びアトラジンを濃度 0.2ppbで含有する試験計測溶液「アトラジン + DCMU」とのそれぞれから得られた比較値 VCP1値、 VCP2値、及び VTP2値を示している。図 23において、グラフ（a)は、各試験計測溶液の VCP1値を示すグラフ、グラフ（b)は、各試験計測溶液の VCP2値を示すグラフ、グラフ（c)は、各試験計測溶液の VTP2値を示すグラフである。

[0094] 図 23のグラフ（a)で示されるように、 VCP1値は、「アトラジン」では 106.4、「DCMU」で 125.6、「アトラジン + DCMUJでは、 132.2となっており、アトラジンと DCMUを同時に含む場合には VCP1が相加的に増加していることがわかる。また、図 23のグラフ（b) で示されるように、 VCP2値は、「アトラジン」では 90.0、「DCMU」で 84.6、「アトラジン + DCMU」では、 86.0となっており、大きな変化が見られないことがわかる。また、図 23 のグラフ（c)で示されるように、 VTP2値は、「アトラジン」では 100.0、「DCMU」で101.5 、「アトラジン + DCMU」では、 100.0となっており、大きな変化が見られないことがわかる。

[0095] 以上の結果から、アトラジンと DCMUを含む「アトラジン + DCMU」では、ともに主な変化の現れる比較値である VCP1値において相加的に値が増加している。このように、同種の生物生育阻害要因は遅延蛍光の計測結果に相加的に影響を与えるので、同種の生物生育阻害要因となる化学物質に対する生物生育阻害要因の総合的な評価結果が得られる。 [0096] (生物生育阻害要因の評価用キット）

続いて、本発明による生物生育阻害要因の評価用キットについて詳細に説明する。上述した生物生育阻害要因の評価方法を簡便に実施するために、生物生育阻害要因の評価用キットを用いることができる。生物生育阻害要因の評価用キットは、水溶液サンプノレ又は標準サンプルに混合される濃縮化光合成サンプルと、光合成サンプノレが混合された水溶液サンプノレ又は標準サンプノレの塩濃度及び pHを調整するための濃縮された混合塩類、栄養塩類を含む調整溶液と、光合成サンプルと調整溶液とを水溶液サンプルに分離して混合させる混合手段と、を含むものである。

[0097] ここで、上記した濃縮化光合成サンプル、調整溶液のレ、ずれか、又はその両方には、光合成サンプルの空間的な安定化に必要な安定化剤を含むことが好ましい。なお、濃縮化光合成サンプルに安定化剤を含ませる場合には、濃縮状態で光合成サンプルに悪影響を与えないような安定化剤が用いられる。また、水溶液サンプル中の生育阻害要因に対して吸着や分解など、光合成サンプルへの作用を阻害しない安定化剤が好適に用いられる。安定化剤としては、例えば、ァガロース等の多糖類や、高分子ポリマーが挙げられる。

[0098] また、混合手段としては、採液容器中にぉレ、て光合成サンプルと調整溶液とを水溶液サンプノレに分離して混合することができるものであれば任意の形状の採液容器を用いることができる。

[0099] 図 24は、このような生物生育阻害要因の評価用キットを用いて遅延蛍光の計測を行う際の手順を示す図である。同図に示されるように、所定の採液容器 50に所定量の水溶液サンプル 52が採取され、その後、塩濃度及び pHが所定の範囲になるように調整溶液 54が混合される。さらに、採液容器 50に濃縮化光合成サンプル 56が混ぜ合わされる。その後、採液容器 50内で調製された試験計測溶液 58を放置後、採液容器 50を遅延蛍光計測装置 1に収納させて遅延蛍光の光量の計測を行う。

[0100] また、採液容器としては、吸引などにより所定量の水溶液サンプノレが採取可能な注射筒やスポイトのような容器を採液容器として用いることも好ましい。この採液容器内に、どちらかまたは双方に安定化剤を含む調整溶液及び濃縮化光合成サンプルを分離した状態で収容させておくことも好ましい。この場合、水溶液サンプル採取の際の一挙動で調整溶液、光合成サンプル、安定化剤の混合が可能であるため計測をより簡便に行うことができる。

[0101] また、水溶液サンプノレが吸引された場合に、先に調整溶液と混合され、次に濃縮化光合成サンプルと混合されるような位置に、調整溶液及び濃縮化光合成サンプルが保持されていることがより好ましい。これにより、水溶液サンプルの塩濃度、 pHが光合成サンプノレに影響を与えうる範囲であっても、調整溶液で調整後に光合成サンプルを混合することにより光合成サンプノレに対する影響を低減することができる。

[0102] 図 25は、スポイト型の生物生育阻害要因の評価用キットを用いて遅延蛍光の計測を行う際の手順を示す図である。同図に示されるように、スポイト型の採液容器 60内には、調整溶液 54と濃縮化光合成サンプル 56とが上下に分離して収容されている。採液容器 60中で、調整溶液と濃縮化光合成サンプルを分離して保持するために、採液容器 60自体に壁や溶液ポケット等の分離手段が備えられてレ、ても良レ、。また、採液容器 60の構造の単純化、コストの低減化の観点からは、調整溶液と濃縮化光合成サンプノレそれぞれに濃縮されたゲルィヒ剤などの安定化剤が含まれていることにより、それぞれもしくは片方の溶液が高粘性を持っていても良い。

[0103] このような採液容器 60において、調整溶液 54が収容されている位置まで水溶液サンプル 52が吸引採取され、水溶液サンプルと調整溶液 54とがー且混合される。その後、採液容器 60に水溶液サンプル 52が所定量に達するまで吸引採取され、濃縮化光合成サンプル 56と混ぜ合わされる。このようにして採液容器 60内で調製された試験計測溶液を放置後、採液容器 60を遅延蛍光計測装置 1に収納させて遅延蛍光の光量の計測を行う。

[0104] 以上説明した生物生育阻害要因の評価用キットを用いることにより、水溶液サンプルに対して高濃度の塩類を含む調整溶液と光合成サンプルとが別々に混合されるので、塩類の光合成サンプルに対する影響を最小限化して、浸透圧差などによる光合成サンプノレの死亡'破損を防止することができる。

[0105] 以下、本発明の実施形態にかかる生物生育阻害要因の評価方法の作用効果について説明する。

[0106] 生物生育阻害要因の評価方法によれば、評価対象の水溶液サンプルに混合された光合成サンプルから発せられる遅延蛍光の減衰カーブと、生物生育阻害要件の存在しない溶液中の光合成サンプルから発せられる遅延蛍光の減衰カーブとが計測される。そして、それぞれの減衰カーブから、ピークや変曲点等の特徴点を評価し、両者を比較することにより生物生育阻害要因の光合成サンプルに対する影響が評価される。そのような評価を行うことにより、複数の化学物質を同時に、かつ精度良く定性、定量することができる。また、遅延蛍光の光量を計測して評価することにより、計測時間を全体的に短縮化することができる。

[0107] なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなぐ例えば、本実施形態にかかる生物生育阻害要因の評価方法では、計測溶液の放置時の光条件は所定の条件に制御されていたが、これは、計測溶液の計測毎に光条件を様々変化させて比較値を評価するようにしても良い。

[0108] 図 26は、この場合の生物生育阻害要因の評価方法の手順を示すフローチャートである。図 3における手順との相違点を中心に説明すると、まず、ステップ S01、ステツプ S02及びステップ S05、ステップ S06と同様にして、試験計測溶液及び標準計測溶液が調製される（ステップ S21—ステップ S22,ステップ S26—ステップ S27)。そして、初回の放置時の光条件が設定される (ステップ S23、ステップ S28)。その後、設定された光条件のもとで試験計測溶液及び標準計測溶液を所定の放置時間放置する（ステップ S24、ステップ S29)。その後、図 3におけるステップ S04、ステップ S08— S12と同様にして計測された遅延蛍光の光量から比較値が算出され、その比較値が評価される（ステップ S25、ステップ S30—ステップ S34)。そして評価が終了すると、ステップ S23及びステップ S28に戻って、前回設定した光条件を変化させた後、再度比較値を算出し、光条件に応じた比較値の変化の評価を繰り返し行う。なお、計測溶液は、各光条件毎に新しく調製してもよい。

[0109] また、放置時における光条件としては、生物生育阻害要因の変化をより細かく計測するために、可視光領域の単色光またはその組み合わせ、赤外光や紫外光などの光を単独又は組み合せて用いることが可能である。

[0110] 図 27は、放置時の光条件を様々変えて算出された比較値の一例を示すグラフである。図 27において、グラフ（a)は、様々な光条件に対する TPNに関する比較値、ダラフ（b)は、様々な光条件に対する無機水銀に関する比較値を示すグラフである。ここで、放置時の光条件は、計測溶液に対する照射光を、白色蛍光灯、緑色単色光（波長 530nm)、及び赤色単色光（波長 665nm)の 3種類に変化させ、各照射光の光量を 1.5 μ mol/m²/sに設定した。比較値としては VCP1値、 VCP2値、 VTP2値を算出した。

[0111] 図 27のグラフ（a)に示されるように、 TPNの場合、 VTP2値は、放置時の光条件が「白色光」の場合 122、「緑色光」の場合 89、「赤色光」の場合 118、となる。 VCP2値は、放置時の光条件が「白色光」の場合 47、「緑色光」の場合 78、「赤色光」の場合 44、となる。 VCP1値は、放置時の光条件が「白色光」の場合 144、「緑色光」の場合 112、「赤色光」の場合、 171となる。この結果から、 TPNの場合、放置時の光条件が「緑色光」の場合は VCP1、 VCP2、 VTP2の全ての評価値の変化率が低下し、生物生育阻害要因の検出感度が低下することがわかる。

[0112] また、図 27のグラフ（b)に示されるように、無機水銀の場合、 VTP2値は、放置時の光条件が「白色光」の場合 117、「緑色光」の場合 113、「赤色光」の場合 114、となる。 VCP2値は、放置時の光条件が「白色光」の場合 77、「緑色光」の場合 78、「赤色光」の場合 77、となる。 VCP1値は、放置時の光条件が「白色光」の場合 103、「緑色光」の場合 96、「赤色光」の場合 98、となる。このため無機水銀の場合、放置時の光条件による、 CPU CP2、 TP2の評価値の変化率に大きな差がないことがわかる。

[0113] 上記結果より、水溶液サンプル中の生物生育阻害要因の作用は、放置条件での光条件により変化するが、この変化は生物生育阻害要因毎に異なり、特定の光波長条件で影響が増大するものや、光条件による影響を受けない生物生育阻害要因などがあること力 S理角军できる。

[0114] 従って、光条件を様々変化させて比較値を評価することにより、同一の水溶液サンプルから得られる試験計測溶液を異なる光条件に置レ、て、それらの計測結果を比較して、生物生育阻害要因の定性に関する情報を得ることができる。例えば、図 27 (a) において示されるように、 TPNの場合、白色光および赤色光における場合と比較して、緑色光において VCP1、 VCP2、及び VTP2の変化が減少する。このことに着目して、他の生物生育阻害要因との判別が可能である。

[0115] 以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[0116] (実施例 1)

評価対象の水溶液サンプルとして井戸水、湖沼水から得た水溶液、標準サンプノレとして蒸留水を用い、上述した標準的な測定条件のもとでの、比較値を算出した。図 28には、本実施例における比較値の算出結果を示す。図 28において、グラフ（a)は、井戸水及び湖沼水を対象に算出された VCP1値、グラフ (b)は、同様に算出された VCP2値、グラフ（c)は、同様に算出された VTP2値を示すグラフである。

[0117] 図 28に示されるように、「井戸水」において、 VCP1値が 137.1%と増加した力「湖沼水」では顕著な変化が認められなかった。また、 VCP2値及び VTP2値に顕著な変化は認められなかった。さらに、同一地点の井戸水について 12日間に 4回採水し計測を行った結果、ほぼ同様に 120— 140%程度の VCP1値が得られた。

[0118] 本実施例の結果において、 VCP1値のみが 120— 140%程度となる生物生育阻害要因として考えられる既知の化学物質は、 0.5ppb以下の極低濃度レベルの DCML；、アトラジンなどの疎水性除草剤である。従って、試験に用いた井戸水には、 DCMUまたはアトラジンに類する疎水性化学物質系の農薬が含まれていると推測された。

[0119] (実施例 2)

評価対象の水溶液サンプルとして、実施例 1における井戸水及び蒸留水、 O. lppb 濃度の DCMUを含む水溶液について、標準的な測定条件のもとで、実施例 1と同様にして比較値を算出した。 DCMUは、既知の疎水性有機物系除草剤の一つであり、実施例 1における井戸水と評価値の変化の特徴が似ているものである。

[0120] また、井戸水、蒸留水、及び DCMUの各水溶液を吸着処理し、吸着処理された水溶液を対象に VCP1値を算出することも行った。吸着には、高密度フィルタ濾過水（ Millipore社 mili-Qにより濾過された水）により洗浄した後に乾燥させた活性炭を用いた。そして、蒸留水、井戸水、 O. lppb濃度 DCMUのそれぞれの水溶液 5mlに対し 0.8g の活性炭をカ卩えた後、 1時間緩やかに浸透した。この 3種の溶液をそれぞれ、 0.45 μ mのフィルタに濾過させて得られたものを対象に遅延蛍光量の測定を行った。

[0121] 図 29には、本実施例における VCP1値の算出結果を示す。図 29においては、蒸留水、井戸水、 DCMUの各水溶液サンプノレについて算出された VCP1値と、吸着処理されたそれぞれの各水溶液サンプルについて算出された VCPl値を示す。図 29に示されるように、 VCP1値は、蒸留水から得られた結果に対し、「井戸水」で 117.1、「DCMU 」で 120.9となり、井戸水から得られた CP1の変化は、 O. lppb濃度の DCMUにおける変化とほぼ同一の結果となった。

[0122] また、吸着前の蒸留水「蒸留水」の VCP1値 100に対する、活性炭吸着処理の後の蒸留水「蒸留水（吸着後）」の VCP1値は、 99.7となり、活性炭吸着処理の VCP1の変化に対する影響はほとんど無いと評価された。活性炭吸着処理前に VCP1の増加が見られた「井戸水」と「DCMU」では、活性炭吸着処理後のそれぞれの VCP1値が、「井戸水（吸着後）」で 95.5、「DCMU (吸着後）」で 96.3となり、「蒸留水」および「蒸留水 (吸着後）」と同等の値となった。この結果より、この井戸水には DCMUなど疎水性有機物に類する物質が含まれているということが評価された。

[0123] 本発明による有害物質の評価方法及び有害物質の評価用キットは、上記した実施形態及び実施例に限られるものではなぐ様々な変形が可能である。例えば、水溶液サンプノレに混合される光合成サンプノレについては、一般には、上述したように、光合成機能を有するものであって、遅延蛍光を発光可能なものを用いれば良い。

[0124] また、このような光合成サンプノレとしては、耐塩性藻類、耐アルカリ性藻類、及び耐酸性藻類からなる群から選択される少なくとも一種力もなる光合成サンプルを用いることが好ましい。ここで、耐塩性藻類とは、塩水や海水などの高塩性の環境で生育可能な藻類を指す。また、耐アルカリ性藻類、耐酸性藻類とは、極端な pH環境で生育可能な藻類を指す。このような光合成サンプノレとしては、例えばスピルリナ（Spirulina) が挙げられる。

[0125] すなわち、光合成サンプノレとして、耐塩性藻類として知られるスピルリナ（Spirulina) 、ドナリエラ（Dunaliella)、耐アルカリ性を有するスピルリナ（Spirulina)、耐酸性を有するユーグレナ（Euglena)や、その他の海洋や塩水湖に生息する藻類など、高塩環境やアルカリ性 (高 pH)または酸性 (低 pH)環境に耐えられる藻類を使用した場合、それらの藻類に適した環境よりも塩濃度が低い淡水試料などを計測する際に、淡水性藻類等を用いた場合に比べて以下の利点が生じる。

[0126] ここでは、一例として、高塩性、アルカリ性の環境に耐えられる藻類であるスピルリナを用いる場合について説明する。スピルリナは、高塩性の環境である塩水湖と、低塩性の環境である淡水湖のどちらにも生息する藍藻類である。このため、スピルリナを用いれば、塩水湖の環境に相当する高塩性培地（SOT培地）と、淡水湖の環境に相当する低塩性培地 (MA培地）の両方の環境で、遅延蛍光を計測することができる

[0127] 一般に、試料となる水溶液サンプルは、河川や湖沼水、地下水、土壌抽出水など様々な環境から採取される。このため、サンプルの塩濃度は均一ではなぐその結果、 pHなど藻類の生育環境として重要な要素が均一ではない場合がある。これに対して、試験対象となる水溶液サンプノレに調整溶液を混合して塩濃度、 pHを調整し、その後に光合成サンプノレと混合する方法が可能である。この場合、水溶液サンプルを高塩性培地として調整することにより、低塩性培地の場合に比べて pHなどをより容易に調整することができる。

[0128] 図 30は、高塩性培地及び低塩性培地を用いて水溶液サンプルを調整した場合の調整例を示す表である。ここでは、水溶液サンプルとして、湖水、井戸水、水道水、及び蒸留水を用いている。これらの調整例では、原水そのものの pHは、湖水で 7. 4 4、井戸水で 6. 03、水道水で 7. 07、蒸留水で 5. 46であり、そのサンプル間の標準偏差は 0. 91であった。

[0129] これに対し、 5倍濃度の高塩性培地を調整溶液として調整を行った場合の pHは、湖水で 9. 68、井戸水で 9. 71、水道水で 9. 72、蒸留水で 9. 69となった。このときの標準偏差は 0. 02であり、原水に比べて水溶液サンプノレの違いによる pHの差が改善した。一方、 5倍濃度の低塩性培地を調整溶液として調整を行った場合の pHは、湖水で 8. 13、井戸水で 7. 77、水道水で 8. 14、蒸留水で 8. 29となった。このときの標準偏差は 0. 22であり、原水に比べて改善はしたものの、高塩性培地に比べて劣る結果となった。

[0130] 一般的な塩濃度に関しても、淡水環境に対して高塩濃度で調整する高塩性培地の方が、低塩性培地に比べて原水における塩濃度の変動を改善しやすい。このように、光合成サンプノレとして、例えば海洋や塩水湖に生息する藻類など、高塩濃度ゃァルカリ性または酸性環境に耐えられる藻類を使用した場合、それらの藻類に適した環境よりも塩濃度が低い淡水サンプノレなどを計測する際において、淡水性藻類を用レ、た場合に比べて、原水の pH、塩濃度などの変動を改善する上で利点がある。

[0131] また、遅延蛍光の計測対象となる溶液については、遅延蛍光の光量を計測する前に均一化させることが好ましい。時間経過にしたがって計測溶液中の光合成サンプルが沈殿、浮上すると、光検出器の視野内における光合成サンプルの密度が変化し、発光量の計測値が変化する。その結果、所定時間の放置や計測中の時間経過により、その計測精度が低下する場合がある。これに対して、溶液を均一化することにより、誤差の少ない有害物質の評価が可能となる。このような溶液の均一化については、光合成サンプノレの分布密度を均一化するための安定化剤を用いることが好ましレ、。また、有害物質の評価に用いられる評価用キットについては、光合成サンプルの分布密度を均一化するための安定化剤を備えることが好ましい。このような安定化剤としては、例えば、上述したように比重調整剤や増粘剤 (ゲル化剤など)などを用いることができる。

[0132] 図 31は、溶液の均一化なし、及び増粘剤添加の条件での放置時間に対する遅延蛍光量の変化を示すグラフである。ここでは、光合成サンプルとして藍藻スピルリナ（ Spirulina platensis)を用い、図 5に関して上述した標準的測定条件と同様の条件下で、放置時間を変えて遅延蛍光の光量の計測を行った。

[0133] 増粘剤の添加に関しては、「均一化なし」では、増粘剤に相当するゲル化剤としての寒天を添加せずに調整された計測溶液を用い、「増粘剤添加」では、増粘剤としての寒天を全体に対して 0. 1重量％となるように添加した計測溶液を用いた場合の計測結果を示している。また、計測は、溶液の調整直後（0分)から 15分後まで放置時間の経過にしたがって実施し、遅延蛍光量として光照射終了後 0.1秒から 0.5秒までの遅延蛍光量積算量である CP1を求めた。

[0134] 図 31に示すように、増粘剤を含まなレ、「均一化なし」のグラフでは、放置時間の経過に伴って CP1が低下している。これは、時間経過にしたがって光合成サンプルが沈殿、浮上していくためである。これに対し、「増粘剤添加」のグラフでは、時間経過後においても CP1の計測値に大きな変化はみられない。以上のことから、計測溶液については、光合成サンプルを均一化する手段を講じた上で計測に用いることが、計測精度を向上するために有効であることがわかる。

[0135] このような増粘剤は、光合成サンプルからの発光の計測を阻害、力べ乱せず、微弱な発光を計測可能な条件で添加することが好ましい。具体的には、増粘剤としては、光合成サンプルの均一化が可能な濃度において、蛍光や燐光を持たず、透明で光合成サンプノレの発光を吸収しないものを用いることが好ましい。このような増粘剤の例としては、低濃度の寒天ゃァガロース、メチルセルロース溶液などを用いることができる。また、計測前に光合成サンプルを均一化させる手段としては、増粘剤の添加の他に、微細な網や格子構造により計測溶液中での光合成サンプノレの沈降、浮上を抑制したり、あるいは、外部からの攪拌によって均一性を保持することも可能である。

[0136] また、遅延蛍光の光量等については、計測溶液中の光合成サンプルの濃度差により生じる測定誤差に対して、必要に応じて補正等を行うことが好ましい。すなわち、計測に用いる光合成サンプルは、生物細胞または細胞内小器官、膜タンパク複合体などを用レ、る性質上、その操作中や保存中に細胞生長 ·分裂による増加や死亡 ·分解による減少により、量的変化を生じる場合がある。また、量的変化がない場合でも、遅延蛍光の発光能力の変化や光量の時間的変化上の特徴などの質的変化が生じる場合もある。

[0137] このような変化は、計測評価での誤差となるため、計測に先立って、使用する光合成サンプノレに変化が生じていないかを評価する評価方法を用いることが有効である。光合成サンプルの量的変化、質的変化を検出することにより、計測結果の精度が管理される。このような評価方法により、光合成サンプルの異常が検出された場合には、それが許容範囲にあるかどうかを判断し、必要に応じて計測者に対して何らかの警告を示すなどの方法を用いることができる。

[0138] 上記した光合成サンプルの評価方法としては、例えば以下の（1)一（3)の方法がある。（1)光合成サンプノレの密度が、遅延蛍光の光量と比例関係を有する密度の範囲であるかどうかを評価する。このような評価は、例えば、光合成サンプルの密度と遅延蛍光の光量とにより作成される検量線を用いて行うことができる。（2)光合成サンプルの密度に対する遅延蛍光の光量が、評価基準となる模範データと比較して変化してレ、なレ、かを評価する。例えば、光合成サンプノレの密度と遅延蛍光の光量とにより作成される検量線において、その検量線に示される光合成サンプノレの密度当たりの発光量の関係式に、一定の誤差範囲で相関が得られるかについて評価を行う。（3)遅延蛍光の光量の時間的変化が評価基準となる模範データと比較して変化していないかを評価する。例えば、模範データの光量の時間的変化に対する差や、遅延蛍光の光量の時間的変化における特徴点の光量及び特徴点の現れる時間、あるいは、 2箇所の特徴点の間の光量変化の傾き、特定の時間範囲での光量変化の傾きなどを用いて評価を行うことができる。

[0139] 上記した光合成サンプルの評価において、模範データとしては、例えば、光合成サンプルの吸光度や光散乱量、遅延蛍光光量、及びその時間的変化などのデータが用いられる。また、このような模範データや許容範囲を示すデータについては、あら力、じめ計測装置または解析装置に記憶されているデータ、または光合成サンプルの調整時に記録されたデータなどを用いることができる。また、同様の評価を水溶液サンプルと混合前の光合成サンプノレにっレ、て実施すれば、その結果から標準計測溶液などでの計測結果を推測することができる。このような場合にも、使用するデータについては上記と同様である。

[0140] また、光合成サンプノレを評価することにより、その変化が検出された場合、必要に応じて計測に対して補正を行うことが好ましい。そのような補正方法の例としては、光合成サンプノレに生じている変化が量的変化の場合、上記した（1)の評価方法により、光合成サンプルの密度が、遅延蛍光の光量と比例関係を有する密度の範囲であるならば、密度が異なる光合成サンプルを用いた各計測結果において、遅延蛍光の光量を光合成サンプルの密度によって規格化し、比較すること力 Sできる。このような場合の規格化方法としては、例えば、遅延蛍光の光量を光合成サンプルの密度によって除算する方法などがある。

[0141] 本発明による有害物質の評価方法について、さらに説明する。

[0142] 上記した実施形態では、主として、（1)水溶液サンプルに光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製し、試験計測溶液を所定の放置時間放置し、試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第 1のステツプと、（2)有害物質が存在しない標準サンプルに、光合成サンプノレを混合して標準計測溶液を調製し、標準計測溶液を所定の放置時間放置し、標準計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第 2のステツプと、 (3)第 1のステップ及び第 2のステップでそれぞれ計測された遅延蛍光の光量に基づいて評価値を算出し、評価値の比較値を求めることにより、水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する第 3のステップとを備える有害物質の評価方法について説明している。

[0143] このような有害物質の評価方法は、一般には、（1)水溶液サンプルに光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製し、試験計測溶液を所定の放置時間放置し、試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第 1のステップと、 (2)比較サンプルに光合成サンプノレを混合して調製された比較計測溶液を所定の放置時間放置し、比較計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測した比較計測結果を用意する第 2のステツプと、 (3)第 1のステップ及び第 2のステップでそれぞれ取得された遅延蛍光の光量に基づいて評価値を算出し、評価値の比較値を求めることにより、水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する第 3のステップとによって構成することができる。

[0144] また、上述したように、このような評価方法において、評価値は、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点における経過時間であることが好ましい。あるいは、評価値は、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化であり、比較値は、時間的変化の差をとつた値であることが好ましレ、。

[0145] ここで、第 2のステップで用いられる比較サンプル、及び比較計測結果については、様々なものを用いて良レ、。例えば、第 2のステップにおいて、比較サンプルとして比較対象となる標準サンプノレを用レ、、標準サンプルに光合成サンプノレを混合して比較計測溶液である標準計測溶液を調製し、標準計測溶液を所定の放置時間放置し、標準計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測して、比較計測結果を取得する方法を用いることができる。この場合、標準サンプノレとしては、図 3に関して上述したように、有害物質が実質的に存在しないサンプルを用いることが好ましい。 [0146] あるいは、第 2のステップにおいて、比較サンプルとして他の水溶液サンプルを用レ、、水溶液サンプノレに光合成サンプルを混合して調製された比較計測溶液である他の試験計測溶液について取得された計測結果を比較計測結果として用意する方法を用いることができる。この場合、比較計測結果としては、例えば、前回の計測結果を用いることができる。

[0147] また、第 2のステップでの比較計測結果の取得については、第 1のステップと同様に、比較計測溶液に対して遅延蛍光の光量の計測を行うことによって比較計測結果を用意する方法を用いることができる。あるいは、第 2のステップにおいて、比較計測結果として、比較計測溶液についてあらかじめ取得された計測結果を比較計測結果として用意する方法を用いても良い。このような場合、あらかじめ取得した比較計測結果をメモリ等に記憶しておき、必要に応じてデータを読み出して用いることが好ましい。このように、第 2のステップにおいて用いられる比較サンプル、比較計測溶液、及び比較計測結果の取得方法等については、様々な変形が可能である。

[0148] (有害物質の連続的な評価方法）

本発明による方法を用いた有害物質の連続的な評価方法 (モニタリング方法）について説明する。このような評価方法を用いれば、河川や地下水などの水溶液サンプルを連続的に計測して、その有害性の変化を監視することができる。

[0149] 図 32は、有害物質の連続的な評価方法の一例を示す模式図である。この評価方法では、まず 1回目計測として、通常の手順にしたがって、標準計測溶液の計測と、河 J 11などから採取した水を水溶液サンプルとした試験計測溶液の計測とを行う。そして、それらの結果を比較して、河川水に含まれる有害物質の評価を行う。この際、標準計測溶液の計測結果 Cl、試験計測溶液の計測結果 SI、及びそれらの比較結果に対応する水溶液サンプノレの有害性の評価結果 D1を記録しておく。

[0150] その後、計測時間間隔として設定された所定の時間経過後に、 2回目計測として、再び、標準計測溶液の計測と、新たに採取した河川水を水溶液サンプルとした試験計測溶液の計測と、それらの結果の比較とを行い、標準計測溶液の計測結果 C2、試験計測溶液の計測結果 S2、及び有害性の評価結果 D2を記録する。

[0151] その後同様に、所定の時間経過毎に計測を実施し、例えば、 n回目計測において、標準計測溶液の計測結果 Cn、試験計測溶液の計測結果 Sn、及び有害性の評価結果 Dnを記録する。これらの記録された水溶液サンプルの有害性の評価結果 D1、 D2、 · · ·、 Dnを連続的に比較することにより、河川水などにおける有害物質による汚染の変化を監視することができる。

[0152] 図 33は、有害物質の連続的な評価方法の他の例を示す模式図である。この評価方法では、まず上記と同様の手順で 1回目計測を実施し、標準計測溶液の計測結果 Cl、及び試験計測溶液の計測結果 SIを記録する。また、この際、それらの比較結果に対応する水溶液サンプルの有害性の評価結果 D1についても、必要に応じて記録しておく。

[0153] その後、所定の時間経過後に、 2回目計測として、新たに採取した河川水を水溶液サンプルとした試験計測溶液の計測のみを行い、その計測結果 S2を記録する。また、ここでは、この 2回目計測における試験計測溶液の計測結果 S2と、 1回目計測における試験計測溶液の計測結果 S1との比較を行い、それらの比較結果に対応する水溶液サンプノレの有害性の評価結果 E2を記録する。この評価結果 E2は、 1回目計測力 2回目計測までの間に、水溶液サンプノレとなる河川水などの有害性がどのくらい変化したかを簡易に示してレ、る。

[0154] その後同様に、所定の時間経過毎に計測を実施し、例えば、 n回目計測において、試験計測溶液の計測結果 Sn、及び n - 1回目計測の計測結果 Sn - 1との比較結果に対応する有害性の評価結果 Enを記録する。これらの記録された水溶液サンプノレの有害性の評価結果 E2、 E3、 · · ·、 Enを連続的に比較することにより、河川水などにおける有害物質による汚染の変化を簡便に監視することができる。

[0155] 図 32及び図 33に示した評価方法のように、計測時期を変えて連続的に有害物質の評価を行う場合、 1回目計測と 2回目以降の計測との間での時間経過により、光合成サンプノレに変化が生じる場合がある。光合成サンプルの変化とは、例えば、光合成サンプルの劣化、分解、死亡、増殖などによる光合成サンプルの密度の変化のような量的変化、あるいは遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点における経過時間や遅延蛍光の光量の変化のような質的変化などである。このような光合成サンプノレの変化については、遅延蛍光の光量の計測、及び光合成サンプルの細胞密度の計測の実施後に、以下のような補正を行うことが可能である。

[0156] まず、光合成サンプルの密度の量的変化が生じた場合、計測に用いる光合成サンプノレについて細胞密度と遅延蛍光の光量とが比例関係にある範囲にあることがあら力、じめ調べられていれば、吸光度または光散乱量などにより計測された光合成サンプノレの細胞密度を元に補正を行うことができる。

[0157] 具体的な補正方法としては、例えば、 1回目計測において、計測溶液からの遅延蛍光の光量とともにサンプノレの細胞密度を計測する。また、 2回目計測においても、計測溶液からの遅延蛍光の光量とともにサンプノレの細胞密度を計測する。ここで、 1回目計測及び 2回目計測のそれぞれの計測結果について、遅延蛍光の光量を細胞密度で除算する補正を行えば、 1回目計測と 2回目計測との間で光合成サンプルの細胞密度が変化した場合であっても、それらを比較することが可能となる。

[0158] また、遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点での経過時間や遅延蛍光の光量などの質的変化が生じた場合、計測に用いる光合成サンプノレについて遅延蛍光の光量の時間的変化が模範データと比較して許容範囲内にあることがあらかじめ調べられていれば、それらの特徴点同士の位置関係などを元に補正を行うことができる。

[0159] 具体的な補正方法の例について、図 34を参照して説明する。図 34は、遅延蛍光の光量の時間的変化の例を示す図であり、グラフ（_a)は 1回目計測で取得された遅延蛍光量の時間的変化を示し、グラフ (b)は 2回目計測で取得された遅延蛍光量の時間的変化を示している。

[0160] これらの遅延蛍光量の時間的変化について、例えば、グラフ（a)に示す 1回目計測での特徴点 A、 Bについて、その経過時間 al、 blを求める。同様に、グラフ（b)に示す 2回目計測での特徴点 A、 Bについて、その経過時間 a2、 b2を求める。また、これらの計測結果に対し、 1回目計測の結果から経過時間 alに対する blの比率 (blZa

1)を求める。同様に、 2回目計測の結果から経過時間 a2に対する b2の比率 (b2Za

2)を求める。そして、これらの比率（blZal)及び（b2/a2)の比較を行うことにより、特徴点の位置関係を元にした補正を行うことができる。

[0161] (Curve値の解析方法）

有害物質の評価に用いられる評価値及び比較値については、上記したように、その一例として、第 1のステップ及び第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化を評価値とし、その時間的変化の差をとつた値を比較値とすることができる。このような比較値としては、上記した実施形態では、試験計測溶液及び標準計測溶液から得られた遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつて得られた Curve値を挙げてレ、る。この Curve値の解析方法にっレ、ては、試験計測溶液及び標準計測溶液に対して取得された具体的な計測結果に応じて、様々な解析方法を用いることができる。

[0162] 遅延蛍光の光量の時間的変化の差に相当する Curve値については、計測結果である遅延蛍光の光量の時間的変化に特徴点が存在する場合と、特徴点が存在しない場合とに分けて考えることができる。

[0163] 遅延蛍光の光量の時間的変化を示す遅延蛍光減衰カーブ（図 5参照）に特徴点が存在する場合、上記したように、その特徴点における発光量や経過時間等に着目して評価を行うことが可能である。また、 Curve値を用いる場合には、 2つの特徴点間、または計測始点と特徴点との間に着目して Curve値を求め、それを比較値として評価を行うことが好ましい。あるいは、特徴点を考慮せずにその全体または所定範囲について Curve値を求めても良い。

[0164] 一方、遅延蛍光減衰カーブに特徴点が存在しない場合、その全体または所定範囲について Curve値を求め、それを比較値として評価を行うことができる。ここで、遅延蛍光の光量の時間的変化において、その各計測点 nにおける Curve値は、（計測点 n における試験計測溶液の発光量) - (計測点 nにおける標準計測溶液の発光量）によつて求められる。

[0165] また、光合成サンプルから発する遅延蛍光は、一般的には、図 5に例示したように、励起後時間が早い時間域では発光量が多ぐ遅い時間域では減衰によって発光量が少ない。このため、 Curve値を算出する時間域が異なると、発光量の差の大きさが異なることとなり、異なる時間域での変化を評価することが難しい場合がある。

[0166] このような場合には、試験計測溶液及び標準計測溶液に対して取得された遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値である Curve値について、さらに試験計測溶液または標準計測溶液に対して取得された遅延蛍光の光量 (好ましくは、標準計測溶液に対して取得された遅延蛍光の光量）との比をとつて標準化した VCurve値を比較値として用いることが有効である。これにより、異なる時間域での変化を評価することが容易化される。ここで、遅延蛍光の光量の時間的変化において、その各計測点 n における VCurve値は、（計測点 nにおける Curve値) / (計測点 nにおける標準計測溶液の発光量） X 100によって求められる。

[0167] なお、上記した VCurve値を特徴点が存在する遅延蛍光減衰カーブに適用する場合には、特徴点間、または計測始点と特徴点との間に着目して VCmve値を求めても良ぐあるいは、特徴点を考慮せずにその全体または所定範囲について VCurve値を求めても良い。

[0168] また、遅延蛍光減衰カーブにおける特徴点の有無に関しては、一般には、第 1のステツプまたは第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化が特徴点を有し、第 3のステップにおいて、一の特徴点と、計測始点または他の特徴点との間の所定範囲について遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値を比較値として有害物質を評価する方法を用いることができる。また、遅延蛍光の光量の時間的変化に特徴点がない場合には、その全体または所定範囲について遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値を比較値とすることができる。

[0169] 図 35は、遅延蛍光減衰カーブに特徴点が存在する場合の Curve値の算出方法の例について示す図である。標準計測溶液での遅延蛍光減衰カーブと、試験計測溶液での遅延蛍光減衰カーブとを比較する場合、それらの減衰カーブで特徴点の位置が異なる場合がある。このような場合において、特徴点の影響を排して有害物質の評価を行うためには、 Curve値の算出範囲として特徴点が含まれない時間域を設定することが好ましい。

[0170] 図 35のグラフ（a) (c)は、注目する 2つの特徴点を励起後時間 0秒の最大値の点

(計測始点）、及びその直後に現れる極小値の点として、標準計測溶液と試験計測溶液とで遅延蛍光減衰カーブの特徴点の位置が異なる場合の Curve値算出の時間域の設定の例を示している。図 35のグラフ（a)は、標準計測溶液及び試験計測溶液の遅延蛍光減衰カーブのうちで標準計測溶液の減衰カーブのみに特徴点が存在する場合を示している。この場合、 Curve値の算出範囲は、計測始点から標準計測溶液での極小値の出現点までの時間範囲「a」を選択することが好ましい。 [0171] また、図 35のグラフ（b)は、試験計測溶液の遅延蛍光減衰カーブでの極小点が、標準計測溶液での極小点よりも早い時間に現れた場合を示している。この場合、 Curve値の算出範囲は、計測始点から標準計測溶液での極小値の出現点までの時間範囲「b」と、計測始点から試験計測溶液での極小値の出現点までの時間範囲「c」とを比較し、双方に共通する時間域である時間範囲「c」を選択することが好ましい。

[0172] また、図 35のグラフ（c)は、試験計測溶液の遅延蛍光減衰カーブでの極小点が、標準計測溶液での極小点よりも遅い時間に現れた場合を示している。この場合、 Curve値の算出範囲は、計測始点から標準計測溶液での極小値の出現点までの時間範囲「d」と、計測始点から試験計測溶液での極小値の出現点までの時間範囲「e」とを比較し、双方に共通する時間域である時間範囲「d」を選択することが好ましい。

[0173] 図 36は、遅延蛍光減衰カーブに特徴点が存在しない場合の Curve値の算出方法の例について示す図である。ここでは、光合成サンプルとして、光強度 50 μ mol/m²/s 、白色蛍光灯下で一般的な方法で育成された緑藻類である Selenastmm

capricornutumを用いた標準計測溶液の遅延蛍光減衰カーブを示してレ、る。サンプルの調整については、 Spirulina platensisの場合と同様の手順で行っている。図 36のグラフでは、遅延蛍光減衰カーブに明確な特徴点が現れていなレ、。このような場合、特徴点に着目した評価ができないため、 Curve値を用いた評価が有効である。

[0174] 図 37は、（a)シマジン濃度及び (b)ジクロロフエノール濃度を変化させた場合の

Curve値を示すグラフである。具体的には、図 37のグラフ（a)は、除草剤の一種であるシマジンを濃度 25、 50、 lOOppbで曝露した試験計測溶液の計測結果と、標準計測溶液の計測結果とから、励起後時間 0. 1秒一 50秒の時間域について算出された Curve値を示している。また、グラフ（b)は、ジクロロフェノールを濃度 1、 5、 lOppmで曝露した試験計測溶液の計測結果と、標準計測溶液の計測結果とから、励起後時間 0. 1秒一 50秒の時間域について算出された Curve値を示している。

[0175] これらのうち、シマジンに関するグラフ（a)では、シマジン曝露濃度に応じて Curve 値が変化し、濃度の増加に伴って励起後時間 0. 1秒付近でプラス側に変化した。また、励起後時間 0. 5秒以降にも、わずかにマイナス側への変化が認められた。また、ジクロロフヱノールに関するグラフ（b)では、ジクロロフヱノール曝露濃度に応じて Curve値が変化し、濃度の増加に伴って励起後時間 0. 2— 10秒付近でマイナス側への変化が認められた。

[0176] 以上の結果から、遅延蛍光減衰カーブに明確な特徴点が存在しない場合でも、

Curve値を算出することにより、有害物質の影響を評価できることがわかる。また、このような Curve値では、変化が現れる時間域、及びそのプラス ·マイナスの変化の方向が有害物質によって異なるため、検出された有害物質の種類及び作用等を特定する上で有用である。

[0177] 図 38は、（a)シマジン濃度及び (b)ジクロロフヱノール濃度を変化させた場合の

VCurve値を示すグラフである。具体的には、図 38のグラフ（a)は、シマジンを濃度 25 、 50、 lOOppbで曝露した試験計測溶液の計測結果と、標準計測溶液の計測結果とから、励起後時間 0. 1秒一 50秒の時間域について算出された VCurve値を示している。また、グラフ（b)は、ジクロロフヱノールを濃度 1、 5、 lOppmで曝露した試験計測溶液の計測結果と、標準計測溶液の計測結果とから、励起後時間 0. 1秒一 50秒の時間域について算出された VCurve値を示している。また、 VCurve値については、具体的には、上記したように、時間的変化の差に相当する Curve値を、標準計測試料での発光量との比率として標準化した例を示してレ、る。

[0178] これらのうち、シマジンに関するグラフ（a)では、シマジン曝露濃度に応じて VCurve 値が変化し、濃度の増加に伴って励起後時間 0. 1— 0. 3秒付近でプラス側に変化した。また、励起後時間 15秒付近を中心に、 0. 4秒一 50秒の幅広い範囲でマイナス側への変化が認められた。また、ジクロロフエノールに関するグラフ（b)では、ジクロロフエノール曝露濃度に応じて VCurve値が変化し、濃度の増加に伴って励起後時間の全域（0. 1 50秒付近）で幅広くマイナス側への変化が認められた。

[0179] 以上の結果から、遅延蛍光減衰カーブに明確な特徴点が存在しない場合でも、

VCurve値を算出することにより、有害物質の影響を評価できることがわかる。また、このような VCurve値では、変化が現れる時間域、及びそのプラス.マイナスの変化の方向が有害物質によって異なるため、検出された有害物質の種類及び作用等を特定する上で有用である。また、 VCurve値では、 Curve値に比べて異なる時間域の変化を比較することが容易である。 [0180] (試験計測溶液の順化処理）

次に、試験計測溶液に対して計測前に行われる順化処理にっレ、て説明する。図 5 における標準的測定条件に関して上述したように、光合成サンプルを計測光条件に順応させるための予備的な光照射、及び所定時間の暗黒下での待機 (暗中待機）による順化処理 (順化ステップ)が行われる場合がある。

[0181] 一般には、このような順化ステップを含む有害物質の評価方法は、試験対象の水溶液サンプノレ中に存在する有害物質を評価する有害物質の評価方法であって、 (a) 水溶液サンプノレに光合成機能を有する光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製する調製ステップと、 (b)試験計測溶液を所定の放置時間放置する放置ステツプと、（c)試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する計測ステップと、 (d)計測ステップで取得された遅延蛍光の光量に基づいて、水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する評価ステップと、（e)計測ステップの前に、試験計測溶液に対して所定の待機時間での暗中待機を行う暗中待機ステップ、または試験計測溶液に対して予備的な光照射及び所定の待機時間での暗中待機を行う予備照射ステップのいずれか一方を含む順化ステップとを備えることが好ましい。

[0182] このような有害物質の評価方法では、評価対象の水溶液サンプルに混合された光合成サンプルから発せられる遅延蛍光の光量の時間的変化において得られる特徴から、複数の有害物質を同時に、かつ精度良く定性、定量することができる。また、遅延蛍光の光量を計測して評価することにより、計測時間を全体的に短縮化することができる。また、計測ステップの前に試験計測溶液に対して順化ステップを行うことにより、遅延蛍光の計測、及びその計測結果による有害物質の評価の精度を向上することができる。

[0183] このように、計測ステップの前に順化ステップを実施する場合、暗中待機ステップにおいて、所定の待機時間は 30秒以上 1時間以下の時間であることが好ましい。また、予備照射ステップにおける予備的な光照射の時間及び暗中待機の時間の比が、計測ステップにおける光の照射の時間及び喑中待機の時間の比と等しいことが好ましレ、。以下、このような順化ステップについて具体的に説明する。 [0184] 有害物質の評価に用いられる遅延蛍光は、光合成サンプルに吸収された光ェネルギ一が、様々な化学反応に分配された後に再び放出される現象である。このため、遅延蛍光の計測（計測ステップ）にいたるまでの光合成サンプノレの光や温度などに関する種々の環境の履歴が、遅延蛍光の計測結果に重大な影響を及ぼす場合がある（例えば、非特許文献 2参照）。したがって、遅延蛍光の計測結果を水質検査等の有害物質の評価に利用するためには、光合成サンプルの環境履歴を制御して再現性の良レ、条件で遅延蛍光の計測を行うことが好ましレ、。

[0185] 図 39は、遅延蛍光の計測回数による CP1の変化を示すグラフである。ここでは、光合成有効放射に換算して 5 x mol/m²/_Sの白色蛍光灯下で 15分間放置した標準計測溶液について、計測条件として 665nm、 0.8mWん m²の光を 2秒照射後に、喑中で 60 秒間、遅延蛍光の光量を計測することとし、この計測を 5回連続で実施してそれぞれにつレ、て CP1値を求めてレ、る。

[0186] この計測結果では、 1回目計測で 15217、 2回目計測で 11693、 3回目計測で 10098 、 4回目計測で 9690、 5回目計測で 9627の CP1値が得られている。これらの CP1値に示すように、 CP1値は特に 1回目力 3回目の計測結果でばらつきがある。また、遅延蛍光の計測を繰り返すことにより、ある値 (例えば 3回目力 5回目での値）で計測結果が安定し、再現性が向上していくことがわかる。これは、光合成サンプル内の光ェネルギ一の分配力 S、放置条件から計測条件に順応していくことを示している。

[0187] 以上の結果からわかるように、計測溶液を所定の放置時間放置する放置ステップの後に、続けて遅延蛍光の計測ステップを行った場合には、遅延蛍光の計測の再現性が充分に得られず、その計測結果にばらつきを生じる場合がある。図 39に示した例では、計測回数が 1回目から 3回目の計測結果では、水質検査の精度は充分には得られなレ、。また、何回目の計測結果から充分な再現性が得られているかの判断は煩雑であり、また、その計測結果に計測者の個人差が反映されてしまうことも考えられる。

[0188] このような場合について、光合成サンプルに対する環境履歴の制御方法を検討した結果、放置ステップと計測ステップとの間に、光合成サンプノレの環境履歴を制御するための順化ステップを付加することによって、再現性の良い計測結果が得られることがわ力た。このような順化ステップを行うことにより、例えば図 39の計測結果において、 3回目以降の計測結果を 1回目から得ることが可能となる。

[0189] 計測溶液を計測条件に順化させる順化ステップは、（1)計測溶液に対して所定の待機時間での暗中待機を行う暗中待機ステップ、または（2)試験計測溶液に対して予備的な光照射及び所定の待機時間での暗中待機を行う予備照射ステップのいずれカまたは両ステップを放置ステップと計測ステップとの間に付カ卩することによって達成される。

[0190] 図 40は、様々な順化条件において遅延蛍光の計測を 3回行った結果における計測精度を示す表である。具体的には、様々な順化条件において 3回連続の計測を行レ、、その標準偏差を 3回計測の平均で除算して 100倍したものを計測精度（％)として算出している。すなわち、図 40に示す計測精度は、 3回の計測において得られた CP1値力それらの平均に対してどの程度の誤差を持っている力、を表している。

[0191] また、ここでは、光合成有効放射に換算して 5 /i mol/m²/sの白色蛍光灯下で 15分間放置した標準計測溶液にっレ、て、計測条件として 665nm、 0.8mWん m²の光を 2秒照射後に、暗中で 60秒間、遅延蛍光の光量を計測することとし、この計測を 3回実施して本計測としている。そして、その本計測の実施前に様々な順化条件 (予備照射条件）で順化処理を行って、それぞれにつレ、て 3回計測結果での計測精度を求めてレ、る。

[0192] 順化条件としては、本計測の直前に計測条件と同じ手順で 665nm、 0.8111\¥ん111²の光を 2秒照射後に暗中で 60秒間待機させたものを「計測条件 1回」、同様の手順を 2 回繰り返したものを「計測条件 2回」とした。また、光照射をせずに計測条件と同じ時間喑中で待機させたものを「喑中 1回」、喑中待機を 2回繰り返したものを「喑中 2回」とした。また、計測条件と同じ時間光を照射したものを「光 1回」、光を 30秒照射後に暗中で 30秒間待機させたものを「光 30喑 30」、光を 1秒照射後に暗中で 30秒間待機させたものを「光 1喑 30」、順化処理を行わないものを「順化条件なし」とした。

[0193] その結果、計測溶液に対する順化条件としては、計測条件と同じ光照射一暗中待機を 1一 2回繰り返すか、または、光照射をせずに計測条件と同じ時間暗中で待機を 1一 2回繰り返すこと力順化処理として適していることがわかった。図 40に示す例では、順化条件の時間が同じ「計測条件 2回」と「暗中 2回」での計測精度はそれぞれ 3 . 6と 4. 8、「計測条件 1回」と「暗中 1回」での計測精度はそれぞれ 10. 6と 14. 2である。また、暗中待機のみで順化処理を行う場合に比べて、計測条件と同じ光照射ー喑中待機を実施する方が、より効果的に計測溶液を計測環境に順化できることがわかつた。

[0194] 以上の結果より、上記した喑中待機ステップ、または予備照射ステップのいずれか

、または両ステップを放置ステップと計測ステップとの間に付加することにより、その後に実施する遅延蛍光の計測精度を向上させることができる。

産業上の利用可能性

[0195] 本発明は、短時間でかつ幅広い有害物質の分析を行うことが可能な有害物質の評価方法、及び有害物質の評価用キットとして利用可能である。

Claims

請求の範囲

[1] 試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する有害物質の評価方法であって、

前記水溶液サンプルに光合成機能を有する光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製し、前記試験計測溶液を所定の放置時間放置し、前記試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する第 1のステップと、

比較サンプノレに前記光合成サンプルを混合して調製された比較計測溶液を前記所定の放置時間放置し、前記比較計測溶液に前記所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測した比較計測結果を用意する第 2のステップと、前記第 1のステップ及び前記第 2のステップでそれぞれ取得された遅延蛍光の光量に基づいて評価値を算出し、前記評価値の比較値を求めることにより、前記水溶液サンプノレ中に存在する有害物質を評価する第 3のステップとを備え、

前記評価値は、前記第 1のステップ及び前記第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化の特徴点における経過時間であることを特徴とする有害物質の評価方法。

[2] 試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する有害物質の評価方法であって、

比較サンプノレに前記光合成サンプルを混合して調製された比較計測溶液を前記所定の放置時間放置し、前記比較計測溶液に前記所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測した比較計測結果を用意する第 2のステップと、前記第 1のステップ及び前記第 2のステップでそれぞれ取得された遅延蛍光の光量に基づいて評価値を算出し、前記評価値の比較値を求めることにより、前記水溶液サンプノレ中に存在する有害物質を評価する第 3のステップとを備え、前記評価値は、前記第 1のステップ及び前記第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化であり、前記比較値は、前記時間的変化の差をとつた値であることを特徴とする有害物質の評価方法。

[3] 前記第 1のステップまたは前記第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化が特徴点を有し、前記第 3のステップにおいて、一の特徴点と、計測始点または他の特徴点との間の所定範囲について遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値を前記比較値として有害物質を評価することを特徴とする請求項 2記載の有害物質の評価方法。

[4] 前記第 3のステップにおいて、前記第 1のステップ及び前記第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化の差をとつた値について、さらに前記第 1のステップまたは前記第 2のステップで取得された遅延蛍光の光量の時間的変化との比をとった値を前記比較値として有害物質を評価することを特徴とする請求項 2または 3 記載の有害物質の評価方法。

[5] 前記第 2のステップにおいて、前記比較サンプルとして比較対象となる標準サンプルを用い、前記標準サンプルに前記光合成サンプルを混合して前記比較計測溶液である標準計測溶液を調製し、前記標準計測溶液を前記所定の放置時間放置し、前記標準計測溶液に前記所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測して、前記比較計測結果を取得することを特徴とする請求項 1一 4のいずれか一項記載の有害物質の評価方法。

[6] 前記第 2のステップにおいて、前記比較サンプノレとして他の水溶液サンプルを用い、前記他の水溶液サンプルに前記光合成サンプノレを混合して調製された前記比較計測溶液である他の試験計測溶液について取得された計測結果を前記比較計測結果として用意することを特徴とする請求項 1一 4のいずれか一項記載の有害物質の評価方法。

[7] 前記第 2のステップにおいて、前記比較計測結果として、前記比較計測溶液につレ、てあらかじめ取得された計測結果を前記比較計測結果として用意することを特徴とする請求項 1一 6のいずれか一項記載の有害物質の評価方法。

[8] 前記第 1のステップ及び前記第 2のステップにおいては、計測毎に光条件を変化させて、前記試験計測溶液及び前記比較計測溶液を所定の放置時間放置し、前記第 3のステップにおいては、前記光条件に応じた前記比較値の変化を評価することを特徴とする請求項 1一 7のいずれか一項記載の有害物質の評価方法。

[9] 前記試験計測溶液中及び前記比較計測溶液中における前記光合成サンプルの密度は、遅延蛍光の光量と比例関係を有する密度の範囲であることを特徴とする請求項 1一 8のいずれか一項記載の有害物質の評価方法。

[10] 前記第 1のステップ及び前記第 2のステップにおいては、遅延蛍光の光量を計測する前に、前記試験計測溶液及び前記比較計測溶液を均一化させることを特徴とする請求項 1一 9のいずれか一項記載の有害物質の評価方法。

[11] 前記光合成サンプルは、耐塩性藻類、耐アルカリ性藻類、及び耐酸性藻類からなる群から選択される少なくとも一種からなることを特徴とする請求項 1一 10のいずれか一項記載の有害物質の評価方法。

[12] 前記光合成サンプルは、スピルリナであることを特徴とする請求項 11記載の有害物質の評価方法。

[13] 試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する有害物質の評価方法であって、

前記水溶液サンプルに光合成機能を有する光合成サンプルを混合して試験計測溶液を調製する調製ステップと、

前記試験計測溶液を所定の放置時間放置する放置ステップと、

前記試験計測溶液に所定の照射時間光を照射した後に、発生する遅延蛍光の光量を計測する計測ステップと、

前記計測ステップで取得された遅延蛍光の光量に基づレ、て、前記水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価する評価ステップと、

前記計測ステップの前に、前記試験計測溶液に対して所定の待機時間での暗中待機を行う暗中待機ステップ、または前記試験計測溶液に対して予備的な光照射及び所定の待機時間での暗中待機を行う予備照射ステップのいずれか一方を含む順化ステップと

を備えることを特徴とする有害物質の評価方法。

[14] 前記暗中待機ステップにおいて、前記所定の待機時間は 30秒以上 1時間以下の時間であることを特徴とする請求項 13記載の有害物質の評価方法。

[15] 前記予備照射ステップにおける予備的な光照射の時間及び暗中待機の時間の比が、前記計測ステップにおける光の照射の時間及び暗中待機の時間の比と等しいことを特徴とする請求項 13または 14記載の有害物質の評価方法。

[16] 試験対象の水溶液サンプル中に存在する有害物質を評価するための有害物質の評価用キットであって、

前記水溶液サンプルに混合される光合成サンプルと、

前記水溶液サンプノレの塩濃度及び pHを調整するための混合塩類と、前記光合成サンプルと前記混合塩類とを、前記水溶液サンプルに分離して混合させる混合手段と、

を備えることを特徴とする有害物質の評価用キット。

[17] 前記光合成サンプノレの分布密度を均一化するための安定化剤を備えることを特徴とする請求項 16記載の有害物質の評価用キット。