DE19718640A1 - Anwendung eines orange-fluoreszierenden Proteins und weiterer farbiger Proteine und der zugehörigen Gene aus der Artengruppe Anemonia sp. (sulcata) Pennant, (Cnidaria, Anthozoa, Actinaria) in Gentechnologie und Molekularbiologie - Google Patents

Anwendung eines orange-fluoreszierenden Proteins und weiterer farbiger Proteine und der zugehörigen Gene aus der Artengruppe Anemonia sp. (sulcata) Pennant, (Cnidaria, Anthozoa, Actinaria) in Gentechnologie und Molekularbiologie

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Description

Anwendungsgebiet
Die Erfindung betrifft Protein und die zugehörigen DNA-Sequenzen entsprechend den Anspruch 1-7. Das Anwendungsgebiet entspricht dem des grün-fluoreszierenden Proteins (vgl. US-Patent 5491084, 1996). Hauptanwendung ist der Simultaneinsatz von grün- und orange-fluoreszierenden Proteinen.
Stand der Technik Anwendung des grün-fluoreszieren den Proteins (GFP) aus Aequorea Victoria (Nach CLONTECH, 1996; vgl. auch CHALFIE et al., US-Patent 5491084, 1996
Das grün-fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria wird als revolutionäres Reportermolekül gehandelt, da es aufgrund seiner Fluoreszenz-Eigenschaften ohne zusätzliche Co-Faktoren oder Substrate nur durch Bestrahlung mit UV- oder blauem Licht sichtbar gemacht werden kann. Dadurch werden Studien an lebenden Zellen möglich. Gereinigtes GFP ist ein 27-kDa-Monomer bestehend aus 238 Aminosäuren. Die Fluoreszenz ist stabil und Spezies-unabhängig. Verwendet wird GFP und die codierende DNA wie folgt:
Zur Herstellung von Fusionsproteinen als Marker von Genexpression, Genaktivität und Proteinlokalisation in vivo, in situ und in Echtzeit (CHALFIE et al., 1994; PRASHER et al.; 1992; INOUE & TSUJI, 1994; WANG & HAZELRIGHT, 1994).
Zum Studium von Zellinien (CHALFIE et al., 1994).
Als Eichsubstanz für Spektrometer und FACS-Geräte (Fluorescence-Activatet-Cell-Sorter) (CLONTECH, 1996).
Für Mikroinjektionen in Zellen und Gewebe (CLONTECH, 1996).
Markierung lebender Organismen (z. B. Identifikation genmanipulierter Tiere) (PRASHER, 1995).
Weitere Anwendungen
GFP findet weitere Verwendung in physiologischen Studien als "Wellenlängentransformator" im Zusammenhang mit der Calcium-aktivierten Bioluminszenz (A. TREWAVAS zitiert von G. SEIFERT in "Die Zeit" vom 17.10.1996)
Protein Engineering (nach STEIPE & SKERRA, 1997)
Durch Mutagenese des Wildtyp-GFPs wurden Mutanten mit sechsfach stärkerer Fluoreszenz erzeugt (S65T), sowie Mutanten die eine rot verschobene Anregung zeigen, wodurch eine simultane Analyse zum Beispiel zweier verschiedener Promotoren in einer Zelle möglich geworden ist (CUBITT et al., 1995; HEIM et al., 1995; DELAGRAVE et al., 1995)
Stabilitätseigenschaften des grün- fluoreszieren den Proteins (Nach STEIPE & SKERRA, 1997)
Die Fluoreszenz des GFP ist erstaunlich tolerant gegenüber Hitze (bis 65°C), Alkalien (pH 11), Detergenzien (1% SDS), Guanidiniumchlorid (6M), Fixierung mit Formaldehyd sowie vielen Proteasen, und es zeigt im Fluoreszenzmikroskop praktisch keinen Photobleicheffekt (CHALFIE et al., 1994; WANG & HAZELRIGHT, 1994). Diese Stabilität erklärt sich aus der Lage der fluorophoren Gruppe im Inneren des tonnenartigen Moleküls (β-Can) (Yang et al., 1996).
Bedeutung in der Literatur (Nach STEIPE & SKERRA, 1997)
Schon ein Jahr nachdem CHALFIE et al. (1994) die Eignung von GFP als biologische Sonde zum Studium der Genexpression und der Proteinlokalisation in lebenden Zellen demonstrierten, wurden in einem Übersichtsartikel 36 experimentelle Anwendungen genannt (CUBITT et al., 1995).
Mehrere Veröffentlichungen in nahmhaften Zeitschriften wie "Nature" und "Science" u. a.
Ein komplettes Sonderheft der Zeitschrift "Gene" zum Thema GFP (Special Issue: Fluorescent Proteins and Applications, Gene 173, 1996).
Mehr als 100 Zitate bei einer aktuellen "Medline"-Suche im Internet.
Desweiteren:
Populärwissenschaftliche Artikel (G. SEIFERT in "Die Zeit" vom 17. 10. 1996)
Wirtschaftliche Bedeutung
GFP und eine Vielzahl assozierter Produkte werden von der Firma Clontech unter Lizenz der Columbia Universität weltweit vertrieben. Clontech
ITC Biotechnologie GmbH
Postfach 103026
Tel.: 06221/303907
Fax.: 06221/303511
Heidelberg
e-mail. tech@itc-biotech.com
Columbia Innovation Enterprise
Columbia University
Engineering Terrace 363
New York, NY 10027
US-Patent 5491084, 1996
Nachteile des Stands der Technik Schwierigkeiten beim Paralleleinsatz verschiedener GFP-Varianten
Aufgrund der nahe beieinander liegenden Emissions- und Anregungsspektren ist ein Paralleleinsatz der verschiedenen GFP-Varianten in der Praxis (vgl. 4.1) schwierig.
Molekülgröße
GFP ist mit einem Molekulargewicht von 27000 Da ein relativ großes Protein. Bei der Untersuchung der Proteinlokalisation durch GFP-Fusionsproteine ist, vor allem bei kleinen Proteinen, mit einer Verfälschung der Ergebnisse durch das große Markerprotein zu rechnen.
Anregungsspektrum
GFP wird durch UV- und blaues Licht angeregt. In der Praxis wird meistens UV-Licht verwendet. Das energiereiche kurzwellige Licht ist stark zell- und DNA-schädigend. Dies stellt einen bedeutenden Nachteil für einen Stoff dar, der hauptsächlich für Untersuchungen in lebenden Zellen verwendet wird.
Aufgaben der Erfindung Bezogen auf das orange-fluoreszierende Protein
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein fluoreszierendes Protein zur Verfügung zu stellen, das den bekannten GFP-Varianten hinsichtlich Stabilität und Anwendbarkeit ebenbürtig ist.
Es soll durch ein deutlich anderes Fluoreszenzspektrum auf verschiedenen Wegen einfach von den GFP-Varianten unterscheidbar sein und so einen Paralleleinsatz der verschiedenen Proteine möglich machen.
Es soll eine geringere Molekülgröße als die GFP-Varianten besitzen.
Es soll in einem Wellenlängenbereich anregbar sein, der Schädigungen von lebenden Zellen und DNA ausschließt.
Bezogen auf die GFP-Varianten
Die Aufgabe der Erfindung ist es, fluoreszierende Proteine zur Verfügung zu stellen, die den bekannten GFP-Varianten hinsichtlich Stabilität und Anwendbarkeit ebenbürtig sind.
Sie sollen durch ein anderes Fluoreszenzspektrum von den bekannten GFP-Varianten unterscheidbar sein und so einen Paralleleinsatz der verschiedenen Proteine möglich machen.
Sie sollen über ihren Aufbau zum Verständnis der Photophysik fluoreszierender Proteine beitragen.
Bezogen auf das rote Protein der Tentakelspitzen
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Protein zur Verfügung zu stellen, die den bekannten GFP-Varianten hinsichtlich Stabilität ebenbürtig ist.
Es soll über seinen Aufbau zum Verständnis der Photophysik fluoreszierender Proteine beitragen.
Es soll als Leitstruktur für die Herstellung eines rot-fluoreszierenden Proteins dienen.
Lösung der Aufgaben Bezogen auf das orange-fluoreszierende Protein
Diese Aufgaben werden durch das orange-fluoreszierende Protein aus der Tentakelunterseite von Anemonia sulcata PENNANT (var. rufescens) (Cnidaria; Anthozoa) gelöst. (vgl. Anspruch 1-7)
Bezogen auf die GFP-Varianten
Diese Aufgaben werden durch die grün-fluoreszierenden Proteine aus Tentakeln von Anemonia sulcata PENNANT (var. smaragdina, var. viridis und var. rufescens) (Cnidaria; Anthozoa) gelöst. (vgl. Anspruch 1-7)
Bezogen auf das rote Protein der Tentakelspitzen
Diese Aufgaben werden durch das rote Protein aus den Tentakelspitzen von Anemonia sulcata PENNANT (var. rosea, var. smaragdina, var. viridis und var. rufescens) (Cnidaria; Anthozoa) gelöst. (vgl. Anspruch 1-7)
Vorteile der Erfindung Bezogen auf das orange-fluoreszierende Protein
Vorteile erwachsen aus der guten Eignung für einen Paralleleinsatzes der fluoreszierenden Proteine. Im Gegensatz zu bekannten Methoden kann auf gut dokumentierbare Weise die Expression und Aktivität verschiedener Gene gleichzeitig untersucht werden. Dies gilt in selben Maße für Studien von Proteinlokalisation. Durch diesen Paralleleinsatz wird das Studiengebiet drastisch erweitert und bisher nicht mögliche Untersuchungen werden machbar.
Aufgrund seines Anregungsspektrums ist das orange-fluoreszierende Protein ebenso wie das grün-fluoreszierende Protein in Kombination mit der Calcium-aktivierten Biolumineszenz in physiologischen Untersuchungen anwendbar. Vorteile erwachsen wiederum aus der Möglichkeit des Paralleleinsatzes der beiden Proteine.
Die geringere Molekülgröße von GFP ist bei der Herstellung von Fusionsproteinen von Vorteil, da das Fusionsprotein in der Größe dem zu untersuchenden Protein eher entspricht als beim Einsatz von GFP als Markerprotein.
Die erweiterten Möglichen im Vergleich verschiedener Zellinien, die der Paralleleinsatz von GFP und GFP bietet, lassen auf Fortschritte im Bereich der Tumorforschung hoffen.
Die Proteine können aufgrund ihrer deutlich unterschiedlichen Anregungsspektren gleichzeitig oder einzeln sichtbar gemacht werden. Eine getrennte visuelle Detektion der beiden Proteine bei gemeinsamer Anregung ist auch durch den Einsatz von Farbfiltern möglich, deren Transmissionsbereich mit dem jeweiligen Protein-Emissions-Spektrum übereinstimmt.
Eine weiterer Vorteil ist die höhere Thermostabilität von OFP. Sie bietet eine weitere Möglichkeit einer getrennte Detektion von OFP und GFP durch eine definierte Hitzeeinwirkung, über die Fluoreszenz von GFP aus geschaltet werden kann während die OFP-Fluoreszenz bestehen bleibt. Darüberhinaus sind weitere Vorteile zu vermuten, z. B. bei Studien der Genregulation im Zusammenhang mit Hitzeschock-Promotoren.
Das orange-fluoreszierenden Protein bietet Vorteile gegenüber dem grün-fluoreszierenden Protein, da es durch grünes Licht anregbar ist. Eine Bestrahlung mit Zell- und DNA- schädigendem kurzwelligem Licht wie bei Verwendung von GFP wird überflüssig. Dies ist zum Beispiel beim Einsatz in Zellkulturen von entscheidendem Vorteil.
Bezogen auf die GFP-Varianten
Die neuen GFP-Varianten bieten im Gegensatz zu den bekannten Varianten nicht die Vorteile des orange-fluoreszierenden Proteins, ein Simultaneinsatz mit den damit verbundenen Vorteilen ist dennoch denkbar. Darüberhinaus kann eine Aufklärung ihrer Struktur zum Verständnis der Photophysik der fluoreszierenden Proteine beitragen und ein gezieltes Protein-Engineering ermöglichen.
Bezogen auf das rote Protein der Tentakelspitzen
Die Farbstabilität des roten Proteins deutet darauf hin, daß es ähnlich aufgebaut ist wie die fluoreszierenden Proteine. Eine gentechnisch erzeugte rot-fluoreszierende Variante ist deshalb denkbar. Diese könnte ähnlich vorteilhaft sein wie das orange-fluoreszierende Protein. Daneben verspricht eine Strukturanalyse einen bedeutenden Erkenntnisgewinn bezüglich der Photophysik der fluoreszierenden Proteine.
Beschreibung der Erfindung Erfindungshöhe
Beweisanzeichen für die erfinderische Tätigkeit sind die dringende Nachfrage nach solchen Stoffen, sowie die Überwindung von vergeblichen Bemühungen der Fachwelt einen entsprechenden Stoff herzustellen oder zu finden.
Die Erfindung fand während einer unbezahlten Diplomarbeit statt, die 1995/96 in der Abt. Ökologie/Morphologie der Tiere (Bio. III) der Universität Ulm angefertigt wurde. Arbeiten zur weitergehenden Charakterisierung des Moleküls wurden im Rahmen der Dissertation in der Abteilung Allgemeine Zoologie (Bio. I) der Universität Ulm durchgeführt.
Neuheit der Erfindung
In einem zusammenfassenden Artikel von G. SEIFERT über die Anwendung von GFP in "Die Zeit" vom 17.10.1996 wurde nur die Hoffnung geäußert, in Zukunft durch gentechnische Veränderung des GFP orange- oder rot-fluoreszierende Varianten zu erhalten.
Bei einer Internet-Recherche konnten nur Veröffentlichungen zum Thema "GFP" gefunden.
Fachleute der Universität Heidelberg, die mit GFP arbeiten, wußten nichts von der Existenz orange-fluoreszierender Proteine.
In meiner Diplomarbeit wird nur von der Entdeckung der farbigen Proteine berichtet, nicht aber von der technischen Anwendbarkeit.
Funktionsnachweis der Erfindung
Ein sicherer Funktionsnachweis kann noch nicht erbracht werden, da hierzu die für die Proteine codierende DNA vorliegen müßte. Eine Isolierung entsprechender Gene ist Gegenstand der derzeitigen Arbeit. Jedoch führt die Expression im Organismus und die abgebildete elektrophoretische Trennung in eindrucksvoller Weise die Eignung der Farbstoffe für die genannten Anwendungsgebiete vor Augen (vgl. Abb. 13-17). Aufgrund der Ähnlichkeit zwischen dem bereits in Anwendung befindlichen GFP und dem neuen Farbstoff OFP bezüglich Herkunft, Stabilität und Größe der Moleküle sind keine größeren Schwierigkeiten beim Einsatz zu erwarten.
Methoden Herstellung von Rohextrakten Methode 1
Für die Untersuchung der Fluoreszenz-Eigenschaften wurden komplette Tentakel mit allen enthaltenen Farbstoffen in Puffer (6,25 mM Tris/HCl; pH7,5; 10% Glycerin) durch Ultraschall homogenisiert. Anschließend wurden die Zellfragmente abzentrifugiert (15000 g; 4°C; 20 min) und der Überstand weiterverarbeitet.
Methode 2
Für Untersuchungen der Fluoreszenzstabilität wurde Gewebe in Anlehnung an Methode 1 in Puffer (6,25 mM Tris/HCl) aufgearbeitet.
Methode 3
Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde das Gewebe in Anlehnung an Methode 1 in reduzierendem Probenpuffer (6,25 mM Tris/HCl; pH6,8; 10% Glycerin; 1% SDS; 200 mM Mercapto-Ethanol) aufgearbeitet.
Untersuchung der Fluoreszenz-Eigenschaften Methode 4
Nach Methode 1 gewonnener Rohextrakt wurde im Fluoreszenz-Spektrometer untersucht.
Methode 5
Nach Methode 1 gewonnener Rohextrakt wurde im nativen Acrylamidgel (4%; pH6,8) aufgetrennt. Eine Erneuerung des Elektrodenpuffers (25 mM Tris/HCl, pH 6,8) erfolgte im Abstand von 30 min. Die fluoreszierenden Gelbanden wurden unter UV-Licht (366 nm) ausgeschnitten und in H2O-bidest überführt um die Farbstoffe aus dem Gel zu lösen (20h; 4°C). Nach dem Abzetrifugieren der Gelreste wurde der Überstand im Fluoreszenz- Spektrometer untersucht.
Untersuchung der Stabilität
Nach Methode 2 gewonnener Rohextrakt wurde in Aliquote aufgeteilt. Diese wurden nach Methode 6-12 behandelt und anschließend im Fluoreszenz-Spektrometer untersucht. Da das rote Protein der Tentakelspitzen keine Fluoreszenz zeigt, wurde der Erhalt der roten Farbe als Kriterium der Stabilität gewählt.
Methode 6 Thermostabilität
  • 1.2 ml Aliquote wurden in 2,5 ml Eppendorf-Gefäßen im vorgewärmten Thermoblock erhitzt. (65°C/5 min; 80°C/5 min; 95°C/2,5 min)
Methode 7 Stabilität gegenüber Detergenzien
Die Proben wurden mit SDS versetzt (Endkonzentration 1%).
Methode 8 Stabilität gegenüber pH-Extremen
Die Proben wurden mit HCl bzw. NaOH auf pH5,5 bzw. pH11 eingestellt
Methode 9 Stabilität gegenüber Harnstoff
Die Proben wurden mit Harnstoff behandelt (Endkonzentrion 8M)
Methode 10 Stabilität gegenüber Mercapto-Ethanol
Die Proben wurden mit Mercapto-Ethanol behandelt (Endkonzentration 200 mM)
Methode 11 Fällung mit Ethanol
Die Farbstoffe wurden durch Zugabe von zwei Teilen eiskaltem Ethanol gefällt. Nach Abzentrifugieren (15000 g; 4°C; 5 min) und Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet in Puffer (6,25 mM Tris/HCl) gelöst.
Methode 12 Stabilität gegenüber lipophilen Substanzen
Die Proben wurden im Verhältnis 1 : 1 mit Mineralöl gemischt und geschüttelt. Nach Trennung der Phasen wurde die wäßrige Phase untersucht.
Photographische Dokumentation
Fluoreszenz in Elektrophoresegelen und im lebenden Organismus wurde durch Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) hervorgerufen und photographiert.
Bestimmung des Molekulargewichts Methode 13 Aufreinigung von OFP
Nach Methode 3 gewonnener Rohextrakt wurde im 4%-Acrylamidgel (pH6,8; 0,,4% SDS) aufgetrennt. Eine Erneuerung des Elektrodenpuffers (25 mM Tris/HCl, pH 6,8; 1% SDS) erfolgte im Abstand von 30 min. Die orange-fluoreszierenden Gelbande wurde unter UV-Licht (366 nm) ausgeschnitten und in H2O-bidest überführt, um den Farbstoff aus dem Gel zu lösen (20h; 4°C). Nach dem Abzentrifugieren der Gelreste wurde der Überstand vakuumgetrocknet.
Methode 14 Aufreinigung von GFP1/2
Die Farbstoffe wurden in Anlehnung an Methode 13 behandelt. Im Unterschied zu Methode 13 wurde dem Gel zusätzlich Harnstoff (2M) beigemengt.
Methode 15
Die durch Methode 13/14 gewonnenen Extrakte wurden mit reduzierendendem Probenpuffer (6,25 mM Tris/HCl; pH6,8; 10% Glycerin; 1% SDS; 200 mM Mercapto-Ethanol) versetzt und 6 min bei 95°C erhitzt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte im 15%- Acrylamidgel (0,4% SDS). Im Anschluß wurde eine Silberfärbung durchgeführt.
Methode 16 Vorbemerkung
Das GFP aus Aequorea victoria verliert im denaturierten Zustand seine Fluoreszenz, behält jedoch seine Absorptionseigenschaften bei (CHALFIE et al., US-Patent 5491084, 1996). Dies gilt auch für GFP1/2 und OFP.
Nach Methode 3 gewonnener Rohextrakt wurde entsprechend Methode 15 behandelt. Es wurden große Mengen eingesetzt (ca. 150 µg Gesamtprotein pro Gelspur). Vor der Fixierung des Gels wurden die rötliche und die grünliche Bande durch Anschneiden des Gels markiert.
Ergebnisse Untersuchung der Fluoreszenz-Eigenschaften Das orange-fluoreszierende Protein
Die Untersuchung der Fluoreszenzspektren des orangen-fluoreszierenden Farbstoffs aus der Tentakelunterseite von Anemonia sulcata PENNANT (var. rufescens) (vgl. Abb. 13-14:) ergab die in Tab. aufgeführten Daten (vgl. Abb. 1-4)
Das Anregungsspektrum im Bereich über 600 nm läßt sich mit dem zur Verfügung stehenden Meßgerät nicht bestimmen.
Je nach Probe kann die Peak-Position um 1-2 nm von den angegebenen Werten abweichen.
Die Unterschiede im 1. Anregungsmaximum zwischen den nach Methode 1 und den nach Methode 5 aufgearbeiteten Proben sind wahrscheinlich auf Wechselwirkungen mit den grün­ fluoreszierenden Proteinen in den nach Methode 1 behandelten Proben zurückzuführen.
Tab. 1.
Spektrale Charakteristika der OFP-Fluoreszenz
Vergleich OFP - GFP (S65T-His)
Ein Vergleich der Anregungs- und Emissionsspektren von OFP mit denen der bekannten GFP-Mutante S65T-His (HEIM et al., 1995) zeigt die Vorteile von OFP und die Eignung für einen Simultaneinsatz beider Proteine (vgl. Abb. 5-6)
Die grün-fluoreszierenden Proteine
Die Untersuchung der Fluoreszenzspektren eines Gemisches der grün-fluoreszierenden Farbstoffe aus Anemonia sulcata PENNANT (var. rufescens-Tentakelunterseite; var. smaragdina-Tentakel; var. viridis-Tentakel) (vgl. Abb. 13-16) ergab die in Tab. aufgeführten Daten (vgl. Abb. 7-10)
Beweis dafür, daß es sich um ein Gemisch aus zwei Farbstoffen handelt, ist das variable Verhältnis der Emissionspeaks zueinander bei:
  • A) Anregung bei verschiedenen Wellenlängen
  • B) Bei unterschiedlichen Individuen einer Varietät
  • C) Bei Proteaseverdau
Je nach Probe kann die Peak-Position um 1-2 nm von den angegebenen Werten abweichen.
Tab. 2
Spektrale Charakteristika der GFP-Fluoreszenz
Vergleich AS-GFP1/2 - GFP (S65T-His)
Ein Vergleich der Anregungs- und Emissionsspektren von AS-GFP1/2 mit denen der bekannten GFP-Mutante S65T-His (HEIM et al., 1995) zeigt die Eignung für einen Simultaneinsatz beider Proteine (vgl. Abb. 11-12)
Das rote Protein der Tentakelspitzen
Die Tentakelspitzen von Anemonia sulcata PENNANT (var. rufescens; var. smaragdina; var. viridis, var. rosea) erhalten ihre Farbe durch ein rotes Protein. Dieser Farbstoff scheint im lebenden Tier zu fluoreszieren (vgl. Abb. 16). Im Homogenisat bleibt die rote Farbe erhalten, jedoch läßt sich keine Fluoreszenz spektrometrisch nachweisen.
Stabilität der farbigen Proteine aus Anemonia sulcata PENNANT
Die Proteine wurden nach den Methoden 6-12 behandelt. Die Ergebnisse sind in Tab. dargestellt. Sie geben den Prozentsatz der Fluoreszenz-Intensität (cps) an, der nach der Behandlung im Vergleich zu einer unbehandelten Referenz gemessen wurde. Teilweise führte die Behandlung zu einer Verschiebung des Emissionsmaximums. Die neue Peak-Position ist dann in Klammern angeführt. Im Fall des roten Proteins (RP) aus den Tentakelspitzen wurde der Erhalt der roten Farbe im Homogenisat als Kriterium gewählt und ist durch (+) oder (-) gekennzeichnet.
Tab. 3
Stabilität der Fluoreszenz / Farbe der farbigen Protein aus Anemonia sulcata
Molekulargewichte
Nach den Methoden 13 und 14 werden die farbigen Proteine nicht vollständig denaturiert. Die Fluoreszenz/Farbe bleibt erhalten. Auf diese Weise können die Farbstoffe im Gel detektiert werden. Es wurden scheinbare Molekulargewichte < 40000 Da ermittelt. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, daß die Farbstoffe unter diesen Bedingungen als Oligomere vorliegen.
Nach den Methoden 15 und 16, durch welche die Proteine vollständig denaturiert werden, wurde für OFP ein Molekulargewicht von ca. 22000 Da ermittelt. AS-GFP1/2 besitzen ein Molekulargewicht von 27000 Da. Diese Übereinstimmung mit dem Molekulargewicht bekannter GFP-Varianten deutet daraufhin, daß die verschiedenen Fluoreszenzspektren durch Austausch einzelner Aminosäuren in der Primärstruktur zustande kommen.
Das Molekulargewicht des RP im vollständig denaturierten Zustand wurde noch nicht ermittelt.
Zur Systematik von Anemonia sulcata (PENNANT ) - Verbreitung; Varietäten; Vorkommen fluoreszierender Proteine Vorbemerkung
Der systematische Teil ist ausführlich gehalten, um trotz bestehender Unklarheiten in der Literatur bezüglich der systematischen Stellung von A. sulcata eine sichere Zuordnung der fluoreszierenden Proteine zu bestimmten Varietäten/Arten zu ermöglichen.
Ökotypen
Anemonia sulcata (PENNANT) (Cnidaria; Anthozoa), die Wachsrose, ist eine häufige Bewohnerin von Hartböden in Atlantik und Mittelmeer. In der englischsprachigen Literatur wird das Tier unter dem Synonym Anemonia viridis (FORSKAL) geführt. Weitere Synonyme finden sich unter 2.3.4. Die Tiere beherbergen in ihrer Endodermis symbiontische Algen (Zooxanthellen). Der allgemeine Habitus wird von GOSSE (1860), ANDRES (1883) und SCHMIDT (1972) beschrieben.
SCHMIDT (1972) unterscheidet im Mittelmeer zwei Ökotypen: Tiere vom Ökotyp I besitzen bis 192 Tentakel und einen Fußscheibendurchmesser von 2-5 cm. Sie leben häufig in Kolonien. Ihre Verbreitung reicht bis in 5 m Tiefe. Ökotyp II besitzt ca. 192 Tentakel, häufig bis 384 und einen Fußscheibendurchmesser bis 15 cm. Die Tiere kommen solitär in Tiefen zwischen 3 und 25 m vor. WIEDENMANN (1996 und unveröffentlicht) fand Ökotyp I an einzelnen Standorten bis in 25 m Tiefe. Ökotyp II findet sich hingegen in wenig exponierten Habitaten schon ab 0,5 m Wassertiefe. Nach WIEDENMAN (1996 und unveröffentlicht) lassen sich die Tiere unter Berücksichtigung der Parameter Fußscheibendurchmesser, Frischgewicht, Tentakelzahl, Tentakellänge, Mundscheibendurchmesser, Körperhöhe und Koloniebildung im Freiland (entspr. vegetativer Vermehrung) in drei Hauptgruppen einteilen. Tiere der Gruppen I und II entsprechen den bekannten Ökotypen I und II. Aufgrund ihrer Merkmalskombination werden die Tiere der Gruppe III einem neuen Ökotyp III zugeordnet (vgl. Tab. 1). Typ III fand sich bisher ausschließlich in Rockpools. Nach der gängigen Definition von SCHMIDT (1972) sind Tiere des Ökotyps III aufgrund der Tentakelzahl und der fehlenden vegetativen Vermehrung am ehesten Ökotyp II zuzuordnen.
Tab. 4
Charakterisierung der Ökotypen nach dem Habitus
Farbvarietäten
Bereits 1860 beschreibt GOSSE Farbvarietäten der Wachsrose. Desgleichen nennt ANDRES (1881, 1883) verschiedene Varietäten. Bei diesen Beschreibungen wird teilweise GOSSE (1860) zitiert, teilweise werden Synonyme gebraucht. Darüberhinaus werden bestimmte Varietäten erstmals genannt. Eine Zusammenfassung dieser Arbeiten findet sich bei PAX (1962).
VALENTIN (1986) macht allein die Zooxanthellen für die Färbung der Tiere verantwortlich.
Eine Abhängigkeit der Farben von der Belichtung im Habität bzw. vom unterschiedlichen Zooxanthellengehalt sieht SCHMIDT (1972).
WIEDENMANN (1996) konnte erstmals zeigen, daß sich die Tentakelfarbe aus zwei Komponenten zusammensetzt: Aus Brauntönen, die durch die Zooxanthellen hervorgerufen werden und aus Rot-und Grüntönen, die von genetisch fixierten Pigmenten des Tiers herrühren.
Die Rot-und Grüntöne der Tentakel werden durch zwei grün-fluoreszierende Proteine (AS- GFP1/2), ein orange-fluoreszierendes Protein (OFP) und ein rotes Protein (RP) im Cytoplasma der Ectodermiszellen des Tieres hervorgerufen. Die Lokalisation im Tentakel wird in Tab. 2 behandelt. Der subjektive Farbeindruck entsteht also aus einer Mischung der Proteinfarben und der Zooxanthellenfarben.
Die Intensität der braunen Grundfärbung ist stark variabel, da der Gehalt an Symbiontenpigment in hohem Maß von verschiedenen Umweltfaktoren abhängig ist (WIEDENMANN; 1996). In ähnlichem Maße variiert die Konzentration der fluoreszierenden Proteine im Tiergewebe in Abhängigkeit von der Lichtqualität im Habitat (WIEDENMANN, unveröffentlicht). Diese neuen Untersuchungen zeigen, daß es sich bei den meisten beschriebenen Farbvarietäten um umweltbedingte Modifikationen von wenigen echten Varietäten handelt. Diese lassen sich nach dem Vorkommen der farbigen Proteine und der Zugehörigkeit zu einem Ökotyp gliedern (vgl. Tab. 5)
Systematische Stellung von Farbvarietäten und Ökotypen
SAUER (1984, 1986) konnte nachweisen, daß es sich bei var. vulgaris und var. rustica um eigenständige Arten handelt, die er als Anemonia sulcata und Anemonia rustica bezeichnet. Eine Stellung als eigenständige Arten vermutet er auch bei anderen Farbvarietäten. Diese Klassifizierung ist meiner Meinung nach richtig, muß aber wahrscheinlich auf die verschiedenen Ökotypen ausgedehnt werden, so daß jeder Ökotyp einer Farbvarietät eine eigene Art darstellt. Nach dieser Sichtweise handelt es sich bei Anemonia sulcata (PENNANT) um eine Artengruppe mit mindestens acht Arten.
Allgemeine Verbreitung fluoreszierender Proteine
Das GFP ist innerhalb der Stämme Cnidaria und Ctenophora weit verbreitet und fand hauptsächlich im Zusammenhang mit Biolumineszenzerscheinungen Beachtung (vgl. Morin 1974). Von Fluoreszenz innerhalb der Actinaria ist wenig bekannt. Allein TARDENT (1979) berichtet, daß die Tentakel von A. sulcata ein rötliches Leuchten bei Bestrahlung mit UV- Licht zeigen. Erste Sichtungen von Bildmaterial und Literatur deuten darauf hin, daß die in vorliegender Arbeit beschriebenen Proteine OFP, AS-GFP1/2 und RP in weiteren Spezies der Actinaria zu finden sind und bisher die Fluoreszenz-/Farberscheinungen aufgrund der fehlenden Lumineszenz übersehen wurden. Ein Vorkommen innerhalb anderer Ordnungen und Klassen der Cnidaria und Ctenophora ist ebenfalls wahrscheinlich.
Synonyma Vorbemerkung
Hier findet sich eine Sammlung von synonym gebrauchten Namen von Anemonia sulcata PENNANT, die nach Zusammenfassungen verschiedener Autoren erstellt wurde.
Nach ANDRES (1883):
1) Urtica cinerea: RONDELET (1554), lib. 17, cap. 16, p. 529.
Urtica secunda sive cinera Rondeletii: GESNER (1560)
Urtica cinera Rondeletii: ALDROVANDI (1606), p. 567.
Urtica cinerea: JONSTON (1650), p. 72, t. 18.
Urtica marina saxo-innata: ALDROVANDI (1606), p. 568.
Urtica marina saxo-innata: JONSTON (1650), p. 72, t. 18.
Hydra tentaculis denudatis: GAERTNER (1762), p. 78, t. 1, f. 1.
2) Priapus viridis sp. n.: FORSKAL (1775), Descript., p. 102, Icones, t. 27, f B. b.
Actinia viridis: GMELIN (1788-93), p. 3134; BRUGUIERE (1789), n. 13, t. 72, f 8. 9; BLAINVILLE (1830), p. 291, t. 32; BLAINVILLE (1834), p. 325; LAMARK (1837), p. 541 Comactis viridis (Forsk.): MILNE EDWARDS (1857), p. 236.
Actina viridis (Gmel.): GRAVENHORST (1831), p. 115.
Actina Enztacamea gracilis: H. & E. EHRENBERG (1834), p. 36.
Actina viridis (Gmel.): HOLLARD (1854), p. 633.
Actinia viridis (Forsk.): HELLER (1868), p. 17.
3) Actinia sulcata n. n.: PENNANT (1766); BRUGUIERE (1789), n. 10, t. 73, f 1,2; PENNANT (1812), p. 102.
Actinocereus sulcatus (Penn.): BLAINVILLE (1830), p. 294; BLAINVILLE (1834), p. 327
Gefurchte Seenessel: OKEN (1835), vol. 2, Part 1, p. 168; LAMARK (1837), p. 541.
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Actinia sulcata (Penn.): TEMPLETON (1836), p. 303.
Anemonia sulcata (Penn.): FISCHER (1875), p. 5, p. 205, p. 1207; Id. p. 373.
Anemonia sulcata (Penn.): JOURDAN (1880), p. 25.
Anemonia sulcata (Penn.): ANDRES (1880), p. 312.
4) Actinia cereus (Ell.): ELLIS & SOLANDER (1786), p. 2.
Hydra cereus: GMELIN (1788-93), p. 3867.
Actina cereus (Ell.): RAPP (1829), p. 56, t. 2, f, 3.
Actinia Entacmaea Cereus: EHRENBERG (1834), p. 35.
Actinia cereus (Ell. & Sol.) (Hexastephanus): BRANDT (1835), p. 12.
Actinia cereus (Ell.): MARTENS (1838); GRUBE (1840), p. 11.
Anemonia cereus (Ell. & Sol.): GRUBE (1864), p. 106.
Anthea cereus: HASSALL (1841), p. 286.
Anthea cereus: THOMPSON (1841), p. 481; THOMPSON (1843), p. 284; THOMPSON (1856); THOMPSON (1858), p. 232.
Anemonia cereus sp. n.: CONTARINI (1844), p. 169, t. 16, 17, 18, f. a, b. 19.
Anemonia cereus (Cont.): VERANY (1846), p. 83; VERANY (1862), p. 98
Anthea cereus (Gaert.): COUCH (1838), III, p. 81, t. 14, f 2; CONCH (1841), p. 34; COCKS (1851), p. 10, t. 2, f23, 27; JOHNSTON (1847), p. 240, t. 44
Actinia cereus: MILNE EDWARDS in CUVIER (1849); t. 61, f 1.
Anthea cereus (John.): MILNE EDWARDS (1851), p. 8.
Anthea cereus (Gaert.): LANDSBOROUGH (1852), p. 258.
Anthea cereus: GOSSE (1855), p. 27, f 37; GOSSE (1858), p. 416, GOSSE (1860), t. 5, f 2.
Anthea cereus: LEWES (1860), p. 17.
Anthea cereus: JORDAN (1855), p. 90.
Anthea cereus (Actinia) (Ell. & Sol.). SARS (1857), p .34.
Anthea cereus (Ell.): WRIGHT PERCEVAL (1858), p. 120.
Anthea cereus (John.): GRUBE (1861), p. 131 e p. 166.
Anthea cereus (John.). JOHNSON (1861), p. 301, JOHNSON (1862), p. 180.
Actinia cereus (Ell. et Sol.): HELLER (1868), p. 10.
Actinia crassicornis (Lin.): DELLE CHIAJE (1825), v. 2, p. 228, 241, t. 16, f 4, BLAINVILLE (1830), p. 292;
BLAINVILLE (1834), p. 326, DELLE CHIAJE (1841), v. 4, p. 125, v. 5, p. 137, t. 152, f 4, 9.
6) Anemonia vagans sp. n.: RISSO (1826), p. 288; BLAINVILLE (1830), p. 292; BLAINVILLE (1834), p. 326;
MILNE EDWARDS (1857), p. 234.
Anemonia edulis sp. n.: RISSO (1826), p. 289, BLAINVILLE (1830), p. 292, BLAINVILLE (1834), p. 326.
Actina flagellifera sp. n.: DANA (1849), t. 1, f. 1.
Comactis flagellifera (Dana): MILNE EDWARDS (1857), p. 236.
Entacmaea phaeochira sp. n.: SCHMARDA (1852), p. 16, t. 5, f 1, 2.
Actinia phaerochira (Schm.): HELLER (1868), p. 11.
Anthea gigantea sp. n.: (WEILAND), p. 38.
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Claims (7)

1. Proteine aus der Artengruppe Anemonia sp. (sulcata) PENNANT bzw. aus Arten, die mit Synonymen bezeichnet werden, dadurch gekennzeichnet, daß sie:
  • A) bei Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) orange fluoreszieren.
  • B) bei Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) grün fluoreszieren.
  • C) in den Tentakelspitzen vorkommen und diesen eine rote Farbe verleihen.
2. Proteine, unabhängig vom Herkunftsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß sie:
  • A) ein ungefähres Molekulargewicht von 22000 Da besitzen und in Puffer (6,25 mM Tris/HCl; pH7,5; 10% Glycerin) eine Fluoreszenz mit einem Emissionsmaximum zwischen 592-599 nm aufweisen und diese Fluoreszenz nach Hitzeeinwirkung (80°C/5 min in 1,2 ml Puffer (s. o.)) noch nachweisbar ist.
  • B) ein Molekulargewicht von 27000 Da besitzen und in Puffer (6,25 mM Tris/HCl; pH7,5; 10% Glycerin) eine Fluoreszenz mit einem Emissionsmaximum zwischen 497-500 nm bzw. zwischen 521-523 nm aufweisen.
  • C) eine rote Eigenfarbe besitzen, die bei einer Fällung mit EtOH erhalten bleibt und nach Hitzeeinwirkung (80°C/5 min in 1,2 ml Puffer (s. o.)) noch nachweisbar ist.
3. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die unter einem der vorherigen Ansprüche genannten Proteine codieren.
4. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch künstliche Veränderung einer der unter Anspruch 3 genannten Sequenzen erzeugt wurden.
5. Eine technische Anwendung eines Proteins bzw. einer DNA-Sequenz der in einem der vorherigen Ansprüche genannten Proteine oder Sequenzen gemäß US-Patent 5491084.
6. Eine simultane Anwendung mehrerer Proteine bzw. DNA-Sequenzen der in einem der vorherigen Ansprüche genannten Proteine oder Sequenzen gemäß US-Patent 5491084.
7. Eine simultane Anwendung eines oder mehrerer Proteine bzw. DNA-Sequenzen in Kombination mit den in US-Patent 5491084 beschriebenen Proteinen/Sequenzen.
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