JP3991069B2

JP3991069B2 - 植物の病害抵抗性評価方法及び増殖方法

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Publication number: JP3991069B2
Application number: JP2002273904A
Authority: JP
Inventors: 哲司袴田; 孝宏牧野; 公彦加藤; 洋江本澤
Original assignee: Shizuoka Prefecture; Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Shizuoka Prefecture; Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2002-09-19
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2007-10-17
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: JP2004109012A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の病害抵抗性評価方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マツノザイセンチュウ病によるマツ枯れの被害は、北海道と青森県を除く全国で認められるようになり、ここ数年、夏季の高温で被害材積が増加している。近年は環境問題の視点から、マツノザイセンチュウを媒介するマツノマダラカミキリを抑える薬剤の空中散布を控えるようになり、それに替わる方法としてマツノザイセンチュウ病に抵抗性を有するマツの苗を育種し、それらを枯損地に植栽していくという考え方が広がってきた。
【０００３】
そして、マツは挿し木増殖が困難な樹種であることから、上記植栽に先立って以下の検定が必要となっていた。すなわち、マツ枯れ被害の激害地で生存していた個体を先ず接木で増殖し、増殖したマツに対してマツノザイセンチュウを接種して生存したものを選択し、これを用いて母樹として採種園を造成し、そこで得られた種子から実生苗を得て、それにマツノザイセンチュウを接種して検定を行っていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この方法は夏季に行う重労働である上に、気象条件により検定結果が大きく左右され、結果が得られるまでに長い時間を要するという欠点があった。この結果、上記検定を行った苗の価格が一般のマツに比べて高騰していた。また、樹体そのものにセンチュウを接種するため、枯損させることのできない個体（母樹、天然記念物等）の検定は不可能であった。
【０００５】
本発明はかかる従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、病原体に対して抵抗性（又は感受性）のある植物を評価する植物の病害抵抗性評価方法であって、植物全体ではなくその一部の組織を用いて、重労働を必要とせずに、短期間に高い精度で、植物の病害抵抗性を評価することのできる方法を提供することを目的とする。本発明は、また、上記病害抵抗性評価方法で選別された植物を用いて、病原体に対する抵抗性を有する植物を増殖する増殖方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、病原体を接種した直後の植物に光を照射して一定時間で生じる遅延発光の積算値と、病原体接種後一定期間経過した植物に光を照射して一定時間で生じる遅延発光の積算値とを比較することにより、上記目的が達成可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、病原体に対する被検植物の抵抗性あるいは感受性を評価する植物の病害抵抗性評価方法において、（１）上記被検植物の試料に上記病原体を接種し、接種直後の当該被検植物の試料に光を照射して、発生する遅延発光を所定時間検出する第１のステップと、（２）上記病原体を接種した上記被検植物の試料を、所定条件下で所定時間放置した後、当該被検植物の試料に上記光を照射し、発生する遅延発光を所定時間検出する第２のステップと、（３）上記第１及び第２のステップでそれぞれ計測された上記遅延発光の量を比較して比較値を求めることにより、上記被検植物の上記病原体に対する抵抗性あるいは感受性を評価する第３のステップと、を備えることを特徴とする植物の病害抵抗性評価方法を提供するものである。
【０００８】
本発明は、上記のように、遅延発光を用いて病原体に対して抵抗性又は感受性のある植物を評価するため、客観的及び精度の高い評価が可能になる。また、被検植物そのものではなく被検植物から得られた試料を用いるために、評価が大掛かりになることがなく、評価を屋外且つ夏季に行う必要がないため重労働が要求されない。更に、被検体として植物体そのものを用いる場合は、ある程度の期間が経過した後でなければ抵抗性等の評価ができないのに対して、上記本発明の方法では短期間（典型的には数日〜数週間）で評価が可能になるため、病原体に対して抵抗性又は感受性のある植物を迅速に選別することができる。
【０００９】
上記比較値は、上記第２のステップで上記所定時間検出した上記遅延発光の量を、上記第１のステップで上記所定時間検出した上記遅延発光の量で除した値であることが好ましい。かかる値を用いることにより、より精度高く客観的に病害抵抗性を評価することが可能になる。
【００１０】
本発明の病害抵抗性評価方法において、上記光として、白色光、赤色光、青色光又は緑色光を用いることが好ましい。かかる光を用いることにより、精度高く病害抵抗性を評価することが可能になる。また、これらの光から得られた遅延発光値をそれぞれ組み合わせることにより、より精度高く病害抵抗性を評価することが可能になる。
【００１１】
本発明の病害抵抗性評価方法を適用する場合において、上記被検植物の試料を上記被検植物の枝又は葉とすることができる。枝又は葉を試料として用いることにより、短期間で遅延発光に基づく抵抗性等の判断が可能になる。
【００１２】
本発明は、また、（１）２以上の被検植物の試料のそれぞれに、病原体を接種し、接種直後の当該被検植物の試料に光を照射して、発生する遅延発光をそれぞれ所定時間検出する第１のステップと、（２）上記病原体を接種した上記被検植物の試料を、所定条件下で所定時間放置した後、当該被検植物の試料のそれぞれに上記光を照射し、発生する遅延発光をそれぞれ所定時間検出する第２のステップと、（３）それぞれの被検植物の試料について、上記第２のステップで上記所定時間検出した上記遅延発光の量を、上記第１のステップで上記所定時間検出した上記遅延発光の量で除した値を求める第３のステップと、（４）上記値の平均値より低い値を示す被検植物であって、上記値の分散分析により有意な値を示す被検植物を、上記２以上の被検植物から排除して、上記病原体に対する抵抗性を有する被検植物のみを選別する第４のステップと、（５）上記第４のステップで選別された被検植物を有性繁殖又は無性繁殖させて、病原体に対する抵抗性を有する植物を得る第５のステップと、を備えることを特徴とする植物の増殖方法を提供する。かかる増殖方法を実施することにより、病原体に対する抵抗性を備えた次世代の植物等を容易に作出することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明にかかる植物の病害抵抗性評価方法の実施の形態について、ステップ毎に説明する。
【００１４】
先ず、第１のステップについて説明する。第１のステップにおいては、被検植物の試料に病原体を接種し、接種直後の当該被検植物の試料に光を照射して、発生する遅延発光を所定時間検出する。
【００１５】
本発明において用いられる被検植物の種類は任意であるが、マツを用いることが好ましく、なかでも松枯れ被害が深刻なクロマツを用いることが好ましい。一方、被検植物に接種する病原体としては、糸状菌、細菌、ウィルス、寄生虫が挙げられるが、寄生虫が好ましく、なかでもマツノザイセンチュウが好ましい。したがって、本発明の病害抵抗性評価方法は、マツのマツノザイセンチュウに対する抵抗性評価方法として適用することが最適である。
【００１６】
病原体を被検植物に接種するにあたっては、被検植物の一部を試料として用いる。測定の容易性の観点及び遅延発光による判断の容易性の観点から、本発明においては被検植物の試料は、枝又は葉であることが好ましい。そして、かかる試料に病原体を接種する方法としては、公知の手法がいずれも採用可能である。例えば、試料に被検植物の枝又は葉を用いる場合は、これらの表面を薄く削り、病原体を直接接種するか、病原体を含む溶液中に浸漬させることが好ましい。
【００１７】
第１のステップにおいては被検植物の遅延発光の初期値を測定するために、病原体接種直後の試料を用いる。ここで、「接種直後」とは接種を行って３時間以内（好ましくは１時間以内）をいう。
【００１８】
接種直後の被検植物の試料に照射する光は、キセノンランプ光源等から発せられる白色光や、発光ダイオード光源等から発せられる赤色光、青色光又は緑色光が好ましく、かかる光を、病原体を接種した面に照射して、この面から発生する遅延発光を検出することが好ましい。また、光照射時間は、２〜５秒（キセノンランプ光源の場合、好ましくは３秒；発光ダイオード光源の場合、好ましくは５秒）が好適であり、遅延発光検出時間は０．１〜４秒（キセノンランプ光源の場合、好ましくは３秒；発光ダイオード光源の場合、好ましくは０．１秒）が好適である。
【００１９】
図１に、病害抵抗性の評価に適用され、被検植物から発する遅延発光を測定する病害抵抗性測定装置２を概略的に示す。病害抵抗性測定装置２は、主として、被検植物試料８からの遅延発光を撮像する遅延発光測定装置４、撮像データに適宜の処理を施す制御部６、及び撮像画像等を出力表示する出力部７から構成されている。
【００２０】
遅延発光測定装置４には、外部からの光を遮断できる構造を有した暗箱１０が設けられており、暗箱１０内には、被検植物試料８を設置できる試料設置台３０が設けられている。遅延発光測定装置４は、被検植物試料８に光を照射するための投光系１１を有しており、投光系１１は、光を出射する光源３４、光源３４からの光を遮蔽可能なシャッター３８、及び、光ファイバ３６を介してシャッター３８に接続された２つの光出射部１６を有している。
【００２１】
光出射部１６は、暗箱１０内において試料設置台３０の上方に備えられており、各光出射部１６は光源３４からの光を被検植物試料８に照射する。なお、光源３４と光出射部１６との間に配置されたシャッター３８は、シャッターコントローラ３９の制御によって光源３４からの光を遮蔽可能であり、シャッター３８とシャッターコントローラ３９との協働によって、被検植物試料８に所望の時間の光照射を行える。
【００２２】
光源３４による照射光は、例えば白色光とすることができ、この場合、光源３４にはキセノンランプを用いることができる。また、被検植物試料８の照射位置における強度は０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ²とすることが好ましい。光源３４は、青色発光ダイオード、緑色発光ダイオード又は赤色発光ダイオードとすることもでき、かかる場合は、青色光、緑色光又は赤色光を被検植物試料８の照射位置において、それぞれ０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ²となるように照射することが好ましい。
【００２３】
暗箱１０内の上部には、試料設置台３０側から、フィルタ３３、レンズ３２、イメージインテンシファイア４０、ＣＣＤカメラ４２をこの順に備えるＶＩＭカメラ１２が設置されている。被検植物試料８からの遅延発光は、特定の波長成分のみがフィルタ３３を通過し、通過光はレンズ３２によって集光される。更に、集光された遅延発光はイメージインテンシファイア４０の前段に設けられた光電面で光電変換された後に増倍され、増倍された電子が後段の蛍光面に衝突することで蛍光パターンが形成される。そして、蛍光面に形成された蛍光パターンはＣＣＤカメラ４２によって撮像される。本実施形態におけるＶＩＭカメラ１２は、このような構成を有しているため、極めて微弱な発光であっても検出することが可能となる。
【００２４】
制御部６は、ＶＩＭカメラ１２の電圧を制御するＶＩＭカメラコントローラ５０、ＶＩＭカメラ１２によって得られた画像信号を処理するイメージプロセッサ５２、及び得られた画像データを数量化するデータ解析装置５６を有している。そして、出力部７は、イメージプロセッサ５２により処理された画像データを出力表示する画像出力モニタ５４及び数量化されたデータを出力表示するデータ出力モニタ５８を有している。データ解析装置５６は、ＶＩＭカメラコントローラ５０、イメージプロセッサ５２及び前述のシャッターコントローラ３９に接続され、各々の制御を行うことが可能である。
【００２５】
ＶＩＭカメラ１２によって得られた画像信号は、ＶＩＭカメラコントローラ５０に送られ、ＶＩＭカメラコントローラ５０は、イメージインテンシファイア４０及びＣＣＤカメラ４２の電圧を制御することによりＶＩＭカメラ１２の感度の調節を行う。また、ＶＩＭカメラコントローラ５０は、ＶＩＭカメラ１２の故障を防ぐ働きも同時に有している。すなわち、ＶＩＭカメラ１２は、光量の少ない条件下で遅延発光の検出を行うことから、作動中のノイズ光の進入により故障する恐れがある。そこで、暗箱１０に接続されたＶＩＭカメラコントローラ５０がＶＩＭカメラ１２の作動中における暗箱１０の扉の開閉状態を監視し、扉を開く動作を検知するとＶＩＭカメラ１２の電圧を切断するように構成している。このようにして、ＶＩＭカメラコントローラ５０は、ノイズ光の進入によるＶＩＭカメラ１２の故障を防いでいる。
【００２６】
更に、ＶＩＭカメラコントローラ５０から送られた画像信号は、イメージプロセッサ５２によって画像処理され、画像出力モニタ５４にＣＣＤカメラ４２の撮像画像が表示される。そして、イメージプロセッサ５２によって処理された画像データは、データ解析装置５６によって遅延発光量として数量化され、数量化されたデータはデータ出力モニタ５８に出力される。これにより、オペレータは、被検植物試料８の遅延発光量を視認でき、この遅延発光量に基づいて試料の病害抵抗性の程度を評価することができる。なお、データ解析装置５６は、被検植物試料８からの遅延発光量を算出するだけでなく、他の試料における遅延発光量との比較値を算出してもよく、更に、前記遅延発光量又は前記比較値を所定の基準値と比較することによって、試料が有する病害抵抗性の程度の評価を行ってもよい。
【００２７】
次に、本発明にかかる植物の病害抵抗性評価方法の第２のステップについて説明する。第２のステップでは、病原体を接種した被検植物の試料を、所定条件下で所定時間放置した後、当該被検植物の試料に光を照射し、発生する遅延発光を所定時間検出する。
【００２８】
第２のステップにおいて病原体を接種した試料を放置する条件は、評価の対象となる被検植物の種類又は試料を得る被検植物の部位等によって適宜決定する。例えば、クロマツの枝又は葉を試料として用いる場合は、２４℃の薄暗い室内で放置することが好ましく、放置時間としては、枝の場合は５〜９日（好ましくは、６〜８日、より好ましくは７日）が好適であり、葉の場合は１０〜１４日（好ましくは、１１〜１３日、より好ましくは１２日）が好適である。そして、第１のステップと同様の条件（照射時間、検出時間、照射強度等）で、第１のステップで光を照射した面と同じ面について、遅延発光を測定することが好ましい。
【００２９】
次に、本発明にかかる植物の病害抵抗性評価方法の第３のステップについて説明する。第３のステップにおいては、第１のステップで計測された遅延発光の量（ＤＬ_xとする）と第２のステップで計測された遅延発光の量（ＤＬ_yとする）とを比較して比較値を求めることにより、被検植物の病原体に対する抵抗性あるいは感受性を評価する。
【００３０】
遅延発光量の比較は、例えば、ＤＬ_x及びＤＬ_yの差分、又はＤＬ_x及びＤＬ_yの比を用いることが可能であり、本発明においては、ＤＬ_y／ＤＬ_xを用いることが好ましい。
【００３１】
本発明者らの知見によれば、被検植物は、その種類にしたがって、ＤＬ_y／ＤＬ_xが経時的に大きく変化するものと、ＤＬ_y／ＤＬ_xの経時変化が少ないものとに分かれる。ここで、ＤＬ_y／ＤＬ_xの経時的な変化は、病原体による個体変化に対応すると考えられるから、ＤＬ_y／ＤＬ_xが経時的に変化が少ないものを抵抗性が高い植物、大きく低下するものを病原体に対する抵抗性が低い植物として識別が可能になる。ＤＬ_y／ＤＬ_xに基づいて、病原体に対する抵抗性があるか否かを判定するにあたり、例えば、以下の判断基準が採用可能である。すなわち、各被検植物のＤＬ_y／ＤＬ_xの値を分散分析して、５％水準（より厳密に行う場合は１％水準）で有意な被検植物を選び出す。選び出された被検植物のうちＤＬ_y／ＤＬ_xの値が、全体の平均値より低い値を示す被検植物を選別し、これを病原体に対する抵抗性が低い被検植物とする。かかる基準で有意な被検植物が選び出せない場合は、第２のステップで放置する時間を、分散分析で有意な値が出るまで延長すればよい。
【００３２】
例えば、被検植物としてクロマツを用い、病原体としてマツノザイセンチュウを用いた場合は、試料が枝である場合は病原体接種後７日程度で、試料が葉である場合は病原体接種後１２日程度で、マツノザイセンチュウに対する抵抗力が低いクロマツについてＤＬ_y／ＤＬ_xの値が顕著に低下する。そして、ＤＬ_y／ＤＬ_xの値の低下とクロマツの枯れや褐変には、高い相関関係が認められる。したがって、ＤＬ_y／ＤＬ_xの値の変化を７日又は１２日という短期間評価することにより、病原体に対する抵抗性（又は感受性）を高い精度で評価することが可能になる。したがって、被検植物そのものを屋外に配置して評価をする従来の方法に比べて、評価期間が圧倒的に短くなるのみならず、評価の客観性も向上し、必要な労力も最低限にすることができる。
【００３３】
次に、本発明にかかる植物の増殖方法の実施の形態について、ステップ毎に説明する。先ず、第１のステップにおいては、被検植物として２以上の被検植物を準備する。ここで、被検植物は同一種の植物から選択することが好ましい。例えば、病原体に対する抵抗性を備えたクロマツについて増殖を行う場合には、被検植物としてクロマツのみを用いることが好ましい。なお、第１のステップでは、上述した病害抵抗性評価方法において用いることの可能な上記病害抵抗性測定装置２と同一の装置を用いて遅延発光を検出でき、好適な光の種類、被検植物及び病原体も上述した病害抵抗性評価方法におけるのと同様である。
【００３４】
第２のステップは、上述した病害抵抗性評価方法の第２のステップと同様に実施ができ、第３のステップにおいても、上記と同様にして、第２のステップで所定時間検出した遅延発光の量を、第１のステップで所定時間検出した遅延発光の量で除した値を求める。
【００３５】
第４のステップにおいては、第３のステップで得られた値の分散分析を行って、病原体に対する抵抗性を有する被検植物を選別する。この場合も、上記と同様の判断基準が採用できる。すなわち、各被検植物のＤＬ_y／ＤＬ_xの値を分散分析して、例えば、５％水準（より厳密に行う場合は１％水準）で有意な被検植物を選び出す。選び出された被検植物のうちＤＬ_y／ＤＬ_xの値が、全体の平均値より低い値を示す被検植物を選別し、これを病原体に対する抵抗性が低い被検植物とする。かかる基準で有意な被検植物が選び出せない場合は、第２のステップで放置する時間を、分散分析で有意な値が出るまで延長すればよい。
【００３６】
第５のステップにおいては、第４のステップで選別された被検植物を有性繁殖又は無性繁殖させて、病原体に対する抵抗性を有する植物を得る。ここで、有性繁殖としては、交配が挙げられ、無性繁殖としては株分け、さし木、接木、組織培養、遺伝子操作等が挙げられる。第５のステップを実施することにより、病害に対する抵抗性に優れた次世代の植物個体等を生産・育苗することが可能になる。また、必要に応じてこれら次世代の植物等を本発明の病害抵抗性評価方法で評価し、より確実に病害抵抗性に優れる個体を生産・育苗することが可能になる。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
［評価に用いるマツの選抜］
本発明の病害抵抗性評価方法が、病原体に対する植物の抵抗性又は感受性の評価のために適用可能かを調べるためには、もともと、病原体に対する抵抗性が高い被検植物と、病原体に対する抵抗性が低い被検植物を用いて、結果を比較する必要がある。したがって、先ず、病原体に対する抵抗性が高い被検植物と低い被検植物を選抜する試験を以下のようにして実施した。
【００３９】
先ず、西南日本のマツ枯れ激害地から選抜されたマツノザイセンチュウに対して抵抗性を持つとされるクロマツ（クローン）の当年枝を試験管内に水挿しした。用いたクロマツは、「津屋崎５０」、「土佐清水６３」、「三崎９０」、「波方７３」、「志摩６４」、「三豊１０３」、「大瀬戸１２」、「波方３７」、「頴娃４２５」、「田辺５４」、「吉田２」、「夜須３７」及び「川内２９０」の１３個体であった。これらのクロマツにセンチュウ５０００頭を接種し、表１の判定基準に従い枯れの程度を調査した。
【表１】

【００４０】
その結果、表２に示すように、クロマツ１３個体（クローン）の間で、枯れの程度に大きな差が認められた。１回目と２回目の試験で枯れの程度が同程度に現れる個体の中で、「津屋崎５０」、「土佐清水６３」、「三崎９０」などは枯れの程度が軽く、病原体であるセンチュウに対する抵抗性が高いと考えられ、また、「川内２９０」、「夜須３７」、「吉田２」などは枯れの程度が大きく、供試した１３個体の中では抵抗性が低いことが判明した。
【表２】

【００４１】
［病害抵抗性の評価（枝を試料に用いる方法）］
クロマツ個体（クローン）「津屋崎５０」、「三崎９０」、「川内２９０」及び「夜須３７」の当年枝を２つに分割し、針葉のついた上部を試験管内に水挿しし、マツノザイセンチュウを５０００頭接種した後、枯れの程度を表１の基準に基づいて調べた。
【００４２】
下部の切片については表面を削り、マツノザイセンチュウを２５００頭接種し、接種直後（接種６０分以内）に、図１に示す病害抵抗性測定装置と同様の構成を有する浜松ホトニクス社製ＡＲＧＵＳ５０／ＶＩＭシステムを用いて、３秒間の白色光を照射後、遅延発光（Delayed Luminescence : DL）を３秒間測定した（得られた遅延発光の積算値をＤＬ₀とする。）。次いで、この試料を２４℃の薄暗い室内で７日間放置した。そして放置期間の毎日、すなわち、接種１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後及び７日後の遅延発光を上記と同様にして測定した（得られた遅延発光の積算値を、それぞれ、ＤＬ₁、ＤＬ₂、ＤＬ₃、ＤＬ₄、ＤＬ₅、ＤＬ₆及びＤＬ₇とする。）。そして、ＤＬ₁／ＤＬ₀、ＤＬ₂／ＤＬ₀、ＤＬ₃／ＤＬ₀、ＤＬ₄／ＤＬ₀、ＤＬ₅／ＤＬ₀、ＤＬ₆／ＤＬ₀、及びＤＬ₇／ＤＬ₀の値を比較値として求めた。かかる比較値を図２に示す。なお、図２においては、例えば「津屋崎５０」が２つ表されているが、これは母樹「津屋崎５０」の２ヶ所の枝についての結果を示すものである。また、図２にはそれぞれの個体について、枯れの程度が記載されているが、これは、試験管内に水挿しした上記当年枝の枯れの程度を表１の基準で評価したものである。
【００４３】
上記試験の対照試験として、２つに分割した「津屋崎５０」、「三崎９０」及び「川内２９０」、「夜須３７」の当年枝の下部の切片に、マツノザイセンチュウを接種せずに、蒸留水を処理した後、上記と同様にして遅延発光を測定した（得られた遅延発光の積算値をＤＬ’₀とする。）。そして、試験開始１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後及び７日後の遅延発光を上記と同様にして測定した（得られた遅延発光の積算値を、それぞれ、ＤＬ’₁、ＤＬ’₂、ＤＬ’₃、ＤＬ’₄、ＤＬ’₅、ＤＬ’₆及びＤＬ’₇とする。）。そして、ＤＬ’₁／ＤＬ’₀、ＤＬ’₂／ＤＬ’₀、ＤＬ’₃／ＤＬ’₀、ＤＬ’₄／ＤＬ’₀、ＤＬ’₅／ＤＬ’₀、ＤＬ’₆／ＤＬ’₀、及びＤＬ’₇／ＤＬ’₀の値を比較値として求めた。かかる比較値を図３に示す。なお、図３においては、例えば「津屋崎５０」が２つ表されているが、これは母樹「津屋崎５０」の２ヶ所の枝についての結果を示すものである。
【００４４】
図３に示されるように、枯れの程度が大きく異なる試料であるにもかかわらず、蒸留水処理のみでは、ＤＬ値の比（ＤＬ値／処理直後のＤＬ値）は、供試個体（クローン）の間で経時的に大きな違いは認められなかった。
【００４５】
これに対し、マツノザイセンチュウを接種した試料については、ＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）は日数の経過とともに個体間の差が大きくなり、分散分析の結果、接種から７日後に１％水準で個体間に有意差が認められた（図２）。また、マツノザイセンチュウ接種試験で枯れの程度が大きいものほどＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）が小さくなる傾向にあり、接種から７日後の遅延発光の比と枯れの程度との相関係数はr=−0.837*であった。
【００４６】
これらの結果から、マツノザイセンチュウに対して抵抗性を持つ個体と感受性の個体を、当年枝切片の遅延発光を測定することにより識別が可能であることがわかった。特に、ＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）があまり変化しない個体が存在し、これらは病害抵抗性が高い個体であることがわかった。一方、ＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）が大きく低下する個体が存在し、これらは病害抵抗性が低い個体であることがわかった。
【００４７】
マツノザイセンチュウ接種試験による枯れの程度と、マツノザイセンチュウ接種７日後の、ＤＬ値の比（初期値に対する遅延発光の比）をまとめて表３に示した。
【表３】

【００４８】
なお、病害抵抗性（枝）の評価において、遅延発光の波長は650nm〜800nmの範囲にあり、特に680nm〜700nmと730nm前後にピークが認められた。
【００４９】
［病害抵抗性の評価（葉を試料に用いる方法）］
「津屋崎５０」、「三崎９０」、「川内２９０」、「夜須３７」、「波方７３ａ」及び「吉田２ａ」の当年枝を試験管内に水挿しし、マツノザイセンチュウ５０００頭を接種した後の枯れの程度を表１の基準に基づいて調べた。なお、本発明において「津屋崎５０」のように地名の後に数字を付した個体名は、接木により得られたクローンを示し、「波方７３ａ」のように末尾にａを付した個体名は、接木により得られたクローンである「波方７３」から得られた種子を育成して得られた個体を意味する。
【００５０】
一方、「津屋崎５０」、「三崎９０」、「川内２９０」、「夜須３７」、「波方７３ａ」及び「吉田２ａ」の当年枝から採取した針葉を３ｃｍの長さに切断し、１０００００頭／３ｍＬのマツノザイセンチュウ懸濁液に２０時間浸漬した。浸漬直後（浸漬後６０分以内）に、１個体につき１２本の針葉をシャーレに並べて、浜松ホトニクス社製ＡＲＧＵＳ５０／ＶＩＭシステムを用いて、３秒間の白色光を照射後、遅延発光を３秒間測定した（得られた遅延発光の積算値をＤＬ₁₀とする。）。
【００５１】
次いで、この試料を２４℃の薄暗い室内で１２日間放置した。そして、接種４日後、６日後、８日後、１０日後及び１２日後の遅延発光を上記と同様にして測定した（得られた遅延発光の積算値を、それぞれ、ＤＬ₁₁、ＤＬ₁₂、ＤＬ₁₃、ＤＬ₁₄及びＤＬ₁₅とする。）。そして、ＤＬ₁₁／ＤＬ₁₀、ＤＬ₁₂／ＤＬ₁₀、ＤＬ₁₃／ＤＬ₁₀、ＤＬ₁₄／ＤＬ₁₀、及びＤＬ₁₅／ＤＬ₁₀の値を比較値として求めた。かかる比較値を図４に示す。
【００５２】
上記試験の対照試験として、「津屋崎５０」、「三崎９０」、「川内２９０」、「夜須３７」、「波方７３ａ」及び「吉田２ａ」の当年枝について、蒸留水に浸漬した後に上記と同様にして遅延発光を測定した（得られた遅延発光の積算値をＤＬ’₁₀とする。）。そして、試験開始４日後、６日後、８日後、１０日後及び１２日後の遅延発光を上記と同様にして測定した（得られた遅延発光の積算値を、それぞれ、ＤＬ’₁₁、ＤＬ’₁₂、ＤＬ’₁₃、ＤＬ’₁₄及びＤＬ’₁₅とする。）。そして、ＤＬ’₁₁／ＤＬ’₁₀、ＤＬ’₁₂／ＤＬ’₁₀、ＤＬ’₁₃／ＤＬ’₁₀、ＤＬ’₁₄／ＤＬ’₁₀、及びＤＬ’₁₅／ＤＬ’₁₀の値を比較値として求めた。かかる比較値を図５に示す。
【００５３】
図５に示されるように、蒸留水処理のみでは、ＤＬ値の比（ＤＬ値／処理直後のＤＬ値）は、供試個体（クローン）の間で経時的に大きな違いは認められなかったが、マツノザイセンチュウを接種した試料については、ＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）は日数の経過とともに個体間の差が大きくなり（図４）、分散分析の結果、接種から１２日後では１％水準で個体間に有意差が認められ、遅延発光の比と枯れの程度との相関係数はr=−0.730であった。
【００５４】
これらの結果から、マツノザイセンチュウ病に対して抵抗性を持つ個体と感受性の個体を、針葉の遅延発光を測定することにより識別が可能であることがわかった。
【００５５】
［枝の褐変の程度と遅延発光との関係］
上記「病害抵抗性の評価（枝を試料に用いる方法）」において、接種１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後及び７日後に、ＤＬ₁／ＤＬ₀、ＤＬ₂／ＤＬ₀、ＤＬ₃／ＤＬ₀、ＤＬ₄／ＤＬ₀、ＤＬ₅／ＤＬ₀、ＤＬ₆／ＤＬ₀、及びＤＬ₇／ＤＬ₀の値を求めると共に、接種１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後及び７日後における褐変の程度を、以下の表４に基づいて評価した。そして、ＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）と褐変の程度との関係を評価した。
【表４】

【００５６】
その結果、マツノザイセンチュウ接種から７日後におけるＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）と褐変の程度との相関係数はr=−0.956**であった。したがって、接種７日後のＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）を用いることにより、枝の褐変の程度を評価可能であることがわかった。
【００５７】
［針葉の褐変の程度と遅延発光との関係］
上記「病害抵抗性の評価（葉を試料に用いる方法）」において、接種４日後、６日後、８日後、１０日後及び１２日後に、ＤＬ₁₁／ＤＬ₁₀、ＤＬ₁₂／ＤＬ₁₀、ＤＬ₁₃／ＤＬ₁₀、ＤＬ₁₄／ＤＬ₁₀及びＤＬ₁₅／ＤＬ₁₀の値を求めると共に、接種４日後、６日後、８日後、１０日後及び１２日後における褐変の程度を、上記表４に基づいて評価した。そして、ＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）と褐変の程度との関係を検討した。
【００５８】
その結果、マツノザイセンチュウ接種から１２日後におけるＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）と褐変の程度との相関係数はr=−0.876*であった。したがって、接種１２日後のＤＬ値の比（ＤＬ値／接種直後のＤＬ値）を用いることにより、針葉の褐変の程度を評価可能であることがわかった。
【００５９】
［植物の病害抵抗性評価方法における照射光の影響］
「津屋崎５０」、「三崎９０」、「川内２９０」及び「夜須３７」の当年枝を試験管内に水挿しし、マツノザイセンチュウ５０００頭を接種した後の枯れの程度を表１の基準に基づいて調べた。
【００６０】
一方、「津屋崎５０」、「三崎９０」、「川内２９０」、「夜須３７」の当年枝から採取した針葉を３ｃｍの長さに切断し、表面を薄く削り取った後に、１０００００頭／３ｍＬのマツノザイセンチュウ懸濁液に２０時間浸漬した。１個体につき１０本の針葉をシャーレに並べて、２４℃の薄暗い室内で６日間放置した。
【００６１】
次いで、この試料を浜松ホトニクス社製ＡＲＧＵＳ５０／ＶＩＭシステムを用いて、発光ダイオードから発する青色光（中心波長４７０ｎｍ）、緑色光（中心波長５５０ｎｍ）又は赤色光（中心波長６５０ｎｍ）をそれぞれ５秒間照射後、遅延発光を０．１秒間測定した（青色光、緑色光及び赤色光により得られた遅延発光の積算値を、それぞれＤＬ_b6、ＤＬ_g6及びＤＬ_r6とする。）。それぞれの光によるＤＬ値を図６に示す。また、接種６日後の枯れの程度を表１の基準で求めた。
【００６２】
そして、ＤＬ値と枯れの程度との相関を、青色光、緑色光又は赤色光それぞれについて求めたところ、相関係数は赤色光でr=−0.686、青色光でr=−0.610、緑色光でr=−0.084であった。この結果から、葉を用いてマツノザイセンチュウに対する抵抗性を評価するにあたっては、照射光として、赤色光及び青色光が特に有効であることが判明した。
【００６３】
さらに、赤色光によるＤＬ値／緑色光によるＤＬ値、青色光によるＤＬ値／緑色光によるＤＬ値と枯れの程度との相関を求めたところ、相関係数は赤色光によるＤＬ値／緑色光によるＤＬ値でr=−0.709*、青色光によるＤＬ値／緑色光によるＤＬ値でr=−0.670であった（図７）。この結果から、葉を用いてマツノザイセンチュウに対する抵抗性を評価するにあたっては、照射光として、赤色光、青色光及び緑色光が有効であり、これらの光によるＤＬ値をそれぞれ組み合わせることによって評価の精度がさらに高まることが判明した。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、病原体に対して抵抗性（又は感受性）のある植物を、重労働を必要とせずに短期間に高い精度で評価する植物の病害抵抗性評価方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いることのできる病害抵抗性測定装置の概略図である。
【図２】マツノザイセンチュウを接種したクロマツ（枝）の遅延発光量の比の経時変化を示す図である。
【図３】対照として蒸留水処理したクロマツ（枝）の遅延発光量の比の経時変化を示す図である。
【図４】マツノザイセンチュウを接種したクロマツ（針葉）の遅延発光量の比の経時変化を示す図である。
【図５】対照として蒸留水処理したクロマツ（針葉）の遅延発光量の比の経時変化を示す図である。
【図６】照射光の種類の違いによる遅延発光量を示す図である。
【図７】赤色光又は青色光の照射によるＤＬ値を緑色光の照射によるＤＬ値で除した場合の比を示す図である。
【符号の説明】
２・・・病害抵抗性測定装置、４・・・遅延発光測定装置、６・・・制御部、７・・・出力部、８・・・被検植物試料、１０・・・暗箱、１１・・・投光系、１２・・・ＶＩＭカメラ、１６・・・光出射部、３０・・・試料設置台、３２・・・レンズ、３３・・・フィルタ、３４・・・光源、３６・・・光ファイバ、３８・・・シャッター、３９・・・シャッターコントローラ、４０・・・イメージインテンシファイア、４２・・・ＣＣＤカメラ、５０・・・ＶＩＭカメラコントローラ、５２・・・イメージプロセッサ、５４・・・画像出力モニタ、５６・・・データ解析装置、５８・・・データ出力モニタ

Claims

病原体に対する被検植物の抵抗性あるいは感受性を評価する植物の病害抵抗性評価方法において、
前記被検植物の試料に前記病原体を接種し、接種直後の当該被検植物の試料に光を照射して、発生する遅延発光を所定時間検出する第１のステップと、
前記病原体を接種した前記被検植物の試料を、所定条件下で所定時間放置した後、当該被検植物の試料に前記光を照射し、発生する遅延発光を所定時間検出する第２のステップと、
前記第１及び第２のステップでそれぞれ計測された前記遅延発光の量を比較して比較値を求めることにより、前記被検植物の前記病原体に対する抵抗性あるいは感受性を評価する第３のステップと、を備えることを特徴とする植物の病害抵抗性評価方法。
前記比較値は、前記第２のステップで前記所定時間検出した前記遅延発光の量を、前記第１のステップで前記所定時間検出した前記遅延発光の量で除した値であることを特徴とする請求項１記載の植物の病害抵抗性評価方法。
前記光は、白色光、赤色光、青色光又は緑色光であることを特徴とする請求項１又は２記載の植物の病害抵抗性評価方法。
前記被検植物の試料は、前記被検植物の枝又は葉であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物の病害抵抗性評価方法。
２以上の被検植物の試料のそれぞれに病原体を接種し、接種直後の当該被検植物の試料に光を照射して、発生する遅延発光をそれぞれ所定時間検出する第１のステップと、
前記病原体を接種した前記被検植物の試料を、所定条件下で所定時間放置した後、当該被検植物の試料のそれぞれに前記光を照射し、発生する遅延発光をそれぞれ所定時間検出する第２のステップと、
それぞれの被検植物の試料について、前記第２のステップで前記所定時間検出した前記遅延発光の量を、前記第１のステップで前記所定時間検出した前記遅延発光の量で除した値を求める第３のステップと、
前記値の平均値より低い値を示す被検植物であって、前記値の分散分析により有意な値を示す被検植物を、前記２以上の被検植物から排除して、前記病原体に対する抵抗性を有する被検植物のみを選別する第４のステップと、
前記第４のステップで選別された被検植物を有性繁殖又は無性繁殖させて、病原体に対する抵抗性を有する植物を得る第５のステップと、を備えることを特徴とする植物の増殖方法。