DE19755642A1

DE19755642A1 - Markierter Primer für die Polymerasekettenreaktion

Info

Publication number: DE19755642A1
Application number: DE19755642A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr Weimer
Original assignee: Centeon Pharma GmbH
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 1997-12-15
Filing date: 1997-12-15
Publication date: 1999-06-24
Anticipated expiration: 2017-12-16
Also published as: DE19755642B4

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein markierter Primer für die Polymerasekettenreaktion und ein Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz mittels der Polymerasekettenreaktion, bei dem ein markierter Primer eingesetzt wird.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist bekanntlich eine sehr wirkungsvolle Methode zum Nachweis geringer Mengen einer bekannten Nukleinsäure-Sequenz in einer Probe (Erlich H.A., Gelfand, D. Sninsky J.J. (1991), Science, 252, pp. 1643-1651; PCR Protocols. Current methods and applications (1993) edited by B.A. White, Humana Press, Totowa, New Jersey, ISBN 0-89603-244-2). Wenn die Sequenz der Virus-DNA bereits bekannt ist, kann ein Primerpaar synthetisiert werden, das zu Regionen auf einander gegenüberliegenden Einzelsträngen komplementär ist und die gesuchte DNA-Sequenz flankiert. Unter den an sich bekannten Bedingungen einer PCR lassen sich dann in vitro durch Aufeinanderfolge von in der Regel mehr als 30 Reaktionszyklen große Mengen einer spezifischen DNA amplifizieren. Durch die PCR-Zyklen wird ein DNA Fragment einer spezifischen Größe, das sich aus den Längen der beiden Primer plus der Länge der Virus-DNA zwischen ihnen zusammensetzt, nur dann amplifizieren, wenn die gesuchte Virus-DNA in der Probe vorhanden ist. Die PCR-Technik ist so empfindlich, daß damit außerordentlich geringe Mengen einer DNA mit großer Sicherheit nachgewiesen werden können.

Aus der internationalen Patentanmeldung WO 92/02638 ist ein Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz bekannt, bei dem eine Probe, in der die nachzuweisende DNA als Einzelstrang vorliegt, mit zwei unterschiedlichen Primern hybridisiert wird, dem 5'-Primer und dem 3'-Primer, die den zu amplifizierenden DNA-Strang flankieren. Außerdem wird bei der Reaktion noch eine Oligonukleotid-Sonde eingesetzt, die am 5'-Ende und am 3'-Ende mit je einem Fluoreszenzfarbstoff versehen ist. Diese markierte Sonde wird so ausgewählt, daß sie mit dem zu amplifizierenden DNA-Abschnitt hybridisiert. Die beiden an der Sonde befestigten Fluoreszenzfarbstoffe zeichnen sich dadurch aus, daß die Fluoreszenz des einen Farbstoffes, des Reporters, durch die Nähe des zweiten Fluoreszenzfarbstoffes, des Quenchers, vermindert wird. Diese markierte Sonde, die zwischen den beiden durch die vorstehend genannten Sequenzen charakterisierten Primern an die DNA angelagert ist, weise dann z. B. folgende Sequenz auf:

SEQ ID NO. 3: ^5'FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA^3'.

Solch eine Sequenz kann unter der Bezeichnung TaqMan® Sonde im Handel bestellt und erworben werden und ist zur Verwendung im 5'-Nuklease-Assay, dem TaqMan Assay, bestimmt. Im einzelnen ist diese Methode beschrieben von Livak K.J., Flood S.J.A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K., Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Method and Appl. 1995; 4: 357-362).

Die besondere Eigenschaft dieser Sonde besteht darin, daß die Fluoreszenz des am 5'-Ende der Sonde befestigten Farbstoffes (FAM), des Reporters, durch die Nähe des am 3'-Ende des Primers angeordneten zweiten Fluoreszenzfarbstoffes (TAMRA), des Quenchers, reduziert wird, siehe oben.

Wird nun im Verlauf der Amplifikation unter der Einwirkung einer thermostabilen DNA-Polymerase der neue DNA-Strang ausgebildet, dann verdrängt die DNA-Polymerase die markierte Sonde nicht nur vom Einzelstrang, sondern zerlegt ihn mittels ihrer endonukleolytischen Aktivität und setzt dabei die beiden Fluoreszenzfarbstoffe frei. Die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes wird jetzt nicht mehr durch den Quencherfarbstoff unterdrückt und steigt an. Mißt man nun mit einem Fluoreszenzspektrometer die Fluoreszenz bei der Wellenlänge des Reporterfarbstoffes, dann läßt sich ein Anstieg der Fluoreszenz feststellen, die der Menge der neu gebildeten DNA entspricht.

Als ein Nachteil dieser Methode ist es anzusehen, daß neben dem 5'-Primer und dem 3'-Primer nach zusätzlich eine markierte Sonde benötigt wird, um die Amplifikation des nachzuweisenden DNA-Abschnittes feststellen zu können. Es stellte sich deshalb die Aufgabe, dieses bekannte Verfahren zu vereinfachen.

Es wurde nun gefunden, daß auf den Einsatz einer zusätzlichen markierten Sonde bei der Polymerasekettenreaktion verzichtet werden kann, wenn einer der beiden Primer mit den beiden Fluoreszenzfarbstoffen markiert wird und gleichzeitig dafür Sorge gefragen wird, daß der so markierte Primer mit dem zu amplifizierenden DNA-Strang nicht vollständig hybridisiert.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein markierter Primer für die Polymerasekettenreaktion, der an den beiden Enden des Oligonukleotidstranges mit zwei unterschiedlich Fluoreszenzfarbstoffen, einem Report- und einem Quencherfarbstoff, markiert ist, und wenigstens die letzten zwei Basen am 3'-Ende des so markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär sind. Dieser markierte Primer kann mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz keine vollständige Basenpaarung eingehen. Das hat zur Folge, daß unter der Einwirkung der zur Amplifikation eingesetzten Polymerase, sofern diese auch Korrektureigenschaften (proof-reading) hat, durch deren nukleolytische Aktivität die nicht gepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit dem daran befestigten Quencherfarbstoff freigesetzt werden. Dann aber befindet sich der Quencherfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Reporterfarbstoff, so daß dessen Fluoreszenz ansteigen kann.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz mittels der Polymerasekettenreaktion, bei dem einer der Primer die vorstehend genannten Merkmale aufweist. Bei der Amplifikation, für die eine oder mehrere thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden können, von denen wenigstens eine auch Korrektureigenschaften (proof-reading) haben muß, werden dann die-nicht gepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit dem daran befestigten Quencherfarbstoff freigesetzt, wodurch die Fluoreszenz auf der Wellenlänge des Reporterfarbstoffes ansteigt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl der 5'-Primer als auch der 3'- Primer mit den beiden vorstehend genannten, unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein. Während der Quencherfarbstoff in die Reaktionslösung abgegeben wird, trägt der neu gebildete DNA-Abschnitt zusammen mit dem Rest des Primers auch noch den fluoreszieren den Reporterfarbstoff. Wenn gleichzeitig mehrere Parameter nebeneinander nachgewiesen werden sollen, dann wählt man zweckmäßigerweise Reporter-Farbstoffe, die ebenfalls nebeneinander nachgewiesen werden können.

Für die erfindungsgemäße Polymerasekettenreaktion können verschiedene thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden. Hat die verwendete DNA-Polymerase die Eigenschaft des proof-readings, dann kann die Reaktion mit einer einzigen Polymerase durchgeführt werden. Anderenfalls ist ein Gemisch aus mehreren thermostabilen Polymerasen einzusetzen, indem neben der Taq DNA-Polymerase z. B. auch noch die Pwo-, Vent- oder Tth-Polymerase zur Anwendung kommen können.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß die ungepaarten Basen des Primers ein Angriffspunkt für die Polymerase mit Korrekturfunktion sind. Die eingesetzten thermostabilen DNA-Polymerasen weisen eine 3'→ 5'-Exonuklea seaktivität auf, der zur Freisetzung der nicht-hybridisierten Basen zusammen mit dem Quencherfarbstoff führt.

Das Verfahren zeichnet sich vor allem durch seine Einfachheit aus, weil nur zwei Oligonukleotide zur Durchführung der PCR erforderlich sind. Dies ist beispielsweise dann von Vorteil, wenn zum Nachweis variabler Zielfrequenzen wie von Viren konservierte Nukleinsäureabschnitte amplifiziert werden müssen bzw. gleichzeitig mehrere z. B. virale Parameter nachgewiesen werden sollen.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Beispiel

Zum Nachweis von Hepatitis B Virus DNS wird diese zunächst mit Hilfe von Standardverfahren extrahiert (zum Beispiel Ishizawa M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma, S: Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 19: 5792). Die Amplifikation wird wie folgt angesetzt:
Zu 10 µl der extrahierten DNA werden 5 µl Mastermix (5 µl 10×PCR Reaktionspuffer, der vom Lieferanten der Polymerase mitgeliefert wird), 4 µl des Primers 1 (siehe SEQ ID No. 1 des Sequenzprotokolls) (10 pMol/µl), 4 µl Primer 2 (siehe SEQ ID No. 2 des Sequenzprotokolls) (1 pMol/µl), 4 µl dNTPs (25 mM) und 0,25 µl thermostabile Polymerase mit proof-reading-Funktion (1' bis 1,5 units) werden mit 22,75 ml Wasser gemischt und folgenden Thermozyklen unterworfen:

1. Initiale Denaturierung für 1 Minute bei 90°
2. 35 Zyklen, jeweils 28 Sekunden bei 94°C Denaturierung und 1 Minute bei 62°C Annealing und Verlängerung
3. Kühlen bei 4°C bis zur Auswertung.

Die PCR-Reaktion wird in einem Fluoreszenzspektrometer ausgewertet. Dazu wird die Fluoreszenz bei der Reporter- und Quencherwellenlänge (518 nm für FAM oder 582 nm für TAMRA) gemessen und der jeweilige Quotient aus Reporter- und Quencher wird gebildet (RQ). Der Mittelwert der Quotienten dreier Negativkontrollen (RQ) wird davon abgezogen und der errechnete Wert als ΔRQ bezeichnet. Proben mit einem ΔRQ größer oder gleich 0,3 werden als positiv gewertet, Proben kleiner als 0,3 als negativ.

Sequenzprotokoll:

Claims

1. Markierter Primer für die Polymerasekettenreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß er

- an den beiden Enden des Oligonukleotid-Stranges mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, einem Reporter- und einem Quencherfarbstoff, markiert ist, und
- wenigstens die letzten zwei Basen am 3'-Ende des markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär sind.

2. Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz mittels der Polymerasekettenreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß

- einer der Primer an den beiden Enden seines Oligonukleotid-Stranges mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, einem Reporter- und einem Quencherfarbstoff, markiert ist,
- wenigstens die letzten zwei Basen am 3'-Ende des markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär sind und deshalb mit ihr keine Basenpaarung eingehen,
- für die Amplifikation eine oder mehrere thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden, von denen eine auch Korrektureigenschaften (proof-reading) hat, und die nicht, gepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit den daran befestigten Quencherfarbstoff freisetzt,
- wodurch die Fluoreszenz auf der Wellenlänge des Reporterfarbstoffes ansteigt und damit die Bildung der mit diesem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Sequenz angezeigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus zwei thermostabilen Polymerasen eine Taq DNA-Polymerase sowie eine Pwo-, Vent- oder Tth-Polymerase umfaßt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zunahme der Fluoreszenz des Reporter-Fluoreszenzfarbstoffes proportional zu der Menge der amplifizierten DNA-Sequenz ist.

5. Verfahren nach Ansprüchen 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Parameter durch Einsatz der entsprechenden Primer gleichzeitig nachgewiesen werden, wobei die Primer voneinander getrennt nachweisbare Reporter-Farbstoffe enthalten.

6. Diagnostisches Mittel, enthaltend neben anderen zur Durchführung der PCR nötigen Komponenten einen markierten Primer nach Anspruch 1.