DE60315432T2 - Natürlicher fluoreszierender farbstoff von meeresinvertebraten, zusammensetzungen die ihn enthalten und deren verwendungen - Google Patents

Natürlicher fluoreszierender farbstoff von meeresinvertebraten, zusammensetzungen die ihn enthalten und deren verwendungen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen bioaktiven Extrakt, welcher einen natürlichen unpolaren und nicht proteinhaltigen fluoreszierenden Farbstoff, der aus dem alkoholischen Extrakt von Ovargewebe des Meeresinvertebraten Holothuria scabra extrahiert wird, enthält. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Extraktion, Teilreinigung und Charakterisierung dieses neuen, unpolaren Farbstoffes. Bei den erwähnten Meeresinvertebraten handelt es sich im Besonderen um die Seegurke. Seegurken sind Echinoderme. Sie gehören zur Gruppe der Tiere mit stacheliger Haut, zu welcher auch Seesterne und Seeigel gehören. Die wissenschaftliche Bezeichnung lautet Holothuriae, sie besitzen längliche, röhrenförmige, gummiartige Körper ohne Knochenskelett. Taxonomisch werden sie wie folgt eingeordnet:
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Seegurken werden taxonomisch folgendermaßen eingeordnet:
    Unterreich: Metazoa
    Stamm: Echinodermata
    Unterstamm: Eleutherozoa
    Klasse: Holothuroidea
    Unterklassen: Aspidochirotacea, Dendrochirotacea, Apodacea
    Ordnungen: Dendrochirota, Aspidochirota, Elasipoda, Molpadonia, und Apoda.
  • Innerhalb dieser Ordnungen gehört die Seegurke Holothuria scabra zu:
    Ordnung: Aspidochirota
    Familie: Holothuriidae
    Gattung: Holothuria
    Spezies: scabra
  • Echinoderme sind coelomate Invertebraten, die ausschließlich im Meer leben, niemals in Kolonien, sie sind unsegmentiert und weisen in der adulten Form eine grundlegende, pentamerische Radialsymmetrie auf. Sie besitzen weder Kopf noch Gehirn, und unterscheiden sich von allen anderen Lebewesen durch strukturelle Besonderheiten des Skeletts und des Coeloms. Die Klasse der Holothuroidea umfasst Tiere, deren Körper beidseitig symmetrisch und für gewöhnlich entlang der oralen-aboralen Achse länglich sind. Der Mund befindet sich am einen Ende oder in der Nähe des einen Endes und der Anus am oder in der Nähe des anderen Endes. Die Körperoberfläche ist rau, das Endoskelett ist auf mikroskopisch kleine Nadeln oder Platten reduziert, welche in die Körperwand eingebettet sind. Der Mund ist von einem Tentakelsatz umgeben, welcher an das Wassergefäßsystem angeschlossen ist, üblicherweise sind Podien oder Schlauchfüße vorhanden, welche der Ortsveränderung dienen. Der Verdauungstrakt ist lang und gewunden, und die Kloake normalerweise mit Atmungsorganen versehen, die Geschlechter sind für gewöhnlich getrennt, die Gonaden sind einzeln oder als paariges Röhrchenbüschel vorhanden. Sie sind sesshafte Formen, die entweder an hartem Substrat anhaften, oder sich in weiches Sediment einbohren, wobei das vordere und das hintere Ende herausragen. Es gibt mehr als 1000 Arten von Holothuroiden. Ihre Länge variiert zwischen 2 cm und 2 m. Sie gehören zu den wenigen Tieren, deren Lebensraum nicht durch die Meerestiefe beschränkt ist. Von einigen Arten wird berichtet, dass sie 50% der Lebensformen bei 4000 m und 90% bei 8000 m Tiefe ausmachen. Die Art Holothuria scabra, welche bisweilen auch als Metriatyla scabra Jaegea bezeichnet wird, ist in Ostafrika, dem Roten Meer, der Bucht von Bengalen, Ostindien, Australien, Japan, dem Südpazifik, den Philippinen, dem Indischen Ozean und anderen indopazifischen Regionen weit verbreitet. Sie wird in Sabah, Malaysia, Indonesien und anderen indopazifischen Ländern zum menschlichen und tierischen Verzehr genutzt.
  • Fluoreszierende Farbstoffe sind in der Fluoreszenzsondenindustrie von immensem Wert, um es Forschern zu ermöglichen, besondere Komponenten komplexer biomolekularer Verbindungen nachzuweisen, inklusive lebender Zellen mit ausgeprägter Sensitivität und Selektivität (lain D. Johnson, „Introduction to flourescence techniques", Kapitel 1, Seite 1 ff. in „The Handbook of Flourescent probes and Research Chemicals" von Richard P. Haughland, 6. Auflage, gedruckt in den USA, 1996). Fluoreszierende Farbstoffe werden in großem Umfang bei der Markierung von Molekularsonden zur Lokalisierung biologischer Strukturen mittels Floureszenzmikroskopie verwendet, z.B. bei Immunoassays, zur Markierung von Nukleotiden und Oligonukleotiden für In-Situ-Hybridisierungsstudien, zur Bindung an polymerische Mikroshären und zum Anfärben von Zellen für die Verwendung in bildgebenden Stu dien. Die Farbstoffe werden zudem zur selektiven Zerstörung von Zellen verwendet, z.B. beim Verfahren der Photodynamischen Therapie. (Haughland, R.P. und Kang, H.C. US-Patent Nr. 4,774,339 , 27. September 1988, Haughland, R.P. und Kang, H.C., US-Patent Nr. 5,248,782 , 28. September 1993).
  • Unpolare Farbstoffe sind beim Aufspüren neutraler Lipide und anderer unpolarer Flüssigkeiten von Nutzen. Die Fluorophore mit der unpolaren Qualität sind höchst geeignet zur Bildung von Konjuganten mit einer Vielzahl von Biomolekülen entsprechend der Anforderungen der Forscher. Zwei unpolare Sonden, nämlich NBD-Sonden, NBD-Dihexadecylamin (D-69) und NBD-Hexadecylamin (H-429), werden vorwiegend zum Aufspüren von Lipiden, die durch TLC getrennt wurden, mittels Fluoreszenz verwendet (The Molecular probes Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals von Richard P. Haughland, 6. Auflage, gedruckt in den USA, 1996, pp.321–322). Dieselben Autoren berichteten von drei unpolaren Derivaten des Bodipy-Fluorophors, welche eine ungewöhnliche Kombination von unpolarer Struktur und langwelliger Absorption und Fluoreszenz bietet. Es wird beschrieben, dass diese Farbstoffe potentiell Anwendung als Färbemittel für neutrale Lipide sowie als Tracer für Öl und andere unpolare Flüssigkeiten finden könnten. Beispielsweise ist BODIPY 493/503 (D-3922) spezifischer für zelluläre Lipidtröpfchen als die Anfärbung mit Nilrot (N-1142). BODIPY 505/515 (D-3921) durchdringt sehr schnell die Zellmembranen lebender Zebrafischembryonen und färbt selektiv die zytoplasmatischen Dotterplättchen (Mark Cooper, University of Washington, zitiert in: Molecular probes The Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals von Richard P. Haughland, 6. Ausgabe, gedruckt in den USA, 1996, S.322 ff.). Bodipy-Farbstoffe besitzen eine geringe Fluoreszenz, einen Stokes-Shift-Extinktionskoeffizienten von typischerweise mehr als 80.000 cm–1M–1, sowie eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute (0,94 für D-3921 in Methanol), welche sich im Wasser nicht verringert. Ihre Lichtechtheit ist generell hoch. Diese Bodipy-Farbstoffe werden in Blitzlichtpumpen-Laserfarbstoffen verwendet. Bodipy 665/676 (B-3932) kann durch Verwendung der 633 nm-Spektrallinie des He-Ne-Lasers oder der 647 nm-Spektrallinie des Ar-Kr-Lasers angeregt werden, für Anwendungen, welche langwellige Fluoreszenznachweise erfordern (Richard P. Haughland, Molecular probes. The Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals, 6. Ausgabe, gedruckt in den USA, 1996 S. 321–322 ff.). Von unpolaren fluoreszierenden Farbstoffen als Färbekomponente in industriellen Anwendungen berichten US-Patente (Fischer, Wolfgang, Deckers, Andreas, Guntherberg, Norbert, Jahns, Ekkehard, Haremza, Sylke, Ostertag, Werner, Schmidt, Helmut, US-Patent Nr. 5710197 , erteilt am 20. Januar 1998 mit dem Titel „Crosslinked polymer particles containing a fluorescent dye", US-Patent Nr. 5304493 vom 19. April 1994 von Nowak, Anthony V. mit dem Titel „Method for detecting a marker dye in aged Petroleum distillate fuels", US-Patent Nr. 4063878 vom 20. Dezember 1977 von Weeks, Bruce W., mit dem Titel „Applying sublimation indicia to Pressure sensitive adhesive tape".
  • Auf der Website
  • http://www.uniulm.de/uni/fak/natwis/oc2/ak_wuert/publications.htm wird von 39 Publikationen von A.K. Wuerthner berichtet, von denen sich die meisten mit Synthese und Design von Chromatophoren für Materialien mit Brechungsindex und photorefraktive organische Gläser befassen. Es werden auch etwa 9 internationale Patente offen gelegt (S. Beckmann, F. Effenberger, F. Würthner, F. Steybe, DE 4416476 (16.11.1995), WO 95/30679 , Präparation von Oligothiophenen für die Verwendung in nichtlinearen optischen Materialien, K.-H. Etzbach, C. Kräh, R. Sens, F. Würthner, DE 19.611.351 (22.03.1996), WO 97/35926 (02.10.1997), Farbstoffmischungen, enthaltend Thienyl- und/oder Thiazolazofarbstoffe, C. Grund, H. Reichelt, A.J. Schmidt, F. Würthner, R. Sens, S. Beckmann, DE 19648564 A1 (28.05.1998), DE 196 50 958 A1 (10.06.1998), WO 98/23688 (04.06.1998) Indoleninmethinfarbstoffe auf Basis von Trifluormethylpyridonen, Indoleninmethinfarbstoffe auf Basis von Trifluormethylpyridonen, F. Würthner, H.-W. Schmidt, F. Haubner, DE 19643097 A1 (23.04.1998), Vernetzbare Triarylaminverbindungen und deren Verwendung als Ladungstransportmaterialien, F. Würthner, R. Sens, G. Seybold, K.-H. Etzbach, DE 197 11 445 A1 (24.09.1998), WO 98/41583 (24.09.1998) Farbstoffsalze und ihre Anwendung beim Färben von polymerem Material;
  • Auf der Webseite www.sigma-aldrich.com, in ihrem Bereich Immunochemikalien aus dem Katalog „Biochemicals and reagents for life sciences research", 2000–2001 von Sigma-Aldrich finden sich Beschreibungen von Markierungs-Reagenten und Zellverbinder-Markierungskits, S. 1454–1456. Drei US-Patente von Horan, Paul K., Jensen, Bruce D., Siezak, Sue E., US-Patent Nr. 4783401 vom 8. November 1988, Horan, Paul K., Siezak, im US-Patent Nr. 4762701 vom 9. August 1988 und Horan, Paul K., Jensen, Bruce D., Siezak, Sue E. im Dokument US 4859584 vom 22. August 1989 legten jeweils „viable cell labeling" (Markierung lebensfähiger Zellen), Zelltracking in vivo und Zellwachstumsratenbestimmung durch Messung von Veränderungen der Cyaninfarbstoffkonzentrationen in Plasmamembranen offen.
  • Es besteht eine große Nachfrage nach nicht toxischen und zelldurchdringenden fluoreszierenden Farbstoffen für ihre Anwendung in Studien über Funktionen lebender Zellen, Wirkstoffzufuhr, Untersuchung zahlreicher Zellorganellen und vieles mehr. Eine eukaryotische Zelle kann mehrere Kompartimente haben, die jeweils durch eine Membran begrenzt sind, wogegen eine Bakterienzelle aus einem einzigen Kompartiment bestehen kann. Die spezifische Permeabilität ist ein Merkmal der Zellmembranen. Ein guter Farbstoff ist derjenige, der die verschiedenen Teile der Zelle bei einer Emission und bei verschiedenen Emissionen zeigen kann (The Handbook of Fluorescent probes and Research chemicals von Richard P. Haughland, 6. Ausgabe, gedruckt in den USA, 1996).
  • Farbstoffe mit Fluorophor, an verschiedene Proteine gebunden, wurden im Handbook of fluorescent probes and Research chemicals von Richard P. Haughland 1996, Seite 126–128, synthetisiert und beschrieben. In dieser Ausführungsform wird der Bereich von blau fluoreszierendem Cascade Blue und neuen AMCA-S Farbstoffen bis zu den rot fluoreszierenden Texas-Red-Farbstoffen und den Phycobiliproteinen dargestellt. Das Unternehmen hat oregongrüne Konjugate, rhodolgrüne Konjugate, Bodipy-Konjugate, eosin-markierte sekundäre Reagenzien, rot fluoreszierendes Rhodamin Rd-X und Texas Red-X-Konjugate, Phycobiliproteinkonjugate, Cascade Blue und AMCA-S-Konjugate hervorgehoben.
  • All diese Farbstoffe sind synthetisch und jeder Einzelne von ihnen emittiert in einem bestimmten Spektralbereich. Die Kombinationen von 2–3 Farbstoffen werden dann für Mehrfarbenexperimente hergestellt. Dasselbe Unternehmen bietet auch Jasplakinolid an, ein makrozyklisches Peptid, das aus dem Meeresschwamm Jaspis johnstoni als zellpermeable F-Aktin-Sonde isoliert wird. Es ist jedoch giftig und zeit fungizide, insektizide und antiproliferative Aktivität. Die meisten der derzeit auf dem Markt erhältlichen Farbstoffe sind synthetisch. Stainsfile-Dyes A hat einen Farbstoff index von 264 Farbstoffen herausgegeben, von welchen 258 synthetisch und nur sechs natürliche Farbstoffe sind.
    (http://members.pgonline.com/~bryand/dyes/dyes.htm).
  • Die Herstellung synthetischer Farbstoffe erfordert oftmals den Einsatz starker Säuren, Alkali und Schwermetalle als Katalysatoren bei hohen Temperaturen. Dies macht das Verfahren und die Abwasserbeseitigung zu einem Umweltproblem. Die Farbstoffindustrie ist stets auf der Suche nach günstigeren und umweltfreundlicheren Herstellungsmethoden für existierende Farbstoffe. (Hobson und Wales, 1998. Green Dyes, Journal of the Society of Dyers and colorists (JSDC), 1998, 114, 42–44). Nicht alle der verfügbaren Farbstoffe sind fluoreszierend. Bitplane Products hat eine Liste der 123 Fluorochrome auf dem Markt veröffentlicht, ebenso deren Anregungs- und Emissionsspektrum
    (http://www.bitplane.ch/public/support/standard/fluorochrome.htm).
  • Fluoreszenz ist ein Phänomen, bei dem ein Atom oder Molekül beim Übergang von einem höheren in einen niedrigeren elektronischen Zustand Strahlung aussendet. Sie folgt dem Stokeschen Gesetz, nach welchem die Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung stets größer ist als die der Anregungsstrahlung. Der Vorgang der Fluoreszenz unterscheidet sich ziemlich stark von der Phosphoreszenz und der Biolumineszenz. Der Ausdruck Fluoreszenz wird verwendet, wenn der Zeitraum zwischen der Anregung und der Emission der Strahlung sehr klein ist (10–8 bis 10–3 Sekunden). Bei der Phosphoreszenz kann der Zeitabstand zwischen Absorption und Emission zwischen 10–3 Sekunden und mehreren Stunden variieren (R. Norman Jones, 1966 in: The encyclopaedia of chemistry, 2. Auflage, 1966, Seiten 435–436). Bioluminiszenz ist der Ausdruck für das Licht, welches als Ergebnis einer chemischen Reaktion erzeugt wird, die zu einer bestimmten Zeit in einer bestimmten Zelle innerhalb des Körpers eines lebenden Organismus stattfindet.
  • Eine große Zahl an fluoreszierenden Farbstoffen ist in „The Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals" von Richard P. Haughland, 6. Auflage, gedruckt in den USA, 1996, aufgeführt. Auf den Seiten 1–6 desselben Buches beschrieb Ian D. Johnson (1996) im Detail den Vorgang der Fluoreszenz und die Methoden zum Nachweis in bestimmten Molekülen, die er Fluorophore oder fluoreszie rende Farbstoffe nannte (im Allgemeinen polyaromatische Kohlenwasserstoffe oder Heterozyklen). Die am vielseitigsten anwendbaren, die derzeit in fluoreszierenden Farbstoffen in Gebrauch sind, sind Fluorescein, auf Fluorescein basierende BODIPY-Farbstoffe und deren Derivate. Die Autoren haben sich eingehend mit den Defiziten all dieser Farbstoffe befasst und die von ihnen bevorzugten Eigenschaften bei Farbstoffen beschrieben. Viele Derivate der fluoreszierenden Farbstoffe und ihre Synthese werden in US-Patenten offenbart (Haughland, R.P. und Kang, H.C., US-Patent Nr. 4774339 , veröffentlicht am 27. September 1988, Haughland, R.P. und Kang, H.C., US-Patent Nr. 5248782 vom 28. September 1993, Kang, H.C. und Haughland, R.P., US-Patent Nr. 5187288 , veröffentlicht am 16. Februar 1993, Kang, H.C. und Haughland, R.P., US-Patent Nr. 5274113 vom 28. Dezember 1993 und Kang, H.C. und Haughland, R.P., US-Patent Nr. 5433896 vom 18. Juli 1995, Kang, H.C. und Haughland, R.P., US-Patent Nr. 5451663 , veröffentlicht am 19. September 1995). Rosenblum, Barnett B., Spurgeon S., Lee Linda G., Benson Scott C. Und Graham Ronald J. berichteten im internationalen Patent Nr. WO 0058406 , Veröffentlichungsdatum 5. Oktober 2000, von 4,7-Dichlororhodamin-Farbstoffen, die sich als Molekularsonden eignen.
  • R. Norman Jones hat in „The encyclopaedia of chemistry", 2. Ausgabe, 1966, Seiten 435–436, die Besonderheit eines guten Fluorophors beschrieben. Nach seinen Angaben muss ein fluoreszierendes Molekül ein gutes chromophorisches System zur Absorption von Anregungsenergie besitzen, sowie einen Schutzmechanismus zum Schutz vor zu schneller Dissipation der Anregungsenergie in eine Schwingungsbewegung, bevor die Fluoreszenzverzögerung auftreten kann. Er merkte auch an, dass es, obwohl die Beziehung der Molekularstruktur und der Fluoreszenz von Verbindungen nicht hinreichend verstanden sind, bestimmte Gruppen gibt, deren Anwesenheit mit Fluoreszenz in Verbindung gebracht wird. Zum Beispiel sind wird die Anwesenheit organischer Moleküle wie Phtalein und aromatischer Strukturen wie Anthracen und Naphtacen besonders mit heller Fluoreszenz assoziiert. Einige wenige anorganische Verbindungen fluoreszieren im flüssigen Zustand stark, und in Feststoffen wird die Fluoreszenz oftmals durch vorhandene Spuren von Verunreinigungen beeinflusst.
  • Pigmente gehören sowohl zur anorganischen als auch in zur organischen Kategorie. Erstere sind die anorganischen chemischen Verbindungen, die für zahlreiche Zwecke der Dekoration, Malerei etc. Verwendung finden. Organische Pigmente wie organische Farbstoffe waren bereits im Altertum bekannt. Über die Verwendung von Farbstoffen aus Pflanzen wie Brasilholz, Blauholz, persische Indigobeere (Persian berry indigo) und Krappe wird aus dem Nahen Osten und Ländern des Fernen Ostens bereits in vorbiblischer Zeit berichtet (George I. Clark 1966, „Encyclopaedia of chemistry", 2. Ausgabe, Seiten 833–835).
  • Debra, K. Hobson und Davis S. Wales beschreiben „Grüne Farbstoffe", welche als Sekundärmetaboliten von einigen Gruppen lebender Organismen wie Pilzen, Blaualgen, Seeigel, Seesterne, Arthropoden und Korallenriff-Hohltieren produziert werden (Journal of the Society of Dyers and Colourists (JSDC), 114, 42–44, 1998). Dabei handelt es sich um Anthrachinonverbindungen, welche historisch von größter Bedeutung für die Farbstoffindustrie sind.
  • Es wird von einer Vielzahl von Carotinoid-Pigmenten aus den carotinoiderzeugenden Bakterienarten berichtet ( US-Patent Nr. 5935808 , veröffentlicht am 10. August 1999, Erfinder Hirschberg und et al., US-Patent Nr. 5858761 , 12. Januar 1999, Erfinder Tsubokura et al.). Collin, Peter Donald stellt in seinem US-Patent Nr. 6055936 , veröffentlicht am 2. May 2000, carotinoide Lipidfraktionen und Verfahren bei Seegurken vor. Bandaranayake, W.M. und Des Rocher, A. 1999 (Marine biology 133, 163–169) beschrieben Carotinoid-Pigmente aus der Körperwandung, den Ovarien und inneren Organen der Holothuria atra aus Australien.
  • All diese Färbemittel und Farbstoffe sind jedoch nicht fluoreszierend. Fluoreszierende Farbstoffe, von denen die meisten synthetisch sind, werden in verschiedenen internationalen und US-Patenten offenbart. Diese wurden in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet. Die Anzahl an Patenten auf diesem Gebiet zeigt die Bedeutung dieser Farbstoffe. Synthetisches Parazoanthoxanthin A (m.w. 214.2), welches bei Lambda (em) 420 nm Fluoreszenz emittiert, erwies sich als reiner kompetitiver Inhibitor von Cholinesterasen. Sepcic K., Turk T., Macek P. (Toxicon, 36 (6): 937–940, 1998). Welch, David Emanuel ( US-Patent Nr. 5989135 , erteilt am 23. November 1999) offenbarte einen lumineszierenden Golfball.
  • White et al. ( US-Patent Nr. 6110566 vom 29. August 2000 und WO 9920688 ) beschrieben einen flexiblen Polyvinylchloridfilm, der beständige fluoreszierende Farben aufweist.
  • Dipietro, Thomas C. (Internationales Patent Nr. WO 9938916 ) offenbarte die Verwendung von fluoreszierenden polymerischen Pigmenten in einer Vielzahl von Farben, Tinten und Textilien. Cramer, Randall J. (Patent Nr. EP 0206718 , veröffentlicht am 30. Dezember 1986) beschrieb eine Zusammensetzung mit fluoreszierendem Farbstoff zum Bleichen und Aufhellen von Polymeren.
  • Leckerkennung ist ein weiterer Einsatzbereich, welcher von einigen offenbart wird (Leighley, Kenneth C., US-Patent Nr. 6056162 vom 2. Mai 2000). Cooper et al., US-Patent Nr. 6165384 , veröffentlicht am 26. Dezember 2000, offenbaren eine über den gesamten Spektralbereich fluoreszierende Farbstoffzusammensetzung für denselben Zweck. Lichtwardt et al., US-Patent Nr. 5902749 vom 11. Mai 1999, nutzen fluoreszierenden Farbstoff in einem automatisierten chemischen Zumesssystem.
  • Es gibt Berichte über einige wenige verfügbare natürliche fluoreszierende Farbstoffe. Ein grün fluoreszierendes Protein, GFP, bei der Pazifikqualle Aequora aequora wurde von Shimomura, O., Johnson, F.H. und Saiga, Y. im „Journal of cellular and comparative physiology", 59, 223–239, 1962, beschrieben, Chalfie, M. in 1: Photochem Photobiol 1995 Oct 62 (4): 651–6 „Green fluorescent Protein", Youvan DC, Michel-Beyerie ME „Structure and fluorescence mechanism of GFP" in National Biotechnology 14. Oktober 1996 (10): 1219–20 und Chalfie, M., Yuan Tu, Ghia Euskirchen, William W. Ward, Douglas C. Prasher in SCIENCE 263 (1994) 802–805 berichteten, dass gereinigtes GFP ein Protein aus 238 Aminosäuren ist. Es absorbiert blaues Licht maximal bei 395 nm mit einer kleineren Spitze bei 470 nm, und es emittiert grünes Licht bei einer Spitzenemission von 509 nm mit einem Rand bei 540 nm. Diese Fluoreszenz ist sehr stabil und es wird praktisch kein Ausbleichen durch Licht beobachtet.
  • GFP mit Fluoreszenz bei anderen Wellenlängen im Rot- und Gelbbereich werden aus nicht bioluminiszenten Anthozoen beschrieben, insbesondere Discosome-Koralle. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. in 1: FERS Lett v. 19. Oktober 2001, 507 (1): 16–20 n beschrieben GPF-ähnliche Chromoproteine as Quelle von Proteinen, die im far-red-Bereich fluoreszieren. Wachter, R.M., Elsliger M.A., Kallio, K., Hanson, G.T., Remington, S.J. beschrieben in 1: Structure 1998, 15. Oktober, 6 (10): 1267–77 „Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent Protein"). Fradkov, A.F., Chen, Y., Ding, L., Barsovsa, E.V., Matz, M.V., Lukyanov, S.A.: „Novel fluorescent Protein from Discosoma coral and ist mutants possesses a unique far-red fluorescence" in 1:FEBS Lett, 18. August 2000: 479 (3): 127–30. Sie beschreiben ein neuartiges Gen für ein fortgeschrittenes rotverschobenes Protein mit einem Emissionsmaximum bei 593 nm, das aus der Discosoma-Koralle geklont wurde. Das Protein mit dem Namen FP593 ist in hohem Maße homolog zum kürzlich beschriebenen GFP-ähnlichen Protein drFP583 mit einem Emissionsmaximum bei 583 nm. Sie entwickelten zahlreiche Mutanten dieser beiden Gene. Ein Hybridmutant resultierte in einer mutierten Variante mit einem einzigartigen rotverschobenen Emissionsmaximum bei 616 nm. Matz, M.V., Fradkov, A.F., Labas, Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov, M.L., Lukyanov S.A., 1:Nat Biotechnolo 17. Dez. 1999 (10): 969–73.
  • In den Ländern des südöstlichen und Südpazifikraums sind Seegurken für ihre Verwendung in der Industrie für Gesundheitsernährung und Arzneimittel wohlbekannt, entweder als Nahrungsmittel oder Inhaltsstoff für zahlreiche Wirkstoffzusammensetzungen, insbesondere für Gelenkentzündungen, Verstauchungen und andere Therapeutika. Etliche US- und internationale Patente sind gelistet und geprüft (Fan Hui-Zeng, Yu Song, Yamanaka, E., Numata, K., Oka, T., Suzuki, N., Muranaka, Y. im US-Patent Nr. 5519010 vom 21. Mai 1996, Weiman, Bernard, US-Patent Nr. 5888514 , veröffentlicht am 30. März 1999, Katsukura, Kitazato, Kenji Yamazaki, Yasundo US-Patent Nr. 5993797 vom 30. November 1999, Henderson, R.W:, Henderson, T., und Hammd, T., US-Patent Nr. 6255295 vom 3. Juli 2001, Shinya US-Patent Nr. 6203827 vom 20. März 2001, US-Patent Nr. 5770205 von Collin Peter Donald, veröffentlicht am 23. Juni 1998 und WO Patent Nr. 0001399 , veröffentlicht am 13. Januar 2000, Kovalev, V.G., Semetsov, V.K. Slutskaja, Akulin V.N., Timchishina, G.N. in RU 2147239 , veröffentlicht am 10. April 2000, Li Zhaoming, Zhu Beiwei, CN 1286926 vom 14. März 2001, Qu Jianhong, Song Xuiquin, Zheng Fuqiang, CN 1223131 vom 21. Juli 1999, Wufa Zhuang Wufa, Meizheng Zhuang, CN 1142365 vom 12. Februar 1997, Fang Hua, CN 1312031 vom 12. September 2001 und Ding Cunyi, CN 1173290 vom 18. Februar 1998, Collin Peter Donald, WO 9937314 , veröffentlicht am 29. Juli 1999). Die Verwendung der Substanzen aus Seegurken in Anti-HIV-Medikamenten wird offenbart (Hishino Hiroo EP 410002 vom 30. Januar 1991 und Hoshino Hiroo, EP 4951167 vom 22. Juli 1992). In Anbetracht ihrer Bedeutung wird versucht, die Tiere in Gefangenschaft zu kultivieren (Annie Mercier, S.C. Battaglene und Jean-Francois Hamel in: Journal of experimental Marine Biology and Ecology, Volume 249, Ausgabe I: 89–110, 2000 „Settlement preferences and early migration of the tropical sea cucumber Holothuria scabra". Gu Zaishi, Wang Shuhai, Zhou Wei stellten eine „Ecological reproducing method for Stichopus japonicus") in Patent Nr. CN1179261 vom 22. April 1998 dar.
  • Jedoch besitzen all diese Patente keine direkte Relevanz auf dem Gebiet des vorliegenden Patentes und sind somit nicht als Referenz beinhaltet.
  • Goswami, Usha und Ganguly, Anutosh haben ein Patent auf einen natürlichen fluoreszierenden Farbstoff aus einem maritimen Meeresinvertebraten eingereicht (CSIR, NF-140/2001, US-Patentantrag, Seriennummer: 09/820654, eingereicht am 30. März, 2001). Dies bezieht sich auf den Rohextrakt aus Holothuria scabra, welcher die Fluoreszenzeigenschaften bei drei verschiedenen Wellenlängen bei Anregung in verschiedenen UV- und sichtbaren Bereichen des Lichtspektrums aufweist. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung dieses neuen Farbstoffes, bei dem es sich um einen teilgereinigten natürlichen Farbstoff aus einer Seegurke handelt. Die Anwendung dieses Farbstoffes als epifluoreszentes Färbemittel und nicht radioaktiver fluoreszierender Farbstoff zur Markierung von Molekularsonden für in-situ-Hybridisierungsstudien wird beschrieben, ebenso etliche andere Qualitäten des Farbstoffes als Arznei. In diesem Patent des Stands der Technik haben wir uns detailliert mit den Pigmenten, synthetischen Farbstoffen und natürlichen Farbstoffen aus terrestrischen Pflanzen und Mikroben beschäftigt. ( US-Patent Nr. 4452822 , veröffentlicht am 5. Juni 1984, Erfinder Shrikhande, Anil J., US-Patent Nr. 5321268 vom 14. Juni 1994 durch Crosby, David A. und Ekstrom, Philip A., US-Patent Nr. 5405416 , veröffentlicht am 11. April 1995, Autor: Swinton, Robert J,. US-Patent Nr. 5858761 , veröffentlicht am 12. Januar 1999, Erfinder Tsobukura et al. US-Patent Nr. 5902749 vom 11. Mai 1999, Erfinder Lichtwardt et al. US-Patent Nr. 5908650 , veröffentlicht am 1. Juni, 1999, Erfinder Lenoble et al. US-Patent Nr. 5920429 , veröffentlicht am 6. Juli 1999, Burns et al. US-Patent Nr. 5935808 am 10. August 1999 von Hirschberg et al., US-Patent Nr. 5989135 vom 23. November 1999, Erfinder Welch, David Emanual, US-Patent Nr. 6055936 vom 2. Mai 2000, Collin, Peter Donald, US-Patent Nr. 6056162 vom 2. Mai 2000, Leighley, Kenneth C., US-Patent Nr. 6103006 vom 15. August 2000, Di Pietro, Thomas C., 6110566 vom 29. August 2000, White et al., 6140041 , 31. Oktober 2000, LaClair, James J., 6165384 , 26. Dezember 2000, Cooper et al., 6180154 , 30. Januar 2001, Wrolstad et al. EP 0206718 veröffentlicht am 30. Dezember 1986, Erfinder Cramer, Randall J., IE901379 vom 30. Januar 1991, Lee, Linda G., Mize, Patrick D., WO 9010044 vom 7. Juli 1990, Swindon, Robert J., AU704112 , veröffentlicht am 7. Oktober 1997, Erfinder Burns, David M., Pavelka, Lee A., DE 19755642 vom 24. Juni 1999 von Weimer, Thomas Dr., WO 9938919 , 28. September 1999, Laclair James J., WO 0058406 vom 5. Oktober 2000 von Rosenblum, Barnett B. et al., WO 9938916 vom 15. August 2000, Erfinder DiPietro, Thomas C., WO 9920688 vom 29. August 2000, Erfinder Pavelka, Lee et al., WO 9920688 vom 29. August 2000, Erfinder White et al. Die vielfältige Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen in der molekularbiologischen Forschung, in Industrieanwendungen und Lebensrettungsgeräten etc. werden ebenfalls beschrieben. Collin, P.D., hat in seinen US-Patenten vom 23 Juni 1998, 2. März 1999 und 16. November 1999 mit den jeweiligen US-Patentnummern 5770205 , 5876762 und 5985330 therapeutische Eigenschaften verschiedener Körperteile der Seegurke beschrieben.
  • In einem anderen Patentantrag haben die Erfinder der vorliegenden Patentanmeldung, d.h. Goswami, Usha und Anutosh Ganguly (vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 60/317190 , eingereicht am 6. September 2001) eine neuartige organosilikonische Si-O-R Verbindungsart und mehrfach fluoreszierende Naturfarbstoffe beschrieben, die aus dem Extrakt aus der Körperwandung des Meeresinvertebraten Holothuria scabra gereinigt werden. Die Verbindung ist ein polysaccharides Fluorochrom, das einen phenolischen Fluorophorteil besitzt und durch Sulfatbindungen mit einer es umgebenden Silikonmatrix verbunden ist. Der Silikonanteil ist ein integraler Bestandteil des Kernmoleküls und ist am Metabolismus des Tieres beteiligt. Die Verbindung ist schwefelreich. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung der neuartigen Verbindung und der mehrfach fluoreszierenden Farbstoffe aus einem lebenden Meeresorganismus, insbesondere der Seegurke. Darüber hinaus kann die Verbindung als leicht mischbarer Bestandteil in Zusammensetzungen der Farbstoffindustrie, Kosmetikindustrie und der pharmazeutischen Industrie verwendet werden.
  • Dieses Patent beinhaltet einen großen Teil der Literatur über fluoreszierende Farbstoffe, von denen berichtet wird in „The Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals" von Richard P. Haughland, 6. Ausgabe, gedruckt in den USA 1996. In US- und internationalen Patenten werden viele Derivate der fluoreszierenden Farbstoffe und ihre Synthese offenbart (Haughland, R.P. und Kang, H.C., US-Patent Nr. 4774339 , veröffentlicht am 27. September 1988, Haughland, R.P. und Kang, H.C., US-Patent Nr. 5248782 vom 28. September 1993, Kang, H.C. und Haughland, R.P., US-Patent Nr. 5187288 , veröffentlicht am 16. Februar 1993, Kang, H.C. und Haughland, R.P., im US-Patent Nr. 5274113 vom 28. Dezember 1993 und Kang, H.C. und Haughland, R.P., US-Patent Nr. 5433896 , 18. Juli 1995, Kang, H.C. und Haughland, R.P., US-Patent Nr. 5451663 , veröffentlicht am 19. September 1995, Rosenblum, Barnett B., Spurgeon, S., Lee, Linda G., Benson, Scott C. und Graham, Ronald J., internationales Patent Nr. WO 0058406 , Veröffentlichungsdatum 5. Oktober 2000, berichteten von 4,7-Dichlororhodaminfarbstoffen, die als Molekularsonden verwendbar sind.)
  • Die Antragsteller haben einen anderen Ansatz als in ihren früheren Patenten und denen, über die von anderen Personen berichtet wurde, verfolgt.
  • Die Farbstoffe, von denen in unseren früheren Patenten berichtet wurde, waren, obwohl sie natürlich waren, dennoch toxisch. Die Spektralbereiche von Emissionen bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen waren ebenfalls unterschiedlich. Die Farbstoffe waren toxisch und für In-Situ-Studien an lebenden Zellen ungeeignet. Ihre Anwendungen und Verwendung in den biomedizinischen und Ingenieurswissenschaften waren unterschiedlich.
  • Der Farbstoff, von dem nun berichtet wird, ist ebenfalls ein natürlicher Farbstoff, er ist jedoch ein unpolares mehrfach fluoreszierendes Fluorophor, welches aus den weiblichen Gonaden eines nicht biolumineszierenden Invertebraten extrahiert wird. Bei dem Meerestier handelt es sich um eine Holothurie, eine Seegurke namens Holothuria scabra, die eine neue Quelle für einen unpolaren fluoreszierenden Farbstoff ist. Der Farbstoff ist umweltfreundlich, da anders als bei den synthetischen Farbstoffen keine Zwischenschritte mit starken Säuren oder Alkali zu seiner Herstellung nötig sind. Anders als die zuvor beschriebenen Karotinoid-Pigmente aus den Seegurken-Ovarien ist dieser Farbstoff kein Karotinoidpigment. Es ist ein unpolares Fluorophor, welches leicht vom konjuganten Biomolekül, einem negativ geladenen Protein, trennbar ist.
  • Anders als die meisten synthetischen fluoreszierenden Farbstoffe muss unser Farbstoff nicht mit anderen Farbstoffen gemischt werden, um verschiedene Fluoreszenzfarbtöne bei verschiedenen Wellenlängen zu erhalten. Sie selbst emittieren sechs verschiedenfarbige Fluoreszenzen bei drei verschiedenen Anregungswellenlängen, was auf verschiedene Weise genutzt werden kann. Die Zellkonstituenten zeigen von dem Hintergrund, auf dem nur Farbstofflösung anwesend ist, eine kontrastierende Färbung.
  • Der vorliegende Farbstoff ist zellpermeant und durchdringt Plasmamembran, Cytosol, Nuklearmembran, Nukleoplasma und Chromosomen.
  • Sobald sich der Farbstoff an die Zellmembranen bindet, ist er bei Raumtemperatur über Monate haltbar, bleicht durch Licht nicht aus und wird nicht von Mikroben kontaminiert. Seine Fluoreszenz verschlechtert sich nicht bei hohen und niedrigen Temperaturen, anders als Extrakte einiger Algen und luminiszenten Organismen.
  • Der Farbstoff ist ungiftig für E. coli-Bakterien und die Gonaden und Larven von in flachen Gewässern lebenden Tieren und von Meerestieren. Seine Abwässer schädigen somit keine Meerestiere und in flachen Gewässern lebende Tiere im Larvenstadium. Es ist ein nicht toxischer und umweltfreundlicher Farbstoff.
  • Eine weitere wichtige Eigenschaft des Farbstoffes ist, dass er nur in lebendem und fixiertem Gewebe Fluoreszenz zeigt. Totes (Gewebe, Anm. d. Ü.) wird nicht angefärbt und gibt keine Fluoreszenz. Ein wichtiger Aspekt des Farbstoffes ist seine Bildung von Zusammensetzungen und die Herstellung von Kits zur nichtradioaktiven In-Situ-Markierung von Molekularsonden und zur Gegenfärbung. Bei Anregungen bei verschiedenen Wellenlängen gibt er die äquivalente Wirkung zur Farbe von DAPI, FITC, PI und anderer fluoreszierender Sonden auf dem Markt ab. Der Farbstoff ist ein natürlicher multipler fluoreszierender Farbstoff. In der Tat deckt dieser Einzelfarbstoff die Farben des Wellenlängenspektrums von 123 Fluorochromen ab, die derzeit auf dem Markt bekannt sind (siehe Bitplane Products (Fluorochrome) im Internet (http://www.bitplane.ch/public/support/standard/Fluorochrome.htm).
  • Ein weiterer Aspekt ist seine Verwendung als nicht toxisches Fluorochromfärbemittel in der Epifluoreszenzmikroskopie für die lebenden Zellen. Der Farbstoff ist ein natürlicher Farbstoff und kein synthetischer, der verschiedene Membranen durchdringt und sie differentiell anfärbt. Diese Anwendung bietet eine einfache und schnelle Methode zur Überprüfung von zytogenetischen Präparate für verschiedene Einsatzzwecke, wie Molekulardiagnostik unter Verwendung von fluoreszierenden in-situ-Hybridisierungstechniken, schnelle Diagnose von Biokontamination in Gewebekulturen, Nahrungsmittelindustrie und industrielle Zubereitungen, Fluss-Zytometrie etc.
  • Noch ein weiterer Aspekt des Farbstoffes ist seine Verwendung als Komponente der nicht radioaktiven Markierungskits für fortschrittliche molekularbiologische Anwendungen, wo Proteinfarbstoffe zur Untersuchung von Funktionen lebender Zellen benötigt werden.
  • GEGENSTAND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren der Extraktion, Reinigung und Charakterisierung einer fluoreszierenden Farbstofflösung aus 70%-iger alkoholischer Lösung von Ovargewebe eines Meeresechinoderms. Dies ist ein natürlicher Farbstoff, welcher einen unpolaren färbenden Anteil besitzt. Bioaktiver Extrakt, der einen natürlichen unpolaren und nicht-proteinhaltigen fluoreszierenden Farbstoff enthält, der aus einem alkoholischen Extrakt aus den Quarzellen extrahiert wird und ein Verfahren der Extraktion, Reinigung und Charakterisierung eines fluoreszierenden Pigments aus dem Ovarextrakt eines Meeresechinoderms. Das Pigment ist ein natürlicher Farbstoff, welcher ein unpolares Fluorophor ist. Der Farbstoff emittiert Fluoreszenz in mehreren Fluoreszenzanregungsbereichen im UV- und im sichtbaren Lichtspektrum. Darüber hinaus offenbart sie die chemische, physikalische und epiflu oreszenzmikroskopische Beschaffenheit des Farbstoffes. Man sieht die nicht toxischen, zellmembranpermeablen Eigenschaften.
  • Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen natürlichen, nicht-toxischen, umweltfreundlichen, unpolaren, mehrfarbigen fluoreszierenden Farbstoff aus dem Ovargewebe der Seegurke Holothuria scabra zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren für die Extraktion, die teilweise Reinigung und die Charakterisierung des genannten Farbstoffes von dem Meerestier Holothuria scabra, das ein nicht biolumineszierendes Meeresinvertebrat darstellt, zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, einen Farbstoff verfügbar zu machen, der zellpermeabel ist, eine Demarkation der Zellunterteilung liefert und einen visuellen Effekt auf Einzel- und Mehrfachemissionsbereiche der spektralen Wellenlängen im UV- und sichtbaren Licht hat.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Entwicklung eines Farbstoffes mit hohem Fluoreszenzquantum.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Entwicklung eines Farbstoffes, der im Licht weniger ausbleicht.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Entwicklung eines Farbstoffes mit höherer Lichtechtheit bei Raumtemperatur.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des Farbstoffes zur Überprüfung von Überleben und Wachstum von tierischen Zellen und Bakterienzellen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, Zusammensetzungen unter Verwendung des Farbstoffes, der aus dem Gewebe von Holothuria scabra gewonnen wird, verfügbar zu machen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, einen Farbstoff verfügbar zu machen, der Fluoreszenz bei sechs verschiedenen Wellenlängenbereichen der UV- und sichtbaren Lichtspektra bei besonderer Anregung bei drei verschiedenen Wellenlängen emittiert.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Beobachtung der Fluoreszenz und die sichtbare spektroskopische Analyse und der Bereich der Emissionswellenlängen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Beobachtung der sechs verschiedenfarbigen Fluoreszenzemissionen des Farbstoffes in den UV- und sichtbaren Bereichen von Epifluoreszenzmikroskopie-Würfeln.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Beobachtung des Effektes von Fluoreszenzanfärbung auf die zytogenetischen Objektträger zur Rasterung von Chromosomen, Zellen und Gewebe unter Verwendung des Farbstoffes dieser Erfindung.
  • Noch ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist es, seine nicht toxische Beschaffenheit durch Experimente mit Bakterien zu sehen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, seine nicht toxische Beschaffenheit anhand der Durchführung von Experimenten mit Zellen von Meerestieren zu sehen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ihre Anwendung bei der Überprüfung auf bakterielle Kontaminationen in der Lebensmittelindustrie.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Beobachtung der Fluoreszenz und sichtbare Spektralanalyse und Bereiche der Emissionswellenlängen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, dass der Farbstoff nützlich ist als nicht radioaktive Markierung von fluoreszierenden Molekularsonden.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, dass der Farbstoff im angeregten Licht nicht schnell gelöscht wird und keine Lichtausbleichung während der Rasterung von Objektträgern auftritt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Beobachtung der Fluoreszenz und sichtbare spektroskopische Analyse und des Bereichs der Emissionswellenlängen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, dass der Farbstoff als nicht radioaktive Markierung fluoreszierender Molekularsonden von Nutzen ist.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, dass der Farbstoff bei Raumtemperatur hoch stabil ist, sowohl allein als auch bei Bindung an die Zellmembranen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist, dass sich ihre Fluoreszenzqualität auch bei extrem hohen und niedrigen Temperaturen nicht verschlechtert.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Entwicklung von Kits zur nicht radioaktiven Markierung von Molekularsonden und Gegenfärben.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die industrielle Nutzung des Fluorophors zur Synthese von Biomolekül-Konjuganten für die Fluss-Zytometrie, Microarrays, Immunoassays und etliche andere molekulare Anwendungen gemäß den Anforderungen des Forschers.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung von Kits, die den fluoreszierenden Farbstoff als nicht radioaktive Markierungskits für die in-situ-Hybridisierung für molekulare Sonden enthalten.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung kostengünstiger LIVE/DEAD Lebensfähigkeit/Zytotoxizitätskits für tierische Zellen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung kostengünstiger LIVE/DEAD Lebensfähigkeit/Zytotoxizitätskits für Bakterien.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung kostengünstiger LIVE/DEAD Lebensfähigkeit/Zytotoxizitätskits für Spermien.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung kostengünstiger LIVE/DEAD Lebensfähigkeit/Zytotoxizitätskits für Hefezellen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung kostengünstiger LIVE/DEAD Lebensfähigkeit/Zytotoxizitätskits für tierische Zellen.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung kostengünstiger Bakteriengramfärbung und LIVE/DEAD Lebensfähigkeitskits.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung eines kostengünstigen LIVE Bakteriengramfärbekits.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung eines kostengünstigen Bakterienzählkits.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung kostengünstiger Kits für tierische Zellen mit einfachen Schritten.
  • Noch ein weiterer Gegenstand ist die Entwicklung von Kits, welche den fluoreszierenden Farbstoff zur Nachweis von Zellkulturkontaminierung enthalten.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Spezifität und Zuverlässigkeit. Die lebenden Zellen färben und geben Fluoreszenz, und die toten Zellen zeigen keinerlei Fluoreszenz.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Einzelfarbstoffes in den Kits anstelle der derzeitigen 2 Farbstoffe zur Nachweis lebender/toter Zellen.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Entwicklung von billigeren und ungefährlichen Proliferationsassays als die radioisotopischen Verfahren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Dementsprechend liefert die Erfindung einen bioaktiven Extrakt, der einen natürlichen, nicht polaren und nicht proteinhaltigen fluoreszierenden Farbstoff enthält, der aus dem alkoholischen Extrakt aus Quarzellen eines nicht bioluminiszenten Meeresorganismus namens Seegurke, Holothuria scabra, extrahiert wird.
  • Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Extraktion, Isolation und Charakterisierung des besagten Farbstoffes, der ein Fluorophor ist, welches von einem Prote inkonjuganten abgelöst wird. Der besagte Farbstoff ist teilgereinigt und liegt in Lösungsform vor. Der Farbstoff wurde auf seine nicht toxische Beschaffenheit für lebende tierische und bakterielle Zellen getestet. Die Farbstoffzusammensetzungen werden als fluoreszierendes epifluoreszenzmikroskopisches Färbemittel, als fluoreszierender Farbstoff für vielfältige Anwendungen für die biomedizinische, molekularbiologische, mikrobiologische, zellbiologische und Rekobinationstechnologien etc. und, bei der Formulierung neuer Biomolekül-Konjuganten für Anwendungen in fluoreszierenden Sonden von Nutzen sein.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Nach viel Forschungsarbeit haben die Antragsteller nun einen neuartigen, natürlichen, nicht toxischen, fluoreszierenden Farbstoff identifiziert, der aus dem Gewebe von Meerestieren gewonnen wird, speziell von Invertebraten und noch genauer von der Seegurke Holothuria scabra.
    Unterreich: Metazoa
    Stamm: Echinodermata
    Unterstamm: Eleutherozoa
    Klasse: Holothuroidea
    Unterklasse: Aspidochirotacea,
    Ordnung: Aspidochirota,,
    Familie: Holothuriidae
    Gattung: Holothuria
    Spezies: scabra
  • Die Erfindung liefert darüber hinaus einen natürlichen, unpolaren, mehrfach fluoreszierenden Farbstoff, der aus den Ovarien des Tieres gewonnen wird und der für lebende Zellen ungiftig ist. Sie beschreibt auch die physikalische und chemische Beschaffenheit des Farbstoffes und seine Stabilität in direktem Licht sowie hohen und niedrigen Temperaturen. Der besagte Farbstoff hat sechs farbige fluoreszierende Emissionen bei drei verschiedenen Anregungswellenlängen im UV- und sichtbaren Spektrum des Lichts. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Rasterung von Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop zur schnellen Überprüfung von Kontaminationen und des Zellüberlebens. Die Erfindung beschäftigt sich auch mit der Nutzung des Farbstoffs als nicht radioaktive Markierung für Protein, DNA- und RNA-Molekularsonden für fortschrittliche Molekulardiagnostik, Epifluoreszenzmikroskopie für einfache, doppelte und mehrfache Anfärbung von Chromosomen, Zellen und Gewebe, fluoreszierende in-situ-Hybridisierungsanwendungen, und die Überprüfung auf Biokontamination, in der Aquakultur und den biomedizinischen Wissenschaften für die Verbesserung der Fruchtbarkeit, als Komponenten von Kits wo Studien an lebenden Zellen erforderlich sind, neuartige Fernsensorikgeräte, Unterwassersonden, Lebensrettungsgeräte, zur Markierung des Absturzortes von Flugzeugen, Rettungsbooten und Verteidigungsausrüstung wie z.B. Raketen, zahlreiche Fluoreszenzapplikationen bei Temperaturbedingungen unter Null und viele mehr. Der Farbstoff ist auf die Umwelt bezogen ökofreundlich, da er die Larven von in flachen Gewässern lebenden Tieren und von Meerestieren nicht tötet.
  • Die Erfindung beschreibt einen fluoreszierenden Farbstoff, der aus Meerestieren gewonnen wird, die entweder Sonnenlicht für ihre physiologischen Funktionen absorbieren oder die über längere Dauer dem Sonnenlicht ausgesetzt sind und Fluoreszenzmechanismen bei verschiedenen Wellenlängen entwickelt zu haben scheinen. So wie Phytoplankton, Pikoplankton und photosynthetisierende Bakterien das Sonnenlicht für ihre photosynthetischen Funktionen absorbieren, werden die erforderlichen Wellenlängen der Lichtspektren auf den chemischen Wegen verwendet, und überschüssiges Licht wird nach dem Stokeschen Gesetz emittiert. Die wirbellosen Tiere, die keine äußere Panzerung wie eine Schale haben und sichtbare Verteidigungsorgane, die eine harte und stachelige Haut haben, die ein starkes Endoskelett haben, das aus Knöchelchen besteht, die sesshaft oder von langsamer Mobilität sind, die lange Stunden dem Sonnenlicht ausgesetzt sind, im Sand oder in Felsspalten leben, können Fluoreszenz aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung möchte die Nachteile des Stands der Technik zu überwinden sucht, indem sie hocheffiziente und selektive Methoden zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung eines Farbstoffes aus Meeresinvertebraten verfügbar macht und seine vielfältige Verwendung bei der Herstellung von Kits für die molekulare Diagnostik unter Verwendung von nicht radioaktiven Markierungen, molekularen Markierungen, Epifluoreszenzmikroskopie, als Komponente für neue Instrumente für Land- und Unterwassersonden, Kosmetikindustrie, Nahrungsmittelindustrie, Verteidigungszwecke etc.
  • Die besagte Meeresinvertebrate ist ein Echinoderm, welcher taxonomisch als Holothuria scabra bezeichnet wird und zur Klasse der Holothuroideen gehört. Das Produkt der Erfindung ist ein neuartiger, nicht toxischer, mehrfarbiger fluoreszierender Proteinfarbstoff, über den zum ersten Mal berichtet wird. Die Tiere wurden bei Ebbe an den Küsten der zentralen Westküste von Indien gesammelt, zum Labor gebracht und in Glastanks aufbewahrt, in denen sich Seewasser mit einem Salzgehalt von 30–32% per par befand. Die Tiere waren ausgewachsen und geschlechtsreif. Die taxonomische Position wurde wie oben angegeben identifiziert.
  • In der Tat sind die meisten verfügbaren Farbstoffe synthetischer Art. Es gibt nur 6 Arten von natürlichen Farbstoffen. Dies beinhaltet Farbstoffe, die aus allen lebenden Organismen gewonnen werden. Der fluoreszierende Farbstoff, von dem in der vorliegenden Erfindung berichtet wird, ist der Einzige seiner Spezialität einer mehrfarbigen Fluoreszenz, nicht toxisch, permeant für lebende Zellmembranen, extrahiert aus dem Ovargewebe einer Meeresseegurke und besitzt die Fähigkeit, an Biomoleküle konjugiert zu werden.
  • Bei der Verwendung hier wird der Terminus Farbstoff für eine Farbstofflösung verwendet, die von einem Reduktionsmittel nicht enffärbt wird. Der besagte Farbstoff verleiht Fasern, Zellulose, Zellmembranen etc. Farbe. Er wird als natürlicher Farbstoff bezeichnet, da die Quelle von einem Meerestier stammt, welches üblicherweise in der Natur entlang von Küsten, flachen und tiefen Gewässern der Welt vorkommt, und kein synthetisches Pigment ist. Ein fluoreszierender Farbstoff ist einer, der bei Anregung bei einer bestimmten Wellenlänge während des Übergangs von einem höheren zu einem niedrigeren elektronischen Zustand innerhalb einer sehr kurzen Dauer Licht emittiert.
  • Mehrfarbige Fluoreszenz bedeutet die Emission verschiedenfarbigen Lichts bei Anregung bei verschiedenen Wellenlängenbereichen. Er emittiert blaue, gelblich-grün und orange-rote Fluoreszenzfarbtöne bei Anregung bei verschiedenen Spektren des UV- und sichtbaren Lichts.
  • Zellmembranpermeant bedeutet, dass der Farbstoff die Poren der lebenden Zelle und die Nuklearmembranen der Zelle durchdringt und seine mehrfarbige Fluoreszenz in den Farbtönen von Blau, Bläulichweiß, Grün, Gelborange und orangeartigem Rot bei Anregung bei UV, blauen und grünen Wellenlängenbereichen verleiht.
  • Der Farbstoff färbt nicht die bereits toten Zellen von Tieren und Bakterien.
  • Nicht toxisch für lebende Zellen bedeutet, dass beim Test an lebenden Zellen sowohl von Meerestieren als auch bei Bakterien (E. coli) deren Zellen nicht absterben.
  • Lichtechtheit bei Raumtemperatur bedeutet, dass sich, wenn (der Farbstoff, Anm. d. Ü) bei Raumtemperatur (~28° Celsius) auf dem Tisch belassen wird, die Fluoreszenzqualität nicht verschlechtert. Lichtechtheit des Farbstoffes nach Anbindung an die Zellmembranen bedeutet die Fortsetzung der Fluoreszenzemission nach Anfärbung der lebenden und mit dem besagten Farbstoff fixierten Zellen.
  • Molekulardiagnositk bedeutet hier die Verwendung des Farbstoffes als nichtradioaktive Markierung von molekularen Sonden für In-Situ-Hybridisierungsanwendungen in der molekularen Zytogenetik und als Marker in Microarrays und molekularbiologischen Studien.
  • Die Epifluoreszenzmikroskopie erstreckt sich hier auf mikroskopische Studien zytogenetischer Präparate auf Objektträgern unter Verwendung des vorliegenden Farbstoffes als Färbemittel, und die Aufzeichnung verschiedenfarbiger Fluoreszenz bei Beobachtung unter verschiedenen Würfelkonfigurationen emittiert eine Emission in bestimmter Farbe bei Anregung mit bekannten Fluorochromen. Die Fluorochrom würfe) WUB, WB, WG sind die designierten Filterwürfelkonfigurationen der Olympus BX-FLA Reflexlichtfluoreszenzanbauteile für verschiedene Wellenlängen.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen bioaktiven Extrakt zur Verfügung, der einen nicht polaren und nicht proteinhaltigen fluoreszierenden Farbstoff beinhaltet, der aus dem alkoholischen Extrakt der Quarzellen eines nicht bioluminiszenten Meeresorganismus namens Holothuria scabra gewonnen wird, der in litoralen, überschwemmten, flachen und tiefen Gewässern vorkommt, üblicherweise zahlreich in schattigen Gebieten wie Alkoven, Ritzen, Vorsprüngen, Überhängen, felsigen und sandigen Lebensräumen, von matter bis heller Farbe mit oder ohne Exo- und Endoskelett, sesshaft, sesshafte Drifter, nektonisch mit unterschiedlichem Schwimmvermögen, gewöhnlich nachtaktiv, mit aktivem Beutefangverhalten, mit oder ohne luminiszente und fluoreszierende Pigmente, die von wenigen bis zu allen Wellenlängen im Spektrum von UVB, UVA, sichtbaren Farben und im Infrarotspektrum emittieren.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf den bioaktiven Extrakt, der aus dem Meeresorganismus gewonnen wird, der als fluoreszierender Farbstoff nützlich ist und die folgenden Eigenschaften aufweist:
    • i. keine Entfärbung durch ein Reduktionsmittel,
    • ii. es handelt sich um eine natürliche Verbindung,
    • iii. der Rohextrakt des Farbstoffes hat eine orange Farbe,
    • iv. die halbgereinigte Farbstofflösung hat für das bloße Auge eine hellorange Farbe,
    • v. unter Leuchtstoffröhrenlicht emittiert er eine Vielzahl an Farben des sichtbaren Lichtspektrums,
    • vi. das vom Proteinanteil getrennte Pigment ist in Wasser und Alkohol unlöslich,
    • vii. das teilgereinigte Farbpigment ist in Äther löslich,
    • viii. bei dem Farbstoff handelt es sich um einen unpolaren Farbstoff mit einem pH-Wert von 7,0,
    • ix. kein reduzierbares Chromophor,
    • x. die Farbstofflösung emittiert Fluoreszenzen von sechs verschiedenen Wellenlängen bei 3 verschiedenen Wellenlängen des UV-Bereiches und des sichtbaren Bereiches der Fluoreszenzwürfel eines Epifluoreszenzmikroskops, je nachdem, ob es sich um die Farbstofflösung allein oder um die Zellen handelt, die vom Farbstoff durchdrungen wurden und auf denen er fixiert wurde,
    • xi. es tritt eine blaue Farbe emittierende Fluoreszenz im Bereich von 450 nm–470 nm bei Anregung unter ultraviolettem WU-Würfel im Anregungsbereich von 330–385 nm auf,
    • xii. es tritt eine gelblich-grüne Farbe emittierende Fluoreszenz im Bereich von 510 nm–570 nm bei Anregung unter WB-Würfel im Anregungsbereich von 450–480 nm auf,
    • xiii. es tritt eine orange Farbe emittierende Fluoreszenz im Bereich von 610 nm–650 nm bei Anregung unter WG-Würfel im Anregungsbereich von 510 nm–550 nm auf,
    • xiv. der Farbstoff emittiert Farbnuancen gelblicher Grautöne unter der normalen Durchlichtlampe des Epifluoreszenzmikroskops bei Betrachtung unter einem Ölobjektiv mit 100-facher Vergrößerung,
    • xv. der Farbstoff emittiert Fluoreszenzfarben selbst bei einer Verdünnung im Bereich vom 1:40.000
    • xvi. der Extrakt behielt bei Lagerung bei ca. 4° Celsius seine Fluoreszenz sogar bis zu einem Jahr,
    • xvii. die Fluoreszenz des Farbstoffes ist hoch lichtecht und wird durch lang anhaltende, direkte Lichteinwirkung nicht beeinträchtigt,
    • xviii. die Fluoreszenz des Farbstoffs ändert sich selbst beim Einfrieren bei –20° Celsius nicht, einer Temperatur, bei der die Moleküle, wie bei Extrakten aus lumineszierenden Organismen, nicht dazu fähig sind, die für die Aktivierung erforderliche Energie zu erreichen,
    • xix. der Farbstoff ist für lebende Eukaryontenzellen und Prokaryontenzellen (E. coli) ungiftig,
    • xx. der Farbstoff ist für Zellmembranen durchlässig,
    • xxi. der Farbstoff ist für tote Eukaryontenzellen und tote Prokaryontenzellen undurchlässig und
    • xxii. der Farbstoff ist selbst nach dem Färben der Zellbestandteile nicht abbaubar.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die mehrfarbigen Emissionen des Farbstoffs bei verschiedenen Anregungswellenlängen mit den fluorochromen mikroskopischen Färbemittel, die auf dem Markt verfügbar sind, vergleichbar.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die blaue Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffes vergleichbar mit der Emission derselben Farbe durch DAPI Fluorochrom bei Anregung mit derselben Wellenlänge, welches als Komponente der nicht radioaktiven Markierungskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist die gelbe Fluoreszenz des Farbstoffes unterhalb des sichtbaren Bereiches vergleichbar mit den Emissionen derselben Farbe von Auramin, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist die gelbe Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im sichtbaren Bereich vergleichbar mit den Emissionen derselben Farbe von FITC, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nach weiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt einen Farbstoff zur Verfügung, der eine orange Fluoreszenzemission besitzt, vergleichbar mit der orangen Fluoreszenz von Propidiumjodid-Fluorochrom, welches als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt einen Farbstoff zur Verfügung, der eine orange Fluoreszenzemission besitzt, vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe von Rhodaminfluorochrom, welches als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt einen Farbstoff zur Verfügung, der eine orange Fluoreszenzemission besitzt, vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe von TRITC-Fluorochrom, welches als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt einen bei Raumtemperatur stabilen Farbstoff mit langer Lagerhaltbarkeit zur Verfügung.
  • Als eine weitere Ausführungsform der Erfindung können die molekularen und radioaktiven Kits des besagten Farbstoffes bei Raumtemperatur exportiert werden.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung liefert einen Farbstoff, der die Eigenschaften von mindestens einhundert verschiedenen Fluorochromen hat, die auf dem Markt erhältlich sind, namentlich DAPI, Hoechest 33258, Hoechest 33342, FITC, Akridinorange, Auramin, Rhodamin, TRITC, und Propidiumjodid etc.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt einen Farbstoff zur Verfügung, der in allen Anwendungen an Stelle von Phycobiliproteinen benutzt wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, mit dem genannten Farbstoff unter dem Auflicht eines Fluoreszenzmikroskopes bei 10-facher Vergrößerung, produzieren die blaugrauen Farbtöne eine Phasenkontrastwirkung, die sehr hilfreich ist bei der schnellen Rasterung zytogenetischer, zytologischer und histochemischer Objektträger, und Kosten für die zusätzliche Phasenkontrastausstattung von Mikroskopen einspart.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen mit dem besagten Farbstoff unter einem Ölobjektiv mit 100-facher Vergrößerung unter einem gewöhnlichen Durchlichtmikroskop die Proteine von Dotter, Nukleoplasma und Chromatin von Zellen, die sich aktiv in der Zellteilung befinden, verschiedene Farbtöne auf, der erstere braungelb, der letztere gelb und die letzte Zellkomponente blau, was für schnelle Bioassays von Nutzen ist, da der Effekt auf die verschiedenen histochemischen Bestandteile der Zelle beobachtet werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung folgen die Fluoreszenzemissionsfarben dem Stokeschen Fluoreszenzgesetz.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung zeigen die Mikrofotografien mit Kodak-Filmrollen Farbtöne der benachbarten Farbemissionwellenlänge, zum Beispiel blaue Fluoreszenz unter der Epifluoreszenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen die Mikrofotografien mit Kodak-Filmrollen Farbtöne der benachbarten Farbemissionswellenlänge auf, man findet bei gelber Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikroskop in der Mikrofotografie auch die grünen Farbtöne.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann man unter dem Epifluoreszenzmikroskop auf der Mikrofotografie orange Fluoreszenzfarbe sehen, rote Farbtöne sind ebenfalls zu finden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ergibt sich bei den zytogenetischen Objektträgern bei Betrachtung unter allen Fluoreszenzen einen Kontrasteffekt von Zellen und Zellkomponenten gegenüber der Hintergrundfarbe, wo kein Objekt, sondern nur der Farbstoff vorhanden ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liefert der Farbstoff, in Wasser mit einem Verhältnis über 1:450.000 bis 1:900.000 gelöst, Fluoreszenz in sechs Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung liefert Zusammensetzungen, welche einen bioaktiven Extrakt enthalten, der aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, zusammen mit passenden Additiven für die folgenden nützlichen Anwendungen:
    • i. Präparation von fluoreszierenden Zusammensetzungen zur Farbbeschichtung und Tinten, die bei einer Vielzahl von Farben, Tinten und Textilien hilfreich sind,
    • ii. als fluoreszierende Molekularsonde in In-Situ-Hybridisierungskits für die Molekulardiagnostik,
    • iii. Verwendung in Experimenten, bei denen verschiedene Anwendungen mit Fluoreszenzfarbstoffen in Feldstationen ausgeführt werden müssen, die in Gebieten mit Minustemperaturen liegen,
    • iv. hilfreich als Fluorochromfärbemittel für die Epifluoreszenzmikroskopie,
    • v. hilfreich als zelldurchdringende Farbstoffzusammensetzungen,
    • vi. eine Zusammensetzung eines Fluoreszenzfarbstoffes zum Bleichen und Aufhellen von Polymeren,
    • vii. Leckerkennung mit einem vollspektralen Fluoreszenzfarbstoff,
    • viii. Verwendung in automatisierten Messsystemen,
    • ix. zur Markierung des Standortes von abgestürzten Flugzeugen, Rettungsinseln und -ausrüstungen wie beispielsweise Raketen,
    • x. Unterseesonden,
    • xi. Bestandteil eines Chromatophoren-Sonnenfilters in Kosmetikcremes und -lotionen,
    • xii. fluoreszierender Bestandteil eines In-Situ-Hybridisierungskits für die Molekulardiagnostik,
    • xiii. Bestandteil der nichtradioaktiven Markierungs- und Nachweiskits für die Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und die Molekularbiologie zur Markierung von DNA, RNA, Proteinen und Enzymen,
    • xiv. Immunofluoreszenznachweis
    • xv. Gegenfärbemittel von DIG-markierten Oligonukleotidsonden und Anti-DIG-Fab-Fragmenten
    • xvi. einfache und mehrfache flusszytometrische Anwendungen,
    • xvii. fluorochromes Färbemittel für die Epifluoreszenzmikroskopie,
    • xviii. für eine schnelle Biokontaminationskontrolle in der Reformkostindustrie, der Kosmetikindustrie, der pharmazeutischen und der chemischen Industrie,
    • xix. für schnelle Schätzungen von Biokontaminanten in Laborkulturen,
    • xx. für einen Schnelltest auf Bioverunreinigungen unter Feldbedingungen,
    • xxi. für einen Schnelltest auf tote und lebende E. coli-Bakterien,
    • xxii. als natürlicher Farbstoff,
    • xxiii. eine bioaktive Zusammensetzung eines Fluoreszenzfarbstoffes im Verhältnis 1:400.000 in Äther ist ausreichend zur Herstellung von sechs verschiedenen Fluoreszenzen bei drei verschiedenen Wellenlängen und einer Phasenkontrastwirkung unter Durchlicht,
    • xxiv. ein Farbstoff für verschiedene in Gebieten mit Minustemperaturen eingesetzte Fluoreszenzanwendungen,
    • xxv. ein Farbstoff zur Herstellung von Konjuganten für eine Vielzahl von Biomolekülen,
    • xxvi. für zeltdurchdringende Membranfarbstoffzusammensetzungen,
    • xxvii. zur Identifizierung von toten und lebenden Zellen in Gewebekulturen,
    • xxviii. für Farbstoffzusammensetzungen in Biosensoren,
    • xxix. als Farbstoffzusammensetzung in Molekularkits und mikrobiologischen Kits, und
    • xxx. ein unpolarer Farbstoff zum Nachweis von Lipiden und Ölen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf das Verfahren zur Präparation eines bioaktiven Extraktes, der einen natürlichen Farbstoff, aus der Seegurke Holothuria scabra enthält. Der besagte Prozess umfasst folgende Schritte:
    • a) Sammeln der Meeresorganismen an der Meeresküste,
    • b) Lagerung des Organismus über Nacht in mit Seewasser gefüllten Tanks ohne jegliche mechanische Belüftung,
    • c) Zerlegen der gewaschenen Tiere und Entfernen der weiblichen Keimdrüsen,
    • d) Extraktion mittels 70-prozentigen Äthylalkohols zum Erhalten einer gelblich-orangen Lösung,
    • e) 3–4-malige Wiederholung des Extraktionsschrittes zum Erhalten einer gefärbten Lösung,
    • f) Filtrierung der oben genannten Lösung durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 zum Erhalten eines teilgereinigten Extrakts,
    • g) Lösen des in Schritt (f) erhaltenen Extraktes in Lösungsäther, und
    • h) Filtrierung durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 zum Erhalten einer klaren, gelb gefärbten Lösung namens „unpolare Fluoreszenzfarbstofflösung".
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die besagte Lösung weiter mit Wasser/Meerwasser verdünnt, im Verhältnis 1:400.000 bis 1:900.000 ergibt sich Fluoreszenz in sechs Farben bei drei verschiedenen Anregungswellenlängen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Bioassays unter Verwendung einer Verdünnung des bioaktiven Extrakts im Bereich 1:450.000, 1:200.000, 1:100.000, 1:50.000 und 1:25.000 zur Bewertung der Ungiftigkeit des Farbstoffes beim Überleben eukaryotischer und prokaryotischer Zellen durchgeführt.
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Methode zur Extraktion, Teilreinigung und Charakterisierung eines natürlichen, unpolaren, ungiftigen, zellmembranpermeablen, mehrfach fluoreszierenden Farbstoffes. Sie liefert darüber hinaus Zusammensetzungen, in denen der Farbstoff lebende eukaryotische und prokaryotische Zellen nachweisen kann, ohne sie zu töten, und sie umfasst:
    • • Sammeln des Materials aus dem Feld und Halten unter Laborbedingungen,
    • • Extraktion des Pigments aus dem 70-%igen alkoholischen Extrakt der Ovarien eines Stachelhäuters, der Seegurke
    • • Holothuria scabra, und Teilreinigung des Farbstoffes,
    • • Testen von biologischen Aktivitäten.
  • Der bioaktive Extrakt der Erfindung wird aus einem 70%-igen alkoholischen Extrakt aus dem Ovargewebe der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen. Der Extrakt ist als natürlicher fluoreszierender Farbstoff verwendbar und besitzt die folgenden Eigenschaften:
    • 1) keine Entfärbung durch ein Reduktionsmittel,
    • 2) keine synthetische Verbindung,
    • 3) der Rohextrakt des Farbstoffes ist von gelb-oranger Farbe,
    • 4) es gibt zwei Extraktionsschritte des Farbstoffes aus den Quarzellen, d.h. in Schritt – 1 wird die alkoholische Lösung extrahiert und zur Evaporation stehen gelassen, und in Schritt 2 wird der trockenen Masse Lösungsäther hinzugefügt und durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert,
    • 5) er produziert eine Farbstofflösung, welche teilgereinigtes Fluorophor enthält,
    • 6) die Farbstofflösung ist von helloranger Farbe,
    • 7) unter Leuchtstoffröhrenlicht emittiert er eine Vielfalt an Farben des sichtbaren Lichtspektrums,
    • 8) das Pigment ist in Wasser und Alkohol unlöslich,
    • 9) das reine Farbstoffpigment ist in Lösungsäther löslich, die weiteren Verdünnungen können mit Hilfe der angegebenen Vorgehensweise hergestellt werden,
    • 10) ist ein unpolarer Farbstoff,
    • 11) besitzt einen pH-Wert um 7,
    • 12) gibt keine reduzierbare Gruppe,
    • 13) das Fluorophor ist mit dem Protein verbunden, welches beim Erhitzen und der Koagulation entfernt wird,
    • 14) Farbstoff in Lösung emittiert sechs verschiedenfarbige Fluoreszenzen bei 3 verschiedenen Wellenlängen im UV- und sichtbaren Bereich der Fluoreszenzwürfel eines Epifluoreszenzmikroskops, abhängig davon, ob es sich um den Farbstoff allein oder die Zellen handelt, an welche er sich gebunden hat,
    • 15) blaue Fluoreszenzemission tritt im Bereich von 450 nm–470 nm bei Anregung unter dem WU-Ultraviolettwürfel im Anregungsbereich –330 nm–385 nm auf,
    • 16) gelblich-grüne Fluoreszenzemission tritt im Bereich 510 nm–570 nm bei Anregung unter dem WB-Würfel im Anregungsbereich 450 nm–480 nm auf,
    • 17) orange Fluoreszenzemission tritt im Bereich 610 nm–650 nm bei Anregung unter dem WG-Würfel im Anregungsbereich 510 nm–550 nm auf,
    • 18) der Farbstoff emittiert gelblich-graue Farbtöne unter der gewöhnlichen Durchlichtlampe des Epifluoreszenzmikroskops bei 100-facher Vergrößerung mit Ölobjektiv,
    • 19) der Farbstoff emittierte diese Fluoreszenzfarben sogar bei einer Verdünnung von 1:400.000 bis 1:900.000 und darüber hinaus,
    • 20) der Extrakt behielt bei Lagerung bei ca. 4° Celsius seine Fluoreszenz sogar mindestens über ein Jahr hinaus,
    • 21) die Fluoreszenz des Farbstoffes ist hoch lichtecht und wird auch durch lang anhaltende, direkte Lichteinwirkung nicht beeinträchtigt, wenn die Zellen erst einmal sogar bei Raumtemperatur gleichmäßig angefärbt sind,
    • 22) die Fluoreszenz des Farbstoffes ändert sich selbst beim Einfrieren bei minus 20° Celsius nicht, einer Temperatur, bei der die Moleküle, wie bei Extrakten aus lumineszierenden Organismen, nicht dazu fähig sind, die für die Aktivierung erforderliche Energie zu erreichen,
    • 23) der Farbstoff ist für lebende Eukaryontenzellen ungiftig,
    • 24) der Farbstoff ist auch für Prokaryonten (E. coli) ungiftig,
    • 25) der Farbstoff durchdringt Zellmembranen,
    • 26) der Farbstoff durchdringt nicht die Zellmembran toter tierischer Zellen,
    • 27) der Farbstoff durchdringt nicht die Zellmembran toter E. coli-Bakterien,
    • 28) der Farbstoff ist ein nicht abbaubares Färbemittel der Zellmembranen.
  • Die physikalischen und anderen Eigenschaften des Farbstoffes können anhand des folgenden Schrittes bewertet werden:
    • a) Farbe und Löslichkeit des Farbstoffes,
    • b) Lichtechtheit,
    • c) Lichtausbleichung,
    • d) Ungiftigkeit,
    • e) selektive Anfärbung von Zellmembranen,
    • f) Physikalischer Emissionstest unter einem UV-Transiluminator im Bereich 260–280 nm,
    • g) Präparation des Objektträgers mit lebenden Austereiern und -spermien,
    • h) Präparation von Objektträgern lebender Bakterien,
    • i) Präparation der fixierten Zellen mittels der Lufttrocknungsmethode,
    • j) Anfärben der Objektträger mit Farbstoff,
    • k) Kontrolle für jedes Experiment ohne Verwendung von Farbstoff,
    • l) Epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der lebenden Eukaryontenzellen unter den Fluorochromwürfeln WU, WB, WG und im Auflicht,
    • m) Epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der fixierten Eukaryontenzellen unter den Fluorochromwürfeln WU, WB, WG und im Auflicht,
    • n) Epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der toten Eukaryontenzellen unter den Fluorochromwürfeln WU, WB, WG und im Auflicht,
    • o) Epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der lebenden Bakterienzellen unter den Fluorochromwürfeln WU, WB, WG und im Auflicht,
    • p) Epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der toten Bakterienzellen unter den Fluorochromwürfeln WU, WB, WG und im Auflicht,
    • q) Epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der lebenden Kontrollzellen ohne Farbstoff unter den Fluorochromwürfeln WU, WB, WG und im Auflicht,
    • r) Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in den Bereichen des Objektträgers ohne jegliche Zellen,
    • s) Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz der zytogenetischen Objektträger unter den Fluorochromwürfeln WU, WB, WG und im Auflicht,
    • t) Überprüfen der Wellenlängenbereiche der fluoreszenten Farbtöne der Emission und der Wellenlängenbereiche der Anregungsbereiche der Fluorochromwürfel mit Farbstoff,
    • u) Überprüfen der Wellenlängenbereiche der fluoreszenten Farbtöne der Emission und der Wellenlängenbereiche der Anregungsbereiche der Fluorochromwürfel bei den mit Farbstoff eingefärbten Zellen, und
    • v) Überprüfen der Zellmembranpermeabilität der Plasmamembran, des Zytoplasmas, der Nuklearmembran und der Chromosomen.
  • Somit stellt die Erfindung einen unpolaren natürlichen Fluoreszenzfarbstoff meerestierischen Ursprungs zur Verfügung, welcher bei Anregung bei drei verschiedenen Wellenlängenbereichen im UV- und sichtbaren Licht der Spektralwürfel eines Epifluoreszenzmikroskops sechs verschiedenfarbige Fluoreszenzen emittiert, in den Farbtönen Blau, Gelb und Orangerot. Der Emissionsbereich der Farbstofflösung und der Zellen, die mit dem Farbstoff angefärbt werden, ist unterschiedlich. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf auf die Epifluoreszenzmikroskopie eukaryotischer und prokaryotischer lebender, fixierter und toter Zellpräparate unter Verwendung dieses Farbstoffes als epifluoreszenten mikroskopisches Färbemittel. Dieser Farbstoff könnte bei der Herstellung nicht radioaktiver Markierungskits für die Molekulardiagnostik durch fluoreszente In-Situ-Hybridisierung in zahlreichen molekularen, biomedizinischen und ingenieurtechnischen Wissenschaften Verwendung finden.
  • In einer Ausführungsform ist die Quelle des Farbstoffes ein wirbelloses Meerestier, welches zum Unterreich Metazoa, Stamm Echinodermata, Unterstamm Eleutherozoa und Klasse Holothuroidea gehört. Name: Holothuria scabra.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Holothuria scabra aus der Gruppe ausgewählt, welche die Seegurken umfasst und weit verbreitet an den Küsten, in flachen und tiefen Gewässern weltweit, insbesondere im Indopazifik, vorkommt. Die nächsten wohlbekannten Verwandten der Seegurke sind Seeigel und Seesterne etc.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Holothuria scabra zerteilt und ihre Ovarien herausgetrennt und gewogen. In Schritt 1 wird zu 1 mg Ovarialgewebe (Nassgewicht) 3 mal 3 ml 70%-iger Alkohol hinzugefügt. Dies wird als 70%-iger alkoholischer Extrakt von Ovarialgewebe bezeichnet.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird in Schritt 2 in der Lösung durch Erhitzen das Protein koaguliert, und der Alkohol verdampft. Die Trockenmasse löst sich nur in unpolarem Lösungsäther.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die farbige Lösung teilweise mittels Filtrierung durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 gereinigt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Schraubverschlussfläschen, in dem sich die Farbstofflösung befindet, mit „unpolare Farbstofflösung" gekennzeichnet und in einem kalten Raum bei 4° Celsius aufbewahrt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Farbe der Farbstofflösung mit bloßem Auge und unter Leuchtstoffröhrenlicht festgestellt.
  • In einer weiteren Ausführungsform bemerkt man, dass der Farbstoff in Äther löslich ist. Die weiteren Verdünnungen für Experimente können mit den folgenden Verfahren hergestellt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Lichtechtheit des Farbstoffes bei Raumtemperatur in der Lösung und bei den angefärbten Zellen festgestellt.
  • Es zeigte sich, dass der Farbstoff sowohl bei Raumtemperatur als auch, wenn er sich an die Zellmembranen haftet, nicht abbaubar ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Test zur elektrischen Ladung des Farbstoffes durch Elektrophorese durchgeführt, der gelbe Punkt zeigte unpolares Verhalten und bewegt sich zu keinem der Pole hin.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Pigment ein Farbstoff, da er das Filterpapier färbt und die Zellmembranen anfärbt.
  • In einer weiteren Ausführungsform hat der Farbstoff einen pH-Wert von 7,0.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde 1 ml der Farbstofflösung vom 70%-igen alkoholischen Extrakt, aus welchem der vorliegende Farbstoff isoliert wird, genommen und 0,2 Gramm Dithioerythriol beigemengt. Die Lösung wird nicht entfärbt. Es zeigte sich, dass die reduzierbare Gruppe im färbenden Teil der Lösung nicht vorhanden ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurden 9 ml des 70%-igen alkoholischen Extrakts, aus welchem der vorliegende Farbstoff isoliert wird, in einem Wasserbad bei 100° Celsius erhitzt. Es wurde Koagulation beobachtet, was das Vorhandensein von Protein aus der Stufe 1-Lösung des Farbstoffs bestätigte.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der farbige Teil nach Entfernung des Proteins aus dem Ausgangsmaterial abgetrennt und löst sich nur in Äther.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde der alkoholische Extrakt dem Anthron-Test (Ref) unter Verwendung von 4 ml Schwefelsäure und Anthronreagens unterzogen. 1 ml Wasser, 4 ml konzentrierte Schwefelsäure und der Anthronreagens wurden als Leerprobe behalten. Die Leerprobe war nach 5 Minuten schwach grün, wohingegen der Extrakt nach 5 Minuten hellgrün wurde. Der Test bewies eine Kohlehydrat-Präsenz im alkoholischen Extrakt.
  • Die Fluoreszenzaktivität der Farbstofflösung beruht auf einer farbigen Komponente, welche unpolares Fluorophor beinhaltet, das an ein negativ geladenes Protein gebunden ist, und sich leicht abtrennt, wenn das Protein koaguliert wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde ein Test auf Ungiftigkeit des Farbstoffes beim Überleben von Eukaryontenzellen durchgeführt.
  • Der Farbstoff wurde an Austernspermien auf Zytotoxizität getestet. Das Überleben der Spermien im Experimentaufbau wurde als Parameter für den Beweis der Ungiftigkeit herangezogen. Die männlichen Keimzellen einer Auster wurden entfernt, und die Spermien in 100%-iges Salzwasser gegeben. Diese wurden durch einen Zellstofffilter filtriert, um jegliche Ablagerungen zu entfernen. Es wurde 1 Milliliter (ml) der Spermienlösung genommen und verschiedene Konzentrationen (1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl und 5 μl) der Farbstofflösung hinzugefügt. Jede halbe Stunde wurde das Überleben der Spermien unter einem Mikroskop beobachtet. Das Experiment wurde über 24 Stunden fortgeführt. Das Kontrollpräparat wurde ohne Beigabe von Farbstoff aufbewahrt. Es wurde beobachtet, dass das Hinzufügen des Farbstoffes keine Auswirkung auf die Überlebensrate der Spermien hatte. Dies beweist die Ungiftigkeit des Farbstoffs.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde ein Ungiftigkeitstest des Farbstoffs zum Überleben von Prokaryonten durchgeführt. Der Extrakt wurde auf Zytotoxizität für gramnegative E. coli-Bakterien durch Beobachtung ihres Überlebens oder ihrer Sterblichkeit durchgeführt. Ein Tropfen lebender E. coli-Bakterien in Wasser (50 μl) wurde auf einen Objektträger aufgebracht. Dazu wurden 0,5 μl–1,0 μl Ätherextrakt hinzugefügt.
  • Die Mischung wurde mit Hilfe der Rührnadel gemischt. Der Objektträger war zum Schutz vor Verdampfung versiegelt. Unter dem Mikroskop war zu sehen, dass die Bakterien 24 Stunden überlebten, solange sie in der Lösung verblieben. Sie starben bei Austrocknung der Lösung. Es wurden Kontrollexperimente durchgeführt. Dies bewies, dass der Farbstoff für Bakterien ungiftig ist. In einer weiteren Ausführungsform zeigen die Bakterien kein Agglutinationsverhalten. In einer weiteren Ausführungsform zeigen weder Austerneier noch Spermien Agglutinationsverhalten.
  • Die Antragsteller untersuchten die Beschaffenheit des Farbstoffes und fanden heraus, dass er mehrfarbig emittierte bei verschiedenen Anregungswellenlängen, welche mit den fluorochromen Mikroskopiefärbemitteln, die bereits auf dem Markt sind, vergleichbar sind. Die blaue Fluoreszenz des vorliegendes Farbstoffes ist mit der Emission der selben Farbe von DAPI Fluorochrom bei der selben Anregungswellenlänge vergleichbar, welches als Komponente in nicht radioaktiven Markierungskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird. Die gelbe Fluoreszenz des besagten Farbstoffes im sichtbaren Bereich ist mit den Emissionen derselben Farbe von Auramin, welches als Komponente in nicht radioak tiven Markierungs- und Nachweiskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird, vergleichbar.
  • Die gelbe Fluoreszenz des besagten Farbstoffes im sichtbaren Bereich ist mit den Emissionen derselben Farbe von FITC, welches als Komponente in nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird, vergleichbar.
  • Die orange Fluoreszenzemission ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe von Propidiumjodidfluorochrom, welches als Komponente in nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird, vergleichbar.
  • Die orange fluoreszierende Emission ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe von TRITC-Fluorochrom, welches als Komponente in nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird, vergleichbar.
  • Der Farbstoff ist bei Raumtemperatur stabil und lange lagerfähig. Die molekularen und radioaktiven Kits mit dem besagten Farbstoff können bei Raumtemperatur exportiert werden. Der Farbstoff weist Merkmale von mindestens einhundertunddreiundzwanzig verschiedenen Fluorochromen auf, nämlich DAPI, Hoechest 33258, Hoechest 33342, FITC, Akridinorange, Auramin, Rhodamin, TRITC, und Propidiumjodid etc., die sich zur Zeit auf dem Markt befinden (Bitplane Products). Bei dem Farbstoff erzeugen unter normalem Mikroskoplicht die Grautöne eine Phasenkontrastwirkung, welche beim schnellen Rastern zytogenetischer, zytologischer und histochemischer Objektträger verwendet werden kann und Kosten für die zusätzliche Phasenkontrastausstattung von Mikroskopen einspart. Die Fluoreszenzfarbe folgt dem Stokeschen Fluoreszenzgesetz.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Epifluoreszenzstudien unter Verwendung dieses Farbstoffs als Färbemittel in Verdünnungen von mehr als 1:400.000 durchgeführt, wobei die Lichtemissionen bei Anregung durch verschiedene Würfel aufgezeichnet und mit den Farbtönen der bekannten Fluorochrome verglichen wurden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde die Rasterung unter Anregung mit UV-Licht und den sichtbaren Lichtspektren mit den WU, WB, WG und BF-Würfeln des Olympus-Reflexlichts durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform beträgt der Wellenlängenbereich des WU-Würfels 330 nm–385 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform beträgt der Wellenlängenbereich des WB-Würfels 450 nm–480 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform beträgt der Wellenlängenbereich des WG-Würfels 510 nm–550 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist BF für das Auflicht, wobei eine gewöhnliche Wolframlampe das Licht liefert.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurden die Emissionbereiche des Farbstoffes bei verschiedenen Anregungswellenlängen herausgefunden. Der Hintergrund der Eier auf den epifluoreszenzmikroskopische Fotografien zeigt die Emissionsfarbe des Farbstoffs.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde beobachtet, dass Anregung mit dem WU-Bereich 330 nm–385 nm Fluoreszenz im Bereich 450 nm–470 nm emittiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde bei Anregung mit dem WB-Filter in einem Spektralbereich von 450 nm–480 nm Fluoreszenz im Bereich 510 nm–570 nm emittiert
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde bei Anregung mit dem WG-Filter im Spektralbereich von 510 nm–550 nm Fluoreszenz im Bereich 610 nm–650 nm emittiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform mit BF wurden die gelblich-grauen Farbschattierungen beobachtet.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurden die Emissionsbereiche des Farbstoffes nach Anfärbung der Zellmembranen bei verschiedenen Wellenlängen herausgefunden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde der Farbstoff als fluoreszenzmikroskopisches Färbemittel bei den toten, lebenden und fixierten Zellen der Auster verwendet. Die Objektträger wurden unter einem Epifluoreszenzmikroskop gerastert. Es wurde beobachtet, dass die toten Zellen den Farbstoff nicht aufnehmen und keine Fluoreszenz aufweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde der Farbstoff als fluoreszenzmikroskopisches Färbemittel bei lebenden Austerneiern verwendet. Die Objektträger wurden unter einem Epifluoreszenzmikroskop gerastert. Es wurde beobachtet, dass die lebenden Zellen Fluoreszenz aufweisen. Der Spektralbereich der Anregung und die emittierte Fluoreszenz folgten streng dem Stokeschen Gesetz. Diese Bereiche unterschieden sich von den Emissionsbereichen des Farbstoffes, welcher den Hintergrund der fluoreszierenden Zelle darstellt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde der Farbstoff als fluoreszenzmikroskopisches Färbemittel auf die fixierten Austerneier in einem Fixativ mit 3:1 Ethanol und Essigsäure angewendet. Die Objektträger wurden unter einem Epifluoreszenzmikroskop gerastert. Es wurde beobachtet, dass die fixierten Zellen Fluoreszenz aufweisen. Der Spektralbereich der Anregung und die Fluoreszenz folgten streng dem Stokeschen Gesetz. Diese Bereiche unterschieden sich von den Emissionsbereichen des Farbstoffes, welcher den Hintergrund der fluoreszierenden Zelle darstellt.
  • In einer weiteren Ausführungsform führte Anregung mit dem WU im Bereich 330 nm–385 nm zu einer Fluoreszenzemission der Zellen im Bereich von 470 nm–500 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform führte Anregung mit dem WB-Filter mit einem Spektralbereich von 450 nm–480 nm zu einer Fluoreszenzemission im Bereich 570 nm–610 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform führte die Anregung mit dem WG-Filter mit einem Spektralbereich 510 nm–550 nm zu einer Fluoreszenzemission im Bereich 610 nm–650 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform emittierte die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der toten Eier im Auflicht Licht im vollständigen weißen Bereich des sichtbaren Spektrums, und in Abhängigkeit von der Dichte der Zelle ergaben die Zellsubstanzen gelblich-graue Farbtöne, wie eine Phasenkontrastwirkung.
  • In einer weiteren Ausführungsform emittierte die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der lebenden Eier unter Auflicht Licht im vollständigen weißen Bereich des sichtbaren Spektrums, und in Abhängigkeit von der Dichte der Zelle ergaben die Zellsubstanzen gelblich-graue Farbtöne, wie eine Phasenkontrastwirkung.
  • In einer weiteren Ausführungsform emittierte die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der fixierten Eier (3:1 Ethanol: Essigsäurefixativ) unter Auflicht Licht im vollständigen weißen Bereich des sichtbaren Spektrums, und in Abhängigkeit von der Dichte der Zelle ergaben die Zutaten gelblich-graue Farbtöne, wie eine Phasenkontrastwirkung.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde der Farbstoff als mikroskopisches Färbemittel für die E. coli angewendet. Ein Ring lebender E. coli-Bakterien wurde in 50 Mikroliter Wasser auf einen Objektträger aufgebracht und gemischt. Dazu wurden 0,5–1 Mikroliter (μl) der Farbstofflösung zum äußeren Tropfenrand der Bakterienlösung hin beigefügt. Den Äther in dem Extrakt ließ man sich verflüchtigen, indem der Objektträger für ca. 4–5 Sekunden auf dem Tisch belassen wurde. Dann wurden beide Tropfen vermischt, ein Abdeckplättchen auf der Probe platziert und sofort versiegelt. Ein Kontrollpräparat mit Bakterienlösung in Wasser ohne Farbstoff wurde auf ähnliche Weise hergestellt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurden beide Objektträger unter dem Ölobjektiv eines Epifluoreszenzmikroskops (Objektiv mit 100-facher Vergrößerung, Augenlinse mit 10-facher Vergrößerung) zur Überprüfung der Fluoreszenz gerastert. Es wurde festgestellt, dass die toten Zellen keinen Farbstoff aufnehmen und keine Fluoreszenz aufweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wiesen die Bakterienzellen Fluoreszenz auf. Der Spektralbereich der Anregung und die Wellenlängen der emittierten Fluoreszenz folgten streng dem Stokeschen Gesetz.
  • Diese unterschieden sich von der Farbstofflösung und waren wie im Folgenden angegeben:
    In einer weiteren Ausführungsform führte Anregung mit WU im Bereich 330 nm–385 nm zu einer Fluoreszenzemission im Bereich 470 nm–500 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform führte Anregung mit dem WB-Filter im Spektralbereich 450 nm–480 nm zu einer Fluoreszenzemission der Zellen im Bereich 570 nm–610 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform führte Anregung mit dem WG-Filter im Spektralbereich 510 nm–550 nm zu einer Fluoreszenzemission der Zellen im Bereich 610 nm–650 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform zeigten die Kontroll-E. coli ohne Farbstoff ebenfalls keine Fluoreszenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde eine Mikrofotografie der Objektträger durchgeführt, bei denen der Farbstoff als epifluoreszenzmikroskopisches Färbemittel verwendet wurde.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in den Bereichen der Objektträger mit Zellen und des umgebenden Hintergrunds, welcher die Farbemissionen darstellte, die nur auf den Farbstoff zurückzuführen sind, unter WU im Bereich 330 nm–385 nm, mit Kodak Film, Geschwindigkeit 400 ASA, mit variierender Belichtungszeit von 50 bis 60 Sekunden durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in den Bereichen der Objektträger mit Zellen und des umgebenden Hintergrunds, welcher die Farbemissionen darstellte, die nur auf den Farbstoff zurückzuführen sind, unter WB im Bereich 450 nm–480 nm, mit Kodak Film, Geschwindigkeit 400 ASA, mit variierender Belichtungszeit von 50 bis 60 Sekunden durchgeführt
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in den Bereichen der Objektträger mit Zellen und des umgebenden Hintergrunds, welcher die Farbemissionen darstellt, die nur auf den Farbstoff zurückzuführen sind, unter WB im Bereich 510 nm–550 nm, mit Kodak Film, Geschwindigkeit 400 ASA, mit variierender Belichtungszeit von 50 bis 60 Sekunden durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in den Bereichen der Objektträger mit Zellen und des umgebenden Hintergrunds, welcher die Farbemissionen darstellt, die nur auf den Farbstoff zurückzuführen sind, unter Auflicht, mit Kodak Film, Geschwindigkeit 400 ASA, mit variierender Belichtungszeit von 50 bis 60 Sekunden durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde die Permeation des Farbstoffes in Zellmembranen untersucht. Die unbefruchteten und befruchteten Eier und Larven von Austern wurden mit dem Farbstoff angefärbt, eine Eilösung im Verhältnis 1:50 Mikroliter zubereitet und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenz in der Plasmamembran, der Kernhülle und dem Chromatin erkennbar war. Obwohl die Emissionswellenlängenbereiche gleich waren, und die Farben dieselben Schattierungen aufwiesen, gab es feststellbaren Abgrenzungen zwischen diesen Zellbestandteilen. Dies bewies, dass der Farbstoff lebende und fixierte Zellmembranen der Eiplasmamembran des Zytoplasmas, der Kernhülle, des Nukleoplasmas und des Chromatins durchdringt.
  • In einer weiteren Ausführungsform zeigte die fehlende Fluoreszenz dieser Zellteile bei den toten Zellen, dass der Farbstoff tote Zellmembranen nicht durchdringt.
  • Für verschiedene Anregungswürfel des Fluoreszenzmikroskops werden verschiedene Färbemittel verwendet. Zum Beispiel DAPI (Anfärbung von DNA, emittiert blaue Farbe), Fluoreszein – dUTP, Hoechest 33258, 33342 werden bei Anregung mit 330 nm–385 nm-Würfeln beobachtet, FITC, Akridinorange (für DNA, RNA, emittiert grünliche/gelbliche Farbtöne), Auramin unter dem 450 nm–480 nm-Anregungswürfel und Rhodamin, TRITC und Propidiumjodid (DNA, emittiert orange Farbtöne) unter dem 510 nm–550 nm-Anregungswürfel.
  • In einer Ausführungsform dieser Epifluoreszenz wird die mikroskopische Rasterung der zytologischen Objektträger durch Aufbringen eines Tropfens des verdünnten Extraktes und Anregung mit dem WU-Filtersystem mit einem Spektralbereich der Wellenlänge 330–385 nm durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der zytologischen Objektträger durch Aufbringen eines Tropfens des Extrakts und Anregung mit dem WB-Filter mit einem Spektralbereich der Wellenlänge 450 nm–480 nm durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der zytologischen Objektträger durch Aufbringen eines Tropfens des Extrakts und Anregung mit dem WG-Filter mit einem Spektralbereich der Wellenlänge 510 nm–550 nm durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der zytologischen Objektträger unter dem Auflichtmikroskop unter Verwendung des Farbstoffs bei Durchlicht.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der zytologischen Objektträger, die mit dem Farbstoff eingefärbt sind, durch Beobachtung der Farbtöne der Fluoreszenz, die bei den jeweiligen Anregungen emittiert wird, durchgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die emittierte Fluoreszenz bei Anregung mit WU 330 nm–385 nm im Bereich von 470 nm–500 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die emittierte Fluoreszenz bei Anregung mit dem WB-Filter mit einem Spektralbereich von 450 nm–480 nm im Bereich von 570 nm–610 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die emittierte Fluoreszenz bei Anregung mit dem WG-Filter mit einem Spektralbereich von 510 nm–550 nm im Bereich von 610 nm–650 nm.
  • In einer weiteren Ausführungsform emittierte die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der zytologischen Objektträger unter Auflicht unter Verwendung von Durchlicht Licht im vollständigen weißen Bereich des sichtbaren Spektrums in Abhängigkeit von der Dichte der Zellbestandteile, und es ergab sich eine Phasenkontrastwirkung.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der Farbstoff in 70%-igem Ethylalkohol im Verhältnis 1:9000 verdünnt und verdampft; die Trockenmasse wird dann wiederum in 3 ml Äther durch dreimalige Wiederholung der Verdünnung mit der selben Menge Äther verdünnt, dann mit Wasser im Verhältnis 1:50 gemischt, was bedeutet, dass die Gesamtverdünnung des Pigments bei über 1:400.000 liegt, was zu Fluoreszenz in sechs Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen führt.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine bioaktive Zusammensetzung, welche einen bioaktiven Extrakt enthält, der aus der Meeresseegurke Holothuria scabra im Verhältnis 1:400.000 gewonnen wird, um eine Fluoreszenz in sechs Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen sowie eine Phasenkontrastwirkung unter Durchlicht zu erreichen.
  • In einer Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, welche einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird und zur Präparation von Beschichtungszusammensetzungen und Tinten verwendbar ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird und zur Leckerkennung einsetzbar ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und in Unterwassersonden einsetzbar ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und als Fluoreszenzsonde in In-Situ-Hybridisierungskits für die Molekulardiagnostik einsetzbar ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und als Komponente von nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie einsetzbar ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und der bei Immunofluoreszenznachweisen einsetzbar ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und der als Gegenfärbemittel für DIG-markierte Oligonukleotidsonden und Anti-DIG Fab-Fragmente eingesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und zur quantitativen Einzel- und Mehrfachzellenfluoreszenz in der Fluss-Zytometrie eingesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und der als Fluorochromfärbemittel für die Epifluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additi ven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und für einen Schnelltest auf Biokontamination in der Reformkostindustrie, Kosmetikindustrie, der pharmazeutischen und chemischen Industrie eingesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und zur schnellen Schätzung von Biokontaminanten in Laborkulturen eingesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und für einen Schnelltest auf Bioverschmutzungen unter Feldbedingungen eingesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, und in mikrobiellen Kits verwendet werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen bioaktiven Extrakt enthält, der zusammen mit konventionellen Additiven aus der Meeresseegurke Holothuria scabra gewonnen wird, der als natürlicher Farbstoff verwendet werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform enthält der Farbstoff ein Fluorophor, welches mit Proteinen und anderen Biomolekülen zur Herstellung kundenorientierter Farbstoffzusammensetzungen konjugiert werden kann.
  • BESCHREIBUNG DER TABELLEN
    • TABELLE 1 Die Emissionen der verschiedenen Fluoreszenzfarben des fluoreszierenden Farbstoffs bei Anregung mit Fluoreszenzfilterwürfeln für verschiedene Wellenlängen des Olympus Epifluoreszenzmikroskops mit an die Zellmembranen von Prokaryontenzellen angebundener Farbstofflösung
    • TABELLE 2 Die Emissionen der verschiedenen Fluoreszenzfarben des fluoreszierenden Farbstoffs bei Anregung mit Fluoreszenzfilterwürfeln für verschiedene Wellenlängen des Olympus Epifluoreszenzmikroskops mit an die Zellmembranen von Eukaryontenzellen angebundener Farbstofflösung
    • TABELLE 3 Tabelle der verschiedenen kommerziell wichtigen Eigenschaften der drei natürlichen, aus der Seegurke gewonnen fluoreszierenden Farbstoffe aus dieser Erfindung
  • KURZE BESCHREIBUNG DER BEGLEITENDEN ZEICHNUNGEN
  • 1 Schwarzweiß-Abbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie der grünen Fluoreszenzemissionen des Farbstoffs und der gelben Emissionen der Bakterienzellen an den Anbindungsstellen des Farbstoffs (siehe Pfeil) bei Anregung des Farbstoffs mit dem WB-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 450–480 nm.
  • 1a Farbfotografie von 1.
  • 2 Schwarzweiß-Abbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie der dunkelroten Fluoreszenzemissionen des Farbstoffs und der orangen Emissionen der Bakterienzellen an den Anbindungsstellen des Farbstoffs (siehe Pfeil) bei Anregung des Farbstoffs mit dem WG-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 510 nm–550 nm.
  • 2a Farbfotografie von 2.
  • 3 Schwarzweißabbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie toter Bakterien, die keine Fluoreszenz aufweisen.
  • 3a Farbfotografie desselben unter dem WG-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 510 nm–550 nm.
  • 4 Schwarzweiß-Abbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie der dunkelroten Fluoreszenzemissionen des Farbstoffs und der orangen Emissionen der Austerneizellen an den Anbindungsstellen des Farbstoffs bei Anregung des Farbstoffs mit dem WG-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 510 nm–550 nm. Die Kernhülle und das Chromatin sind zu sehen.
  • 4a Farbfotografie von 4.
  • 5 Schwarzweiß-Abbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie der grünen Fluoreszenzemissionen des Farbstoffs und der gelben Emissionen der lebenden Eizellen an den Durchdringungsstellen des Farbstoffs (siehe Pfeil) bei Anregung des Farbstoffs mit dem WB-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 450 nm–480 nm. Die zellpermeante Beschaffenheit des Farbstoffes zeigt dabei die Anfärbung der Eimembran, der Kernzelle, des Cytoplasmas und des Nukleoplasmas (Pfeile).
  • 5a Farbfotografie von 5. Das Chromatin des Spermiennukleus ist ebenfalls zu sehen.
  • 6 Schwarzweiß-Abbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie der dunkelbläulich-grünen Fluoreszenzemissionen des Farbstoffs und der blauen Emissionen der lebenden Eizellen an den Durchdringungsstellen des Farbstoffs (siehe Pfeil) bei Anregung des Farbstoffs mit dem WU-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 330 nm–385 nm. Die zellpermeante Beschaffenheit des Farbstoffes zeigt dabei die angefärbte Eimembran, die Kernzelle, das Zytoplasma und das Nukleoplasma (Pfeile).
  • 6a Farbfotografie von 6. Das Chromatin innerhalb des Kerns ist ebenfalls zu sehen.
  • 7 Schwarzweiß-Abbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie der dunkelbläulich-grünen Fluoreszenzemissionen des Farbstoffs und der hellbläulich-weißen Emissionen der Austernembryonenzellen 5 Tage nach der Durchdringung durch den Farbstoff (siehe Pfeil) bei Anregung des Farbstoffs mit dem WU-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 330 nm–385 nm.
  • 7a Farbfotografie von 7.
  • 8 Schwarzweiß-Abbildung der Ergebnisse der Epifluoreszenzmikroskopie der dunkelbläulich-grünen Fluoreszenzemissionen des Farbstoffs und der gelben Emissionen der lebenden Austernembryozellen 5 Tage nach der Durchdringung durch den Farbstoff (siehe Pfeil) bei Anregung des Farbstoffs mit dem WB-Filterwürfel des Olympus BX-60-Mikroskops mit einem Anregungsbereich von 450–480 nm.
  • 8a Farbfotografie von 8.
  • 9 Flussdiagramm.
  • Diese Erfindung bezieht sich auf den Prozess der Extraktion, Teilreinigung und Charakterisierung eines neuen unpolaren Pigments, welches ein fluoreszierender Farbstoff aus einem entlang der zentralen Westküste Indiens und in den indopafizischen Gegenden der Welt weit verbreiteten Echinodermen (Holothuroidea: Holothuria scabra) ist.
  • Weiterhin liefert die Erfindung einen neuartigen fluoreszenten Proteinfarbstoff aus dem Ovargewebe des Tieres, welcher 3–4 mal wiederholt aus dem selben Gewebe durch Aufbewahrung in 70%-igem Ethylalkohol unter –4° Celsius extrahiert werden kann, wodurch Raubbau an natürliche Ressourcen erspart bleibt.
  • Die vorliegende Erfindung betrachtet auch, dass der besagt Farbstoff sechs Fluoreszenzfarben unter Anregung bei drei verschiedenen Wellenlängen im UV- und sichtbaren Lichtspektrum besitzt, welche zu Emissionen von sechs verschiedenen Fluorochromen (DAPI, FITC und PI) und der Pycobiliproteine und Rhodamine äquivalent sind, die derzeit zur mehrfarbigen Fluoreszenzerkennung eingesetzt werden.
  • Der Farbstoff deckt genau genommen die Wellenlängenemissionsspektren von ca. einhundertdreiundzwanzig Fluorochromen ab, die derzeitig auf dem Markt für Fluoreszenzmikroskopiesonden verkauft werden. Die angefärbten Zellen zeigen verschiedenfarbige Emissionsfarben bei gleichen Anregungen, folgen jedoch streng dem Stokeschen Gesetz. Somit emittiert der Farbstoff bei derselben Anregung mit Olympus BX-60-Mikroskopfiltern insgesamt 6 Farben.
  • Der Farbstoff ist für lebende E.-coli- und Eukaryontenzellen ungiftig.
  • Der Farbstoff durchdringt die Membranen der verschiedenen Zellkonstituenten und färbt sie fluoreszierend an.
  • Der Farbstoff ist nach Bindung an die Zellmembranen durch die Anfärbung nicht abbaubar. Der Farbstoff zeigt keine Agglutination von Bakterienzellen und tierischen Zellen. In Ätherlösung ist der Farbstoff ein Fluorophor. Das Fluorophor ist an ein Protein in der 70%-igen alkoholischen Lösung des Ovarzellgewebes konjugiert.
  • Somit kann der Farbstoff als natürlicher, ungiftiger, zellpermeanter fluoreszierender Mehrfachfarbstoff für die Epifluoreszenzmikroskopie zur einfachen doppelten und dreifachen Anfärbung von Chromosomenzellen und Gewebe nach Vorgabe einfacher Protokolle vermarktet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrachtet auch die Verwendung des Farbstoffs zur nicht radioaktiven Markierung von Protein-, DNA- und RNA-Sonden für fluoreszierende In-Situ-Hybridisierungsanwendungen in der Molekularbiologie.
  • Somit kann der Farbstoff in einer bevorzugten Art und Weise als Komponente von molekularen Markierungs- und Nachweiskits verwendet werden, von denen die meisten in großen Stückzahlen importiert und verkauft werden.
  • Es besteht große Nachfrage nach diesen Markierungskits für die Molekulardiagnostik unter Verwendung schneller molekularer zytogenetischer und Mikroarraytechniken.
  • Ein weiterer Vorteil des Farbstoffs ist, dass die Fluoreszenz sogar bei sehr hohen Verdünnungen (1:40.000 bis 400.000) und darüber hinaus sichtbar ist.
  • Diese Eigenschaft und die ungiftige, umweltfreundliche Beschaffenheit des Farbstoffs kann bei Lebensrettungsgeräten als eine Komponente für Rettungswesten und zur Markierung des Standortes abgestürzter Flugzeuge, Rettungsinseln und Verteidigungsgerät, z.B. Raketen, und zur Leckprüfung in der Industrie etc. eingesetzt werden.
  • Die Erfindung wäre zur quantitativen Messung der Fluoreszenz in der Fluss-Zytometrie für einzelne und mehrere Zellen einsetzbar.
  • Die Erfindung wäre auch bei der schnellen Schätzung von Biokontamination in natürlichen und kontrollierten Umgebungen wie Gewebekulturen, Verschmutzung und industrieller Kontamination in der Reformkost-, Nahrungsmittel und Kosmetikindustrie von Vorteil.
  • Ein weiterer Verwendungsvorteil des Farbstoffes ist seine lange Haltbarkeit bei Raumtemperatur, wenn die Farbstoffflasche richtig verschlossen ist.
  • Ein weiterer Verwendungsvorteil des Farbstoffes ist seine lange Haltbarkeit bei Raumtemperatur, sobald die Zellen angefärbt wurden, wie mit der fluoreszenzmikroskopischen Analyse geprüft wurde.
  • Eine weitere Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffes ist die als Komponente neuartiger Fernnachweisgeräte und Unterwasser-Meeressonden, wo Daten, die auf Lichtwellenlängenempfindlichkeit basieren, benötigt werden.
  • Die Erfindung wird mit den folgenden Beispielen illustriert, die in keiner Weise als Einschränkungen des schöpferischen Umfangs der Erfindung ausgelegt werden sollten.
  • Beispiele
  • Es werden die Methoden der Isolierung, Teilreinigung und Charakterisierung des Farbstoffs und die Details der zur Überprüfung der unpolaren, ungiftigen, zellpermeanten, nicht agglutinierenden und mehrfachen Fluoreszenzeffekte des Farbstoffs durch Epifluoreszenzmikroskopie durchgeführten Experimente offenbart:
  • Beispiel 1:
  • Sammeln des Materials:
  • Das Material des Patentes ist eine Seegurke mit den folgenden taxonomischen Details.
  • Unterreich: Metazoa, Stamm: Echinodermata, Unterstamm: Eleutherozoa, Klasse: Holothuroidea, Unterklasse: Aspidochirotacea, Ordnung: Aspidochirota, Gattung: Holothuria, Art: scabra
  • Das Material wurde bei Ebbe an den Küsten der zentralen Westküste von Indien gesammelt. Die Tiere wurden ins Labor gebracht und in mit Seewasser mit einem Salzgehalt von 30–32 per par (30‰) gefüllten Glastanks zur späteren Verwendung aufbewahrt.
  • Beispiel 2:
  • Extraktion des Farbstoffs
  • Die Extraktion des Farbstoffs ist ein Prozess in zwei Schritten. Zuerst wird ein alkoholischer Extrakt hergestellt, zweitens wird der Alkohol verdampft und das Fluorophor separiert und in Ätherlösungsmittel wie folgt aufgelöst:
    Schritt 1: Die Tiere werden zuerst mit Leitungswasser und dann mit Milli-Q-Wasser (ultrareines Wasser) gewaschen. Dann wurde der Körper mit einer scharfen Schere aufgeschnitten und die weiblichem Keimdrüsen identifiziert und entfernt. Die Farbe der Keimdrüsen variierte von gelb bis orange. 1 Milligramm (1 mg) des Ovargewebes wurde abgewogen und 70%-iger Ethylalkohol im Verhältnis 1:3 (Verhältnis Gewicht zu Volumen) hinzugefügt. Es kam gelblich-orangefarbiges Pigment heraus. Die Farbstofflösung wurde dekantiert. Zum verbleibenden Gewebe wurde wiederum 70%-iger Ethylalkohol zugefügt und die farbige Lösung entfernt. Diese Schritte wurden zur Extraktion des Pigmentes ohne Homogenisierung des Ovargewebes dreimal wiederholt. Der Extrakt wurde durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert. Der Extrakt wurde in einem Fläschchen mit Schraubverschluss bei 4° Celsius aufbewahrt und als „Lager-Farbstoff" bezeichnet. Der Extrakt, welcher sowohl hellgelbe als auch orange Pigmente aus dem Ovargewebe trug, wurde mit Hilfe der folgenden Methoden charakterisiert.
  • Man fand heraus, dass die Eigenschaften gleich waren. 1 mg Ovargewebe:3 ml 70%-iger Ethylalkohol (3 Mal), d.h. 1 mg Pigment in 9 ml oder 9000 Mikroliter Alkohol.
    Schritt 2: 15 ml der 70%-igen alkoholischen Farbstofflösung wurden genommen, zur Koagulation der Proteine erwärmt und langsam in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 80° Celsius bis zum trockenen Zustand verdampft. Das getrocknete Material war in Wasser und Alkohol nicht löslich. Es war in Äther löslich. Äther wurde dem getrockneten Material hinzugefügt und bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen. Der farbige Anteil löste sich auf. Dann wurde es durch einen Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert, um eine klare Lösung von gelber Farbe zu erhalten, die als „unpolarer Fluoreszenzfarbstoff" markiert wurde.
  • Beispiel 3:
  • Physikalische Eigenschaften des Farbstoffs:
  • Farbe und Löslichkeit:
  • Die besagte Farbstofflösung ist bei mit bloßem Auge von oranger Farbe. Im Tageslicht/Leuchtstoffröhrenlicht gibt er verschiedenfarbige Emissionen ab. Der Farbstoff ist in Wasser unlöslich, ist aber in unpolarem Lösungsäther löslich. Somit ist es ein unpolarer Farbstoff. Der Farbstoff besitzt einen pH-Wert von 7,0.
  • Beispiel 4:
  • Der besagte Extrakt wurde der Papierelektrophorese unterzogen. Ein Whatman Nr. 1-Filterpapier wurde in einem Phosphatpuffer (0,1 M) pH7 getränkt und in einer Elektrophoresekammer platziert. Beide Elektroden wurden in den Phosphatpuffer getaucht. Mit 5 Mikrolitern (5 μl) des Farbstoffes, der bei 40 Volt der Papierelektrophorese unterzogen wurde, wurde ein Spot gemacht. Der gelbe Spot bewegt sich nach keiner Seite. Zudem löst er sich nur im unpolaren Ätherlösungsmittel. Da sich der Farbstoff nur in Äther löst, handelt es sich um einen unpolaren Farbstoff.
  • Beispiel 5:
  • Lichtechtheit:
  • Der Ätherextrakt des Farbstoffs ist bei Raumtemperatur stabil. Jedoch muss der Farbstoff zum Schutz vor Verdampfung de Ätherlösung an einem kühlen Ort aufbewahrt werden. Sobald die Zellen mit dem Farbstoff markiert sind, bleibt die Fluoreszenz bei Raumtemperatur über Monate erhalten.
  • Beispiel 6:
  • Test auf elektrische Ladung des Farbstoffs durch Elektrophorese:
  • Der besagte Extrakt wurde der Papierelektrophorese unterzogen. Ein Whatman Nr. 1-Filterpapier wurde in einem Phosphatpuffer (0,1 M) pH7 getränkt und in einer Elektrophoresekammer platziert. Beide Elektroden wurden in den Phosphatpuffer getaucht. Mit 5 Mikrolitern (5 μl) des Farbstoffes, der bei 40 Volt der Elektrophorese unterzogen wurde, wurde ein Spot gemacht. Der gelbe Spot bewegt sich nach keiner Seite.
  • Jedoch bewegte sich der Farbspot bei Versuchen mit der 70%-igen Alkohollösung aus Phase 1 zum positiven Pol. Dies zeigt, dass das unpolare Pigment des vorliegenden Farbstoffs in dem alkoholischen Phase-1-Extrakt des Ovargewebes an irgendein negatives Protein gebunden ist. In einer chemischen und HPLC-Analyse wurden das Vorhandensein von Proteinen und Kohlehydraten in dem alkoholischen Extrakt nachgewiesen.
  • Beispiel 7:
  • Chemische Eigenschaften des Farbstoffs:
  • 1 ml der Farbstofflösung, bei der es sich um alkoholischen Ovarextrakt handelt, wurde genommen und 0,2 Gramm Dithioerythriol wurden beigegeben. Die Lösung entfärbt sich nicht. Es zeigte sich, dass der färbende Teil des Fluoreszenzfarbstoffes keine reduzierbare Gruppe enthält.
  • Beispiel 8:
  • Test der nicht proteinhaltigen Beschaffenheit des Farbstoffs.
  • 5 ml des Extraktes aus Schritt 1 wurde in einem Wasserbad bei 100° Celsius erhitzt. In dem alkoholischen Extrakt wurde Koagulation festgestellt. Dies bestätigte das Vorhandensein von Protein im anfänglichen alkoholischen Extrakt, jedoch wurde das Protein durch Koagulation entfernt. Die farbige Lösung kam von der getrockneten Materie durch Auflösung derselben in Äther. Da der Proteinanteil entfernt wurde, sagt man, der Farbstoff sei nicht-proteinhaltiger Beschaffenheit.
  • Beispiel 9:
  • Fehlen von Agglutination der Bioaktivität
  • Ein Ring lebender E. coli-Bakterien wurde in 50 Mikrolitern Wasser auf einem mikroskopischen Objektträger platziert und vermengt. Dazu wurde 1 Mikroliter (μl) der Farbstofflösung hinzugefügt. Den Alkohol ließ man verdampfen, indem der Objektträger für 10–15 Sekunden auf dem Tisch belassen wurde. Dann wurde ein Deckplättchen auf das Bakterienpräparat aufgebracht und versiegelt. Auf ähnliche Weise wurde ein Kontroll-Bakterienpräparat ohne jeglichen Farbstoff angefertigt.
  • Beide Objektträger wurden unter dem Ölmikroskop eines Epifluoreszenzmikroskops gerastert (Objektiv mit 100-facher Vergrößerung, Augenlinse mit 10-facher Vergrößerung), um die Agglutinationsbioaktivität und die Fluoreszenz unter WU, WB, WG und BF zu prüfen. Es wurde beobachtet, dass die Bakterien keinerlei Klumpenbildung zeigten (10, 10a).
  • Jedoch wurde in der 70%-igen Alkohollösung, welche in Phase 1 der Isolierung von dem Ovargewebe entfernt worden war, das Agglutinationsverhalten festgestellt. Jedoch war das Protein in der zweiten Phase der Isolierung entfernt worden, und die vorliegende Farbstofflösung war von nicht proteinhaltiger Beschaffenheit.
  • Die fehlende Tendenz der Zellen zur Aggregatbildung in Anwesenheit der vorliegenden Farbstofflösung legte nahe, dass sie kein Lektin, wie z.B. Glykoprotein, mehr enthält.
  • Beispiel 10:
  • Test auf Agglutinationsbioaktivität bei eukaryotischen Spermien
  • Ein Milliliter Lösung von Austernspermien (100 Mikroliter) wurde in der Aussparung eines Sedgewick-Zählers, der zur Phytoplanktonzählung verwendet wird, platziert. 1 Mikroliter (μl) der Farbstofflösung wurde hinzugefügt. Der Objektträger wurde unter einem Objektiv mit 40-facher Vergrößerung eines Mikroskops mit 10-fach-Augenlinse gerastert. Es wurde beobachtet, dass die Spermien keine Klumpen bildeten, was das Fehlen von lektinartiger Aktivität des Farbstoffs bestätigte.
  • Beispiel 11:
  • Test auf Fluorophor- und Proteinassoziation in Phase-1-Material der 70%-igen alkoholischen Lösung, jedoch fehlend in der vorliegenden Phase-2-Isolation
  • Wie in den Bespielen 4 und 6 erwähnt, zeigt das Fluorophor unpolares Verhalten. Es scheint jedoch, dass sich der gelbe Spot in der 70%-igen alkoholischen Lösung von Ovargewebe aus der Isolationphase 1 während der Papierelektrophorese zum positiven Pol hin bewegt. In dieser Phase könnte er an eine negativ geladene Komponente gebunden sein. Die HPLC-Daten der 70%-igen Alkohollösung wiesen nur Proteine und Kohlehydrate nach. Da Kohlehydrate keine elektrische Ladung haben, wird nahe gelegt, dass die Farbkomponente des vorliegenden Farbstoffes in Phase 1 (70%-ige alkoholische Lösung) an ein negativ geladenes Protein gebunden ist. Jedoch wird sie in Isolationsphase 2, welche den vorliegenden Farbstoff erzeugt, durch Koagulation bei Erhitzen von Protein getrennt. Es ist die Lösung des Phase-2-Farbstoffs, welche die vorliegende unpolare Farbstofflösung bildet.
  • Beispiel 12:
  • Methode zur Verwendung des unpolaren Farbstoffs in Experimenten
  • Der Farbstoff ist in Äther löslich, daher wird eine spezielle Methode zum Hinzufügen von Farbstoff zu den Versuchstieren eingeführt. Lebende Zellen werden auf einen sauberen Objektträger aufgebracht. Dazu wird eine abgemessene Menge ultrareinen Wassers oder Meerwassers gegeben, abhängig vom Medium, in dem die Zellen kultiviert werden und in Kontrollpräparaten am Leben bleiben. Die ab gemessene Menge Farbstoff wird am äußeren Rand des Tropfens platziert, dann erfolgt Verdampfung für 2–3 Sekunden. Die Lösung wird dann mit einer Eppendorf-Spitze gemischt. Ein Deckplättchen wird sofort auf die Probe aufgebracht und versiegelt. Die Objektträger werden markiert und unter einem Epifluoreszenzmikroskop betrachtet.
  • Beispiel 13:
  • Test auf Ungiftigkeit des Farbstoffs bei eukaryotischen Zellen
  • Der Extrakt wurde auf Ungiftigkeit für die Austernspermien getestet. Das Überleben der Spermien in den Versuchsaufbauten wurde als Parameter zum Zeigen der Ungiftigkeit herangezogen.
  • Männliche Keimdrüsen einer Auster wurden entfernt, und Spermien in 100% Meerwasser gegeben.
  • Diese wurden zur Entfernung jeglicher Ablagerungen durch ein Zellstofffilter filtriert. 1 Milliliter (ml) der Spermienlösung wurde genommen und verschiedene Konzentrationen (1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl und 5 μl) der Farbstofflösung hinzugefügt. Zu jeder halben Stunde wurde das Überleben der Spermien unter einem Mikroskop beobachtet. Die Experimente wurden 24 Stunden lang fortgeführt. Die Kontrollpräparate wurden ohne Zugabe von Farbstoff aufbewahrt. Es wurde beobachtet, dass es unter Zugabe von Farbstoff keine schädliche Wirkung auf das Überleben der Spermien gab. Dies bewies die ungiftige Beschaffenheit des Farbstoffs auf Zellen von Meerestieren und Tieren, die in flachen Gewässern leben, gab.
  • Beispiel 14:
  • Test auf Ungiftigkeit des Farbstoffs bei Prokaryonten
  • Der Extrakt wurde auf Toxizität für gramnegative E. coli-Bakterien durch Beobachtung ihres Überlebens/ihrer Mortalität getestet. Lebende E. coli-Bakterien wurden auf einen sauberen Objektträger aufgebracht. Dazu wurden 25 μl ultrareines Wasser gegeben. 1 μl des Farbstoffs wird auf dem äußeren Rand des Tropfens platziert, dann erfolgt Verdampfung für 2–3 Sekunden. Die Lösung wird dann mit einer Eppendorf-Spitze gemischt. Unverzüglich wird ein Deckplättchen auf die Probe aufgebracht und versiegelt. Die Objektträger werden markiert und die Zellen unter einem Epifluoreszenzmikroskop betrachtet (1,1a, 2 und 2a). Die toten Bakterien weisen keinerlei Fluoreszenz auf (3, 3a).
  • Beispiel 15:
  • Permeabilitätstest bei Austereiern
  • Die unbefruchteten und befruchteten Eier sowie die Larven von Austern wurden mit dem Farbstoff und Eilösung im Verhältnis 1:50 Mikrolitern angefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop gerastert. Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenz in der Plasmamembran, der Kernhülle und dem Chromatin erkennbar war. Obwohl die Bereiche der Emissionswellenlängen gleich waren, und die Farben dieselben Farbtöne aufwiesen, gab es eine merkliche Abgrenzung der Grenzen dieser Zellteile (4, 4a, 5, 5a und 6, 6a). Dies bewies, dass der Farbstoff die lebenden und fixierten Zellmembranen der Plasmamembran, des Zytoplasmas, der Kernhülle und des Chromatins des Eis durchdringt. Die fehlende Fluoreszenz dieser Zellteile bei toten Zellen zeigte, dass der Farbstoff tote Zellmembranen nicht durchdringt.
  • Beispiel 16:
  • Nachweis lebender und toter Bakterien in Kulturen
  • Ein Tropfen lebender E. coli-Bakterien (25 μl) wurde auf einem mikroskopischen Objektträger platziert. Dazu wurde 1 μl des Farbstoffs gegeben. Der Objektträger wurde vorübergehend versiegelt, um ihn vor Verdampfung zu schützen. Unter dem Mikroskop war zu sehen, dass die Bakterien Fluoreszenz in allen Anregungswellenlängen des Filters, wie WU, WB und WG, abgaben. Die Kontrollpräparate wurden mit den lebenden E. coli ohne die Anfärbung und den toten E. coli aufbewahrt. In beiden Kontrollpräparaten zeigten die Bakterien keine Fluoreszenz. Dies zeigte, dass der Farbstoff zum Aussortieren von lebenden und toten Bakterien in Kulturen einsetzbar ist (3, 3a).
  • Beispiel 17
  • Zur Überprüfung der Ergebnisse von Zytotoxizitäts-Bioassays einsetzbarer Farbstoff
  • Die Eigenschaft, dass Fluoreszenz bei den lebenden und fixierten Zellen, nicht jedoch bei den toten Zellen auftritt, kann zur Überprüfung von Zytotoxizität und antibakterieller Aktivität verschiedener Verbindungen durch Bioassays genutzt werden, indem die Ergebnisse mit diesem Farbstoff überprüft werden.
  • Beispiel 18:
  • Farbstoff einsetzbar zur Überprüfung bakterieller Kontamination
  • Die Eigenschaft, dass Fluoreszenz bei den lebenden und fixierten Zellen, nicht jedoch bei den toten Zellen auftritt, kann zur Überprüfung von Kontamination in umwelttechnischen und industriellen Proben genutzt werden, bei denen Vorhandensein und Fehlen von Bakterien nachgewiesen werden muss.
  • Beispiel 19:
  • Epifluoreszenzmikroskopie des Fluorophors
  • Die epifluoreszenzmikroskopischen Studien werden durchgeführt, indem man den Farbstoff als Färbemittel mit Verdünnungen von 1:100 verwendet, die Lichtemissionen bei Anregung mit verschiedenen Würfeln aufzeichnet und die Farbtöne mit den bekannten Fluorochromen vergleicht. Es wurde festgestellt, dass die Emissionen beim Fluorophor viel stärker waren, obwohl die Farbschattierungen gleich waren. Die Rasterung wurde unter Anregung mit UV-Licht und dem sichtbaren Lichtspektrum mit WU, WB, WG und BF-Würfeln des Olympus-Reflexlichts durchgeführt. Die Details der Würfel waren wie folgt: Der Wellenlängenbereich des WU-Würfels war 330 nm–385 nm.
  • Der Wellenlängenbereich des WB-Würfels war 450 nm–480 nm.
  • Der Wellenlängenbereich des WG-Würfels war 510 nm–550 nm.
  • BF ist für das Auflicht, wobei eine gewöhnliche Wolframlampe als Lichtquelle dient.
  • Beispiel 20:
  • Die Emissionsbereiche des Farbstoffs bei verschiedenen Anregungsbereichen wurden untersucht. Es wurde erkannt, dass Anregung mit dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm zu Fluoreszenzemission im Bereich von 450 nm–470 nm führt. Anregung mit dem WB-Filter im Spektralbereich von 450 nm–480 nm führt zu Fluoreszenzemission im Bereich 510 nm–570 nm. Die Anregung mit dem WG-Filter im Spektralbereich von 510 nm–550 nm führt zu Fluoreszenzemission im Bereich 610 nm–650 nm. Mit BF waren gelblich-graue Schattierungen zu sehen.
  • Beispiel 21:
  • Fluoreszenzemission in den Austernzellen
  • Der Farbstoff wurde als mikroskopisches Färbemittel auf die toten, lebenden und fixierten Austerneier angewandt. Die Objektträger wurden unter einem Epifluoreszenzmikroskop gerastert. Es wurde festgestellt, dass die toten Zellen keinen Farbstoff aufnehmen und keine Fluoreszenz aufweisen (4, 4a, 5, 5a, 6, 6a, 7, 7a, 8 und 8a). Die Fluoreszenz wurde in den Eiern sogar noch 5 Tage nach dem ersten Einsatz des Farbstoffs und Aufbewahrung der Objektträger bei Raumtemperatur festgestellt.
  • Die lebenden und fixierten Zellen wiesen Fluoreszenz auf. Der Spektralbereich der Anregung und die emittierte Fluoreszenz folgten streng dem Stokeschen Gesetz. Diese unterschieden sich von der Farbstofflösung und waren wie unten aufgeführt:
    Anregung mit dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm emittierte Fluoreszenz im Bereich 470 nm–500 nm. Anregung mit dem WB-Filter im Spektralbereich von 450 nm–480 nm emittierte Fluoreszenz im Bereich 570 nm–610 nm. Die Anregung mit dem WG-Filter im Spektralbereich von 510 nm–550 nm emittierte Fluoreszenz im Bereich 610 nm–650 nm. Die epifluoreszenzmikroskopische Rasterung der toten, lebenden und fixierten Eier unter Auflicht mit Verwendung von Durchlicht emittierte Licht im vollständigen weißen Bereich der sichtbaren Licht spektra, und in Abhängigkeit von der Zelldichte ergaben die Grauschattierungen eine Art Phasenkontrastwirkung.
  • Beispiel 22:
  • Fluoreszenzemissionen in den E. coli-Zellen
  • Der Farbstoff wurde als mikroskopisches Färbemittel auf die E. coli angewendet. Die Objektträger wurden unter einem Epifluoreszenzmikroskop gerastert. Es wurde festgestellt, dass die toten Zellen keinen Farbstoff aufnehmen und keine Fluoreszenz zeigen (3, 3a). Die lebenden Zellen zeigten Fluoreszenz. Der Spektralbereich der Anregung und die emittierte Fluoreszenz folgten streng dem Stokeschen Gesetz. Diese unterschieden sich von der Farbstofflösung und waren wie unten angegeben:
    Anregung mit dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm emittierte Fluoreszenz im Bereich 470 nm–500 nm. Anregung mit dem WB-Filter im Spektralbereich von 450 nm–480 nm emittierte Fluoreszenz im Bereich 570 nm–610 nm. Die Anregung mit dem WG-Filter im Spektralbereich von 510 nm–550 nm emittierte Fluoreszenz im Bereich 610 nm–650 nm. Die Kontroll-E. coli ohne Farbstoff zeigten keinerlei Fluoreszenz.
  • Beispiel 23:
  • Mikrofotografie der fluoreszierenden Zellen mit dem Farbstoff als Färbemittel
  • Die Mikrofotografie der emittierten Fluoreszenz in den Bereichen des Objektträgers ohne Zellen und mit Musterzellen wurde unter WU im Bereich 330 nm–385 nm, WB im Bereich 450 nm–480 nm, WG im Bereich 510 nm–550 nm und Auflicht mit Kodak Film, 400 ASA Geschwindigkeit und einer variablen Belichtung zwischen 50 und 60 Sekunden durchgeführt.
  • VORTEILE GEGENÜBER DEN DERZEIT VERMARKTETEN FARBSTOFFEN
    • 1) Der Farbstoff ist nicht radioaktiv, da er aus einer natürlichen Quelle stammt und nicht synthetisch ist.
    • 2) Der Farbstoff ist ungiftig für Tiere, die in flachen Gewässern lebenden, Meerestiere und gramnegative E. coli-Bakterien.
    • 3) Der Farbstoff ist zellmembranpermeant und bindet sich selbst an die Kernmembran und auch an das Chromatin.
    • 4) Der Farbstoff durchdringt das Zytoplasma und Nukleoplasma.
    • 5) Der Farbstoff ist ein unpolarer Fluoreszenzfarbstoff aus einem nicht bioluminiszenten Meerestier.
    • 6) Der Farbstoff ist ein teilgereinigtes Fluorophor in Lösung.
    • 7) Der Farbstoff ist in seiner Einzelform zu sechs synthetischen Fluorochromen äquivalent, was den größten Teil der Emissionen im UV- und sichtbaren Spektralbereich des Lichts von fluoreszierenden Farben abdeckt.
    • 8) Der Farbstoff kann als mikroskopisches Schnellfärbemittel verwendet werden, das eine Phasenkontrastwirkung ohne zusätzliche Aufwendungen für Phasenkontrastzubehör eines Mikroskops und ohne lange Protokolle zur Fixierung und Präparation von Proben ergibt, insbesondere zur Vor-Ort-Qualitätsprüfung von Lebend-Proben.
    • 9) Da er in Bezug auf die Fluoreszenzqualität bei Raumtemperatur nicht abbaubar ist, ist während des Exports des Farbstoffs keine Kühlung erforderlich. Die derzeit vermarkteten Farbstoffe werden gekühlt bei einer Temperatur äquivalent zu –20° Grad Celsius exportiert.
    • 10) Da er in Bezug auf die Fluoreszenzqualität von angefärbten Zellen über einen längeren Zeitraum nicht abbaubar ist, ist zum Export angefärbter Objektträger keine Kühlung erforderlich. Die Farbstofflösung kann bei 4 Grad Celsius vermarktet werden. Die derzeit vermarkteten Fluoreszenzfarbstoffe werden gekühlt bei einer Temperatur äquivalent zu –20 Grad Celsius exportiert.
    • 11) Der Farbstoff hat einen pH-Wert im Bereich von 7,0, so dass sich in Zusammensetzungen der pH-Wert des Produktes nicht drastisch ändern wird.
    • 12) Das Fluorophor kann mit anderen Biomolekülen konjugiert werden.
    • 13) Der Farbstoff ist unpolar.
    • 14) Er ist in Äther löslich.
    • 15) Der Farbstoff ist unter natürlichen Bedingungen nicht abbaubar.
    • 16) Der Farbstoff ist unter natürlichen Bedingungen nicht abbaubar, und das gleiche gilt, sobald er sich einmal mit den Zellmembranen verbunden hat. Dies kann für Studien von Funktionen an lebenden Zellen, Organellstrukturen, Zellsortierung und Fluss-Zytometrie von immensem Wert sein.
    • 17) Die Farbstofflösung ist für lebende Bakterien, Austerneier und Spermien ungiftig.
    • 18) Die ungiftige Beschaffenheit des Farbstoffs hat den Vorteil, dass daraus eine Farbstoffkomponente für Kits zur Analyse lebender Zellen gemacht werden kann.
    • 19) Die ungiftige Beschaffenheit des Farbstoffs hat den Vorteil, dass daraus eine Farbstoffkomponente für Kits für In-Situ-Operationale Studien in der Ozeanographie gemacht werden kann.
    • 20) Der Farbstoff färbt tote Bakterien nicht an und zeigt in ihnen auch keine Fluoreszenz. Dies ist für Gewebekulturen zur Überprüfung lebender und toter Bakterien von Nutzen.
    • 21) Die Ungiftigkeit des Farbstoffs für lebende Zellen kann zur Nachverfolgung von Zelllinien von Nutzen sein.
    • 22) Der Farbstoff ist in lebenden und fixierten Zellen zellmembranpermeant. Dies ist ein natürliches Farbstoff und hat somit gegenüber synthetischen Farbstoffen den Vorteil der größeren Umweltfreundlichkeit.
    • 23) Der Farbstoff deckt einen größeren Bereich von Emissionswellenlängen bei selektiven Anregungen ab. Dies macht ihn zu einer sehr akzeptablen Kom ponente von derzeit vermarkteten Zweifach-Emissionskits zum Hinzufügen eines dritten Emissionsfarbbereiches.
    • 24) Der Farbstoff erfährt bei der Rasterung unter dem Mikroskop keine Lichtausbleichung.
    • 25) Der Farbstoff zeigt keine Lichtausbleichung, sobald er die Zellen auf dem Objektträger anfärbt. Dies macht ihn für histochemische Studien nützlich.
    • 26) Der Farbstoff emittierte diese Fluoreszenzfarben sogar bei einem Verdünnungsbereich von 1:400.000 bis 1:900.000.
    • 27) Diese mehrfarbigen Emissionen des Farbstoffs bei verschiedenen Anregungswellenlängen sind mit den bereits auf dem Markt befindlichen mikroskopischen Fluorochromfärbemitteln vergleichbar.
    • 28) Die blaue Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist mit der Emission derselben Farbe durch das DAPI-Fluorochrom bei Anregung mit derselben Wellenlänge vergleichbar, welches als Komponente der nicht radioaktiven Markierungskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
    • 29) Die blaue Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist auch mit der Farbemission von Hoechest 33258 vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
    • 30) Die blaue Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist auch mit der Farbemission von Hoechest 33342 Fluorochrom bei Anregung mit derselben Wellenlänge vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie verwendet wird.
    • 31) Die gelbe Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist mit der Emission derselben Farbe von Akridinorange vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie eingesetzt wird.
    • 32) Die gelbe Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist mit der Emission derselben Farbe von Auramin vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie eingesetzt wird.
    • 33) Die gelbe Fluoreszenz des besagten Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist mit der Emission derselben Farbe von FITC vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie eingesetzt wird.
    • 34) Die orange Fluoreszenzemission ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Propidiumjodid-Fluorochroms vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie eingesetzt wird.
    • 35) Die orange Fluoreszenzemission ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Rhodamin-Fluorochroms vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie eingesetzt wird.
    • 36) Die orange Fluoreszenzemission ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des TRITC-Fluorochroms vergleichbar, das als Komponente der nicht radioaktiven Markierungs- und Nachweiskits der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie eingesetzt wird.
    • 37) Anders als die synthetischen kommerziellen Farbstoffe, die für dieselben Zwecke eingesetzt werden, ist der vorliegende Farbstoff bei Raumtemperatur stabil und besitzt eine lange Haltbarkeit. Molekulare, nicht radioaktive Kits des besagten Farbstoffs können bei Raumtemperatur exportiert werden.
    • 38) Der besagte Einzelfarbstoff besitzt Eigenschaften von mindestens einhundertdreiundzwanzig derzeit auf dem Markt befindlichen verschiedenen Fluo rochromen (DAPI, Hoechest 33258, Hoechest 33342, FITC, Akridinorange, Auramin, Rhodamin, TRITC, Propidiumjodid etc.)
    • 39) Unter gewöhnlichem Mikroskoplicht erzeugen die Grauschattierungen eine Phasenkontrastwirkung, die zur schnellen Rasterung von zytogenetischen, zytologischen und histochemischen Objektträgern von Nutzen ist und die zusätzlichen Aufwendungen für die Phasenkontrast-Zusatzausstattung von Mikroskopen erspart. Die Fluoreszenzfarbenemission folgt dem Stokeschen Fluoreszenzgesetz.
    • 40) Die Mikrofotografien mit Kodak Filmrollen zeigen Farbschattierungen der benachbarten Emissionswellenlängen. So erscheinen bei blauer Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikroskop auf der Mikrofotografie auch die grünen Farbschattierungen.
    • 41) Die Mikrofotografien mit Kodak Filmrollen zeigen Farbschattierungen der benachbarten Wellenlängen. So erscheinen bei gelber Fluoreszenz unter dem Epifluoreszenzmikroskop auf der Mikrofotografie auch die grünen Farbschattierungen.
    • 42) Bei oranger Fluoreszenz des Farbstoffs unter dem Epifluoreszenzmikroskop erscheinen auf der Mikrofotografie auch die roten Farbschattierungen.
    • 43) Die zytogenetischen Objektträger ergeben bei Betrachtung unter allen Fluoreszenzen einen Gegenfärbeeffekt der Zellen gegenüber dem Hintergrund, wo keine Probe, sondern nur Farbstoff vorhanden ist.
    • 44) Der Farbstoff kann in fluoreszierenden Farben bei einer Vielzahl von Farben, Tinten und Textilien verwendet werden.
    • 45) Der Farbstoff kann in Zusammensetzungen für fluoreszierenden Farbstoff zum Bleichen und Aufhellen von Polymeren verwendet werden.
    • 46) Der Farbstoff kann zur Leckerkennung mit einem im vollen Spektrum fluoreszierenden Farbstoff verwendet werden.
    • 47) Er kann auch in einem automatisierten chemischen Zumesssystem verwendet werden. Er kann auch zur Markierung des Standortes abgestürzter Flugzeuge, Rettungsinseln und Geräten wie z.B. Raketen verwendet werden. Weiterhin kann er in Unterwasser-Meeressonden verwendet werden.
    • 48) Die ungiftige und zellpermeante Beschaffenheit des Farbstoffs kann auch als Komponente für nicht radioaktive Markierungs- und Nachweiskits in der Biochemie, Zellbiologie, Immunochemie und Molekularbiologie zur Markierung von DNA, RNA, Proteinen und Enzymen, für Immunofluoreszenz-Nachweise, zum Gegenfärben von DIG-markierten Oligonukleotidsonden und Anti-DIG Fab-Fragmenten, quantitative Einzel- und Mehrzellenfluoreszenz in der Fluss-Zytometrie und für Fluorochromfärbemittel für die Epifluoreszenzmikroskopie verwendet werden.
    • 49) Der Farbstoff kann für einen Schnelltest auf Biokontamination in der Reformkostindustrie, Kosmetikindustrie, Pharmaindustrie und chemischen Industrie, für schnelle Schätzungen der Biokontamination in Laborkulturen und zum Schnelltest auf Bioschadstoffe unter Feldbedingungen verwendet werden.
    • 50) Der Farbstoff kann in Zusammensetzungen, die einen ungiftigen Farbstoff erfordern, eingesetzt werden.
    • 51) De Farbstoff ist umweltfreundlich. Er tötet keine Larven von Tieren, die in flachen Gewässern oder im Meer leben.
    • 52) Der Farbstoff kann als natürliches Färbemittel verwendet werden. Eine bioaktive Zusammensetzung des Meeresfarbstoffs im Verhältnis 1:40.000 bis 1:400.000 zum Erhalten von Fluoreszenz in sechs Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen und einer Phasenkontrastwirkung unter Durchsicht.
    • 53) Da der Farbstoff unpolar ist, kann er auf einfache Weise an eine Vielzahl von Biomolekülen angebunden werden.
    • 54) Er erfüllt die Anforderungskriterien der Industrie an einen guten Farbstoff, da er die verschiedenen Teile der Zelle bei einer und bei verschiedenen Emissionen zeigt.
  • TABELLE 1
  • Die Emissionen der verschiedenfarbigen Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs bei Anregung mit Fluoreszenzfilterwürfeln verschiedener Wellenlängen des Olympus Epifluoreszenzmikroskops mit Farbstofflösung und bei Anbindung an die Zellmembranen der prokaryotischen Zellen.
    Name des Fluoreszenzwürfels laut Katalog von Olympus Co. Ltd. Anregungsbereich des Fluoreszenz-würfels Emissionsbereich der Farbstofflösung Emissionsbereich des Farbstoffs bei Anbindung an die Zellmembranen Emittierte Farbe des Farbstoffs Emittierte Farbe des Farbstoffs nach Anbindung an die Zellmembranen
    M WU 330–385 nm 450–470 nm 470–500 nm Blau Blau
    M WB 450–480 nm 510–570 nm 570–610 nm Grün Gelb
    M WG 510–550 nm 610–650 nm 610–650nm Orange-Rot Orange-Rot
    Auflicht Durchlicht Weißes Licht Weißes Licht Gelblich-Grau Gelblichdunkelgraue Schattierungen
  • TABELLE 2
  • Die Emissionen der verschiedenfarbigen Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs bei Anregung mit Fluoreszenzfilterwürfeln verschiedener Wellenlängen des Olympus Epifluoreszenzmikroskops mit Farbstofflösung und bei Anbindung an die Zellmembranen der eukaryotischen Zellen.
    Name des Fluoreszenzwürfels laut Katalog von Olympus Co. Ltd. Anregungsbereich des Fluoreszenz-würfels Emissionsbereich der Farbstofflösung Emissionsbereich des Farbstoffs nach Anbindung an die Zellmembranen Emittierte Farbe des Farbstoffs Emittierte Farbe des Farbstoffs nach Anbindung an die Zellmembranen
    M WU 330–385 nm 450–470 nm 470–500 nm Blau Blau
    M WB 450–480 nm 510–570 nm 570–610 nm Grün Gelb
    M WG 510–550 nm 610–650 nm 610–650nm Orange-Rot Orange-Rot
    Auflicht Durchlicht Weißes Licht Weißes Licht Gelblich-Grau Gelblichdunkelgraue Schattierungen
    Figure 00740001
    Figure 00750001
    Figure 00760001
    Figure 00770001
    Figure 00780001
    Figure 00790001
    Figure 00800001
    Figure 00810001
    Figure 00820001
    Figure 00830001
    Figure 00840001
    Figure 00850001
    Figure 00860001
    Figure 00870001
    Figure 00880001

Claims (11)

  1. Bioaktiver Extrakt, der einen unpolaren und nichtproteinhaltigen, aus einem alkoholischen Extrakt der Ovarialzellen eines nicht biolumineszenten Meeresorganismus, Holothuria scabra, gewonnenen Fluoreszenzfarbstoff enthält, der im Gezeitenbereich, im stehenden Wasser sowie im Flach- und Tiefwasser gewöhnlich in schattigen Bereichen wie Alkoven, Felsspalten, Riffen, Überhängen sowie felsigen und sandigen Lebensräumen in großen Mengen vorkommt. Dunkel bis hell gefärbte, festsitzende, sedentär treibende Organismen mit oder ohne Exo- und Endoskelette, ungestielt von unterschiedlicher Schwimmkraft, normalerweise nachtaktiv, abhängig von aktiver Prädation, mit und ohne lumineszierenden und fluoreszierenden Pigmente, die von wenigen bis allen Wellenlängenbereichen des UVB-Lichts, des UVA-Lichts, der sichtbaren Farbspektren und des Infrarotspektrums emittieren.
  2. Bioaktiver Extrakt, gewonnen nach Anspruch 1 und als natürlicher Fluoreszenzfarbstoff mit folgenden Eigenschaften verwendbar: i. Keine Entfärbung durch ein Reduktionsmittel, ii. es handelt sich um eine natürliche Verbindung, iii. der Rohextrakt des Farbstoffes hat eine orange Farbe, iv, die halbgereinigte Farbstofflösung hat für das bloße Auge eine hellorange Farbe, v. unter Leuchtstoffröhrenlicht emittiert es eine Vielfalt an Farben des sichtbaren Lichtspektrums, vi. das vom Proteinanteil getrennte Pigment ist in Wasser und Alkohol unlöslich, vii. das teilgereinigte Farbpigment ist in Äther löslich, viii. bei dem Farbstoff handelt es sich um einen unpolaren Farbstoff mit einem pH-Wert von 7,0, ix. kein reduzierbares Chromophor, x. die Farbstofflösung emittiert Fluoreszenzen von sechs verschiedenen Farben bei 3 verschiedenen Wellenlängen des UV-Bereiches und des sichtbaren Bereiches der Fluoreszenzwürfel eines Epifluoreszenzmikroskopes, je nachdem, ob es sich um die Farbstofflösung allein oder um die Zellen handelt, die von dem Farbstoff durchdrungen wurden und auf denen er fixiert wurde, xi. es tritt eine blaue Farbe emittierende Fluoreszenz im Bereich von 450 nm–470 nm bei Anregung unter ultraviolettem WU-Würfel im Anregungsbereich von 330 nm–385 nm auf, xii. es tritt eine gelblich-grüne Farbe emittierende Fluoreszenz im Bereich von 510 nm–570 nm bei Anregung unter WB-Würfel im Anregungsbereich von 450 nm–480 nm auf, xiii. es tritt eine orange Farbe emittierende Fluoreszenz im Bereich von 610 nm–650 nm bei Anregung unter WG-Würfel im Anregungsbereich von 510 nm–550 nm auf, xiv. der Farbstoff emittiert Farbnuancen gelblicher Grautöne unter der normalen Durchlichtlampe des Epifluoreszenzmikroskops bei Betrachtung unter einem Ölobjektiv mit 100-facher Vergrößerung, xv. der Farbstoff emittiert Fluoreszenzfarben selbst bei einer Verdünnung im Bereich von 1:900.000, xvi. der Extrakt behielt bei Lagerung bei ca. 4°C seine Fluoreszenz sogar bis zu einem Jahr xvii. die Fluoreszenz des Farbstoffes ist hoch lichtecht und wird durch lang anhaltende, direkte Lichteinwirkung nicht beeinträchtigt, xviii. die Fluoreszenz des Farbstoffes ändert sich selbst beim Einfrieren bei –20°C nicht, einer Temperatur, bei der die Moleküle, wie bei Extrakten aus lumineszierenden Organismen, nicht dazu fähig sind, die für die Aktivierung erforderliche Energie zu erreichen, xix. der Farbstoff ist für lebende Eukaryontenzellen und Prokaryontenzellen (E. Coli) ungiftig, xx. der Farbstoff ist für Zellmembranen durchlässig, xxi. der Farbstoff ist für tote Eukaryontenzellen und tote Prokaryontenzellen undurchlässig und xxii. der Farbstoff ist selbst nach dem Färben der Zellbestandteile nicht abbaubar.
  3. Verwendung des Farbstoffes nach Anspruch 1 oder 2 bei allen Anwendungen als Ersatz für Phycobiliproteine.
  4. Verwendung des Farbstoffes nach Anspruch 1 oder 2 bei der schnellen Rasterung von zytogenetischen, zytologischen und histochemischen Objektträgern.
  5. Verwendung des Farbstoffes nach Anspruch 1 oder 2 bei schnellen Bioassays, deren Wirkung auf die verschiedenen histochemischen Zellbestandteile sichtbar ist.
  6. Verwendung des Farbstoffes nach Anspruch 1 oder 2 auf zytogenetischen Objektträgern, um einen Gegenfärbeeffekt der Zellen und Zellbestandteile gegenüber der Hintergrundfarbe zu erzielen, bei der reiner Farbstoff ohne Probe vorhanden ist.
  7. Verwendung des Farbstoffes nach Anspruch 1 oder 2 mit Wasser im Verhältnis von 1:450.000 bis 1:900.000 verdünnt, um bei den verschiedenen Wellenlängen eine Fluoreszenz von sechs Farben zu erhalten.
  8. Verwendung einer Zusammensetzung, die einen nach Anspruch 1 aus der Seegurke Holothuria scabra gewonnenen, bioaktiven Extrakt zusammen mit geeigneten Zusätzen für folgende Anwendungen enthält: i. zur Herstellung von Zusammensetzungen und Tinten zur fluoreszierenden Farbbeschichtung, die für eine Vielzahl von Farben, Tinten und Textilien eingesetzt werden können; ii. als fluoreszierende Molekularsonde eines In-Situ-Hybridisierungskits für die Molekulardiagnostik; iii. für Experimente, in denen verschiedene Anwendungen mit Fluoreszenzfarbstoffen in Feldstationen ausgeführt werden müssen, die in Gebieten mit Minustemperaturen liegen; iv. als fluorochrome Färbemittel für die Epifluoreszenzmikroskopie; v. in zelldurchdringenden Farbstoffzusammensetzungen; vi. als Zusammensetzung eines fluoreszierenden Farbstoffes zum Bleichen und Aufhellen von Polymeren; vii. bei der Leckerkennung mit einem vollspektralen Fluoreszenzfarbstoff; viii. in automatisierten chemischen Meßsystemen; ix. zur Markierung des Standortes von abgestürzten Flugzeugen, Rettungsinseln und -ausrüstungen wie beispielsweise Raketen; x. als Unterwassersonde; xi. als ein Bestandteil eines Chromatophoren-Sonnenfilters in Kosmetikcremes und -lotionen; xii. als ein fluoreszierender Bestandteil eines In-Situ-Hybridisierungskits für die Molekulardiagnostik; xiii. als ein Bestandteil der nichtradioaktiven Markierungs- und Nachweiskits für die Biochemie, die Zellbiologie, die Immunchemie und die Molekularbiologie zur Markierung von DNS, RNA, Proteinen und Enzymen; xiv. bei Immunofluoreszenznachweis; xv. als Gegenfärbemittel von DIG-markierten Oligonukleotidsonden und Anti-DIG-Fab-Fragmenten; xvi. in einfachen und mehrfachen flusszytometrischen Anwendungen; xvii. als ein fluorochromes Färbemittel für die Epifluoreszenzmikroskopie; xviii. für eine schnelle Biokontaminationskontrolle in der Reformkostindustrie, der Kosmetikindustrie, der pharmazeutischen und der chemischen Industrie; xix. für schnelle Bewertungen von Biokontaminationen in Laborkulturen; xx. für einen Schnelltest auf Biokontaminanten unter Feldbedingungen; xxi. für einen Schnelltest auf tote oder lebende E. coli-Bakterien; xxii. als natürlicher Farbstoff; xxiii. als bioaktive Zusammensetzung eines Fluoreszenzfarbstoffes im Verhältnis 1:900.000 in Äther zur Herstellung von Fluoreszenzen sechs verschiedener Farben bei drei verschiedenen Wellenlängen und einer Phasenkontrastwirkung unter Durchlicht; xxiv. als Farbstoff für verschiedene in Gebieten mit Minustemperaturen eingesetzte Fluoreszenzanwendungen; xxv. als ein Farbstoff zur Herstellung von Konjuganten für eine Vielzahl von Biomolekülen; xxvi. für zelldurchdringende Membranfarbstoffzusammensetzungen; xxvii. zur Identifizierung von toten und lebenden Zellen in Gewebekulturen; xxviii. für Farbstoffzusammensetzungen in Biosensoren; xxix. als Farbstoffzusammensetzung in Molekularkits und mikrobiologischen Kits; und xxx. als ein unpolarer Farbstoff zum Nachweis von Lipiden und Ölen.
  9. Verfahren zur Herstellung eines einen natürlichen Fluoreszenzfarbstoff aus der Seegurke Holothuria scabra enthaltenden bioaktiven Extraktes, das aus folgenden Schritten besteht: a) Sammeln der Meeresorganismen an der Meeresküste b) Lagerung des Organismus über Nacht in mit Seewasser gefüllten Tanks ohne jegliche mechanische Belüftung, c) Zerlegen der gewaschenen Tiere und Entfernen der weiblichen Keimdrüsen, d) Extraktion mittels 70-prozentigem Äthylalkohol zum Erhalten einer gelblich-orangen Lösung, e) 3- bis 4-malige Wiederholung des Extraktionsschrittes zum Erhalten einer gefärbten Lösung, r) Filtrierung der oben genannten Lösung durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 zum Erhalten eines teilgereinigten Extraktes, g) Lösen des in Schritt (f) erhaltenen Extraktes in Diethylether und h) Filtrierung durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 zum Erhalten einer klaren, gelb gefärbten Lösung mit der Bezeichnung „unpolare Fluoreszenzfarbstofflösung".
  10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die oben genannte Farbstofflösung weiter in einem Verhältnis zwischen 1:400.000 und 1:900.000 mit Wasser/Seewasser verdünnt wird, um eine Fluoreszenz von sechs Farben bei drei verschiedenen Anregungswellenlängen zu erzielen.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem Bioassays unter Benutzung von Verdünnungen des bioaktiven Extraktes im Verhältnis 1:450.000, 1:200.000, 1:100.000, 1:50.000 und 1:25.000, zur Feststellung der Ungiftigkeit des Farbstoffes nach dem Überleben von Eukaryontenzellen und Prokaryontenzellen durchgeführt werden.
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